KR20040073518A

KR20040073518A - 섬유아세포 증식 인자-23에 대한 항체

Info

Publication number: KR20040073518A
Application number: KR10-2004-7010142A
Authority: KR
Inventors: 유지 야마자끼; 다까시 시마다; 다께요시 야마시따
Original assignee: 기린 비루 가부시키가이샤
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2003-01-06
Publication date: 2004-08-19
Also published as: HK1078093A1; CA2471656C; CN100519584C; ATE441666T1; EP1466925A4; AU2003202472A1; WO2003057733A1; DE60329070D1; JP4527982B2; US20050048058A1; EP1466925B1; KR101016476B1; AU2003202472B2; CN1639193A; ES2331414T3; US7923012B2; CA2471656A1; EP1466925A1; JPWO2003057733A1

Abstract

본 발명은 섬유아세포 증식 인자-23에 대한 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열에서 1개 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 섬유아세포 증식 인자-23 활성을 갖는 폴리펩티드를 동물에게 면역화시킴으로써 얻어지고, 인산 대사 또는 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 항체로서, 이하의 (a), (b) 또는 (c)로 표시되는 항체이다.

(a) 서열 1에 나타낸 180번째 내지 194번째 또는 237번째 내지 251번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체

(b) 수탁 번호가 FERM BP-7838, FERM BP-7839, FERM BP-7840 또는 FERM BP-8268인 하이브리도마가 생산하는 항체

(c) 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와의 결합에 있어서, 수탁 번호가 FERM BP-7838, FERM BP-7839, FERM BP-7840 또는 FERM BP-8268인 하이브리도마가 생산하는 항체와 경합하는 항체.

Description

섬유아세포 증식 인자-23에 대한 항체 {Antibodies Against Fibroblast Growth Factor 23}

섬유아세포 증식 인자(Fibroblast growth factor)는 처음에 섬유아세포주인 NIH3T3의 증식을 자극하는 물질로서 소의 하수체로부터 정제되었다. 이후, 여러가지 조직으로부터 유사한 단백질이 동정되고 있으며, 그들 일군의 물질은 폴리펩티드 패밀리(FGF 패밀리)를 형성하고 있다. 현재까지 FGF 패밀리에 속하는 것으로서 척추 동물에서 22종의 단백질이 동정되고 있다. 이들 단백질의 생물 활성으로서는 섬유아세포 증식 활성 뿐만 아니라, 중배엽이나 신경 외배엽의 증식이나 혈관 신생 작용, 발생 단계에서의 지아(肢芽) 형성 등 다방면에 걸친 작용이 알려져 있다. FGF는 그 유전자의 발현 부위, 발현 시기에 있어서도 다양하며, 발생 단계나 성인의 특정 부위에서만 발현되는 것도 많다. FGF의 수용체를 코딩하는 유전자로서는 FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4의 적어도 4종이 알려져 있으며, FGFR1, FGFR2, FGFR3에서는 스플라이싱의 차이에 의해 세포외 도메인이 상이한 수용체 단백질이 각각에서 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한, 헤파린이나 헤파란 황산 프로테오글리칸이 FGF나 FGF 수용체와 상호작용함으로써 작용을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한, 구조적 유사성으로부터 FGF 패밀리에 속하지만, 그 생물 활성이나 수용체 결합성 등에 대해서 거의 해명되어 있지 않은 것도 많다. 이러한 FGF 패밀리의 특징에 대해서는 총설로서 정리되어 있다(Ornitz, D. M. and Itoh, N. Fibroblast growth factors. Genome biology 2: 3005. 1-3005. 12, 2001).

FGF-23은 FGF-15와의 상동성을 이용한 데이타베이스 검색과 PCR법에 의해 최초로 마우스에서 클로닝되고, 또한 마우스 FGF-23의 서열 상동성을 이용하여 인간 FGF-23이 클로닝되었다(Yamashita, T., Yoshioka, M. and Itoh, N. Identification of a Novel Fibroblast Growth Factor, FGF-23, Preferentially Expressed in the Ventrolateral Thalamic Nucleus of the Brain. Biochem. Biophy. Res. Commun. 277: 494-498, 2000). 이어서, 상염색체 우성 저인혈증성 구루병ㆍ골연화증(Autosomal dominant hypophosphatemic rickets/osteomalachia: 이하 ADHR이라고 함)의 연구에서, ADHR 환자에서의 변이 유전자 영역을 좁혀 책임 유전자의 동정을 진행시키는 가운데, ADHR 환자의 FGF-23의 유전자에 미스센스 변이가 특징적으로 발견되었다(The ADHR Consortium. Autosomal dominant hypophosphatemic rickets is associated with mutations in FGF23. Nature Genet. 26: 345-348, 2000). 이발견에 의해 생체 내에서의 생리적 중요성이 강하게 시사되었다. 그러나, FGF-23의 생물학적 활성에 대해서는 여전히 불명확하였다. 한편, FGF-23의 생물 활성을 결정지은 것은 종양성 골연화증의 연구였다. 이 질환에서는 질환의 책임 종양이 액성의 질환 야기 인자를 분비 생산하며, 이 질환 야기 인자의 작용에 의해 저인혈증, 골연화증 등의 병태에 빠진다고 여겨졌다.

이 책임 종양이 생산하는 질환 야기 인자의 탐색에 있어서, 종양에 많이 발현되는 유전자로서 FGF-23이 클로닝되며, 또한 이 인자를 투여함으로써 저인혈증이나 골연화증이 재현됨이 시사되었다(Shimada, T., Mizutani, S., Muto, T., Yoneya, T., Hino, R. Takeda, S, Takeuchi, Y., Fujita, T., Fukumoto, S and Yamashita, T. Cloning and chatacterization of FGF23 as a causative factor of tumor-induced osteomalacia. Proc Natl. Acad. Sci. 98: 6500-6505, 2001). 이 연구에 의해 FGF-23이 생체 내의 인이나 칼슘과 관련한 대사 조절에 관여하는 것이 시사됨과 동시에, 생체 내를 순환하여 작용하는 전신성 인자로서 기능하는 것이 시사되었다. 그러나, FGF-23의 작용 발현에 필요한 체내 농도나 대사에 대해서는 명확하지 않으며, FGF-23의 생리적 역할에 대해서는 불명확한 점이 많다. 또한, 임상적 소견에서 유사한 양태를 드러내는 질환으로서 X 염색체성 저인혈증성 구루병이 알려져 있지만, 이 병태에서의 FGF-23의 관여에 대해서는 아직까지 명확하지 않으며, ADHR이나 종양성 골연화증 이외에 FGF-23이 관련되었음이 증명된 질환도 아직까지 알려져 있지 않다.

상술한 종양성 골연화증은 종양 형성에 따라 혈중 인과 1α,25-디히드록시비타민 D(이하, "1,25D"라고 함)가 이상 저수치를 나타내는 것을 특징으로 하며, 근력 저하, 골연화증을 수반할 때에는 보행 장해, 기립 장해에도 이른다. 이 질환의 책임 종양은 간엽계 세포로부터 유래하는 양성의 것이 많다. 책임 종양의 대부분은 증식성이 부족하여 경과 관찰에서 현저한 증대는 확인되지 않으며, 병태 진행이 확인되기는 하지만 책임 종양 발견에 전신 MRI 검사 등의 정밀 조사를 요하는 경우도 적지 않다. 이러한 점에서 현재 원인 불명의 저인혈증으로서 확정 진단이 내려지지 않은 증례에 있어서도 종양성 골연화증이 의심되는 경우가 존재하고 있다. 종양성 골연화증의 확정 진단은, 현재까지는 종양 적출 수술에 의해 병상이 회복되는 것을 확인하는 방법밖에 없다. 이것은 종양 형성과 병상의 인과 관계를 임상 검사에 의해 조사하는 방법이 존재하지 않기 때문이며, 때로는 병상과 전혀 관련없는 비책임 종양의 적출 수술을 단행해 버리는 경우도 있을 수 있다. 이러한 상황을 개선하기 위해서라도 종양성 골연화증을 감별 진단할 수 있는 임상 검사 방법의 개발에 기대가 모아지고 있다.

FGF-23이 생체의 인 대사 조절 작용을 갖는 것이 발견되었지만, 이제까지 인 대사 조절 작용이 알려져 있는 부갑상선 호르몬이나 1,25D는 인 대사 조절보다도 오히려 칼슘 대사 조절에 있어서 중요한 역할을 하고 있다. 인 대사를 중심적으로 조절하는 분자는 이제까지 알려져 있지 않으며, FGF-23에 그러한 활성이 기대되고 있다. 한편, 인 대사와 칼슘 대사가 밀접하게 관련되었다는 것은 임상학적으로 알려져 있는 바이며, 특히 골조직의 석회화나 병적인 이소성의 석회화를 고려하는 데 있어서 분리하여 생각하기가 곤란하다. FGF-23의 과잉 상태가 골연화증을 유도하는 것이나, 1,25D를 저하시키는 작용을 갖는다는 점으로부터도 FGF-23이 인 대사 뿐만 아니라, 석회화 조절이나 골 대사에 넓게 관여하고 있다고 여겨지며, 장관, 신장, 골조직을 중심으로 한 미네랄 대사 조절 기관의 이상 질환에 있어서 FGF-23의 과잉 축적이나 결핍 상태를 수반하는 것이 존재하는 가능성을 생각할 수 있다. 이러한 질환을 이해하고, 정확하게 치료를 실시하기 위해서라도 FGF-23의 체내 농도를 검사하는 방법의 개발이 요구된다.

FGF-23의 과잉이 질환을 야기하는 병태에 있어서, FGF-23을 억제 또는 제거하는 것이 질환의 치료 방법이 될 수 있다고 여겨진다. 그 중 하나의 방법으로서는 FGF-23의 수용체 길항 물질이나 FGF-23 결합 물질에 의한 리간드-수용체 상호작용의 억제나, FGF-23 결합 물질을 이용한 FGF-23의 제거를 생각할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 방법으로 FGF-23을 선택적으로 억제 또는 제거하는 물질은 알려져 있지 않다.

본 발명은 섬유아세포 증식 인자-23(FGF-23)에 대한 항체에 관한 것이다.

상세하게는 본 발명은 생체 내의 FGF-23을 적절하게 검출, 측정함으로써 FGF-23 단백질의 축적 또는 감소를 수반하는 질환이나 병적 상태를 진단하는 방법을 제공함과 동시에, FGF-23이 과잉 작용함으로써 생기는 질환이나 병적 상태에 있어서 FGF-23을 억제함으로써 병상의 개선 또는 치료를 가능하게 하는 항체와 그의 제조 방법, 및 사용 방법에 관한 것이다.

도 1A는 CHO-FGF23H 세포 배양 상청을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 항FGF-23 폴리클로날 항체로 웨스턴 블롯팅에 의해 재조합체 FGF-23단백질 및 그의 대사물을 검출한 도면이다. 배양 상청 중에는 전장의 FGF-23H 단백질과 서열 1의 아미노산 서열의 서열 179번째와 180번째 사이에서 절단되어 생긴 N 말단측 단편과 C 말단측 단편이 존재한다. hFGF23-48 항체 및 hFGF23-148 항체에서 전장의 FGF-23H 단백질과 N 말단측 단편 펩티드가 인식되었다. N 말단측 단편은 소단편화된 펩티드의 존재로 확인된다. 항His6-태그(tag) 항체에서는 전장 단백질과 C 말단측 단편이 검출되었다(실시예 2).

도 1B는 CHO-FGF23 세포 배양 상청으로부터 정제한 FGF-23 전장 단백질과 N 말단측 단편 및 C 말단측 단편을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, CBB 염색하여 검출한 도면이다(실시예 2).

도 1C는 CHO-FGF23H와 CHO-FGF23RQ 세포 배양 상청을 각각 채취하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 항FGF23-148 항체로 웨스턴 블롯팅에 의해 재조합체 FGF-23 단백질, 재조합체 FGF-23RQ 단백질 및 이들의 대사물을 검출한 도면이다(실시예 5).

도 2는 항FGF-23 폴리클로날 항체인 hFGF23-25 항체를 고상화하고, 검출용 항체로서 hFGF23-237 항체를 이용한 샌드위치 ELISA로 FGF-23H 단백질의 측정을 실시한 도면이다(실시예 7).

도 3은 항FGF-23 모노클로날 항체로 FGF-23H 단백질을 면역 침강하고, 그것을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리한 후, 2A2B 항체 및 1C3H 항체로 검출한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 10)

도 4는 항FGF-23 모노클로날 항체를 고상화하고, 항FGF-23 폴리클로날 항체로 검출하는 샌드위치 ELISA로 정제한 FGF-23H 전장 단백질, N 말단측 단편 폴리펩티드, C 말단측 단편 폴리펩티드를 검출한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 11).

도 5는 FGF-23 단백질의 전장 단백질과 그의 절단 부위, 및 항FGF-23 모노클로날 항체의 인식 부위를 모식적으로 나타낸 도면이다(실시예 12).

도 6은 2C3B 항체를 고상화 항체로서 사용하고, 검출 항체로서 1C3H 항체, 1D6A 항체 및 3C1E 항체를 이용한 ELISA계로 정제한 FGF-23 단백질을 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 13).

도 7은 CHO-FGF23H 세포를 이식한 누드 마우스로부터 채취한 혈청에 포함되는 FGF-23H 단백질을 1C3H 항체, 1D6A 항체 및 2C3B 항체를 고정화한 수지를 사용하여 면역 침강법으로 회수하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리한 후, 2A2B 항체 및 1C3H 항체로 검출한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 15).

도 8은 20 ng의 정제 FGF-23 단백질에 래트 혈청을 최종 농도가 50％가 되 도록 첨가하여 혼화하고, 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24 시간 배양함으로써 생기는 대사물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 2A2B 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 검출한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 16).

도 9는 20 ng의 정제 FGF-23 단백질에 인간 혈청 또는 인간 혈장을 최종 농도가 50％가 되도록 첨가하여 37 ℃에서 3 시간 배양한 후, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 2A2B 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하여 정제 FGF-23 단백질로부터 유래하는 대사물을 검출한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 16).

도 10은 20 ng의 정제 FGF-23 단백질에 트롬빈을 최종 농도 1 단위/㎖로 첨가하여 3 시간 배양한 후, 이 용액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 2A2B 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하여 정제 FGF-23 단백질로부터 유래하는 대사물을 검출한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 17).

도 11은 트롬빈의 선택적 억제제인 히루딘의 존재하 및 비존재하에서 20 ng의 정제된 FGF-23 단백질에 래트의 혈청을 최종 농도가 50％가 되도록 첨가하여 4 시간 배양하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 2A2B 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하여 정제 FGF-23 단백질로부터 유래하는 대사물을 검출한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 17).

도 12는 10 ㎍의 정제 FGF-23 단백질과 래트의 혈청을 24 시간 혼화하여 22 kDa의 폴리펩티드를 생성시켰다. 이 22 kDa의 폴리펩티드를 항2A2B 항체 칼럼으로 정제하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하여 22 kDa 폴리펩티드를 CBB 염색으로 동정한 것을 나타낸 도면이다(실시예 18).

도 13은 2C3B 항체를 고상화하여 3C1E 항체 또는 1D6A 항체로 검출하는 ELISA계를 이용하여, 종양성 골연화증 환자의 원인 종양 적출 전후에 채취한 혈액 샘플 중의 FGF-23 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 19).

도 14는 종양성 골연화증 환자의 원인 종양 적출 전후에 채취한 혈액 샘플 중의 FGF-23 단백질을 정량화한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 19).

도 15는 종양성 골연화증 환자로부터 적출한 종양 조직 중의 FGF-23 단백질의 존재를 면역 조직 염색으로 검출한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 20).

도 16A는 정제한 마우스 FGF-23RQ 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 항인간 FGF-23 모노클로날 항체인 3C1E 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하여 마우스 FGF-23RQ 단백질을 검출한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 22).

도 16B는 정제한 마우스 FGF-23 단백질을 단계 희석하여 2C3B 항체를 고상화하고, 검출용 항체로서 3C1E 항체를 이용하여 마우스 FGF-23 단백질 용액을 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 22).

도 17은 2C3B 항체를 고상화하고, 검출용 항체로서 3C1E 항체를 이용한 ELISA계를 이용하여 27 내지 30 주령의 Hyp 마우스 및 대조군 마우스로부터 채취한 혈청 중의 내재성 FGF-23 단백질을 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 23).

도 18A는 6 주령의 BALB/c 수컷 마우스 6 마리에 정제한 FGF-23H 단백질을 1 마리당 5 ㎍ 투여하고, 투여 후 1, 4, 9 시간 경과한 시점에서 채혈하여 혈청 중의 1,25D 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 24).

도 18B는 7 주령의 BALB/c 수컷 마우스 6 마리에 0.025 ㎍의 1,25D를 복강 내 투여하고, 투여 후 8 시간 경과한 시점에서 채혈하여 혈청 중의 FGF-23의 양을 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 24).

도 19A는 7 주령의 위스터(Wistar) 래트에 0.75％의 비율로 아데닌을 혼이(混餌)한 CE-2(일본, 구레아사)를 제공하여 신장 기능 부전 고인혈증 모델을 제조하였다. 대조군에는 CE-2를 제공하였다. 혼이식(混餌食)을 제공하고 3 주 후에 채혈하여 혈청 중의 인산 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 25).

도 19B는 7 주령의 위스터 래트에 0.75％의 비율로 아데닌을 혼이한 CE-2(일본, 구레아사)를 제공하여 신장 기능 부전 고인혈증 모델을 제조하였다. 대조군에는 CE-2를 제공하였다. 혼이식을 제공하고 3 주 후에 채혈한 후, 래트를 대사 케이지에 넣어 뇨를 24 시간 채취하였다. 혈청 중 및 뇨 중 크레아티닌의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 25).

도 19C는 7 주령의 위스터 래트에 0.75％의 비율로 아데닌을 혼이한 CE-2(일본, 구레아사)를 제공하여 신장 기능 부전 고인혈증 모델을 제조하였다. 대조군에는 CE-2를 제공하였다. 혼이식을 제공하고 3 주 후에 채혈하였다. 2C3B 항체를 고상화하고, 3C1E 항체를 검출 항체로 한 ELISA계를 이용하여 혈청 중의 FGF-23 농도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 25).

도 20은 종양성 골연화증 환자 혈장 중에 존재하는 FGF-23 단백질을 면역 침강법에 의해 검출한 도면이다(실시예 26).

도 21A는 각종 모노클로날 항체 및 매체를 투여한 후, 24 시간째의 혈청 중 인산, 칼슘, 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도를 나타낸 도면이다(실시예 27).

도 21B는 3C1E 모노클로날 항체 및 매체를 투여한 후, 8 시간째의 혈청 중 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도를 나타낸 도면이다(실시예 28).

도 22A는 아데닌 혼이식 사육군(아데닌) 또는 통상식 사육군(대조군)에서의,사육 개시로부터 7 일째의 혈청 중 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도를 나타낸 도면이다. 측정치는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *, ** 는 스튜던트-t(Student-t)에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.05, p<0.01이었던 것을 나타낸다(실시예 29).

도 22B는 아데닌 혼이식 사육군(아데닌) 또는 통상식 사육군(대조군)에서의, 사육 개시로부터 7 일째의 혈청 FGF-23 농도를 나타낸 도면이다. 측정치는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.05, p<0.01이었던 것을 나타낸다(실시예 29).

도 22C는 아데닌 혼이식 사육군에서의, 사육 개시로부터 7 일째의 혈청 FGF-23 농도와 1,25-디히드록시 비타민 D 농도를 개체별로 플롯팅한 상관도이다(실시예 29).

도 22D는 사육 개시로부터 7 일 경과한 아데닌 혼이식 사육군(아데닌) 또는 통상식 사육군(대조군)에 3C1E 항체 투여 또는 매체(비히클)를 투여하고, 12 시간 후의 혈청 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도 변화를 나타낸 도면이다. 측정치는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *, ** 는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.05, p<0.01이었던 것을 나타낸다(실시예 29).

도 23은 X-연관 저인혈증성 구루병(XLH) 환자 6명의 성별, 동정된 phex 유전자의 변이 부위, 채혈시 연령, 및 혈청 중 FGF-23 농도를 나타낸 도면이다(실시예 30).

도 24는 정상 마우스에 2C3B 항체, 3C1E 항체, 두개의 항체의 혼합물 또는매체(PBS)를 투여한 후 1 일째(1 일) 및 2 일째(2 일)의 혈청 인산 농도를 나타낸 도면이다. 측정치는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 매체 투여군에 비하여 각각 p<0.05, p<0.01이었던 것을 나타낸다. a, b는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.05, p<0.01이었던 것을 나타낸다(실시예 31).

도 25A는 야생형 마우스(WT) 및 Hyp 마우스(Hyp)에 2C3B 항체와 3C1E 항체의 혼합물(Ab) 또는 매체(PBS)를 반복 투여한 후, 1, 7 일째의 혈중 인산 농도, 1,25-디히드록시 비타민 D 농도, 총 알칼리포스파타제 활성을 나타낸 도면이다. 혈중 인 및 알칼리포스파타제 활성치는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.01, p<0.001이었던 것을 나타낸다. 혈중 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도는 각 군마다 등량씩 혼화한 혈장을 이용하여 측정한 결과이다(실시예 32).

도 25B는 야생형 마우스(WT) 및 Hyp 마우스(Hyp)에 2C3B 항체와 3C1E 항체의 혼합물(Ab) 또는 매체(PBS)를 1회 투여한 후, 4 일째의 혈중 인산 농도, 1,25-디히드록시 비타민 D의 농도를 나타낸 도면이다. 결과는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.01, p<0.001이었던 것을 나타낸다(실시예 32).

도 25C는 야생형 마우스(WT) 및 Hyp 마우스(Hyp)에 2C3B 항체와 3C1E 항체의 혼합물(Ab) 또는 매체(PBS)를 1회 투여한 후, 4 일째의 신장으로부터 제조한 BBMV의 NaPi2a 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯팅법으로 해석한 도면(상단), 및 이들의인산 수송 활성을 나타낸 도면(하단)이다. 시험에 사용한 BBMV의 단백질량을 보정하기 위해 웨스턴 블롯팅에 이용한 블롯을 CBB 염색하고 베타-액틴(beta-actin)을 염색한 상을 동시에 나타내었다. 인산 수송 활성의 결과는 평균치+/-표준 편차로 표시되며, 각각 n=3이다(실시예 32).

도 25D는 야생형 마우스(WT) 및 Hyp 마우스(Hyp)에 2C3B 항체와 3C1E 항체의 혼합물(Ab) 또는 매체(PBS)를 1회 투여한 후, 4 일째의 신장으로부터 제조한 RNA를 이용하여 1αOHase 유전자의 발현 변화를 해석한 노던(Nothern) 블롯팅이다(실시예 32).

도 26은 정상 래트에 3C1E 항체 또는 매체를 투여한 후의, 혈중 오스테오칼신 농도의 경시 변화를 나타낸 도면이다. 결과는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.01, p< 0.001이었던 것을 나타낸다(실시예 33).

도 27은 야생형 마우스(WT) 및 Hyp 마우스(Hyp)에 2C3B 항체와 3C1E 항체의 혼합물(Ab) 또는 매체(PBS)를 투여한 후에 적출한 대퇴골, 경골 및 늑골의 X선 확대 화상을 나타낸 도면이다(실시예 32).

도 28은 2C3B 항체와 3C1E 항체의 항체 혼합물을 반복 투여한 Hyp 마우스(Hyp/항체)의 경골 근위부, 대퇴골 원위부의 골조직상을, 매체를 투여한 Hyp(Hyp/매체) 및 야생형 마우스(야생형/매체)의 해당 영역의 조직상과 비교하여 나타낸 도면이다. 적출한 경골 및 대퇴골은 빌라누에바 본(Villanueva Bone) 염색을 실시하였다. 이들을 수지 포매한 후 5 ㎛ 두께의 비탈회 단편 표본으로 한 것이다. 가시광하에서 유골은 보라색, 석회화골은 엷은 오렌지색, 저석회화골은 엷은 갈색, 세포 포체는 엷은 보라색으로 다르게 염색되었다(실시예 32).

도 29A는 모조 수술 마우스에 매체(PBS)를 투여한 군(sham/PBS) 및 난소 적출 처치 마우스에 2C3B 항체와 3C1E 항체의 혼합물을 투여한 군(OVX/Abs), 또는 난소 적출 처치 마우스에 매체(PBS)를 투여한 군(OVX/PBS)을 제조하여 난소 적출 후 2 주째의 혈중 오스테오칼신 농도(IRMA 키트, Immutopics, Inc.)를 나타낸 도면이다. 혈중 오스테오칼신 농도는 평균치+/-표준 오차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.01, p<0.001이었던 것을 나타낸다(실시예 34).

도 29B는 모조 수술 마우스에 매체(PBS)를 투여한 군(sham/PBS) 및 난소 적출 처치 마우스에 2C3B 항체와 3C1E 항체의 혼합물을 투여한 군(OVX/Abs), 또는 난소 적출 처치 마우스에 매체(PBS)를 투여한 군(OVX/PBS)을 제조하여 난소 적출 후 4 주째의 혈중 오스테오칼신 농도(IRMA 키트, Immutopics, Inc.)를 나타낸 도면이다. 혈중 오스테오칼신 농도는 평균치+/-표준 오차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.01, p<0.001이었던 것을 나타낸다(실시예 34).

도 30A는 모조 수술 마우스에 매체(PBS)를 투여한 군(sham/PBS) 및 난소 적출 처치 마우스에 2C3B 항체와 3C1E 항체의 혼합물을 투여한 군(OVX/Abs), 또는 난소 적출 처치 마우스에 매체(PBS)를 투여한 군(OVX/PBS)을 제조하여 난소 적출 후 4 주째의 대퇴골 골염량을 나타낸 도면이다. 대퇴골 골염량, 골밀도는 평균치+/-표준 오차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.05, p<0.01이었던 것을 나타낸다(실시예 34).

도 30B는 모조 수술 마우스에 매체(PBS)를 투여한 군(sham/PBS) 및 난소 적출 처치 마우스에 2C3B 항체와 3C1E 항체의 혼합물을 투여한 군(OVX/Abs), 또는 난소 적출 처치 마우스에 매체(PBS)를 투여한 군(OVX/PBS)을 제조하여 난소 적출 후 4 주째의 골밀도(골염량 측정 장치 DCS-600형, 아로카 가부시끼 가이샤)를 나타낸 도면이다. 대퇴골 골염량, 골밀도는 평균치+/-표준 오차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p<0.05, p<0.01이었던 것을 나타낸다(실시예 34).

도 31A는 Hyp 마우스에 매체(Hyp/매체), 2C3B 항체와 3C1E 항체 혼합물 4 mg/kg(Hyp/항체 저용량), 또는 동일한 혼합물 16 mg/kg(Hyp/항체 고용량)을, 또는 야생형 마우스에 매체(야생형/매체)를 주 1회 반복 피하 투여했을 때의 미추골 전장을 정기적으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 결과는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 Hyp 매체 투여군에 비하여 p<0.05, p<0.01이었던 것을 나타낸다(실시예 35).

도 31B는 Hyp 마우스에 매체(Hyp/매체), 2C3B 항체와 3C1E 항체 혼합물 4 mg/kg(Hyp/항체 저용량), 또는 동일한 혼합물 16 mg/kg(Hyp/항체 고용량)을, 또는 야생형 마우스에 매체(야생형/매체)를 주 1회 반복 피하 투여했을 때의 경골 길이를 정기적으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 결과는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 Hyp 매체투여군에 비하여 p<0.01이었던 것을 나타낸다(실시예 35).

도 31C는 Hyp 마우스에 매체(Hyp/매체), 2C3B 항체와 3C1E 항체 혼합물 4 mg/kg(Hyp/항체 저용량), 또는 동일한 혼합물 16 mg/kg(Hyp/항체 고용량)을, 또는 야생형 마우스에 매체(야생형/매체)를 주 1회 반복 피하 투여했을 때의 체중 변화를 정기적으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 결과는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *, **는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 Hyp 매체 투여군에 비하여 p<0.05, p<0.01이었던 것을 나타낸다(실시예 35).

도 32는 Hyp 마우스에 매체(Hyp/매체), 2C3B 항체와 3C1E 항체 혼합물 4 mg/kg(Hyp/항체 저용량), 또는 동일한 혼합물 16 mg/kg (Hyp/항체 고용량)을, 또는 야생형 마우스에 매체(야생형/매체)를 주 1회 반복 피하 투여하고, 31일 후에 적출한 대퇴골을 회화했을 때의 회 중량이 건조골 중량에서 차지하는 비율을 나타낸 도면이다. 결과는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *는 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, Hyp 매체 투여군에 비하여 p<0.001이었던 것을 나타낸다.

