KR20040040474A

KR20040040474A - 바이러스 벡터 탑재 유전자 발현의 제어방법

Info

Publication number: KR20040040474A
Application number: KR10-2004-7004306A
Authority: KR
Inventors: 이노우에마코토; 이이다아키히로; 하세가와마모루
Original assignee: 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2004-05-12
Also published as: WO2003029474A1; CA2462255A1; US20040258668A1; JPWO2003029474A1; EP1447450A4; EP1447450A1; CN1561396A

Abstract

비스테로이드성 항염증약 및 근이완약이 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 억제하는 것을 발견하였다. 이들 약제는 바이러스 벡터에 의한 세포상해성도 억제하였다. 본 발명은 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 사용하여 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 제어하는 방법을 제공한다. 약제에 의한 효과는 가역적이어서, 약제의 투여를 멈추면 바이러스 벡터로부터의 유전자 발현은 다시 상승하여 바이러스 벡터에 의한 세포상해성의 상승이 관찰되었다. 본 발명의 약제는 유전자 치료용 바이러스 벡터를 사용한 유전자 치료에 있어서의 바이러스 유전자와 치료유전자의 발현 제어 및 상기 바이러스 벡터에 의한 세포상해성의 억제에 유용하다.

Description

바이러스 벡터 탑재 유전자 발현의 제어방법{Method of regulating expression of gene carried on viral vector}

바이러스 벡터는 세포로의 유전자 도입효율이 높아 도입유전자의 높은 발현을 얻을 수 있기 때문에, 유전자 치료를 포함한 많은 유전자 도입법에 있어서 사용되고 있다. 그러나, 세포에 도입된 바이러스 벡터로부터의 도입유전자의 발현을 제어하는 방법은 거의 알려져 있지 않다. 바이러스 벡터가 탑재되는 유전자의 발현을 제어하거나, 또는 바이러스에 의한 세포상해성(細胞傷害性)을 저감시키는 방법의 개발이 요망되고 있다.

Chen 등은 수포성 구내염 바이러스(Vescular Stomatitis Virus; VSV)의 증식이 아스피린에 의해 억제되는 것을 보고하고 있다(Chen, N. et al., Virology 276, 44-51(2000)). 그러나 Chen 등은 수포성 구내염 바이러스가 탑재되는 유전자의 발현에 주는 아스피린의 작용에 대해서는 개시하고 있지 않다. 더욱이, 아스피린을 유전자 도입용 벡터 탑재 유전자의 발현 제어에 사용하는 것에 대해서는 전혀 시사하고 있지 않다. 또한 아스피린을 제거했을 때 바이러스의 증식성이 가역적으로 제어 가능한지의 여부에 대해서도 Chen 등은 검토하고 있지 않다.

한편, 최근 바이러스 유전자의 조작에 의해 종양세포에 있어서의 바이러스 증식능을 유지하면서 정상 조직에 있어서의 병원성을 소실한 증식성 바이러스 벡터의 개발이 진행되고 있다. 그 중에서도 증식성 바이러스 벡터로서 단순 헤르페스바이러스(Herpes Simplex Virus)(HSV 벡터), 아데노바이러스(Adeno Virus) 및 레오바이러스(Reo Virus)가 주목되고 있다. 또한 유전자 발현 벡터의 증식성 바이러스의 효과를 높이는 방법으로서 면역 유전자 치료 및 자살 유전자 치료가 주목되고 있다. 더욱이 특이성을 높이기 위해 증식성 바이러스 벡터에 대해서 조직 특이적 프로모터의 이용도 시도되고 있다(뇌종양의 유전자 진단·치료 유전자 치료연구의 최전선 증식성 바이러스 벡터를 사용한 뇌종양 치료, 토도 도모키, 뇌의 과학, Vol. 23, No. 5, 379-387, 2001). 그 중에서도, 벡터로서의 HSV의 특징은 일과성 목적 유전자의 발현이며, 또한 신경세포 등의 비분열 세포에도 도입 가능하다는 점이다. HSV 벡터에 대해서 이하의 성능이 주목되고 있다. 1) HSV의 세포상해성 이용, 2) 특정 종양세포만을 공격하는, 간세포암 특이적 재조합 HSV주의 이용, 3) 앰플리콘 플라스미드(amplicon plasmid) 및 헬퍼 HSV를 이용한 결손 HSV의 이용 등이다(유전자 치료용 바이러스 벡터의 개발과 전망 유전자 치료용 벡터로서의 단순 헤르페스바이러스, 미야타케 신이치, 바이러스, Vol. 47, No. 2, 239-246, 1997).

세포상해성 치료에 대한 적극적인 활용은 단순 헤르페스바이러스, 아데노바이러스 및 레오바이러스를 베이스로 한 바이러스 벡터의 이점이지만, 이들 벡터의 생산은 역시 세포에서 생산시킬 수 밖에 없기 때문에, 의약에 응용하기 위한 대량의 바이러스를 생산하는 경우, 이 이점이 한편으로 결점이 되어 배양세포로부터 충분한 바이러스를 얻을 수 없다고 하는 결점을 가지고 있다. 세포상해성을 제어하는 약제를 배양시에 이용할 수 있다면 약제를 첨가함으로써 바이러스를 얻는 것을 기대할 수 있다.

본 발명은 비스테로이드성 항염증약 등을 사용하여 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 제어하는 방법에 관한 것이다.

발명의 개시

본 발명은 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약(筋弛緩藥)을 사용하여 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 제어하는 방법 및 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 제어하기 위한 약제를 제공한다. 본 발명자 등은 인간을 포함한 포유동물에 적용되는 여러 가지 약제가, 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현에 어떻게 영향을 미치는지를 예의 연구하였다. 그 결과, 놀랍게도 비스테로이드성 항염증약(NSAID라고도 칭한다) 및 근이완약이 바이러스 벡터로부터의 유전자 발현을 유의하게 억제하는 활성을 나타내는 것을 발견하였다. 바이러스 벡터 도입세포로부터의 벡터 탑재 유전자의 발현에 대한 억제효과는 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜, 인도메타신, 디클로페낙 및 메페남산을 포함하는 조사한 모든 비스테로이드성 항염증약에서 현저히 발견되었다. 더욱이 평활근이완약인 파파베린도 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현에 대한 강한 억제효과가 발견되었다.

