KR20040075993A - 류마티스 관절염에 대한 치료효과가 우수한 자하거 추출물및 그를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한약재의 일종으로서 사람의 태반을 건조시킨 자하거(紫河車, Hominis Placenta)의 열탕, 또는 유기 용매 추출의 방법으로 제조되며, 만성자가면역질환인 류마티스 관절염의 치료에 효과적인 자하거 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 자하거 추출물은 고순도 반복 정제 후, 환부의 특정부위에 미량 주입되어 난치성 만성질환인 류마티스의 병리증상을 신경 행동학적, 면역학적, 분자생물학적 기전을 통해 억제함으로써 우수한 류마티스 치료효과를 나타낼 뿐 아니라 전통적으로 사용되어 온 한방약재를 사용함으로써 인체에 안전하고 부작용을 최소화할 수 있어 항 자가면역성 의약품과 기능성 식품 및 생활용품에 다양하게 이용될 수 있다.

Description

류마티스 관절염에 대한 치료효과가 우수한 자하거 추출물 및 그를 포함하는 약제학적 조성물 {Hominis Placenta extracts showing a good therapeutic effect on rheumatoid arthritis and pharmaceutical compositions containing the same}

본 발명은, 류마티스 관절염에 대해 치료효과가 우수한 자하거 (紫河車) 추출물 및 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 류마티스 관절염은 대표적인 만성 염증성 자가 면역 질환이다. (Lee YH etal., Expression of cyclooxygenase-1 and -2 in rheumatoid arthritis synovium. J Korean Med Sci. 2000, 15: 88-92; Woods JM etal., IL-4 adenoviral gene therapy reduces inflammation, proinflammatory cytokines, vascularization, and bony destruction in rat adjuvant-induced arthritis. J Immunol. 2001, 166(2): 1214-1222; Kwon YB etal., Bee venom injection into an acupuncture point reduces arthritis associated edema and nociceptive responses. Pain. 2001, 90(3): 271-280; de Hooge AS etal., Involvement of IL-6, apart from its role in immunity, in mediating a chronic response during experimental arthritis. Am J Pathol. 2000, 157(6): 2081- 2091).

류마티스 관절염이 발병되면 여러 가지 염증 세포의 침윤과 관절 내의 만성 염증 반응이 일어나고 pannus의 형성으로 인하여 연골조직의 파괴와 관절 뼈조직의 부식 및 변형을 초래하게 된다 (Cai L et al., Pathways by which interleukin 17 induces articular cartilage breakdown in vitro and in vivo. Cytokine. 2001, 16(1): 10-21).

류마티스 관절염의 원인은 아직까지 정확하게 규명되지 않았으나, 어떤 항원 물질에 대한 생체 면역 반응의 결과 생산되는 cytokine을 비롯한 주요 면역 반응 매개 물질의 작용에 의해 지속적인 염증 반응이 나타남으로써 연골조직이 손상되고 뼈의 손상을 가져와 관절 기능을 제대로 할 수 없게 되는 것으로 알려져 있다 (Feldmann M etal., Role of cytokines in rheumatoid arthritis. Annu Rev Immunol. 1996, 14: 397-440).

특히, TNF- , IL-1 그리고 IL-6와 같은 염증성 cytokine이 염증 반응 및 관절 손상에 주요 역할을 하는 것으로 보고되어 있고 실제로 류마티스 관절염이 유발된 환자들의 관절 부위에서 많이 발견된다. 관절 내 뼈의 손상은 pannus의 침습에 의하여 일어난다 (de Hooge AS etal., Involvement of IL-6, apart from its role in immunity, in mediating a chronic response during experimental arthritis. Am J Pathol. 2000, 157(6): 2081- 2091; Cai L et al., Pathways by which interleukin 17 induces articular cartilage breakdown in vitro and in vivo. Cytokine. 2001, 16(1): 10-21; Feldmann M etal., Role of cytokines in rheumatoid arthritis. Annu Rev Immunol. 1996, 14: 397-440). Pannus는 여러 가지 염증 세포들의 덩어리로 연골을 파괴시키고 이어 연골하골을 손상시켜 관절의 변형을 가져오며 관절 주위에 있는 뼈 또한 약화시킨다 (Burr DB, The importance of subchondral bone in osteoarthrosis. Curr Opin Rheumatol. 1998, 10(3): 256-262).

