KR20040057021A - 우뭇가사리로부터 얻은 지방세포 (NIH3T3-L1 cell) 분화저해용 활성분획 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우뭇가사리 (Gelidium amansii, Makusa)로부터 얻은 지방세포 (NIH3T3-L1 cell) 분화 저해용 활성 분획 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍조식물 우뭇가사리과의 바닷말이며 한천의 원료로서 사용하여온 우뭇가사리로부터 지방세포 (NIH3T3-L1 cell) 분화를 저해하는 기능을 지니는 해조류 추출물을 유효성분으로 하는 지방세포 분화 저해제, 특이 건강식품 및 사료를 제공한다. 본 발명을 이용하면 당뇨병의 주 증상인 혈당상승에 대한 혈당강하 효과를 갖으므로 당뇨병 예방과 치료에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 지방세포의 분화를 특이하게 저해하므로 가축 및 양식어류의 육질을 개선시킬 수 있다.

Description

우뭇가사리로부터 얻은 지방세포 (NIH3T3-L1 cell) 분화 저해용 활성분획 조성물 {Active fraction,isolated from Gelidium amansii,having inhibitory effects on adipocyte differentiation (NIH3T3-L1 cell) }

본 발명은 우뭇가사리로부터 얻은 지방세포 (NIH3T3-L1 cell) 분화 저해용 활성분획 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍조식물 우뭇가사리과의 바닷말이며 한천의 원료로서 사용하여온 우뭇가사리로부터 지방세포 (NIH3T3-L1 Cell) 분화를 저해할 수 있는 활성분획 조성물과 이를 효율적으로 추출, 정제하는 방법 그리고 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방세포의 분화를 억제하는 기능을 지닌 특이건강식품 및 동물용 사료에 관한 것이다. 본 발명을 이용하면 혈당강하 효과가있으므로 당뇨병의 예방과 치료에 사용할 수 있다. 또한 본 발명은 가축 및 양식어류의 육질을 향상시킬 수 있다.

최근, 생활 수준의 향상으로 인하여 생활 여건이 향상되면서 전반적인 식생활의 향상으로 섭취 열량이 크게 증가하고 운동부족 현상을 초래하며 과도한 스트레스에 노출되는 생활이 지속되면서 인슐린의 활성이 떨어져서 야기되는 제2형의 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병)이 증가하고 있다. 또한, 이러한 생활방식에 의한 심각한 비만이 발생하며 이에 따라 야기되는 제2형 당뇨병이 증가하고 있다. 따라서, 우리 나라 당뇨병 환자의 대부분은 이러한 제2형 당뇨병 환자로 당뇨병이 오래 지속되면 혈당의 증가 이외에도 혈중 지질 농도가 증가하여 지방간, 동맥경화, 관상 심장질환 등의 심혈관 질환, 당뇨병성 신장 및 망막질환 등의 합병증을 유발하므로 이의 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

현재, 제2형 당뇨병 치료제로 많이 사용하는 약물로는 인슐린 생성이 부족하거나 혈중인슐린이 충분하다해도 활성이 낮아 체내에서 당을 제대로 활용하지 못하는 인슐린 내성(insulin resistance)을 치료하기 위하여 혈당강하제를 사용한다. 혈당강하제는 치료기전 및 작용 약물의 작용점에 따라 나눌 수 있는데, 설포닐우레아 계통은 주로 췌장의 베타 세포 안에 있는 인슐린을 함유한 과립포의 이동을 촉진하여 간접적으로 인슐린 분비를 촉진시키는 약물로 저혈당 유발 등의 심각한 부작용이 보고되고 있으나, 최근에는 부작용을 최소화한 약물이 개발되어지고 있다. 비구아나이드 계통 약물은 근육세포로 당을 이동시키고 간에서 당이 만들어지지 못하게 하는 약물로 비만인 당뇨 환자에게 사용하며 저혈당을 일으키지 않는 장점을갖고 있으나, 고령자와 심혈관 질환 환자에게는 주의해야 한다. 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해제는 소장에서 포도당을 만드는 효소 활동을 억제시켜 식후에 일시적으로 혈당이 급상승하는 것을 막아주고, 부작용이 심하지 않은 편이어서 경증당뇨병 치료에 이용된다. 최근에는 핵수용체중의 하나로서 전사인자로 알려진 피피에알 감마(PPAR-r, Peroxisome proliferator activated receptor-gamma)를 활성화하는 피페리디온계 약물도 개발되고 있다. 그러나, 경구용 혈당강하제만으로는 혈당이 효과적으로 떨어지지 않고 이미 알려진 대부분의 약물에서 부작용이 나타나므로, 보다 안전한 당뇨병 치료제나 당뇨병 예방제의 개발이 시급한 실정이다. 지방세포 분화 저해제는 비만인에서 흔히 나타나는 인슐린 내성을 일으키는 과도한 지방조직의 축적을 감소시키기 때문에 근본적인 당뇨병 치료제로 개발될 가능성이 높다. 또한, 양식동물 및 어류에 있어서 과도한 지방의 축적을 제어할 수 있기 때문에 육질이 개선된 양식을 할 수 있는 가능성이 있다. 일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법론 중에서도, 기존약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통의학이나 식용으로 사용해 온 소재들로부터 새로운 활성 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 개발된 약물들에 의한 독성 염려가 적은 장점이 있다.

