HRP20040832A2 - Microorganism for genetic therapeutic treatment of proliferative diseases - Google Patents

Microorganism for genetic therapeutic treatment of proliferative diseases

Info

Publication number
HRP20040832A2
HRP20040832A2 HRP20040832A HRP20040832A2 HR P20040832 A2 HRP20040832 A2 HR P20040832A2 HR P20040832 A HRP20040832 A HR P20040832A HR P20040832 A2 HRP20040832 A2 HR P20040832A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
microorganism
tumor
component
protein
cells
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Ulf R Rapp
Werner Goebel
Hans-Harald Sedlacek
Joachim Fensterle
Ivaylo Gentschev
Original Assignee
Ulf R Rapp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ulf R Rapp filed Critical Ulf R Rapp
Publication of HRP20040832A2 publication Critical patent/HRP20040832A2/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/16—Exonucleases active with either ribo- or deoxyribonucleic acids and producing 3'-phosphomonoesters (3.16)
    • C12Y301/16001—Spleen exonuclease (3.1.16.1), i.e. 5->3 exoribonuclease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

Polje izuma
Izum se odnosi na mikroorganizam sa nepoznatim nukleotidnim sekvencama, pomoću kojeg se eksprimiraju eksprimirajući produkti koji djeluju antiproliferativno ili citotoksično kao i na primjenu takvih mikroorganizama za pripremu farmaceutskog sklopa, te jedan plazmid kao i postupak za pripremu takvog mikroorganizma kao i primjene takvog mikroorganizma.
Pozadina izuma i pregled tehnike
Mikroorganizmi sa smanjenom virulencijom kao npr. genetički promijenjeni virusi ili bakterije sa utišanom virulencijom koji služe kao nosači stranih nukleotidnih sekvenci dobivaju, u okviru genske terapije, na značenju. Prilikom genske terapije unose se strane nukleotidne sekvence bilo "in vitro" u stanice tkiva pri čemu se te stanice unose pacijentu ili se mikroorganizmi iniciraju u pacijenta pri čemu se očekuje da mikroorganizmi kao nosioci gena prenese strane nukleotidne sekvence u željenu stanicu tkiva.
Mikroorganizmi predstavljaju čestice. Nakon iniciranja u organizam te će čestice pretežno biti preuzete kroz tzv. retikuloendotelni sustav. Nasuprot tom eliminacijskom mehanizmu koji povećava broj mikroorganizama nosioca gena, napravljen je mikroorganizam sa stanično specifičnim ligandom. Bez obzira na taj pomak u sadržaju nosioca dosada je odstranjivanje mikroorganizma kroz retikuloendotelni sustav neznatno smanjen. Sadašnji cilj u znanstvenim istraživanjima vezanim za gensku terapiju je terapija proliferativnih bolesti, -kao npr. tumora, leukemija, kroničnih upala, autoimunoloških bolesti te odbacivanje transplantiranih organa-, bez obzira na sve uspjehe tretmana lijekovima tretman tumorskih bolesti je još uvijek nedovoljno uspješan.
Tako npr. bez obzira na sve uspjehe kirurgije, radioterapije, kemoterapije i imunoterapije u tretmanu tumora dosada nije bilo izlječenja odmaklih tumora glave i vrata, središnjeg živčanog sustava, prsne žlijezde, pluća, želučano-crijevnog trakta, jetre, gušterače, bubrega, kože, jajnika i prostate.
Razlozi tog smanjenog uspjeha u tumorskoj terapiji su raznoliki i još ne u potpunosti poznati. U postojeće razloge spadaju i) prije svega (primarna) postojeća rezistencija tumorskih stanica na kemoterapeutike primjenjivane u koncentraciji dostatnoj za “in vivo”, zatim na zračenje ili na imunoterapeutike, ii) rezistencija na terapeutike nastala tijekom terapije. Ta inducirana, tzv. sekundarna rezistencija ima svoje uzroke u genetičkoj varijabilnosti tumorskih stanica koja im omogućuje da izbjegnu djelovanje tumorske terapije razvojem rezistencije, iii) nedostatnost do sada upotrebljavanih tumorskih terapeutika s obzirom na njihovu farmakokinetiku i/ili farmakodinamiku je koncentracija koja je nedovoljna da uništi tumor bez obzira da li se radi o primarnom tumoru, recidivu ili metastazama. U te nedostatnosti tumorskih terapeutika spadaju, iv) preveliki volumen raspodjele, v) premala količina stigne do tumora, zapravo do tumorskih stanica, iv) premala sposobnost ulaska u tumor i/ili vii) toksičnost za čitav organizam, što smanjuju povećanje koncentracije doze za tumor.
U prošlosti se pokušalo različitim postupcima usmjeriti tumorski terapeutik prema tumoru.
Tumorski specifični ligandi, kao npr. antitijela ili njihovi cijepani produkti, vezani na citostatik, na antitumorski djelujuće citokine, na citotoksične proteine, ili na izotope dovode do poboljšanja citotoksičnosti supstance na tumor kada se usporedi sa normalnim tkivom, no to poboljšanje gledajući kroz duže vrijeme u većini slučajeva nije dovoljno za terapiju tumora (Pregled: Sedlacek i sur., Contributions to Oncology 43: 1-145, 1992; Carter, Nature Reviews Cancer 1: 118-129, 2001).
Konsekventno se “izbacuju” sustavi pojačavanja čijom pomoći se koncentracija određenog spoja na tumor može povećati.
Sustav pojačavanja ima za cilj u tumor dovesti takve enzime koji neće biti sveopće pristupačni ostatku tijela ili mu biti strani, a da istovremeno u tumoru mogu pretvoriti ili cijepati netoksičan predstupanj jednog citostatika u citotoksično aktivan citostatik. Dovođenje enzima u tumor odvija se upotrebom specifičnih liganada za tumorske stanice, vezanih na te enzime (npr. u obliku antitijela-Derived Enzyme-mediated Prodrug-Therapy; ADEPT) ili upotrebom gena za te enzime uz pomoć tumor-specifičnih ili nespecifičnih vektora (Gene Derived Enzym-mediated Prodrug Therapy, GDEPT) (Sedlacek i sur., Contributions to Oncology 43: 1-145, 1992; Sedlacek, Critical Reviews in Oncology/Hematology 37: 169-215, 2001; McCormic, Nature Reviews Cancer 1: 130-141, 2001; Carter, Nature Reviews Cancer 1: 18-129, 2001).
Dosadašnja klinička istraživanja s ADEPT ili GDEPT pokazala su nedovoljno dobre terapeutske rezultate. Kao postojeći problemi ukazuju se i) imunogenitet jednog tijelu nepoznatog enzima, ii) relativno premala lokalizacija konjugata enzim-antitijelo (ADEPT) u tumoru, iii) tehničke teškoće, dobiti dovoljnu količinu uz podnošljive troškove proizvodnje, fuzioniranog proteini jednog ljudskog antitijela s ljudskim enzimom, iv) premali ulazak konjugata enzim-antitijelo ili genskog vektora u tumor i v) premali postotak transdukcije “in vivo”, točnije rečeno, broj tumorskih stanica jednog tumorskog čvora u kojem se mogao eksprimirati gen za enzim bio je premali za jedno protu-tumorsko djelovanje.
Jedan daljnji sustav pojačavanja temelji se na indukciji jedne imunološke reakcije protiv stanica tumora, u smislu proliferacije njihovih specifičnih stanica za proizvodnju antitijela i citotoksičnih stanica. Za indukciju jedne imunološke reakcije upotrebljavaju se tumor antigeni u prikladnoj pripravi. Cilj je očito da kod tumorskih pacijenata dođe do “proboja” imunološke tolerancije prema vlastitom tumoru i/ili rezistencije vlastitog tumora protiv vlastite imunološke reakcije.
U okviru posljednjih godina klinički su provjerene brojne tehničke varijacije tumorskih cjepiva kroz kombinacije s različitim tumorskim antigenima s dodacima, bez da je došlo do “proboja” u tumorskoj terapiji. Iako su novi pripravci, kao npr. upotreba kombinacije imunogena tumor specifičnih antigena s novim dodacima, ili dendritične stanice natovarene s tumor specifičnim antigenima, ili nukleotidne sekvence koje kodiraju za tumor specifične antigene rezultirale se klinički obećavajućim rezultatima, ipak niti ovdje se ne vidi skorašnji proboj u tumorskoj terapiji.