도 33은 2C3B 항체 또는 2C5L 항체를 고상화 항체로서 사용하고, 검출 항체로서 3C1E 항체를 이용한 ELISA계로 정제한 FGF-23 단백질을 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다(실시예 36).

도 34는 비처리 정상 마우스에 매체를 투여한 군(비처리/매체), 침투압 펌프를 이용하여 인간 재조합 FGF-23을 지속 투여시킨 후, 매체(FGF-23/PBS), 2C5L 항체(FGF-23/2C5L) 및 2C3B 항체(FGF-23/2C3B)를 각각 투여한 군의, 항체 투여 전 및투여 후 24 시간째의 혈중 인산 농도를 나타낸 도면이다. 결과는 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *는 스튜던트-t에 의해 항체 투여 전에 각 군에 대하여 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 매체 투여군에 비하여 p<0.001이었던 것을 나타낸다.^{#, ##}는 스튜던트-t에 의해 각 군 항체 투여 전에 투여 24 시간 후에 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 p=0.01, p<0.001이었던 것을 나타낸다.^{+, ++, +++}는 스튜던트-t에 의해 항체 투여 후에 각 군에 대하여 유의차 검정을 실시한 결과, 각각 FGF-23/PBS 항체 투여 후 24 시간 군과 비교하여 p<0.05, p<0.01, p<0.001이었던 것을 나타낸다(실시예 38).

<서열 목록 설명>

서열 2: 합성 DNA

서열 3: 합성 DNA

서열 4: 합성 DNA

서열 5: 합성 DNA

서열 6: 합성 DNA

서열 7: 합성 DNA

서열 8: 합성 DNA

서열 9: 합성 펩티드

서열 10: 합성 펩티드

서열 11: 합성 펩티드

서열 12: 합성 펩티드

서열 13: 합성 펩티드

서열 14: 합성 펩티드

서열 15: 합성 펩티드

서열 16: 합성 펩티드

서열 17: 합성 펩티드

서열 18: 합성 펩티드

서열 19: 합성 펩티드

서열 20: 합성 펩티드

서열 21: 합성 펩티드

서열 22: 합성 펩티드

서열 23: 합성 펩티드

서열 24: 합성 펩티드

서열 25: 합성 DNA

서열 26: 합성 DNA

서열 27: 합성 DNA

서열 28: 합성 DNA

서열 29: 합성 DNA

서열 30: 합성 DNA

서열 33: 합성 DNA

서열 34: 합성 DNA

서열 35: 합성 DNA

서열 36: 합성 DNA

본 발명은 FGF-23을 인식하는 항체, 및 이 항체를 이용하여 FGF-23이 관련하는 질환의 진단 방법, 치료 방법 및 예방 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행한 결과, FGF-23 단백질의 부분적 구조를 특이적으로 인식하여 결합하는 항체를 얻고, 또한 이 항체를 이용하여 FGF-23을 검출할 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열에서 1개 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 섬유아세포 증식 인자-23 활성을 갖는 폴리펩티드를 동물에게 면역화시킴으로써 얻어지고, 인산 대사 또는 비타민 D 대사 조절 활성을 갖는 항체로서, 이하의 (a), (b) 또는 (c)로 표시되는 항체.

(2) 상기 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물. 본 발명의 의약 조성물에는 서열 1에 나타낸 180번째 내지 194번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체가 포함된다. 본 발명의 조성물은 종양성 골연화증, ADHR, XLH, 신장성 골이영양증, 투석골증, 골다공증, 저인혈증, 구루병, 골연화증, 세뇨관 기능 장해, 골감소증, 저칼슘혈증, 골신장 장해, 골석회화 장해, 부갑상선 기능 항진증, 이소성 석회화, 가려움증, 골경화증, 파젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증, 부갑상선 기능 저하증, 골통, 근력 저하, 골격 변형, 성장 장해 및 저 1,25D 혈증에서 선택되는 하나 이상의 질환에 유효하며, 이들 질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.

상기 의약 조성물은 상기 항체를 유효 성분으로서 포함하는 골형성 촉진제를 포함한다.

(3) 서열 1에 나타낸 25번째 내지 179번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체, 및 서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체를 이용하여 피검 시료와 반응시키는 것을 특징으로 하는 섬유아세포 증식 인자-23의 검출 방법.

상기 검출 방법에서 사용되는 항체(서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체)로서는, 예를 들면 서열 1에 나타낸 180번째 내지 196번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법에는 트롬빈 억제제를 사용할 수도 있다.

(4) 서열 1에 나타낸 25번째 내지 179번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체, 및 서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체를 포함하는, 섬유아세포 증식 인자-23의 검출 키트.

본 발명의 키트에는 서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체로서, 서열 1에 나타낸 180번째 내지 196번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체가 포함된다.

(5) 상기 항체에서 선택되는 하나 이상의 항체를 결합시킨 항섬유아세포 증식 인자-23 항체 결합재.

(6) 상기 결합재를 구비한 의료 기구. 본 발명의 의료 기구는 혈액 중의 섬유아세포 증식 인자-23을 제거하기 위해 사용된다.

(7) 상기 항체 중 다른 부위를 인식하는 2종 이상의 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

FGF-23은 종양성 골연화증의 책임 종양에서 고발현되는 것으로 알려져 있으며, 실험적으로 FGF-23을 분비하는 세포를 누드 마우스에 이식함으로써 종양성 골연화증의 특징인 저인혈증, 골연화증이 재현되기 때문에 종양성 골연화증의 유발 인자라고 여겨진다. 한편, 유전성 저인혈증의 한 양태인 상염색체 유전성 저인혈증성 구루병(ADHR: autosomal dominant hypophosphatemic rickets)의 책임 유전자의 탐색 연구가 진행되어, ADHR 환자에서 특이적으로 변이가 확인되는 유전자로서 FGF-23이 동정되고 있다. 이러한 점으로부터 FGF-23이 저인혈증성 질환의 병원성 인자로서 관여한다고 여겨진다. FGF-23의 생물 활성에 대해서는 재조합체 FGF-23을 마우스에 투여하는 실험에서 저인혈증을 유도하는 것이 확인되었다. 이러한 점으로부터 FGF-23은 생체 내에서 액성 인자로서 작용하여 인 대사나 골 대사를 조절한다고 추정된다. 따라서, 체내의 FGF-23을 정량적 및 정성적으로 평가하는 것은 질환의 이해, 진단에 매우 유용하다. 또한, FGF-23의 생물 활성을 조절함으로써, 앞서 진술한 FGF-23의 관여가 명확한 저인혈증성 질환을 치유할 수 있을 것으로 기대될 뿐만 아니라, 인 대사나 골 대사의 제어를 가능하게 하여 미네랄 대사 이상이나 대사성 골질환 등의 치료로의 응용도 생각할 수 있다.

이하, 본 발명에서 사용하는 어구의 의미를 명확히 함으로써, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 명세서 또는 도면에서 아미노산을 표기하기 위해 사용되는 알파벳의 1 문자는 각각 다음에 나타내는 아미노산을 의미한다. (G) 글리신, (A) 알라닌, (V) 발린, (L) 루이신, (I) 이소루이신, (S) 세린, (T) 트레오닌, (D) 아스파라긴산, (E) 글루탐산, (N) 아스파라긴, (Q) 글루타민, (K) 리신, (R) 아르기닌, (C) 시스테인, (M) 메티오닌, (F) 페닐알라닌, (Y) 티로신, (W) 트립토판, (H) 히스티딘, (P) 프롤린. 또한, DNA를 표기하기 위해 사용되는 알파벳의 1 문자의 의미는 각각 다음과 같다. (A) 아데닌, (C) 시토신, (G) 구아닌, (T) 티민.

인산 조절 활성이란, 혈중의 인산 농도를 조절하는 활성을 가리킨다.

비타민 D 대사 조절 활성이란, 생체 내에 존재하는 비타민 D 및 그에 따라 체내에서 합성되는 대사물의 절대량 변화, 또는 존재율의 변화를 조절하는 효력을 가리킨다.

1. FGF-23을 인식하는 항체

본 발명에서 말하는 인간 FGF-23이란, 후술하는 아미노산 서열(서열 1)을 갖는 폴리펩티드이며, 상기에 예시한 바와 같은 특징(활성)을 갖는 것이다. 또한, 본 발명에서의 FGF-23 및 그의 일부에는, 후술하는 본 발명의 항체가 반응성을 갖는 한, 그 천연형의 단백질 일차 구조와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간 FGF-23 유도체 및 그의 일부도 포함된다.

여기서 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간 FGF-23 유도체라는 용어는, 천연형의 인간 FGF-23과 실질적으로 동등한 성질(활성)을 갖는 한, 그 아미노산 서열중 1개 또는 몇개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 수식되어 있는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다. 또한, 그러한 치환, 결실, 수식 및 부가가 복수의 조합인 경우일 수도 있다. 인간 FGF-23의 활성이란, 상기와 같은 저인혈증 또는 골연화증을 유발할 수 있는 활성을 의미한다.

본 발명에서의 인간 FGF-23은 유전자 재조합 기술 외에 화학적 합성법, 세포 배양 방법 등과 같은 기술적 분야에서 알려진 공지된 방법 또는 그의 수식 방법을 적절하게 이용함으로써 제조할 수 있다. 또한, 인간 FGF-23의 부분 서열은 후술하는 기술적 분야에서 알려진 공지된 방법 또는 그의 수식 방법에 따라, 유전자 재조합 기술 또는 화학적 합성법에 의해 제조할 수도 있고, 세포 배양 방법에 의해 단리한 인간 FGF-23을 단백질 분해 효소 등을 이용하여 적절하게 절단함으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 항체란, 상기에 정의한 인간 FGF-23 또는 그의 일부에 반응성을 갖는 항체 또는 그 항체의 일부이다. 본 발명의 항체에는, 항체를 구성하는 중쇄 및(또는) 경쇄의 각각의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및(또는) 경쇄를 포함하며, FGF-23과 결합할 수 있는 모노클로날 항체도 포함된다. 본 발명의 인간 FGF-23 또는 항체의 아미노산 서열 중 상기와 같은 아미노산의 부분적 변이(결실, 치환, 삽입, 부가)는, 그 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 부분적으로 변이화시킴으로써 도입할 수 있다. 이러한 변이 기술은 당업자에게 주지되어 있으며, 시판되고 있는 돌연 변이 도입 키트 등을 사용할 수 있다.

(1) FGF-23 단백질의 부분적 구조를 특이적으로 인식하여 결합하는 항체

FGF-23의 검출이나 생물 활성 조절에 유용한 항체를 취득하기 위해서는 FGF-23의 구조적 특징을 인식하는 항체, 고친화성을 갖는 항체, 생물 활성을 중화할 수 있는 항체 등의 취득이 유효하다. FGF-23의 구조나 항원성에 대해서는 불명확하기 때문에 FGF-23의 부분 서열에 상당하는 복수의 펩티드를 합성하고, 각 펩티드에 대한 항체의 취득을 행하였다. 이것들을 이용하여 발현 세포가 분비된 FGF-23의 검출을 웨스턴 블롯팅에 의해 행하고, 발현 세포의 배양 상청 중에는 성숙형 FGF-23단백질 외에 다량의 FGF-23 단백질로부터 유래하는 저분자량의 펩티드가 포함되어 있는 것을 밝혔다. 또한, 얻어진 항체는 성숙형 FGF-23과 그 절단에 의해 생기는 펩티드에 대하여 다양한 결합 특이성을 나타내었다.

또한, 면역 침강법에 의해 항체의 액상에서의 결합 활성을 밝혔다. 또한, 이들 부위 특이적 항체를 조합하여 사용함으로써, 다양한 FGF-23 유래 펩티드 중에서 특정한 서열 영역을 갖는 펩티드를 검출할 수 있게 되었다. FGF-23의 수식, 대사에 대한 상세한 것은 밝혀져 있지 않지만, 본 발명자들은 FGF-23을 CHO 세포에서 발현시켰을 경우 시그널 서열을 소실한 전장 단백질 뿐만 아니라, 179번째 Arg 잔기와 180번째 Ser 잔기 사이에서의 절단에 의해 생성된 대사물의 존재를 본 발명에서 얻은 여러가지 항체를 이용한 검출 실험에서 밝혔다. 또한, FGF-23을 포함하는 혈액 샘플을 혈장 및 혈청으로서 채취하여 대사물을 검출하는 실험 및 정제 재조합체와 혈청의 혼화 실험에 의해, 혈장 중에서는 FGF-23이 전장형으로 존재하는 데 반하여, 혈청 중에서는 FGF-23의 196번째 Arg 잔기와 197번째 Ala 잔기 사이에서 절단이 생기는 것을 밝혔다. 이것은 트롬빈에 의한 것이라고 여겨지며, 198번째Arg와 199번째 Met 사이에서도 절단이 생긴다고 여겨졌다.

(2) 항체의 제조

본 발명의 항체는, 예를 들면 하기와 같은 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 예를 들면, 상기에서 정의한 인간 FGF-23 또는 그의 일부, 또는 항원의 항원성을 높이기 위한 적당한 물질(예를 들면, 소 혈청 알부민 등)과의 결합물을 필요에 따라 면역보강제(프로인트 면역보강제(Freund's Adjuvant) 등)와 함께, 인간 항체 생산 트랜스제닉(transgenic) 마우스 등을 포함하는 비인간 포유동물에게 면역화시킨다. 또는, FGF-23을 혼입시킨 발현 벡터를 투여함으로써 면역 감작을 행할 수 있다. 폴리클로날 항체는 면역 감작 동물로부터 얻은 혈청에서 취득할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체는 면역 감작 동물로부터 얻은 항체 생산 세포와 자기 항체 생산능이 없는 골수종계 세포(미엘로마(myeloma) 세포)로부터 하이브리도마를 제조하고, 하이브리도마를 클론화하여 면역화에 사용한 항원에 대하여 특이적 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 제조된다.

더욱 구체적으로는 하기와 같이 하여 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마의 제조는 케라 및 밀슈타인 등의 방법(Nature, 1975 Vol. 256: 495-497) 및 그에 준하여 행할 수 있다. 즉, 상술한 바와 같이 면역 감작된 동물로부터 취득되는 비장, 림프절, 골수 또는 편도 등(바람직하게는, 림프절 또는 비장)에 포함되는 항체 생산 세포와, 바람직하게는 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물로부터 유래하는 자기 항체 생산능이 없는 미엘로마 세포와의 세포 융합으로 제조된다. 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 스크리닝은, 하이브리도마를, 예를 들면 마이크로타이터 플레이트 중에서 배양하고, 증식이 보여진 웰 중의 배양 상청의 면역화 항원에 대한 반응성을, 예를 들면 ELISA 등의 효소 면역 측정법에 의해 측정함으로써 행할 수 있다.

하이브리도마로부터의 모노클로날 항체의 제조는, 하이브리도마를 시험관 내에서 배양하여 배양 상청으로부터 단리할 수 있다. 또한, 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터 또는 토끼 등의 복수 중에서 생체 내 배양하고, 복수로부터 단리할 수도 있다.

또한, 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 인간 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 적당한 벡터에 혼입시키고, 이 벡터를 숙주(예를 들면, 포유류 세포주, 대장균, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산시킨 재조합형 항체를 제조할 수 있다(P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS). 또한, 트랜스제닉 동물 제조 기술을 이용하여 목적 항체의 유전자가 내재성 유전자에 혼입된 트랜스제닉 소, 염소, 양 또는 돼지를 제조하고, 그 트랜스제닉 동물의 젖으로부터 그 항체 유전자로부터 유래하는 모노클로날 항체를 대량 취득할 수도 있다. 하이브리도마를 시험관 내에서 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험 연구의 목적 및 배양 방법 등의 여러가지 조건에 맞추어 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청 중에 모노클로날 항체를 생산시키기 위해 사용되는 공지된 영양 배지 또는 공지된 기본 배지로부터 유도 제조되는 모든 영양 배지를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 폴리클로날 항체는 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 화학 합성한 FGF-23의 부분 펩티드와 담체 단백질인 소 티로글로불린(thyroglobulin)과 결합시킨 것을 제조하여 토끼에게 면역화시켰다. 면역화에 의해 유도된 각 펩티드에 대한 항체는 면역화에 사용한 펩티드를 고상화한 친화도 칼럼으로 정제하였다. 이와 같이 하여 얻은 항체의 특성에 대해서는 웨스턴 블롯팅(Westerning blotting)과 ELISA로 검토하여 FGF-23 단백질에 대한 반응성을 밝혔다.

본 발명의 모노클로날 항체의 제조는 실시예 3에 나타낸 두가지 방법으로 면역화시키고, 얻어진 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체의 특성으로서, 실시예 9에 나타낸 고상화된 FGF-23 부분 펩티드와의 반응성이나, 실시예 10에 나타낸 면역 침강 실험에서의 FGF-23 단백질과의 반응성을 조사하고, 각 항체와 FGF-23의 결합 특성이나 인식 부위의 특이성에 대하여 밝혔다.

2. FGF-23의 검출 방법

(1) 생체 시료 중의 FGF-23과 그의 대사물을 구별하여 정량적으로 검출하는 방법

임상 검사에서 생체 시료 중의 활성을 갖는 FGF-23을 정확하게 측정할 필요가 있는데, 본 발명자들이 발견한 FGF-23의 생산시 발생하는 FGF-23 단백질 절단이나, 혈액 샘플 제조에서의 FGF-23 단백질 절단에 의한 단편화 산물이 FGF-23 측정의 방해 인자가 될 수 있다고 여겨진다. 특히, 본 발명자들은 서열 1에 나타낸179번째와 180번째 사이의 절단으로 활성이 소실되는 것을 밝히고 있다. 따라서, 생체 시료 중의 활성을 갖는 FGF-23을 검출하기 위해서는, 서열 1에 나타낸 25번째 내지 179번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체와, 서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체를 조합한 샌드위치 ELISA법이 유효하며, 본 발명자들이 취득한 N 말단측 인식 항체인 2C3B 항체 또는 2C5L 항체와, C 말단측 인식 항체인 3C1E 항체 또는 1D6A 항체를 조합하여 실시할 수 있다(도 5). 또한, 혈액 샘플의 제조에서도 혈청 샘플을 사용했을 경우, 혈중에 존재하는 전장 FGF-23이 196번째와 197번째, 또는 198번째와 199번째 사이에서 절단되는 경우가 있기 때문에, 이 경우에는 197번째 이후의 C 말단측을 인식하는 항체를 이용했을 경우의 본래의 혈중 존재량을 반영하는 측정이 불가능해진다. 이 절단은 혈장 중에서는 관찰되지 않기 때문에(실시예 26), 혈청 샘플을 사용한 경우라도 본 발명자들이 취득한 180번째 내지 196번째 사이를 인식하는 항체인 3C1E 항체를 C 말단 인식 항체로서 사용함으로써 본래의 혈중 존재량을 반영하는 측정이 가능해진다.

또한, 혈청 샘플의 제조시, FGF-23을 절단하는 효소는 트롬빈인 것이 밝혀졌다(실시예 17). 따라서, 트롬빈 억제제를 혈청 샘플 제조시 첨가함으로써 혈청 샘플 제조에 따른 FGF-23의 주요 절단을 억제하고, 검출에서의 FGF-23 절단에 의한 영향을 피할 수도 있다. 트롬빈 억제제로서는 FGF-23의 검출을 방해하지 않는 것이면 어떠한 것이든 좋으며, 바람직하게는 히루딘을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 서열 1에 나타낸 25번째 내지 179번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체, 및 서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체를 포함하는, FGF-23의 검출 키트에 관한 것이다. 본 발명의 FGF-23의 검출 키트에 있어서, 항FGF-23 항체 외에 안정제, pH 조정제 등을 필요에 따라 함유시킬 수 있다.

(2) FGF-23을 고감도로 검출하는 방법

FGF-23의 생체에서의 작용과 병태와의 관련을 명확하게 하는 것은 임상적으로 유용하며, 종양성 골연화증의 감별 진단이나 유전성 저인혈증성 구루병(ADHR, XLH: X-연관 저인혈증성 구루병(X-linked hypophosphatemic rickets))의 진단에 있어서 유용하다. 영양 불량 및 가족력이 확인되지 않은 저인혈증, 구루병, 골연화증에 대해서는 병인을 특정할 수 없는 질환으로서 진단이 곤란한 것이 현실이다. 이러한 환자에게 FGF-23의 혈중 농도 상승이 확인된 경우, 유전자 변이의 확인에 의한 유전성 질환의 감별 진단이나 정밀한 종양 검출법을 응용하여 종양을 발견함으로써 종양성 골연화증의 치료를 가능하게 하는 등의 치료 지침을 유도할 수 있게 된다. 또한, FGF-23이 인 대사 조절 인자, 비타민 D 대사 조절 인자로서 생체 기능에 밀접하게 관여하고 있는 가능성으로부터, 미네랄 대사 이상을 수반하는 질환, 간기능 질환, 골 대사 질환 등의 병태에서 혈중 농도가 변동하는 것을 생각할 수 있으며, 건강한 사람의 평균적인 FGF-23의 혈중 농도와, 이들 질환 환자의 FGF-23 혈중 농도를 비교함으로써 병태의 이해, 치료 방법의 선택이나 치료 방침의 결정에 유용하다고 여겨진다. 이러한 FGF-23의 검출계를 구축하는 데 있어서, 혈중 FGF-23 농도를 측정할 수 있는 검출 감도가 요구된다. 본 발명자들은 취득한 항체의여러가지 조합을 샌드위치 ELISA법으로 검토하고, 건강한 사람 및 질환 환자에서의 FGF-23의 혈중 농도를 정량적으로 측정하는 것을 가능하게 하였다.

항체를 활용하여 항체가 인식하는 물질("항원 분자"라고 함)을 검출하는 방법으로서는, 항체와 항원 분자의 결합을 이용하여 검출가능한 양의 기질을 회수하는 방법, 검출 대상인 항원 분자에 특이적으로 결합한 항체를 검출함으로써 항원 분자의 존재를 검출하는 방법, 공지량의 기질과 항체와의 특이적 결합에 있어서 검출 대상인 항원 분자를 존재시킴으로써 생기는 경합을 측정하여 항원 분자의 존재를 검출하는 방법 등이 있다. 이들을 활용한 정성적인 검출 방법으로서는 웨스턴 블롯팅, 면역 침강법, 면역 염색 등이 있으며, 또한 정량적으로 측정하는 방법으로서는 방사 면역 분석법, ELISA, FACS 등의 방법이 일반적으로 알려져 있다. 또한, 항체가 인식하는 항원 분자가 수식이나 절단을 받아 다양한 형태를 나타내기 때문에, 그 일부 형태의 것을 특정하여 검출하는 방법으로서는, 대상 물질의 상이한 부위를 인식하는 항체를 조합하는 것이 유효하며, 대표예로서 샌드위치 ELISA가 있다.

본 발명의 FGF-23의 검출 방법을 완성함에 있어서, FGF-23에는 단백질 절단에 기인하는 복수의 분자종이 존재한다는 것을 도 1A에 나타내었다. 특히, 실시예 16에 나타낸 바와 같이 혈중에서 전장으로서 존재하는 FGF-23이 혈청 중에서 절단되는 것으로 밝혀졌고, 생체 내에서의 FGF-23을 정확하게 정량적으로 검출하기 위해서는 이러한 절단을 고려한 검출계의 개발이 필요하였다. 여기에는 상술한 FGF-23 단백질의 부분 서열을 인식하는 항체를 조합하여 사용하는 것이 매우 유용하였다. 폴리클로날 항체를 이용한 ELISA에 대해서는, 실시예 7에 나타낸 바와 같이 FGF-23 단백질과 그의 절단 단편을 선택적으로 측정할 수 있음을 나타내었다. 또한, 실시예 3, 실시예 4에서 취득한 항FGF-23 모노클로날 항체에 대해서도 FGF-23 단백질의 인식 부위의 특이성이 해석되었고, 또한 FGF-23과의 결합 특성으로부터 샌드위치 ELISA로의 응용이 가능함을 밝혔다. 취득한 항체 중 1D6A 항체, 2C3B 항체, 3C1E 항체는 각각 고상화 항체로서도 검출 항체로서도 사용할 수 있는 것으로 판명되었다. 한편, 2A2B 항체는 어떠한 용도에도 부적합하였다. 또한, FGF-23 단백질의 단백질 절단이 생체 내 및 혈청 제조시에 발생하는 것으로 밝혀졌다. 서열 1에 나타낸 FGF-23 단백질 아미노산의 25번째 내지 179번째까지의 서열 영역, 180번째 내지 196번째까지의 서열 영역, 197번째 내지 251번째까지의 서열 영역을 각각 인식하는 항체를 조합함으로써 FGF-23 단백질의 대사물 검출, 측정을 실현할 수 있다. 본 발명의 항체 중에서 2C3B 항체는 서열 1에 나타낸 FGF-23 단백질 아미노산의 25번째 내지 179번째까지의 서열 영역을 인식하는 항체이고, 3C1E 항체는 180번째 내지 196번째까지의 서열 영역을 인식하는 항체이다. 1D6A 항체는 서열 1의 237번째 내지 251번째의 서열 영역을 인식하는 항체이다. 특히, 임상 검사 등의 목적으로 활성을 갖는 FGF-23 단백질의 검출을 고려했을 경우, 혈청 제조시 생기는 절단도 고려하여 25번째 내지 179번째까지의 서열 영역을 인식하는 항체와, 180번째 내지 196번째까지의 서열 영역을 인식하는 항체를 조합하는 것이 바람직하며, 특히 2C3B 항체 또는 2C5L 항체를 고상화 항체로서 사용하고, 3C1E 항체를 검출 항체로서 사용함으로써 고감도의 검출계를 실현하였다. 또한, 전장의 FGF-23 단백질을 검출하는 데 있어서는, 25번째 내지 179번째까지의 서열 영역을 인식하는 항체와, 237번째 내지 251번째까지의 서열 영역을 인식하는 항체를 조합하는 것이 바람직하며, 특히 2C3B 항체를 고상화 항체로서 사용하고, 1D6A 항체를 검출 항체로서 사용함으로써 고감도의 검출계를 실현하였다.

3. 저인혈증성 질환, 구루병, 골연화증의 진단 방법

ADHR의 환자에게 있어서 FGF-23 유전자의 미스센스 변이가 저인혈증성 질환의 야기에 관여한다는 것이 시사되었다(The ADHR Consortium. Autosomal dominant hypophosphatemic rickets is associated with mutations in FGF23. Nature Genet. 26: 345-348, 2000). 또한, 본 발명자들은 종양성 골연화증에 있어서 종양이 생산하는 질환 야기 인자로서 FGF-23을 동정하였다(Shimada, T., Mizutani, S., Muto, T., Yoneya, T., Hino, R. Takeda, S, Takeuchi, Y., Fujita, T., Fukumoto, S and Yamashita, T., Cloning and chatacterization of FGF23 as a causative factor of tumor-induced osteomalacia., Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 6500-6505, 2001). 이들 연구에 의해 FGF-23이 저인혈증성 질환이나 구루병ㆍ골연화증을 수반하는 질환에 관여하고 있을 가능성이 있다. 그러나, 이제까지 생체 내의 FGF-23을 정량적으로 해석하는 방법은 없었다. 본 발명에서 발명자들은 상술한 바와 같이 FGF-23의 특이적 검출계를 확립하였다. 이것을 이용하여 실시예 19에 나타낸 바와 같이, 종양성 골연화증 환자로부터 종양 적출 전에 채취한 혈액 샘플과 종양 적출 후의 혈액 샘플에 포함되는 FGF-23을 정량적으로 측정하였다. 도 14B에 나타낸 바와 같이 수술 전에도 혈중 FGF-23이 현저한 고수치를 나타냈지만, 종양 적출 후의혈중 FGF-23 농도는 검출 한계 부근까지 저하되었다. 종양성 골연화증에서 일반적으로 종양은 작으며, 저인혈증, 근력 저하, 골통, 골연화증 등의 증상을 나타냄에도 불구하고, 원인 종양이 발견되지 않는 경우가 있다. 또한, 종양이 확인된 경우에 있어서도 종양이 FGF-23을 생산하는 것을 확인할 수 없기 때문에, 유사한 증상을 나타내는 저인혈증 질환과의 감별 진단이 곤란하다. 본 발명의 측정은 종양성 골연화증 질환에서의 혈중 FGF-23의 상승 수준을 검출하는 것을 가능하게 하는 것이며, 종래 불가능했던 진단을 가능하게 하는 것이다.