Adjuvant 관절염 동물모델은 류마티스 관절염의 공인된 동물모델 중의 하나로 항염작용에 대한 실험에 많이 이용되고 있으며 관절의 부종, 몸무게의 감소와같은 임상적 증상은 물론, 면역세포의 침윤과 활액막 세포의 활성화 등과 같은 조직학적 변화에 있어 인간의 류마티스 관절염과 유사한 병증을 보인다 (Woods JM etal., IL-4 adenoviral gene therapy reduces inflammation, proinflammatory cytokines, vascularization, and bony destruction in rat adjuvant-induced arthritis. J Immunol. 2001, 166(2): 1214-1222; Leech M et al., Regulation of macrophage migration inhibitory factor by endogenous glucocorticoids in rat adjuvant-induced arthritis. Arthritis Rheum. 2000, 43(4): 827-833).

현재 류마티스 관절염에 대한 가장 보편적인 치료 방법은 비스테로이드성 소염제 및 항류마티스 약제 등의 이용이다. 비록 이러한 약물의 이용은 통증을 완화시키고 염증을 억제하며 관절의 기능 소실을 최소화하는 효과를 나타내고 있으나 여러 장기의 기능 저하, 우울증, 세균감염 등의 심각한 부작용이 발생할 수 있다 (Burr DB. The importance of subchondral bone in osteoarthrosis. Curr Opin Rheumatol. 1998, 10(3): 256-262; Scott DL et al., The clinical management of rheumatoid arthritis and osteoarthritis: strategies for improving clinical effectiveness. Br J Rheumatol. 1998, 37(5): 546-554). 따라서 부작용이 적고 안전성이 높은 더욱 효과적인 류마티스 관절염 치료법의 지속적 개발이 요구되고 있다.

본 발명에서 사용한 한약재 추출 정제액의 주입에 의한 병증 치료법은 한약재 추출물의 고순도 반복 정제 후, 환부의 특정부위(경혈점, acupoint)에 미량 주입됨으로써 전통적 침치료 효과와 약물의 효과를 동시에 기대할 수 있는 새로운 한의학적 치료법으로 자하거의 경우, 난치성 만성질환인 류마티스의 병리증상을 신경 행동학적, 면역학적, 분자생물학적 기전을 통해 억제함으로써 우수한 류마티스 치료효과를 나타낼 뿐 아니라 전통적으로 사용되어 온 한방약재를 사용함으로써 인체에 안전하고 부작용을 최소화할 수 있어 항 자가면역성 의약품과 기능성 식품 및 생활용품에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명은 한약재의 일종으로서 사람의 태반을 건조시킨 자하거(紫河車, HominisPlacenta)의 열탕, 또는 유기 용매 추출의 방법으로 제조되며, 만성자가면역질환인 류마티스 관절염의 치료에 효과적인 자하거 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

도1은 adjuvant-induced arthritis (AIA)가 유발된 흰쥐 무릅 관절 부위의 시간에 따른임상적 양상을 보여준다. 류마티스 관절염의 대표적인 동물 모델인 AIA는 squalane에 유화시킨 MycobacteriumtuberculosisH37RA를 흰쥐의 꼬리 기저부에 피내 주사하여 유발시킨다. 주사 후 제 10-11일부터 대부분 (90-100%)의 흰쥐에서 그림에서와 같은 홍반 및 부종 등의 임상 증상이 나타났다.

도2는 AIA 흰쥐의 몸무게에 대한 자하거 추출 정제액 주입의 영향을 나타나며 자하거 치료군 (HP/Z)의 몸무게 감소가 유의적으로 억제됨을 보였다.

도3은 AIA 흰쥐의 부종에 대한 자하거 추출 정제액 주입의 영향을 나타내며 치료군(HP/Z)의 부종의 증가율이 유의적으로 감소됨을 보였다.

도4는 AIA 흰쥐의 관절염 지표 (arthritis index, AI)에 대한 자하거 추출 정제액 주입의 효과를 나타내며. 치료군(HP/Z)의 관절염 지표의 증가율이 감소됨을보였다.

도5는 관절염 유발 후, 제 25일째에 AIA 유발 흰쥐 관절의 조직학적 양상을 나타내며 Hematoxyline-Eosin (H-E) 염색을 통해 AIA 흰쥐의 관절 조직 부위에 많은 세포(파골세포로 추정)가 침윤되었음을 보였다. 치료군(HP/Z)의 경우, 세포 침윤 양상이 뚜렷이 억제됨을 보인다.

