KR20040030121A - 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 - Google Patents
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Abstract
매질 중에 현탁된, 기체-충진된 마이크로스피어; 기체-충진된 마이크로스피어의 표면 상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및 상기 지질 또는 계면활성제에 부착된 액체-충진된 리포좀을 포함하는 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함하는 제형이 기술된다. 이의 제조방법 및 초음파 영상화시의 이의 용도도 기술된다. 본 발명은 또한 환자에서 심장 질환, 염증, 감염, 암 또는 혈전성 질환의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
Description
초음파 영상은 환자 (예: 포유류)의 체내 구조를 영상화하여 진단 및 치료를 돕는데 유용하다. 초음파 영상화 동안에, 초음파 스캐너가 음파를 생성시키고 수용하는데 사용될 수 있다. 초음파 스캐너는 영상화될 영역 위에 겹쳐지는 신체 표면 상에 위치되고, 스캐너에 의해 생성되는 음파는 영상화 될 영역을 향한다. 이어서, 스캐너는 하부 영역으로부터 반사된 음파를 검출하고 데이터를 영상으로 번역한다. 각각의 신체내 구조의 음향 특성 (예: 밀도)를 전형적으로는 구조의 밀도 및 전송 속도에 의존할 것이다. 음향 특성의 변화는 상이한 물질 사이의 계면(즉, 고체, 액체 및 기체 사이의 계면)에서 가장 현저할 것이다. 따라서, 초음파 에너지가 상이한 물질 사이의 계면을 포함하는 영역을 향하는 경우, 물질의 상이한 음향 특성이 상이한 반사 특징을 일으킬 것이다. 상이한 구조 사이의 계면을 가짐으로써 생성되는 초음파 영상의 품질이 향상되므로, 상이한 구조 사이의 음향 특성 중의 차이를 증가시키고 초음파 영상화 동안에 생성되는 영상의 질을 향상시키는 것이 유용할 것이다.
초음파 영상의 질에 영향을 미칠 수 있는 한 가지 방법은 조영제를 신체의 맥관 구조에 도입하여 초음파 조영제로 작용하도록 하는 것이다. 조영제가 미세맥관 구조로 주입되어 관류하는 경우, 보다 선명한 영상을 얻을 수 있다. 상기 시약은 음파 반사제로서 작용하여 맥관 구조 및 기타 구조사이의 계면을 효과적으로 향상기킨다.
인트랩된(entrapped) 기체를 함유하는 액체 및 고체 조영제는 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,235,871호; 미국 특허 제4,265,251호; 미국 특허 제4,442,843호; 미국 특허 제4,533,254호; 미국 특허 제4,572,203호; 미국 특허 제4,657,756호; 미국 특허 제4,681,199호; 미국 특허 제5,088,499호; 미국 특허제5,147,631호; 미국 특허 제5,228,446호; 미국 특허 제5,271,928호; 미국 특허 제5,380,519호; 미국 특허 제5,413,774호; 미국 특허 제5,527,521호; 미국 특허 제5,531,980호; 미국 특허 제5,547,656호; 미국 특허 제5,558,094호; 미국 특허 제5,573,751호; 미국 특허 제5,585,112호; 미국 특허 제5,620,689호; 미국 특허 제5,715,824호; 미국 특허 제5,769,080호; EP 0 122 624; EP 0 727 225; WO 96/40285; 및 WO 99/65467를 참고할 것. 상기 조영제에 의해 제공된 미세 버블은 기체 미세 버블 및 주위의 액체 사이의 음향 차이에 기인한 음파 반사기로서 작용한다.
파인스타인(Feinstein)(미국 특허 제4,572,203호)은, 특정 점성 용액에 초음파를 가하여 제조된 초음파 조영제로 사용하기 위한 약 6-20 미크론 직경의 "미세 버블"을 개시한다. 파인스타인은 또한 포획된 공기를 함유하지 않고 모세관을 통과하기에 충분히 작은 유리 또는 그래파이트와 같은 고체 또는 반-고체 금속-함유 미세입자를 초음파 조영제로서 개시한다. 또한 알부민과 같은 아미노산 중합체 매트릭스로부터 형성되고, 자철광 (Fe304)과 같은 자석입자가 임베딩된 마이크로스피어가 개시된다.
티크너(미국 특허 제4,265,251호)는 공동(hollow) 기체-충진된 내부 공간를 지닌 특정 당류(saccharide) 조성물 "미세 버블" 입자의 초음파 향상제로서의 용도를 개시한다.
레이서 등(미국 특허 제4,442,843호, 미국 특허 제4,657,756호, 및 미국특허 제4,681,119호)는 초음파 영상에 사용하기 위한, 혈액 중에서 용해가능하고, 입자 사이의 공극 내에 기체를 함유하거나 입자 표면 상에 흡착된 기체를 갖거나, 입자의 내부 구조와 일체 부분으로서 기체를 함유하는 고체 물질의 미세입자 응집체 (1-50 미크론 직경)를 예시한다. 하기의 고체 재료가 사용된다: 다양한 당류, NaCl, 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 타르트산 나트륨, CaCl2및 AlCl3.
힐먼 등(EP0122624)은 초음파 조영제로 사용하기 위한 봉입된 공기를 갖는 다양한 유기 친지질성 화합물을 비롯한 고체 표면-활성 물질을 포함하는 미세입자를 포함한다. 또한 표면-활성 물질의 입자 및 염화나트륨, 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 타르트산 나트륨 및 다양한 당류와 같은 비-표면 활성 물질의 입자의 조합이 개시되어 있다.
글래쥐(Glajch) 등(미국 특허 제5,147,631호)는 인트랩핑된 기체 또는 액체를 포함하는 무기 물질 다공성 입자를 개시한다. 개시된 물질은 단량체성 또는 중합체성 보레이트, 단량체성 또는 중합체성 알루미나, 단량체성 또는 중합체성 카르보네이트, 단량체성 또는 중합체성 실리카, 단량체성 또는 중합체성 포스페이트; 및 그의 제약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 양이온성 염을 포함한다.
운거(Unger)는 진단 영상화용 퍼플루오로카본 기체-충진된 마이크로스피어 (미국 특허 제5,547,656호 및 미국 특허 제5,527,521호) 및 기체-충진된 및 기체상-전구체-충진된 리포좀 조성물, 또는 일반 및 진단 초음파 영상화용 상기 조영제의 제조 또는 사용방법을 개시한다 (미국 특허 제5,228,446호, 미국 특허 제5,585,112호, 미국 특허 제5,769,080호 및 미국 특허 제5,715,824호).
운거(미국 특허 제5,088,499호)는 기체 충진된 리포좀의 제조 및 초음파 조영제로서의 그의 용도를 개시한다. 이들은 pH, 온도, 또는 압력에 의해 활성화시킬 수 있는 기체상 전구체, 기체 및 기타 고체 및 액체 조영제를 함유하는 물질을 포함한다.
상기 운거가 개시한 물질의 경우, 봉입된 기체 버블의 리포좀성 막은 잘 알려진 인지질과 같은 양쪽성 지질 막의 유니라멜라 또는 멀티-라멜라 헤드-대-테일(head-to-tail) 구조로서 기술되어 있다(도 1 참조). 이와 같이, 운거 조성물은 액체충진된 내부가 기체로 대체된 고전적인 리포좀이다.
퀘이(Quay)는 초음파 조영제로서 낮은 Q-인자 (낮은 확산도)의 유리 기체 마이크로버블을 기술하였다(미국 특허 제5,573,751호 및 미국 특허 제5,558,094호). 이 경우에서, 퀘이는 마이크로버블의 구조 또는 조성을 개시하지 않으면서 다양한 낮은 확산도 기체의 유리 기체 마이크로버블을 개시한다.
슈나이더(Schneider) (미국 특허 제5,271,928호, 미국 특허 제5,380,519호 및 미국 특허 제 5,531,980호)는 미분된 기체의 공동 스피어 또는 구체이고 비누(tensides) 또는 계면활성제에 의해 안정화된 마이크로버블 현탁액을 개시하였다.
슈나이더 마이크로버블 특허('928,'519 및 '980)의 경우, 초음파 조영제는 기체 마이크로버블 주위에 물질 경계가 없는 마이크로버블인 것으로 개시되엇다. 슈나이더에 따르면, 상기 마이크로버블 "은 일시적인 외피에 의해 결합될 뿐"이다(미국 특허 제5,531,980호, 컬럼 1).
상기 슈나이더 마이크로버블 개시 내용('928,'519 및 '980)은 마이크로버블 자체의 바람직한 조성/구조는 언급하지 않으면서 마이크로버블-기재 초음파 조영제의 제조방법에 관한 것이다.
슈나이더(미국 특허 제5,413,774호)는 마이크로스피어-기재 초음파 조영제로서, 비히클 내에 낮은 용해도의 기체를 더욱 함유하는 리포좀성 물질 경계 층을 갖는 마이크로비히클을 개시한다. 그러나, 마이크로벌룬의 조성 또는 구조에 대해서는 기술되지 않았다; 오히려, 마이크로비히클 또는 마이크로벌룬 상의 조영제 기재를 제조하는 방법은 선택된 낮은 용해도 기체를 사용하는 것으로 기술된다.
상기 조영제는 맥관 구조의 일반적인 초음파 조영술 및 특히 심장 영상화를 목적으로 한다.
신체의 특정 기관, 계(systems), 또는 기타 영역의 영상화는 다양한 특정 질병 상태를 진단하는데 유용할 것이다. 이들의 예들은 지시된 방식으로 종양, 응혈 및 감염 영역의 특정한 영상화를 포함한다. 퀘이, 등(유럽 특허 출원 EP727225)은 원하는 분자로 혼입되어 콘쥬게이트(conjugate)를 형성하는 세포 부착 분자 (CAM) 리간드를 포함하는 조성물의 용도를 예시한다. CAM은 계면활성제 또는 알부민 담체 중에 혼입되고, 또한 체온에서 기체가 되기에 충분히 높은 증기압을 갖는 화학물질을 포함한다.
운거 (WO 96/40285)는 진단 영상화 또는 생체활성 약제의 전달을 위하여 체내에서 특정 조직으로 표적화될 수 있는 표적화된 기체-함유 리포좀을 기술한다.상기 표적화된 물질은 기체, 지질 및 표적화 리간드로 이루어진다.
상기 모든 물질은, 1) 용액 중에서 계면활성제에 의해 안정화되어 기체-액체 계면에서 표면장력이 감소된 유리 마이크로버블 (즉, 마이크로버블 표면에 고정된 물질의 외피를 갖지 않음)이거나, 또는 2)액체 매질 중의 현탁액으로서 기체 마이크로스피어를 안정화시키는 물질 경계 층을 갖는 진정 비히클인 기체 마이크로스피어 (마이크로버블로도 지칭됨)의 현탁액 또는 유화액을 포함한다. 상기 물질 모두에 있어서 한 가지 실용적인 면에서의 난점은, 적절하고, 음향적으로-활성이고, 크키가 ~0.5㎛ 내지 10㎛ 직경 범위인 기체 마이크로버블이 이들이 현탁화되는 수성 매질과 상이한 밀도를 갖는다는 점이다.