최근 국내에서 출원된 해조류 관련 특허내용은 해조류를 원료로 한 건강식품(엽상차, 분말차, 두부, 음료수 등)의 개발, 항산화, 항암, 항알레르기 효과 등을 갖는 해조류 유래 물질의 추출 및 이용, 비만억제 효과를 갖는 식이섬유로서의 해조류 의 가공 및 이용, 기능성 화장품의 원료로서의 해조류의 이용 등이 있다. 이러한 내용중 본 특허에서 언급한 우뭇가사리를 특허로 한 내용을 살펴보면 우뭇가사리를 이용한 두부의 제조방법 (한국특허출원 1020010002757), 다시마등의 해조류 추출물을 함유하는 샴푸대용 모발세정제 및 그의 제조방법 (한국특허출원 1020000063562), 허출원 1020010001021(암예방 식이 조성물)등이 보고되고 있다. 제주도 해안은 해조류의 양적 풍부성을 조사하였을 경우 단위면적당 생물량은 그 평균치에 있어 여름에 648.64 g-dry wt/㎡으로 가장 많았고, 가을에 238.37g-dry wt/㎡로 가장 적었는데, 이와 같은 결과는 국내 다른 해안에서 보고된 생물량 자료와 비교할 때 제주도산 해조자원의 상대적인 양적 풍부성 및 다양성을 나타내고 있다 (김영환, 1991. 제주도의 해양식물자원. 제주도연구, 8 : 136-156).

또한, 지방세포의 분화를 저해 하여 비만, 당뇨 및 어류 및 육류의 육질개선에 대한 연구가 일본 및 미국 등에서 행하여 지고 있다 (대한민국 특허; 등록번호 특0161747호, 일본특허; JP-A-02-154,693).

그러나, 이러한 지방세포 분화 저해제는 올리고 펩타이드 함유물질로 경구섭취시 문제가 발생할 수 있으나 본 특허에서 주장하는 우뭇가사리는 우리나라의 해안에서 풍부하게 산출되는 식용이 가능한 원료로 부작용이 없으며 어민의 소득증대에 기여할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 제주도의 해안지역에서 채취 가능한 해조류를 대상으로 지방세포 분화 저해작용을 탐색하고 저해작용을 나타내는 해조류를 대상으로 동물효과 (Wister종)를 관찰한 결과, 특이적인 저해활성을 보이는 활성분획 조성물을홍조식물 우뭇가사리과의 바닷말이며 한천의 원료로서 사용하여온 우뭇가사리로부터 획득함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 지방세포의 분화를 억제하는 기능을 보이며 당뇨병환자의 주요 증상인 고혈당에 대한 혈당강하 효과를 갖고 있기 때문에 당뇨병 예방과 치료에 사용할 수 있으며 지방세포의 분화를 특이하게 저해하므로 가축 및 양식어류의 육질을 개선시킬 수 있는 우뭇가사리 추출물을 활성이 가장 우수한 조성으로 추출하는 방법과 그 추출물을 유효성분으로 함유한 생약제를 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 제주도 해역에서 채취하여 동정한 우뭇가사리의 사진이다.