도6은 관절염 유발 후 제 25일째에 대표적 세포 내 염증성 인자인 tumor necrosis factor- (TNF- ), interleukin-1 (IL-1 ) 및 interleukin 6 (IL-6)의 mRNA 발현 양상을 나타내며 치료군(HP/Z)에서 각 인자의 mRNA 발현량이 현저히 감소됨을 보였다.

도7은 관절염 유발 후 제 25일째에 무릎의 연골하골 (subchondral bone) 부위에서의 TNF- , IL-1 및 IL-6 단백질 발현의 면역조직화학적 양상을 나타내며 치료군(HP/Z)에서 각 인자의 단백질 발현량이 현저히 감소됨을 보였다.

본 발명은 이러한 목적을 달성하기 위하여 자하거를 정제·추출하여 얻은 자하거 추출물 및 약학적으로 허용되는 자하거 추출 유효성분의 약제학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어 자하거 고순도 추출물의 제조방법은 자하거를 증류수와 혼합한 후, 섭씨 80∼100 로 가열하며, 다시 증류하여 70∼90% 증류수를 얻어 여과지로 여과한 후 중탕하여 얻는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 자하거를 증류수와 혼합하여 가열 및 증류하여 여과 및 중탕하여 얻어진 자하거 추출물 유효성분의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 유효성분의 자하거 추출물은 한의학적 치료에 사용되는 약침에 의해 투여되는 약침액으로 사용될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 유효성분의 자하거 추출물을 관절 내의 염증 유발시 관절 내로의 세포 침윤을 억제하는 약제학적 조성물로 제공한다.

본 발명은, 만성자가면역질환 중 대표적인 류마티스 관절염의 치료약물로 사용되고 있는 약침제재의 효능을 검증하고자 AIA 동물모델을 이용하여 류마티스 관절염에 의한 염증 반응 및 부종·발적 등에 유용다고 생각되는 자하거 약침액의 효과를 각종 임상적 지표와 역전사 연쇄중합반응 (RT-PCR), 면역조직화학적기법 (immunohistochemistry)을 이용하여 살펴보았다.

본 발명에 사용된 약물 주입요법은 질병 치료에 효과적인 한약재를 선정하여 유효성분을 반복 추출한 후, 해당 질병에 가장 효과적인 경혈(經穴)에 주입하는 방법으로 약침요법이라고도 한다.

약침요법은 본초학과 침구학을 결합시킨 신침 요법으로, 침치료 작용과 한약물의 작용을 동시에 적용함으로써 치료효과를 극대화한다.

특히 이 기법은 내복약이 갖는 소화흡수 과정에서의 장시간 소요, 유효성분의 소실, 복용 후 위장장애 등의 부작용, 복용의 어려움 등을 극복하고 극소량의 고순도 약물로 경락·경혈을 자극함으로서 약침의 기운이 내장의 병소에 직접 전달되어 최대의 효과를 볼 수 있으며 내성, 중독성, 습관성 등의 부작용이 없다는데 그 의의가 있다.

본 발명에 사용된 자하거 (紫河車, Hominisplacenta)는 한약의 보약 (益氣, 養血, 補精) 중의 하나로 사람의 태반을 건조한 것이다. 자하거에는 간세포증식인자(HGF), 상피세포증식인자(EGF), 신경세포증식인자(NGF), 콜로니 형성자극인자(CSF), 각종 interleukin과 interferon 등 각종 세포증식인자가 있는 것으로 밝혀져 있고, 아울러 혈액응고인자와 성선자극호르몬, prolactin, 갑상선 자극 호르몬, 스테로이드 호르몬, prostaglandin과 함께 lysozyme, kininase, histaminase 등과 같은 효소류, erithropoietin, 인지질 및 각종 다당류 등도 함유하고 있다 (이상길 et al., 자하거 약침제제에 관한 고찰, 대한약침학회지, 2000, 17(1) 67-74).

본 발명의 자하거 고순도 추출액을 주입한 AIA 유발 흰쥐 관절 부위는 한의학 경혈중의 하나로 족삼리(ST36)이라 불리며 슬개골 바깥쪽 무릎 아래 약 10Cm 부분에 위치하고 있고 위장과 관계가 깊은 혈위로 알려져 있다. 주요 효능은 소화불량, 입안 염증, 복막염, 팔다리 노곤할 때, 신경성 다리 통증, 눈병, 노이로제, 고혈압, 상중하초병 등의 치료에 주로 사용된다 (김성민 외, 합곡과 족삼리에서 체침과 화침의 뇌혈류에 미치는 효과 비교, 제 38차 대한핵의학회 추계학술대회 포스터, 대한핵의학회, 1999).