Razvijena je tehnika, kod koje se eksprimiraju ekspresijski produkti nukleotidnih sekvenci koje se eksprimiraju na membrani te bakterije ili se iz te bakterije izlučuju. Temelj te tehnike je hemolizin-sustav Escherichia coli HlyAs koji predstavlja prototip jednog tip I sekretornog sustava gram-pozitivnih bakterija. Uz pomoć HlyAs razvijeni su sekretorni vektori koji omogućavaju jedno dostatno izbacivanje protein antigena u Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica i Vibrio cholerae. Takvi sekrecijski vektori sadrže cDNA jednog željenog proteinskog antigena vezanog na nukleotidnu sekvencu za HlyA-signalnog peptida, za hemolizin sekrecijski aparat, hlyB i hlyD te hly-specifičan promotor. Uz pomoć takvog sekrecijskog vektora može se protein eksprimirati na površini te bakterije. Takve genetički promijenjene bakterije induciraju kao cjepiva jednu znatno jaču imunološku zaštitu nego bakterije u kojima eksprimirajući protein unesene nukleotidne sekvence ostaje unutar stanice (Donner i sur., Vaccine 19: 2621-2618, 2001, Hess i sur., PNAS 93: 1458-1463, 1996). Nedostatak ovog sustava je da upotrebom hly-specifičnog promotora količina proteina, eksprimirana na površini bakterije, mala.
Razvijena je tehnika kojom se unosi plazmidna DNA u stanicu sisavaca korištenjem bakterija tipa Salmonella i Listeria monocytogenes. Geni koji se nalaze u plazmidu mogu se u stanicama sisavaca samo tada eksprimirati kada se nalaze pod kontrolom eukariotskih promotora. U sojevima Listeria monocytogenes unose se oni plazmidi koji imaju nukleotidnu sekvencu željenog antigena pod kontrolom željenog eukariotskog promotora. Tijekom unošenja nukleotidnih sekvenci za jedan specifičan gen za lizu učinjeno je da se sojevi Listeria monocytogenes u citosolu antigen-prezentirajućih stanica otapaju i oslobađaju svoje plazmide što pak krajnje dovodi do eksprimiranja, procesiranja i prezentiranja proteina kodiranog plazmidom te dovodi do povećanja imunogeniteta tog proteina (Dietrich i sur., Nat. Biotechnol 16; 181-185,1998; Vaccine 19: 2506-2512, 2001).
Razvijene su virulentno utišane varijante bakterija koje se smjeste unutar stanice. Tako npr. su određene varijante Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, odnosno typhimurium i typhi, kao i BCG kao dobro podnošljiva vijabilna cjepiva protiv tifusa i tuberkuloze. Te bakterije, uključujući njihove oslabljene mutante su generalno imunostimulirajuće i mogu potaknuti dobar imunološki odgovor. Tako npr. L. monocytogenes stimulira proliferaciju i citotoksičnost limfocita u velikoj mjeri preko aktivacije TH1 stanica. Takve bakterije dovode secernirane antigene direktno u citosol antigen-prezentirajućih stanica (APC; makrofage i dendritične stanice), koje pak eksprimiraju kostimulirajuće molekule i potiču jednu eficijentnu stimulaciju T-stanica. Listeria se ugrađuju djelomično u fagosomalne odjeljke i u tim bakterijama proizvedeni antigeni mogu stoga biti prezentirani preko MHC II klase molekula te tako dovesti do stimulacije T-stanica. S druge strane Listeria se repliciraju nakon što se oslobađaju iz fagosoma u citosol APS-a; proizvedeni i secernirani antigeni iz tih bakterija prvenstveno se prezentiraju preko MHC klase I, kroz što se inducira CTL odgovor protiv tih antigena. Osim toga pokazalo se da kroz interakciju Listeria s makrofagima, prirodnim stanicama ubojicama (NR) i neutrofilnim granulocitima će biti inducirana ekspresija tih citokina (TNF-alfa, IFN-gama, IL-2, IL-12; Unanue, Curr. Opin. Immunol. 9: 35-43, 1997; Mata i Peterson, J Immunol 163: 1449-14456, 1999), za koje je dokazana antitumorska aktivnost. Tako je kroz davanje L. monocytogenes, koje su bile transducirane za ekspresiju tumorskih antigena, bilo moguće antigenspecifično spriječiti rast eksperimentalnih tumora (Pan i sur., Nat Med 1: 471-477, 1995; Cancer Res 59; 5264-5269, 1999; Voest i sur., NATL Cancer Inst 87: 581-586, 1995; Beatty i Peterson, J Immunol 165: 5502-5508, 2000). Virulentno utišani rodovi Salmonella enterica, u koje su unesene nukleotidne sekvence za tumorske antigene, mogle su kao bakterijski nosioci koji eksprimiraju tumor-antigen izazvati specifičnu zaštitu protiv različitih eksperimentalnih tumora (Medina i sur., Eur J Immunol 30: 768-777, 2000; Zoller i Christ, J Immunol 166: 3440-3450, 2001; Xiang i sur., PNAS 97; 5492-5497, 2000).
Rekombinantni rodovi Salmonella bili su djelotvorni također kao profilaktična cjepiva protiv virusnih infekcija (HPV) (Benyacoub i sur., Infect Immun 67: 3674-3679, 1999) i za terapeutski tretman jednog kroz tumorski virus (HPV) imortaliziranog tumora miša (Revaz i sur., Virology 279: 354-360, 2001). Za sistemsku terapiju tumora izdvojeni su rodovi Salmonella koje dolaze u specifičnim tumorskim tkivima (Murray i sur., J Bacteriol 183: 5554-5564, 2001). U tim rodovima Salmonella kao i u rodovima Escherichia coli unesene su nukleotidne sekvence koje kodiraju za izabrani enzim te su određeni bakterijski nosači uspješni za GEDPT "in vitro" kao također i za "in vivo" (Pawelek i sur., Cancer Res 57: 4537-4544, 1997).
Upalna tkiva te posebice tumorska tkiva karakterizirana su, u tumoru većinom kaotično razvijenom, angiogenezom. U tim novostvorenim žilama mogu se sakupljati topive kao i supstance u česticama sve dok su dostupne preko jednog smanjenog distribucijskog volumena i s time preko jednog relativno dugačkog krvnog poluvremena opticaja. To sakupljanje (također naznačeno kao pasivno ciljanje) može se koristiti za terapeutske svrhe ( Sedlacek, Critical Reviews in Oncology/Hematology 37: 169-215, 2001).
Tehnički problemi izuma
U osnovi tehnički problem izuma leži u farmaceutskom pripravku koji će pokazati pojačano djelovanje prilikom tretmana proliferativnih bolesti, posebice u terapiji tumora.
Osnovna koncepcija izuma kao i poznata znanja na osnovu izuma
Za rješenje tih tehničkih problema, izum opisuje jedan mikroorganizam s omotačem u čiji genom su unesene i eksprimirane slijedeće komponente: I) jedna nukleotidna sekvenca, koja kodira za jedan direktan ili indirektan, antiproliferativni ili citotoksično djelujući ekspresijski produkt ili za više različitih takvih ekspresijskih produkata, II) jedna nukleotidna sekvenca, koja kodira za jedan protein krvne plazme koje se nalazi pod kontrolom jedne u mikroorganizmu aktivirajuće aktivne sekvence ili je konstitutivno aktivna, III) izborno, jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za jedan stanično specifičan ligand koji se nalazi pod kontrolom, u mikroorganizmu aktivirajuće aktivne sekvence, ili je konstitutivno aktivna, IV) jedna nukleotidna sekvenca za jedan transportni sustav koji djeluje na ekspresiju ekspresijskog produkta komponente I) i II) kao i izborno III) na površini mikroorganizma ili na izlučivanje ekspresijskog produkta komponente I) i II) kao i izborno III) i većinom je konstitutivno aktivna, V) izborno jedna nukleotidna sekvenca za jedan protein lize mikroorganizma u citosolu stanica sisavca i za unutarstanično otpuštanje plazmida sa jednom ili više komponenata I) i VI) koje se nalaze u liziranom mikroorganizmu, i VI) jedna u mikroorganizmu aktivirajuća, i/ili jedna tkivno specifična, tumor specifična, funkcionalno specifična ili nestanično specifična aktivirajuća sekvenca za ekspresiju komponente I) pri čemu se svaka od komponenata I) do VI) bilo jednom ili više put, bilo isto ili različito može namjestiti.
U okviru izuma će biti opisani prvenstveno mikroorganizmi s omotačem korišteni kao nosači genetičke informacije i upotreba tih omotanih mikroorganizama za profilaksu i terapiju proliferativnih bolesti. Ovaj se izum temelji na sljedećim iskustvima i tehničkim razvojima.
Bit izuma su prvenstveno omotani mikroorganizmi kao nosioci nukleotidnih sekvenci za tretman proliferativnih bolesti pri čemu su u mikroorganizme unesene slijedeće komponente: I) najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za najmanje jedan direktni ili indirektni antiproliferativni ili citotoksično djelotvoran ekspresijski produkt, II) najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za najmanje jedan protein krvne plazme pod kontrolom najmanje jedne u mikroorganizmu aktivne aktivirajuće sekvence, III) izborno najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za najmanje jedan stanično specifičan ligand pod kontrolom najmanje jedne u mikroorganizmu aktivne aktivirajuće sekvence, IV) najmanje jedna nukleotidna sekvenca za najmanje jedan transportni sustav koji omogućava ekspresiju ekspresijskog produkta komponente I), II) ili III) na vanjskoj površini mikroorganizma ili izlučivanje komponente I), II) i III), V) izborno najmanje jedna nukleotidna sekvenca za najmanje jedan protein za lizu mikroorganizma u citosolu stanice sisavca i za unutarstanično oslobađanje plazmida koji se nalazi u liziranom mikroorganizmu, VI) najmanje jedna u mikroorganizmu aktivirajuća ili najmanje jedna tkivno specifična, tumor specifična ili nestanično specifična aktivirajuća sekvenca za ekspresiju komponente I):