따라서, 이들 마이크로스피어는 신속하게 분리되는 경향을 갖는다 (즉, 마이크로버블 현탁액이 불균일하게 된다). 이 때문에 혼합 후 마이크로스피어의 분리가 일어나기 전에 조영물질을 신속히 사용해야 한다.
약물 전달 플랫폼(platform)으로서 사용되는 기체 마이크로스피어의 경우(운거 WO 96/40285 및 퀘이 EP0727225 참조), 상기 물질은 지질 또는 중합체의 경계층 상의 화학적 또는 물리적 흡착을 통하여 기체 마이크로스피어의 표면에 치료 부분을 혼입시킨다. 이들 물질에 있어서 실용적인 면에서의 난점은, 기체 마이크로스피어 주위의 표면 물질에 제한적인 양의 치료제가 흡수 또는 결합될 수 있다는 점이다.
앨런(Allen) 등 (미국 특허 제5,620,689호)은 리포좀 상의 폴리에틸렌 글리콜 코팅을 통하여 부착된 리포좀의 표면 상의 생체지향 그룹을 갖는 리포좀 봉입된화학치료제를 사용하여 B-세포 또는 T-세포 신생물을 치료하는 방법을 개시한다. 시이(See) 등(WO 99/65467)은 200nm 미만 직경의 약물 충진된 리포좀을 제조하는 방법을 개시한다. 이들 기재사항은 문헌에서 유사한 리포좀 약물 전달의 큰 부류를 대표하고, 이들 모두는 본원에 제공된 MSLC 조성물 형태의 기체 마이크로스피어 성분이 없는 액체-충진된 리포좀 만을 단독으로 포함한다.
상기 기술된 조영제의 사용에도 불구하고, 생성된 초음파 영상, 예를 들어, 심근 조직의 영상은, 품질이 비교적 불량하고, 매우 가변적이고, 정량화될 수 없을 수 있다. 현재까지의 전체적 진단 결과는 다소 실망스럽다. 이와 같이, 체내의 혈관 공간과 조직 사이의 콘드라스트를 개선시켜 초음파 영상의 품질을 향상기킬, 초음파 영상화에서 유용한 개선된 약제에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 그러한 조영제는 묽은 수성 현탁액 중에 있는 경우 우수하고 안정한 음향 반응 특성을 가져야 한다. 추가로, 조영제는 최소한의 마이크로스피어 부유 및 분리를 나타내어야 한다.
체내의 혈관 공간과 조직의 윤곽을 개선시켜 초음파 영상의 품질 및 선명도를 향상시키는 초음파 영상화제에 대한 필요성이 있어 왔으며 계속된다. 또한, 정상 조직에 대해서 높은 독성을 나타내어 결과적으로 불량한 치료 지수를 나타내는 많은 약물에 대하여 병리적 부위로의 약물 전달 제어에서의 개선점이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 초음파 영상화의 콘트라스트 향상 및 초음파 (즉, 음향적으로) 자극된 약물 방출을 위한 제형을 제공한다. 상기 제형은 묽은 수성 현탁액 중에 있을 경우 우수하고 안정한 음향 반응 특성을 지닌 안정한 기체 마이크로스피어 (즉, 미세하게 분리된 기체 버블) 현탁액을 제공한다. 상기 제형은 기체-충진된 마이크로스피어를 통하여 공지의 제형에 비하여 보다 높은 농도의 활성 약물을 소정의 조직으로 전달함으로써, 병리 영역에서 약물 또는 유전자의 높은 국소 농도의 의도된 치료 이점을 달성할 수 있다. 상기 제형은 양호한 초음파 산란 특성을 지니며, 이는 혈관 공간 내에서 초음파 후방산란 신호의 선택적 증가를 일으킨다. 혈관 공간 내에서 초음파 후방산란 신호의 증가는 주위의 고체 조직에 대한 콘트라스트를 개선시킨다. 추가로, 상기 제형은 최소한의 마이크로스피어 부유 및 분리를 나타낸다.
본 발명은 매질 중에 현탁된 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC)를 포함하는 제형을 제공한다. 상기 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체는 기체-충진된 마이크로스피어; 상기 기체-충진된 마이크로스피어의 표면상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및 상기 지질 또는 계면활성제에 부착된 액체-충진된 리포좀을 포함한다.
본 발명은 또한 초음파 영상화가 필요한 환자(예: 포유류)에서의 초음파 영상화 방법을 제공한다. 상기 방법은 효과량의 본 발명의 제형을 환자 (예: 포유류)에게 투여하고; 기체-충진된 마이크로스피어 복합체가 순환하기에 충분한 시간을 주어 표적화된 영역에 이르도록 하고; 환자(예: 포유류)에 대해 초음파 영상화를 수행하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 심장 질환, 염증, 감염, 암 또는 혈전성 질환의 치료가 필요한 환자 (예: 포유류)에서 상기 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 액체충진된 리포좀이 독립적으로 치료제를 포함하는 본 발명의 제형의 효과량을 환자 (예: 포유류)에게 투여하고; 기체-충진된 마이크로스피어 복합체가 순환하기에 충분한 시간을 주어 표적화된 영역에 이르도록 하고; 병리적 영역에서 마이크로스피어 리포좀 복합체로부터 치료제가 방출되기에 충분한 초음파 에너지를 환자(예: 포유류)의 표적화된 영역에 가하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 제형의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 계면활성제 및 지질을 포함하는 수용액에서 리포좀의 현탁액을 접촉시키는 단계; 및 상기 현탁액을 제형을 제공하기에 충분한 25 ℃ 및 1 atm의 물에서 약 1.0% (v/v) 미만의 용해도를 갖는 기체와 혼합하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 제형의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 치료제 및 하나 이상의 계면활성제 또는 지질을 포함하는 수용액에서 리포좀의 현탁액을 접촉시키는 단계; 및 상기 수성 리포좀 현탁액을 제형을 제공하기에 충분한 25 ℃ 및 1 atm의 물에서 약 1.0% (v/v) 미만의 용해도를 갖는 기체와 혼합하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 제형을 제조하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 하나 이상의 계면활성제 및 지질, 및 액체-충진된 리포좀을 포함하는 수용액을 포함하는 용기; 및 25 ℃ 및 1 atm의 물에서 약 1.0% (v/v) 미만의 용해도를 갖는 기체를 상기 수용액에 도입하는 수단을 포함한다.
본 발명은 또한 심장 질환, 염증, 감염, 암 또는 혈전성 질환의 치료가 필요한 환자 (예: 포유류)에서 상기 질병을 치료하는 약제를 제조하기 위한 본 발명의 제형의 용도를 제공한다. 상기 제형은, 매질 중에 현탁된, 기체-충진된 마이크로스피어; 기체-충진된 마이크로스피어의 표면상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및 상기 지질 또는 계면활성제에 부착된 액체-충진된 리포좀을 포함하는 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함한다.
본 발명은 또한 초음파 영상화가 필요한 환자 (예: 포유류)에서 상기 초음파 영상화를 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 제형의 용도를 제공한다. 상기 제형은 매질 중에 현탁된, 기체-충진된 마이크로스피어; 기체-충진된 마이크로스피어의 표면상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및 상기 지질 또는 계면활성제에 부착된 액체-충진된 리포좀을 포함하는 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함한다.
본 발명은 또한 진단 영상화가 필요한 환자 (예: 포유류)에서 상기 진단 영상화를 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 제형의 용도를 제공한다. 상기 제형은 매질 중에 현탁된, 기체-충진된 마이크로스피어; 기체-충진된 마이크로스피어의 표면상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및 상기 지질 또는 계면활성제에 부착된 액체-충진된 리포좀을 포함하는 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1는 기체-충진된 리포좀을 예시한다.
도 2는 본 발명의 단층 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC)를 예시한다.
도 3은 본 발명의 다층 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC)를 예시한다.
발명의 상세한 설명
도 2 및 3을 참조하면, 본 발명은 수성 매질 (2)에 분산된 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC) (1)를 제공한다. 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC) (1)은 적합한 비활성 기체 (4)로 기체-충진된 마이크로스피어 (3)를 포함한다. 지질 (5) 및/또는 계면활성제 (6)는 기체-충진된 마이크로스피어 (3)의 표면 (12) 상에 흡착된다. 액체-충진된 리포좀(LFLs) (7)은 지질 (5) 및/또는 계면활성제 (6)에 부착된다. LFL (7)은 LFL (7)의 액체 내부 (10)에 치료제 (8) 또는 진단 시약 (9)을 포함할 수 있다. 또한, 표적화 잔기 (11)는 LFL (7)의 표면 (13)에 부착될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC)" (1)은 기체-충진된 마이크로스피어 (3)의 외부 표면 (12) 상에 흡착된 하나 이상의 지질 (5) 및 계면활성제 (6)를 가지며, 또한 지질 (5) 또는 계면활성제 (6)에 부착된 액체-충진된 리포좀을 갖는 기체-충진된 마이크로스피어 (3)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "계면활성제" (6)는 용액에서 계면 장력을 감소시키는 임의의 이온성 또는 비이온성 물질을 지칭한다. 용어 계면활성제 (6)는 기체-충진된 마이크로스피어 (3)와 그 주위의 수성 매질 (2) 사이의 계면 장력을 감소시킬 수 있는 중합체 및 약 1,000 분자량 미만의 양쪽성 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "액체 충진된 리포좀(LFL)"(7)은 액체 내부 (10) (즉, 내부 용적 중의 액체)를 함유하는 리포좀을 지칭한다. 액체 충진된 리포좀 (7)은 유니라멜라 (14), 바이라멜라 (15), 또는 멀티라멜라 (16)일 수 있다. 액체 충진된 리포좀 (7)은 흡착된 액체 또는 계면활성제(6)에 전형적으로는 연속적인 방식으로 결합된다. 각각의 액체 충진된 리포좀 (7)은 액체 충진된 리포좀(7)의 액체 내부 (10)에 치료제 (8) 또는 진단 시약 (9)을 독립적으로 함유할 수 있다. 추가로, 각각의 액체 충진된 리포좀 (7)은 액체 충진된 리포좀(7)의 표면 (13)에 결합된 높은 친화도의 표적화 잔기 (11)를 독립적으로 함유할 수 있다.