Ⅰ. 실 험 방 법

1. 실험동물

체중 120g 가량의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐로서 고형 사료 (신촌사료; 小동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 7일 동안 적응시킨 후 사용하였다. 실험 시작 시, 몸무게는 120∼140g이었으며 4∼5마리씩 개별 cage에 수용하였다. 주야 조명 주기는 12시간 (조명상태; 08:00∼20:00, 소등상태; 20:00∼08:00)으로 하여 충분한 먹이와 물을 공급하였다.

2. 약침액 및 약침 주입기

본 발명에 사용된 자하거 추출액은 고순도 유지를 위해 열탕 추출과정을 반복하여 증류시킨 것으로 대한약침학회의 도움을 얻어 제조하였다. 약물 주입기는 1.0ml의 1회용 주사기(26gauge, 동신메디텍, 한국)를 사용하였다.

3. 관절염 유발

Santos14), Leech13) 등의 방법에 따라 squalane에 유화시킨 1.5 mg의 MycobacteriumtuberculosisH37RA를 흰쥐의 꼬리 기저부에 피내 주사하였다. 정상군은 동량의 멸균된 증류수를 동일한 방법으로 주사하였다.

4. 실험군 분류 및 약침액의 투여

흰쥐를 1군 당 4-5 마리로 하여 관절염을 일으키지 않은 정상군, 관절염을 유발한 후 아무런 처치를 하지 않은 대조군, 족삼리(ST36) 혈위에 자하거 추출액을 처치한 치료군 (HP/Z군), 비혈위에 자하거 추출액을 처치한 군 (HP/B군)으로 나누었다. 실험군은 관절염 유발 후 증후가 나타난 11일째에 증후의 정도에 따라 동물을 선발하여 분류함으로써 자하거 치료 시작시 각 군 당 발병 정도가 유사하게 하였다. 자하거 추출액의 투여 혈위는 족삼리를 선정하였고, 그 위치는 인체와 해부학적으로 상응하는 부위로 양쪽 무릅에서 취혈하였으며 비혈위는 꼬리 기저 부위 임의점의 피하 주사하였다. 치료는 임상적 발병이 시작된 11일부터 25일까지 총 15일간 1일 1회 0.1ml씩 주입하였다. 정상군과 대조군은 족삼리 양측에 동량의 식염수를 주입하였다.

5. 임상적 측정

1) 몸무게

관절염 유발 직후부터 실험 종료 일까지 체중계를 이용하여 3-4일 간격으로 측정하였다.

2) 뒷다리 부종

관절염 유발 직후부터 실험 종료 일까지 Water Displacement Plethysmometer (UGO BASIL, Italy)를 이용하여 양쪽 뒷발바닥의 용적을 측정하였다. 각각 3회씩 측정한 후 평균값을 사용하였다.

3) 관절염 지표(arthritis index)

관절염 유발 직후부터 실험 종료 일까지 관절 주위의 부종이나 발적 등 임상적 관절염의 증후에 대하여 관찰하였다. 관절염 지표는 아래 기준으로 채점되었고 각 동물 당 최고 점수는 16점 (4점×4肢)이 부여되었다.

0 = no swelling or erythema

1 = slight swelling and/or erythema

2 = low to moderate edema

3 = pronounced edema with limited joint usage

4 = excess edema with joint rigidity

6. 유전자 발현 변화 양상의 측정

1) RNA의 정제

관절염 유발 후 25일째 되는 날에 흰쥐의 뒷다리로부터 피부와 근육조직을 제거하고 슬관절을 추출하여 즉시 액체질소에 얼린 후 -80 에 보관하였다. total RNA는 TRIzolTM (GIBCO BRL, MD, USA)을 사용하여 흰쥐의 슬관절로부터 추출하여 분광분석기로 260nm에서 정량한 후 -80 에서 보관하였다.