Željeni oblici izuma
Komponenta I)
Komponenta I) je najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za najmanje jedan direktan ili indirektan antiproliferativni ili citotoksično djelujući ekspresijski produkt. U smislu izuma pod direktnim antiproliferativno-djelujućim ekspresijskim produktima smatraju se npr. interferoni kao npr. IFN-alfa, IFN-gama, IFN-β; interleukini koji zaustavljaju stanice imunološkog sustava ili stanice tumora kao npr. IL-10, IL-12; pro-apoptotski peptidi ili proteini kao npr. TNF-related apoptosis inducing ligand (TRIAL); antitijelo ili dijelovi antitijela koji zaustavljaju procese tako da djeluju citotoksično na jednu stanicu imunološkog sustava , jednu stanicu tumora ili jednu stanicu tkiva od koga tumor potječe kao npr. antitijelo usmjereno protiv i) antigena vezanog za tumor ili tumor specifičnog antigena, ii) antigena na limfocite kao npr. protiv T-staničnog receptora, B-staničnog receptora, receptora za CD40 ligande (B7.1 ili B7.2), receptora za interleukin kao npr. IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15 ili -16, receptora za interferon ili receptor za kemokin kao npr. RANTES, MCAF, MIP-alfa, IL-8, MGSA/Gro, NPA-2 ili IP-10, iii) jednog tkivno specifičnog antigena kao npr. protiv jednog tkivno-specifičnog antigena prsne žlijezde, bubrega, madeža, prostate, štitne žlijezde, sluznice želuca, jajnika, maternice, sluznice mokraćnog mjehura; jednog antiproliferativno djelujućeg proteina kao npr. retinoblastom protein (pRb=p110) ili promijenjenog p107 i p130 proteina ili mutante tih proteina s antiproliferativnim djelovanjem, p21 (WAF-1) protein, p27 protein, p16 protein, GAAD45 protein, antiproliferivno djelujući proteini Bcl-2 obitelji kao npr. bad ili bax, citotoksični proteini kao npr. perforin, granzim, onkostatin, jedna antisense RNA ili jedan ribozim specifičan za jednu mRNA koja kodira za jedan receptor, za jedan enzim za prijenos signala, za jedan protein koji sudjeluje u staničnom ciklusu, za jedan transkripcijski faktor ili za jedan transportni protein. Indirektno antiproliferativno djelujući proteini su npr. poticatelji akutne upalne i imunološke reakcije kao npr. kemokini kao RANTES (MCP-2), monocyte chemotactic and activating factor (MCAF), IL-8, macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1-alfa, -β), neutrophil activating protein-2 (NAP-2), inteleukini kao IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, human leukemia inhibitory factor (LIF), IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, citokini kao GM-CSF, G-CSF, M-CSF, enzimi za aktiviranje ili cijepanje inaktivnih predstupnjeva jedne citotoksične tvari u jednu citotoksičnu tvar, pri čemu je taj enzim jedna oksireduktaza, jedna transferaza, jedna hidrolaza ili jedna liaza. Primjeri za te enzime su β- glukoronidaza, β- galaktozidaza, glukozna oksidaza, glikozidaza, alkohol dehidrogenaza, lektoperoksidaza, urokinaza, tkivna plazminogen-aktivator karboksi peptidaza, citozin deaminaza, deoksicitidin kinaza, timidin kinaza, lipaza, kisela fosfataza, alkalna fosfataza, kinaza, purin nukleozid fosforilaza, glukozna oksidaza, laktoperoksidaza, lakto oksidaza, penicilin-V-amidaza, penicilin-G-amidaza, lizozim, β- laktamaza, aminopeptidaza, karboksi peptidaza A, B ili G2, nitroreduktaza, citokrom p450 oksidaza. Prema izumu enzim može potjecati od jednog virusa, jedne bakterije, jednog kvasca, jednog mekušca, jednog insekta ili jednog sisavca. Prvenstveno će se koristiti ljudski enzimi. Prvenstveno prema izumu koristiti će se sljedeći konstrukti nukleinskih kiselina koji kodiraju za jedan fuzioni protein jednog stanično-specifičnog liganda s jednim enzimom i/ili proteinima koji inhibiraju angiogenezu kao npr. inhibitor plazminogen aktivatora (PAI-1); PAI-2 ili PAI-3, angiostatin ili endostatin, interferon-alfa, -β, ili -gama, interleukin 12, trombocitni faktor 4, trombospondin-1 ili -2, TGF-β, TNF-alfa, vascular endothelial cell growth inhibitor (VEGI). U osnovi izuma komponenta I) može predstavljati jednu ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju za jednu ili više istih ili različitih, direktnih ili indirektnih antiproliferativnih ili citotoksično djelujućih proteina. Prvenstveno će se koristiti kombinacije proteina koje pokazuju aditivno ili sinergističko djelovanje. Aditivno ili sinergističko djelovanje se npr. može očekivati kod proteina koji ne djeluju jednako: citotoksični proteini i proapoptotički proteini, enzimi i citotoksični i/ili proapoptotički proteini, antiangiogenetski proteini i citotoksični i/ili proapoptotički proteini, poticatelji upalne reakcije i enzimi ili citotoksični, proapoptotički i/ili antiangiogenetski proteini.
Komponenta II)
Komponenta II) je jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za jedan protein krvne plazme koji se nalazi pod kontrolom jedne u mikroorganizmu aktivne aktivirajuće sekvence. Prvenstveno se to odnosi na ljudske proteine krvne plazme koji pokazuju jedno srednje dugačko vrijeme cirkulacije u krvi koje je veće od 24h. Ovdje posebice pripadaju albumin (Nucleotide 1-2258, Hinchliffe i sur, EP 0248637-A, 9.12.1987), transferin ( Nuclotide 1-2346, Uzan i sur., Biocehem Biophys Res Commun 119: 273-281, 1984; Yang i sur., PNAS USA 81, 2752-2756, 1984), ceruloplasmin (Baranov i sur., Chromosoma 96: 60-66, 1987), haptoglobin (Nuclotide 1-1412, Raugei i sur., Nucleic Acid Res 11: 5811-5819, 1983; Yang i sur., PNAS USA 80: 5875-5879, 1983; Brune i sur., Nucleic AcidRes 12: 4531-4538, 1984), hemoglobin alfa ( Nucleotide 1-576; Marotta i sur., PNAS USA 71: 2300-2304, 1974; Chang i sur., PNAS USA 74: 5145-5149, 1977), hemoglobin β (Nucleotide 1-626; Marotta i sur., Prog nucleic Acid Res Mol Biol 19: 165-175, 1976; Marotta i sur., J Biol Chem 252: 5019-5031, 1977), alfa2 makroglobulin (Nucleotide 1-4599; WO 9103557-A, 21.03.1991). Tome spadaju također i drugi proteini krvne plazme kao npr. alfa1 lipoprotein, alfa2 lipoprotein, β1 lipoprotein. Ekspresija najmanje jednog takvog proteina plazme kroz mikroorganizam prema izumu djeluje da mikroorganizam nakon sistemskog davanja- posebice nakon injekcije u krvni opticaj- te je u smanjenoj mjeri preuzet od strane fagocitnih stanica te je na taj način duže prisutan u krvi te tako više dolazi do sustava tumorskog tkiva ili u tkivo zahvaćeno kroničnom upalom.
Komponenta III)
Komponenta III) je jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za jedan stanično specifičan ligand koji se nalazi pod kontrolom u mikroorganizmu aktivne aktivirajuće sekvence. Specifičnost tog liganda je ovisna o vrsti proliferativne bolesti za koju će se mikroorganizam upotrebljavati i o stanicama ili tkivima s kojima će komponenta I) u mikroorganizmu doći u doticaj kako bi usmjerila svoje terapeutsko djelovanje. Tako će se npr. kod tumorskih bolesti upotrebljavati ligandi sa specifičnošću za tumorske stanice, odnosno za tumor vezane ili tumor specifične antigene ili tumorske endotelne stanice ili za stanice tkiva od kojih određeni tumor potječe kao npr. za stanice štitne žlijezde, prostate, jajnika, prsne žlijezde, bubrega, ovojnice želuca, madeže, maternice, mjehura, kod kroničnih upala, staničnih autoimuno bolesti i odbacivanja transplantiranih organa, ligande bilo sa specifičnošću za makrofage, dendritične stanice, T-limfocite ili za aktivirane endotelne stanice. Takvi ligandi su npr. specifična antitijela ili antigen-vezani fragmenti tog antitijela, faktori rasta, interleukini, citokini ili stanične adhezivne molekule koje se vežu na stanice tumora, stanice leukemije, stanice tkiva, makrofage, dendritične stanice,T-linfocite ili na aktivirane endotelne stanice.