지질 (5) 또는 계면활성제 (6) 코팅된 기체-충진된 마이크로스피어 (3) 표면에 부착된 액체-충진된 리포좀 (7)과 관련하여, 본원에 사용된 바와 같은, "연속적(continuous)" 또는 "지속적(contiguous)"은 기체-충진된 마이크로스피어 (3)의 외부 표면 (12)의 상당한 부분 (예: 약 50% 이상)이 액체-충진된 리포좀 (7)로 덮인 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "표적화 잔기(targeting moiety)"는 수용체, 효소, mRNA 또는 DNA에 대하여 높은 친화도를 갖는 생체적합성 유기 분자, 생체적합성 무기 분자, 단백질, 펩티드, 펩티드 모방물질, 다당류 또는 기타 분자를 지칭한다. 생체적합성 유기 분자, 생체적합성 무기 분자, 단백질, 펩티드, 펩티드 모방물질, 다당류 또는 기타 분자는 그 주위의 정상 조직에 대하여 생체내 병리 부위에서 그의 표현이 변경된다. 추가로, 상기 표적화 잔기는 원칙적으로 액체-충진된 리포좀 (7)의 표에 결합되거나 부착된다.
본원에 사용된 바와 같은, "높은 친화도"는 단일 표적화 잔기 및 생물학적 표적 (예: 수용체, 효소, mRNA, 또는 DNA)의 상호작용에 대한 해리 상수, Kd로 표현한 경우 약 1μm 미만의 결합 친화도를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "환자"는 소정의 질병 또는 질환을 앓고 있거나, 특정 질병 또는 질환에 대한 치료가 필요한 개체를 지칭한다. 적합한 환자는 예를 들어 동물을 포함한다. 적합한 동물은 예를 들어 포유류를 포함한다. 적합한 포유류는 예를 들어 인간을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 치료 ("treating" 또는 "treatment")는 환자에서 질병 또는 질환을 치료하는 것을 지칭하며, (i) 특히 질병 또는 질환에 걸리지 쉬우나(predisposed) 아직 그 질병 또는 질환을 가지고 있다고 진단되지는 않은 경우에, 환자에서 질병 또는 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (ii) 질병 또는 질환을 억제하는 것, 즉, 그의 진행을 저지하는 것; 및/또는 (iii) 질병 또는 질환을 완화시키는 것, 즉, 질병 또는 질환의 위축을 일으키는 것을 포함한다.
기체-충진된 마이크로스피어
본원에 사용된 바와 같은, "기체-충진된 마이크로스피어"는 대략 매질의 어는 점 보다 높으면서 대략 매질의 비점 보다 낮은 온도 및 약 0 atm 압력 보다 높으면서 약 5 atm 압력 보다 낮은 압력(예: 표준 온도 및 압력)에서 공칭(nominal) 구형을 갖는, 매질 중에 현탁된 마이크로버블이다.
도 2 및 도 3에 예시한 바와 같이, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (1) (MSLC)는 기체-충진된 마이크로스피어 (3)를 포함한다. 기체-충진된 마이크로스피어 (3)는 전형적으로 음향적으로 활성이다. 기체-충진된 마이크로스피어 (3)는 전형적으로 25 ℃ 및 1 atm의 물에서 약 1.0% (v/v) 미만의 용해도를 갖는다. 추가로, 기체-충진된 마이크로스피어 (3)은 전형적으로 약 0.1㎛ 내지 약 10㎛의 평균 입경을 갖는다. 바람직하게는, 기체-충진된 마이크로스피어 (3)는 약 0.5㎛ 내지 약 10㎛의 평균 입경을 갖는다.
기체-충진된 마이크로스피어 (3)는 전형적으로 하나 이상의 적합한 비활성 기체 (4)를 포함한다. 본 발명의 적합한 비활성 기체 (4)는 초음파 조영제 분야에 공지되어 있다. 본 발명에 유용한 적합한 비활성 기체 (4)는 예를 들어, 운거, 등(미국 특허 제5,547,656호; 미국 특허 제5,527,521호; 미국 특허 제5,228,446호; 미국 특허 제5,585,112호; 미국 특허 제5,769,080호; 및 미국 특허 제5,715,824호), 퀘이, 등(미국 특허 제5,573,751호 및 미국 특허 제5,558,094호) 및 슈나이더 (미국 특허 제5,271,928호; 미국 특허 제5,380,519호; 및 미국 특허 제5,531,980호)에 개시되어 있다. 이들은 기체 및 기체상 전구체(즉, 감압 또는 승온 하에 기체상으로 전이되는 액체)를 둘 다 포함 할 수 있다. 바람직한 비활성 기체 (4)는 혈중 용해도가 낮고, 비-반응성, 비-대사가능성 이고/이거나 환자 (예: 포유류)에서 비독성이다. 본 발명에서 유용한 적합한 비활성 기체 (4)는 예를 들어 퍼플루오로카본 기체 (예: (C2-C6) 퍼플루오로카본), 퍼플루오로에테르 기체, 질소, 및 0족(noble) 기체 (예: 헬륨, 아르곤, 및 네온)을 포함한다.
기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC)
기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (1)는 기체-충진된 마이크로스피어 (3); 기체-충진된 마이크로스피어 (3)의 외부 표면 (12)상에 흡착된 하나 이상의 지질 (5) 및 계면활성제 (6); 및 지질 (5) 또는 계면활성제 (6)에 부착된 액체-충진된 리포좀 (7)을 포함한다. 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (1) (MSLC)는 전형적으로 평균 직경이 약 0.1㎛ 내지 약 10㎛이다. 바람직하게는, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (1)는 약 0.2㎛ 내지 약 4㎛의 평균 직경을 가질 것이다. 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (1)는 전형적으로 매질 (2) 밀도의 약 0.90 내지 약 1.10의 밀도를 갖는다. 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (1) (MSLC)는 2종 이상의 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (1)의 응집체 형태로 존제할 수 있다. 응집체는 전형적으로 약 1㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 가질 것이다.
지질 및 계면활성제
도 2 및 도 3에 예시한 바와 같이, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC) (1)는 기체-충진된 마이크로스피어 (3)의 외부 표면 (12)상에 흡착된 하나 이상의 지질 (5) 및 계면활성제 (6)를 포함한다. 지질 (5) 또는 계면활성제 (6)는 기체-충진된 마이크로스피어 (3)의 외부 표면 (12)상에서 단분자 층, 2-분자 층, 또는 다(multi)-분자 층으로서 존재할 수 있다. 계면활성제 (6)는 기체-충진된 마이크로스피어 (3)의 외부 표면 (12)에 신속하게 흡착함으로써 낮은 용해도의 비활성 기체 (4) 또는 기체들의 표면 장력을 감소시킨다. 추가로, 계면활성제 (6)은 LFL (7)이 결합할 수 있는 계면으로서 작용한다.
계면활성제 (6)는 임의의 적합한 비-이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 또는 음이온성 계면활성제가 될 수 있다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 셀룰로즈, 젤라틴, 크산틴 검, 펙틴, 및 덱스트란을 포함한다. 적합한 양이온성 계면활성제는 예를 들어 테트라알킬 암모늄, 테트라알킬 포스포늄, 또는 그의 적합한 염을 포함한다. 적합한 양이온성 계면활성제는 예를 들어 테트라헥실 암모늄, 테트라데실 암모늄, 테트라부틸 암모늄, 테트라헥실 포스포늄, 테트라데실 포스포늄, 테트라부틸 포스포늄, 테트라페닐 포스포늄, 및 그의 적합한 염을 포함한다. 적합한 음이온성 계면활성제는 예를 들어 알킬 술포네이트, 알킬 카르복실레이트, 및 그의 적합한 염을 포함한다. 적합한 음이온성 계면활성제는 예를 들어 도데실 술페이트, 팔미틸 술페이트, 도데실 카르복실레이트, 팔미틸 카르복실레이트, 및 그의 적합한 염을 포함한다.
적합한 지질 (5)은 예를 들어 인지질, 글리코지질, 트리글리세라이드 및 지방산을 포함한다. 적합한 인지질은 예를 들어 디팔미토일포스파티딜 콜린 클로라이드, 디미리스토일포스파티딜 콜린, 디라우리오일포스파티딜 콜린, 및 디올레일포스파티딜 콜린을 포함한다.
액체-충진된 리포좀(LFLs)
도 2 및 도 3에 예시된 바와 같이, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (1) (MSLC)는 지질 (5) 또는 계면활성제 (6)에 연결된 액체-충진된 리포좀 (7)(LFLs)을 포함한다. 액체-충진된 리포좀 (7)의 존재는 계면활성제-봉입된 또는 지질-봉입된 기체-충진된 마이크로스피어 (3)를 안정화시킨다. 하나 이상의 액체충진된 리포좀(7)은 전형적으로 현탁액(2)의 매질(즉, 매질 (2))로 부터의 매질을 포함할 것이다. 바람직하게는, 각각의 액체-충진된 리포좀 (7)은 전형적으로 현탁액의 매질 (2)로 부터의 매질을 포함할 것이다. 액체-충진된 리포좀 (7)의 액체 내부 (10) (예: 인터벌(interval) 부피)에 현탁액의 매질 (2)로 부터의 매질이 존재하면, 현탁액 (2)의 매질의 밀도와 근접한 (예: 약 20% 이내)의 밀도를 가지는 마이크로스피어 조성물을 제공하며, 이로 인해 마이크로스피어의 부유 및/또는 분리를 최소화한다.
LFLs (7)은 액체-충진된 내부 부피 중에 하나 이상의 약물 (예: 치료제 (8) 및/또는 진단 시약 (9))을 함유할 수 있다. LFLs (7)이 계면활성제-코팅된 또는 지질-코팅된 기체-충진된 마이크로스피어 (3)에 부착되어 있기 때문에, LFLs (7)은 내부 기체를 초음파 자극시킬 때 터짐으로써 질병 기관 또는 조직에서 하나 이상의 약물 (예: 치료제 (8) 및/또는 진단 시약 (9))을 방출시킨다. 액체-충진된 리포좀 (7)은, 그러나, 그 자체로는 제한된 음향 활성을 갖는다.
LFLs (7)은 계면활성제-봉입된 또는 지질-봉입된 기체-충진된 마이크로스피어 (3)에 부착하여 안정화시킨다. 이는 현탁액 (2)의 매질의 밀도와 근접한 (예: 약 20% 이내) 밀도를 가지는 MSLCs (1)을 제공함으로써, 기체 마이크로스피어의 부유 및/또는 분리를 최소화한다. 이는 또한 제조후에 합리적인 시간 (예: 약 30 분 이하)에 걸쳐서 크기 분포가 비교적 균일한(예: 약 1㎛ 내지 약 5㎛) 기체 마이크로스피어 현탁액을 제공한다.
액체-충진된 리포좀 (7)은 전형적으로 마이크로스피어 표면 영역의 약 50%를초과하여 차지한다. 액체-충진된 리포좀 (7)은 또한 전형적으로 흡착된 지질 (5) 또는 계면활성제 (6)에 본질적으로 연속적인 방식으로 부착된다. 이러한 배열은, MSLCs (1)에 대하여 우수한 부유 특성을 제공하여, 이는 묽은 수성 현탁액 중에 있을 경우 우수하고 재현성있는 음향 반응 특성을 지닌 비교적 안정한 현탁액을 제공한다.