바이러스 벡터 도입세포에 있어서, 벡터 도입에 의해 야기되는 세포상해성에 대한 이들 약제의 투여효과를 검사한 바, 특히 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜 및 인도메타신은 세포상해성을 감약(減弱)시키는 강한 효과를 가지고 있는 것이판명되었다. 그 중에서도 아스피린 및 케토프로펜은 세포상해성 억제효과가 특히 높은 것이 명백해졌다.

아스피린에 대해서 바이러스 벡터 탑재 유전자 발현의 억제효과를 상세히 조사한 바, 이 억제작용은 일과적인 것으로, 약제의 적용을 중지하면 짧은 일수 중에 벡터 탑재 유전자 발현의 억제가 해제되는 것이 판명되었다. 이 사실은 벡터 탑재 유전자의 발현을 억제하고자 하는 경우, 또는 바이러스 벡터에 의한 세포상해성을 억제할 필요가 생긴 경우에 본 발명의 약제를 적용함으로써 그 목적을 달성할 수 있고, 필요가 없어지면 약제의 적용을 중지함으로써 바이러스 벡터로부터의 발현을 가역적으로 제어할 수 있는 것을 나타내고 있다. 즉, 본 발명에 의해 벡터 탑재 유전자의 발현을 다이나믹하게 제어하는 것이 가능해진다.

본 발명의 약제는 특히 유전자 치료 등의 임상장면에 있어서 바이러스 벡터에 의해 도입한 치료유전자 등의 바이러스 탑재 유전자의 발현레벨 및 세포상해성을 신속하게 제어하는 것을 가능하게 한다. 본 발명은 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 사용하여 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 제어하는 방법 및 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 제어하기 위한 약제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는

(1) 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 바이러스 벡터 도입세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 상기 바이러스 벡터가 탑재되는 유전자의 발현을 제어하는 방법,

(2) (1)에 있어서, 바이러스 벡터에 의한 세포상해를 감약시키는 방법,

(3) (1)에 있어서, 비스테로이드성 항염증약이 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜, 인도메타신, 디클로페낙 및 메페남산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법,

(4) (3)에 있어서, 비스테로이드성 항염증약이 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜 및 인도메타신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법,

(5) (4)에 있어서, 비스테로이드성 항염증약이 아스피린 및/또는 케토프로펜인 방법,

(6) (1)에 있어서, 근이완약이 파파베린인 방법,

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터가 마이너스 가닥(minus-strand) RNA 바이러스 벡터인 방법,

(8) (7)에 있어서, 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스인 방법,

(9) (8)에 있어서, 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 방법,

(10) 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 포함하는, 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현 억제제,

(11) (10)에 있어서, 바이러스 벡터에 의한 세포상해를 감약시키는 작용을 갖는 억제제에 관한 것이다.

본 발명은 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 제어하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명의 방법은 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 바이러스 벡터 도입세포에 접촉시키는 공정을 포함하는 방법이다. 비스테로이드성 항염증약 및 근이완약으로서는 특별히 제한은 없고, 목적으로 하는 비스테로이드성 항염증약 및 근이완약을 단독으로 또는 복수 조합하여 사용할 수 있다.

비스테로이드성 항염증약이란 스테로이드 이외에서 항염증 작용을 갖는 약물군을 가리키는 총칭으로, 아스피린 유사 약물(aspirin-like drugs)이라고도 불리운다(굿맨·길맨 약리서, p775). 특히 산성 비스테로이드성 항염증약이 프로스타글란딘의 생합성을 억제하는 것이 알려져 있다(Vane, J. R. and Botting, R., FASEB J. 1, 89-96(1987); Vane, J. R., Nat. New Biol. 231(25), 232-235(1971)). 비스테로이드성 항염증약으로서는 예를 들면, 살리실산계(살리실산, 아스피린, 아스피린 DL 리신 등의 아스피린염, 디설파닐), 아릴초산계(인도메타신, 디클로페낙, 설린닥, 나부메톤, 프로글루메타신, 인도메타신파네실, 에토돌락), 프로피온산계(이부프로펜, 나프록센, 플루비프로펜, 티아프로펜, 프라노프로펜, 록소프로펜, 알미노프로펜, 케토프로펜), 페남산계(메페남산, 톨루페남산), 피라졸론계(페닐부타존, 옥시펜부타존), 옥시캄계(피록시캄, 테녹시캄, 암피록시캄)가 있다. 비산성의 비스테로이드성 항염증약으로서는 에피리졸, 티아라미드, 에모르파존을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 약제로 할 수 있는 비스테로이드성 항염증약으로서는 산성 비스테로이드성 항염증약이 바람직하고, 보다 바람직한 비스테로이드성 항염증약으로서는 특히 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜, 인도메타신, 디클로페낙(디클로페낙 나트륨을 포함한다) 및 메페남산을 들 수 있다. 보다 바람직한 비스테로이드성 항염증약으로서는 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜 및 인도메타신을 들 수 있고, 특히 아스피린 및 케토프로펜은 가장 바람직한 비스테로이드성 항염증약에 포함된다.

본 발명에 있어서 사용되는 근이완약으로서는 예를 들면 골격근이완약(투보쿠라린, 석사메토늄, 데카메토늄, 단트롤렌), 평활근이완약(파파베린, 리토드린, 테르부탈린, 황산마그네슘)을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 약제로 할 수 있는 바람직한 근이완약으로서는 평활근이완약을 들 수 있고, 특히 평활근이완약으로서 작용하는 아편 알칼로이드, 그 중에서도 이소퀴놀린 유도체가 바람직하고, 예를 들면 파파베린을 들 수 있다.

상기의 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약은 염(예를 들면 나트륨염), 수화물 또는 착체 등의 형태도 포함된다. 또한 동족체, 아날로그, 유도체, 에스테르 등도 포함된다. 본 발명의 약제는 바이러스 벡터 도입세포에 있어서의 상기 바이러스 벡터가 탑재되는 유전자의 발현을 억제하기 위한 시약 및 의약 또는 의약품원료로서 유용하다. 또한, 바이러스 벡터에 의한 세포상해를 감약시키기 위한 시약 및 의약 또는 의약품 원료로서 유용하다.

본 발명의 방법에 있어서 바이러스 벡터 도입세포에 있어서의 상기 바이러스 벡터가 탑재되는 유전자의 발현을 억제하기 위해서는, 상기 세포에 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 접촉시킨다. 접촉의 조작은 바이러스 벡터를 세포에 도입하기 전에 행해도 되고, 동시에 또는 바이러스 벡터의 도입 후에 행해도 된다. 이들 태양은 모두 본 발명에 포함된다. 바이러스 벡터 도입세포에 본 발명의 약제가 접촉됨으로써 상기 세포에 있어서의 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현이 억제된다.