Komponenta IV)
Komponenta IV) je jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za jedan transportni sustav koji omogućava ekspresiju ekspresijskog produkta komponente I), II) i/ili III) na vanjskoj površini mikroorganizma. Spomenute komponente mogu po izboru biti izlučivane ili se eksprimirati na membrani mikroorganizma. Komponente II) i III) prvenstveno će biti membranski eksprimirane. Takvi transportni sustavi su npr. hemolizinski transportni signal bakterija E. coli (nukleotidna sekvenca sadrži HlyA, HlyB i HlyD pod kontrolom hly-specifičnog promotora, Gentschev i sur., Gene 179: 133-140, 1996). Upotrebljivi su slijedeći transportni sustavi: za izlučivanje C-terminalnog HlyA transportnog signala, u suprotnosti od HlyB i HlyD proteina; za stalnu membransku ekspresiju C-terminalnog HlyA-transportnog signala, suprotno od HlyB-proteina; hemolizinski transportni signal E. coli (nukleotidna sekvenca koja sadrži HlyA, HlyB i HlyD pod kontrolom jednog nespecifičnog bakterijskog promotora); transportni signal za S-layer protein (Rsa A) Caulobacter crescetus; za izlučivanje i za stalnu membransku ekspresiju C-terminalnog RsaA- transportnog signala (Umelo- Njaka i sur., Vaccine 19: 1406-1415, 2001); transportni signal za TolC protein Escherichia coli (TolC protein opisan je od strane Koronakis i sur., Nature 405: 914-919, 2000 i Gentschev i sur., Trends in Microbiology 10: 39-45, 2002).; za stalnu membransku ekspresiju N-terminalnog transportnog signala.
Komponenta V)
Komponenta V) je jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za najmanje jedan litički protein koji se eksprimira u citosolu jedne stanice sisavca i lizira mikroorganizam kako bi došlo do oslobađanja plazmida u citosol stanice domaćina. Takvi litički proteini (endolizini) su npr. Listeria- specifični proteini lize kao npr. PLY551 (Loessner i sur., Mol Microbiol 16: 1231-41, 1995), Listeria- specifičan holin koji se nalazi pod kontrolom jednog Listeria promotora. Željena izvedba ovog izuma je kombinacija različitih komponenata V), kao npr. kombinacija jednog proteina lize s holinom.
Komponenta VI)
Komponenta VI) predstavlja aktivnu sekvencu po izboru koja kontrolira ekspresiju komponente I). Za ekspresiju komponente I) na vanjskoj površini mikroorganizma je komponenta VI) u bakteriji aktivirajuća aktivna sekvenca poznata stručnjacima. Takve aktivne sekvence su npr. konstitutivno aktivne regije promotora kao što je promotorska regija s "Ribosomal binding site" (RBS) gena za beta- laktamazu E. coli ili tetA gena (Busby i Ebright, Cell 79: 743-746, 1994), inducibilni promotori što podrazumijeva promotore koji nakon ulaska u stanicu postaju aktivni. Kao posljednji spada actA promotor L. monocytogenes (Dietrich i sur., Nat Biotechnol 16: 181-185, 1998) ili pagC promotor S. monocytogenes (Bumann, Infect Immun 69: 7493-7500, 2001). Prvenstveno će se fokusirati na aktivirajuće sekvence, koje nakon oslobađanja plazmida bakterijskog nosača u citosolu ciljane stanice, u toj stanici postaju aktivne. Tako se npr. može upotrijebiti CMV-pojačivač, CMV-promotor, SV40 promotor ili svaka druga stručnjaku poznata promotorska ili pojačivačka sekvenca. Prvenstveno će se dalje koristiti stanično specifična ili funkcionalno specifična aktivirajuća sekvenca. Izbor stanično specifične ili funkcionalno specifične aktivirajuće sekvence ovisiti će o stanici ili tkivu u kojem će se eksprimirati bakterijski nosač, točnije od strane bakterije noseći i oslobođeni plazmid koji sadrži komponentu I). Takve aktivirajuće sekvence su npr. aktivirajuće sekvence vezane za tumorske stanice (tima pripada aktivirajuće sekvence gena za midikine, GRP, TCF-4, MUC-1, TERT, MYC-MAX, površinski protein, alfa-fetoprotein, CEA, tirozinaze, fibrilarni kiseli protein, EGR-1, GFAP, E2F1, bazični mijelin, alfa-laktabumin, osteokalcin, tiroglobulin i PSA (McCormic, Nature Reviews Cancer 1: 130-141, 2001)); specifične aktivirajuće sekvence endotelnih stanica (tima pripadaju aktivirajuće sekvence gena za proteina koji se prvenstveno eksprimiraju u endotelnim stanicama (Sedlacek, Critical Reviews in Oncology/Hematology 37: 169-215, 2001) kao npr. VEGF nazvan po Willebrand faktor, za mozak specifičan endotelni glukoza-1-transporter, endoglin, VEGF-receptor posebice VEGF-R1 i VEGF-R3, zatim TIE-1, ODECGF-receptor/i, B61, endotelin-1, endotelin-B, manoza-6-fosfat-receptor, VCAM-1 i PECAM-1; aktivirajuća sekvenca gena za proteine koji se prvenstveno eksprimiraju u stanicama tkiva od kojih tumor pacijenta potječe (tu pripadaju proteini koji se eksprimiraju u tkivu dojke (kao npr. MUC-1, alfa-laktalbumin), zatim štitne žlijezde (kao npr. tiroglobulin), prostate (kao npr. kalikrein-2, androgeni-receptor, PSA), jajnika, madeža (kao npr. tirozinaze), i bubrega); aktivirajuće sekvence gena za proteine koji se eksprimiraju u makrofagima, dendritičnim stanicama ili limfocitima kao npr. interleukini, citokini, kemokini ili interferoni; aktivirajuće sekvence koje se aktiviraju tijekom hipoksije kao npr. aktivirajuća sekvenca za VEGF ili za eritropoetin.
Unošenje komponenata I) do VI) u mikroorganizam obavlja se stručnjacima poznatim molekularno biološkim metodama. Tako je npr. stručnjacima opće poznato na koji se način unose komponente u pripremljen plazmid te kako se plazmid prenosi u bakteriju.
Na osnovu izuma će se ti mikroorganizmi dati pacijentu za profilaksu ili terapiju jedne proliferativne bolesti kao npr. jednog tumora, jedne leukemije, jedne kronične upale, jedne autoimune bolesti ili prilikom odbacivanja jednog transplatiranog organa. Za tretman jedne od ovih bolesti davati će se mikroorganizam prema izumu u obliku za to namijenjenog pripravka lokalno ili sistemski kao npr. u krvnu cirkulaciju, u jednu tjelesnu šupljinu, u jedan organ, u jedan zglob ili u jedno vezno tkivo. Da bi se prilikom sistematičnog unošenja mikroorganizma, posebice u krvnu cirkulaciju, izbjeglo smanjivanje količine mikroorganizma kroz tzv. retikuloendotelni sustav kroz djelovanje komponente II) te da se produži vrijeme cirkulacije u krvi, mikroorganizmi se mogu uklopiti u otopinu koja posjeduje takve tvari koje produžuju vrijeme cirkulacije u krvi. Suspenzija povezuje inkubaciju. Suspenzija i inkubacija mikroorganizma može uslijediti u npr. krvnoj plazmi ili krvnom serumu. Suspenzija i inkubacija će se prvenstveno provoditi u otopinama tvari ili otopinama smjesa tvari koje pokazuju jedno duže vrijeme cirkulacije u krvi. U te tvari spadaju npr. albumin, transferin, proalbumin, hemoglobin, alfa-1-lipoprotein, alfa-2-lipoprotein, β-1-lipoprotein, alfa-2-makroglobulin, polietilenglikol (PEG), konjugati PEG-a s prirodnim ili sintetičkim polimerima, hidroksietilni škrob.
Kroz suspenziju i inkubaciju u jednoj takvoj otopini dolazi do adsorpcije tvari na površinu mikroorganizma po izumu. Prekrivanje mikroorganizma s takvim tvarima može se još više poboljšati korištenjem konjugata. Metode konjugacije opisane su pregledno u Sedlacek i sur., Contributions to Oncology 32: 1-132, 1998. Prekrivanje kao rezultat adsorpcije uspješno je ukoliko se mikroorganizmi nalaze u otopini s 0,1% do 50% tvari za prekrivanje i to posebice u vremenu od 10 min do 24 sata i pri temperaturi od 4 Celzijeva stupnja.
Prema izumu kao mikroorganizmi će se koristiti one bakterije koje imaju smanjenu virulentnost. Što više, prvenstveno će se bakterije izabrati iz jedne grupe koja uključuje Escherichia coli, Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Shigella.