LFLs (7)의 크기는 비교적 중요하다. 액체-충진된 리포좀 (7)은 바람직하게는 기체충진된 마이크로스피어 (3) 직경의 약 10% 미만의 직경을 가져야 한다. 대부분의 생체내 초음파 영상화제 또는 약물 전달제의 가장 관심이 되는 범위는 전체 직경이 약 1㎛ 내지 약 5 ㎛이고, lOOnm 미만의 직경의 액체-충진된 리포좀 (7)으로부터 제조되는 MSLC (1)이다. 보다 큰 액체-충진된 리포좀 (7) (예: 약 0.2㎛ 초과의 직경)은 체내 모세혈관의 직경을 넘는 전체 직경을 지닌 MSLC (1)를 생성한다. 이는, 모세혈관 막힘과 관련한 위험한 상황을 일으킬 뿐 아니라 혈액의 조직으로의 미세순환을 차단하는 것과 관련된 결과적인 생물학적 독성을 일으킨다. 따라서, 약 100nm 미만의 직경의 LFLs (7)를 사용하여 살아있는 환자 (예: 포유류)에서 안정하게 사용될 수 있는 적절한 크기(dimensions)를 갖는 MSLCs (1)을 제조하는 것이 매우 바람직하다. 각각의 액체-충진된 리포좀 (7)은 전형적으로 약 10nm 내지 약 200nm의 직경을 갖는다. 바람직하게는, 각각의 액체-충진된 리포좀 (7)은 직경이 약 20nm 내지 약 100nm이다. 또한, 각각의 액체-충진된 리포좀 (7)은 전형적으로 직경이 기체-충진된 마이크로스피어 (3) 직경의 약 10% 미만일 것이다.
도 2 및 도 3에 예시된 바와 같이, 하나 이상의 LFLs (7)은 하나 이상의 적합한 약물 (예: 치료제 (9) 및/또는 진단 시약 (9))을 액체-충진된 내부 부피에 포함할 수 있다. 각각의 액체-충진된 리포좀 (7)은 독립적으로 액체-충진된 리포좀 (7)의 액체 내부 (10)에 하나 이상의 약물 (예: 치료제 (8) 및/또는 진단 시약 (9))을 포함할 수 있다. LFLs (7)은, 계면활성제-코팅된 또는 지질-코팅된 기체-충진된 마이크로스피어 (3) 표면에 부착되는 경우, 초음파 자극시에 터져서 하나 이상의 치료 약물 (예: 치료제 (8))을 질병에 걸린 기관 또는 조직에 국소적이고 농축화된 방식으로 방출한다. 높은 에너지 초음파는 일반적으로 기체-충진된 마이크로스피어 (3)가 신속하게 팽창하고 수축하도록 하여 궁극적으로는 기체 버블 파열을 일으킨다. 기체-충진된 마이크로스피어 (3)에 의해 포획된 초음파 에너지는 MSLC (1)를 절단시키고, 파열시킴으로써, 차례로, MSLC (1)의 표면에 부착된 LFLs (7)의 내부에 함유된 하나 이상의 약물 (예: 치료제 (8))을 방출시킨다.
적합한 부류의 치료제 (8)는 예를 들어 항응고제, 혈전제, 항종양제, 및 항염증제를 포함한다. 적합한 특정 치료제 (8)는 예를 들어 (PCT/US99/13682)에 기재되어 있고, 예를 들어 독소루비신, 시클로포스파미딘, 아디아마이신, 메토트렉세이트, 젬시타빈, 나벨빈, 시스플라틴, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인테그랄린, 록시피반, 메토트렉세이트 및 엔브렐을 포함한다. 초음파 자극된 약물 방출을 위한 본 발명의 바람직한 실시태양에서, MSLCs (1)는 치료 지수 및 기체 마이크로버블 당 전달되는 약물의 양을 최대화하기 위하여 LFLs (7)의 용액 중에 높은 친화도의 표적화 잔기 (11) 및 치료 약물 (예: 치료제 (8))을 둘 다 포함한다.
적합한 부류의 진단 시약 (9)은 예를 들어 X-레이 조영제 및 MRI 조영제를포함한다. 적합한 특정 진단 시약 (9)는 예를 들어 비-이온성 요오드화된 X-레이 조영제, 이온성 요오드화된 X-레이 조영제, 가돌리늄 함유 MRI 조영제, 철 함유 MRI 조영제, 및 망간 함유 MRI 조영제를 포함한다.
LFLs 중에 진단 시약 (9)을 사용하면 1종의 MSLC 조성물을 사용하여 초음파 영상 향상 (예: 후방 산란) 및 X-레이 또는 MRI 영상 향상을 달성할 수 있을 것이다.
하나 이상의 약물 (예: 치료제 (8) 및/또는 진단 시약 (9))을 선택된 병리적 상태로 표적화 전달시키기 위하여, 본 발명의 LFLs (7)은 LFL (7)의 표면 (13)상에 공유결합되거나 흡착된 높은 친화도의 표적화 잔기 (11)로 유도체화될 수 있다. 이와 같이, 액체-충진된 리포좀 (7)은 전형적으로 액체-충진된 리포좀 (7)의 표면 (13)에 부착된 하나 이상의 적합한 높은 친화도의 표적화 잔기 (11)를 가질 수 있다. 이는 LFLs (7)가 생체내 병리 부위에서 초음파 콘트라스트를 향상기킬 수 있도록 한다. 이는 질병 부위의 이상 세포 내에서 과발현되거나 변경된 수용체, 효소, mRNA, 또는 DNA에 대한 높은 친화도를 갖는 LFLs (7) 상의 리간드를 제공함으로써 달성할 수 있다. 별법으로, LFLs (7)에 부착된 이들 표적화 잔기 (11)는, LFLs (7)에 의해 표적화된 수용체가 결여된 인접한 질병 조직에서 음향 향상이 없는 것과는 반대로 정상 조직의 선택적 영상화를 위하여 정상 조직 수용체에 결합할 수 있다. 하나 이상의 LFLs (7)는 내부 액체 매질 (10) 중에 현탁액(2)의 매질로 부터의 하나 이상의 적합한 진단 시약 (9)을 포함할 수 있다.
MSLC (1)을 특정 병리 부위로 향하게 하기 위하여 LFL (7)의 표면 (13) 상에혼입될 수 있는 적합한 높은 친화도의 표적화 잔기 (11)는 이전에 기재되었다. 지향화된 초음파 영상화제 또는 약물 전달 조성물의 계면활성제 (6) 또는 지질 (5) 성분으로 혼입될 수 있는 생물학적 표적화 잔기의 다수의 예를 제공하는 운거 (PCT/US96/09938), 앨런 (미국 특허 제5,620,689호) 및 퀘이 (EP 0727225)의 문헌을 참고할 것. 이들 중에는 세포 부착 분자 등과 같은 종양 특정 항체, 수용체-특정 펩티드 및 펩티드 모방물질이 있다.
적합한 특정 표적화 잔기 (11)는 예를 들어 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트; DPPEPEG3400-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트; 1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐 PEG3400-2-{[7-(N-히드록시카르바모일) (3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]카보닐아미노}-N-(3-아미노프로필) 아세트아미드; 및 1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐 PEG3400-[7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]-N-{[4(아미노메틸)페닐]메틸}카복사미드를 포함한다.
본 발명에 사용되는 액체-충진된 리포좀 (7)은 당분야에 공지되어 있다. 본 발명에 사용하기 위한 리포좀을 제조하는데 바람직한 물질 중에는, 자연상태에서 양이온성, 음이온성 또는 쯔비터이온성일 수 있는 인지질이 있으며, 혼합물로 사용될 수 있다. 리포좀의 조성물 및 제조에 관해서는 많은 문헌이 있다. 예를 들어, 뉴(New) (R.R.C. New, editor, Liposomes, a practical approach, Oxford University Press, Oxford, UK, 1990), 티렐("New Aspects of Liposomes", D.A.Tyrrell, T.D. Heath, C.M. Colley & B.E. Ryman, Biochimica & Biophysica Acta, 457 (1976), 259-302), 슈나이더 (US 특허 제4,224,179호), 우들 (MC Woodle and D. Papahajopoulos, Methods in Enzymology 171, 193, 1989)을 참고할 것. 특히, 파파하죠풀로스 (US 특허 제4,235,871호)는 치료체를 포함하는 LFL를 제조하는 방법을 기술하었다.
MSLC 평균 크기 분포 및 안정도의 제어
MSLC의 크기 및 안정도는 몇 가지 파라미터, 예를 들어, 용액 중의 지질 농도; LFLs의 직경; 조성물에 포함된 중합체 계면활성제(예: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG))의 분자량; 및 사용된 중합체의 농도를 통하여 제어될 수 있다.
1. 용액 중의 인지질 농도
지질 농도를 변화시키면 액체 충진된 리포좀의 크기 분포 및 안정도를 제어할 수 있고, 따라서, 이는 차례로 현탁액 중에서 형성되어 안정화되는 MSLC의 크기를 조정할 수 있다. 현탁액 중의 안정화된 MSLC의 평균 크기는 초기 LFLs의 농도 및 크기에 직접적으로 비례한다. LFL의 수 및 크기가 이용가능한 지질 (예: 인지질)의 양에 의존하기 때문에, 초기 지질 농도는 현탁액 중에서 안정화된 MSLC의 수 및 크기 분포에 직접적으로 영향을 미친다.
2. LFL의 직경
지질 (예: 인지질) 농도와 무관하게, 현탁액 중의 MSLC의 크기는 물리적 수단을 통하여 LFL 크기를 변경시킴으로써 변화될 수 있다. LFL의 크기는 리포좀 과학 분야에서 공지된 압출 또는 초음파와 같은 방법에 의해 변화될 수 있다(예를 들어, R.R.C. New, editor, Liposomes, a practical approach, Oxford University Press, Oxford, UK, 1990 참조). 상기한 바와 같이, LFL 크기의 변화는 MSLCs 크기 분포의 변화를 일으킨다(즉, 약 100nm 미만의 크기 범위의 보다 작은 LFLs는 약 10㎛ 미만의 범위의 보다 작은 MSLC를 생성시킨다).
3. 조성물에 사용된 계면활성제의 분자량
제조시의 중합체성 계면활성제 (이온성 또는 비-이온성)의 분자량은 형성된 MSLCs의 평균 직경에 영향을 주도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 보다 높은 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은, 조성물의 기타 성분/지질에 공유결합하거나 또는 용액 중의 유리(free) PEG로서에 첨가되거나, 일단 기체가 시스템에 도입되면 보다 큰 크기의 기체상 마이크로버블-함유 MSLC를 안정화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, PEG의 분자량을 500에서 10,000으로 변화시킴으로써, MSLC 직경이 조정될 수 있다.