본 발명에 있어서 바이러스 벡터 탑재 유전자란 상기 벡터에 의해 세포에 도입되는 유전자를 말한다. 이들 유전자에는 세포에서 발현시키기 위해 벡터에 삽입되어 있는 외래유전자 및 바이러스 벡터가 원래 보유하고 있는 바이러스 유전자 및 벡터가 보유할 수 있는 마커 유전자 등, 바이러스 벡터에 의해 세포에 도입되는 모든 유전자가 포함된다. 또한, 유전자란 유전물질을 가리키고, RNA 및 DNA 등의 핵산이 포함된다. 일반적으로, 유전자는 단백질을 코드해도 되고 또한 단백질을 코드하고 있지 않아도 된다. 예를 들면 유전자는 리보자임 또는 안티센스 RNA 등의 기능적 RNA를 코드하는 것이어도 된다. 유전자는 천연 유래 또는 인위적으로 설계된 서열일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「DNA」란 단일 가닥 DNA 및 이중 가닥 DNA를 포함한다.

본 발명의 방법은 특히 바이러스 벡터에 탑재된 외래유전자의 발현을 제어하기 위해 적합하게 사용된다. 예를 들면, 외래유전자를 발현하는 바이러스 벡터를 도입한 세포에 있어서는, 본 발명의 방법에 의해 외래유전자의 발현을 억제할 수 있다. 예를 들면 바이러스 벡터를 사용한 유전자 치료에 있어서, 치료유전자의 높은 레벨의 발현이 원하지 않는 부작용을 나타내는 경우에, 본 발명의 방법에 의해 치료유전자의 발현을 억제하는 것이 가능해진다. 외래유전자로서는 제한은 없어, 예를 들면 벡터 도입의 대상이 되는 숙주로 기능할 수 있는 생리활성 단백질 등을 들 수 있고, 구체적으로는 사이토카인/케모카인, 호르몬, 효소, 가용성 수용체, 항체 단편 등이 포함된다.

또한 본 발명의 방법에 의해 바이러스 벡터가 갖는 바이러스 유전자 등의 발현을 억제하는 것도 가능하다. 벡터가 갖는 바이러스 유전자로부터 발현되는 단백질은 도입세포에서 발현함으로써 세포상해성을 야기하는 것이 많이 알려져 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 억제함으로써, 바이러스 벡터에 의한 세포상해성을 감약시킬 수 있다. 상술한 바와 같이, 단순 헤르페스바이러스, 아데노바이러스 및 레오바이러스를 베이스로 한 바이러스 벡터는 세포상해성을 가지고 있다. 본 발명은 이들 바이러스 벡터에 의한 세포상해를 억제하기 위해 유용하다.

본 발명의 방법에 의해 목적으로 하는 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 특히 본 발명의 방법의 적용에는 포유동물 세포 감염성 바이러스 벡터가 바람직하고, 이들에는 예를 들면 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터 등을 들 수 있고, 바람직하게는 단순 헤르페스바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 셈리키 삼림 바이러스 벡터(Semliki Forest Viral vector), 신드비스바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 계두(Fowlpox) 바이러스 벡터를 들 수 있으며, 가장 바람직하게는 광견병 바이러스 벡터, 홍역 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등의 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터를 들 수 있지만 이들에 제한되지 않는다. 또한 상기한 바와 같이, 세포상해성을 갖는 바이러스 벡터는 본 발명의 방법의 적용에 적합하다. 본 발명은 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 바이러스 벡터 도입세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 바이러스 벡터에 의한 세포상해를 감약시키는 방법을 제공한다. 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 포함하는 약제는 바이러스 벡터에 의한 세포상해를 감약시키기 위한 약제가 된다.

본 발명에 있어서 마이너스 가닥 RNA 바이러스란, 마이너스 가닥(네거티브 가닥)을 게놈에 갖는 RNA 바이러스를 말한다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는 예를 들면 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)의 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytial virus), 우역 바이러스(Rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 오르토마이코바이러스과(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 라브도바이러스과(Rhabdoviridae)의 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 광견병 바이러스(Rabies virus) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 본 발명의 방법의 적용에 있어서 보다 바람직한 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터는 비분절형(즉 단일 가닥의) 마이너스 가닥 RNA 바이러스이고, 더욱 바람직하게는 파라믹소바이러스이다.

본 발명에 있어서 파라믹소바이러스란 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체를 가리킨다. 파라믹소바이러스는 비분절형 네거티브 가닥 RNA를 게놈에 갖는 바이러스의 그룹의 하나로, 파라믹소바이러스아과(Paramyxovirinae)(레스피로바이러스속(파라믹소바이러스속이라고도 한다), 루블라바이러스속 및 모르빌리바이러스속을 포함한다) 및 뉴모바이러스아과 (Pneumovirinae)(뉴모바이러스속 및 메타뉴모바이러스속을 포함한다)를 포함한다. 본 발명을 적용할 수 있는 파라믹소바이러스로서는 예를 들면 파라믹소바이러스과의 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytial virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 2, 3형 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 파라믹소바이러스는 바람직하게는 파라믹소바이러스아과(레스피로바이러스속, 루블라바이러스속 및 모르빌리바이러스속을 포함한다)에 속하는 바이러스이고, 보다 바람직하게는 레스피로바이러스속(Respirovirus)(파라믹소바이러스속(Paramyxovirus)이라고도 한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이다. 본 발명의 적용에 특히 바람직한 레스피로바이러스속 바이러스로서는, 예를 들면 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형(HPIV-3), 소 파라인플루엔자 바이러스 3형(BPIV-3), 센다이 바이러스(Sendai virus; 마우스 파라인플루엔자 바이러스 1형이라고도 불리운다) 및 원숭이 파라인플루엔자 바이러스 10형(SPIV-10) 등이 포함된다. 본 발명의 방법의 적용에 가장 바람직한 파라믹소바이러스는 센다이 바이러스이다. 이들 바이러스는 천연주, 야생주, 변이주, 라보계대주 및 인위적으로 구축된 주 등에 유래해도 된다. DI 입자(J. Virol. 68, 8413-8417(1994)) 등의 불완전 바이러스 탑재 유전자의 발현도 본 발명의 방법에 의해 억제하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 「마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터」란, 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 유래하여 유전자를 숙주세포에 도입하는 벡터를 가리킨다. 벡터란유전자를 세포에 도입하기 위한 담체이다. 본 발명의 방법에 의해 복제능을 갖는(replication competent한) 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터 및 복제능을 갖지 않는(replication deficient한) 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터 양쪽에 있어서, 벡터 탑재 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 특히 복제능을 갖는 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터가 도입된 세포에 대해서 본 발명의 방법을 적용하면, 상기 바이러스 벡터의 복제를 억제하는 것도 가능하다. 이것에 의해, 바이러스 벡터의 과도한 증폭이나 확산을 저지할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하면, 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 가역적으로 억제할 수 있다. 즉, 본 발명의 약제를 벡터 도입세포에 접촉시키고 있는 동안은 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현이 억제되어, 벡터에 의해 야기될 수 있는 세포상해성을 억제할 수 있다. 약제 적용을 정지함으로써 벡터 탑재 유전자의 발현 억제는 해제된다. 본 발명의 방법은 인 비보 및 인 비트로(엑스 비보를 포함한다)에 있어서 사용할 수 있다. 인 비보에서의 적용에 있어서는, 본 발명의 약제는 생체 내에 투여함으로써 바이러스 도입세포에 접촉시킨다. 투여 경로는 약제가 바이러스 도입세포에 접촉되는 한 제한은 없고 유효성분의 성질에 따라, 예를 들면 경구적, 경피적, 비강내적, 경기관지적(經氣管支的), 근내적(筋內的), 복강내, 정맥내, 관절내 또는 피하 등에 행해질 수 있지만 그들에 한정되지 않는다. 인 비트로(엑스 비보를 포함한다)에서의 적용에 있어서는, 본 발명의 약제는 표적세포에 접촉하도록 첨가된다. 예를 들면 세포배양액에 첨가된다.