Mikroorganizmi prema izumu su dalje membranski omotači, tzv. duhovi, živućih, točnije postojećih mikroorganizama. Takvi membranski omotači napravljeni su prema EPA 0540525.
Predmet izuma su pripravci lijekova koji sadrže mikroorganizme po izumu i upotreba tih pripravaka lijekova u profilaksi i/ili terapiji jedne proliferativne bolesti. U smislu izuma pod proliferativnom bolešću podrazumijeva se bolest s prekomjernom ili nekontroliranom staničnom proliferacijom kao npr. jedna tumorska bolest kao što je jedan karcinom ili jedan sarkom, jedan leukemija, jedna kronična upala, jedna autoimuna bolest ili jedno odbacivanje transplantiranog organa. Za profilaksu ili terapiju jedne bolesti davati će se mikroorganizmi po izumu u sklopu pripravka lijeka bilo lokalno bilo sistemski u jednoj dozi od 100 do 100 miliona klica po jednom pacijentu.
Pod pojmom “umotani” podrazumijeva se da na vanjskoj strani membrane mikroorganizma mogu se nalaziti veći broj istih ili različitih molekula (eksprimiranih i/ili izlučenih prema jednoj ili više oznaka I) do III)) kako je prethodno opisano pri čemu geometrijski stupanj prekrivanja može ležati između 0,001 i 1, posebice 0,1 i 1 odnosno 0,1i 1. Geometrijski stupanj prekrivanja može se izračunati iz koeficijenta ukupne površine molekula, u radijalnoj (pod tim se smatra jedna središnja točka mikroorganizma) projekciji na površini mikroorganizma i površine mikroorganizma. U pravilu se uzima da je površina mikroorganizam oblika kugle pa se izračunava iz volumena mikroorganizma. Oznaka “omotan” je dana kao fakultativna.
PRIMJERI
Primjer 1: Konstrukcija jednog bakterijskog soja za stalnu membransku ekspresiju ljudskog albumina i beta-glukoronidaze
U ovom primjeru potrebno je opisati način nastanka bakterijskog soja St21-bglu. Taj utišani soj Salmonella typhi Ty21a (nosač odobren za upotrebu kod ljudi) uz pomoć Hly sustava za izlučivanje E. coli eksprimira fuzijski protein, koji se stalno eksprimira u membrani, ljudske beta-glukoronidaze i HlyA kao i ljudskog albumina i HlyA. Osnova konstrukta je poznati plazmid pMOhly1 (Gentchev i sur., Behring Inst Mitt 57-66, 1994) i pGP704 (Miller i Mekalanos, J Bacteriol 170: 2575-2583, 1988). Kroz pasivno ciljanje soj omogućava (Bermudes i sur., Adv Exp Med Biol 465: 57-63, 2000) da beta-glukuronidaza dođe do tumora i time se cijepanje beta-glukuronidaze u aktivirajući prolijek ograničava na tumorsko tkivo.
Stalna membranska ekspresija može biti uspješna kroz fuziju proteina C-terminalnog dijela HlyA proteina za izlučivanje u prisutnosti HlyB proteina, ali u odsutnosti jednog potpuno funkcionalnog HlyD proteina. U svakom slučaju HlyD ne smije u potpunosti manjkati jer u suprotnom ne dolazi do vezanja između mehanizma za izlučivanje i TolC proteina vanjske membrane (Spreng i sur., Mol Microbiol 31: 1596-1598, 1999). U ovom primjeru dana je jedna od mogućih modifikacija HlyD proteina za stalnu membransku ekspresiju. Prvo se konstruira vektor pMOHly DD kod kojeg se ne stvara funkcionalni HlyD protein. Zbog toga se pomoću endonukleaza DraIII i ApaI odstrani dio HlyD gena. Nakon restrikcije krajevi se režu korištenjem 3’-5’ egzonukleaze te se ponovno ligira fragment veličine 10923 baznih parova. Na kraju se u taj vektor klonira gen za beta-glukuronidazu u okvir čitanja hlyA gena. Za tu svrhu se lančanom reakcijom polimeraze (PCR) umnoži bglu cDNA iz jedne cDNA banke (GenBank Accession (Gb): M15182) korištenjem slijedećih početnica:
bglu 5’: ATGCATTGCAGGGCGGGATGCTGTACC
bglu 3’. ATGCATAAGTAAACGGGCTGTTTTCCAAAC
Dijelovi početnica koji su podcrtani komplementarni su cDNA beta-glukoronidaze, a dio napisan koso je informacija za stvoreno NsiI mjesto (ovaj način označavanja koristiti će se i dalje; oligonuklotidne sekvence označavati će se i dalje kao i ovdje s 5’-3’). Početnice su tako izabrane da se gen umnaža bez signalne sekvence. Produkt (1899 parova baza) se subklonira s “PCR Cloning Kit” namijenjenim za tu svrhu, a zatim se korištenjem NsiI ekstrahira dio od otprilike 1890 parova baza. Na kraju se NsiI fragment klonira u pripremljeno NsiI mjesto plazmida pMOhly DD. Dobiveni vektor naziva se pMO Ddbglu (Slika 1). (ukoliko se NsiI fragment klonira u pMOhly1 vektor rezan NsiI tada nastaje plazmid pMO bglu koji omogućava secerniranje fuzijskog proteina). U drugom dijelu biti će predstavljen integracijski vektor za kromosomalne integracije albumin-HlyA fuzije. U prvom koraku bit će predstavljen pMOhly alb vektor. Taj vektor, koji se bazira na pMOhly1 vektoru, nosi fuziju cDNA albumina s HlyA genom. Za kloniranje će se cDNA albumin gena (Gb: A06977), koja potiče iz jedne genske banke, umnožiti korištenjem PCR i NsiI napravljenim početnicama:
5’: ATGCATGGGTAACCTTTATTTCCCTTC
3’: ATGCATAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG
1830 parova baza veliki fragment će se subklonirati i na kraju rezati s NsiI. Fragment veličine 1824 baznih parova će se ligirati samo u NsiI rezani pMOhly1. Gotovi pMOhly abl eksprimira uz HlyB, HlyD i jedan fuzijski protein albumina i HlyA. Za pojedine se eksperimente NsiI fragment može alternativno klonirati u pMO DD vektor pri čemu se tada taj vektor zove pMO DDalb. U daljnjem tijeku događaja upotrijebiti će se jedna modifikacija upravo opisane strategije kloniranja za unošenje u kromosom Salmonella (Miller i Mekalanos, J Bacteriol 170: 2575-2583, 1988). Za to se prvo klonira aroA gen Salmonella-e u pUC18 vektor (PCR sa slijedećim početnicama:
Početnica 5’: ATGGAATCCCTGACGTTACAACCC
Početnica 3’. GGCAGGCGTACTCATTCGCGC
“Tupo (Blunt)” kloniranje fragmenta od 1281 baznih parova u HincII mjesto za rezanje pUC18). Odmah potom se korištenjem HincII I ponovnog ligiranja otklanja 341 parova baza veliki fragment iz aro A. Taj vektor je nazvan pUC18 araA’. Odmah potom klonira se alb-hlyA fuzionirani gen zajedno s promotor sekvencom koja se nalazi na pMOhly u pUC18aroA’ vektor. Za to se vektor pMOhly alb reže s AacII i SwaI te potom inkubira 3’-5’ egzonukleazom. Tupi fragment veličine 3506 parova baza se ekstrahira i zatim inkubacijom s HincII ligira u pUC18aroA’. To rezultira vektorom pUCaro-alb. Sada se klonira od aroA tupi alb-hlyA fragment s čitavom aktivirajućom sekvencom iz vektora pUCaro-alb u vektor pGP704. Za to je potrebno inkubirati pUCaro-alb s HindIII i na kraju uz pomoć 5’-3’ egzonukleaze dobiti tupe krajeve. Odmah potom reže se s EcoRI te se 4497 parova baza veliki fragment koji se ligira u pGP704 vektor prethodno inkubiran s EcoRI/EcoRV (tupo)(EcoRI/RV fragment: 6387 parova baza). Rezultat toga je integracijski vektor pGParo-alb (Slika 2). Vektor se transformira u soj E. coli SM101pir. Taj soj omogućava repliciranje vektora s obzirom da on stvara za replikaciju potreban p-protein. Vektor će se transferirati samo preko konjugacije u prihvatnom soju Salmonella typhi Ty21a koji ne dopušta replikaciju vektora. Nakon toga se izdvajaju samo bakterije sa rezistencijom na tetraciklin kod koji je vektor integriran u kromosom. Western blot analizom provjerava se citoplazmatska proizvodnja albumina. Taj soj St21-alb, koji doduše eksprimira fuziju alb-hlyA, u ovom obliku niti je ne može secernirati niti stalno membranski eksprimirati. Za stalnu membransku ekspresiju potreban je plazmid s funkcionalnim HlyB (kao pMO DDbglu) ili funkcionalnim HlyB i HlyD (kao pMO bglu).
U ovom primjeru upotrijebit će se pMO DDbglu plazmid sa St21-abl sojem. To rezultira sojem St21-abl pMO DDbglu koji se uz pomoć Hly sustava za izlučivanje, kako i ljudskog albumina tako i ljudske beta-glukuronidaze eksprimira stalno membranski. Takav soj se tada može u smislu patenta oblikovati za prolijek konverziju.
Primjer 2: Konstrukcija jednog omotanog bakterijskog soja s fuzijom albumin-HlyA, za prenošenje genetičke informacije ljudske beta-glukuronidaza.