도 2는 우뭇가사리로부터 얻은 활성 분획물을 지방세포인 NIH3T3-L1 세포주에 처리하여 지방세포의 분화가 저해된 차이를 보여주는 사진이다.

도 3은 우뭇가사리로부터 나온 활성 분획을 10 ug/ml 농도로 지방전구세포인 3T3 F442A에 처리시 지방세포분화 저해를 보여주는 사진이다.

본 발명은 우뭇가사리로부터 얻은 지방세포 분화 저해용 활성분획 조성물을 그 특징으로 한다.

본 발명은 우뭇가사리로부터 알코올성 수용액으로 추출하여 생약제를 제조함에 있어서,

(1) 우뭇가사리 (Gelidium amansii, Makusa)에 알콜 수용액을 우뭇가사리 함량대비 3 ∼ 10배를 넣어 3회 용매 추출하는 단계;

(2) 상기 추출단계에서 얻어진 여액을 증발 농축한 후, 농축액을 50 ∼ 100배 부피의 증류수에 현탁하고 디아이온 (Diaion) HP-20 레진에 통과시켜 흡착시킨 다음 비활성 분획을 10% 에탄올을 사용하여 용출 제거하는 단계;

(3) 상기 흡착된 활성 분획을 10 ∼ 20 배량의 에탄올, 메탄올등의 유기용매를 사용하여 용출시킨 후, 농축하여 엑기스를 얻는 단계;

(4) 상기 엑기스를 엑기스 총량의 10 ∼ 100 배의 증류수로 현탁시킨 후 부탄올을 사용하여 추출하는 단계 및;

(5) 상기 부탄올 추출물을 동결건조하여 분리과정중에 들어간 유기용매를 제거하는 단계를 포함하는 우뭇가사리로부터 지방세포 분화 저해용 활성분획 조성물을 분리 정제하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 추출 정제방법에 따라 분리된 우뭇가사리 추출물을 유효성분으로 하는 지방세포의 분화를 억제하는 기능을 지니며 혈당강하 효과가 있으므로 당뇨병의 예방과 치료에 사용할 수 있다. 또한 본 발명은 가축 및 양식어류의 육질 개선제 등으로 사용하는 것을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 지방세포 분화 저해 및 당뇨병 효과의 측정방법으로서 근육 세포주인 C2C12 세포주에 처리하여 포도당의 흡수 (glucose uptake)가 개선된 효과를 보이는 당뇨병 예방과 치료효과를 보이는 우뭇가사리의 활성 분획 조성물에 관한 것이다. 또한, 양식어류 및 웅성 랫트 (Wister 종)에 우뭇가사리를 사료로 함유하여 섭취시킨 뒤뒤의 지방세포, 미성숙 지방세포, 섬유아세포 및 혈관세포등의 세포수를 조사하여 육질개선 효과를 보이는 활성 분획 조성물에 관한 것이다.

즉, 우뭇가사리 (Gelidium amansii, Makusa)로부터 분획하여 얻은 활성분획 조성물이 지방세포 분화를 저해하고, 근육 세포주인 C2C12 세포주에 처리하여 포도당의 흡수 (glucose uptake)가 개선된 효과를 갖고 있는 것을 처음으로 관찰하여, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방과 치료 및 어류 및 가축 및 양식어류의 육질을 개선하는 활성 조성물을 개발하였다.

본 발명에 따른 활성 조성물 이외에도 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 정제, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.

상기 활성 분획물로 표시되는 유효성분의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 1000 mg/kg(몸무게)/1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 우뭇가사리로부터 활성 분획물의 제조