적용되는 약제의 농도는 특별히 한정되지 않는다. 약제의 종류, 염의 종류,투여 경로 등에 따라 적절히 결정하면 된다. 일반적으로, 약제의 용량에 의존하여 바이러스 탑재 유전자에 대한 발현 억제효과는 높아지는 것이 기대되지만, 약제에 따라서는 고용량으로 세포독성이 나타날 가능성이 있다. 당업자라면 개개의 약제의 종류나 사용목적에 따라 농도나 투여량은 조정할 수 있다. 예를 들면, 아스피린의 경구투여의 경우, 1회 0.5~1.5 g, 1일 1.5~4.5 g을 표준적인 투여량으로 하여 추정 중독량 300 mg/Kg(LD₅₀1750 mg/Kg의 1/6)을 초과하지 않는 양을 한도량으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법의 적용대상이 되는 생물로서는 바이러스 벡터에 의한 유전자 도입이 가능한 한 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 닭, 메추라기, 마우스, 랫트, 개, 돼지, 고양이, 소, 토끼, 양, 염소, 원숭이 및 인간 등을 포함하는 조류 및 포유동물을 들 수 있다. 본 발명의 방법을 인 비트로(엑스 비보를 포함한다)에서 사용하는 경우는, 적용 개체로서는 예를 들면 인간, 비인간 포유동물 및 조류 등을 들 수 있다. 본 발명의 방법을 인 비보에서 사용하는 경우는 적용 개체로서는 특별히 비인간 포유동물 및 조류 등을 들 수 있다.

본 발명은 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 제어하기 위한 약제를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 포함하는, 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현 억제제를 제공한다. 본 발명의 약제에는 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 억제하기 위한 시약 및 의약이 포함된다. 본 발명의 약제는 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약 자체여도 되고, 또한 멸균수, 생리식염수, 완충제, 염, 안정제, 보존제, 계면활성제 등과 적절히 조합하여 조성물로 해도 된다. 이들은 혼합되어 있어도 되고, 사용시에 혼합될 때까지 분리되어 있어도 된다. 또한, 본 발명의 약제는 공지의 제제학적 방법에 의해 제제화하는 것도 가능하다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 서방제 등과 적절히 조합하여 제제화할 수 있다. 또 본 발명의 약제는 수용액, 산제, 세립제, 과립제, 정제, 피복 정제, 캡슐, 트로키, 구강정(buccal tablet), 엘릭시르(elixir), 현탁액, 시럽, 점비액, 흡입액, 연고, 첩부제 또는 좌제 등의 형태일 수 있다. 제제에 있어서의 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약의 함유율은 적절히 결정하면 된다.

예를 들면, 경구제제를 제조하기 위해서는 비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약의 1종류 이상에 부형제, 추가로 필요에 따라 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 교미교취제 등을 가한 후, 일반적인 방법으로 산제, 세립제, 과립제, 정제, 피복 정제, 캡슐제 등으로 할 수 있다.

부형제로서는 예를 들면 락토오스, 콘스타치, 수크로오스, 포도당, 만니톨, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스, 젤라틴, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다. 붕괴제로서는 예를 들면 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아르산 마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 식물유 등을 들 수 있다. 착색제 및 교미교취제로서는 의약품에 첨가할 수 있는 여러 가지 화합물이 알려져 있다. 이들은 정제, 마이크로캡슐 또는 과립제여도 되고, 예를 들면 당의 또는 그 밖의 코팅이 되어 있어도 된다.

주사용 제제를 제조하기 위해서는 주제(主劑)에 pH 조정제, 용해제, 등장화제 등을 가하고, 필요에 따라 용해보조제, 안정화제 등을 가하여 일반적인 방법으로 제제화할 수 있다. 제제화에 있어서 사용되는 기제(基劑) 원료로서는 의약품, 의약부외품, 화장품 등에 통상 사용되는 각종 원료를 사용하는 것이 가능하다. 사용하는 기제 원료로서 구체적으로는 예를 들면 동물유, 식물유, 광물유, 에스테르유, 왁스류, 고급 알코올류, 지방산류, 실리콘유, 계면활성제, 인지질류, 알코올류, 다가 알코올류, 수용성 고분자류, 점토광물류, 정제수 등의 원료를 들 수 있다. 추가로 필요에 따라 pH 조정제, 항산화제, 킬레이트제, 방부방미제(防腐防黴劑), 착색료, 향료 등을 첨가할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 약제는 목적으로 하는 투여 경로로 투여되어도 되고, 상기한 바와 같이 예를 들면 경구적, 경피적, 비강내적, 경기관지적, 근내적, 복강내, 정맥내, 관절내 또는 피하 등에 행해질 수 있다. 또한, 전신적 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 투여량, 투여방법은 의약조성물의 유효성분의 조직이행성, 치료목적, 환자 등의 투여대상의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동되지만, 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하다. 투여는 1회에서 수회로 나눠 행할 수 있다. 본 발명의 약제는 목적으로 하는 배양세포계 및 개체에 적용할 수 있다. 대상이 되는 개체 및세포의 유래는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 소, 개 등의 임의의 포유동물 및 그 밖의 척추동물을 들 수 있다. 특히, 본 발명의 약제는 바이러스 벡터를 사용한 인간 유전자 치료에 있어서의 벡터 탑재 유전자의 발현 제어를 위해 유용하다. 또한 본 발명의 약제는 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현의 가역적 억제제로서도 유용하다.