유전성 저인혈증 중에서 가장 이환률이 높은 질환인 XLH는 약 2만명에 1명의 비율로 존재한다고 한다. XLH의 책임 유전자는 PHEX로서 동정되고 있지만, 이 유전자는 22개의 엑손을 포함하고, 그 유전자 영역은 220 kb에 달하기 때문에 유전병의 원인이 되는 변이 해석은 현시점에서 진단 목적으로는 불가능한 상황이다. 돌발적 발증례나 성인 발증형의 존재도 시사되고 있다. 현재까지 PHEX와 FGF-23의 관련은 밝혀져 있지 않다. XLH의 모델 동물로서 자연 발증 변이 마우스인 Hyp 마우스가 알려져 있다. 이 마우스에서는 PHEX 유전자의 3' 영역의 결손이 확인되었고, 저인혈증, 구루병ㆍ골연화증을 나타내는 것이 알려져 있다. 본 발명의 측정계를 이용하여 실시예 23에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 Hyp 마우스에서의 FGF-23 혈중 농도를 측정하고, FGF-23의 농도가 현저히 높다는 것을 발견하였다. 이러한 점으로부터 본 발명의 항체 및 그것을 이용한 검출법이나 측정법이 종양성 골연화증, XLH의 진단을 가능하게 하는 것임이 밝혀졌다. 또한, 다른 저인혈증 질환에서 FGF-23의 변이가 원인이라고 여겨지는 ADHR에 있어서도 본 발명의 측정법을 활용할 수 있다고 여겨진다.

FGF-23은 혈중 인 농도와 1,25D 농도를 저하시키는 활성을 갖지만, 그 생리적 역할에 대해서는 잘 해명되어 있지 않다. 후술하는 FGF-23 활성의 중화 실험에 의해, 본 발명자들은 FGF-23이 건강할 때에도 인이나 1,25D의 대사 균형을 유지하는 데 있어서 중요한 역할을 갖는다는 것을 밝혔다. 따라서, FGF-23은 인 대사 및 인 대사와 밀접하게 관련된 신장 질환, 장관 질환, 미네랄 대사성 질환, 비타민 D 대사 이상 질환의 병태에 관여한다고 여겨진다. 또한, 1,25D 또는 그의 유도체 투여를 받고 있는 환자에 있어서도 FGF-23이 변동됨으로써 병태나 치료 효과에 영향을 준다고 여겨진다. 본 발명의 측정계는 이들 병태를 깊이 이해하여 보다 정확한 의료 행위를 가능하게 하는 것이라고 여겨진다.

4. FGF-23 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 질환 치료 방법

FGF-23의 과잉 작용이 질환을 야기하는 것으로 종양성 골연화증, ADHR이 알려져 있다. 또한, 본 발명자들은 본 발명 중에서 XLH에 있어서도 FGF-23이 혈중 고수치를 나타내는 것을 밝혀냈다. FGF-23을 억제하는 것은 저인혈증이나 구루병, 골연화증 개선으로 연결된다고 여겨진다. FGF-23이 신장의 근위 세뇨관 상피 세포에 작용하는 것을 고려하면, 세뇨관의 기능 장해 치료에 유용한 가능성을 생각할 수 있다. 또한, FGF-23의 인 대사 조절이나 비타민 D 대사 조절에서의 역할을 고려하면, 인 대사 이상 질환이나 Ca 대사 이상 질환, 골 대사 이상 질환, 신장 기능 저하에 따른 대사 이상 질환, 신부전 혈액 투석에 따른 대사 이상, 신장 이식에 따른 질환에서 FGF-23이 바람직하지 않은 작용으로서 기능하고 있을 가능성을 생각할수 있다. 마찬가지로 신장 이식 후에 높은 빈도로 저인혈증이 확인되고, 골 감소증을 수반하는 것이 보고되어 있으며, 이러한 증례에 있어서도 FGF-23의 관여가 시사되고 있다. 이러한 경우에는, 이상적으로 상승한 FGF-23을 정상 수준으로 되돌릴 뿐만 아니라, 약리적 처치로서 정상치를 나타내는 FGF-23을 더 저하시킬 필요가 있는 경우도 생각할 수 있다. 실시예 27, 실시예 28에 나타낸 FGF-23의 활성을 중화 또는 수식할 수 있는 항체는 여러가지 질환 치료에 유용하다고 여겨진다. 실시예 25에 나타낸 바와 같이 신장 기능 저하에 의한 고인혈증을 나타내는 동물에 있어서, FGF-23이 현저하게 높은 값을 나타내는 것이 발견되었다. 신장 기능 저하에 따른 비타민 D 대사 이상의 적어도 일부는 이 FGF-23의 상승에 의한 작용이라고 여겨진다. 본 발명의 항체를 이용하여 FGF-23의 활성을 중화 또는 제거함으로써, 상기 FGF-23의 이상 고수치에 따른 질환을 치료할 수 있다고 여겨진다. 특히 인 대사, 칼슘 대사, 비타민 D 대사의 시정에 의해 저칼슘혈증, 부갑상선 기능 항진증, 이소성 석회화, 가려움증 등의 미네랄 대사 이상에 따른 질환이나 신장성 골이영양증, 투석골증과 같은 신장 기능 저하에 따른 골 대사 이상 질환에 유용하다고 여겨진다. 나아가, 혈액 투석 환자에게 문제가 되고 있는 석회화를 수반하는 심혈관 기능 저하증에도 유용하다고 여겨진다. 또한, 실시예 27에 나타낸 바와 같이, 정상적인 대사 상황에 있어서도 FGF-23이 미네랄 대사나 비타민 D 대사에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 상술한 고인혈증에서 FGF-23이 유도될 뿐만 아니라, FGF-23이 신속하게 1,25D를 저하시키고, 1,25D에 의해 FGF-23이 신속하게 유도되는 것을 생각하면, 본 발명의 FGF-23의 활성을 중화 또는 수식할 수 있는 항체는 FGF-23의 작용을 억제하여 인 대사나 비타민 D 대사, 칼슘 대사를 조절할 뿐만 아니라, 간접적으로 부갑상선 호르몬이나 칼시토닌과 같은 칼슘 대사 호르몬을 조절하여 미네랄 대사 이상 질환에 있어서 광범위한 유용성을 갖는다고 여겨진다. 특히, 미네랄 대사의 균형과 대사 회전이 관련되어 다양한 병태를 나타내는 골다공증이나 골감소증, 골경화증, 파젯병, 또는 고칼슘혈증이나 부갑상선 기능 저하증의 치료에 유효한 것으로 기대된다. 이상과 같이 본 발명의 항체는 상술한 질환 중 하나 이상의 질환에 유용하다고 여겨진다.

5. FGF-23의 생물 활성에 대한 중화 항체

FGF-23은 상술한 바와 같이 생체의 대사 조절에 있어서 중요한 역할을 한다고 여겨진다. 이러한 인자의 생물 활성을 조절하는 방법은 여러가지 질환의 치료나 예방에 도움이 된다고 여겨진다. 항체는 항원 분자와의 특이적 결합을 특징으로 하지만, 그 인식 부위에 의해 항원 분자의 구조나 기능에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 FGF-23의 기능 조절, 특히 생물 활성을 억제할 수 있는 항체를 단리 동정하는 것을 목표로 하였다. 실시예 27, 28에 나타낸 바와 같이, FGF-23을 인식하는 항체를 투여함으로써 혈청 인의 상승과 혈청 1,25D 농도가 상승하는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명에서 사용한 항체는 실험적으로 마우스의 체내에서 생산시킨 인간 FGF-23의 혈청 인 및 1,25D를 저하시키는 활성을 완전히 소실시켰다. 또한, 인간 FGF-23을 생산시키지 않는 대조군 마우스에 있어서도, 혈청 인의 상승과 비타민 D의 상승이 확인되었다. 이 감소는 FGF-23을 투여한 경우 보여지는 변화와 전혀 반대의 것으로, 본 발명의 항체는 마우스의 내인성FGF-23도 억제한다고 여겨진다. 한편, 상기 현상은 FGF-23이 병태시 뿐만 아니라 정상시에도 인이나 비타민 D 대사를 제어하는 인자로서 기능하고 있다는 것을 나타내는 것이다. 본 발명의 FGF-23의 생물 활성을 소실 또는 감소시킬 수 있는 항체는, FGF-23의 생물 활성이 반영하는 생리적 및 병리적 상황을 조절할 수 있는 것이다. 본 발명의 항체가 제어할 수 있는 FGF-23의 생물 활성의 범위는 인 대사나 비타민 D 대사만으로 규정되는 것은 아니며, FGF-23이 갖는 모든 생물 활성, 생리 활성을 제어할 수 있는 것이다.

또한, 실시예 31에 나타낸 바와 같이 FGF-23의 상이한 부위, 즉 다른 에피토프를 인식하는 2종 이상의 항체를 사용할 수도 있으며, 이 경우 항체의 중화 활성이 증강되어 항체의 작용 시간도 장시간 유지될 수 있다. 2종 이상의 항체의 조합으로서는, 예를 들면 서열 1에 나타낸 180번째 내지 194번째 또는 237번째 내지 251번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체의 조합, 또는 수탁 번호가 FERM BP-7838, FERM BP-7839, FERM BP-7840 또는 FERM BP-8268인 하이브리도마가 생산하는 항체의 조합 등이 있다.

6. 항FGF-23 항체를 포함하는 의약 조성물

본 발명의 항체 또는 의약 조성물은, 체내에서 생산된 FGF-23이나 FGF-23을 발현하는 세포가 관련된 여러가지 질환 또는 증상의 치료 또는 예방으로의 적용이 가능하다. 본 발명의 항체는 종양성 골연화증, ADHR, XLH에 대하여 의약 조성물로서 사용할 수 있으며, 이들 질환에서 공통적으로 확인되는 저인혈증, 골석회화 부전, 골통, 근력 저하, 골격의 변형, 성장 장해, 저1,25D 혈증에 대하여 개선 효과를 기대할 수 있다. 또한, 상술한 바와 같이 FGF-23이 생리적 조건하에서 중요한 역할을 하고 있으며, FGF-23의 인 대사 조절 작용이나 FGF-23이 조절하는 비타민 D 대사를 통한 칼슘 대사 조절 작용을 본 발명의 항체가 제어함으로써, 골다공증, 구루병, 고칼슘혈증, 저칼슘혈증, 이소성 석회화, 골경화증, 골신장 장해, 골석회화 장해, 파젯병, 부갑상선 기능 항진증, 부갑상선 기능 저하증, 가려움증 등의 미네랄 대사나 비타민 D 대사의 이상에 기인하는 질환에 대하여 치료적 및 예방적인 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 또한, 신부전에 있어서 혈중 FGF-23 농도의 상승이 명확하기 때문에 신장성 골이영양증, 투석골증, 세뇨관 기능 장해 등으로 대표되는 신부전이나 혈액 투석에 합병되는 질환에 대해서도 치료적 및 예방적인 의약 조성물로서 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체에 치료 시약을 결합시킨 것을 의약 조성물로서 사용할 수 있다. 종양성 골연화증에 있어서는, 종양이 FGF-23을 과잉 생산하여 병태를 야기하는 것으로 알려져 있으며, 현재 유일한 치료 방법은 그 원인 종양을 제거하는 것이다. 그러나, 원인 종양은 작은 것이 대부분이며, MRI에서의 철저한 검색으로 겨우 발견할 수 있는 예도 여러건 보고되고 있다. 또한, 종양을 발견할 수 없기 때문에 원인 불명의 저인혈증이나 골연화증이라고 진단되고 있는 예도 많다고 여겨진다. 이러한 질환에 대하여 본 발명의 항체는 FGF-23과의 친화성에 의해 FGF-23 생산 종양에 집적된다고 여겨진다. 이 성질을 이용하여 종양을 퇴축시키는 방법으로서 치료 시약을 본 발명의 항체에 결합시켜 사용하는 것이 유효하다. 항체로 결합시키는 치료용 시약으로서는, ① 요오드(131요오드: 131I, 125요오드 125I), 이트륨(90이트륨: 90Y), 인듐(111인듐: 111In), 테크네튬(99m테크네튬: 99 mTc) 등의 방사핵종(J.W.Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS), ② 녹농균 독소(Pseudomonas exotoxin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 리신(Ricin)과 같은 세균 독소, 및 ③ 메토트렉세이트(Methotrexate), 마이토마이신(mitomycin), 칼리키아마이신 (Calicheamicin) 등의 화학 요법제(D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T.J.International Ltd, M.L.Grossbard., Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc) 등을 들수 있고, 보다 바람직하게는 마이탄시노이드(Maytansinoid) 등의 전구약물을 들 수 있다(Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol52: 127, Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol93: 8681).

또한, 항인간 FGF-23 항체의 정제품을 함유하는 제제도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 제제는 바람직하게는 항체에 추가하여 생리학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 담체를 포함하고 있으며, 다른 항체 또는 항생 물질과 같은 다른 약제와의 혼합물일 수도 있다. 적절한 담체에는 생리적 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 글루코스액, 및 완충 생리 식염수가 포함되지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체는 동결 건조(freeze-dry)하고, 필요할 때 상기와 같은 완충 수용액을 첨가함으로써 재구성하여 사용할 수도 있다. 투여 경로는 경구 경로, 및 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 주사 또는 배약(配藥)을 포함하는 비경장적 경로이다.

본 발명의 의약 조성물을 환자에게 투여하는 경우, 유효 투여량은 1회마다 체중 1 kg당 20 ng 내지 200 mg의 범위에서 선택된다. 또는, 환자 1 인당 0.001 내지 10000 mg, 바람직하게는 환자 1 인당 0.005 내지 2000 mg, 더욱 바람직하게는 환자 1 인당 0.01 내지 1000 mg의 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 의약 조성물은 이들 투여량으로 제한되는 것은 아니다.

7. 항FGF-23 항체를 포함하는 의료 기구

혈액 투석, 혈장 교환, 세포 채취를 목적으로 하는 치료 기술에 있어서, 채취한 체액의 일부나 체외 순환시킨 체액으로부터 생체 내 물질의 제거, 교환, 채취가 행해지고 있다. 이러한 치료 기술에 있어서, 본 발명의 항체는 FGF-23 분자와 특이적으로 결합하는 성질을 이용하여, 생체 내 FGF-23 분자의 선택적 제거나 FGF-23 발현 세포의 선택적 회수에 유용하다. 혈액 투석이나 혈장 교환에 있어서는, 체액이 접하는 소재의 일부에 본 발명의 항체를 고정화하는 방법 등을 생각할 수 있다. 투석막의 재질로서는 셀룰로오스막 등 뿐만 아니라, 합성 고분자막인 폴리아크릴로니트릴막, 폴리메틸메타크릴레이트막, 에틸렌비닐알코올막, 폴리술폰막, 폴리아미드막, 폴리에테르술폰/폴리아릴레이트막 등이 사용되고 있는데, 이러한 막에 항체를 공유 결합으로 고정하여 혈액 투석에 사용하는 것을 생각할 수 있다. 또한, 세파로스 등의 비드에 항체를 결합시킨 것을 충전한 칼럼으로서 체액 분리를 행하는 방법도 생각할 수 있다. 또한, 자기 비드 상에 항체를 고정화하고, 항체 결합 분자와 혼화하여 결합하게 한 후, 자석을 이용하여 항체와 대상 물질의 복합체를 회수하는 방법 등도 가능하며, 이러한 방법으로 세포를 회수하여 치료에 사용하는 방법도 행해지고 있다. 이와 같이 의료 용구로서 적절한 기재에 본 발명의 항체를 결합시켜 의료 기구로서 사용할 수 있다.

8. FGF-23의 분자 구조나 생물 활성을 제어하는 방법

단백질이 갖는 생물 활성을 생체 내에서 유지하는 데 있어서 중요한 점은, 단백질의 3차 구조를 생체 내에서 유지한 채 존재시키는 것이다. 생체 인자 중에서도 인슐린-유사 성장 인자(IGF: Insulin-like growth factor)나, 종양 증식 인자 베타(TGF-β: Transforming growth factor-β)에서 보여지는 바와 같이 생체에서 별도의 단백질과 결합하여, 그 생물 활성을 제어하고 있는 예가 다수 확인된다. FGF-23에 있어서는, 현재 시점에서 결합 단백질이라는 것은 알려져 있지 않다. 본 발명의 항체 중에는 실시예 9에 나타낸 바와 같이 부분 펩티드와는 결합하지 않고, FGF-23의 구조를 강하게 인식하고 있다고 여겨지는 2C3B 항체가 포함되어 있다. 이들 항체 또는 항체 중 일부를 이용하여 FGF-23에 결합시킨 상태를 만들어냄으로써, FGF-23의 생체 내에서의 생물 활성을 조절할 수 있다고 여겨진다.

9. FGF-23을 효율적으로 제거하는 방법

간기능의 현저한 저하를 초래하면, 요독증 물질의 체내로부터의 제거가 필요해진다. 저분자량의 요독증 물질의 제거에 대해서는 투석막을 이용한 혈액 투석이 실용화되어 있다. 그러나, 고분자량의 단백질 제거에 대해서는 여전히 과제로 남아 있다. 본 발명의 항체는 FGF-23의 특이적 제거로서도 이용 가능하다. 혈액 투석에서 행해지고 있는 바와 같이, 혈액을 체외 순환시키는 혈액을 본 발명의 항체를 고상화한 기재에 접촉시킴으로써 FGF-23을 선택적으로 제거할 수 있다. FGF-23이 과잉 존재하는 질환의 치료 용구로서의 응용을 생각할 수 있다. 실시예 25에 나타낸 바와 같이 신장 기능 부전시에 FGF-23이 고수치를 나타낸다는 점으로부터 FGF-23이 투석 합병증의 야기 인자일 가능성을 생각할 수 있다. 특히, FGF-23이 1,25D를 저하시키는 작용이 있기 때문에 신장 기능 저하에 따른 1,25D 저하의 야기 인자로서 FGF-23이 기능하고 있을 가능성이 높으며, 투석 환자에 있어서 본 발명의 항체를 이용하여 FGF-23을 제거하는 방법은 투석 합병증 치료에 유용하다고 여겨진다.

이상과 같이, 본 발명은 FGF-23을 인식할 뿐만 아니라, FGF-23이 관련한 생리적, 약리적, 병리적 작용을 조절할 수 있고, 질환의 치료, 예방, 진단에 응용할 수 있는 항체를 취득함으로써 본 발명을 완성하였다.

10. 경합 항체의 특정

FGF-23과의 결합에서 본 발명의 항체와 동일한 부위 또는 매우 근접한 부위를 인식하는 항체는, 여기서 나타낸 특성과 동등한 성질을 나타낸다고 여겨진다. 사실상 동등한 이러한 항체는 경합 실험을 행함으로써 분별할 수 있다. 2종 이상의 항체간을 공존시켰을 경우, 항원 결합에서 서로 배타적인 결합 특성을 나타내는 것이 경합 항체라고 정의된다. 본 발명의 경합 항체를 특정하기 위해서는 표지한 항체와 FGF-23 단백질이 결합하는 조건에서 표지되어 있지 않은 항체를 과잉량 존재시킴으로써 판정할 수 있다. 첨가한 항체가 본 발명 항체와 FGF-23 단백질의 결합을 현저하게 저하시키는 경우에는 경합한다고 판단할 수 있다.

본 명세서는 본 발명의 우선권 기초인 일본 특허 출원 2001-401689호 및 특허 출원 2002-262020호의 명세서 및(또는) 도면에 기재된 내용을 포함한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 그 실시예에 기재되는 양태나 기술적 범위로만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합체 FGF-23 발현 벡터의 제조

(1) FGF-23H 단백질 발현 벡터의 구축

FGF-23을 코딩하는 cDNA는 종양성 골연화증의 책임 종양인 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, F1EcoRI 프라이머(서열 2)와 LHisNot 프라이머(서열 3), 및 LA-Taq DNA 중합효소를 사용하여 96 ℃에서 1 분간 보온한 후, 96 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초로 이루어지는 공정을 1 사이클로 하여 35 사이클의 PCR을 실시함으로써 증폭하였다. F1EcoRI 프라이머는 FGF-23을 코딩하는 염기 서열의 5'측 상류에 존재하는 서열에 어닐링하고, 그 증폭 단편의 FGF-23을 코딩하는 영역의 5'측에 EcoRI 제한 효소 부위를 부가한다. LHisNot 프라이머는 FGF-23을 코딩하는 서열의 종결 코돈의 5'측 서열과 어닐링하는 서열 및 His6-태그 서열 (His-His-His-His-His-His)을 코딩하는 서열과 이어지는 종결 코돈, 및 NotI 제한 효소 서열을 포함한다. 그 결과, 증폭 단편은 FGF-23 단백질의 C 말단에 His6-태그 서열을 부가한 것을 코딩하게 되며, 그 하류에 NotI 제한 효소 부위를 갖는다. 이 증폭 단편을 EcoRI와 NotI로 분해하고, 마찬가지로 EcoRI와 NotI로 분해한 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1Zeo(미국, 인비트로젠사)와 연결하였다. 이와 같이 제조한 발현 벡터를 클로닝하고, 염기 서열을 결정하여 His6-태그 서열이 부가된 목적 FGF-23 단백질을 코딩하는 것을 확인하였다. 이 벡터를 pcDNAFGF-23H라고 한다.

F1EcoRI: CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(서열 2)

LHisNot: ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(서열 3)

(2) FGF-23 단백질 발현 벡터의 구축

pcDNA/FGF-23H를 주형으로 하고, F1EcoRI 프라이머와 LNot 프라이머(서열 4), 및 LA-Taq DNA 중합효소를 사용하여 94 ℃에서 1 분간 보온한 후, 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분으로 이루어지는 공정을 1 사이클로 하여 25 사이클의 PCR을 실시함으로써 증폭하였다. 반응 종료 후, PCR 산물의 말단을 T4 DNA 중합효소(스위스, 로슈사)에 의해 평활화한 후, 폴리뉴클레오티드 키나아제(Polynucleotide kinase, 스위스, 로슈사)를 사용하여 DNA 말단의 인산화를 행함으로써 FGF-23 단백질을 코딩하는 cDNA 단편을 제조하였다. 발현 벡터 pCAGGS(Niwa H, et al., Gene. 1991, 108: 193-199)를 EcoRI로 분해하고, 클레나우(Klenow) 단편(스위스, 로슈사)을 사용하여 말단을 평활화하고, 소 소장 알칼리포스파타제(일본, 다까라 슈조사)를 사용하여 탈인산화를 행하였다. 이와 같이 제조한 FGF-23을 코딩하는 cDNA 단편과 pCAGGS 벡터를 연결하였다. 이와 같이 제조한 발현 벡터를 클로닝하고, 염기 서열을 결정하여 목적의 FGF-23 단백질을 코딩하는 서열이 정확하게 삽입되어 있는 것을 확인하였다.

이 벡터를 pCAGGS/FGF-23이라고 한다.

또한, 상술한 F1EcoRI 프라이머와 LNot 프라이머로 증폭한 FGF-23 코딩 단편을 EcoRI와 NotI로 분해한 후 정제하였다. 이것을 발현 벡터인 pEAK8(미국, 엣지 바이오시스템(Edge Biosystem)사)에 분자 내 리보솜 엔트리 서열(IRES)과 증강형 녹색 형광 단백질(EGFP)을 연결한 pEAK8/IRES/EGFP 벡터의 EcoRI과 NotI 제한 효소 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 취득한 플라스미드의 염기 서열을 결정하여 FGF-23 단백질을 코딩하고 있는 것을 확인하였다. 이 벡터를 pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23이라고 한다.

LNot: ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(서열 4)

pCAGGS/FGF-23을 EcoRI로 분해하여 직쇄화한 후, 클레나우 단편(스위스, 로슈사)를 사용하여 말단을 평활화하였다. 이것을 다시 BamHI로 분해하여 FGF-23의 cDNA를 포함하는 DNA 단편을 아가로스 전기영동으로 분리 정제하였다. 또한, 발현 벡터 INPEP4를 BglII로 분해한 후, 클레나우 단편(스위스, 로슈사)를 사용하여 말단을 평활화하였다. 또한, BamHI로 분해한 후 아가로스 전기영동으로 벡터를 정제하였다. 이들 FGF-23 cDNA를 포함하는 단편과 벡터를 연결하였다. 이와 같이 제조한 발현 벡터를 클로닝하고, 염기 서열을 결정하여 목적의 FGF-23 단백질을 코딩하는 서열이 정확하게 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 이 벡터를 INPEP4/FGF-23이라고 한다.

(3) FGF-23RQH의 발현 벡터의 구축

FGF-23 단백질은 179번째 Arg 잔기와 180번째 Ser 잔기 사이에서 단백질이절단되기 쉽다는 사실이 발견되었다. 이 절단 부위의 N 말단측 아미노산 서열은 단백질 변환 효소의 인식 서열인 Arg-X-X-Arg 서열과 일치하는 Arg176-His177-Thr178-Arg179(서열 31)이고, ADHR에서의 미스센스 변이가 상기 176번째 또는 178번째 Arg 잔기의 치환 변이인 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 단백질 변환 효소에 의한 절단에 내성을 나타내고, 또한 ADHR에 보여지는 변이 FGF-23의 모델로서 C 말단에 His6-태그를 갖고, 176번째와 179번째 Arg 잔기를 Gln 잔기로 치환한 변이 FGF-23 단백질(이하, "FGF-23RQH"라고 함)을 실험적으로 제조하기 위한 벡터 구축을 행하였다. 제조 방법은 Arg를 Gln로 치환하기 위한 염기 치환 서열을 포함하는 정방향 프라이머인 RQF(서열 5)와 역방향 프라이머인 RQR(서열 6)을 합성하였다. 또한, 이 염기 치환 프라이머와 조합하여 변이 도입 부위의 5'측과 3'측의 FGF-23 서열을 증폭하기 위한 프라이머인 ME1(서열 7)과 HNt(서열 8)를 제조하였다. ME1은 FGF-23 cDNA가 코딩하는 개시 코돈을 포함하는 부분의 정방향의 프라이머이고, EcoRI 제한 효소 서열을 가지며, HNt는 FGF-23 cDNA가 코딩하는 종결 코돈 전에 His6-태그 서열을 코딩하는 코돈 서열을 삽입할 수 있고, NotI 제한 효소 서열을 부가할 수 있는 역방향 프라이머이다.

RQF: ATACCACGGCAGCACACCCAGAGCGCCGAG(서열 5)

RQR: CTCGGCGCTCTGGGTGTGCTGCCGTGGTAT(서열 6)

ME1: ATGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGG(서열 7)

HNt: ATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGATGAACTTGGCGAAGGG(서열 8)

10 ng의 pCAGGS/FGF-23을 주형으로 하고, RQF와 HNt의 조합, 및 ME1과 RQR의조합의 프라이머(각 200 nM)로 PCR 반응을 실시하였다. 반응은 pfu DNA 중합효소(미국, 프로메가사)를 사용하여 94 ℃에서 1 분간 보온한 후, 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분으로 이루어지는 공정을 1 사이클로 하여 25 사이클을 실시하였다. 이렇게 해서 얻은 2종의 반응액을 10배로 희석하고, 그 중의 1 ㎕씩을 혼화하여 주형으로 하고, 여기에 ME1과 HNt의 최종 농도가 200 nM이 되도록 첨가한 50 ㎕의 PCR 반응액을 제조하여 94 ℃에서 1 분간 보온한 후, 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분으로 이루어지는 공정을 1 사이클로 하여 25 사이클의 PCR 반응을 실시하였다. 여기서는 LA Taq DNA 중합효소(일본, 다까라 슈조사)를 사용하였다. 얻어진 약 800 bp의 증폭 산물을 EcoRI와 NotI로 분해한 후에 정제하여 삽입체 DNA를 취득하였다. 이것을 발현 벡터인 pEAK8(미국, 엣지 바이오시스템사)에 분자 내 리보솜 엔트리 서열(IRES)과 증강형 녹색 형광 단백질 (EGFP)을 연결한 pEAK8/IRES/EGFP 벡터의 EcoRI와 NotI 제한 효소 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 취득한 플라스미드의 염기 서열을 결정하여 목적하는 176번째와 179번째 Arg가 Gln로 변환되어 C 말단에 His6-태그 서열이 부가된 변이 FGF-23 단백질을 코딩하고 있는 것을 확인하였다. 이 벡터를 pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQH라고 한다.