1. 우뭇가사리 (Gelidium amansii, Makusa)로부터 활성 분획물을 제조하기 위한 추출용매의 선정

우뭇가사리로부터 지방세포 분화활성을 저해하는 분획물의 추출정도가 가장 좋은 용매를 결정하기 위하여 증류수, 에탄올, 수용성 에탄올 (30%, 70%, 100%), 메탄올, 수용성 메탄올 (30%, 70%, 100%)등의 용매를 사용하여 추출정도를 비교하였다. 제주도 근해에서 수집한 우뭇가사리를 건조한 뒤 건조한 해조류 50g을 분쇄한 후 추출 용매로 300 ml의 증류수, 에탄올, 수용성 에탄올, 메탄올, 수용성 메탄올 용액에 넣은뒤 각각 60℃ ∼ 100℃의 온도에서 3시간동안 환류추출 하였다. 이후, 추출 용액을 여과지를 사용하여 여과한 뒤 감압 농축하였다. 감압 농축액을 동량의 용매에 녹인뒤 일정량을 취하여 10 ug/ml의 농도로 하여 지방세포 분화저해활성을 검사하였다. 지방세포 분화 저해활성 결과 전체적으로 메탄올, 수용성 메탄올 추출물의 활성이 우수하였으나 의약용 및 식품으로 허가되는 70% 에탄올을 추출용매로 사용하였다. 그러나, 추출용매로서 70% 에탄올 용매를 선정한 것이 본 발명의 용매선정을 한정하는 것은 아니다. 보다 높은 추출효율 및 추출용매가 필요하다면 매탄올, 수용성 메탄올을 추출용매로 사용할 수 있다.

실시예 2. 디아이온 (Diaion) HP-20 레진에 흡착시켜 용출한 활성분획의 지방세포 저해 활성

상기 방법으로 제조된 70% 에탄올 추출액을 에탄올을 제거하기 위하여 감압농축기로 농축한후 동량의 증류수를 가하여 현탁하여 디아이온 (Diaion) HP-20 레진에 통과시켜 활성물질을 흡착시켰다. 이후, 증류수, 10% 에탄올, 50% 에탄올, 에탄올, 메탄올등의 용매를 사용하여 순차적으로 활성물질을 농축하였다. 각 분획을 동량으로 DMSO에 10 ug/ml으로 녹여 지방세포주인 NIH3T3-L1 세포주에서 지방세포 분화 저해활성을 측정하였다.

[표 1]

각 분획물의 지방세포인 NIH3T3-L1 저해효과 검색

실시예 3. 우뭇가사리의 부탄올 추출물의 지방세포 저해 활성

상기 방법으로 제조된 100% 에탄올 용출액을 감압농축기로 농축한후 동량의 증류수를 가하여 현탁하였다. 디아이온 (Diaion) HP-20 레진에 흡착하여 용출뒤 농축한 분획에 들어있는 비활성 물질을 제거하기 위하여 에틸아세테이트 동량을 사용하여 추출하였다. 이후 활성분획을 부탄올을 용매로 하여 추출 분획한 뒤 농축하였다. 각 분획을 동량으로 DMSO에 10 ug/kg으로 녹여 지방세포 저해 활성효과를 조사하였다.

[표 2]

분획물의 지방세포인 NIH3T3-L1 저해효과 검색

실시예 4 : 지방세포 분화 저해활성 측정

지방전구세포인 3T3-L1 또는 F442A 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포배양 한다. 지방전구세포가 배양시 세포밀도가 약 85 ∼ 90% 가량되면 3T3-L1의 경우 Dexamethasone, IBMX, 인슐린 등을 48 ∼ 55시간 정도 처리하여 지방세포분화를 유도하며, 이어 매 2일마다 세포 배양액을 fetal calf serum과 인슐린이 든 배양액으로 치환한다. F442A 세포의 경우 지방전구세포가 세포 배양시 약 90%정도의 밀도를 보일 때 10%의 fetal calf serum과 인슐린이 포함된 배양액으로 바꾸어 주고 매 2일마다 세포배양액을 갈아주고 지방세포의 분화을 유도한다. 지방세포분화 저해활성의 측정은 RP-18 칼람 크로마토그래피로 분획하여 나온 활성분획을 지방세포분화 유도의 초기단계부터 0.1 ∼ 10 ㎍/ml의 농도로 처리하여 대조군과 비교해 나간다. 90% 이상의 세포가 지방세포로 분화하기까지는 약 12 ∼ 15일 정도가 걸리며, 각각의 분획물의 활성은 대조군과 같은 시기까지 처리하여 그 효능을 관찰하고 현미경사진을 촬영하여 관찰하였다 (도 3).