특히 적합한 투여 경로에 있어서는, 예를 들면 본 발명의 약제는 피하 및 각질층의 바로 아래 또는 근방에 투여된 벡터의 발현량을 피내(皮內)의 국소에서 조절하기 위한 경피 흡수제제로서 조제되는 것이 바람직하다. 경피 흡수제제는 연고, 파프(cataplasm), 테이프 등의 제형이어도 되고, 배합하는 기재, 보조제 및 부형제로서 통상 의약품 및 화장품에 배합되는 성분이 바람직하다. 예를 들면, 점착성 수지재료(폴리테르펜 수지, 탄화수소 수지 등), 천연고무 또는 합성고무(폴리이소부틸렌, 스티렌-부틸렌 중합체, 스티렌-이소프렌 중합체, 스티렌-에틸렌-부틸렌 중합체, 1,4-폴리이소프렌 등) 또는 갈락토만난 등의 수중에서 팽윤할 수 있는 폴리머를 주성분으로 하는 첩부제여도 되고, 폴리에틸렌글리콜과 지방산 에스테르가 배합되어 있어도 된다. 사용되는 지방산 에스테르는 구체적으로는 올레산 에틸, 미리스트산 이소프로필, 팔미트산 이소프로필, 스테아르산 부틸, 미리스트산 미리스틸, 미리스트산 옥틸도데실, 스테아르산 콜레스테릴, 아디프산 디이소프로필 등을 들 수 있다. 사용되는 폴리에틸렌글리콜은 구체적으로는 폴리에틸렌글리콜 200, 폴리에틸렌글리콜 300, 폴리에틸렌글리콜 400, 폴리에틸렌글리콜 600, 폴리에틸렌글리콜 1000, 폴리에틸렌글리콜 1500, 폴리에틸렌글리콜 1540, 폴리에틸렌글리콜 4000등을 들 수 있다. 필요에 따라 이들 배합에 수흡수 고분자가 포함되어 있어도 상관 없다. 예를 들면 수흡수 고분자는 바람직하게는 자중(自重)의 10배 이상의 물을 흡수하여 겔화 팽창하는 것으로서, 바람직하게는 미분체의 것으로, 카르복시 메틸셀룰로오스 및 그의 금속염, 카르복시메틸 폴리머 등에 경도의 가교결합을 도입한 것, 폴리아크릴산 및 그의 금속염, 나트륨염, 카르복시메틸화된 폴리비닐알코올 또는 전분 아크릴로니트릴 그래프트 비누화물 금속염 등을 들 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 약제의 평가에 사용한 SeV의 유전자구조 모식도이다.

도 2는 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 기재된 농도의 아스피린을 첨가한 후, 2일 마다 회수한 배양상청에 대해 측정한 아스피린에 의한 농도의존적 SeV 전사 복제 억제활성 (A) 비리온(virion)량을 반영하는 HA 활성값, (B) 세포상해성을 반영하는 LDH 방출량, (C) 탑재 유전자 발현량을 반영하는 SEAP 활성의 경시변화를 나타내는 도면이다.

도 3은 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 기재된 농도의 아스피린을 첨가하고, 첨가 4일 후 및 6일 후의 GFP 발현량 및 세포상해성을 반영하는 형광현미경 사진이다.

도 4는 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 기재된 농도의 아스피린을 첨가하고, 첨가 2일 후, 4일 후 및 6일 후의 배양상청을 원심한 후, 회수된 비리온에 대해서 (A) 항M 항체 또는 (B) 주로 NP를인식하는 DN-1 항체로 행한 웨스턴 블로팅 해석 및 (C) 아스피린 첨가 6일 후의 세포에 대해서 항M 항체, DN-1 항체 및 항G3PDH 항체로 행한 웨스턴 블로팅 해석결과를 나타내는 사진이다.

도 5는 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 기재된 농도의 아스피린을 첨가하고, 첨가 2일 후, 4일 후 및 6일 후의 배양상청을 원심한 후, 회수된 비리온에 대해서 항M 항체로 웨스턴 블로팅을 행한 결과의 정량화를 나타내는 도면이다.

도 6은 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 5 mM의 아스피린을 첨가한 후, 2일 마다 5 mM의 아스피린을 포함하거나 또는 포함하지 않는 새로운 배지를 첨가하여(아스피린 처리기간: 0, 2, 4, 6 및 8일간), 회수한 배양상청에 대해서 측정한 HA 활성 변화를 나타내는 도면이다.

도 7은 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 5 mM의 아스피린을 첨가한 후, 2일 마다 5 mM의 아스피린을 포함하거나 또는 포함하지 않는 새로운 배지를 첨가하여(아스피린 처리기간: 0, 2, 4, 6 및 8일간), 회수한 배양상청에 대해서 측정한 LDH 방출량 변화를 나타내는 도면이다.

도 8은 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 5 mM의 아스피린을 첨가한 후, 2일 마다 5 mM의 아스피린을 포함하거나 또는 포함하지 않는 새로운 배지를 첨가하여(아스피린 처리기간: 0, 2, 4, 6 및 8일간), 회수한 배양상청에 대해서 측정한 SEAP 활성의 경시변화를 나타내는 도면이다.

도 9는 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 5 mM의 아스피린을 첨가한 후, 2일 마다 5 mM의 아스피린을 포함하거나 또는 포함하지 않는 새로운 배지를 첨가하여(아스피린 처리기간: 0, 2, 4, 6 및 8일간), 경시적으로 관찰한 GFP 발현량 및 세포상해성을 반영하는 형광현미경 사진이다.