U ovom primjeru je prikazan bakterijski soj koji uz pomoć pasivnog ciljanja, ljudsku DNA koja kodira za beta-glukuronidazu usmjeruje prema tumorskim stanicama pri čemu bi se ona u tumorskim stanicama trebala eksprimirati. Kako bi se dobio soj jednostavan za pripravu u ovom primjeru će se za stalnu membransku ekspresiju upotrijebiti kao i u primjeru 1 lagano modificiran soj. Pri tome je potrebno da i gen za albumin-HlyA i informacija za HlyB su integrirani u kromosom. Na taj način taj soj eksprimira konstitutivno stalnom membranskom ekspresijom albumin.
U tu će se svrhu gore opisani vektor inkubirati BsrI i EcoRI i nakon toga tretirati 5’-3’ egzonukleazom. Ovo rezanje restrikcijskim enzimima rezultira 5815 parova baza velikim fragmentom s tupim krajevima koji sadrži kompletnu prokariotsku aktivirajuću sekvencu i hlyC, alb-hlyA i hlyB gene, ali ne i hlyD. Taj se fragment može klonirati samo u tupo HincII rezano mjesto gore opisanog pUC18aroA’ vektor. Rezultat toga je pUCaro-alb-B vektor. Kroz restrikciju enzimom EcoRI-NruI moguće fragment od 6548 parova baza ponovno klonirati u pGP704 vektor inkubiran EcoRI-EcoRV (Slika 3). Sljedeći koraci (replikacija i integracija u S. typhi Ty21a) odgovaraju gore opisanoj strategiji. Rezultirajući soj St21-alb-B eksprimira konstitutivno membranski fuzijski protein albumin-hlyA. Transficiranjem vektora s HlyD secernira se fuzijski protein albumin-HlyA. Plazmid koji služi za prenošenje beta-glukuronidaze temelji se na komercijalnom pCMVbeta vektoru (Clontech). Za konstrukciju je prvo potrebna upotrijebiti fuzija bglu gena s jednim signalom za izlučivanje. U ovom primjeru potrebno je upotrijebiti signalni peptid tPA prekursorske molekule. Taj signalni peptid dozvoljava jednu posebno efikasnu proizvodnje i izlučivanje fuzijskog proteina. Za kloniranje fuzije u prvom koraku će se umnožiti PCR-om 5’ UTR tPA cDNA (Gb E02027) do kraja područja koje kodira za signalni peptid. Upotrebljavaju se slijedeće početnice (umnažanje s tupo generiranom polimerazom):
5’: GCGGCCGCAGGGAAGGAGCAAGCCGTGAATTT
3’: AGCTTAGATCTGGCTCCTCTTCTGAATC
Nastali 166 parova baza fragment ligira se u komercijalno dostupan vektor pCDNA3 (Invitrogen) prethodno rezan s HindIII, a zatim inkubiran 5’-3’ egzonukleazom. Ligacija je pozitivne orijentacije. Na taj se način kodirajuće područje tPA signalne sekvence korištenjem NotI restrikcijskog enzima izrezuje iz nastalog pCDNAtp plazmida. Taj 237 parova baza fragment će se ligirati s 3760 parova baza fragmentom vektora pCMVbeta nakon restrikcije NotI (sadrži kostur vektora). Nastali pCMVtp plazmid (3972 parova baza) može se koristiti samo za ekspresiju heterolognog fuzijskog proteina). Da bi se konstruirao pCMV bglu plazmid potrebno je umnožiti, korištenjem SpeI konstruiranih početnica, jedan fragment bglu gena (Gb M15182) (bez sekvence za signalni peptid) iz jedne cDNA banke:
5’: ACTAGTCAGGGCGGGATGCTGTACCCCCAG
3’: ACTAGTCTTGCTCAAGTAAACGGGCTGTTTTC
Nakon rezanja SpeI enzimom 1899 parova baza veliki vektor ligira se u pCMVtp vektor također rezan sa SpeI. Rezultat toga je pCMVtp bglu plazmid koji kodira samo za jednu N-terminalnu fuziju tPA signalnog peptida s područjem zrelog proteina beta-glukuronidaze. Nakon uspostavljanja ispravnog stanja transformira se pCMVtp bglu plazmid (Slika 4) u St21-alb-B soj. Taj soj omogućava samo jedno prenošenje DNA na tkivo tumora, a ekspresija DNA kroz transficirane tumorske stanice omogućava pretvorbu predodređenog prolijeka.
Primjer 3: Konstrukcija jednog omotanog soja s fuzijom albumin-TolC sa stalnom membranskom ekspresijom vanstanične domene FAS-a i prijenos jednog enzima koji konvertira prolijek.
U ovom primjeru prikazan soj povezuje karakteristike opisane u primjeru 2 s jednim usmjerenim ciljanjem prema (tumorskim-) stanicama koje eksprimiraju Fas-ligand (FasL). Tim sojem je moguće napasti stanice s eksprimiranim FasL kao npr. određene tumore dojki (Herrnring i sur., Histochem Cell Biol 113: 189-194, 2000). Ekspresija FasL u tumorskim stanicama navodi se kao mogući mehanizam imunološkog bijega s obzirom da te aktivno napadnute i eksprimirajuće stanice uništavaju limfocite (Muschen i sur., J Mol Med 78: 312-325, 2000). Ovdje opisanim sojem moguće je ciljano napasti ove za terapiju problematične tumorske stanice te odmah potom ih odstraniti mehanizmom neovisnim o apoptozi. U ovom primjeru soj-nosač se temelji na jednoj fuziji albumina s TolC proteinom E. coli. Na taj se način omogućava stalna membranska ekspresija albumina. Stalna membranska ekspresija vanstanične domene Fas-a omogućena je preko pMOhlyDD plazmida, a za prenošenje se upotrebljava gore opisani pCMV-bglu plazmid. Prvi korak obuhvaća konstruiranje TolC-albumin eksprimirajućeg soja-nosača. Za to je prvo potrebno konstruirati gen za fuzijski protein i odmah potom se taj gen, odgovara gornjem primjeru, preko sukcesivnog kloniranja u pUCaroA’ i pGP704 integrira u genom Salmonella-e. TolC gen za E. coli nalazi se zajedno s prirodnim promotorom u pBRtolC plazmidu. Taj će se uz pomoć početnica konstruiranih sa SalI umnožiti iz pAX629 vektora (sadrži tolC gen, područje u vektoru odgovara Gb X54049 Pos. 18-1914):
5’ tol: TAACGCCCTATGTCGACTAACGCCAACCTT,
3’ tol: AGAGGATGTCGACTCGAAATTGAAGCGAGA
1701 fragment ligirati će se nakon SalI rezanja u SalI rezano mjesto pBR322 vektora (Gb J01749) pri čemu je prekinut tet gen. Na temelju poznate kristalne strukture TolC (Koronakis i sur., Nature 405: 914-919, 2000) unešena heterologna DNA omogućava, u jednostruko KpnI rezano mjesto u tolC genu, ekspresiju kodirajućeg heterolognog fuzijskog proteina u jednu vanstaničnu petlju vanjske membrane. Za ekspresiju albumina umnožava se gen albumina iz cDNA (Gb A06977) uz pomoć početnica konstruiranih KpnI:
5’: GGTACCCGAGATGCACACAAGAGTGAGG
3’: GGTACCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC
Nakon restrikcije 1779 baznih parova velikog fragmenta KpnI enzimom DNA se može ubaciti u KpnI rezani pBRtolC vektor. Suprotna orijentacija (u okvir čitanja tolC) rezultira pBRtolC-alb vektorom. Gen za fuziju tolC-albumin ligira se tada preko EcoRV i PshAI (fragment od 3970 bp) u suprotnu orijentaciju u HincII restrikcijsko mjesto vektora pUCaroA'. Nastali vektor pUCaro-alb-tol (7596 parova baza) će tada s HindIII biti lineariziran, s 5’-3’ egzonukleazom obrađen i potom rezan EcoRI enzimom. Fragment od 4961 parova baza biti će unesen u PGP704 vektor rezan EcoRI-EcoRV (Slika 5). Nakon konjugacije (tome odgovara primjer 1) nastaje soj St21-tol-alb. Tada je plazmid nosilac stalne membranske ekspresije Fas (CD95)-HlyA fuzijskog proteina uz pomoć HlyB komponente sekrecijskog mehanizma Tip I iz E. coli.. Za to se prvo umnožava dio odgovoran za vanstanično područje Fas gena (Gb: M67454) početnicama konstruiranim NsiI:
5’: ATGCATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGC
3’: ATGCATTAGATCTGGATCCTTCCTCTTTGC
477 parova baza veliki fragment reže se NsiI i unosi u okvir čitanja HlyA gena pMOhly DD vektora rezanog NsiI. Nastali pMO DD-fas vektor (Slika 6) producira, nakon transformacije u jedan soj Salmonella-e, jedan membranski Fas-fragment koji se nakon poprimanja odgovarajuće strukture veže na stanice s eksprimiranim FasL. Time se ove Salmonella-e usmjeruju na FasL eksprimirajuće stanice, kao npr. tumorske stanice.
Za usmrćenje tumorskih stanica s ekspresijom FasL-a će isto toliko pCMV bglu plazmida biti transficirano u Salmonella-e (Primjer 2). Time je, kao i u gornjem primjeru, nakon ekspresije beta-glukuronidaze kroz tumorske stanice moguća tumorska terapija prolijek-lijek. Bolja djelotvornost ovog primjera u odnosu na prethodni primjer ovisi o korektnom strukturiranju (nabiranju) vanstanične domene Fas-a. Umjesto Fas-a moguće je upotrijebiti FasL specifična monoklonalna antitijela na Fab-fragmente (koja se pravilno nabiru u bakterijama) na isti način kao što je ovdje već opisano. Taj primjer pokazuje da je pomoću ovih tehnika konstrukciju sojeva s željenom staničnom specifičnošću moguća i to upotrebom prilagođena specifičnim Fab fragmentima.