도 3은 지방세포분화 유도시기에 따라 대조군 과 우뭇가사리로부터 나온 활성분획물의 지방세포분화 능력을 비교한 것이다. 대조군의 경우 80 ∼ 90%의 F442A세포가 지방세포로 분화하는데 까지 약 11일이 걸린 반면, 우뭇가사리로부터 나온 활성분획물의 경우는 분화초기 단계에서부터 10 ug/ml 농도로 처리로 처리하였을 경우 동시기에 각각 10% 이하의 세포만이 지방세포로 분화하였다. 얻어진 활성 분획물은 지방세포 분화를 50% 저해하는 농도 (IC50)를 측정한 결과 1∼3 ug/ml 로 나타났다.

실시예 5 : 포도당 흡수도 분석

근육세포인 C2C12 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포배양 한다. 세포밀도가 약 85 ∼ 90% 가량 되면 serum-free 배양액으로 치환하여 세포분화를 유도시킨다. 완전히 분화된 세포를 5mM 의 glucose 가 포함된 Krebs-Ringer Buffer (KRB) 로 2시간 더 배양한다. 인슐린 또는 여러가지 해조류 추출물을 일정 시간 처리한 후 0.2μCi 2-deoxyglucose 를 첨가하고 2분동안 방치한다. KRB buffer를 제거한 후 ice-cold PBS로 세번 세포를 세척한 후 0.5N NaOH를 사용하여 세포를 용해시키고 방사선 계측기를 이용하여 cpm 을 측정한다. 이 경우 non-specific glucose uptake는 10μM 의 cytochalsin B를 포함한 KRB buffer 로 측정하여 전체 값에서 제거한다.

실험결과로부터 C2C12 세포에 우뭇가사리 추출물을 50 ug/ml 의 농도로 처리하였을 경우 대조군에 비하여 근육세포주에서 포도당의 흡수가 150% 증가함을 관찰할 수 있었다.

실시예 6 : 정제의 제조

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법 (direct tabletingmethod)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 mg이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 mg이다.

실시예 7 : 분말제의 제조

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 9 번 경질 캡슐에 분말 100 mg을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 우뭇가사리로부터 얻은 활성분획 조성물은 지방세포 분화 저해, 당뇨병 예방과 치료 및 가축 및 양식어류의 육질개선 효과가 우수하므로 이를 유효성분으로 함유하는 생약제로 사용할 수 있다.

Claims (15)

1. 우뭇가사리 (Gelidium amansii, Makusa)로부터 얻은 활성 분획물을 주성분으로 하여 치료 또는 예방적 유효량으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 및 가축 및 어류의 육질 개선용 조성물
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 지방세포 분화 저해 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 및 가축 및 어류의 육질 개선용 조성물
3. 제 1항 내지 제 2항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물
4. 제 3항에 있어서, 활성 성분의 함량이 성인 체중 1kg 당 1 ∼ 1000 mg/일 범위로 투여됨을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 및 가축 및 어류의 육질 개선용 조성물
5. 제 1항의 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 및 가축 및 어류의 육질 개선제제
6. 제 5항에 있어서, 상기 제제는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것임을 특징으로 하는 제제
7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 제제가 정제, 산제, 경질 또는 연질 캅셀제, 현탁제, 주사용 제제, 유화액, 비경구 투여용의 단위 투여형 또는 수회투여형 제제인 것을 특징으로 하는 제제
8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 식용음료 또는 식품의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 및 가축 및 어류의 육질 개선 조성물
9. 우뭇가사리 (Gelidium amansii, Makusa)로부터 용매 추출하여 조 추출액을 얻는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 및 가축 및 어류의 육질개선 조성물 제조방법
10. 제 9항에 있어서, 상기 농축단계 후 농축된 조 추출물의 부가적인 추출단계를 더욱 포함하는 것임을 특징으로 하는 제조방법
11. 제 9항에 있어서, 상기 추출에 사용하는 용매는 정제수, 탄소수 1 내지 5의 알코올류, 또는 유기 용매인 것을 특징으로 하는 제조방법
12. 제 11항에 있어서, 상기 알코올성 용매는 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 에탄올 수용액, 또는 메탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법
13. 제 9항에 있어서, 생약은 건조약제 혹은 생약제인 것을 특징으로 하는 제조방법
14. 제 11항에 있어서, 추출용매는 에틸아세테이트, 클로로포름, 또는 핵산인 것임을 특징으로 하는 제조방법
15. 제 9항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해서 제조된 활성분획물