도 10은 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP 또는 SeV18+/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜, 인도메타신, 디클로페낙 나트륨, 메페남산 또는 파파베린을 기재된 농도로 첨가한 후, 2일 마다 회수한 배양상청에 대해서 측정한 HA 활성값 및 LDH 방출량을 나타내는 도면이다. 도 11에 계속된다.

도 11은 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP 또는 SeV18+/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜, 인도메타신, 디클로페낙 나트륨, 메페남산 또는 파파베린을 기재된 농도로 첨가한 후, 2일 마다 회수한 배양상청에 대해서 측정한 HA 활성값 및 LDH 방출량을 나타내는 도면이다. 도 10으로부터 계속된다.

도 12는 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염 2일 후에 이소소르비드 디니트레이트(Isosorbide Dinitrate)(ISDN) 또는 니코란딜 (Nicorandil)을 기재된 농도로 첨가한 후, 2일 마다 회수한 배양상청에 대해서 측정한 HA 활성값 및 LDH 방출량을 나타내는 도면이다.

도 13은 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켜, 감염2일 후에 5 mM의 아스피린 또는 1 mM의 케토프로펜을 첨가하고, 그 직후에 기재된 농도의 L-NAME를 첨가한 후, 2일 마다 회수한 배양상청에 대해서 측정한 HA 활성값 및 LDH 방출량을 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지는 않는다. 또한, 본 명세서에 있어서 인용된 문헌은 모두 본 명세서의 일부로서 삽입된다.

[실시예 1] 아스피린 첨가에 의한 SeV 전사 복제 억제

NSAIDs의 가장 대표적인 약제로서 먼저 아스피린[aspirin; 아세틸살리실산 (acetylsalicylic acid)이라고도 한다]을 선택하여, 센다이 바이러스(SeV)의 증식(전사 복제)에 영향을 주는지의 여부에 관하여 검증하였다. 평가법으로서는 항바이러스제적인 평가가 아니라 발현 제어라는 관점에서의 평가를 행하기 위해, SeV 감염 2일 후에 어느 정도 바이러스가 늘어난 상태에서 아스피린(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)을 첨가한다는 방법으로 행하였다.

원숭이 신장 유래 세포인 LLC-MK2를 6웰 배양 플레이트에 5×10⁵cells/웰로 뿌리고, 10% 소 혈청(FBS: BioWhittaker, Walkersville, MD)을 포함하는 MEM 배지(Gibco-BRL, Rockville, MD)에서 37℃, 5% CO₂인큐베이터 하에 24시간 배양하였다. PBS로 세정한 후, 분비형 알칼리포스파타아제(SEAP) 및 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; GFP) 두 유전자를 탑재한 F 결실형 SeV(SeV18+SEAP/△F-GFP: 도 1)를 m.o.i. 3에서 감염시켰다. 사용한 F 결실형 SeV는 Li 등의 방법으로 조제한 것이다(Li, H.-O. et al., J. Virology 74, 6564-6569(2000), WO00/70070). 감염 후에는 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 배양을 계속하고, 2일 후에 0.625, 1.25, 2.5, 5 mM의 아스피린을 포함하거나 또는 포함하지 않는 MEM(혈청 없음)으로 치환하여 2일 마다 배양상청을 회수하고, 동시에 새로운 동일 조건의 배지를 첨가하여 경시적으로 샘플링을 행하였다. 회수한 상청에 대해서 비리온 형성량의 지표가 되는 적혈구응집 활성(HA 활성), 세포상해성의 지표가 되는 락트산 탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH) 정량 및 탑재 유전자 발현량의 지표가 되는 SEAP 활성측정을 행하였다. 또한, 경시적으로 형광현미경으로 관찰하여 GFP 발현량이나 세포상해성의 관찰을 행하였다.

HA 활성은 Kato 등의 방법(Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579(1996))에 따라 행하였다. 즉, 바닥이 둥근 96웰 플레이트를 사용하여 바이러스액을 단계적으로 PBS(Gibco-BRL, Rockville, MD)로 희석하여 각 웰 50 μL의 2배 희석계열을 제작하였다. 그 50 μL에 1% 농도로 PBS로 희석한 닭 보존혈(COSMO BIO Co., Ltd., Tokyo, Japan) 50 μL를 혼합하여 4℃에서 1시간 방치하여 적혈구의 응집을 관찰하고, 응집된 것 중 가장 바이러스 희석률이 높은 것의 희석률을 HA 활성으로서 판정하였다. 또한, 1 HAU를 1×10⁶바이러스로 환산하여 바이러스수로 나타냈다. 5 mM아스피린 첨가에 의해 HA 활성 상승은 억제되어 있어 비리온 형성량이 감소되었다고 판단되었다(도 2(A)). LDH 정량은 Cytotoxicity Detection Kit(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 행하였다. 아스피린 농도 의존적으로 LDH 방출량이 감소되고, 특히 5 mM의 아스피린 존재하에 있어서는 거의 상해가 관찰되지 않았다(도 2(B)). SEAP 활성측정은 Reporter Assay Kit-SEAP(TOYOBO, Osaka, Japan)를 이용하여 Kit에 기재된 방법에 따라 측정하였다. SEAP 활성 변화에 관해서도 아스피린 농도 의존적으로 감소되어 아스피린 5 mM에서의 감소가 현저하였다(도 2(C)).

아스피린 첨가 4일 후(SeV 감염 6일 후) 및 첨가 6일 후(SeV 감염 8일 후)의 형광현미경 하의 사진을 도 3에 나타냈다. 아스피린 농도 의존적으로 GFP 발현량이 감소되고 세포상해성도 감약되어 있는 것이 관찰되어, 아스피린 5 mM 첨가 조건에서의 작용이 현저하였다.