2) 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)

3 g의 total RNA를 65 에서 15분 동안 변성시킨 후, 200U의 MuLV reverse transcriptase (GIBCO BRL, MD, USA)을 이용하여 최종 부피가 25 l인 반응 혼합액에서 역전사 반응을 수행하여 cDNA mixture를 얻었다. cDNA는 10mM Tris-HCl (pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.2mM dNTP, 0.4mM의 각 primer와 0.5U의Taqpolymerase (TaKaRa, Shiga, Japan)을 포함하는 20 l의 반응 혼합액에서 PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research, Waltham, MA, USA)를 사용하여 증폭되었다. 각각의 primer는 Genbank에 기록된 염기서열을 토대로 적당한 부위를 선택하여 제작하였으며 각각의 염기서열은 아래와 같다.

① GAPDH

forward 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3'

reverse 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'

② TNF-

forward 5'-GTCGTAAACCACCAAGC-3'

reverse 5'-GACTCCAAAGTAGACCTGCCC-3'

③ IL-1

forward 5'-GGCATAACAGGCTCATCTGG-3'

reverse 5'-CATCATCCCACGAGTCACAG-3'

④ IL-6

forward 5'-CCACTGCCTTCCCTACTTCA-3'

reverse 5'-TGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3'

각각의 증폭반응의 조건은 다음과 같다. GAPDH는 94 30초, 58 30초, 72 45초의 반응주기를 30회 반복하였고 TNF- 와 IL-1 는 94 45초, 58 45초, 72 90초의 반응주기를 35회 반복하였으며 IL-6는 94 60초, 63 60초, 72 120초의 반응주기를 40회 반복하였다. 증폭된 DNA는 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. gel상의 band intensity는 ImageMaster TotalLab (Amersham Biosceinces, Piscataway, NJ)을 이용하여 분석하였고 내부 표준물질로 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 이용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하였다.

7. 조직 검사

1) 조직절편의 slide 제작

모든 동물은 sodium pentobarbital로 마취한 후 식염수와 인산염 완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)에 녹인 4% paraformaldehyde(PFA)용액으로 관류고정하였다. 슬관절을 적출하여 4% PFA에 담가서 4 에서(decalcification) 12∼16시간 동안 후고정하였다. 고정된 슬관절 조직은 PBS에 녹인 10% EDTA 용액에서 4-5주간 탈회하였다. 탈회된 슬관절은 70%, 80%, 90%, 95%, 100% ethanol을 이용하여 탈수하고 xylene으로 투명하고 paraffin용액으로 침윤시킨 후 paraffin으로 포매한다. 조직은 10 m 두께로 saggital section을 만들어 poly-L-lysine-coated slide에 올려놓았다.

2) 조직 염색

HE (hematoxylin-eosin) staining은 보편적인 염색 방법을 적용하였다. 각 절편은 탈paraffin시킨 후, 100%, 90%, 80%, 70% 단계별 ethanol로 함수시키고 Harris hematoxylin 용액에 7분간 염색한 뒤 1% HCl acohol 용액과 ammonia로 침적시킨 다음, eosin 용액으로 30초간 염색하였다. 70%, 80%, 90%, 95%, 100% ethanol을 이용하여 순차적으로 탈수시킨 후 xylene으로 투명화한 뒤 봉입하여 현미경으로 관찰하고 사진을 촬영하였다.

3) 면역조직화학법

면역조직화학법 (immunohistochemistry, IHC)은 vector avidin-biotincomplex (ABC) kit (Vector, CA, USA)와 diaminobenzidine (DAB)을 이용하여 실시하였다. 조직절편은 탈 paraffin 하고 함수한 후, tween-20을 포함한 tris-buffered saline 용액(TBST)으로 세척하였다. 0.3% 과산화수소를 포함한 TBST에 30분간 반응시켜 내재성 peroxidase를 비활성화시키고, 10% goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA) 용액과 반응시켜 비특이적 결합을 제거하였다. rabbit polyclonal anti-rat TNF- (1:500 dilution; Endogen, Woburn, MA, USA), rabbit polyclonal anti-rat IL-1b (1:500 dilution; Endogen, Woburn, MA, USA) 또는 rabbit polyclonal anti-rat IL-6 (1:500 dilution; Santa Cruz biotech, Santa Cruz, CA, USA)의 1차 항체용액으로 4 에서 하루 밤 동안 반응시켰다. TBST로 세척 후에 biotinylated anti-rabbit IgG 2차 항체 용액에서 1시간 반응시키고 Vectastain Elite ABC reagent (Vector, Burlingame, CA, USA)로 실온에서 1시간 반응 후 발색제 DAB으로 상온에서 발색한 후 TBST로 세척하여 발색을 중지시켰다. 발색이 끝난 조직은 ethanol로 탈수하고 xylene으로 투명화시킨 뒤 봉입하여 광학현미경의 관찰하고 사진을 촬영하였다.

