KR20030091593A - 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 음료조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 음료조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 구연산 1 내지 10중량%, 아연 1 내지 5중량% 및 알부민 0.01 내지 1중량%와 강화제를 포함하고, 감미제, 산미제, 교미제, 보존제, 착향제, 천연과즙 중 2종 이상을 용제에 함유한 음료조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

구연산, 아연 및 알부민을 함유한 음료조성물{Beverage Composition Comprising Citric acid, Zinc And Albumin}

본 발명은 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 음료조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 구연산, 아연 및 알부민을 주성분으로 하여 강화제를 포함하고, 감미제, 산미제, 교미제, 보존제, 착향제, 천연과즙 중 2종 이상을 용제에 함유한 음료조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

구연산은 많은 식물의 씨나 과즙 속에 유리상태의 산으로 함유되어 있는 것으로 레몬, 메실, 감귤류의 과일에 특히 많이 함유되어 있는 물질로서 염기성의 유기산으로 이것을 과일에서 추출해서 청량음료나 식품첨가제로 사용해 왔으나, 근래에는 당류(예, 전분이나 전분박)를 기질로 하여 미생물을 이용한 발효로 만들어내고 있다. 일반적으로, 구연산은 결정성의 백색 가루로 되어 있고 물에 잘 녹으며 이것을 청량음료 등에 첨가하면 상쾌한 맛을 낸다. 또한 구연산은 생체내에서는 TCA(Tricarboxylic acid, 트리카르복시산)회로를 구성하는 한 요소로서 고등동물의 물질대사에서 중요한 구실을 한다. 이 밖에도 체내의 칼슘흡수를 촉진시키는 작용 및 살균효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 용도로는 과즙 ·청량음료, 이뇨성 음료에 신맛을 내 식품첨가제로서 주로 사용되고, 의약품, 분석시약, 화장품원료로 널리 쓰이고 있다.

아연은 생체내 모든 체세포들 안에 있으며, 200개가 넘는 효소들의 구성 성분이다. 실제로, 아연은 효소 반응에서 다른 어떤 무기질보다도 많은 기능을 한다. 아연은 또한 갑상선 호르몬과 인슐린 성장 호르몬, 성호르몬을 포함한 많은 인체 호르몬들의 적절한 활동에도 필요하다. 보통 성인의 인체에는 총 1.4 내지 2.5g의 아연이 들어 있는데, 주로 근육내에 저장되어 있으며, 적혈구와 백혈구 내에도 높게 농축되어 있다. 아연 농도가 높은 다른 조직들로는 뼈와 피부, 신장, 간, 췌장, 망막, 전립선 등이 있다. 성인의 아연 영양 권장량은 하루 15㎎이다. 아연의 영양공급원으로 가장 잘 알려져 있는 것은 굴이지만, 아연은 다른 갑각류들과 생선, 붉은 고기 등에도 비교적 높은 농도로 들어있다. 알곡과 콩류, 견과류, 씨앗류 같은 여러 가지 식물성 식품에도 아연이 충분한 농도로 들어 있다. 그러나, 이들 식품에 들어 있는 아연은 피틴(섬유 화합물)산과 결합해서, 흡수되지 않는 불용성의 아연 피틴산염 복합체를 형성하기 때문에 이용도가 떨어진다. 선택할수 있는 아연 형태는 아주 많다. 대부분의 임상 연구들에서는 황산염 아연을 사용해 왔지만, 인체는 다른 여러 형태들을 더 잘 흡수하고 이용한다. 피콜리네이트(picolinate)와 아세테이트, 구연산염, 글리세린산염 또는 모노메티오닌과 아연과의 결합 형태들이 그 예이다.