전사 복제량을 다른 관점에서 평가하기 위해 바이러스 단백을 웨스턴 블로팅에 의해 반정량적으로 해석하였다. 상술한 것과 동일한 샘플, 즉 LLC-MK2 세포에 SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시키고, 2일 후에 아스피린을 첨가한 후 2일 마다 회수한 배양상청 및 아스피린 처리 6일 후(감염 8일 후)에 회수한 세포를 사용하였다. 배양상청은 48,000 g으로 45분간 원심하여 바이러스 단백을 회수하고, 세포는 직접 셀 스크레이퍼로 회수하였다. SDS-PAGE 후, 웨스턴 블로팅을 행하여 항M 항체 및 주로 NP 단백을 인식하는 DN-1 항체(모두 토끼 다중클론)에서 검출되었다. 웨스턴 블로팅은 이하의 방법으로 행하였다. 6웰 배양 플레이트의 1웰로부터회수한 세포(-80℃에서 동결보존 후의 것) 및 배양상청으로부터 조제한 바이러스 단백에 대해서 1×로 희석한 SDS-PAGE용 샘플 버퍼(Red Loading Buffer Pack; New England Biolabs, Beverly, MA) 100 μL로 용해하여 98℃에서 10분간 가열하였다. 원심 후, 상청 10 μL를 SDS-PAGE 겔(멀티겔 10/20; Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo, Japan)에 로드하였다. 15 mA에서 2.5시간 영동한 후, PVDF막(Immobilon PVDF transfer membrane; Millipore, Bedford, MA)에 세미드라이법(Semi-dry method)으로 100 mA에서 1시간 전사하였다. 전사막을 블로킹 용액(Block Ace; Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Sapporo, Japan)에서 4℃ 1시간 이상 방치한 후, 10% Block Ace를 포함하고 항M 항체를 1/4000 용량 또는 DN-1 항체를 1/1000 용량 첨가한 1차항체 용액에 침지하여 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 0.05% Tween20을 포함하는 TBS(TBST)로 3회, 추가로 TBS로 3회 세정한 후, 10% Block Ace를 포함하고 HRP를 결합한 항토끼 IgG항체(Anti-rabbit IgG(Goat) H+L conj.; ICN P., Aurola, OH)를 1/5000 용량 첨가한 2차항체 용액에 침지하여 실온에서 1시간 진탕하였다. TBST로 3회, TBS로 3회 세정한 후, 화학발광법(ECL Western blotting detection reagents; Amersham pharmacia biotech, Uppsala, Sweden)에 의해 검출하였다. 배양상청 중의 바이러스 단백 및 감염세포 중의 바이러스 단백 모두 바이러스 단백량이 감소되어 있는 것이 확인되었다(도 4). 또한, 항M 항체로 반정량적으로 해석한 결과(도 5)가 HA 활성값(도 2(A))과 매우 좋은 상관관계를 나타내, 아스피린 첨가에 의해 SeV 전사 복제 억제가 틀림없이 생기고 있는 것으로 판단되었다.

[실시예 2] 아스피린 첨가 처리기간의 SeV 전사 복제 억제활성으로의 영향

확인된 아스피린 첨가에 의한 SeV 전사 복제 억제가 첨가 처리기간에 의해 영향을 받는지의 여부, 즉 아스피린 첨가가 지속적인지 또는 일시적인(transient) 효과인지를 판단하기 위해 아스피린을 첨가하는 처리기간을 바꿔 그 후의 바이러스 증식의 차이를 조사하였다.

실시예 1의 기재와 동일한 방법으로 행하였다. 즉, LLC-MK2를 6웰 배양 플레이트에 5×10⁵cells/웰로 뿌리고, 10% 소 혈청을 포함하는 MEM 배지에서 37℃, 5% CO₂인큐베이터 하에 24시간 배양하였다. PBS로 세정한 후, SeV18+SEAP/△F-GFP를 m.o.i. 3에서 감염시켰다. 감염 후에는 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 배양을 계속하고, 2일 후에 5 mM의 아스피린을 포함하는 MEM(혈청 없음)으로 치환하여 2일 마다 배양상청을 회수하고, 동시에 5 mM의 아스피린을 포함하거나 또는 포함하지 않는 새로운 배지를 첨가하여 경시적으로 샘플링을 행하였다. 아스피린 처리는 0, 2, 4, 6 및 8일간의 처리로 차이를 조사하였다. 회수한 상청에 대해서 HA 활성, LDH 정량 및 SEAP 활성측정을 행하였다. 또한, 경시적으로 형광현미경으로 관찰하여 GFP 발현량이나 세포상해성의 관찰을 행하였다.

HA 활성 변화(도 6)에서는 아스피린 처리기간 중에는 HA 활성의 상승이 적어, 즉 비리온 형성이 억제되어 있지만, 처리를 종료한 2일 후에는 HA의 상승이 보여 비리온 형성이 항진되어 있었다. 중요한 것은 이 현상이 처리기간에 상관없이보이고 있는 점으로, 아스피린 첨가효과가 일시적인 것을 나타내고 있다. LDH량은 더욱이 2일 늦게 반응하고 아스피린 처리를 종료한 4일 후에 LDH 방출량의 상승이 보여, HA 활성과 마찬가지로 동일한 현상이 처리기간에 상관없이 관찰되었다(도 7). HA 활성의 변화 보다도 2일 늦게 반응한 것은 바이러스의 전사 복제 항진(HA 활성 상승) 후, 세포상해가 생겨 LDH를 배지에 방출할 때까지의 타임 래그(time lag)를 반영하고 있는 것으로 생각되었다. SEAP 활성 변화에서는 HA 활성이나 LDH량 변화와 같은 아스피린 처리개시 및 해제에 민감한 변화는 관찰되지 않았지만, 아스피리 처리 후 SEAP 활성이 한번 떨어지고 다음에 회복할 때까지, 처리 종료로부터 6일간 정도 걸리고 있는 경향이 보였다(도 8).

형광현미경상을 도 9에 나타냈다. 결과는 상술한 HA 활성, LDH량 및 SEAP 활성변화 결과를 지지하는 것으로, 아스피린 처리기간 중에는 GFP 발현량이 적고 세포상해성도 관찰되었지만, 처리 종료 후의 GFP 발현항진과 세포상해성 야기가 관찰되었다. 이들 변화는 처리기간의 길이에 상관없이 거의 동일한 변화를 나타내, 아스피린에 의한 SeV 전사 복제 억제활성은 일시적인 효과인 것으로 판단되었다.

[실시예 3] 아스피린 이외의 NSAIDs의 작용

SeV에 대한 전사 복제 억제활성에 관해서 아스피린 이외 약제의 검색을 행하였다. 평가를 행한 약제는 케토프로펜(Ketoprofen)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan), 플루비프로펜(Flurbiprofen)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan), 인도메타신 (Indomethacin)(Wako PureChemical Industries, Ltd., Osaka, Japan), 디클로페낙 나트륨(Diclofenac sodium)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan), 메페남산(Mefenamic acid)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) 및 NSAIDs가 아닌 사이토메갈로바이러스에 대한 증식억제가 보고(Albrecht, T. et al., Proc Soc Exp Biol Med 186, 41-46(1987))되어 있어 평활근이완 활성이 있는 파파베린(Papaverin)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)이다.