8. 통계분석

실험군 중 두 군간의 비교는 ANOVA test로 검증하였고 p 값이 0.05 이하인 경우에 두 실험군 간에 유의한 차이가 있는 것으로 인정하였다.

Ⅱ. 실 험 결 과

대부분의 동물 (90-100%)에서 관절염이 유발되었다. 관절 주위의 부종, 홍반 등의 임상적 양상은 관절염 유발 후 10-11일부터 나타났다. 도1은 유발 후 17일로 가장 극심한 부종과 발적이 관찰되었다.

1. 임상적 지표의 변화

체중, 다리 부종, 관절염 지수를 류마티스 관절염에 대한 임상적 지표로 선정하였다.

1) 체중

체중의 변화를 도2에서 나타내었다. 정상군의 몸무게는 계속 증가하였다. 대조군의 경우 관절염의 임상적 증후가 나타나기 전까지는 증가하다가 증후가 보이기 시작한 11일 이후부터는 감소하기 시작하였다. 족삼리에 자하거 추출액을 처치한 HP/Z군 역시 관절염의 증후가 보인 이후부터 몸무게가 감소하였으나 그 감소율이 대조군에 비하여 현저히 낮았으며 제 17-18일 이후부터는 증가하기 시작했다. 비혈위에 자하거를 주사한 HP/B 군의 경우 그 양상이 대조군과 매우 유사하게 나타났다.

2) 부종

도3에서는 부종의 변화를 나타내었다. 정상군의 경우 관절 부위의 변화가 없었다. 반면 대조군과 HP/B군에서는 관절 부위의 부종이 관절염 유발 후 제 11일부터 나타나서 급격히 증가하여 제 17일에 최고조에 도달하였고 이후 계속 지속되었다. 이에 비해 HP/Z군 또한 제 10일부터 관절 부위의 부종이 시작되었으나 그 증가율이 대조군과 HP/B군에 비하여 비교적 낮았으며 제 17일 이후부터는 서서히 감소하기 시작하였다.

3) 관절염 지수

관절염 지수의 경향(도4)은 부종의 경향과 유사하였다. 대조군과 HP/B군의 관절염 지수는 제 11일부터 급격히 증가하여 실험 종료 시에는 대부분의 동물들이 최고 점수인 16점에 도달하였다. HP/Z군은 자하거 추출물 처치 초반에는 대조군이나 HP/B군과 비슷하게 관절염 지수가 증가하였으나 제 14일 이후부터 그 증가율이 낮아져 실험 종료 시에는 점수 자체가 감소하였다.

4. 관절 내 조직학적 비교

H-E staining을 통해 각 실험군 간의 조직학적 비교를 하였다 (도5). 정상군의 연골 표면이 매끄러운 반면 대조군의 경우는 연골 및 뼈의 파괴를 일으키는 pannus와 관절 내 뼈의 부식이 관찰되었다(도5 A, B). HP/Z군의 연골층이 확대되었으나 그 표면은 매끄러웠고 pannus의 형성도 보이지 않았다 (도5 C). 또한 정상군과 HP/Z군에 비하여 대조군의 관절 내의 연골과 활액막 (synovial membrane)에서 많은 침윤 세포가 관찰되었다 (도D, E, F).

5. 슬관절 내의 TNF- , IL-1 및 IL-6 mRNA 발현

transcription 수준에서의 발현 양상을 관찰하기 위해서 RT-PCR을 이용하여 전체 관절 내의 TNF- , IL-1 , IL-6 mRNA의 발현 양을 측정해 보았다. 도6에서 나타난 바와 같이, TNF- , IL-1 , IL-6 mRNA의 발현 양상은 전반적으로 모두 비슷하였다. 정상군과 비교하여 대조군과 HP/B군은 높은 발현을 보였다. HP/Z군의 경우, 정상군에 비하여 발현양이 약간 높았으나 대조군이나 HP/B군에 비해서는 현저히 감소하였다. 특히 IL-6 mRNA의 발현이 뚜렷한 증가를 보였다. 상대적인 발현 정도를 비교하기 위해서 내부 표준물질인 GAPDH로 보정하여 비교하였을 때 TNF- 의 경우 정상군 23%, 대조군 56%, HP/Z군 42%, HP/B군 79%을 나타내었고, IL-1 의 경우 정상군 32%, 대조군 74%, HP/Z군 55%, HP/B군 81%을 나타냈다. IL-6의 경우 정상군 64%, 대조군 133%, HP/Z군 75%, HP/B군 156%을 나타내었다.