4. 중합체의 농도
MSLC의 크기는 리포좀성 현탁액 중의 중합체 계면활성제의 농도를 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 조성물 중 중합체 농도의 증가는 전형적으로 현탁액 중의 MSLC 평균 크기 및/또는 농도를 증가시킨다.
기체 마이크로스피어 리포좀 복합체의 제조
본원에 기술된 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLCs)는 낮은 수용해도의 기체를 현탁액 중의 액체-충진된 리포좀 및 계면활성제를 함유하는 수용액과 혼합하여 제조될 수 있다. 이는 기계적 혼합, 초음파 또는 계면활성제 및 LFLs를 함유하는 액체로 기체를 고속 주입하여 달성할 수 있다.
초기 LFL을 형성하기 위하여, 인지질은 벌크 수용액 중에 현탁화될 수 있으며, 비경구적으로 적합하다면(즉, 비독성이라면), 표면 활성 물질, 뿐 아니라 비-수성 성분(예: 글리세롤 또는 프로필렌 글리콜), 또는 현탁 보조제 (예: 다당류, 단백질 또는 합성 중합체)를 더욱 포함할 수 있다. LFL을 제조하기 위하여 본 발명에서 사용되는 방법은 우들 (M. C. Woodle and D. Papahajopoulos, Methods in Enzymology 171,193, 1989)에 의하여 이전에 기술되었다.
MSLC의 생체표적화가 요구되면, LFL는 액체-충진된 리포좀의 표면에 공유결합되거나 흡착된 높은 친화도의 표적화 잔기를 가질 수 있다. 표적화 잔기는 MSLC의 표면에 흡착되거나, 더욱 바람직하게는, 인지질 에스테르로서 LFL에 공유 결합되거나 MSLC의 PEG 성분에 부착된다(앨런 미국 특허 제5,620,689호 참조). 초음파 자극된 약물 방출을 위한 MSLCs의 경우에는, LFL은 약물을 포함하는 계면활성제-함유 수성 매질 중에서 리포좀을 제조한 후 상기 매질을 적절한 비활성 기체와 함께 혼합하거나 초음파를 가함으로써 리포좀의 내부 액체 부피 중에 치료제를 포함시키도록 제조될 수 있다.
약 100 nm 미만의 크기 범위로 LFL 직경을 제어하는 것은, 초음파 영상화 및 초음파 자극된 약물 방출을 위하여 원하는 크기 범위(예: 약 0.5 ㎛ 보다 크고 약1O ㎛ 보다 작은 직경)의 MSLC를 제조하고 안정화시키는데 중요하다, LFL의 크기를 제어하는 방법은 문헌(예: R.R.C. New, editor, Liposomes, a practical approach, Oxford University Press, Oxford, UK, 1990, pp. 36-85 참고)에 기재되어 있다. 쿡, 등(미국 특허 제4,533,254호)에 기술된 바와 같이, 원하는 크기의 LFL를 제조하기 위해서는 미세유체화 기법이 특히 효과적이다.
구조의 입증
신규한 구조 (기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC)로 지칭됨)의 존재를 입증하기 위해, 실시예 1에 기술된 리포좀 시스템을 제조하여, 4가지 기법, 광학 현미경법, 투과 전자 현미경법, 형광 프로브법 및 소프트(Soft) X-레이 현미경법을 사용하여 분석하였다. 이들 기법은 거대구조 (약 1 ㎛ 보다 큰 크기), 미세구조 (10 nm 내지 ~ 1000nm), 및 화학 시스템의 미세환경(분자 수준에서)에 대한 정보를 제공한다.
광학 현미경법
광학 현미경법은 물체의 크기 및 형태를 미크론 범위로 결정할 수 있도록 해 준다. 따라서, 약 1 내지 약 10 ㎛ 직경 범위의 MSLC 조성물은 1000X 현미경을 사용하여 볼 수 있으며, 약 1 내지 약 10 mm 직경의 크기로 확대된 크기를 갖는다. 광학 현미경법은 MSLC가 형태적으로 구형이고, 직경이 약 1 내지 약 10 ㎛의 크기 범위로 존재한다는 것을 보이기 위하여 수행되었다.
MSLC 현탁액 (예를 들어, 실시예 1에서 기술된 바와 같은)을 제조한 후, 시린지 (B-D 5 cc 시린지 및 정밀도 가이드 22 1/2 G 니들; 0.70 mm x 40 mm)를 사용하여 바이알로부터 약 0.5mL를 서서히 꺼냈다. 샘플을 행잉 드롭 슬라이드(Hanging Drop Slide) (18 mm 직경; 0.5 mm 깊이) 상에 위치시키고, 커버 슬라이드로 덮었다. 이어서 현미경 오일 한 방울을 커버 슬라이드 상에 놓았다. 샘플을 전체적으로 1000X의 배율이 되는 10X 접안경 및 오일 임머젼 아크로마틱 (Immersion Achromatic) 100X 대물렌즈가 장착된 올림푸스(Olympus) BHA-P 현미경으로 검사하였다. 결과 사진은 1㎛ 보다 크고 10 ㎛ 미만인 크기 범위의 구형 물체를 보여주었다. 대략 2㎛ 보다 큰 직경의 기체 충진된 MSLC는 보다 작은 1차 MSLC 단위의 응집체인 것으로 보인다.
전자 현미경법
MSLC의 표면상에 LFL이 존재하는 것은 투과 전자 현미경법 (TEM)을 사용하여 증명되었다. 투과 전자 현미경법은 전자 빔을 사용하여 시편을 비춘다. 전자 빔은 고진공에서 작동되고, 1,000,OOOX 까지 확대할 수 있다. 고진공 및 전자 빔은 둘 다 연구되는 시스템에 손상을 줄 수 있다. 따라서, 많은 샘플을 조사하기 위해서는, 이들은 얇고, 건조되고 통상적으로 콘트라스트 염색을 함유해야 한다.
리포좀 구조를 검사하는 한 방법은 음성 염색법(negative staining)이다. 음성 염색법은 전자 밀도가 높은 물질 중에 시편을 둘러싸거나 임베딩시켜 구조의 영상을 향상기킨다. 샘플은 기체 및 계면활성제-리포좀 혼합물 함유 수성 시스템을 혼합하기 전 뿐 아니라 혼합 후에 포스포텅스텐산 (PTA)을 염료로 사용하여, TEM 하에서 검사하여 MSLC 형성을 증명한다.
기체와 혼합하기 전의 계면활성제-LFL 시스템("비활성" 샘플)에 대해서는,미리활성화시킨 시스템 6 방울을 1 ml의 0.3% PTA 염료에 가하고, 가볍게 흔든다. 혼합물을 5 분 동안 흔들리지 않게 방치하고, 이어서 한 방울의 혼합물을 그리드 플레이트에 도포한다. 그리드를 TEM 연구 용 그리드 운반 케이스로 옮기기 전에, 한 장의 여과지 상에서 30 분 동안 공기 건조시킨다.
MSLC 샘플 (기체와의 혼합 후)에 대해서는, 한 방울을 1 mL의 0.3% PTA 염료에 가하고, 가볍게 혼합한다. 이어서, 용액 한 방울을 그리드에 도포한다. 과량의 용액을 흡입 및 공기 건조로 제거한다.
TEM 사진은 퍼플루오로카본 기체와 혼합 전의 조성물이 약 50nm 내지 약 100nm의 리포좀을 함유한다는 것을 나타낸다. 혼합 후 MSLC 현탁액 (퍼플루오로카본 기체와 혼합 후)의 TEM 사진은 표면을 따라 약 50nm 내지 약 100nm의 리포좀 단위를 갖는 지질 또는 계면활성제 쉘을 지닌 기체-충진된 마이크로스피어 보이드를 포함하는 약 300 nm 내지 약 1000nm의 MSLC을 나타낸다.
형광 분석
형광 프로브 실험은 리포좀 시스템의 일반적인 화학 특성을 연구하는데 사용된다. 형광 프로브는 형광발색단이고, 전형적으로 파이렌인데, 리포좀의 특정 영역에서 국소화되고 형광 방출에 의한 에너지의 광자에 반응한다. 이 방출은 시스템 중의 형광발색단의 국소화된 농도 및 미세 환경 (미세 극성)을 결정하는데 사용될 수 있다.
상기 실험을 위하여, 대조군 매질 (계면활성제 또는 액체-충진된 리포좀이 없는 용액)의 바이알, 계면활성제 및 액체-충진된 리포좀 (퍼플루오로카본 기체와혼합하기 전)의 바이알, 및 현탁액 중의 MSLC 함유 바이알(퍼플루오로프로판으로 조성물을 고속혼합한 후)에 파이렌을 주입하여 파이렌 형광 스펙트라를 비교하였다. 사용된 대조군 매질은 80% 염화나트륨 용액 (9% NaCl), 10% 프로필렌 글리콜 및 10% 글리세롤로 이루여졌다. MSLC 현탁액을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다.
상기 연구의 결과는 대조군 매질 중의 파이렌의 미세 환경적 극성이 순수한 수성 환경에 용해된 파이렌과 일치함을 나타내었다. (기체 혼합 전) 계면활성제/액체-충진된 리포좀 시스템 중의 파이렌의 미세 환경 극성은 LFL의 지질 막 에서 용해된 파이렌과 일치하였다. 퍼플루오로카본 기체와 계면활성제/액체-충진된 리포좀 시스템을 고속 기계적 혼합 후, 파이렌의 국소 농도는, TEM 실험에서 관찰된 MSLC 구조와 같이, 리포좀 응집체 시스템의 존재와 일치하는 방식으로 증가하는 것으로 나타났다.
소프트 X-레이 현미경법
소프트 X-레이는 약 100 내지 약 1000 eV의 에너지를 갖는 X-레이이다. 상기 에너지는 탄소 및 산소와 같은 낮은 Z 원자 또는 칼슘과 같은 원자의 L 껍질 및 K 껍질 흡수 엣지와 잘 맞는다. 상기 X-레이 파장은 1 내지 10 nm 범위인 반면, 가시 광선의 파장은 350-700 nm이다. 이는 매우 높은 해상도의 영상화를 가능하게 한다. 소프트 X-레이 현미경법은 샘플의 파괴는 피하면서 높은 해상도를 제공한다; 상기 X-레이는 샘플에 무시할 수 있을 만한 영향을 미친다.