<실시예 2> 재조합체 FGF-23 단백질 및 재조합체 변이 FGF-23 단백질의 발현

(1) FGF-23H 발현 세포의 취득

약 20 ㎍의 pcDNAFGF-23H를 벡터 중의 앰피실린 내성 유전자 내에 있는 FspI 제한 효소 부위로 절단하여 직쇄화하고 정제하였다. 이것을 10 ㎕의 순수한 물에용해하고, 1×10⁷개의 CHO Ras 클론-1 세포(Shirahata, S., et al. Biosci Biotech Biochem, 59: 345-347, 1995)와 혼화하여 진 펄서(Gene Pulser) II(미국, 바이오래드사)를 사용하여 전기천공법으로 세포로의 유전자 도입을 행하였다. 이 세포를, 10％ FCS 를 포함하는 MEMα 배양액(미국, Gibco BRL사)에서 24 시간 배양한 후, 최종 농도가 0.5 mg/㎖가 되도록 제오신(Zeocin, 미국, 인비트로젠사)를 첨가하여 1 주일 배양하였다. 접착하여 증식된 세포를 트립신으로 유리하고, 최종 농도 0.3 mg/㎖의 제오신 존재하에서 한계 희석법에 의한 클로닝을 행하여 35종의 클론화 세포를 얻었다. 이들 세포 중에서 FGF-23H 단백질을 가장 잘 발현하는 세포를 이하에 나타낸 웨스턴 블롯팅으로 동정하였다. 각 클론화 세포의 배양 상청을 채취하여 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동을 행한 후, PVDF막(미국, 밀리포어사)에 단백질을 전사하고, 항His-태그(C 말단) 항체(미국, 인비트로젠사)와 ECL 발광 시스템(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)사)를 사용하여 약 32 kDa 부근의 FGF-23H 단백질로부터 유래하는 시그널을 검출하였다. 그 결과, #20이라고 칭하는 클론에서 가장 높은 발현이 확인되었고, 이것을 CHO-OST311이라고 명명하여 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1 쥬오 다이6)에 2000년 8월 11자로 기탁하였다(수탁 번호: FERM BP-7273). 본 명세서에서는 CHO-OST311을 CHO-FGF23H라고 한다.

(2) FGF-23 및 FGF-23RQH 발현 세포의 취득

pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23과 pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQH 벡터의 CHO Ras 클론-1 세포로의 도입은 막융합 지질을 이용한 유전자 도입법에 의해 행하였다. CHORas 클론-1 세포를 6웰 플레이트에 저면의 약 60％를 세포가 피복할 정도로 배양한다. 또한, 배양액을 제거하고, 혈청을 포함하지 않는 MEMα 배양액을 1 ㎖ 첨가한다. 도입하는 벡터 2.5 ㎍과 10 ㎕의 트랜스펙탐(Transfectam, 등록 상표)(미국, 프로메가사)을 각각 50 ㎕의 혈청을 포함하지 않는 MEMα 배양액과 혼화하고, 두가지를 혼합하여 10 분간 정치한 후, 양자를 혼합해 준비해 둔 6웰 플레이트에 첨가하였다. 2 시간 배양한 후, 이 DNA를 포함하는 배양액을 제거하고, 10％의 FCS를 포함하는 배양액으로 치환하여 하룻밤 배양하였다. 다음날 최종 농도가 5 ㎍/㎖가 되도록 퓨로마이신(미국, 시그마사)을 첨가하여 약제 내성 세포를 선택하였다. 이렇게 하여 얻어진 약제 내성 세포는 상술한 FGF-23H 발현 세포의 취득과 마찬가지로 한계 희석법으로 클론화를 행하였다. 또한, 웨스턴 블롯팅에 의해 목적하는 단백질을 가장 잘 발현하는 세포주를 취득하였다. 이들 세포를 각각 CHO-FGF23, CHO-FGF23RQ라고 한다.

(3) 재조합체 단백질의 정제

CHO-FGF23H의 배양 상청 중의 재조합체를 C 말단의 His6-태그 서열에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 검출했더니, 도 1A에 나타낸 바와 같이 32 kDa 부근의 밴드와 10 kDa 부근의 밴드가 확인되었다. 이 2개의 밴드를 겔로부터 잘라내 N 말단측의 아미노산 서열을 결정했더니, 분자량이 큰 쪽의 밴드는 서열 1의 25번째로부터의 아미노산 서열이 검출되어, FGF-23 단백질로부터 분비 과정에서 시그널 서열이 제거된 것이라고 여겨졌다. 한편, 분자량이 작은 밴드는 서열 1의 180번째로부터의 아미노산 서열이 확인되어, 179번째와 180번째 사이에서의 절단에 의해 생긴 단편인 것이 판명되었다. 또한, FGF-23의 N 말단측을 인식하는 폴리클로날 항체를 이용하여 검출함으로써, 179번째까지의 서열을 갖는다고 여겨지는 펩티드의 존재도 확인되었다.

CHO-FGF23H 세포의 배양 상청 1000 ㎖를 16,200 g으로 15 분간, 4 ℃에서 원심분리하여 부유 세포를 제거한 후, 상청을 내경 30 mm×길이 200 mm의 칼럼에 충전한 SP-세파로스 FF(등록 상표)(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)에 통과시킴으로써, 서열 1의 180 내지 251번째에 상당하는 펩티드에 His6-태그가 부가된 펩티드는 통과하고 25 내지 251번째 펩티드(이하, 전장 FGF-23 단백질이라고 하기도 함)에 His6-태그 서열을 부가한 것은 칼럼에 흡착하였다. 이 칼럼에 50 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.7) 중에서 0 내지 0.7 M까지의 NaCl 농도 구배로 흡착 물질을 용출시켰더니, 약 0.3 M의 NaCl으로 용출되는 분획에 His6-태그가 부가된 전장 FGF-23 단백질이 확인되고, 약 0.4 M로 용출되는 분획에 서열 1의 179번째보다 N 말단측의 서열을 갖는다고 여겨지는 펩티드가 확인되었다. 이와 같이 SP-세파로스 칼럼으로 분리된 분획은 이어서 금속 친화도 칼럼, 탈론 슈퍼플로우(Talon Superflow, 등록 상표)(미국, 클론테크사)에 걸어 더 분리할 수 있었다. 179번째로부터 N 말단측의 서열에 대해서도 금속 칼럼과의 친화성을 갖고 있어 정제에 유효하였다. 또한, SP-세파로스 칼럼으로 정제하고, CBB 염색으로 단일 밴드로서 전장의 FGF-23H를 취득할 수 있었다. 이 결과를 도 1B에 나타내었다.

FGF-23 단백질도 동일한 방법으로 정제할 수 있다. CHO-FGF23의 배양 상청을 공경 0.2 ㎛의 막인 슈퍼캡(SuperCap, 등록 상표)(미국, 폴 겔만 래보로토리사)으로 여과하고, 여과된 용액을 SP-세파로스 FF(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)에 통과시켰다. 칼럼과의 친화성이 약한 물질을 50 mM의 인산나트륨 완충액, pH 6.7로 세정, 용출시켰다. 칼럼에 유지된 단백질을 0 내지 0.7 M까지의 NaCl 농도 구배로 용출시켰더니, 약 0.3 M의 NaCl으로 용출되는 분획에 전장 FGF-23 단백질이 확인되었다. 이것을 금속 친화도 칼럼인 탈론 슈퍼플로우(등록 상표)(미국, 클론테크사)에 흡착시킨 후, 50 mM의 인산 나트륨 완충액, pH 6.7로 세정한 후, 이미다졸의 농도를 변화시켜 첨가함으로써 단백질을 용출 정제하였다. 또한, 목적하는 단백질을 포함하는 분획을 SP 세파로스 FF 칼럼에 흡착, 용출시켜 정제하였다. 동일한 방법으로 CHO-FGF23RQ 상청으로부터 전장 FGF-23RQ 단백질을 정제하였다.

<실시예 3> 인간 FGF-23에 대한 마우스 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 취득

이 실시예에서의 모노클로날 항체의 제조는 단일 클론 항체 실험 조작 입문(안도 다미에 등 저서, 고담샤 발행 1991) 등에 기재되어 있는 일반적인 방법에 따라 제조하였다. 피면역화 동물은 Balb/c 마우스를 사용하고, 인간 FGF-23의 면역화는 면역원의 차이에 의해 이하의 2종의 방법으로 행하였다.

(1) 벡터 투여와 재조합체 단백질 투여의 조합에 의한 면역화

Balb/c 마우스에 실시예 1에서 제조한 INPEP4/FGF-23 벡터(10 또는 50 ㎍/마리)를 트랜스 IT(Trans IT, 등록 상표) 생체 내 유전자 전달 시스템 시약(일본, 다까라 슈조사)을 정맥으로부터 도입하여 첫회 면역화를 실시하였다. 첫회 면역화로부터 동일 벡터를 1 주 후에 1회 도입하여 추가 면역화시켰다. 또한, 실시예 2에서 제조한 FGF-23RQH 단백질(20 내지 30 ㎍/마리)을 스쿠알렌, 트윈(Tween) 80, 모노포스포릴 지질(Monophosphoryl lipid) A 및 트레할로스 디마이콜레이트(Trehalose dimycolate)를 포함하는 RIBI 면역보강제(미국, 코릭사(Corixa)사)에 현탁하여 유탁액을 제조한 후, 복강내 주사에 의해 4회 또는 5회 추가 면역화시키고, 다시 이하에 진술하는 비장 세포의 취득 4 일 전에 실시예 2에서 제조한 FGF-23H 단백질 (18 ㎍/마리)을 꼬리정맥 내 주사에 의해 면역화시켰다.

(2) 인간 FGF-23을 이용한 면역화

Balb/c 마우스에 실시예 2에서 제조한 FGF-23(22 ㎍/마리)을 상술한 RIBI 면역보강제에 현탁하여 복강내 주사에 의해 첫회 면역화시켰다. 또한, 동일 단백질을 복강내 주사에 의해 1 주마다 1회, 4 주에 걸쳐 추가 면역화시키고, 이하에 서술하는 비장 세포의 취득 3 일 전에 FGF-23(10 ㎍/마리)을 꼬리정맥 내 주사에 의해 면역화시켰다.

(3) 하이브리도마의 제조와 선별

상술한 바와 같이 면역화된 마우스로부터 비장을 적출하고, 그로부터 회수한 비장 세포를 마우스 미엘로마 SP2/0(ATCC: CRL1581)와 5:1로 혼합하고, 융합제로서 폴리에틸렌글리콜 1500(일본, 로슈 다이아그노스틱스사)을 사용하여 세포 융합시켜 하이브리도마를 제조하였다. 하이브리도마의 선택은 10％의 소 태아 혈청(Fetal Calf Serum, FCS)과 히포크산틴(H), 아미노프테린(A), 티미딘(T)을 함유하는 HAT 함유 DMEM 배지(미국, Gibco BRL사) 중에서 배양함으로써 행하였다. 또한, HT 함유 DMEM 배지를 이용하여 한계 희석법에 의해 클로닝을 실시하였다. 단일 세포로부터 유래하는 클론화 하이브리도마를 취득하였다.

(4) 항FGF-23 항체를 생산하는 클론화된 하이브리도마의 선별

하이브리도마가 생산하는 항체와 FGF-23 단백질과의 결합성을 조사함으로써, FGF-23 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다. 상술한 제1 방법으로 면역화시켜 얻은 하이브리도마의 선별은 이하와 같이 실시하였다. 50 mM의 NaHCO₃용액에 1 ㎍/㎖의 농도로 희석한 FGF-23H 단백질 용액을, ELISA용 96 웰 마이크로 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)의 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하고, 37 ℃에서 30 분 또는 4 ℃에서 12 시간 배양하여 FGF-23H 단백질을 마이크로 플레이트에 흡착시켰다. 이어서, 이 용액을 제거하고, 각 웰에 블로킹 시약(슈퍼블록(SuperBlock, 등록 상표) 블로킹 완충액, 미국, 피어스사)을 첨가하여 실온에서 30 분간 배양한 후, 각 웰을 0.1％의 트윈 20을 함유하는 Tris-완충 염수(500 mM NaCl 함유 TRIZMA 프리-셋 크리스탈스(pre-set crystals, 등록 상표) 미국, 시그마사)(T-TBS)로 2회 세정하였다. 이와 같이 FGF-23H 단백질을 코팅한 마이크로 플레이트의 각 웰에 각각의 하이브리도마의 배양 상청을 50 ㎕ 첨가하고, 30 분간 반응시킨 후, 각 웰을 T-TBS로 2회 세정하였다. 이어서, 각 웰에 50 ㎕씩 3000배 희석한 퍼옥시다제 표지 염소 항마우스 IgG 항체(미국, Zymed laboratories사)를 첨가하여 실온하에서 30 분간 배양하였다. 이것을 T-TBS로 3회 세정한 후, 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 포함하는 기질 완충액을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하여 실온하에서 15 분간 배양하였다. 이어서, 0.5 M 황산을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하고, 반응을 정지하였다. 참조 파장을 570 nm로 하여 파장 450 nm에서의 흡광도를 마이크로 플레이트 판독기(MTP-300, 일본, 코로나 덴끼사)로 측정하였다. 여기서, 명확한 흡광도의 상승을 나타낸 하이브리도마를 선별하고, 다시 FGF-23 단백질을 사용하여 동일한 실험을 실시하여 FGF-23과의 결합이 재확인된 클론을 선별하였다. 이로부터 FGF-23 단백질을 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마로서 9종의 클론을 얻었다.

이 중에는 후에 나타내는 1C3H, 1D6A, 2A2B, 2C3B 및 2C5L이 포함되어 있었다.

상술한 제2 방법으로 면역화시켜 얻은 하이브리도마의 선별은, 이하와 같이 실시하였다. 50 mM의 NaHCO₃용액에 1 ㎍/㎖의 농도로 희석한 FGF-23 단백질 용액을 ELISA용 96 웰 마이크로 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)의 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하고, 4 ℃에서 10 시간 배양하여 FGF-23 단백질을 마이크로 플레이트에 흡착시켰다. 이어서, 이 용액을 제거하고, 각 웰에 블로킹 시약(슈퍼블록(등록 상표) 블로킹 완충액, 미국, 피어스사)을 첨가하여 실온에서 30 분간 배양한 후, 각 웰을 0.1％의 트윈 20을 함유하는 Tris-완충 염수(T-TBS)으로 2회 세정하였다. 이와 같이 FGF-23H 단백질을 코팅한 마이크로 플레이트의 각 웰에 각각의 하이브리도마의 배양 상청을 50 ㎕ 첨가하고, 30 분간 반응시킨 후, 각 웰을 0.1％의 트윈 20을 함유하는 Tris-완충 염수(T-TBS)으로 2회 세정하였다. 이어서, 각 웰에 50 ㎕씩 3000배 희석한 퍼옥시다제 표지 염소 항마우스 IgG 항체(미국, Zymed laboratories사)를 첨가하여 실온하에서 30 분간 배양하였다. 이것을 T-TBS로 3회 세정한 후, 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 포함하는 기질 완충액을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하여 실온하에서 15 분간 배양하였다. 이어서, 0.5 M 황산을 각 웰에50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지하였다. 참조 파장을 570 nm로 하여 파장 450 nm에서의 흡광도를 마이크로 플레이트 판독기(MTP-300, 일본, 코로나 덴끼사)로 측정하였다. 여기서, 명확한 흡광도의 상승을 나타낸 하이브리도마를 선별하였다. 이로부터 FGF-23 단백질을 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마로서 새롭게 4종의 클론을 얻었다. 이 중에 3C1E가 포함되어 있었다.

이와 같이 취득한 FGF-23 단백질을 특이적으로 인식하는 항체의 서브클래스를 이소 스트립(Iso Strip) 마우스 모노클로날 항체 이소타이핑 키트(미국, 로슈사)를 이용하여 동정하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 하이브리도마 클론 중 3개의 하이브리도마 클론 2C3B, 3C1E 및 1D6A를 2001년 12월 26일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1 쥬오 다이6)에 부타페스트 조약에 기초하여 국제 기탁하였다. 또한, 하이브리도마 클론 2C5L을 2003년 1월 6일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1 쥬오 다이6)에 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁하였다. 수탁번호는 이하와 같다.

2C3B: FERM BP-7838

3C1E: FERM BP-7839

1D6A: FERM BP-7840

2C5L: FERM BP-8268

<실시예 4> 모노클로날 항체의 제조

(1) 항FGF-23 항체를 포함하는 배양 상청의 제조

항FGF-23 항체 생산 하이브리도마를 10 ㎍/㎖의 소 인슐린(미국, 시그마사), 5.5 ㎍/㎖의 인간 트랜스페린(미국, 시그마사), 0.01 mM의 에탄올아민(미국, 시그마사), 5 ng/㎖의 아셀렌산 나트륨(미국, 시그마사)을 함유하는 eRDF 배지(일본, 교꾸또 세야꾸사)에서 순화시켰다. 항체를 제조하기 위한 하이브리도마의 배양은 스피너(spinner) 플라스크에서 실시하였다. 배양액을 공경이 0.2 ㎛인 필터(미국, 폴 겔만 래보로토리사)에 통과시킴으로써 하이브리도마 등의 불순물을 제거하고, 항체를 포함하는 배양 상청을 회수하였다.

(2) 단백질 G를 이용한 모노클로날 항체의 정제

항FGF-23 항체를 포함하는 배양 상청을 단백질 G 세파로스 4FF 칼럼(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)에 통과시켜 항체를 칼럼에 흡착시키고, 0.1 M 글리신 완충액(pH 2.8)을 이용하여 용출시켰다. 용출 분획은 1 M Tris-HCl를 첨가하여 pH 7.2로 조정하였다. 이와 같이 제조한 항체 용액을 분획 분자량 10000 컷트의 투석막(미국, 스펙트럼 래보로토리사)을 이용하여 PBS(-)로 투석 치환하고, 공경0.22 ㎛의 막 필터 MILLEX-GV(미국, 밀리포어사)로 여과 멸균하여 정제 항FGF-23 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하여 1 mg/㎖를 1.35 OD로서 산출하였다.

(3) 단백질 A를 이용한 모노클로날 항체의 정제

단백질 A 담체 칼럼(일본, 멘에끼 세부쯔 겡뀨소)을 사용하고, 흡착 완충액으로서 글리신 완충액(pH 8.9), 용출 완충액으로서 시트르산 완충액(pH 4.0)을 사용하여 항FGF-23 항체를 포함하는 배양 상청으로부터 항체를 친화도 정제하였다. 이 항체를 포함하는 용출 분획에 1 M Tris-HCl를 첨가하여 pH 7.2 부근으로 조정하였다. 이어서, 투석막을 사용하여 이 항체를 포함하는 용액을 PBS(-)로 치환하고, 다시 공경 0.22 ㎛의 막 필터로 여과 멸균하여 정제 항FGF-23 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하여 1 mg/㎖를 1.35 OD로서 산출하였다.

이와 같이 하여 얻어진 각 정제 모노클로날 항체를, 생산하는 하이브리도마의 이름을 사용하여 나타내기로 한다. 예를 들면, 하이브리도마 1D6A가 생산하는 항체에 대해서는 1D6A 항체라고 기재하기로 한다.

<실시예 5> 항FGF-23 부분 펩티드 폴리클로날 항체의 제조

(1) FGF-23 부분 서열에 상당하는 펩티드의 합성

서열 1의 폴리펩티드를 맥벡터(MacVector) 버전 6.5.1의 계산 기능을 이용하여 소수성도를 예측하고, 펩티드 항체 제조에 적합한 부위를 예측하였다. 친수성 정도가 높고, 당쇄 수식이나 인산화 부위가 될 수 있는 부위를 제외한다는 조건으로 항체 제조에 적절하다고 여겨지는 부분 서열을 추출하였다. 그 결과, 서열 1의잔기 번호 25번째 티로신으로부터 시작되는 15 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 펩티드 hFGF23-25(서열 9), 48번째 아르기닌으로부터 시작되는 20 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 펩티드 hFGF23-48(서열 10), 114번째 아르기닌으로부터 시작되는 15 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 hFGF23-114(서열 11), 148번째 글리신으로부터 시작되는 16 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 펩티드 hFGF23-148(서열 12), 170번째 아스파라긴으로부터 시작되는 10 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 N 말단에 시스테인 잔기를 부가한 펩티드 hFGF23-170(서열 13), 174번째 프롤린으로부터 시작되는 14 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드에 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 hFGF23-174(서열 14), 180번째 세린으로부터 시작되는 15 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 펩티드 hFGF23-180(서열 15), 210번째 Leu에서 시작되는 13 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 펩티드 hFGF23-210(서열 16) 및 237번째 글리신으로부터 시작되는 15 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 hFGF23-237(서열 17)을 항원으로서 선택하여 화학 합성하였다.

hFGF23-25: YPNASPLLGSSWGGLC(서열 9)

hFGF23-48: RNSYHLQIHKNGHVDGAPHQC(서열 10)

hFGF23-114: RFQHQTLENGYDVYHSPQYHC(서열 11)

hFGF23-148: GMNPPPYSQFLSRRNEC(서열 12)

hFGF23-170: CNTPIPRRHTR(서열 13)

hFGF23-174: PRRHTRSAEDDSERC(서열 14)

hFGF23-180: SAEDDSERDPLN VLKC(서열 15)

hFGF23-210: LPSAEDNSPMASDC(서열 16)

hFGF23-237: GGTGPEGCRPFAKFI(서열 17)

(2) 항FGF-23 부분 펩티드에 대한 폴리클로날 항체의 제조

상술한 모든 펩티드는 각각이 갖는 시스테인 잔기를 통하여 담체 단백질인 소 티로글로불린을 결합시켜 면역화에 사용하였다. 면역화는 하나의 항원 펩티드에 대하여 3 마리의 토끼를 사용하였다. 첫회 면역화는 1 마리당 100 ㎍의 담체 단백질에 결합된 펩티드를 프로인트 완전 면역보강제를 사용하여 유탁액으로 만든 것을 토끼의 피내 또는 피하에 투여하였다. 첫회 면역화 1 주일 후에 100 ㎍의 담체 단백질에 결합된 펩티드를 프로인트 불완전 면역보강제를 사용하여 유탁액으로 만든 것을 동일하게 투여하였다. 이와 동일한 투여를 2 주 간격으로 6회 실시하고, 최종 투여 1 주일 후에 전체 채혈을 행하여 항혈청을 제조하였다.

토끼 혈청으로부터 항FGF-23 부분 펩티드 항체를 정제하기 위한 친화도 칼럼을 제조하기 위해, 면역화에 사용한 각각의 펩티드를 술포링크 키트(SulfoLink Kit, 미국, 피어스사)를 사용하여 겔상으로 고상화하였다. 흡착 완충액으로서 PBS(-)를 사용하여 항혈청을 상기 칼럼에 첨가하고, 면역화에 사용한 펩티드와 결합하는 항체를 칼럼에 유지하였다. 이어서, 용출 완충액으로서 0.1 M 글리신 완충액(pH 2.5 내지 3.3)을 사용하여 칼럼에 결합된 항체를 용출시켜 회수하였다. 용출 분획은 1 M Tris-HCl를 첨가하여 pH7.2 부근으로 조정하였다. 이와 같이 제조한 항체 용액을 겔 여과 칼럼 NAP25(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)에 사용하여 PBS(-)로 완충액을 치환한 후, 공경 0.22 ㎛의 막 필터 MILLEX-GV(미국, 밀리포어사)로 여과 멸균하여, 각 펩티드에 대한 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하여 1 mg/㎖를 1.35 OD로서 산출하였다. 이와 같이 하여 얻어진 각 정제 항체를 면역화에 사용한 펩티드의 이름을 사용하여 나타내기로 한다. 예를 들면, 서열 9의 hFGF23-25 펩티드를 면역화시켜 얻어진 항체에 대해서는 hFGF23-25 항체라고 기재하기로 한다.

(3) 항FGF-23 부분 펩티드 항체에 의한 FGF-23 단백질 및 그의 대사물의 인식

상술한 방법에 의해 취득한 hFGF23-48 항체와 hFGF23-148 항체를 이용하여 CHO-FGF23H 발현 세포 상청 중의 FGF-23H 단백질 및 그의 대사물을 웨스턴 블롯팅으로 해석하였다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, 어느쪽 항체에서나 32 kDa 부근의 전장 FGF-23H 단백질이 검출되었다. 또한, 대략 18 kDa 이하의 크기인 대사물이 확인되었지만, 이것은 FGF-23 단백질이 서열 1에 나타낸 아미노산 서열의 179번째와 180번째 사이에서 절단되어 생긴 N 말단측 단편으로부터 유래한다고 여겨진다. hFGF23-48 항체에서는 보다 소단편화된 대사물을 인식하고 있었다. 또한, 179번째와 180번째 사이에서의 절단을 피하는 변이 단백질을 생산하는 CHO-FGF23RQ의 배양 상청 중의 FGF-23RQ 단백질과 그의 대사물에 대하여 hFGF23-148 항체를 사용하여 검토하였다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, FGF-23H에서 확인되었던 단편화 펩티드는 검출되지 않게 되었다. 이상의 점으로부터 FGF-23 단백질의 단백질 절단에 의한대사는, 179번째와 180번째 사이가 절단됨으로써 생긴 N 말단측 단편은 더 소단편화되어 가지만, 이러한 소단편은 179번째와 180번째 사이에서의 절단이 생긴 후에 생성된다고 여겨졌다. 따라서, FGF-23 단백질의 대사를 고려하는 데 있어서 179번째와 180번째 사이에서의 절단 유무를 분별하는 것이 매우 중요한 것으로 판명되었다.

<실시예 6> 비오틴화 항체의 제조

상기 정제한 9종의 FGF-23 부분 펩티드에 대한 폴리클로날 항체 및 13종의 항FGF-23 모노클로날 항체의 일부를 사용하여 비오틴화를 행하였다. 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 1 mg/㎖의 농도로 희석한 항체 용액 1 ㎖에 비오틴(Biotin)-AC5-Osu(일본, 도진 가가꾸사)를 디메틸포름아미드에 1.82 mg/㎖의 농도로 용해한 용액을 10㎕ 첨가하고, 4 ℃에서 2 시간 전도 혼화하였다. 그 후, 이 반응액을 NAP10 칼럼(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)에 사용하고, 미반응의 비오틴-AC5-Osu를 제거하여 용매를 PBS(-)로 치환하였다. 9종의 비오틴 표지 항FGF-23 부분 펩티드 폴리클로날 항체 및 5종의 비오틴 표지 항FGF-23 모노클로날 항체(1C3H 항체, 1D6A 항체, 2A2B 항체, 2C3B 항체, 3C1E 항체)를 얻었다.

<실시예 7>

FGF-23의 특정 부위를 인식하는 폴리클로날 항체를 이용한 샌드위치 ELISA법

(1) 샌드위치 ELISA계의 구축

상술한 FGF-23의 부분 펩티드 서열에 대한 9종의 폴리클로날 항체 중 8종의 항체(hFGF23-25 항체, hFGF23-48 항체, hFGF23-114 항체, hFGF23-148 항체,hFGF23-170 항체, hFGF23-180 항체, hFGF23-210 항체 및 hFGF23-237 항체)를 고상화용 항체 및 검출용 항체로서 조합하여 샌드위치 ELISA계의 구축을 검토하였다.