알부민은 세포의 기초물질을 구성하며, 동식물의 조직 속에 널리 존재하는 단백질로서, 알부민의 종류로 동물성 알부민에는 달걀의 오브알부민, 혈청알부민, 젖의 락토알부민, 간 및 근육 속의 알부민(미오겐) 등이 있으며, 식물성 알부민에는 류코신(보리 씨), 레구멜린(완두콩), 리신(피마자 씨) 등이 있다. 알부민은 우리가 주로 섭취하는 육류에도 많이 포함되어 있다. 따라서, 육류 섭취시, 알부민의 혈중농도를 높여 면역력을 강화하는 작용이 있다. 실제로 알부민의 혈중농도가 낮으면 병에 걸리기 쉽고 수명이 짧은 것으로 알려져 있다. 혈중알부민 수치는 우리 몸의 영양상태나 노화의 진행정도를 알 수 있는 지표가 된다. 예를 들면, 혈액 100㎖ 중 알부민이 4 내지 5ｇ이 포함되어 있으면 영양상태가 좋은 편이고 3.8g 이하이면 영양상태가 나쁜 것으로 판단한다. 3.5g 이하에선 간경변이나 신장병 암 등의 질병이나 극단적인 영양실조 노쇠 등으로 이어지는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 주성분인 구연산, 아연 및 알부민은 현재 각각 분말이나 킬레이트화합물 형태 또는 캡슐제 등으로 시중에 많이 시판되고 있다. 그러나 상기 성분을 모두 함유한 건강보조식품으로는 아직까지 개발되어 있지 않은 상태이다. 따라서 본 발명자들은 구연산, 아연 및 알부민의 각각 알려진 생체에 대한 효과와 특히, 연구 결과로서 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 암세포에 처리하면 암세포의 괴사를 유도한다는 것을 발견함으로써(대한민국특허출원 제 2002-14342호) 인체에 유익한 작용을 나타내는 구연산, 아연 및 알부민 성분을 함유하는 음료조성물을 제공하여, 체내에 쉽게 흡수되며, 간편하게 먹을 수 있도록 하였다.

본 발명자들은 구연산, 아연 및 알부민을 포함하는 조성물이 인체에 유익한 효능, 특히 항암효과가 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명자들은 구연산 1 내지 10중량%, 아연 1 내지 5중량% 및 알부민 0.01 내지 1중량%와 강화제를 포함하고, 감미제, 산미제, 교미제, 보존제, 착향제, 천연과즙 중 2종 이상을 용제에 함유함을 특징으로 하는 음료조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 열정제수를 교반하면서 구연산 1 내지 10중량%, 아연 1 내지 5중량% 및 알부민 0.01 내지 1중량%를 혼화시킨 다음, 감미제 1 내지 30중량%를 넣고 용해시킨 후, 산미제 0.05 내지 1중량%를 첨가하여 시럽을 조제하는 단계;

b) 정제수에 강화제 0.001 내지 0.3중량%를 첨가하여 용해시키는 단계;

c) a)의 액에 b)의 액을 가하고 1시간동안 교반시키는 단계;

d) 열정제수에 교미제 0.01 내지 3중량%를 용해시키는 단계;

e) 열정제수에 교반하면서 보존제 0.001 내지 0.1중량%를 넣어 용해시키는 단계;

f) c)의 액에 d), e)의 액을 혼화하여 완전히 용해시킨 다음, 착향제, 천연과즙을 가하여 서서히 교반하면서 충분히 균질화시킨 후, 정제수 적량을 첨가하여음료조성물을 수득하는 단계로 이루어진 음료조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

도 1은 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물이 사람 폐 섬유아세포 WI-38(A), 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3(B) 및 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(C)

(복수)의 세포 생존력에 미치는 효과를 보여주는 MTT 검정 결과이다.

도 2는 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물이 사람 폐 섬유아세포 WI-38, 사람 신장 상피세포 293cell, 마우스 근육 섬유아세포 NIH3T3, 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수), 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3 및 사람 유선 상피암세포 MDA-MB-231의 세포생존력에 미치는 효과를 보여주는 MTT 검정 결과이다.

도 3은 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 및 항암제인 택솔, 시스플라틴이 사람 신장 상피세포 293cell의 세포 생존력에 미치는 효과를 보여주는 MTT 검정 결과이다.

도 4는 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 및 조성물의 각 성분처리가 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수)의 세포 생존력에 미치는 효과를 보여주는 MTT 검정 결과이다.

도 5는 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물이 사람 폐 섬유아세포 WI-38, 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3 및 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수)의 세포 주기에 미치는 효과를 보여주는 유세포분석 결과이다.

도 6은 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물에 의한 사람 폐 섬유아세포 WI-38(A), 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3(B) 및 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(C)(복수)의 괴사 효과를 보여주는 BrdU 검정 결과이다.

도 7은 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물에 의해 처리 또는 비처리된 사람 폐 섬유아세포 WI-38, 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3 및 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수)의 형광현미경 분석 사진이다.