MSLC 현탁액은 상기 소프트 X-레이 현미경법 기법을 사용하여 연구되었다.샘플을 두 개의 실리콘 니트라이드 막 사이에서 준비하였다. 상기 막은 200 미크론 두께의 9mm x 9mm 실리콘 프레임중에서 100nm의 두께 및 3mm x 3mm 크기를 갖는다. 하나의 막을 습윤된 세포의 각각의 측면에 마운팅시킨 후, 시린지를 사용하여 MSLC 물질의 매우 소량의 액적(약 5 μ 미만이나 부피가 이로 한정되는 것은 아니다)을 막 중의 하나 상에 놓았다. 상기 실험을 위하여, 샘플을 희석하거나 전처리하지 않았다. 이어서, 습윤된 세포의 두 부분을 함께 위치시키고, 스크류로 조였다. 상기 두개의 막 사이의 샘플의 층 두께를 가시 광선 현미경을 사용하여 조사하였다. 층 두께가 적절하지 않은 경우, 스크류를 조정하여 적절한 두께를 얻었다. 습윤 세포의 리저버 슬롯(reservoir slot)으로 소량의 물 방물을 위치시켜, 샘플의 증발을 방지하였다. 리저버 슬롯을 작은 조작의 테이프로 밀봉한 후, 습윤 세포를 현미경에 마운팅시켰다.
소프트 X-레이 현미경법의 결과는 퍼플루오로프로판 기체와 고속 혼합 후 시스템이 본질적으로 경계 표면 전체를 따라서 약 50nm 내지 약 100nm의 액체-충진된 리포좀을 갖는 약 300nm 내지 약 500nm의 MSLC를 함유한다는 것을 나타낸다.
MSLC은 진단 초음파 용의 일반적 목적의 초음파 조영제로서 사용될 수 있다. 이들은 또한 MSLC의 표면 상의 액체 충진된 리포좀에 결합되거나 흡착된 생물학적 표적화 잔기를 포함함으로써 체내에서 MSLC의 선택적 국소화가 가능하도록 변형될 수 있다. 생물학적으로-표적화된 MSLC은 특정 질병 과정의 표적화된 콘트라스트 초음파 영상화에 유용하다. 또한, 이들 생물학적으로-표적화된 MSLC는 액체-충진된 리포좀 내에 봉입되고, 생체내에서 MSLC가 초음파 에너지에 노출될 때 방출되는약물의 국소 전달용으로 사용될 수 있다.
제형은 주입 또는 주사에 의해 정맥내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 제형의 용액은 선택적으로 비독성 계면활성제와 혼합된 물이다. 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 또는 기타 적합한 비경구 희석제를 함유하는 수용액 중에서 분산액이 제조될 수 있다.
주사 또는 주입에 적합한 제약학적 투여형은, 리포좀 중에 선택적으로 봉입된 멸균 주사가능한 또는 주입가능한 용액 또는 분산액을 즉석에서 제조하기 적합한 제형을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에서, 궁극적 투여형은 멸균된 유체이며 제조 및 저장 조건에서 안정해야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜)의 혼합물 등과 같은 제약학적으로 허용가능한 희석제이다. 적합한 유체성은, 예를 들어, 리포좀의 형성, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어, 당, 완충제 또는 염화나트륨과 같은 등장성 제제를 포함하는 것이 바람직하다. 젤라틴, 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 제제 또는 유사한 현탁 보조제를 사용하여 주사가능한 조성물을 지속적으로 현탁화시킬 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 상기 열거한 구성성분을 혼입시키고, 여과 멸균시켜 제조할 수 있다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위하여 멸균 분말을 사용하는 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 기법으로, 미리 멸균 여과된 용액 중의 분말 활성 구성성분과 임의의 추가의 원하는 구성성분을 생성시킨다.
마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLCs)는 원칙적으로 수성 매질 중에서 대략 103내지 109마이크로스피어 리포좀 복합체를 함유하는 현탁액으로써 환자 또는 인간에 주사된다. MSLC이 충분한 시간 동안 체내에서 전체적으로 순환하도록 한 후, 초음파 영상화 기계 (예를 들어 임상적으로 통상 사용되는 것)를 사용하여 영상화 또는 방출 질병 부위 또는 심장과 같은 관심의 대상이 되는 기관 또는 종양 내, 또는 염증 부위에서 치료 약물을 방출하도록-- (보다 높은 에너지 또는 반복되는 음파 조사 펄스를 사용하여) MSLC를 파괴시킨다.
조영제로서 작용하기 위한 본 발명의 제형의 능력은 당 분야에 공지된 약리학적 모델을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 빌라뉘바(Villanueva) 등의 문헌[(Villanueva, F. S., Glasheen, W. P., Sklenar, J., Kaul, S. Circulation, 88,596-604 (1993))] 참고할 것.
치료제로서 작용하기 위한 본 발명의 제형의 능력은 당 분야에 공지된 약리학적 모델을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 운거(PCT/US961/09938) (W096/40285) 참조.
본 발명은 하기의 비-제한적인 실시예에 의해 설명된다.
일반 목적 진단 MSLC 조영제의 제조
실시예 1
물 중에 글리세롤 (10ml) 및 NaCl (680±2 mg)을 포함하여 최종 부피가 100 ml이 되도록 하여 염수 글리세롤 용액 (100 ml)을 제조하였다. DPPC (디팔미토일포스파티딜 콜린) (40.0 mg), MPEG500 DPPE (디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민) (30.0 mg), 및 DPPA (4.5 mg)을 100 ml 부피 플라스크 중에서 프로필렌 글리콜 (10 ml)과 혼합하고, 고온의 수조(70 ℃)에 위치시키고, 용액이 투명해질 때까지 15 분 동안 초음파를 가하였다. 이어서 상기 염수/글리세롤 용액을 가하여 혼합물의 최종 부피가 100 ml가 되도록 하고, 현탁액을 잘 혼합하였다. 상기 현탁액 (1.6 ml)을 2 ml 보로실리케이트 유리 바이알로 옮겼다. 상부 공간을 퍼플루오로프로판 기체로 퍼징하고, 바이알의 뚜껑을 닫고, 밀봉하였다. 스토퍼는 웨스트 그레이 V 50 lyo 13 mm, 4416/50 알라스토머성 제형이었다. 밀봉은 플립 오프(flip off) 알루미늄 밍봉이었다. 지질 현탁액을 함유하는 바이알을 이오노스 (IONOS) 이오노믹스(Ionomix, 등록상표)를 사용하여 45초 동안 진탕하였다. 진탕 후, 현탁액은 유백색이 되었다.
생물학적으로-표적화된 진단 MSLC 물질의 제조
실시예 2 및 3은 αvβ3 길항제인 종양 신생혈관 구조에 대한 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 초음파 조영제의 합성에 관한 것이다.
실시예 2
파트 A. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트 콘쥬게이트의 합성
디숙신이미딜 도데카노에이트 (0.424 g, 1 mmol); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE) (1.489 g,1 mmol); 및 시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) TFA 염 (0.831 g, 1 mmol) (상기 시클릭 펩티드 표적화 잔기 제조를 위한 미국 일련번호 제09/281,474호 참고, 이는 본원에 참고로서 포함된다)을 교반하면서(5분) 클로로포름(25 ml)에 용해시켰다. 탄산 나트륨(1 mmol) 및 황산 나트륨(1 mmol)을 가하고, 용액을 실온에서 질소하에 교반하였다(18h). 진공하에 클로로포름을 제거하고, 표제 화합물을 프리파라티브(preparative) HPLC 또는 재결정화에 의해 조생성물 혼합물로부터 정제하였다.
파트 B. 조영제 조성물의 제조
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트 콘쥬게이트를 3개의 다른 지질 --1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포티드산(phosphotidic acid); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린; 및 N-(메톡시폴리에틸렌 글리콜 5000 카르바모일)-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-포스파티딜에탄올아민--과 2:4:54:40의 상대 중량비로 혼합하였다. 이어서, 상기 지질 혼합물(1 mg/mL), 염화나트륨 (7 mg/mL), 글리세린 (0.1mL/mL), 및 프로필렌 글리콜 (0.1 mL/mL)을 함유하는 수성 현탁액을,pH 6-7에서 2cc 유리 바이알 중에서 제조하였다. 바이알 중의 공기를 배기시키고, 퍼플루오로프로판으로 대체하고, 바이알을 밀봉하였다. 덴탈 아말가메이터(dental amalgamator) 중의 밀봉된 바이알 중에서 현탁액을 30-45 초 동안 교반하여 유백색 용액을 형성시켰으며, 이는 혈관생성성 혈관의 영상화를 위한 초음파 조영제에 적합하다.
실시예 3
파트 A. ω-아미노-PEG3400-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lvs)의 제조:
트리에틸아민 (3 mmol)을 디메틸포름아미드 (DMF) (25 mL) 중의 N-Boc-PEG3400-숙신이미딜 에스테르 (1 mmol) 및 시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (1 mmol) 의 용액에 가하였다. 반응 혼합물 질소하에 실온에서 밤새 교반하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 조생성물 트리플루오로 아세트산/디클로로메탄(1:1 부피/부피) 중에 용해시키고, 4 시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 제거하고, 디에틸 에테르 중에서 연마시켜 TFA 염으로서 표제화합물을 분리시켰다.
파트 B. DPPE-PEG3400-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트 콘쥬게이트의 제조:
5분 동안 교반시키면서, 디숙신이미딜 도데카노에이트 (1 mmol), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE) (1 mmol), 및 ω-아미노-PEG3400-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) TFA 염(1 mmol)을 클로로포름(25 ml)에 용해시켰다. 탄산 나트륨(1 mmol) 및 황산 나트륨 (1 mmol)을 가하고, 상기 용액을 실온에서 질소하에 18 시간 동안 교반하였다. DMF를 진공하에 제거하고, 프리파라티브 HPLC 또는 재결정화에 의해 조생성물 혼합물로부터 표제 화합물을 정제하였다.
파트 C. 조영제 조성물의 제조:
DPPE-PEG3400-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트 콘쥬게이트를 3종의 다른 지질--1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포티드산; 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린; 및 N-(메톡시폴리에틸렌 글리콜 5000 카르바모일)-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민--과 1:6:54:41의 상대 중량비로 혼합하였다. 상기 지질 혼합물(1 mg/mL), 염화나트륨 (7 mg/mL), 글리세린 (0.1mL/mL), 및 프로필렌 글리콜 (0.1mL/mL)을 함유하는 수성 현탁액을 pH 6-7, 2cc 유리 바이알 중에서 제조하였다. 바이알 중의 공기를 배기시키고, 퍼플루오로프로판으로 대체하고, 바이알을 밀봉하였다. 덴탈 아말가메이터(dental amalgamator) 중의 밀봉된 바이알 중에서 현탁액을 30-45 초 동안 교반하여 유백색 현탁액을 형성시켰으며, 이는 초음파 조영제로서 사용하기에 적합하다.
하기 실시예 4 및 5는 매트릭스 메탈로프로테나제 억제제에 대한 표적화 잔기를 포함하는 본 발명의 초음파 조영제의 합성을 기술한다.