실시예 1의 기재와 동일한 방법으로 행하였다. 즉, LLC-MK2를 6웰 배양 플레이트에 5×10⁵cells/웰로 뿌리고, 10% 소 혈청을 포함하는 MEM 배지에서 37℃, 5% CO₂인큐베이터 하에 24시간 배양하였다. PBS로 세정한 후, SeV18+SEAP/△F-GFP 또는 SEAP 유전자를 갖지 않는 F 결실형 SeV(SeV18+/△F-GFP)를 m.o.i. 3에서 감염시켰다. 감염 후에는 혈청을 포함하지 않는 MEM에서 배양을 계속하여 2일 후에 기재된 농도의 약제를 포함하는 MEM(혈청 없음)으로 치환하여 2일 마다 배양상청을 회수하고, 동시에 새로운 동일 조건의 배지를 첨가하여 경시적으로 샘플링을 행하였다. 회수한 상청에 대해서 HA 활성 및 LDH 정량을 행하였다. 또한, 경시적으로 형광현미경으로 관찰하여 GFP 발현량이나 세포상해성의 관찰을 행하였다.

그 결과, 조사한 약제는 모두 SeV 탑재 유전자의 발현을 억제하는 것이 판명되었다. 조사한 약제는 크게 3개의 그룹으로 분류되었다. 1) 아스피린과 동일하게 SeV의 전사 복제를 억제하는 동시에, 세포상해성을 감약시키는 케토프로펜, 2) SeV의 전사 복제를 억제하지만 그 농도에서는 세포상해성을 중간 정도로 야기하는 플루비프로펜 및 인도메타신, 3) SeV의 전사 복제를 억제하고 세포상해성 야기가 현저한 디클로페낙 나트륨, 메페남산 및 파파베린의 3 그룹으로 분류되었다(도 10~11). 이들 결과로부터 작용 메커니즘면에서의 상이도 예상되지만, 많은 NSAIDs에서 SeV의 전사 복제 억제는 달성되는 것이 명확해졌다. 또한, SeV 탑재 유전자 발현의 조절이라는 관점에서는 SeV의 전사 복제를 억제하는 동시에 세포상해성을 감약시키는 아스피린 및 케토프로펜이 특히 유효한 성질을 가지고 있는 것으로 생각되었다. 그 이외의 약제에 관해서도 최종적으로 발현을 감약시킬 수 있었기 때문에 아스피린 및 케토프로펜과 동일하게 벡터 탑재 유전자 발현 제어의 목적으로 사용하는 것이 가능한 것이 증명되었다.

[실시예 4] 작용 메커니즘의 탐색

아스피린에 의한 VSV의 증식억제의 작용 메커니즘에 관해서는 NO에 의한 항바이러스 효과가 지적되어 있다(Chen, N. et al., Virology 276, 44-51(2000)). 즉, NSAIDs의 작용점으로 생각되고 있는 시클로옥시게나아제(Cyclooxygenase; COX)의 활성저해로 인해 NO 합성효소(NO synthase; NOS)의 활성을 억제적으로 작용하는 프로스타글란딘(Prostaglandin) E2의 생산이 억제되어, 결과적으로 NOS의 활성화로부터 NO 생산항진이 생겨 VSV의 전사 복제를 저해하는 것으로 생각되고 있다. 또한, 인터루킨(interleukin)-12에 의한 VSV의 전사 복제 억제에 관해서도 NOS의 관여가 시사되어 있다(Komatsu, T. et al., Virology 259, 334-341(1999)). 따라서, NSAIDs에 의한 SeV의 전사 복제 억제에 관해서도 NO의 관여에 대해 조사하였다.

먼저, NO의 직접적인 작용의 유무를 조사하기 위해, NO제 첨가에 의해 SeV의 전사 복제 억제가 생기는지의 여부를 검토하였다. 이소소르비드 디니트레이트 (Isosorbide Dinitrate)(ISDN: Sigma, St.Louis, MO) 또는 니코란딜(Nicorandil)(Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 첨가한 경우, 현저한 전사 복제 억제는 생기지 않았다(도 12). 즉, NO에 의한 직접적인 영향은 관찰되지 않았다. 또한, 실제로 SeV의 전사 복제가 억제된 조건, 즉 5 mM 아스피린 첨가조건 또는 1 mM 케토프로펜 첨가조건에 NOS 저해제인 L-NAME(DOJINDO LABORATORIES, Kumamoto, Japan)를 동시 첨가한 경우도, L-NAME 첨가에 의한 전사 복제 억제의 회복 등은 관찰되지 않았다(도 13). 이와 같이, 본 실시예에서 관찰된 전사 복제 억제작용에 있어서는 상기 문헌에 나타내져 있는 바와 같은 NO의 관여는 지지되지 않고, 다른 작용 메커니즘을 매개로 하고 있을 가능성이 시사된다.

본 발명에 의해 비스테로이드성 항염증약 및 근이완약의 새로운 용도가 제공되었다. 이들 약제를 사용하면 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현을 제어하고, 또한 바이러스 벡터에 의한 세포상해성을 억제하는 것이 가능해진다. 본 발명은 특히 유전자 치료에 있어서 투여 벡터로부터의 바이러스 유전자 및 치료유전자의 발현을 제어하기 위해 유용하다.

Claims

비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 바이러스 벡터 도입세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 상기 바이러스 벡터가 탑재되는 유전자의 발현을 억제하는 방법.
제1항에 있어서, 바이러스 벡터에 의한 세포상해를 감약시키는 방법.
제1항에 있어서, 비스테로이드성 항염증약이 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜, 인도메타신, 디클로페낙 및 메페남산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제3항에 있어서, 비스테로이드성 항염증약이 아스피린, 케토프로펜, 플루비프로펜 및 인도메타신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제4항에 있어서, 비스테로이드성 항염증약이 아스피린 및/또는 케토프로펜인 방법.
제1항에 있어서, 근이완약이 파파베린인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터인 방법.
제7항에 있어서, 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스인 방법.
제8항에 있어서, 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 방법.
비스테로이드성 항염증약 및/또는 근이완약을 포함하는 바이러스 벡터 탑재 유전자의 발현 억제제.
제10항에 있어서, 바이러스 벡터에 의한 세포상해를 감약시키는 작용을 갖는 억제제.