도 8은 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수)를 접종하여 종양이 유도된 마우스에 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리 또는 비처리하여 형성된 마우스의 피하 종양의 조직 사진이다.

본 발명은 구연산, 아연 및 알부민을 주성분으로 하여, 이에 각종 강화제를 첨가하고, 여기에 첨가제로 감미제, 산미제, 교미제, 보존제, 착향제, 천연과즙 등을 함유하여 생체내 흡수가 용이하고 높은 생리활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 액제 형태의 음료조성물을 제공한다.

구연산, 아연 및 알부민의 생체내 주요기능으로 구연산은 생체내에서 TCA 회로를 구성하는 요소로서 고등동물의 신진대사를 활발하게 해 줌으로써 피로회복에 효과가 있고, 이 밖에도 체내의 칼슘흡수를 촉진시키며, 살균효과를 나타낸다. 아연은 그 효과가 매우 광범위하다. 그 이유는 아연이 많은 효소들과 인체의 기능에 관여하고 있기 때문이다. 아연의 효과중에서 대표적인 것으로는 면역 기능과 상처 치유, 감각 기능, 성 기능 등을 향상시킨다. 알부민은 면역력을 강화시키는 역할을 한다. 실제로 알부민의 혈중농도가 낮으면 병에 걸리기 쉽고 수명이 짧은 것으로 알려져 있다. 혈중알부민 수치는 우리 몸의 영양상태나 노화의 진행정도를 알 수 있는 지표로서 중요하다.

위와 같은 구연산, 아연 및 알부민 각각의 효과 이외에도 본 발명자의 연구결과로서 구연산은 세포의 미토콘드리아에 작용하여 전자현미경 소견상 미토콘드리아를 파괴시키는 작용을 관찰하였고, 암세포 및 정상세포 모두에 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 반면, 아연은 세포를 보호하는 역할이 있으며 정상세포를 암세포보다 더 많이 보호한다는 것을 발견하였다. 이러한 사실을 입증하기 위해 구연산,아연 및 알부민을 함유한 조성물을 상피성 난소암을 대상으로 연구하였다.

상피성 난소암은 난소암중 가장 흔한 유형일 뿐만 아니라 부인과의학에서 악성에 의한 주된 사망 원인이다. 상피성 난소암 환자의 치사율이 가장 높게 나타나는 이유는 상피성 난소암의 잠행성 진행으로 인해 암이 상당히 진행된 단계에서 환자가 진단되는 것이 대부분이기 때문이다(Ozols, R. F., Semin. Oncol., vol. 22, pp61-66, (1995)). 비록 종양을 수술로 제거하거나 적극적인 화학요법이 난소암의 표준 치료법이긴 하지만 전체 생존율은 약물 내성으로 인하여 단지 20 내지 30%에 불과하다.

현재까지도 상피성 난소암의 위험 요소와 원인에 관하여 잘 알려져 있지 않다. 많은 연구들은 배란의 빈도와 상피성 난소암의 발전 사이에 밀접한 관계가 있음을 공통적으로 보여주고 있다. 상피성 난소암의 발생률은 젊은 여성과 나이든 여성(이른 초경과 늦은 폐경기), 미혼 및 미출산 여성에서 증가하고 있다(Franceshi, S. et al., Int. J. Cancer, 49, 57-60, (1991); Taylor, S.R. et al., Cancer, 12, 1207-, (1959); Fraumeni, H.F. et al., J. Natl. Cancer Inst., 42, 455-, (1969); Dorn, H.F. et al., Public Health Monogr. 56, PHS Publication No. 590, (1959); Weiss N.S. et al., J. Natl. Cancer Inst., 58, 913-, (1977); Nergri, E. et al., Int. J. Cancer, 49, 50-56, (1991)). 상피성 난소암의 발병을 설명하는 유력한 학설은 배란 동안 난소 상피 표면이 반복적으로 분열하고 회복하기 때문이라는 것이다(Fathalla, M.F., Lancet., 2, 163-, (1971)). 상피 표면이 회복되는 과정에 변형된 상피 세포는 자발적으로 돌연변이되고, 종양 억제 유전자가 불활성화되며 발암물질에 의해 온코진이 활성화되기 쉽다.