이들 물질은 종양, 죽상경화판, 및 CHF (울형 심장 부진)에서의 심장 조직 퇴행에서 나타나는 세포외 매트릭스 분해 부위에 대해 MSLC를 표적화시키는데 유용하다. 상기 조성물은 상기 병리상태의 국소 초음파 영상화를 위하여 질병 부위에 음향적으로 활성인 MSLC를 국소화시키는데 유용하다. 별법으로, 실시예 8 및 9에 기술된 바와 같이, 조성물은 MSLC에 부착된 LFL의 내부에 있는 치료제로 제조될 수 있으며, 이는 특정 질병 부위의 초음파 자극된 약물 방출에 유용하다.
실시예 4
1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐PEG3400-2-{[7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]카보닐아미노}-N-(3-아미노프로필)아세트아미드 콘쥬게이트의 합성:
클로로포름(25 ml) 중의 숙신이미딜 에스테르 DSPE-PEG-NHS 에스테르 (미국 알라바마주 헌츠빌 소재의 시어워터 폴리머스)(1 mmol)의 용액에 2-{[7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]카보닐아미노}-N-(3-아미노프로필)아세트아미드 TFA 염(1 mmol)을 가하였다(상기 표적화 잔기의 합성을 위한 미국 일련번호 제 60/182,627호 참고). 탄산 나트륨 (1 mmol) 및 황산 나트륨 (1 mmol)을 가하고, 상기 용액을 실온에서 질소하에 18 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 표제 화합물을 프레파라티브 HPLC에 의해 조생성물 혼합물로부터 정제하였다.
조영제 조성물의 제조:
1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐PEG3400-2-[7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]카보닐아미노}-N-(3-아미노프로필)아세트아미드 콘쥬게이트를 3종의 다른 지질--1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포티드산; 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린; 및 N-(메톡시폴리에틸렌 글리콜 5000 카르바모일)-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민--과 1:6:54:41의 상대 중량비로 혼합하였다. 상기 지질 혼합물(1 mg/mL), 염화나트륨 (7 mg/mL), 글리세린 (0.1mL/mL), 및 프로필렌 글리콜 (0.1mL/mL)을 함유하는 수성 현탁액을 pH 6-7에서, 2cc 유리 바이알 중에서 제조하였다. 바이알 중의 공기를 배기시키고, 퍼플루오로부탄으로 대체하고, 바이알을 밀봉하였다. 덴탈 아말가메이터(dental amalgamator) 중에서 밀봉된 바이알 중의 현탁액을 30-45 초 동안 교반하여 매트릭스 메탈로프로테나제에 대해 표적화된 MSLC의 유백색 현탁액을 형성시켰다. 상기 현탁액은 초음파 조영제로서 적합하다.
실시예 5
1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐PEG3400-7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15)12(16),13-트리엔-3-일l-N-({4-(아미노메틸)페닐]메틸} 카복사미드 콘쥬게이트의 제조:
클로로포름(25 ml) 중의 숙신이미딜 에스테르 DSPE-PEG-NHS 에스테르 (미국 알라바마주 헌츠빌 소재의 시어워터 폴리머스)(1 mmol)의 용액에 [7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]-N-{[4(아미노메틸)페닐]메틸}카복사미드 TFA 염(1 mmol)을 가하였다(MMP 표적화 잔기의 합성을 위한 미국 일련번호 제 60/182,627호 참고). 탄산 나트륨 (1 mmol) 및 황산 나트륨 (1 mmol)을 가하고, 상기 용액을 실온에서 질소하에 18 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 표제 화합물을 프레파라티브 HPLC에 의해 조생성물 혼합물로부터 정제하였다.
조영제 조성물의 제조:
1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐PEG3400-[7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]-N-{[4(아미노메틸)페닐]메틸}카복사미드 콘쥬게이트를 3종의 다른 지질--1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포티드산; 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린; 및 N-(메톡시폴리에틸렌 글리콜 5000 카르바모일)-1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민--과 1:6:54:41의 상대 중량비로 혼합하였다. 상기 지질 혼합물(1 mg/mL), 염화나트륨 (7 mg/mL), 글리세린 (0.1mL/mL), 및 프로필렌 글리콜 (0.1mL/mL)을 함유하는 수성 현탁액을 pH 6-7에서, 2cc 유리 바이알 중에서 제조하였다. 바이알 중의 공기를 배기시키고, 퍼플루오로부탄으로 대체하고, 바이알을 밀봉하였다. 덴탈 아말가메이터(dental amalgamator) 중에서 밀봉된 바이알 중의 현탁액을 30-45 초 동안 교반하여 매트릭스 메탈로프로테나제에 대해 표적화된 MSLC의 유백색 현탁액을 형성시켰다. 상기 현탁액은 초음파 조영제로서 적합하다.
생물학적으로-표적화된 치료 MSLC 물질의 제조
실시예 6
실시예 3의 인지질 조영제 조성물에 독소루빈(100-200 mg/ml)을 가하였다.1/2 ㎕를 바이알로 옮겼다. 바이알 중의 공기를 배기시키고 퍼플루오로부탄으로 대체하고, 바이알을 밀봉시켰다. 덴탈 아말가메이터(dental amalgamator) 중에서 바이알을 30-45 초 동안 진탕하여 치료제용 유백색 MSLC 현탁액을 형성시켰다.
실시예 7
실시예 4의 인지질 조영제 조성물에 시클로포스파미드(100-200 mg/ml)을 가하였다. 1/2 ㎕를 바이알로 옮겼다. 바이알 중의 공기를 배기시키고 퍼플루오로부탄으로 대체하고, 바이알을 밀봉시켰다. 덴탈 아말가메이터(dental amalgamator) 중에서 바이알을 30-45 초 동안 진탕하여 치료제용 유백색 MSLC 현탁액을 형성시켰다.
실시예 8
실시예 5의 인지질 조영제 조성물에 시클로포스파미드(100-200 mg/ml)을 가하였다. 1/2 ㎕를 바이알로 옮겼다. 바이알 중의 공기를 배기시키고 퍼플루오로부탄으로 대체하고, 바이알로 밀봉시켰다. 덴탈 아말가메이터(dental amalgamator) 중에서 바이알을 30-45 초 동안 진탕하여 치료제용 유백색 MSLC 현탁액을 형성시켰다.
실시예 9
실시예 5의 인지질 조영제 조성물에 조직 플라스미노겐 활성화제(100-200 mg/ml)을 가하였다. 1/2 ㎕를 바이알로 옮겼다. 바이알 중의 공기를 배기시키고 퍼플루오로부탄으로 대체하고, 바이알로 밀봉시켰다. 덴탈 아말가메이터(dental amalgamator) 중에서 바이알을 30-45 초 동안 진탕하여 치료제용 유백색 MSLC 현탁액을 형성시켰다.
실시예 10
살아있는 환자 (예: 포유류)에게 주사하고, 표적화된 MSLC가 질병 부위 또는 인접 부위에 국소화되도록 충분한 시간을 준 후, 진단 초음파 스캔을 얻거나, 또는 치료제 전달의 경우, 반복되는 펄스화 또는 매우 높은 전력의 초음파 에너지의 단일 펄스를 가함으로써 MSLC를 파괴하기에 충분한 초음파 에너지를 가하여 표적화된 부위에서 약물을 방출시킬 수 있다.
개별적으로 참고로서 포함되었지만, 모든 간행물, 특허, 및 특허 문헌은 본원에 참고로서 포함된다. 본 발명은 다양한 특정 및 바람직한 실시태양 및 기법과 관련하여 기술되었다. 그러나, 본 발명의 진의 및 범주 내에서 많은 변경과 변형이 만들어질 수 있음을 유의해야 한다.
본 발명은 매질 중에 현탁된 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체 (MSLC)를 포함하는 제형에 관한 것이다. 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체는 기체-충진된 마이크로스피어; 상기 기체-충진된 마이크로스피어의 표면 상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및 상기 지질 또는 계면활성제에 부착된 액체-충진된 리포좀을 포함한다. 액체-충진된 리포좀의 외부 표면은, 수용체, 효소, mRNA 및 기타 관련된 생물학적 표적의 선택적인 영상화를 위하여 MSLC의 지향된(directed) 전달을 위한 표적화 리간드 (즉, 진단 시약을 표적화하는 잔기)를 혼입시킬 수 있다. 추가로, 액체-충진된 리포좀은 액체-충진된 리포좀의 내부 용적 내에 하나 이상의 약물 (예: 치료제 및/또는 진단 시약)을 포함할 수 있다. 그와 같이, 치료제 또는 진단 시약이 국소 전달을 위하여 병리적 부위 또는 기관에 선택적으로 전달될 수 있다. 표적화된 MSLC가 결합한 병리적 부위에 음향 에너지를 가하여 치료제 또는 진단 시약을 선택적인 방법으로 국소적으로 고농도로 농축시킴으로써, 가속화된 약물 방출을 자극시킬 수 있다.
Claims (72)
- 기체-충진된 마이크로스피어;상기 기체-충진된 마이크로스피어의 표면상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및상기 지질 또는 계면활성제에 부착된 액체-충진된 리포좀을 포함하는, 매질 중에 현탁된 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함하는 제형.
- 제1항에 있어서, 기체-충진된 마이크로스피어의 기체가 25 ℃ 및 1 atm에서 물 중에서 약 1.0% (v/v) 미만의 용해도를 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 기체-충진된 마이크로스피어가 약 0.1㎛ 내지 약 10㎛의 평균 직경을 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 기체-충진된 마이크로스피어가 약 0.5㎛ 내지 약 10㎛의 평균 직경을 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 기체-충진된 마이크로스피어가 하나 이상의 비활성 기체를 포함하는 갖는 것인 제형.
- 제5항에 있어서, 비활성 기체가 0족(noble) 기체인 것인 제형.
- 제5항에 있어서, 비활성 기체가 퍼플루오로에테르 기체인 것인 제형.
- 제5항에 있어서, 비활성 기체가 퍼플루오로카본 기체인 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 기체-충진된 마이크로스피어가 기체-충진된 마이크로스피어의 표면 상에 흡착된 지질을 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 기체-충진된 마이크로스피어가 기체-충진된 마이크로스피어의 표면 상에 흡착된 계면활성제를 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 지질 또는 계면활성제가 기체-충진된 마이크로스피어의 표면 상에 단분자 층을 형성하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 지질 또는 계면활성제가 기체-충진된 마이크로스피어의 표면 상에 이분자 리포좀성 층 또는 다-분자 리포좀성 층을 형성하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 계면활성제가 비-이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제,또는 음이온성 계면활성제인 것인 제형.
- 제13항에 있어서, 비-이온성 계면활성제가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 셀룰로즈, 젤라틴, 크산틴 검, 펙틴, 또는 덱스트란을 포함하는 것인 제형.
- 제13항에 있어서, 양이온성 계면활성제가 테트라알킬 암모늄,테트라알킬 포스포늄 이온, 또는 그의 적합한 염을 포함하는 것인 제형.