Claims (19)

1. Mikroorganizam, naznačen time, da su mu u genom unesene i eksprimirane sljedeće komponente su: I) jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za jedan direktni ili indirektni, antiproliferativni ili citotoksično djelujući ekspresijski produkt ili za više različitih takvih ekspresijskih produkata, II) jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za jedan protein krvne plazme pod kontrolom jedne u mikroorganizmu aktivirajuće aktivne sekvence ili konstitutivno aktivne, III) izborno, jedna nukleotidna sekvenca koja kodira za stanično specifičan ligand pod kontrolom jedne u mikroorganizmu aktivirajuće aktivne sekvence ili konstitutivno aktivne, IV) jedna nukleotidna sekvenca za jedan transportni sustav koji djeluje na ekspresiju ekspresijskog produkta komponente I) i II) kao izborno i III) na vanjskoj površini mikroorganizma ili na izlučivanje ekspresijskog produkta komponente I) i ekspresiju komponente II) kao i izborno komponente III) i prvenstveno je konstitutivno aktivna, V) izborno jedna nukleotidna sekvence za jedan protein za lizu mikroorganizma u citosolu stanica sisavaca i za unutarstanično oslobađanje plazmida s najmanje jednom ili više komponenata I) i VI) koje se nalaze u liziranom mikroorganizmu, i VI) jedna u mikroorganizmu aktivirajuća i/ili jedne tkivno specifična, tumor specifična, funkcionalno specifična ili nestanično specifična aktivirajuća sekvenca za ekspresiju komponente I), pri čemu komponente I) do VI) mogu biti jednostruko ili višestruko, kao i isto ili različito namještene.
2. Mikroorganizam prema zahtjevu 1, naznačen time, da je mikroorganizam virus, bakterija ili jednostaničan parazit.
3. Mikroorganizam prema zahtjevu 1 ili 2, naznačen time, da je virulentnost mikroorganizama smanjena.
4. Mikroorganizam prema jednom od zahtjeva 1 do 3, naznačen time, da je mikroorganizam gram-pozitivna ili gram-negativna bakterija.
5. Mikroorganizam prema jednom od zahtjevu 1 do 4, naznačen time, da je izabran iz grupe sastavljene od “Escherichia coli, Salmonella, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes i Schigella”.
6. Miroorganizam prema jednom od zahtjeva 1 do 5, naznačen time, da je mikroorganizam omotač bakterije.
7. Mikroorganizam prema jednom od zahtjeva 1 do 6, naznačen time, da komponenta I) kodira za najmanje jedan protein, izabran iz grupe sastavljene od “interferona; interleukina; proapoptotičkih proteina, antitijela ili fragmenata antitijela, koji zaustavljaju ili su citotoksični za jednu imunološku stanicu, za jednu stanicu tumora ili za stanice tkiva od kojeg tumor potječe; antiproliferativno djelujući proteini; citotoksični proteini; inicijatori upale, posebice interleukini, citokini ili kemkini; enzima koji potječu od virusa, bakterija, jednog kvasca, jednog mekušca, jednog sisavca ili čovjeka za aktiviranje ili cijepanje jednog inaktivnog predoblika jednog citostatika u citostatik; fuzijskih produkata iz jednog stanično specifičnog liganda i jednog enzima; i inhibitora angigeneze”.
8. Mikroorganizam prema jednom od zahtjeva 1 do 7, naznačen time, da komponenta II) kodira za najmanje jedan protein krvne plazme izabran iz grupe sastavljene od “albumina, transferina, heptoglobina, hemoglobina, alfa1 lipoproteina, alfa2 lipoproteina, β1 lipoproteina i alfa2 makroglobulina”.
9. Mikroorganizam prema jednom od zahtjeva 1 do 8, naznačen time, da komponenta III) kodira za najmanje jedan ligand specifičan za jedan ciljani organizam izabran iz grupe sastavljene od “tumorskih stanica; tumorskih endotelnih stanica; stanica tkiva, od kojih tumor potječe; aktivirajućih endotelnih stanica; makrofaga; dendritičnih stanica; i limfocita”.
10. Mikroorganizmi prema jednom od zahtjeva 1 do 9, naznačen time, da je komponenta III) kodira za najmanje jedan ligand specifičan za jednu vrstu stanicu tkiva iz tkiva izabranog iz jedne grupe sastavljene od “štitne žlijezde, prsne žlijezde, žlijezde slikovnice, limfne žlijezde, želučane ovojnice, bubrega, jajnika, prostate, maternice, sluznice mokraćnog mjehura i madeža”.
11. Mikroorganizam prema jednom od zahtjeva 1 do 10, naznačen time, da komponenta IV) kodira za hemolizinski transportni sustav Escherichia coli, S-layer (Rsa A) protein Caulobacter crescentus, i/ili TolC protein Escherichi coli.
12. Mikroorganizam prema jednom od zahtjeva 1 do 11, naznačen time, da komponenta V) kodira za litički proteine iz Listeria monocytogenes, za PLY551 iz Listeria monocytogenes i/ili za holin iz Listeri monocytogenes.
13. Mikroorganizam prema jednom od zahtjeva 1 do 12, naznačen time, da je na njega vezana tvar koju karakterizira produženo vrijeme cirkulacije u krvi, posebice najmanje jedna tvar izabrana iz grupe sastavljene od “albumina, transferina, prealbumina, hemoglobina, haptoglobina, alfa-1-lipoproteina, alfa-2-lipoproteina, β-1-lipoproteina, alfa-2-makroglobulina, polietilenglikola (PEG), konjugata PEG-a s prirodnim ili sintetičkim polimerima, kao npr. s polietilenimin, dekstran, poligelin, hidroksietilni škrob i smjese tih spojeva” pri čemu se vezanje tvari događa kroz fizičku apsorpciju, kemijsku apsorpciju ili kovalentno.
14. Plazmid ili ekspresijski vektor, naznačen time, da sadrži komponente I), II), IV) i VI) kao i izborno jednu ili više komponenata III) i V).
15. Postupak za konstruiranje jednog od organizama prema zahtjevima 1 do 13, naznačen time, da je plazmid konstruiran prema zahtjevu 14 i s tim plazmidom je transformiran mikroorganizam.
16. Upotreba jednog mikroorganizma prema jednom od zahtjeva 1 do 13, naznačen time, da služi za proizvodnju farmaceutskog pripravka.
17. Upotreba jednog mikroorganizma, naznačena time, da služi za proizvodnju farmaceutskog pripravka za profilaksu i/ili terapiju jedne bolesti koja je uzrokovana nekontroliranom diobom stanica, posebice jedne tumorske bolesti, kao npr. karcinoma prostate, karcinoma jajnika, karcinoma dojke, karcinoma želuca, tumora bubrega, tumora štitnjače, melanoma, tumora maternice, tumora mokraćnog mjehura, tumora žlijezde slikovnice i/ili tumora limfne žlijezde, leukemije, upale, odbacivanja organa, i/ili autoimune bolesti.
18. Upotreba prema zahtjevu 17, naznačena time, da služi za odstranjenje tumora kao i zdravog tkiva od kojeg tumor potječe.
19. Postupak za pripravljanje jednog farmaceutskog pripravka prema jednom od zahtjeva 16 do 18, naznačen time, da je omotani mikroorganizam napravljen prema jednom od zahtjeva 1 do 13 u fiziološki djelotvornim dozama s jednim ili više fiziološki podnošljivim spojevima-nosačima za oralno, intramuskularno, intravenozno ili intraperitonalno davanje.
HRP20040832 2002-02-14 2004-09-14 Microorganism for genetic therapeutic treatment of proliferative diseases HRP20040832A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10206325A DE10206325A1 (de) 2002-02-14 2002-02-14 Ummantelter Mikroorganismus
PCT/DE2003/000470 WO2003068954A2 (de) 2002-02-14 2003-02-13 Mikroorganismus zur gentherapeutischen behandlung proliferativer erkrankungen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20040832A2 true HRP20040832A2 (en) 2004-12-31