항체를 고상화하기 위해 항FGF-23 부분 펩티드 폴리클로날 항체 8종(hFGF23-25 항체, hFGF23-48 항체, hFGF23-114 항체, hFGF23-148 항체, hFGF23-170 항체, hFGF23-180 항체, hFGF23-210 항체 및 hFGF23-237 항체)을 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 30 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96 웰 ELISA용 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 1.5 시간 정치하였다. 그 후, 반응액을 제거하고, (슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)를 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 60 분간 배양하여 블로킹을 행하였다. 용액을 제거한 후, 1 ㎍/㎖의 FGF-23H 단백질을 1 웰당 50 ㎕씩 첨가하여 실온에서 1 시간 정치하고, 고상화한 항체와 결합시켰다. 항체 반응 후, T-TBS로 3회 세정한 후, 10％ 블록케이스(Blockace, 일본국, 다이닛본 세야꾸사)를 포함하는 T-TBS에 10 ㎍/㎖로 희석한 상술한 비오틴 표지의 항FGF-23 부분 펩티드 항체 8종(hFGF23-25 항체, hFGF23-48 항체, hFGF23-114 항체, hFGF23-148 항체, hFGF23-170 항체, hFGF23-180 항체, hFGF23-210 항체, hFGF23-237 항체) 및 대조군으로서 10％ 블록케이스(일본국, 다이닛본 세야꾸사)를 포함하는 T-TBS 용액을 각각 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 30 분간 정치하여 2차 항체 반응을 행하였다. 각 웰을 T-TBS로 3회 세정한 후, 10％ 블록케이스를 포함하는 T-TBS에 5000배로 희석한 HRP 표지 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 비오틴 표지 항체와 결합시켰다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 15 분간 발색시킨 후, 0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도 측정 장치 MTP-300(일본, 코로나 덴끼사)을 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 감한 값을 구하였다(하기 표 2). 비오틴 표지 항체를 첨가하지 않은 대조군에서는 450 nm 내지 570 nm의 값이 모두 0.06 이하였지만, 표 2에 나타낸 바와 같이 복수의 고상화 항체와 검출 항체의 조합에 있어서 현저하게 450 nm 내지 570 nm의 값이 상승하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, FGF-23 단백질의 절단에 의해 생기는 폴리펩티드의 존재가 알려져 있으며, 동일 시료 중에 FGF-23으로부터 유래하는 다른 분자종의 폴리펩티드가 존재한다고 여겨지고 있다. 여기서 사용하고 있는 항체는 FGF-23의 특정한 부위를 인식하기 때문에, 항체의 조합에 따라 측정 대상의 분자종을 좁힐 수 있다. 예를 들면, hFGF23-170 항체를 고상화하고, hFGF23-25 항체로 검출하는 조합을 이용한 경우에는, 두 항체의 항원 부위가 서열 1에 나타낸 FGF-23 단백질 아미노산 서열의 25-179 잔기의 N 말단측 부분 폴리펩티드 단편에 포함되기 때문에, 이들 조합에 의한 샌드위치 ELISA에서는 서열 1의 25 내지 251 잔기의 전장 폴리펩티드를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그의 N 말단 부분 폴리펩티드 단편도 검출할 수 있다고 예상된다. 한편, hFGF23-180 항체를 고상화하여 hFGF23-237 항체로 검출하면 전장 폴리펩티드 뿐만 아니라, 서열 1에 나타낸 FGF-23 단백질의 180 내지 251 잔기에 상당하는 C 말단측 부분 폴리펩티드 단편을 검출할 수 있다고 예상된다. 또한, 예를 들면, hFGF23-237 항체를 고상화하여 hFGF23-25 항체로 검출하면, 절단 후의 N 및C 말단측 부분 폴리펩티드를 검출하지 않고 전장의 FGF-23 단백질만을 검출할 수 있다고 예상된다. 따라서, 이들의 조합을 복합적으로 사용함으로써, 생체 시료 등의 검체 중의 FGF-23 전장 폴리펩티드와 부분 폴리펩티드의 절대량 측정과 존재비의 식별이 가능해진다.

가로가 고상화 항체의 종류, 세로가 검출 항체의 종류를 나타내며, 각 조합으로 얻어진 측정치를 나타낸다.

(2) 샌드위치 ELISA에 의한 FGF-23 단백질의 정량적 검출

상술한 샌드위치 ELISA계 제조 방법에 따라 hFGF23-25 항체를 고상화하고, 검출용 항체로서 hFGF23-237 항체를 사용하여 1, 0.33, 0.1, 0.033, 0.01, 0.0033 및 0.001 ㎍/㎖ 농도의 FGF-23H 단백질 용액을 피검 물질로 하여 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 0.1 내지 1 ㎍/㎖의 범위 내에서 농도 의존적인 450 nm 내지 570 nm의 값의 상승을 얻을 수 있었기 때문에, 적어도 이 농도 범위에서의 FGF-23H 단백질을 농도 의존적으로 검출할 수 있음이 판명되었다.

<실시예 8> FGF-23 부분 펩티드의 제조

실시예 5에서 제조한 FGF-23의 부분 서열에 상당하는 펩티드 이외에, 이하의 서열을 갖는 FGF-23의 부분 서열을 갖는 펩티드를 화학 합성하였다. 서열 1의 잔기 번호 38번째 글리신으로부터 시작되는 13개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 hFGF23-38(서열 18), 서열 1의 잔기 번호 68번째 트레오닌으로부터 시작되는 28개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 hFGF23-68(서열 19), 서열 1의 잔기 번호 96번째 메티오닌으로부터 시작되는 18개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 hFGF23-96(서열 20), 서열 1의 잔기 번호 129번째 세린으로부터 시작되는 22개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 hFGF23-129(서열 21), 서열 1의 잔기 번호 161번째 아르기닌으로부터 시작되는 13개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 C 말단에 시스테인 잔기를 부가한 hFGF23-161(서열 22), 서열 1의 잔기 번호 197번째 알라닌으로부터 시작되는 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 hFGF23-197(서열 23) 및 서열 1의 잔기 번호 220번째 세린으로부터 시작되는 24개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 hFGF23-220(서열 24).

hFGF23-38: GLIHLYTATARNSC(서열 18)

hFGF23-68: TIYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLC(서열 19)

hFGF23-96: MDFRGNIFGSHYFDPENC(서열 20)

hFGF23-129: SPQYHFLVSLGRAKRAFLPGMNC(서열 21)

hFGF23-161: RNEIPLIHFNTPIC(서열 22)

hFGF23-197: ARMTPAPASCSQELPS(서열 23)

hFGF23-220: SDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGC(서열 24)

<실시예 9> 모노클로날 항체의 FGF-23 인식 영역의 결정

항FGF-23 모노클로날 항체가 인식하는 아미노산 서열을 포함하는 영역을, 인간 FGF-23의 부분 서열을 포함하는 펩티드와의 반응성에 대해 조사하여 결정하였다.

(1) 고상화 펩티드와의 결합 실험 1

실시예 5에서 합성한 펩티드(서열 7 내지 17)를 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 1 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96 웰 ELISA용 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 정치하여 FGF-23 부분 펩티드를 고상화하였다. 그 후, 용액을 제거하여 블로킹 용액(슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 60 분간 배양하여 블로킹을 행하였다. 용액을 제거한 후, 실시예 3에서 취득한 하이브리도마의 배양 상청, 또는 대조군으로서 HT 함유 DMEM 배지를 1 웰당 50 ㎕씩 첨가하여 실온에서 1 시간 정치함으로써 FGF-23 부분 펩티드와 결합시켰다. 항체 결합 반응 종료 후에 T-TBS로 3회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 3000배로 희석한 HRP 표지 염소 항마우스 IgG(H+L)-F(ab')₂를 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 2차 항체를 결합시켰다. 각 웰을 T-TBS로 3회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘 (덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 3 분간 발색시킨 후,0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도 측정 장치(MTP-300, 일본, 코로나 덴끼사)를 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 감한 값을 구하였다. 대조군으로서 HT 함유 DMEM 배지만을 첨가한 경우의 450 nm 내지 570 nm의 값은 모두 0.06 이하였지만, 하이브리도마 배양 상청을 첨가한 것에서는 특정한 펩티드를 고상화한 것에 의해 명확한 흡광도치의 상승을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 2A2B 항체는 서열 12의 hFGF23-148 펩티드에 결합하였다. 1D6A는 서열 17의 hFGF23-237 펩티드와의 결합을 나타내었다. 따라서, 하이브리도마 2A2B가 생산하는 항체는 서열 1에 나타낸 FGF-23의 148 내지 163번째로 표시된 영역 또는 그의 일부에 결합한다고 여겨졌다. 또한, 1C3H는 서열 1에 나타낸 FGF-23의 180 내지 194번째로 표시된 영역 또는 그의 일부와 결합하고, 1D6A는 서열 1에 나타낸 FGF-23의 237 내지 251번째로 표시된 영역 또는 그의 일부에 결합한다고 여겨졌다.

(2) 고상화 펩티드와의 결합 실험 2

FGF-23은 서열 1에 나타낸 서열의 179번째와 180번째 사이에서의 절단이 확인되지만, 이 절단 부위로부터 C 말단측을 인식하는 항체에 대하여 상세하게 검토할 목적으로, 이 영역 중 일부에 상당하는 서열을 갖는 합성 펩티드를 이용한 결합 실험을 실시하였다. 실시예 5에서 합성한 펩티드(서열 14, 15, 16 및 17) 및 실시예 8에서 합성한 펩티드(서열 23 및 24)를 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 1 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96 웰 ELISA용 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하고, 4 ℃에서 12 시간 정치하여 플레이트 상에 고상화하였다. 그 후, 용액을 제거하고, 블로킹 용액(슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 60 분간 배양하여 블로킹을 행하였다. 용액을 제거한 후, 실시예 3 및 실시예 4에서 정제, 취득한 1D6A 항체, 3C1E 항체를 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 10 ㎍/㎖가 되도록 희석한 용액을 1 웰당 50 ㎕씩 첨가하였다. 대조군으로서 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS를 50 ㎕ 첨가한 웰을 설정하였다. 이것을 실온에서 1 시간 정치함으로써 고상화한 펩티드와 항체를 반응시켰다. 항체 반응 후, T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 3000배로 희석한 HRP 표지 염소 항마우스 IgG(H+L)-F(ab')2를 1 웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 실온에서 60 분간 정치하여 2차 항체를 반응시켰다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)를 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 20 분간 발색시킨 후, 0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도측정 장치(MTP-300, 일본, 코로나 덴끼사)를 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 감한 값을 구하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 대조군으로서 희석 용액만을 첨가한 웰의 450 nm 내지 570 nm의 값은 모두 0.05 이하였다. 이에 대하여 3C1E 항체는 펩티드 hFGF23-180(서열 15)과 결합하고, 1D6A 항체는 펩티드 hFGF23-237(서열 17)과 결합하였다.

<실시예 10> 면역 침강에 의한 FGF-23 단백질 및 그로부터 유래하는 폴리펩티드의 검출

고상화 펩티드와 비교하여, 보다 생리적 조건에 가까운 액상에 있어서의 취득한 모노클로날 항체와 FGF-23 단백질 및 그로부터 유래하는 폴리펩티드와의 반응성을 밝히기 위해 면역 침강을 실시하고, 침강 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 검출하였다.

실시예 2에서 제조한 FGF-23H를 발현하는 CHO-FGF23 세포를 CHO-S-SFM II 배지(미국, Gibco BRL사)에서 4 일간 배양하고, FGF-23 단백질, N 말단측 폴리펩티드 단편 및 C 말단측 폴리펩티드 단편을 포함하는 배양 상청을 얻었다. 이 상청 400 ㎕당 실시예 3 및 실시예 4에서 제조한 5종의 항FGF-23 모노클로날 항체를 0.5 ㎍첨가한 용액을 제조하였다. 완충액만을 첨가한 것을 실험 대조군으로 하였다. 이 용액을 4 ℃에서 1.5 시간 전도 혼화하고, 항체와 배양 상청 중의 단백질을 반응시켰다. 그 후, 단백질 G 세파로스 4FF 수지(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)를 30 ㎕ 첨가하고, 4 ℃에서 3 시간 전도 혼화한 후, 수지에 결합되지 않은 물질을 PBS로 3회 세정하였다. 이 수지의 절반의 양에 대하여 30 ㎕의 20 mM DTT 함유 및 비함유 샘플 완충액(50 mM Tris-Cl pH 6.8, 1％ SDS, 10％ 글리세롤, 0.001％ 브로모페놀 블루, 2 mM EDTA)을 첨가하고, 95 ℃에서 5 분간 가열한 후 원심분리하여 상청을 회수하였다. 이와 같이 회수된 면역 침강물을 10 내지 20％의 농도 구배 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 반건식 블롯팅 장치(미국, 오울(Owl) 세퍼레이션 시스템즈사)를 사용하여 겔 중의 단백질을 임모빌론(Immobilon) PVDF막(미국, 밀리포어사)에 전사하였다. 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)으로 상기 PVDF막을 블로킹한 후, T-TBS에 1 ㎍/㎖로 희석한 비오틴 표지의 2A2B 항체 또는 1C3H 항체 용액 중에서 4 ℃로 12 시간 배양하였다. 또한, HRP 표지 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 반응시켜 세정한 후, ECL 플러스 발광 시스템(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)을 이용하여 필름에 1 시간 노광하고, 자동 현상기(일본, 후지 필름사)로 현상하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 웨스턴 블롯팅에서 사용한 2A2B 항체는, 서열 1의 아미노산 잔기 번호 148 내지 163번째에 상당하는 부위를 인식하는 항체이다. 또한, 여기서 사용한 1C3H 항체는 서열 1의 180 내지 194번째에 상당하는 부위를 인식하는 항체인 것이 판명되어 있다. 두가지를 사용함으로써 179번째와 180번째 절단으로 생기는 단편화 폴리펩티드를 구별하여 인식할 수 있다. 따라서, 본 실험의 결과로부터 모노클로날 항체는 이하의 3종의 항체로 분류되었다. 즉 ① 서열 1의 아미노산 잔기 25 내지 179번째에 상당하는 N 말단측 단편 폴리펩티드 내에 인식 서열을 갖고, 또한 N 말단측 단편 폴리펩티드 및 FGF-23 전장 단백질과 면역 복합체를 형성하는 2종의 항체(2C3B 항체 및 2C5L 항체), ② 서열 1의 아미노산 잔기 180 내지 251번째에 상당하는 C 말단측 단편 폴리펩티드에 인식 서열을 갖고, 또한 C 말단측 단편 폴리펩티드 및 FGF-23 전장 단백질과 면역 복합체를 형성하는 2종의 항체(1D6A 항체 및 3C1E 항체), 및 ③ 면역 침강물을 검출할 수 없던 항체(2A2B 항체)이다.

<실시예 11> 항FGF-23 모노클로날 항체와 항FGF-23 폴리클로날 항체를 이용한 ELISA에 의한 FGF-23 단백질의 검출

2종의 모노클로날 항체(1D6A 항체, 2C3B 항체)를 각각 고상화하고, 실시예 7에서 검출 항체로서 유용성이 입증된 5종의 폴리클로날 항체(hFGF23-25 항체, hFGF23-170 항체, hFGF23-180 항체, hFGF23-210 항체 및 hFGF23-237 항체)를 각각 검출 항체로 사용한 샌드위치 ELISA계로 정제 FGF-23 단백질의 검출을 행하였다.

단백질 G 친화도 칼럼으로 정제한 상기 2종의 모노클로날 항체를 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 10 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96 웰 ELISA용 플레이트 (Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 정치하여 고상화하였다. 그 후, 반응액을 제거하고, 블로킹 용액(슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)을 1 웰당 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 30 분간 배양하여 블로킹하였다. 용액을 제거하고, 트윈 20을 0.05％ 함유하는 PBS(T-PBS)로 3회 세정한 후, 각각 실시예 2에서 제조된 0.1 ㎍/㎖의 농도의 FGF-23H 단백질 정제물, N 말단측 단편 폴리펩티드 정제물, C 말단측 단편 폴리펩티드에 His6 태그가 부가된 정제물 용액을 1 웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 실온에서 2 시간 정치하여 고상화한 항체와 반응시켰다. 항체 반응 후, T-PBS로 3회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 2.5 ㎍/㎖로 희석한 5종의 비오틴 표지 항FGF-23 부분 펩티드 폴리클로날 항체(hFGF23-25 항체, hFGF23-170 항체, hFGF23-180 항체, hFGF23-210 항체, hFGF23-237 항체)를 실온에서 30 분간 배양하여 2차 항체 반응을 행하였다. 각 웰을 T-PBS로 3회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 5000배로 희석한 HRP 표지 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 비오틴 표지 항체와 결합시켰다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 배양하였다. 7 분 후에 0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도 측정 장치(MTP-300, 일본, 코로나 덴끼사)를 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 감한 값을 구하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 항체를 첨가하지 않은 대조군의 450 nm 내지 570 nm의 값은 모두 0.015 이하였지만, 고상화 항체와 검출 항체의 조합에 따라 각각 FGF-23 전장 단백질(도 4A), N 말단측 단편 폴리펩티드(도 4B), 또는 C 말단측 단편 폴리펩티드(도 4C)에 특이적인 반응이 관찰되었다. 이 반응성의 차이에 의해 항FGF-23 모노클로날 항체의 인식 부위를 확인할 수 있었다. 즉, 2C3B 항체를 고상화한 경우, 3종의 비오틴화 폴리클로날 항체(hFGF23-180 항체, hFGF23-210 항체, hFGF23-237 항체)를 검출 항체로서 사용하는 조합에 있어서 전장 FGF-23 단백질은 검출되었지만, N 말단측 단편 폴리펩티드 또는 C 말단측 단편 폴리펩티드는 검출되지 않았다. 한편, N 말단측 단편 폴리펩티드를 인식하는 비오틴 표지 폴리클로날 항체(hFGF23-25 항체, hFGF23-170 항체)에서 전장 FGF-23 단백질과 N 말단측 단편 폴리펩티드가 강하게 검출되었지만, C 말단측 단편 폴리펩티드는 전혀 검출되지 않았다.

이로부터 2C3B 항체는 N 말단측 단편 폴리펩티드를 인식하는 것으로 확인되었다. 1D6A 항체를 고상화한 경우, N 말단측 단편 폴리펩티드를 인식하는 폴리클로날 항체를 검출 항체로서 사용함으로써 전장 단백질이 검출되었지만, N 말단측 단편 및 C 말단측 단편 폴리펩티드는 전혀 검출되지 않았다. 한편, C 말단측 단편 폴리펩티드를 인식하는 폴리클로날 항체를 검출 항체로서 사용하여 전장 단백질 및 C 말단측 단편 폴리펩티드의 검출을 행하면, 1D6A 항체는 hFGF23-180과의 조합으로 검출이 가능하였다. 이 결과로부터 1D6A 항체는 폴리클로날 항체 hFGF23-237 항체와 경합한다는 것이 입증되었고, 1D6A 항체는 서열 1의 아미노산 잔기 237 내지 251번째 영역을 인식한다는 것이 확인되었다.

<실시예 12> 항FGF-23 모노클로날 항체를 조합한 샌드위치 ELISA에 의한 FGF-23 단백질의 검출

실시예 3과 실시예 4에서 취득한 4종의 항FGF-23 모노클로날 항체를 고상화하고, 실시예 6에서 제조한 4종의 비오틴 표지 항FGF-23 모노클로날 항체를 검출항체로서 사용하는 샌드위치 ELISA를 실시하여 정제 FGF-23 단백질의 검출을 행하였다.

4종의 FGF-23 모노클로날 항체(1D6A 항체, 2A2B 항체, 2C3B 항체, 3C1E 항체)를 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 10 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96 웰의 ELISA용 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 12 시간 정치하여 고상화하였다. 그 후, 반응액을 제거하고, 블로킹 용액 (슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 20 분간 배양하여 블로킹하였다. 용액을 제거하고, 트윈 20을 0.1％ 함유하는 TBS (T-TBS)로 3회 세정한 후, 0.1 ㎍/㎖의 농도의 FGF-23 단백질 정제물을 1 웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하여 고상화 항체와 반응시켰다. 항체 반응 후, T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 10 ㎍/㎖로 희석한 3종의 비오틴 표지 항FGF-23 모노클로날 항체(1D6A 항체, 2C3B 항체, 3C1E 항체)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하여 2차 항체 반응을 행하였다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 5000배로 희석한 HRP 표지 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 20 분간 정치하여 비오틴 표지 항체와 결합시켰다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 배양하였다. 30 분 후에 0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도 측정 장치(MTP-300, 일본, 코로나 덴끼사)를 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 감한 값을 구하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 고상화 항체 또는 검출 항체를 첨가하지 않은 대조군의 450 nm 내지 570 nm의 값은 모두 0.033 이하였지만, 고상화 항체와 검출 항체의 조합에 따라 흡광도의 상승이 확인되었다. 예를 들면, 서열 1에 나타낸 FGF-23 단백질 아미노산 서열 중의 25 내지 179번째 영역 내에 인식 부위를 갖는 2C3B 항체를 고상화 항체로 하고, 서열 1에 나타낸 FGF-23 단백질 아미노산 서열 중의 180 내지 251번째 영역 내에 인식 부위를 갖는 비오틴 표지의 1D6A 항체 3C1E 항체를 검출 항체로서 조합한 샌드위치 ELISA를 행했을 경우, 450 nm 내지 570 nm의 값은 모두 2.9 이상으로 높은 값을 나타내었다. 서열 1에 나타낸 FGF-23 단백질 아미노산 서열의 179번째 아르기닌과 180번째 세린 사이에서 절단되어 생긴 단편화 폴리펩티드는, 이러한 샌드위치 ELISA의 측정 대상에서 제외되기 때문에, 이러한 항체의 조합을 이용함으로써 N 말단측 폴리펩티드 단편이나 C 말단측 폴리펩티드 단편을 인식하지 않고, 절단되어 있지 않은 FGF-23 단백질을 고감도로 검출할 수 있다. 실시예 2에서 정제한 전장 FGF-23H 단백질, N 말단측 폴리펩티드 단편, C 말단측 폴리펩티드 단편을 공지된 방법과 동일하게 마우스에 투여했더니, 혈청 인의 저하 유도는 전장 FGF-23H 단백질에서만 확인되었다. 이로부터 서열 1에 나타낸 FGF-23 단백질 아미노산 서열의 179번째 아르기닌과 180번째 세린 사이에서의 절단은, FGF-23 단백질의 활성을 크게 변화시키는 것으로 밝혀졌다. 여기서 나타낸 절단된 폴리펩티드를 제외하고 절단되지 않은 FGF-23 단백질을 선택적으로 검출하는 방법은 시료 내에 포함되는 활성을 갖는 FGF-23을 보다 정확하게 검출 및 측정할 수 있게 하는 것이다. 한편, 서열 1에 나타낸 FGF-23 단백질 아미노산 서열 중의 180 내지 251번째 영역 내에 인식 부위를 갖는 1D6A 항체, 3C1E 항체를 고상화 항체로 하고, 검출 항체로서도 비오틴 표지의 1D6A 항체, 3C1E 항체를 사용했을 경우, 마찬가지로 항체의 경합으로부터 서열 1에 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 잔기 180 내지 194번째의 영역을 인식하는 3C1E 항체의 그룹과 서열 1에 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 잔기 237 내지 251번째의 영역을 인식하는 1D6A 항체는 다른 인식 부위를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 또한, 이들 항체를 조합함으로써 서열 1에 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 잔기 25 내지 179번째 영역 내에 위치하는 폴리펩티드 단편을 제외하고, 180 내지 251 잔기의 C 말단측 단편 폴리펩티드를 고감도로 검출할 수 있는 측정법을 확립할 수 있음이 밝혀졌다.

<실시예 13> 항FGF-23 모노클로날 항체를 이용한 샌드위치 ELISA법에 의한 FGF-23 단백질의 정량적 측정

2C3B 항체를 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 10 ㎍/㎖로 희석한 것을 96 웰 ELISA용 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고,4 ℃에서 12 시간 정치하여 고상화하였다. 그 후, 반응액을 제거하고, 블로킹 용액(슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)을 1 웰당 250 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 배양하여 블로킹을 행하였다. 용액을 제거하고, 트윈 20을 0.1％ 함유하는 TBS(T-TBS)로 2회 세정하였다. 여기에, 실시예 2에서 정제한 FGF-23 단백질을 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01 및 0.003 ng/㎖가 되도록 희석한 각 용액을 1 웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하여 고상화 항체와 반응시켰다. 항체 반응 후, T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 10 ㎍/㎖로 희석한 2종의 비오틴 표지 항FGF-23 모노클로날 항체(1D6A 항체 및 3C1E 항체)를 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 2차 항체 반응을 행하였다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 5000배로 희석한 HRP 표지 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 비오틴 표지 항체와 결합시켰다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 배양하였다. 25 분 후에 0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도 측정 장치(MTP-300, 일본, 코로나 덴끼사)를 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 감한 값을 구하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 적어도 0.03 ng/㎖ 농도의 FGF-23 단백질이 존재함으로써 유의한 측정치의 상승이 관찰되고, 3ng/㎖ 정도까지의 범위 내에서 농도 의존적인 450 nm 내지 570 nm 값의 상승이 얻어져 이 농도 범위에서의 FGF-23 단백질의 검출이 가능함이 밝혀졌다.

<실시예 14> 항FGF-23 모노클로날 항체 고정화 칼럼의 제조

FGF-23 단백질의 면역 침강에 의한 회수나, FGF-23 단백질의 정제용 항체 칼럼으로서 유용한 항FGF-23 항체를 고정화한 칼럼을 시판용 고정화 시약(술포링크(SulfoLink, 등록 상표), 미국, 피어스사)을 이용하여 제조하였다. 5 mM EDTA를 포함하는 0.1 M 인산 완충액(pH 6.0)에 1C3H 항체, 1D6A 항체 및 2C3B 항체를 희석하여, 각각 1 mg/㎖, 1 mg/㎖ 및 0.4 mg/㎖ 농도의 용액을 제조하였다. 이 항체 용액 1 ㎖에 대하여 6 mg의 2-머캅토에탄올아민을 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 전도 혼화하고, 환원 반응에 의해 항체 내의 디술피드 결합을 해리시켰다. NAP10 칼럼(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)을 사용하여 완충액을 1.5 ㎖의 결합 완충액(50 mM TrisㆍHCl, pH 8.5, 5 mM EDTA) 용액으로 교환함과 동시에, 2-머캅토에탄올아민을 제거하여 환원 반응을 정지시켰다. 이들 항체 용액을 미리 결합 완충액으로 세정한 1 ㎖의 술포링크(등록 상표) 커플링 겔(미국, 피어스사)에 첨가하고, 실온에서 30 분 전도 혼화하여 결합 반응을 행하였다. 원심분리 후, 수지를 결합 완충액으로 세정하고, 미반응 티올기의 블로킹을 위해 1 ㎖ 의 0.05 mM L-시스테인-HCl 용액을 첨가하여 실온에서 30 분간 전도 혼화하였다. 그 후, 1 M NaCl를 사용하여 수지를 세정하고, 미반응의 항체 및 L-시스테인을 제거하였다.

<실시예 15> CHO-FGF23H 세포 이식 마우스의 혈청 중에 존재하는 FGF-23 단백질의 면역 침강법에 의한 검출

혈중에서의 FGF-23 단백질의 존재 형태를 조사하기 위해 FGF-23H를 발현하는 세포를 누드 마우스에 이식하고, 이 세포로부터 혈중에 분비된 FGF-23H 단백질을 면역 침강법으로 검출하였다. 1 마리의 Balb/c 누드 마우스에 대하여 2×10⁷개의 CHO-FGF23H 세포, 또는 대조군으로서 CHO ras 클론-1 세포를 피하에 이식하고, 이식 후 32일 후의 시점에서 세포가 생착하여 종양을 형성한 마우스로부터 혈청을 채취하였다. 5 마리의 CHO ras 클론-1 이식 마우스 및 6 마리의 CHO-FGF23H 이식 마우스로부터 채취한 혈청을 각각 등량씩 혼합하고, 이 150 ㎕의 혼합 혈청에 대하여 실시예 14에서 제조한 1D6A 항체 및 2C3B 항체를 각각 고정화한 수지, 및 항체가 고정화되지 않은 수지를 각각 10 ㎕ 첨가하여 4 ℃에서 1 시간 전도 혼화하여 항체와 FGF-23을 반응시켰다. 그 후 PBS로 수지를 3회 세정하고, 미반응물을 제거하였다. 각각의 수지에 50 ㎕의 샘플 완충액(50 mM Tris-Cl pH 6.8, 1％ SDS, 10％ 글리세롤, 0.001％ 브로모페놀 블루, 2 mM EDTA, 20 mM DTT)을 첨가하여 95 ℃에서 5 분간 가열한 후, 원심분리하여 얻은 상청을 회수하였다. 이것을 10 내지 20％ 구배 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 반건식 블롯팅 장치(미국, 오울 세퍼레이팅 시스템즈사)를 사용하여 겔 중의 단백질을 PVDF막(미국, 밀리포어 사)에 전사하였다. 상기 PVDF막을 블록케이스(등록 상표, 일본, 다이닛본 세야꾸사)에 0.5 ㎍/㎖로 희석한 비오틴 표지의 2A2B 항체 또는 1C3H 항체 용액 중에서 4 ℃로 12 시간 배양한 후, 다시 HRP 표지 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 반응시켰다. 이것을 ECL 플러스 발광 시스템(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)을 사용하여 필름에 1 시간 노광하고, 자동 현상기(일본국 후지 필름사)로 현상하였다.그 결과를 도 7에 나타내었다. 항체를 고정화하지 않은 수지에 있어서는 전혀 시그널이 관찰되지 않았지만, 1C3H 항체로 면역 침강하여 2A2B 항체로 검출했을 경우 22 kDa의 시그널이 검출되고, 1C3H 항체로 검출했을 경우 22 kDa와 10 kDa의 시그널이 검출되었다. 또한, 1D6A 항체로 면역 침강하여 2A2B 항체로 검출했을 경우 22 kDa의 시그널이 검출되지 않고, 1C3H 항체로 검출했을 경우 10 kDa만의 시그널이 검출되었다. 또한, 2C3B 항체로 면역 침강하여 2A2B 항체로 검출했을 경우 22 kDa와 16 kDa의 시그널이 검출되고, 1C3H 항체로 검출했을 경우 22 kDa만의 시그널이 검출되었다. 2A2B 항체는 서열 1의 아미노산 잔기 148 내지 163번째의 영역을 인식하고, 1C3H 항체는 서열 1의 아미노산 잔기 180 내지 194번째의 영역을 인식하는 것으로 판명되었다. 또한, 2A2B 항체는 웨스턴 블롯팅법에서 서열 1의 아미노산 잔기 25 내지 179번째에 상당하는 N 말단측 단편 폴리펩티드를 인식하고, 그 시그널의 크기는 전기영동 상에서 16 kDa으로 검출되며, 1C3H 항체는 서열 1의 아미노산 잔기 180 내지 251번째의 C 말단측 단편 폴리펩티드를 인식하고, 그 시그널의 크기는 10 kDa에서 검출되는 것으로 판명되었다. 본 실험에서 검출된 16 kDa의 시그널은 N 말단측 단편 폴리펩티드를 나타내고, 10 kDa의 시그널은 C 말단측 단편 폴리펩티드를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, 마우스 혈청으로부터 회수된 22 kDa의 폴리펩티드는, 서열 1의 아미노산 잔기 25 내지 179번째로 표시되는 N 말단측 영역을 인식하는 2C3B 항체와 아미노산 잔기 148 내지 163번째의 영역을 인식하는 2A2B 항체 및 아미노산 잔기 180 내지 194번째의 영역을 인식하는 1C3H의 생산 항체로 인식할 수 있지만, 아미노산 잔기 237 내지 251번째의 영역을 인식하는1D6A 항체로는 인식할 수 없는 것이었다. 이 실험에서 관찰되고 있는 22 kDa 부근의 시그널은 FGF-23 단백질이 절단되어 생긴 것이라고 여겨지며, 그 절단 부위는 1C3H 항체가 인식하는 영역보다 C 말단측에 존재하는 것이다. 이제까지 착안해 온 서열 1로 표시되는 아미노산 번호의 179번째 아르기닌과 180번째 세린 사이의 절단과는 다른 절단과, 그에 의해 생기는 단편이 혈청 중에서 확인되는 것으로 밝혀졌다.