6. 연골하골에서의 TNF- , IL-1 및 IL-6의 발현

연골하골에서 TNF- , IL-1 , IL-6의 발현을 면역조직화학법을 이용하여 관찰하였다 (도7). 정상군과 비교할 때 대조군에서 TNF- , IL-1 , IL-6 발현 세포가 현저히 많이 관찰되었다. HP/Z군에서는 대조군에 비하여 TNF- , IL-1 , IL-6 발현 세포의 수가 뚜렷이 감소됨을 확인할 수 있었다.

Ⅲ. 결 론

관절염에 대한 자하거 추출액 처치의 효과를 알아보기 위하여 흰쥐의adjuvant 관절염 모델을 이용하여 체중감소, 부종 및 발적 등과 같은 임상적 증상과 TNF- , IL-1 , IL-6 등의 세포신호 인자의 mRNA와 단백질의 발현 정도를 살펴본 결과를 정리해 보면 다음과 같다.

1. Squalane에 유화시킨 MycobacteriumtuberculosisH37RA를 흰쥐의 꼬리 기저부에 피내 주사에 시켜 만든 흰쥐의 adjuvant 관절염 동물 모델은 대다수의 동물에서 체중감소와 부종 및 발적이 다발적으로 나타났다.

2. 임상적 지표의 변화에 있어서 자하거 추출액 주입이 체중감소와 부종 및 발적을 유의하게 억제하였다.

3. 대조군과 비교할 때 자하거 추출액 처치는 관절 내에서 TNF- , IL-1 , IL-6 mRNA 발현을 정상군 수준으로 감소시켰다.

4. 대조군과 비교할 때 자하거 추출액 처치는 관절 내 연골하골에서 TNF- , IL-1 , IL-6 단백질의 발현을 정상군 수준으로 감소시켰다.

5. 비혈위에 자하거 추출액을 주사한 경우에는 관절 내의 염증 억제 효과를 나타내지 못했다.

이상의 결과와 같이, 자하거 추출액 처치는 류마티스 관절염에 의한 염증 반응을 억제시키고, 또한 부종 및 발적을 저해시키는 효능이 있다. 따라서 대표적인 만성자가면역질환인 류마티스 관절염의 새로운 치료제임을 알 수 있다.

이상 실험 예를 들어 본 발명을 상세히 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.

위 실시 예에서 실험동물을 흰쥐로 하였으나 다른 동물, 예를 들어 개나 원숭이 등일 수도 있다.

위 실시 예에서 제재는 자하거 추출물의 고순도 추출액인 것으로 설명하였으나 통상적으로 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 약제학적으로 허용되는 약제학 제재, 예를 들어 주사제, 액제, 시럽제, 정제, 캡슐제 등으로 체계화하여 류마티스 관절염과 같은 만성자가면역질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 제재로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 제재는 임상적 투여시 경구, 복강, 피하 투여 등의 방법으로 투여될 수도 있다.

본 발명에 따른 제재의 임상적 투여량은 환자의 연령, 증상, 투여제형, 또는 약물의 종류에 따라 다양하게 조절할 수 있다. 특정한 상태에서 바람직한 투여량을 결정하는 것은 공지된 기술에 해당한다.

본 발명은, 류마티스 관절염 실험 동물 모델에 자하거 고순도 증류 추출액을 지속적으로 투여한 결과, 관절 내의 염증반응을 효과적으로 억제시키고, 부종 및발적 증상을 뚜렷이 완화시킴을 알 수 있다. 즉 자하거 추출액 처치가 류마티스 관절염의 치료에 효과적임을 알 수 있다.

Claims (3)

1. 자하거를 정제·중탕하여 얻어진 자하거 증류 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료용 약제학적 조성물
2. 자하거를 증류수와 혼합하여 가열 및 증류하여 여과 및 중탕하여 얻어진 자하거 추출물을 유효성분으로 포함한 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 치료용 약제학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 유효성분의 자하거 추출물은 약침에 의해 투여되는 약침액인 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염의 치료용 약제학적 조성물.