Family

ID=27674670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HRP20040832 HRP20040832A2 (en) 2002-02-14 2004-09-14 Microorganism for genetic therapeutic treatment of proliferative diseases

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20050244374A1 (hr)
EP (1) EP1474519A2 (hr)
JP (1) JP2005517405A (hr)
KR (1) KR20040103941A (hr)
CN (1) CN1646693A (hr)
AU (1) AU2003206663B2 (hr)
BR (1) BRPI0307722A2 (hr)
CA (1) CA2513198A1 (hr)
DE (2) DE10206325A1 (hr)
HR (1) HRP20040832A2 (hr)
IL (1) IL163553A0 (hr)
MX (1) MXPA04007934A (hr)
NO (1) NO20043800L (hr)
NZ (1) NZ535310A (hr)
PL (1) PL372901A1 (hr)
RS (1) RS72404A (hr)
RU (1) RU2004127459A (hr)
WO (1) WO2003068954A2 (hr)
ZA (1) ZA200407358B (hr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005260697B2 (en) * 2004-06-29 2011-10-06 Anticancer, Inc. Cancer selective auxotrophs
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
US11519007B2 (en) 2019-02-22 2022-12-06 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Tumor-navigating, self-eradicating, trail-armed salmonella for precision cancer therapy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19720761A1 (de) * 1997-05-07 1998-11-12 Schering Ag Verfahren zur Synthese und Sekretion von zur Kontrazeption geeigneter Proteine oder Proteinfragmente durch attenuierte Salmonellen oder einen anderen Gram-negativen attenuierten Impfstamm zur Erzeugung einer oralen Vakzinierung

Also Published As

Publication number Publication date
PL372901A1 (en) 2005-08-08
NO20043800L (no) 2004-11-08
US20050244374A1 (en) 2005-11-03
WO2003068954A2 (de) 2003-08-21
AU2003206663B2 (en) 2007-11-01
WO2003068954A8 (de) 2005-10-13
JP2005517405A (ja) 2005-06-16
WO2003068954A3 (de) 2003-10-16
MXPA04007934A (es) 2005-11-23
KR20040103941A (ko) 2004-12-09
BRPI0307722A2 (pt) 2017-07-04
ZA200407358B (en) 2005-11-18
CN1646693A (zh) 2005-07-27
CA2513198A1 (en) 2003-08-21
EP1474519A2 (de) 2004-11-10
AU2003206663B9 (en) 2003-09-04
AU2003206663A1 (en) 2003-09-04
RS72404A (en) 2006-12-15
DE10390506D2 (de) 2005-01-13
RU2004127459A (ru) 2005-05-10
IL163553A0 (en) 2005-12-18
NZ535310A (en) 2008-04-30
DE10206325A1 (de) 2003-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11104916B2 (en) Compositions and methods for alphavirus vaccination
JP2005531507A (ja) ストローマ細胞前駆体による抗癌物質の局所的な産生および／または送達方法
US20080187520A1 (en) Tool for the transfer and production of proteins using the pseudomonas type III secretion system
JP2004500042A (ja) エフェクター分子の腫瘍標的送達のための組成物および方法
JPH08510911A (ja) 遺伝子治療に適するプラスミド
JP2000503004A (ja) 化合物を細胞に輸送するための毒素ペプチドおよび／またはアフィニティハンドルの使用
JPWO2011093467A1 (ja) 形質転換用プラスミド
JP2015506697A (ja) １２量体ｔｒａｉｌ及びｈｓｖ−ｔｋ自殺遺伝子を同時に発現するベクター並びにそれを用いた抗癌幹細胞治療剤
Li et al. Messenger RNA-based therapeutics and vaccines: what’s beyond COVID-19?
EA011282B1 (ru) Бактериальные упаковывающие штаммы, используемые для генерирования и продуцирования рекомбинантных нуклеокапсидов с двухцепочечной рнк, и их применение
US20090011036A1 (en) Drug containing hollow protein nanoparticles of particle-forming protein, fused with disease-treating target-cell-substance
US20060105423A1 (en) Microorganisms as carriers of nucleotide sequences coding for cell antigens used for the treatment of tumors
AU2003206663B2 (en) Microorganism for genetic therapeutic treatment of proliferative diseases
JP2006502726A (ja) 改善された免疫療法
Green et al. Immune enhancement of nitroreductase‐induced cytotoxicity: Studies using a bicistronic adenovirus vector
US20220249647A1 (en) Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and dihydropyrimidine derivatives as capsid assembly modulators
Wu et al. Functional Nucleic Acid-Based Immunomodulation for T Cell-Mediated Cancer Therapy
Barnes et al. Current strategies in gene therapy for ovarian cancer
CN113144181B (zh) 一种靶向b7h3的dna疫苗、制备方法及应用
EP1468076B1 (en) AroQ-deficient Bordetella strain and uses thereof
JP2023527910A (ja) 多用途かつ効率的な遺伝子発現のためのｒｎａレプリコン
WO2024113419A1 (zh) 一种具有肿瘤微环境响应的乳酸杆菌载体及应用
Sherr et al. SESSION I: TUMOUR BIOLOGY AND ANTI-TUMOUR IMMUNITY
MUKKUR Patent 2475993 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
ARAI Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application
PPPP Transfer of rights

Owner name: ZENTARIS GMBH, DE

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20080211

Year of fee payment: 6

OBST Application withdrawn