<실시예 16> FGF-23 단백질의 혈청 중에서의 절단

(1) 래트 혈청과 정제 FGF-23 단백질의 혼화 실험

혈청에 의한 FGF-23 단백질의 절단에 대하여, 정제 FGF-23 단백질과 래트 혈청을 혼화하여 검토하였다. 20 ng의 정제 FGF-23 단백질에 래트 혈청을 최종 농도가 50％가 되도록 첨가하여 혼화하고, 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24 시간 배양하였다. 이 용액을 폴리아크릴아미드 전기영동으로 분리하고, 반건식 블롯팅 장치(미국, 오울 세퍼레이션 시스템즈사)를 사용하여 겔 중의 단백질을 PVDF막(미국, 밀리포어사)에 전사하였다. 2A2B 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하고, 정제 FGF-23 단백질로부터 유래하는 대사물을 검출하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 혈청과 혼화한 후, 배양 시간의 증가에 따라 전장 FGF-23 단백질의 존재량은 감소하고, 새롭게 22 kDa의 단편이 출현하여 증가하는 것으로 확인되었다.

(2) 인간 혈청 및 혈장과 정제 FGF-23 단백질의 혼화 실험

20 ng의 정제 FGF-23 단백질에 인간 혈청 또는 인간 혈장을 최종 농도가 50％가 되도록 첨가하여 37 ℃에서 3 시간 배양하였다. 이 용액을 폴리아크릴아미드전기영동으로 분리하고, 반건식 블롯팅 장치(미국, 오울 세퍼레이팅 시스템즈사)를 이용하여 겔 중의 단백질을 PVDF막(미국, 밀리포어사)에 전사하였다. 2A2B 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하고, 정제 FGF-23 단백질로부터 유래하는 대사물을 검출하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 인간 혈청과 FGF-23 단백질을 혼합한 경우에는 22 kDa의 밴드가 나타났지만, 인간 혈장과 FGF-23 단백질을 혼합해도 22 kDa의 밴드는 확인되지 않았다. 따라서, 22 kDa의 밴드는 혈청 중에 존재하는 단백질 절단 효소에 의한 것이라고 추정되었다.

<실시예 17> FGF-23 단백질의 절단 효소의 동정

(1) 트롬빈으로의 FGF-23의 절단

20 ng의 정제 FGF-23 단백질에 트롬빈(미국, 시그마사)을 최종 농도 1 단위/㎖로 첨가하여 3 시간 배양하였다. 이 용액을 폴리아크릴아미드 전기영동으로 분리하고, 반건식 블롯팅 장치(미국, 오울 세퍼레이팅 시스템즈사)를 사용하여 겔 중의 단백질을 PVDF막(미국, 밀리포어사)에 전사하였다. 2A2B 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하고, 정제 FGF-23 단백질로부터 유래하는 대사물을 검출하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 전장의 FGF-23 단백질은 소실되고, 22 kDa의 밴드로 변환되었다.

(2) 혈청에 의한 FGF-23 단백질의 절단에 대한 히루딘의 억제 작용

혈청에 의한 FGF-23 절단에 있어서 혈청 중 트롬빈의 관여에 대하여 검토할 목적으로, 트롬빈의 선택적 억제제로서 알려져 있는 히루딘의 영향을 검토하였다. 20 ng의 정제한 FGF-23 단백질에 래트 혈청을 최종 농도가 50％가 되도록 첨가하여4 시간 배양하였다. 또한, 래트의 혈청 첨가시 히루딘을 1.0 단위/㎖로 첨가하여 동일하게 배양하였다. 이 용액을 폴리아크릴아미드 전기영동으로 분리하고, 반건식 블롯팅 장치(미국, 오울 세퍼레이팅 시스템즈사)를 사용하여 겔 중의 단백질을 PVDF막(미국, 밀리포어사)에 전사하였다. 2A2B 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하고, 정제 FGF-23 단백질로부터 유래하는 대사물을 검출하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 래트에 혈청을 첨가함으로써 FGF-23 단백질의 일부가 22 kDa의 폴리펩티드로 변환되었지만, 히루딘을 공존시킴으로써 22 kDa의 밴드 출현이 억제되었다. 이로부터 혈청에 의해 생기는 FGF-23 단백질의 절단은 트롬빈 또는 트롬빈과 유사한 효소에 의한 것임이 밝혀졌다.

<실시예 18> 혈청에 의한 FGF-23 단백질의 절단 부위의 동정

FGF-23의 혈청에 의한 절단 부위를 동정하기 위해 10 ㎍의 정제 FGF-23 단백질과 래트의 혈청을 24 시간 혼화하여 22 kDa의 폴리펩티드를 생성시켰다. 이 용액 중의 22 kDa의 폴리펩티드를 실시예 14에서 제조한 항1C3H 항체 칼럼에 흡착시키고, 용출하여 정제하였다. 여기서 사용한 항체 칼럼은 200 ㎍의 비오틴화 1C3H 항체를 500 ㎕의 스트렙타비딘 고정화 수지(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)에 흡착시킴으로써 제조하였다. 항체 칼럼으로부터의 FGF-23 유래 단백질의 용출은 0.1 M 글리신 용액(pH 2.7)을 사용하여 행하였다. 이와 같이 정제한 폴리펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, CBB 염색을 행하여 도 12에 나타낸 바와 같이 정제된 22 kDa 폴리펩티드를 동정하였다. 이 밴드를 절단하여 MALDI-TOF MS 해석에 사용하였다. 그에 따라 얻어진 분자량으로부터, 22 kDa의 폴리펩티드는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열의 25번째 티로신으로부터 196번째 아르기닌까지의 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.

이들 결과로부터, FGF-23 단백질은 혈청 중에서는 혈청 중에 포함되는 트롬빈에 의해 서열 1에 나타낸 아미노산 서열의 196번째에 위치하는 아르기닌 뒤에서 절단되어 서열 1의 25 내지 196번째 서열로 나타낸 폴리펩티드로 변환된다는 것이 밝혀졌다. 이미 상술한 바와 같이 혈중에서 활성을 갖는 FGF-23 단백질의 측정에는 서열 1의 아미노산 서열의 179번째와 180번째 사이에서 절단되지 않은 폴리펩티드를 검출할 필요가 있지만, 활성을 갖는 전장형 FGF-23 단백질이 혈청 샘플 제조 과정에서 196번째와 197번째 사이에서 일부 절단되는 것이 명확해져 C 말단을 인식하는 항FGF-23 모노클로날 항체에서는 이 대사물을 인식할 수 없는 것으로 판명되었다. 즉, 서열 1의 아미노산 서열 25 내지 179번째의 영역을 인식하는 항체와 서열 1의 아미노산 서열 180 내지 196번째의 영역을 인식하는 항체의 조합으로 샌드위치 ELISA를 행했을 경우에는 혈청화에 의한 절단의 영향을 무시할 수 있지만, 서열 1의 아미노산 서열 25 내지 179번째의 영역을 인식하는 항체와 서열 1의 아미노산 서열 197 내지 251번째의 영역을 인식하는 항체를 사용했을 경우, 혈장 중에서와 비교하여 혈청 중에서는 측정치가 저하될 가능성이 있다. 이번에 취득하게 된 항FGF-23 모노클로날 항체 중 1C3H 항체 및 3C1E 항체는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열의 아미노산 잔기 180 내지 194번째의 영역을 인식하는 항체라는 점에서, FGF-23이 혈청 중에서 절단되어 생산된 22 kDa 단백질(서열 1의 아미노산 서열 25 내지 196번째에 상당)을 서열 1의 아미노산 서열의 179번째와 180번째 사이에서 절단에의해 생기는 폴리펩티드 단편과 구별하여 인식할 수 있고, 혈청 샘플의 측정법을 작제하는 데 있어서 매우 유용한 항체라는 것이 밝혀졌다.

<실시예 19> 종양성 골연화증 환자 혈청 및 혈장 중의 FGF-23 단백질 농도의 정량적 해석

종양성 골연화증에서는 종양으로 FGF-23이 과잉 생산되는 것이 보고되어 있으며, 이 원인 종양을 제거함으로써 치유하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 종양성 골연화증의 원인 종양은 일반적으로 증식성이 낮기 때문에 종양이 작아 발견하기 곤란한 경우가 많으며, 다른 저인혈증성 질환과의 감별 진단이 쉽지 않다. 혈중 FGF-23 농도가 종양성 골연화증을 진단하는 데 있어서의 지표가 되는 것을 실증할 수 있고, 또한 정량적으로 측정할 수 있는 방법이 개발되면 임상적으로 유용하다.

종양성 골연화증 환자의 혈청 및 혈장 샘플을 입수하고, 항FGF-23 모노클로날 항체를 이용한 샌드위치 ELISA계로 검체 중의 FGF-23을 정량적으로 해석하는 것을 시도하였다. 항FGF-23 모노클로날 항체를 이용한 ELISA계는 상술한 방법을 이용하였다. 2C3B 항체를 고상화 항체로서 사용하고, 검출용 항체로서 비오틴 표지의 3C1E 항체 또는 1D6A 항체를 이용하였다. 정제한 2C3B 항체를 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 10 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96 웰 ELISA용 플레이트 (Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하고, 4 ℃에서 12 시간 정치하여 고상화하였다. 그 후, 반응액을 제거하고, 블로킹 용액(슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)을 1 웰당 250 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 배양하여 블로킹을 행하였다. 용액을 제거하고, 트윈 20을 0.1％ 함유하는 TBS(T-TBS)로 2회 세정하였다. 종양성 골연화증 환자 혈청 및 혈장 샘플에는 마우스 항체로의 비특이적 반응을 피하기 위해, 이소형 대조군으로서 80 ㎍/㎖ 농도의 마우스 IgG1을 포함하는 T-TBS 용액에 2배 희석하였다. 또한, FGF-23 단백질로의 특이적 반응을 확인하기 위해 고상화에 사용한 항체 2C3B 항체를 과잉량(80 ㎍/㎖) 포함하는 T-TBS에 2배 희석한 것을 제조하였다. 검량선을 작성하기 위한 표준액은, 마찬가지로 이소형 대조군 항체를 포함하는 용액에 희석한 건강한 사람의 혈청 또는 혈장에, 정제 FGF-23 단백질을 0.5, 0.25, 0.125, 0.061, 0.031, 및 0.015 ng/㎖의 농도가 되도록 첨가하여 제조하였다. 각각의 샘플을 1 웰당 50 ㎕씩 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하여 검체 중의 FGF-23 단백질을 고상화 항체와 반응시켰다. 항체 반응 후, T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액 (블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 10 ㎍/㎖로 희석한 2종의 비오틴 표지 항FGF-23 모노클로날 항체(1D6A 항체, 3C1E 항체)를 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 2차 항체 반응을 행하였다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 5000배로 희석한 HRP 표지의 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 비오틴 표지 항체와 결합시켰다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 배양하였다. 30 분 후에 0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도측정 장치(MTP-300, 일본, 코로나 덴끼사)를 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 감한 값을 구하였다. FGF-23 특이적인 반응을 나타내는 값으로서, 과잉량의 이소형 대조군 항체의 존재하에서 측정한 A450 내지 A570의 값으로부터 과잉량의 2C3B 항체의 존재하에서 측정한 A450 내지 A570의 값을 감함으로써 구하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다. 1D6A를 검출 항체에 사용했을 경우, 혈장 샘플 및 혈청 샘플의 측정치는 각각 0.033, 0.008이고, 분명히 혈청에서 혈장보다 낮은 측정치를 나타내었다. 한편, 3C1E를 검출 항체로서 사용했을 경우, 혈청 샘플과 혈장 샘플의 측정치는 거의 동일한 정도의 값을 나타내었다. 이 결과는 실시예 18에 나타낸 혈청 중에서의 FGF-23 단백질 절단이 본 샘플에서도 일부 발생하기 때문이라고 여겨지며, 상술한 바와 같이 검출 항체의 차이에 의해 임상 샘플에서도 측정치의 차이가 나오는 것이 명확해졌다. 따라서, 혈청 제조에 의해 생기는 절단체도 측정할 수 있는 3C1E 항체를 검출 항체로서 사용하여 샌드위치 ELISA를 행하고, 본 환자의 종양 적출 수술 전후에 채취된 혈장 중의 FGF-23 농도를 측정하였다. 건강한 사람도 혈장 샘플에 여러가지 농도의 정제된 FGF-23 단백질을 첨가한 용액을 표준액으로 하고, 첨가한 정제 단백질량에 따른 흡광도의 증가에 기초하여 검량선을 작성하였다. 이와 같이 하여 구한 검량선을 도 14A에 나타내었다. 2배 희석한 인간 혈장 및 혈청 중에서도 표준액 중의 FGF-23 단백질을 30 pg/㎖의 농도로부터 유의한 측정치의 상승으로서 검출하여 적어도 500 pg/㎖ 정도까지의 범위 내에서 정량에 사용할 수 있는 검량선을 얻을 수 있었다. 이러한 조건하에서 종양성 골연화증 환자로부터 종양 적출 수술 전날 채취한 혈장과 종양 적출 수술후 1 개월 이상 경과하여 채취한 혈장 샘플 중의 FGF-23 농도를 정량적으로 측정하였다. 그 결과를 도 14B에 나타내었다. 종양 적출 수술 전의 혈장 중에는 약 270 pg/㎖의 FGF-23 단백질이 존재하였지만, 수술 후에 채취한 샘플에서는 FGF-23 단백질은 검출 감도(30 pg/㎖) 이하로 저하되어 있었다. 종양성 골연화증에 있어서는 원인 종양의 존재에 의해 측정할 수 있는 농도의 FGF-23이 혈중에 존재하고, 종양 제거에 의해 혈중의 FGF-23 농도가 현저하게 저하하는 것이 명확하게 시사되었다. 이상의 점으로부터, 항FGF-23 모노클로날 항체를 이용한 ELISA가 종양성 골연화증 진단에 유용함과 동시에, 인식 부위를 특정한 항체를 사용함으로써 혈청에 의한 FGF-23의 절단 영향도 가미하여 정량적으로 측정할 수 있음이 시사되었다.

<실시예 20> 항FGF-23 모노클로날 항체를 이용한 면역 조직 염색

항FGF-23 모노클로날 항체를 이용하여 종양성 골연화증 원인 종양의 면역 조직 염색을 행하였다. 적출 종양을 동결 절편 제조용 포리액에 침지하여 액체 질소로 냉각한 아세톤으로 동결하고, 종양 동결 블록을 제조하였다. 또한, 대조군으로서 수술시에 동시 적출된 종양 조직 주변의 정상이라고 여겨지는 조직에 대해서도 동일하게 동결 블록을 제조하였다. 쿼스타트(CM1900, 독일, 레이카사)를 사용하여 동결 블록을 4 ㎛의 두께로 얇게 절단하고, 절편을 MAS 코트 슬라이드 글래스(일본, 마쯔나미 글래스사) 상에 냉각 건조시키면서 접착시켰다. 이와 같이 제조한 동결 절편은 -20 ℃에서 보존하였다. 동결 절편을 접착시킨 슬라이드 글래스를 아세톤 중에서 실온하에 5 분 정치하고, 조직을 슬라이드 글래스 상에 고정하였다. PBS로 세정한 후, 1％의 과산화수소, 0.1％의 아지드화 나트륨을 함유하는 PBS 중에서 30 분간 실온 배양하여 내인성의 퍼옥시다제를 불활성화하였다. 그 후, 0.1％의 트윈 20을 함유하는 PBS로 세정하고, 4％의 탈지 분유를 함유하는 PBS 중에서 30 분간 실온 배양하여 블로킹하였다. 그 후, 10 ㎍/㎖의 비오틴 표지의 1C3H 항체 및 2C3B 항체를 함유하는 PBS로 1 시간 실온에서 배양하여 조직 중의 FGF-23과 첨가한 모노클로날 항체를 반응시켰다. 0.1％의 트윈 20을 함유하는 PBS로 세정한 후, 퍼옥시다제 키트(Vectastain Elite ABC(등록 상표), 미국, 벡터 래보로토리사)를 사용하여 조직 절편에 특이적으로 결합된 비오틴 표지의 모노클로날 항체에 서양 고추냉이ㆍ퍼옥시다제를 결합시켰다. 0.1％의 트윈 20을 함유하는 PBS로 세정한 후 퍼옥시다제와 기질의 반응(DAKA 액체 DAB 기질-발색원 시스템(DAKA liquid DAB substrate-chromogen system, 등록 상표), 덴마크, 다코사)을 행한 후, PBS로 반응을 정지시켰다. 탈이온교환수를 이용하여 세정한 후, 헤마토크실린ㆍ마이어(미국, 머크사)를 탈이온교환수에 5 배 희석한 용액 중에서 30 초간 실온 배양한 후, 흐르는 물로 세정하였다. 그 후, 에탄올을 사용하여 탈수하고, 크실렌을 사용하여 투철한 후, 봉입액을 사용하여 봉입하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다. 종양 조직에서 FGF-23과 반응했다고 여겨지는 부위가 갈색으로 염색되었지만, 이러한 염색상은 종양 주변부의 조직에서는 관찰되지 않았다. 이로부터 종양성 골연화증의 원인 종양에 FGF-23이 고농도로 존재한다는 것이 확인되었다.

<실시예 21> 마우스 FGF-23 단백질의 발현과 정제

마우스의 FGF-23 서열은 이미 보고되어 있다(Yamashita, T., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277: 494-498, 2000). 이 서열에 기초하여 NCBI유전자 서열 데이타베이스를 검색함으로써, 마우스의 FGF-23의 서열 정보를 입수할 수 있다. 이와 같이 하여 얻은 서열 정보에 기초하여 마우스의 FGF-23 단백질을 코딩하는 cDNA를 취득하기 위해 2단계(Nested) PCR을 실시하였다. 제1 단계 증폭 반응에 사용하는 프라이머로서 마우스 FGF-23 cDNA 서열의 5' 및 3' 비번역 영역에 각각 상보적인 서열을 갖는 mF5 프라이머(서열 25)와 mF3 프라이머(서열 26)를 합성하였다. 마우스의 폐 유래의 cDNA(미국, 클론테크사)를 주형으로 하고, LA-Taq DNA 중합효소(일본, 다까라 슈조사)를 사용하여 94 ℃에서 1 분간 보온한 후, 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 45 초로 이루어지는 공정을 1 사이클로 하여 30 사이클의 PCR을 실시하였다. 이어서, 제2 단계 반응은 개시 코돈로부터 번역 영역을 포함하는 서열 27에 나타낸 mF23F 프라이머와, 번역 영역에서 종결 코돈을 포함하는 서열 28에 나타낸 mF23R 프라이머를 사용하여 행하였다. mF23F 프라이머에는 클로닝용의 EcoRI 제한 효소 인식 서열과 코작(Kozak) 서열이 도입되어 있다. 한편, mF23R 프라이머에는 종결 코돈 후에 NotI 제한 효소 인식 서열이 도입되어 있다. 제1 단계 반응액을 주형으로 하고, 파이로베스트(PyroBest) DNA 중합효소(일본, 다까라 슈조사)를 사용하여 98 ℃에서 1 분간 보온한 후, 98 ℃에서 10 초, 58 ℃에서 10 초, 72 ℃에서 60 초로 이루어지는 공정을 1 사이클로 하여 35 사이클의 PCR을 실시함으로써 마우스 FGF-23 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 증폭하였다. 이 cDNA를 pEAK8 벡터(미국, 엣지 바이오시스템사)의 EcoRI 부위와 NotI 부위에 클로닝하였다. 이 벡터를 pEAK8mFGF-23이라고 한다. 또한, 실시예 1에 나타낸 FGF-23RQH의 제조 방법에 준하여, 마우스 FGF-23의 절단 효소 인식 부위의 아르기닌 잔기를 글루타민 잔기로 치환시킨 변이를 도입한 마우스 FGF-23RQ를 구축하였다. 변이 도입은 실시예 1의 (3)에 기재한 방법에 따라 실시하였다. 변이 도입용의 정방향 mRQF 프라이머(서열 29)와 역방향 mRQR 프라이머(서열 30)를 합성하였다. 우선, pEAK8mFGF-23을 주형으로 하여 mF23F 프라이머와 mRQR 프라이머의 조합, 및 mF23R 프라이머와 mRQF 프라이머의 조합으로 PCR을 행하고, 각각의 PCR 단편을 취득하였다. 이어서, 이 두가지 산물을 혼합하여 주형으로 하고, 마우스 FGF-23 cDNA의 양 말단에 위치하는 mF23F 프라이머와 mF23R 프라이머로 PCR을 행하여 변이가 도입된 마우스 FGF-23 cDNA를 증폭하였다. 이것을 pEAK8/IRES/EGFP 플라스미드의 EcoRI 제한 효소 부위와 NotI 제한 효소 부위에 클론화하였다. 이것을 정제하여 염기 서열을 결정함으로써, 목적하는 변이를 도입한 마우스 FGF-23 cDNA가 클로닝되어 있는 것을 확인하였다. 이것을 pEAK8/IRES/EGFP/mFGF-23RQ라고 한다. 또한, 이 플라스미드를 CHO ras 클론-1에 도입하고, 5 ㎍/㎖의 퓨로마이신(미국, 시그마사)을 첨가하여 약제 내성 세포를 선택하고, 클로닝하여 마우스 FGF-23 발현 세포를 취득하였다. 이 세포를 CHO-mFGF23RQ라고 한다. 이 CHO-mFGF23RQ 세포를 롤러 병에서 배양하여 약 12 ℓ의 배양 상청을 취득하였다. 이것을 실시예 2의 (3)에 기재한 FGF-23 단백질의 정제법에 따라 정제하여 정제 마우스 FGF-23RQ를 취득하였다.

mF5: ATTAGCCACTCAGTGCTGTGCAATG(서열 25)

mF3: GCAGCCTGGCCTGGGGACCTA(서열 26)

mF23F: GGAATTCCACCATGCTAGGGACCTGCCTTAGACTC(서열 27)

mF23R: ATAGTTTAGCGGCCGCCTAGACGAACCTGGGAAAGGGGCGACA(서열 28)

mRQF: TTCGCCCACGGCAACACACGCAAAGCGCCGAGGAC(서열 29)

mRQR: GTCCTCGGCGCTTTGCGTGTGTTGCCGTGGGCGAA(서열 30)

<실시예 22> 항인간 FGF-23 모노클로날 항체와 FGF-23의 반응 교차성

정제한 마우스 FGF-23RQ 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, PVDF막(미국, 밀리포어사)에 단백질을 전사하여 3C1E 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시한 결과, 도 16A에 나타낸 바와 같이 약 32.5 kDa에서 밴드를 검출하였다. 이 정제 마우스 FGF-23RQ 단백질 용액을 단계 희석하고, 항인간 FGF-23 모노클로날 항체를 이용한 샌드위치 ELISA에서의 검출을 시도하였다. 여기서 사용한 마우스 FGF-23RQ 단백질 용액의 농도를 정확하게 구하지는 않았지만, 농도가 공지된 정제 인간 FGF-23 단백질과 견주어 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, CBB 염색으로 검출한 밴드의 농도로부터 판단했더니, 도 16B에서 상대치 10으로서 나타낸 것이 1 내지 5 ㎍/㎖의 범위라고 여겨졌다. 2C3B 항체를 고상화하고, 검출용 항체로서 3C1E 항체를 사용하여 마우스 FGF-23RQ 단백질 희석 용액을 피검 물질로 하여 측정을 실시한 결과를 도 16B에 나타내었다. 정제 마우스 FGF-23RQ 단백질의 농도 의존적인 450 nm 내지 570 nm의 값의 상승이 확인되었기 때문에, 여기서 사용한 항인간 FGF-23 모노클로날 항체를 이용한 ELISA에서 마우스의 FGF-23 단백질을 농도 의존적으로 검출할 수 있다는 것이 판명되었다. 또한, 항인간 FGF-23 모노클로날 항체가 마우스 FGF-23 단백질을 인식할 수 있다는 것을 확인할 수 있기 때문에, 실시예 27, 실시예 28에서 확인된 항인간 FGF-23 모노클로날항체의 작용은 마우스의 내재성 FGF-23과의 결합에 의해 활성을 중화 또는 수식하는 것으로 여겨졌다.

<실시예 23> 유전성 저인혈증 모델 마우스에서의 혈중 FGF-23 단백질의 검출

FGF-23이 종양성 골연화증의 야기 인자라는 것과, ADHR로 FGF-23 유전자의 미스센스 변이가 확인되어 질환 야기에 FGF-23이 관련되어 있다는 것이 알려져 있다. 그러나, 또 하나의 유전성 저인혈증 질환인 XLH에서는 책임 유전자가 해명되어 있음에도 불구하고, 그 질환 야기 메카니즘은 잘 알려져 있지 않다. 또한, FGF-23과의 관련성에 대해서도 알려져 있지 않다. 이 질환에서의 FGF-23의 관여를 검토할 목적으로 XLH의 모델 마우스인 Hyp 마우스의 혈중 FGF-23 농도의 측정을 시도하였다.

ELISA 실시에 있어서 2C3B 항체를 고상화 항체로서 사용하고, 검출용 항체로서 비오틴 표지의 3C1E 항체를 사용하였다. 정제한 2C3B 항체를 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 10 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96 웰 ELISA용 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 12 시간 정치하여 고상화하였다. 그 후, 반응액을 제거하고, 블로킹 용액(슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)을 1 웰당 250 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 배양하여 블로킹을 행하였다. 용액을 제거하고, 트윈 20을 0.1％ 함유하는 TBS(T-TBS)로 2회 세정하였다. 27 내지 30 주령의 Hyp 마우스 및 27 내지 30 주령에서 얻어진 정상적인 대조군 마우스로부터 안와 채혈에 의해 채취한 혈청을 제조하였다. 이것을, 2C3B 항체 또는 이소형 대조군인 마우스 IgG1 항체를 40 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 T-TBS에 2배 희석하였다. 각각의 샘플을 1 웰당 50 ㎕씩 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하여 검체 중의 FGF-23 단백질을 고상화 항체와 반응시켰다. 항체 반응 후, T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 2 ㎍/㎖로 희석한 3C1E 항체를 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 2차 항체 반응을 행하였다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 5000배로 희석한 HRP 표지의 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 비오틴 표지 항체와 결합시켰다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 배양하였다. 30 분 후에 0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도 측정 장치(MTP-300, 일본, 코로나 덴끼사)를 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 감한 값(A450-A570)을 구하였다. 반응시 이소형 대조군 항체를 첨가하여 얻은 A450 내지 A570의 값으로부터 흡수 항체로서 사용한 2C3B 항체를 첨가하여 얻은 A450 내지 A570의 값을 감한 값을 FGF-23 특이적 반응으로 하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17의 결과로부터, Hyp 마우스에서는 혈중의 FGF-23 농도가 현저하게 상승되어 있는 것으로 밝혀졌다. Hyp 마우스가 PHEX 유전자의 결손에 의한 저인혈증을 나타낸다는 것과, 인간의 저인혈증 질환인 XLH가 PHEX 유전자의 변이나 결손이 원인이라는 점에서, Hyp 마우스가 XLH의 모델 마우스라고 여겨졌다. 이것은 XLH에서 저인혈증 야기 인자로서 FGF-23 혈중 농도 상승이 존재하는 것이 강하게 시사되는 결과이다.