- 제15항에 있어서, 양이온성 계면활성제가 테트라헥실 암모늄, 테트라옥틸 암모늄, 테트라데실 암모늄, 테트라부틸 암모늄, 테트라헥실 포스포늄, 테트라옥틸 포스포늄, 테트라부틸 포스포늄, 테트라페닐 포스포늄, 또는 그의 적합한 염을 포함하는 것인 제형.
- 제13항에 있어서, 음이온성 계면활성제가 알킬 술포네이트, 알킬 카르복실레이트, 또는 그의 적합한 염을 포함하는 것인 제형.
- 제17항에 있어서, 음이온성 계면활성제가 도데실 술페이트, 팔미틸 술페이트, 도데실 카르복실레이트, 팔미틸 카르복실레이트, 또는 그의 적합한 염을 포함하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 지질이 인지질, 글리코지질, 트리글리세라이드 또는 지방산을 포함하는 것인 제형.
- 제19항에 있어서, 인지질이 디팔미토일포스파티딜 콜린, 디미리스토일포스파티딜 콜린, 디라우리오일포스파티딜 콜린, 또는 디올레일포스파티딜 콜린을 포함하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 액체-충진된 리포좀이 흡착된 지질 또는 계면활성제에 연속적인 방식으로 부착되는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 액체-충진된 리포좀이 약 50% 보다 많은 외부 기체-충진된 마이크로스피어의 표면 영역을 차지하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 각각의 액체-충진된 리포좀이 독립적으로 약 10nm 내지 약 200nm의 직경을 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 각각의 액체-충진된 리포좀이 독립적으로 약 20nm 내지 약 100nm의 직경을 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 각각의 액체-충진된 리포좀이 독립적으로 기체-충진된 마이크로스피어의 직경의 약 10% 미만의 직경을 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 액체-충진된 리포좀이 독립적으로 액체충진된 리포좀의 내부에 치료제 또는 진단 시약을 포함하는 것인 제형.
- 제26항에 있어서, 치료제가 항응고제, 혈전제, 항종양제, 또는 항염증제인 것인 제형.
- 제26항에 있어서, 치료제가 독소루비신, 시클로포스파미딘, 아디아마이신, 메토트렉세이트, 젬시타빈, 나벨빈, 시스플라틴, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인테그랄린, 록시피반, 메토트렉세이트 또는 엔브렐을 포함하는 것인 제형.
- 제26항에 있어서, 진단 시약이 X-레이 조영제 또는 MRI 조영제를 포함하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 각각의 액체-충진된 리포좀이 독립적으로 액체-충진된 리포좀의 표면 상에 부착된 높은 친화도의 표적화 잔기를 갖는 것인 제형.
- 제30항에 있어서, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체의 표면에 부착된 높은친화도의 표적화 잔기가, 혈관생성에서 상향 조절된 수용체에 결합하는 리간드, 염증에서 상향 조절된 수용체에 결합하는 리간드; 또는 죽상동맥경화증에서 상향 조절된 수용체에 결합하는 리간드를 포함하는 것인 제형.
- 제30항에 있어서, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체의 표면에 부착된 높은 친화도의 표적화 잔기가, 인테그론 αvβ3, αvβ5또는 GpIIb/IIIa에 결합하는 리간드; 매트릭스 메탈로프로테나제에 결합하는 리간드; 또는 LTB4수용체에 결합하는 리간드를 포함하는 것인 제형.
- 제30항에 있어서, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체의 표면에 부착된 높은 친화도의 표적화 잔기가,1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트;DPPE-PEG3400-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트;1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐 PEG3400-2-{[7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]카보닐아미노}-N-(3-아미노프로필)아세트아미드; 또는1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐PEG3400-[7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]-N-{[4-(아미노메틸페닐]메틸}카복사미드를 포함하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 각각의 액체-충진된 리포좀이 독립적으로 현탁액의 매질로부터의 액체를 포함하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체가 약 0.1㎛ 내지 약 10 ㎛의 평균 직경을 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체가 약 0.2㎛ 내지 약 4㎛의 평균 직경을 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체가 2종 이상의 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체의 응집체로서 존재하는 것인 제형.
- 제37항에 있어서, 응집체가 약 l㎛ 내지 약 100㎛의 직경을 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체가 매질 밀도의 0.90 내지 약 1.10의 밀도를 갖는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 지질 또는 계면활성제가 높은 친화도의 표적화 잔기를 포함하는 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 지질 또는 계면활성제가 치료제를 포함하는 것인 제형.
- 제41항에 있어서, 치료제가 독소루비신, 시클로포스파미딘, 아디아마이신, 메토트렉세이트, 젬시타빈, 나벨빈, 시스플라틴, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인테그랄린, 록시피반, 메토트렉세이트 또는 엔브렐인 것인 제형.
- 제1항에 있어서, 매질이 진단 시약을 포함하는 것인 제형.
- 제43항에 있어서, 진단 시약이 X-레이 또는 MRI 조영제인 것인 제형.
- 제40항에 있어서, 높은 친화도의 표적화 잔기가1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트;DPPE-PEG3400-시클로(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-도데카노에이트;1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐PEG3400-2-{[7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2]헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]카보닐아미노}-N-(3-아미노프로필) 아세트아미드; 또는1-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노)-α,ω-디카보닐PEG3400-[7-(N-히드록시카르바모일)(3S,6R,7S)-4-아자-6-(2-메틸프로필)-11-옥사-5-옥소비시클로[10.2.2] 헥사데카-1(15),12(16),13-트리엔-3-일]-N-{[4-(아미노메틸)페닐]메틸)카복사미드를 포함하는 것인 제형.
- 효과량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 제형을 환자에게 투여하고;기체-충진된 마이크로스피어 복합체가 순환하기에 충분한 기간의 시간을 주어 표적화된 영역에 이르도록 하고;환자에 대해 초음파 영상화를 수행하는 것을 포함하는, 초음파 영상화가 필요한 환자에서 초음파 영상화하는 방법.
- 제46항에서, 환자가 인간인 방법.
- 제46항에서, 효과량의 제형이 약 103내지 약 1010의 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함하는 것인 방법.
- 제46항에서, 충분한 기간의 시간이 약 5 분 내지 약 2 시간인 방법.
- 제46항에서, 충분한 기간의 시간이 약 5 분 내지 약 30 분인 것인 방법.
- 하나 이상의 액체충진된 리포좀이 독립적으로 치료제를 포함하는 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 제형을 환자에게 효과량으로 투여하고;기체-충진된 마이크로스피어 복합체가 순환하기에 충분한 시간을 주어 표적화된 영역에 이르도록 하고;병리적 영역에서 마이크로스피어 리포좀 복합체로부터 치료제가 방출되기에 충분하게 환자의 표적화된 영역에 초음파 에너지를 가하는 것을 포함하는, 심장 질환, 염증, 감염, 암 또는 혈전성 질환의 치료가 필요한 환자에서 상기 질병을 치료하는 방법.
- 제51항에 있어서, 환자가 인간인 것인 방법.
- 제51항에 있어서, 각각의 액체-충진된 리포좀이 독립적으로 치료제를 포함하는 것인 방법.
- 제51항에 있어서, 효과량의 제형이 약 103내지 약 1010의 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함하는 것인 방법.
- 하나 이상의 지질 또는 계면활성제를 포함하는 수용액에서 리포좀의 현탁액을 접촉시키는 단계, 및상기 현탁액을 제형을 제공하기에 충분한 25 ℃ 및 1 atm의 물에서 약 1.0% (v/v) 미만의 용해도를 갖는 기체와 혼합하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 제형을 제조하는 방법.
- 제55항에 있어서, 혼합이 기계적 교반에 의해 이루어지는 방법.
- 제55항에 있어서, 혼합이 초음파에 의해 달성되는 방법.
- 제55항에 있어서, 혼합이 수성 리포좀 현탁액으로 기체를 고속으로 주입하여 달성되는 것인 방법.
- 하나 이상의 치료제 및 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수용액에서 리포좀의 현탁액을 접촉시키는 단계; 및상기 수성 리포좀 현탁액을 제형을 제공하기에 충분한 25 ℃ 및 1 atm의 물에서 약 1.0% (v/v) 미만의 용해도를 갖는 기체와 혼합하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 제형을 제조하는 방법.
- 제59항에 있어서, 혼합이 기계적 교반에 의해 이루어지는 방법.
- 제59항에 있어서, 혼합이 초음파에 의해 달성되는 방법.
- 제59항에 있어서, 혼합이 수성 리포좀 현탁액으로 기체를 고속으로 주입하여 달성되는 것인 방법.
- 하나 이상의 계면활성제, 및 액체-충진된 리포좀을 포함하는 수용액을 포함하는 용기; 및25 ℃ 및 1 atm의 물에서 약 1.0% (v/v) 미만의 용해도를 갖는 기체를 상기 수용액에 도입하는 수단을 포함하는, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 제형을 제조하기 위한 키트.
- 제63항에 있어서, 용기가 상부 공간을 포함하는 키트.
- 제63항에 있어서. 상부 공간이 25 ℃ 및 1 atm 압력하의 물에서 약 1.0% (v/v) 미만의 용해도를 갖는 하나 이상의 비활성 기체를 포함하는 것인 키트.
- 제63항에 있어서, 비활성 기체가 퍼플루오로카본 기체인 것인 키트.
- 제63항에 있어서, 비활성 기체가 퍼플루오로에테르 기체인 것인 키트.
- 제63항에 있어서, 비활성 기체가 영(0)족 기체인 키트.
- 기체-충진된 마이크로스피어;기체-충진된 마이크로스피어의 표면상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및상기 지질 또는 계면활성제에 부착된 액체-충진된 리포좀을 포함하는, 매질 중에 현탁된 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함하는, 의학적 치료 또는 진단에 사용하기 위한 제형.
- 기체-충진된 마이크로스피어;기체-충진된 마이크로스피어의 표면상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및상기 지질 또는 계면활성제에 결합된 액체-충진된 리포좀을 포함하는, 매질 중에 현탁된 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함하는 제형의, 심장 질환, 염증, 감염, 암 또는 혈전성 질환의 치료가 필요한 환자에서 상기 질병을 치료하는약제를 제조하기 위한 용도.
- 기체-충진된 마이크로스피어;기체-충진된 마이크로스피어의 표면상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및상기 지질 또는 계면활성제에 결합된 액체-충진된 리포좀을 포함하는, 매질 중에 현탁된 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함하는 제형의, 진단 영상화가 필요한 환자에서 상기 진단 영상화를 위한 약제의 제조를 위한 용도.
- 기체-충진된 마이크로스피어;기체-충진된 마이크로스피어의 표면상에 흡착된 하나 이상의 지질 및 계면활성제; 및상기 지질 또는 계면활성제에 결합된 액체-충진된 리포좀을 포함하는, 매질 중에 현탁된 기체 마이크로스피어 리포좀 복합체를 포함하는 제형의, 초음파 영상화가 필요한 환자에서 상기 초음파 영상화를 위한 약제의 제조를 위한 용도.
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