<실시예 24> FGF-23과 1,25D의 상호 조절 작용

(1) FGF-23H 투여에 의한 1,25D의 저하

6 주령의 BALB/c 수컷 마우스 6 마리에 정제한 FGF-23H 단백질을 1 마리당 5 ㎍씩 꼬리정맥으로 투여하고, 투여 후 1, 4, 9 시간 경과한 시점에서 채혈하여 혈중 1,25D 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 18A에 나타내었다. FGF-23H의 투여 후 3 시간에 유의적인 1,25D의 저하가 확인되고, 9 시간만에 더욱 저하되는 것이 발견되었다.

(2) 1,25D 투여에 의한 FGF-23의 유도

1,25D를 마우스에 투여하여 혈중 FGF-23의 변화를 검토하였다. 7 주령의 BALB/c 수컷 마우스 6 마리를 1 군으로서, 0.05％ 트윈을 포함하는 PBS에 용해시킨 0.025 ㎍의 1,25D를 투여하는 군과, 대조군으로서 그의 매체인 0.05％ 트윈을 포함하는 PBS를 투여하는 군을 설정하였다. 투여는 복강 내에서 행하였다. 투여 후 8 시간 경과한 시점에서 마취하에 심장으로부터 채혈하여 혈청을 제조하였다. 이 샘플을 실시예 23의 방법과 동일한 방법으로 ELISA에 사용하고, 인간 FGF-23 단백질 표준액을 사용하여 작성한 검량선을 이용하여 혈중 FGF-23의 양을 측정하였다. 그 결과를 도 18B에 나타내었다. 1,25D 투여 후 8 시간만에 현저한 혈중 FGF-23의 상승이 확인되었다.

이상의 점으로부터 FGF-23은 1,25D와 밀접한 상호 조절 관계를 갖는다는 것이 시사되었다.

<실시예 25> 신장 기능 부전 고인혈증 모델에서의 혈중 FGF-23 농도

7 주령의 위스터 래트에 0.75％의 비율로 아데닌을 혼이한 CE-2(일본, 구레아사)를 제공하고, 신장 기능 부전 고인혈증 모델을 제조하였다. 대조군에는 CE-2를 제공하였다. 혼이식을 제공하여 3 주째에 꼬리동맥으로부터 채혈하여 혈청을 채취하였다. 채혈 후, 래트를 대사 케이지에 넣어 뇨을 24 시간 채취하였다. 혈청 중의 인산 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 19A에 나타내었다. 혈청 중 및 뇨 중 크레아티닌은 시판되고 있는 키트(CRE-EN 카이노스(등록 상표), 일본, 카이노스사)를 이용한 효소법으로 측정하였다. 그 결과를 도 19B에 나타내었다. 또한, 2C3B 항체를 고상화하고, 3C1E 항체를 검출 항체로 한 ELISA계를 이용하여 혈청 중의 FGF-23 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 19C에 나타내었다.

이 모델에서 신장 기능의 장해가 진행되고 있는 것이 뇨 중 크레아티닌의 저하와 혈중 크레아티닌의 상승으로부터 명확하였다. 또한, 그에 따라 고인혈증을 나타내었다. 이 모델에서 혈중 FGF-23 단백질은 현저한 고수치를 나타내었다. 이 모델은 신부전의 한 형태를 반영하는 것이라고 여겨지며, FGF-23이 신장 기능 저하나 혈액 투석 환자에게 있어서 합병증의 야기 인자로서 작용하고 있을 가능성을 나타내었다.

<실시예 26> 종양성 골연화증 환자 혈장 중에 존재하는 FGF-23 단백질의 면역 침강법에 의한 검출

혈중에서의 FGF-23 단백질의 존재 형태를 조사하기 위해 건강한 사람의 혈장 또는 종양성 골연화증 환자 혈장으로부터 면역 침강법에서의 검출을 행하였다.400 ㎕의 혼합 혈장에 대하여, 실시예 14에서 제조한 2C3B 항체를 고정화한 수지, 및 항체를 고정화하지 않은 수지 각각 20 ㎕를 첨가하고, 4 ℃에서 1 시간 전도 혼화하여 항체와 FGF-23을 반응시켰다. 그 후, PBS로 수지를 4회 세정하고, 미반응물을 제거하였다. 각각의 수지에 50 ㎕의 샘플 완충액(50 mM Tris-Cl pH 6.8, 1％ SDS, 10％ 글리세롤, 0.001％ 브로모페놀 블루, 2 mM EDTA, 20 mM DTT)을 첨가하여 95 ℃에서 5 분간 가열한 후, 원심분리하여 얻은 상청을 회수하였다. 이것을 10 내지 20％ 구배 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고, 반건식 블롯팅 장치(미국, 오울 세퍼레이팅 시스템즈사)를 사용하여 겔 중의 단백질을 PVDF막(미국, 밀리포어사)에 전사하였다. 이 PVDF막을 T-TBS(미국 시그마사)에 0.5 ㎍/㎖로 희석한 비오틴 표지의 3C1E 항체 용액 중에서 실온하에 2 시간 배양한 후, 다시 HRP 표지 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 반응시켰다. 이것을 ECL 플러스 발광 시스템(미국, 아마샴 파마시아 바이오테크사)를 사용하여 필름에 1 시간 노광하고, 자동 현상기(일본국 후지 필름사)로 현상하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었다. 항체를 고정화하지 않은 수지에서는 혈장 유래의 비특이적인 시그널만이 관찰되었지만, 2C3B 항체로 면역 침강한 면역 침강물에 대하여 종양성 골연화증 환자 혈장에서는 전장형 FGF-23이라고 여겨지는 32 kDa에서 밴드가 검출되었다. 또한, 트롬빈으로 절단된 22kDa의 밴드는 전혀 관찰되지 않았다. 한편, 건강한 사람에게서는 22kD, 32kD의 밴드 모두 관찰되지 않았다. 이러한 결과로부터, 종양성 골연화증에서 고발현되는 FGF-23은 혈중에서는 절단되지 않고 전장체로서 존재하는 것으로 밝혀졌다.

<실시예 27> 정상 마우스에서의 항인간 FGF-23 모노클로날 항체 투여 시험

항인간 FGF-23 모노클로날 항체의 정상 마우스로의 영향을 검토하기 위해, 이하의 실험을 실시하였다. 정상 마우스(BALB/c, 수컷, 12 주령)를 4 마리씩으로 이루어지는 5개의 군으로 무작위 분별하고, 도 21A에 나타낸 바와 같이 1 군에는 매체로서 PBS를, 2 군 내지 4 군에는 0.67 mg/㎖의 항인간 FGF-23 모노클로날 항체(1D6A, 2C3B, 3C1E)를, 또한 5 군에는 대조군으로서 0.67 mg/㎖의 항 TPO 모노클로날 항체를 각각 0.15 ㎖씩 꼬리정맥 내에 1회 투여하였다. 투여로부터 24 시간 후에 에테르 마취하에 심장 채혈을 실시하고, 마이크로테이너(microtainer, 미국 벡톤 디킨슨사)를 사용하여 혈청을 분리하였다. 얻어진 혈청 중의 인산 농도를 인-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸사), 혈청 중의 칼슘 농도를 칼슘-테스트 와꼬(일본국 와꼬 쥰야꾸사), 혈청 1,25D 농도를 1,25(OH)2D RIA 키트 TFB(미국 티에프비사)를 각각 사용하여 첨부 문서에 따라 측정하였다. 투여로부터 채혈까지의 사이에, 각각의 군을 플라스틱 케이지에서 사육하고, 인 및 칼슘을 1％씩 포함하는 고형식 CE-2(일본, 닛본구레아사) 및 수도물을 자유 섭취시켰다.

얻어진 결과를 도 21A에 나타내었다. 측정치는 각 군에서의 평균치+/-표준 편차로 표시되어 있다. *를 부여한 군은, 스튜던트-t에 의해 유의차 검정을 실시한 결과, 매체(PBS) 투여군 및 항TPO 항체 투여군 모두에 대하여 p<0.01을 나타낸 군을 나타낸다.

<실시예 28>

실시예 27에서 3C1E 항체에서는 혈청 인 농도의 상승이 확인됨에도 불구하고, 혈청 1,25D 농도가 저하된다는 결과가 확인되었지만, 혈중 1,25D 농도의 변화는 민감하여 1,25D 농도를 일과성으로 상승시켰을 경우, 그 후에 저수치를 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서, 3C1E 항체 투여 시험을 다시 실시하였다. 정상 마우스 6 마리에 대하여 1 마리당 400 ㎍의 3C1E 항체를 정맥내 투여하고, 8 시간 후의 혈청 1,25D 농도를 측정하였다. 대조군으로서 PBS를 투여하여 동일하게 처치한 마우스의 혈청 1,25D 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 21B에 나타내었다. 이 실험에서는 3C1E 항체에 의한 현저한 혈청 1,25D 농도의 상승이 확인되었다.

<실시예 29> 아데닌 유발 신부전 래트에서의 항FGF-23 항체(3C1E)의 1,25(OH)2D 회복 작용

실시예 25에 기재한 바와 같이, 아데닌 유발 신부전 래트에서는 모델 제조로부터 3 주째에 유의한 혈청 인 농도 및 혈중 FGF-23 농도의 상승이 확인된다. 한편, 이 모델에서는 아데닌 투여 후 7 일째에 이미 신장 기능 저하에 따른 혈중 1,25D 농도의 저하도 확인된다(도 22A). 따라서, 이 신장 기능 장해 초기의 혈중 FGF-23 농도에 대해서도 비교 검토를 위해 하기의 요령으로 정량을 행하였다.

ELISA 측정에는 고상화 항체로서 2C3B 항체를, 검출용 항체로서 비오틴 표지의 3C1E 항체를 사용하였다. 우선, 정제한 2C3B 항체를 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 5 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96 웰 ELISA용 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하고, 4 ℃에서 12 시간 정치하여 고상화하였다. 그 후, 반응액을 제거하고, 블로킹 용액(슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)을 1 웰당 250 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 배양하여 블로킹하였다. 용액을제거하고, 트윈 20을 0.1％ 함유하는 TBS(T-TBS)로 2회 세정하였다. 혈청을 제조하고, 이것을 T-TBS에 2배 희석하였다. 또한, 표준물의 희석은 실시예 14에서 제조한 항2C3B 항체 고정화 수지와 함께, 내재성 FGF-23을 제거한 래트 혈청을 T-TBS에 2배 희석한 것을 사용하여 행하였다. 각각의 샘플을 1 웰당 50 ㎕씩 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하여 검체 중의 FGF-23 단백질을 고상화 항체와 반응시켰다. 항체 반응 후, T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 1.5 ㎍/㎖로 희석한 3C1E 항체를 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 2차 항체 반응을 행하였다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액 (블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 5000배로 희석한 HRP 표지 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 비오틴 표지 항체와 결합시켰다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 배양하였다. 30 분 후에 0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도 측정 장치를 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 570 nm의 흡광도로 감한 값(A450-A570)을 구하고, 검량선으로부터 재조합 인간 FGF-23 단백질 정제물로 환산한 농도를 산출하였다.

그 결과, 도 22B에 나타낸 바와 같이, 아데닌 혼이군에서의 혈중 FGF-23 농도는 유의한 상승을 보였다. 그런데, 실시예 24에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스로의 FGF-23 투여는 혈중 1,25D 농도를 빠르게 저하시킬 수 있기 때문에, 신장 기능 저하시의 혈중 1,25D의 저하와, 혈중 FGF-23 농도의 상승 사이에는 무언가 상호작용이 존재함이 시사되었다. 이 가능성을 검증하기 위해 아데닌 혼이 후의 혈중 1,25D 농도와 혈중 FGF-23 농도를 개체별로 플롯팅했더니, 유의한 음의 1차 상관을 나타내는 것(도 22C)이 밝혀졌다. 이들 결과로부터, 혈중 FGF-23 농도를 제어함으로써 혈중 1,25D 저하를 시정할 수 있는 가능성이 시사되었다. 따라서, 이 모델로의 항FGF-23 중화 항체 투여 시험을 이하의 요령으로 실시하였다.

7 주령의 수컷 위스터 래트 12 마리에 설치류용 시판 분말 사료 CE-2(일본, 구레아사)에 아데닌(6-아미노퓨린, 미국, 시그마사)을 최종 농도가 0.75％가 되도록 배합한 혼합 사료를 7 일간 자유 섭취시킴으로써 신장 기능 저하 모델로 하였다. 대조군 12 마리에게는 CE-2만을 제공하였다. 모델 제조로부터 7 일 후의 혈중 크레아틴의 값을 지표로 신장 기능 장해 정도가 동등해지도록 아데닌 혼이군, 대조군을 각각 6 마리씩 2 군으로 나누어 3C1E 항체를 1 mg/kg, 또는 매체로서 PBS를 1 ㎖/kg, 각각 꼬리정맥 내 1회 투여하고, 12 시간 후에 꼬리동맥으로부터 부분 채혈하여 이것을 원심분리함으로써 혈청을 얻었다. 얻어진 혈청 중의 1,25D 농도를 1,25(OH)2D RIA 키트 TFB(미국 티에프비사), 혈청 크레아티닌 농도를 CRE-EN 카이노스((등록 상표), 일본, 카이노스사)를 각각 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 22D에 나타낸 바와 같이, 대조군, 아데닌 혼이군 모두에서 매체 투여군에 비하여 유의한 1,25D 농도의 상승을 확인하였다. 이상의 결과로부터, 신장 기능 저하에 따른 저1,25D 혈증에 FGF-23이 관여하며, 이 때 FGF-23의 작용을 억제함으로써 저1,25D 혈증을 개선할 수 있음이 시사되었다.

<실시예 30> X-연관 저인혈증성 구루병(XLH) 환자에서의 혈중 FGF-23 단백질의 검출

XLH는 반성 유전 형질을 나타내는 저인혈증성 구루병이고, 그 병태에는 종양성 골연화증과 공통점이 많이 확인된다. 최근, 원인 유전자로서 메탈로 엔도펩티다제(metalloendopeptidase) 패밀리에 속하는 phex가 동정되고, 그 가상 기질이 병태의 야기 인자라는 것이 시사되고 있다. 한편, 실시예 23에 나타낸 바와 같이, XLH와 동일 phex에 유전자 변이를 수반한 유전성 저인혈증성 모델 마우스인 Hyp 마우스에서 FGF-23의 혈중 농도가 매우 높다는 것이 판명되었다. 이들 사실으로부터 XLH에서의 저인혈증이 종양성 골연화증과 마찬가지로 혈중 FGF-23 농도 상승에 기인할 가능성이 시사되었다. 따라서, 우선 이 질환에서의 FGF-23의 관여를 검토할 목적으로 건강한 사람 및 XLH 환자 혈청 중의 FGF-23 농도를 측정하였다. 또한, 측정에 사용한 혈청은 건강한 사람 및 phex 유전자 변이를 확인한 XLH 환자로부터 사전에 충분한 승인을 얻은 후 제공된 것이다. 환자의 연령, 성별, phex 유전자의 변이 위치를 도 23에 기재하였다.

ELISA 측정에는 고상화 항체로서 2C3B 항체를, 검출용 항체로서 비오틴 표지의 3C1E 항체를 사용하였다. 우선, 정제한 2C3B 항체를 50 mM 탄산수소나트륨 용액에 10 ㎍/㎖가 되도록 희석하고, 96 웰 ELISA용 플레이트(Maxisorp(등록 상표), 미국, 누크사)에 1 웰당 50 ㎕를 첨가하고, 4 ℃에서 12 시간 정치하여 고상화하였다. 그 후, 반응액을 제거하고, 블로킹 용액(슈퍼블록(등록 상표), 미국, 피어스사)을 1 웰당 250 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 배양하여 블로킹하였다. 용액을제거하고, 트윈 20을 0.1％ 함유하는 TBS(T-TBS)로 2회 세정하였다. XLH 환자로부터 채취한 혈청을 제조하고, 이것을 FGF-23에 결합성을 갖지 않는 마우스 IgG1 항체를 100 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 T-TBS에 2배 희석하였다. 또한, 표준물의 희석은 실시예 14에서 제조한 항2C3B 항체 고정화 수지와 함께, 내재성의 FGF-23을 제거한 건강한 사람의 혈청을 FGF-23에 결합성을 갖지 않는 마우스 IgG1 항체를 100 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 T-TBS에 2배 희석한 것을 사용하여 행하였다. 각각의 샘플을 1 웰당 50 ㎕씩 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치하여 검체 중의 FGF-23 단백질을 고상화 항체와 반응시켰다. 항체 반응 후, T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 1.5 ㎍/㎖로 희석한 비오틴 표지의 3C1E 항체를 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 2차 항체 반응을 행하였다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 10％의 블로킹 용액(블록케이스(등록 상표), 일본, 다이닛본 세야꾸사)을 포함하는 T-TBS에 5000배로 희석한 HRP 표지의 스트렙타비딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 정치하여 비오틴 표지 항체와 결합시켰다. 각 웰을 T-TBS로 4회 세정한 후, 퍼옥시다제 발색 기질인 테트라메틸벤지딘(덴마크, 다코사)을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 배양하였다. 30 분 후에 0.5 M 황산액을 1 웰당 50 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 측정은 96 웰 플레이트용의 흡광도 측정 장치를 사용하여 행하고, 450 nm의 흡광도를 595 nm의 흡광도로 감한 값(A450-A595)을 구하였다.

그 결과, 건강한 성인 104명(남성 30명, 여성 74명)의 혈중 FGF-23 농도치는8.2 내지 54.3 ng/ℓ의 범위로 집약되고, 이들 평균치 및 그 표준 오차는 28.9 +/- 1.1 ng/ℓ였다. 한편, 도 23에 나타낸 바와 같이, XLH 환자에게 있어서의 혈청 중 FGF-23 농도치는 모두 건강한 사람의 평균치에 비하여 고수치를 나타내고, 평균치에 있어서도 건강한 사람의 그것에 대하여 유의하게 고수치였다(p<0.0001, 스튜던트-t에 의해 산출). 이로부터 XLH 환자 혈청 중에서의 고농도의 FGF-23은 해당 질환의 야기 인자로서 작용하고 있을 가능성이 강하게 시사되었다.

<실시예 31> 2종의 다른 중화 항체를 혼합했을 때의 중화 활성의 증강 작용

다른 부위를 인식하는 중화 항체를 혼합했을 경우의 생리 작용 변화에 대하여 정상 마우스를 사용하여 검토하였다.

8 주령의 수컷 C57BL/6을 6 마리씩으로 이루어지는 4개의 군으로 무작위 분별하고, 1 군에는 매체로서 PBS를, 2 군에는 마우스 1 마리당 100 ㎍의 2C3B 항체를, 3 군에는 100 ㎍의 3C1E 항체를, 4 군에는 50 ㎍의 2C3B 항체와 50 ㎍의 3C1E 항체를 혼화한 항체를 각각 꼬리정맥 내에 1회 투여하였다. 투여로부터 1 일째 및 2 일째에 에테르 마취하에 안와 채혈을 실시하고, 마이크로테이너(미국 벡톤 디킨슨사)를 사용하여 혈청을 분리하였다. 얻어진 혈청 중의 인산 농도를 인-테스트 와꼬(일본 와꼬 쥰야꾸사)를 사용하여 첨부 문서에 따라 측정하였다. 투여로부터 채혈 사이에, 각각의 군을 플라스틱 케이지에서 사육하여 CE-2(일본, 닛본구레아사) 및 수도물을 자유 섭취시켰다.

얻어진 결과를 도 24에 나타내었다. 100 ㎍의 2C3B 항체 또는 3C1E 항체는 투여 후 1 일째에 단독으로 유의하게 혈청 인 농도를 상승시켰다. 한편, 혼합 항체 투여군에서는 각 항체의 용량이 반감함에도 불구하고, 유의한 혈청 인 상승 작용을 나타내고, 단독 투여군 모두와 비교하더라도 유의한 고수치를 나타내었다. 또한, 투여 후 2 일째, 2C3B 항체 또는 3C1E 항체 투여군에서는 혈청 인 상승 작용이 소실된 것에 비하여, 혼합 항체 투여군에서는 여전히 유의하게 혈청 인 농도를 상승시켰다. 이상의 결과로부터, 2종의 다른 부위를 인식하는 항체를 혼합한 쪽이 1종의 항체를 단독으로 투여했을 때보다 중화 활성이 증강되고, 그 작용 시간이 유지될 수 있음이 시사되었다.

<실시예 32> 유전성 저인혈증성 모델 마우스에서의 FGF-23 중화 항체 투여 시험

실시예 23 및 실시예 30에 나타낸 바와 같이, XLH 및 Hyp 마우스에서의 혈중 FGF-23 농도의 상승이 명확해지고, FGF-23이 이들 질환의 병태인 저인혈증, 비타민 D 대사 이상 또는 골석회화 장해의 책임 인자일 가능성이 시사되었다. 따라서, Hyp 마우스에 항FGF-23 중화 모노클로날 항체를 투여하고, 상술한 병태가 개선될 수 있지의 여부를 검토하였다.

(1) 항FGF-23 중화 항체의 반복 투여 시험

4 내지 7 주령의 수컷 C57BL/6-Hyp 마우스 및 4 내지 7 주령의 야생형 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하여 중화 항체의 반복 투여에 의한 Hyp 마우스의 혈중 인산 농도 및 혈중 1,25D 농도에 대한 효과를 검토하였다. 이 시험에서의 군 구성은 야생형 마우스 매체 투여군, 야생형 마우스 항체 투여군, Hyp 마우스 매체 투여군, Hyp 마우스 항체 투여군의 4 군으로서, 1 군당 4 마리로 하였다. 항체 투여군에는 3C1E 항체 및 2C3B 항체를 각각 최종 농도가 1.7 mg/㎖가 되도록 혼화한 것을 마우스 1 마리당 17 mg/kg의 용량으로 등 피하에 투여하고, 항체 투여군에서의 항체 투여와 동일 용량에 상당하는 10 mg/kg의 PBS를 마우스 1 마리당 투여하였다. 또한, 첫회 투여 후 2, 4, 6 일째에 동일한 투여를 행하였다. 첫회 투여로부터 1 일 후 및 7 일 후에 에테르 마취하에서 꼬리부 말단을 절개하여 부분 채혈을 행하였다. 혈중 인산, 1,25D 농도 및 혈중 총 알칼리성 포스파타제 활성의 측정에는, 각각 인 테스트 와꼬(등록 상표, 일본, 와꼬 쥰야꾸), 칼슘 테스트 와꼬(등록 상표, 일본, 와꼬 쥰야꾸), 1,25(OH)2D RIA 키트 TFB(미국, 티에프비사), 및 알칼리성 포스파 B 테스트 와꼬(등록 상표, 일본, 와꼬 쥰야꾸)를 사용하였다.

결과를 도 25A에 나타내었다. 야생형 마우스 항체 투여군에서는 투여 후 1 일째 내지 7 일째에 걸쳐 현저한 혈중 인산 농도의 상승을 확인하였다. Hyp 마우스에의 항체 투여에 있어서도, 투여 후 1 일째에 매체 투여군에 비하여 유의적인 혈중 인산 농도의 상승을 확인하였다. 이 상승은 투여 후 7 일째에서 보다 현저해지고, 야생형 마우스 항체 투여군과 동일한 정도의 값을 나타내었다. 또한, 중화 항체 투여에 의해 야생형 마우스 및 Hyp 마우스 모두에 있어서 투여 후 1 일째에서 현저한 혈중 1,25D 농도의 상승을 확인하였다. 한편, Hyp 마우스 또는 XLH 등의 저인혈증성 구루병에서 혈중 총 알칼리포스파타제 활성의 이상적인 상승이 보고되었다. Hyp 마우스로의 중화 항체 투여는, 상기 정상 마우스와 비교하여 이상 고수치를 나타내는 혈중 총 알칼리포스파타제 활성을 투여 24 시간 후부터 쇠약화시키고, 첫회 투여 후 7 일째에 야생형 마우스와 동일한 정도의 활성으로까지 유의적으로 저하시킨다는 것이 밝혀졌다.

4 내지 7 주령의 수컷 C57BL/6J-Hyp 마우스(Hyp 마우스) 및 정상 대조군인 4 내지 7 주령의 수컷 C57BL/6J 야생형 마우스(야생형 마우스)를 사용하여 항FGF-23 중화 항체의 반복 투여에 의한, Hyp 마우스의 골조직에 대한 효과를 검토하였다. 이 시험에서의 군 구성은 야생형 마우스 매체 투여군, 야생형 마우스 항체 투여군, Hyp 마우스 매체 투여군, Hyp 마우스 항체 투여군의 4 군으로서, 1 군당 4 마리로 하였다. 항체 투여군에는 3C1E 항체 및 2C3B 항체를 각각 최종 농도가 1.7 mg/㎖가 되도록 혼화한 용액을 제조하고, 마우스 1 마리당 17 mg/kg의 용량으로 배 피하에 투여하였다. 매체 투여군에는 마우스 1 마리당 10 ㎖/kg의 PBS를 배 피하에 투여하였다. 첫회 투여일을 0 일째로 하여 2, 4, 6, 8, 21, 40 일째에서 동일한 투여를 행하였다. 첫회 투여 후 49 일째에 에테르 마취하에서 심장 채혈을 행한 후, 우측 대퇴골, 우측 경골 및 늑골을 채취하였다. 적출 대퇴골, 경골 및 늑골의 X선 확대 화상은 마이크로 포커스 X선 확대 촬상 시스템 μFX-1000(일본, 후지 필름)을 사용하여 100 μA, 25 kV의 사출 조건으로 5 초간 X선 조사에 의해 촬영하고, BAS 이미지 분석기(일본, 후지 필름)를 이용하여 디지탈 영상화함으로써 얻었다.

얻어진 적출 대퇴골, 경골 및 늑골의 X선 확대 화상을 도 27에 나타내었다. Hyp 마우스 또는 XLH 등의 저인혈증성 구루병에 있어서, 석회화 장해에 따라 확인되는 연골 세포 증가와 장관골 골간 단부, 및 늑골에서의 골연골 이행부의 비대화가 보고되어 있다. X선 화상 해석 결과, Hyp 마우스 매체 투여군에서 확인되는 대퇴골 및 경골의 골격 단부의 비대화, 골밀도의 저하, 및 피질골의 비박화(菲薄化)에 대하여, Hyp 마우스 항체 투여군에서 개선 경향이 확인되었다. 또한, Hyp 마우스 매체 투여군에서 확인되는 대퇴골 및 경골의 장축 방향으로의 신장 부전도 Hyp 마우스 항체 투여군에서의 개선 경향이 확인되었다. 또한, Hyp 마우스 매체 투여군의 늑골ㆍ늑연골 접합부의 비대화도 Hyp 마우스 항체 투여군에서는 소실되었다. Hyp 마우스로의 항FGF-23 중화 항체의 반복 투여는 골의 신장 장해와 석회화 장해를 개선시키는 것으로 밝혀졌다.

또한, 항FGF-23 항체의 골조직에 대한 작용을 상세하게 검토할 목적으로, 이 시험에 사용한 동물의 골조직 표본을 제조하였다. 도살 후, 좌측 경골 및 좌측 대퇴골을 적출하고, 70％ 에탄올로 고정한 후에 빌라누에바 본 염색(빌라누에바 본 염색 분말(Villanueva Bone Stain Powder), 일본, 마루토)을 행하여 순차적으로 농도를 상승시킨 에탄올 용액으로 탈수한 후, 테크노빗(Technovit) 7100(독일, 쿠르츠)에 포리하였다. 약 5 ㎛ 두께로 얇게 절단하고, 경골 근위부 및 대퇴골 원위부를 현미경하에서 관찰하였다. 그 골조직 표본상을 도 28에 나타내었다. 야생형 마우스에서는 연골 세포가 정연하게 배열된 성장판이 확인된 데 비하여(도 28A, D), Hyp 마우스의 골조직에서는 성장판 영역의 확대와 연골 세포의 불규칙한 배열을 특징으로 하는 기둥상 구조가 흐트러진 영역이 관찰되었다(도 28B, E). 이에 대하여, FGF-23에 대한 중화 항체를 반복 투여한 Hyp 마우스에서는 성장판 폭의 확대가 억제되고, 연골 세포의 불규칙한 배열도 소실되어 있는 것이 관찰되었다(도 28C, F).

(2) 항FGF-23 중화 항체의 1회 투여 시험

12 내지 20 주령의 수컷 C57BL/6-Hyp 마우스 및 12 내지 20 주령의 야생형수컷 C57BL/6 마우스를 사용하여 중화 항체의 1회 투여에 의한, Hyp 마우스의 혈중 인산 농도 및 혈중 1,25D 농도에 대한 효과를 검토하였다. 본 시험에서의 군 구성은 야생형 마우스 매체 투여군(n=4), 야생형 마우스 항체 투여군(n=5), Hyp 마우스 매체 투여군(n=3), Hyp 마우스 항체 투여군(n=3)의 4 군으로 하였다. 항체 투여군에는 3C1E 항체 및 2C3B 항체를 각각 최종 농도가 1.7 mg/㎖가 되도록 혼화한 것을 마우스 1 마리당 17 mg/kg의 용량으로 배 피하에 1회 투여하고, 매체 투여군에는 PBS를 마우스 1 마리당 10 ㎖/kg의 용량으로 투여하였다. 투여로부터 4 일 후에 에테르 마취하에서 심장 채혈 및 신장 적출을 행하였다.

얻어진 혈청 중의 인산 및 1,25D 농도의 측정 결과를 도 25B에 나타내었다. 야생형 마우스로의 항체 1회 투여에 의해 4 일째의 혈청 인산, 1,25D는 모두 유의적인 상승을 보였다. 이 상승 작용은 Hyp 마우스에서도 확인되었고, 항체 투여에 의해 저하되었던 혈청 인산 농도는 정상 수준까지 시정되고, 1,25D 농도는 유의적인 상승을 나타내었다.

(3) 항FGF-23 중화 항체에 의한 NaPi2a 및 1αOHase의 발현 제어 작용

혈청 인산 농도는 주로 신장 근위 세뇨관에 존재하는 나트륨 의존성 인산 공액 수송 단체(NaPi2a)에 의한 재흡수율에 의해 결정된다. 또한, 그 재흡수율은 NaPi2a 자체의 발현량 또는 NaPi2a 단백질의 국재 비율에 의해 제어되는 것이 이미 보고되어 있다. 따라서, 항FGF-23 중화 항체에 의한 혈청 인산 상승 작용이 NaPi2a를 통하는지의 여부를 검토하였다.

동결 융해한 신장으로부터 NaPi2a가 국재하는 신장 근위 세뇨관 쇄자연막 소포(BBMV; Brush Border Membrane Vesicle)를 카타이 등이 문헌[J. Biol. Chem. 274, pp.28845-28848, 1999]에서 이미 보고한 칼슘 침전법에 준하여 제조하였다. 얻어진 BBMV를 20 ㎍씩 실시예 16에 기재한 방법에 준하여 웨스턴 블롯팅에 사용하였다. NaPi2a 단백질의 검출에는 마우스 NaPi2a 단백질의 C 말단 부분 펩티드(서열 32)를 실시예 5와 동일하게 토끼에게 면역화시켜 얻어진 항혈청으로부터 정제한 항마우스 NaPi2a 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 행하였다. 그 결과를 도 25C에 나타내었다. Hyp 마우스 BBMV 상의 NaPi2a 단백질 수준은 현저하게 저하되어 있다는 것이 이미 보고되어 있다. 그러나, 항FGF-23 중화 항체의 투여에 의해 상기 NaPi2a의 발현은 현저히 증가되었다. 또한, 야생형 마우스에 대해서도 지속적인 NaPi2a 단백질의 상향 수정이 확인되었다. 또한, 상술한 BBMV를 이용하여 NaPi2a 단백질에 의한 인산 수송 활성을 측정하였다. 각 개체로부터 제조한 BBMV를 각각 0.1 mg씩 사용하고, 신속 여과법에 의해 60 초간 나트륨 의존성의 인산 취득 활성을 측정하였다. 시약, 반응 조건은 카타이 등이 문헌[J. Biol. Chem. 274, pp.28845-28848, 1999]에서 보고한 방법에 준하였다. 그 결과, 도 25C에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스, Hyp 마우스 모두에 있어서 항체 투여에 의해 인산 수송 활성의 상승을 확인하였다. 이들 결과로부터, 항FGF-23 중화 항체에 의한 야생형 마우스, 또는 Hyp 마우스에서의 혈청 인산 농도 상승 작용은 신장 근위 세뇨관에 존재하는 NaPi2a 단백질 수준의 상향 수정에서 기인함이 시사되었다.

mNpt2C: LALPAHHNATRLC(서열: 32)

이어서, 혈청 1,25D 농도 상승의 작용 기작을 해명하기 위해 신장 25 히드록시 비타민 D-1α 수산화 효소(1αOHase)의 발현 양식을 해석하였다. 동결한 신장으로부터 전체 RNA를 이소겐(ISOGEN) 시약(일본, 닛본 진)을 이용하여 추출하였다. 얻어진 RNA를 20 ㎍씩 정법에 따라 노던 블롯팅에 사용하였다. 혼성화는 PerfectHyb 시약(일본, 도요보)을 사용하고, 블롯 반응 및 세정은 첨부된 문서에 따랐다. 프로브에는 마우스 신장으로부터 제조한 cDNA 라이브러리를 주형으로, 서열 33, 34에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR법에 의해 증폭한 마우스 1αOHase 부분 cDNA, 또는 내부 표준으로서 서열 35, 36에 나타낸 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR법에 의해 증폭한 글리세르알데히드-3-인산 데히드로게나제(GAPDH) 부분 cDNA를 메가프라임(Megaprime) DNA 표지 시스템(미국, 아마샴 바이오사이언스)를 이용하여³²P 표지한 것을 사용하였다. 시그널 검출은 BAS 이미지 분석기(일본, 후지 필름)를 사용하여 행하였다. 그 결과를 도 25D에 나타내었다. 중화 항체 투여에 의해 야생형 마우스 및 Hyp 마우스에서 현저한 1αOHase의 발현 항진이 확인되었다. 이 결과로부터, 항FGF-23 중화 항체에 의한 야생형 마우스, 또는 Hyp 마우스에서의 혈청 1,25D 농도 상승 작용은 신장에 존재하는 1αOHase의 유전자 발현 수준의 항진에서 기인함이 시사되었다.

m1alphaFW: cagacagagacatccgtgtag(서열: 33)

m1alphaRV: ccacatggtccaggttcagtc(서열: 34)

gapdhFW: accacagtccatgccatcac(서열: 35)

gapdhRV: tccaccaccctgttgctgta(서열: 36)

이상의 결과로부터, Hyp 마우스, 즉 인간 XLH에서의 혈중 인산 농도 저하,혈중 1,25D 저하에는 FGF-23이 밀접하게 관여하고 있으며, 항FGF-23 항체 투여에 의한 FGF-23 작용 억제에 의해 이들 병태가 개선될 수 있는 가능성이 시사되었다. 또한, Hyp 마우스에서의 혈중 총 알칼리포스파타제 활성의 이상 고수치, 및 골의 신장 장해, 골석회화 장해가 항FGF-23 항체 투여에 의해 정상화되었기 때문에, 골 대사 회전의 정상화를 수반한 골연화증의 해결도 기대된다.

<실시예 33> 항FGF-23 항체(3C1E)의 골 대사에 대한 작용

실시예 32(1)에 기재한 바와 같이 항FGF-23 항체의 골 대사 회전에 대한 작용이 시사되었다. 이것을 상세하게 검토하기 위해 항FGF-23 항체 투여 후의 혈청 중 오스테오칼신 농도 변화를 경시적으로 해석하였다. 실험은 이하와 같이 하여 행하였다. 7 주령의 수컷 S.D.래트에 3C1E 항체를 3 mg/kg, 또는 매체(PBS)를 1.1 ㎖/kg, 꼬리정맥 내에 1회 투여하였다. 투여 후 4, 12, 24, 48, 72 시간째에 꼬리동맥으로부터 부분 채혈하여 혈청을 제조하였다. 혈청 오스테오칼신 농도는 오스테오칼신 ELISA 키트(일본, 아마샴 바이오사이언스 가부시끼 가이샤)를 사용하여 측정하였다. 결과를 도 26에 나타내었다. 항체 투여 후 12, 24, 48 시간째에 혈청 오스테오칼신 농도의 유의적인 상승이 확인되었다. 이 결과는 항FGF-23 항체 투여가 직접적 또는 간접적으로 골 대사 회전에 영향을 미칠 수 있다는 가능성을 시사하는 것이다.

<실시예 34> 항FGF-23 중화 항체(2C3B 항체, 3C1E 항체 혼합)의 골다공증 모델 마우스에 대한 작용

실시예 33에 기재한 항FGF-23 중화 항체의 골 대사에 대한 작용을 상세하게검토할 목적으로, 폐경 후 골다공증에서 확인되는 골감소를 반영한다고 여겨지는 난소 적출 골감소 모델 마우스에 대한 항FGF-23 항체의 작용을 검토하였다. 8 주령의 암컷 ddy 마우스의 난소를 적출하고, 매체 투여군과 항FGF-23 항체 투여군의 2 군으로 나누었다. 또한, 수술 대조군으로서 가수술을 실시한 가수술군을 설정하였다. 수술 3 일 후부터 주 3회 4 주에 걸쳐 항체 투여군(n=10)에는 2C3B 항체와 3C1E 항체를 동량 혼합한 항FGF-23 항체(3 mg/kg; 2C3B 항체, 3C1E 항체 각각이 1.5 mg/kg)를 배 피하에 투여하였다. 또한, 매체 투여군(n=9) 및 가수술군(n=10)에는 매체로서 PBS를 항체 용액과 동일 용량(10 ㎖/kg) 투여하였다. 난소 적출로부터 2 주째에 에테르 마취하에서 안와 채혈을 실시하였다. 또한, 난소 적출로부터 4 주째에 에테르 마취하에서 심장 채혈을 행하였다. 채취한 혈액으로부터 8000 rpm×10 분 원심분리에 의해 혈청을 제조하고, 혈청 오스테오칼신(IRMA 키트, Immutopics, Inc.)의 측정에 사용하였다. 또한, 난소 적출로부터 4 주째의 심장 채혈에 의한 도살 후, 대퇴골을 적출하고 골염량 및 골밀도(골염량 측정 장치 DCS-600형, 아로카 가부시끼 가이샤)를 측정하였다.

도 29A, B에 나타낸 바와 같이, 난소 적출로부터 2 주째, 4 주째 모두에서 항FGF-23 항체(2C3B, 3C1E 혼합)를 반복 투여한 군에서 매체 투여군과 비교하여 유의적인 혈청 오스테오칼신의 상승을 확인하였다. 오스테오칼신은 골아세포가 특이적으로 생산하는 단백질이며, 생체에서 혈청 오스테오칼신치의 상승이 골형성의 지표라고 여겨지고 있는 점으로부터, 항FGF-23 항체 투여가 골형성을 촉진시키고 있을 가능성이 시사되었다.

또한, 도 30A, B에 나타낸 바와 같이, 난소 적출 매체 투여군은 가수술 매체 투여군과 비교하여 유의적인 골감소를 나타냈지만, 이 난소 적출에 의한 유의적인 골염량, 골밀도의 저하에 대하여 항FGF-23 항체를 투여한 난소 적출군의 골염량, 골밀도는 유의적인 고수치를 나타내었다. 이러한 점에서 항FGF-23 항체 투여는 난소 적출에 의해 생기는 골감소를 억제한다고 여겨졌다.

<실시예 35> 유전성 저인혈증성 구루병 모델 마우스에서의 항FGF-23 중화 항체 (2C3B 항체, 3C1E 항체 혼합) 투여 시험

실시예 32에 기재한 바와 같이, 항FGF-23 중화 항체는 Hyp 마우스에서의 골의 신장 장해 및 석회화 장해를 해결함이 시사되었다. 따라서, 실시예 32에서 사용한 마우스보다 훨씬 주수가 낮은 성장이 현저한 4 주령의 수컷 C57BL/6-Hyp 마우스 및 4 주령의 야생형 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하여 Hyp 마우스에서의 골신장 장해 및 골석회화 장해에 대한 상기 항FGF-23 중화 항체의 작용을 더욱 상세하게 검토하였다. 이 시험에서의 군 구성은 야생형 마우스 매체(PBS) 투여군, Hyp 마우스 매체(PBS) 투여군, Hyp 마우스 저용량 항체 투여군, Hyp 마우스 고용량 항체 투여군의 4 군으로 1 군당 6 내지 7 마리로 하였다. 사용한 중화 항체는 2C3B 항체와 3C1E 항체를 동일 농도로 포함하는 혼합액을 사용하고, 2종 항체의 총량이 저용량군, 고용량군에서 각각 4 mg/kg, 16 mg/kg의 용량이 되도록 제조하였다. 중화 항체 또는 매체는 첫회 투여일을 0 일째로서 7, 14, 21, 28 일째에 마우스 배 피하에 10 ㎖/kg의 용량으로 반복 투여하였다. 체중, 꼬리부 전장 및 경골 전장은 항체 투여일과 같은 날에 측정하였다. 또한, 첫회 투여일로부터 31 일째에 에테르마취하에서 심장 채혈에 의해 도살하고, 좌우 대퇴골 및 경골을 적출하였다.

(1) 항FGF-23 중화 항체에 의한 꼬리부 전장ㆍ경골 전장의 신장 작용 및 체중 증가 작용

Hyp 마우스의 뼈는 장관골의 장축 방향으로의 신장 장해 등의 특징적인 골 발육 부전을 수반하는 구루병적 소견을 보이며, 개체에서도 야생형 마우스와 비교하여 명확하게 체장이 짧고 체중도 적다. 이러한 Hyp 마우스의 발육 부전에 대한 항FGF-23 중화 항체 투여의 효과를 검토하기 위해, 시험에 사용한 Hyp 마우스의 꼬리부 전장ㆍ경골 전장의 계측, 및 체중 변화에 대하여 검토하였다. 이 결과를 도 31A, B, C에 나타내었다. 이 시험에서도 정상 마우스와 비교하여 Hyp 마우스는 현저한 꼬리부 및 경골의 저신장도 및 저체중을 나타내었다. 또한, Hyp 마우스 매체 투여와 비교하여, Hyp 마우스로의 중화 항체 투여는 용량 의존적으로 꼬리부 전장ㆍ경골 전장의 신장 작용 및 체중 증가 작용을 나타내었다.

(2) 항FGF-23 중화 항체에 의한 골석회화 작용

Hyp 마우스의 골조직은 정상 마우스와 비교하여 비석회화 및 저석회화 뼈의 비율이 많으며, 미네랄 함유량이 낮은 것으로 알려져 있다. 따라서, 항FGF-23 중화 항체에 의해 Hyp 마우스 대퇴골의 골 미네랄 함유량 증가 작용을 얻을 수 있는지의 여부를 검토하였다. 이 시험에서 적출 좌측 대퇴골을 건조기로 100 ℃에서 12 시간 건조시킨 후, 그 중량을 측정하여 건조 중량으로 하였다. 이어서, 이 건조골을 머플로(muffle furnace)에서 600 ℃로 12 시간의 가열에 의해 회화하고, 그 중량을 측정하여 골회분 중량으로 하였다. 그 결과를 도 32에 나타내었다. Hyp마우스의 건조골 중량에 대한 골회 중량은 야생형 마우스에 대하여 매우 저수치였다. Hyp 마우스 항체 투여군의 건조골 중량에 대한 골회분 중량은, 반복 투여한 중화 항체의 용량에 의존하여 유의적으로 증가하였다. 특히, 고용량 항체 투여군에서는 야생형 마우스군과 거의 동일한 정도의 값을 나타낼 때까지의 개선이 확인되었다.

이들 결과로부터, 항FGF-23 중화 항체의 투여에 의해 FGF-23 작용이 억제됨으로써 Hyp 마우스가 나타내는 골신장 장해, 골석회화 장해를 개선할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

<실시예 36> 2C5L 항체를 이용한 샌드위치 ELISA법에 의한 인간 FGF-23 단백질의 정량적 측정

실시예 3에서 취득한 클론화 하이브리도마 2C5L이 생산하는 2C5L 항체를 실시예 4에 따라 정제하였다. 실시예 10에 기재한 방법으로 그 인식 부위를 해석했더니, 2C5L 항체는 2C3B 항체와 마찬가지로 서열 1의 아미노산 잔기 25 내지 179번째에 상당하는 N 말단측 단편 폴리펩티드 내에 인식 부위를 갖고, N 말단측 단편 폴리펩티드 및 FGF-23 전장 단백질과 면역 복합체를 형성하는 것으로 판명되었다. 또한, 실시예 12에 기재한 요령으로 2C5L 항체와 2C3B 항체의 조합에 의한 샌드위치 ELISA법의 확립을 시도하였다. 각각의 항체와 FGF-23 단백질과의 결합에 있어서, 두가지는 서로 경합 억제를 하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이 결과로부터, 2C5L 항체는 아미노산 잔기 25 내지 179번째에 상당하는 N 말단측 단편 폴리펩티드 내에 인식 부위를 갖고 있지만, 마찬가지로 N 말단측 단편 폴리펩티드 내에 인식 부위를갖고 있는 2C3B 항체와는 인식 부위가 다른 항체이기 때문에, 두가지를 조합시킨 ELISA법이 가능하다는 것이 판명되었다. 이어서, 실시예 13에 기재한 방법으로 비오틴 표지의 3C1E 항체를 검출 항체로 하고, 2C3B 항체 또는 2C5L 항체를 고상화 항체로서 각각 사용했을 때의 FGF-23 단백질의 검출능을 검토하였다. 그 결과를 도 33에 나타내었다. 2C5L 항체는 10 pg/㎖ 내지 10 ng/㎖의 범위에서 재조합 인간 FGF-23 정제물을 농도 의존적으로 인식한다는 것이 확인되었다.

<실시예 37> 2C5L 항체와 마우스 FGF-23의 반응 교차성

2C3B 항체와 3C1E 항체 조합의 샌드위치 ELISA계에 있어서, 실시예 22, 23에나타낸 바와 같이 마우스 FGF-23도 인간 FGF-23과 동일하게 인식할 수 있었다. 따라서, 2C5L 항체가 마우스 FGF-23을 인식할 수 있는지의 여부를 검토하였다. 실시예 24와 동일하게 혈중 FGF-23 고수치의 마우스 혈청을 취득하고, 2C3B 항체, 비오틴화 표지의 3C1E 항체의 조합으로 측정한 결과, 약 600 pg/㎖를 나타낸 샘플을 얻었다. 이 샘플에 대하여 2C5L 항체, 비오틴화 표지 3C1E 항체의 조합에서는 실시예 36과 동일한 샌드위치 ELISA계를 검토했더니 전혀 반응성이 관찰되지 않았다. 이 결과로부터, 2C5L 항체는 인간 FGF-23에는 강한 결합능을 갖지만, 마우스 FGF-23에는 매우 약한 결합능밖에 갖지 못하거나, 또는 결합능을 갖지 않는 것으로 나타났다.

<실시예 38> 2C5L 항체의 인간 FGF-23에 대한 중화 활성능의 측정

실시예 37의 결과로부터, 2C5L 항체는 2C3B 항체 또는 3C1E 항체와 비교하여 마우스 FGF-23에 대한 결합능이 매우 낮기 때문에 마우스 내재성 FGF-23에의 중화활성능도 현저하지 않음이 시사되었다. 그러나, 실시예 36의 결과로부터 2C5L 항체는 인간 FGF-23에는 강한 결합능을 갖기 때문에, 인간 내재성 FGF-23에의 중화 활성능을 가질 가능성이 있다. 이 가능성을 검증하기 위해 동물을 이용한 인간 FGF-23 중화 활성의 측정계를 이하의 요령으로 구축하고, 이것을 이용하여 2C5L 항체의 인간 내재성 FGF-23에 대한 중화 활성을 검토하였다.

7 주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 배 피하에 인간 FGF-23 재조합체를 1.2 ㎍/일의 용량으로 서방성으로 조정된 침투압 미니 펌프(alzet micro-osmotic pump model 1007D, 캐나다, 듀렉트(DURECT)사)를 이식하고, 인간 FGF-23 재조합체 지속 투여 모델을 구축하였다. 이 모델에 2C5L을 포함하는 항FGF-23 중화 항체 또는 매체를 펌프 이식 후 3 일째 복강 내 투여함으로써, 지속적으로 존재하는 인간 재조합체 FGF-23에 의한 혈청 인산 농도 저하 작용을 억제시킬 수 있는지의 여부를 검토하였다. 이 시험에서의 군 구성은 비처리 마우스에 매체를 투여한 군(비처리/매체), 인간 FGF-23 재조합체 지속 투여 모델에 매체를 투여한 군(FGF-23/매체), 인간 FGF-23 재조합체 지속 투여 모델에 2C5L 항체를 투여한 군(FGF-23/2C5L), 및 인간 FGF-23 재조합체 지속 투여 모델에 2C3B 항체를 투여한 군(FGF-23/2C3B)의 4 군으로 하였다. 매체 및 항체의 희석에는 PBS를 사용하고, 항FGF-23 중화 항체는 20 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 매체 및 중화 항체는 체중 10 g 당 0.1 ㎖의 용량으로 투여하였다. 항체 투여 전 및 항체 투여 24 시간 후에 에테르 마취하에서 안와 채혈을 행하여 혈청을 얻었다. 혈청 중 인산 농도의 측정에는 인 테스트 와꼬(등록 상표, 일본, 와꼬 쥰야꾸)를 사용하였다.

결과를 이하에 나타내었다. 인간 FGF-23 재조합체를 침투압 미니 펌프를 이용하여 지속 투여함으로써, 펌프 이식 후 3 일째에는 비처리 마우스 매체 투여군과 비교하여 현저한 혈중 인 농도의 저하를 확인하였다(도 34 좌측). 이들 인간 FGF-23 재조합체 투여군에 2C5L 항체를 투여했더니(FGF-23/2C5L군), 24 시간 후의 혈청 인산 농도 저하 작용이 FGF-23/매체 투여군 또는 항체 투여 전에 비하여 유의적으로 억제되고, 비처리/매체 투여군의 혈청 인 농도와 동일한 정도까지 나타났다(도 34 우측). 이상의 결과 및 실시예 37의 결과로부터, 2C5L 항체는 지속 투여한 인간 FGF-23 재조합체 의존적인 혈중 인산 저하 작용에 대하여 중화 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 한편, 2C3B 항체 투여군에서 24 시간 후의 혈청 인 농도는 비처리/매체 투여군보다 현저하게 고수치를 나타내었다. 이 결과는 마우스 FGF-23과 강한 결합능을 갖는 2C3B 항체가 투여한 인간 FGF-23 재조합체 뿐만 아니라, 내재성 마우스 FGF-23에 대해서도 중화 활성을 나타냈기 때문이라고 여겨졌다.

본 발명에 의해 FGF-23에 대한 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는 생체 내의 FGF-23을 적절하게 검출, 측정함으로써 FGF-23 단백질의 축적 또는 감소를 수반하는 질환이나 병적 상태를 진단하는 데 있어 유용하다. 또한, 본 발명의 항체는 FGF-23의 작용을 중화하는 활성을 갖기 때문에, FGF-23이 과잉 작용함으로써 생기는 질환이나 병적 상태에 있어서 FGF-23의 작용을 억제함으로써, 상기 질환이나 병적 상태를 치료 또는 완화할 수 있다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 내용 전체가 본명세서에 삽입된 것으로 간주한다. 또한, 첨부한 청구 범위에 기재되는 기술 사상 및 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 여러가지 변형 및 변경이 가능하다는 것은 당업자에게 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 이러한 변형 및 변경도 포함하는 것을 의도한다.

SEQUENCE LISTING <110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> ANTI FGF-23 ANTIBODY <130> PH-1707-PCT <140> <141> <150>JP2001/401689 <151>2001-12-28 <150>JP2002/262020 <151>2002-09-06 <160> 36 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val 1 5 10 15 Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu 20 25 30 Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg 35 40 45 Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala 50 55 60 Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala 65 70 75 80 Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met 85 90 95 Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn 100 105 110 Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His 115 120 125 Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala 130 135 140 Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg 145 150 155 160 Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg 165 170 175 His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val 180 185 190 Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln 195 200 205 Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu 210 215 220 Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly 225 230 235 240 Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 245 250 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 2 ccggaattca gccactcaga gcagggcacg 30 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 3 ataagaatgc ggccgctcaa tggtgatggt gatgatggat gaacttggcg aa 52 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 4 ataagaatgc ggccgctcag atgaacttgg cgaa 34 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 5 ataccacggc agcacaccca gagcgccgag 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 6 ctcggcgctc tgggtgtgct gccgtggtat 30 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 7 atgaattcca ccatgttggg ggcccgcctc agg 33 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 8 atgcggccgc ctaatgatga tgatgatgat ggatgaactt ggcgaaggg 49 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 9 Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Cys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 10 Arg Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys 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Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Cys 1 5 10 15 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 16 Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Cys 1 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 17 Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile 1 5 10 15 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 18 Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg Asn Ser Cys 1 5 10 <210> 19 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 19 Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala Gly Phe Val 1 5 10 15 Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys 20 25 <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 20 Met Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu 1 5 10 15 Asn Cys <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 21 Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala 1 5 10 15 Phe Leu Pro Gly Met Asn Cys 20 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 22 Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Cys 1 5 10 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 23 Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro Ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 24 Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala 1 5 10 15 Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly Cys 20 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Claims

서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열에서 1개 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 섬유아세포 증식 인자-23 활성을 갖는 폴리펩티드를 동물에게 면역화시킴으로써 얻어지고, 인산 대사 또는 비타민 D 대사 조절 활성을 가지며,

(a) 서열 1에 나타낸 180번째 내지 194번째 또는 237번째 내지 251번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체

(b) 수탁 번호가 FERM BP-7838, FERM BP-7839, FERM BP-7840 또는 FERM BP-8268인 하이브리도마가 생산하는 항체

(c) 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와의 결합에서, 수탁 번호가 FERM BP-7838, FERM BP-7839, FERM BP-7840 또는 FERM BP-8268인 하이브리도마가 생산하는 항체와 경합하는 항체

중 어느 하나로 표시되는 항체.
제1항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 수탁 번호가 FERM BP-7838, FERM BP-7839, FERM BP-7840 또는 FERM BP-8268인 하이브리도마가 생산하는 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
제4항에 있어서, 종양성 골연화증, ADHR, XLH, 신장성 골이영양증, 투석골증, 골다공증, 저인혈증, 구루병, 골연화증, 세뇨관 기능 장해, 골감소증, 저칼슘혈증, 골신장 장해, 골석회화 장해, 부갑상선 기능 항진증, 이소성 석회화, 가려움증, 골경화증, 파젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증, 부갑상선 기능 저하증, 골통, 근력 저하, 골격 변형, 성장 장해 및 저1,25D 혈증에서 선택되는 하나 이상의 질환에 유효한 의약 조성물.
제5항에 있어서, 종양성 골연화증, XLH, 저인혈증, 골다공증, 골신장 장해, 골석회화 장해 및 골연화증에서 선택되는 하나 이상의 질환에 유효한 의약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효 성분으로서 포함하는 골형성 촉진제.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항에 기재된 항체 중 다른 부위를 인식하는 2종 이상의 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
제4항에 있어서, 항체가 서열 1에 나타낸 180번째 내지 194번째의 아미노산서열을 인식하는 항체인 의약 조성물.
서열 1에 나타낸 25번째 내지 179번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체, 및 서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체를 사용하여 피검 시료와 반응시키는 것을 특징으로 하는 섬유아세포 증식 인자-23의 검출 방법.
제10항에 있어서, 서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체가, 서열 1에 나타낸 180번째 내지 196번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체인 검출 방법.
제10항에 있어서, 트롬빈 억제제를 더 사용하는 검출 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 항체가 수탁 번호 FERM BP-7838, FERM BP-7839, FERM BP-7840 또는 FERM BP-8268의 하이브리도마가 생산하는 항체인 검출 방법.
서열 1에 나타낸 25번째 내지 179번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체, 및 서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체를 포함하는 섬유아세포 증식 인자-23의 검출 키트.
제14항에 있어서, 서열 1에 나타낸 180번째 내지 251번째 아미노산 서열의 일부를 인식하는 항체가, 서열 1에 나타낸 180번째 내지 196번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체인 키트.
제14항 또는 제15항에 있어서, 항체가 수탁 번호 FERM BP-7838, FERM BP-7839, FERM BP-7840 또는 FERM BP-8268의 하이브리도마가 생산하는 항체인 키트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 항체에서 선택되는 하나 이상의 항체를 결합시킨 항섬유아세포 증식 인자-23 항체 결합재.
제17항에 기재된 결합재를 구비한 의료 기구.
제18항에 있어서, 혈액 중의 섬유아세포 증식 인자-23을 제거하기 위한 의료 기구.