구연산, 아연, 알부민은 사람 정장 성분 중에도 그 일부가 포함되어 있다(사람 정장의 주요성분 : 알부민(albumin), 락토페린(lactoferrin), 전달요소(transferring factors), 면역글로불린, 산 포스파타제(acid phosphatase), L-카르니틴(L-carnitine), 구연산(citric acid), 프락토즈(fructose), 마그네슘(magnesium), 아연(zinc), 프로스타글란딘(prostaglandin) 및 글리세로포스포콜린(glycerophosphocholine)이다). 사람 정장은 림프구에 대한 세포독성 영향에 의한 성교 후의 면역학적 손상으로부터 정자를 보호한다고 알려져 있다(Stities, D.P. et al., Nature, 253, 727-729, (1975); James, K. et al., Immunol., 6, 61-70, (1985)). 또한 사람 정장은 체액성 면역의 발달과 생체내 종양 성장의 증진을 억제시킬 수 있다고 제시되었으며(Anderson, D.J. et al., Immunol., 128, 535-539, (1985); Michaelis, M. et al., Anticancer Drugs, 11, 369-376, (2000)), 자궁경부 상피성 암종세포에서 메탈로프로테이나제(metalloproteinase, MMP)-2 및 MMP-9의 전령 RNA가 생성되는 것에 영향을 미친다. 이에 따라 성행위는 자궁경부암의 진행에 영향을 미칠 수 있다(Jeremias, J. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 181, 591-595, (1999)).

최근 소의 정액 리보뉴클레아제(BS-RNase)는 사람 림프구와 사람 종양세포의 세포자살을 시간과 농도에 의존적으로 유도하는 능력을 가지고 있다고 밝혀졌다. BN-RNase는 화학치료 약물에 대한 내성적인 NB 세포에 대하여 높은 효능을 나타내는 물질이다(Cinatl, J. et al., Anticancer Res., 20, 853-859, (2000); Cinatl, J. et al., Int. J. Oncol., 15, 1001-1009, (1999)). 조르고브(Gjorgov)는 사례-대조 연구 및 많은 생태학적 조사를 실시하여 사람 정액 요소에의 감소된 노출과 유방암 발생사이의 상호관계를 조사하였다. 그는 차단피임방법(콘돔)을 사용한 여성이 비차단 피임방법(피임약, IUD(Intra Uterine Device), 리듬 또는 난관 결찰)을 사용한 여성보다 유방암 발생 위험도가 5.2배 더 높다고 결론지었다(Gjorgov, A.N. et al., Folia Med., vol. 40, pp17-23, (1998)).

상술한 바와 같이 상피성 난소암과 정장사이의 관계에 관한 종래 지식으로부터 본 발명자들은 상피성 난소암이 배란기간동안 사람 정장에 대한 감소된 노출은 상피성 난소암의 발전에서 병인학적 위험요소 중 하나이며, 사람 정장의 성분이 악성형질전환된 상피 세포를 제거하는데 기여할 수 있을 것으로 추론하였다. 따라서, 본 발명자들은 생체내 및 시험관내에서 상피성 난소암 세포(SK-OV-3, OVCAR-3)에 미치는 정자-유리된 사람 정장의 영향을 연구하고, 또한 대조구로서 섬유아세포(Wi-38) 및 사람 신장 상피세포(293cell)등에 미치는 정자-유리된 사람 정장의 영향을 시험하는 과정에서 상기 정장의 성분중 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물이 상피성 난소암의 성장에 억제 활성을 나타낸다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명자들의 난소암 세포의 시험관내 검정에 따르면, 구연산, 아연 및 알부민의 조성물을 포함하는 희석액(약 1:20 내지 1:100의 희석비)에서 상피성 난소암 세포의 괴사를 유도하는 반면 섬유아세포에는 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, SK-OV-3 난소암 세포주의 접종에 의해 종양이 생긴 누드(nude) 마우스(BALB-c)를 사용한 생체내 실험에서 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물은 주요 기관에서 탐지될 정도의 독성 효과를 나타내지 않으면서 종양의 괴사를 유도하였다.

상술한 바와 같이 구연산, 아연 및 알부민 각각의 효과와 특히, 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물의 항암효과 등은 구연산, 아연 및 알부민이 인체에 유익한 효과를 나타낸다는 것을 보여주는 것이다.

본 발명은 구연산, 아연, 및 알부민을 균질하게 용해시킨 정제수에 강화제로서 비타민류, 아미노산류, 칼슘염류 중 2종 이상을 배합하고, 첨가제로서 감미제, 산미제, 교미제, 보존제, 착향제, 천연과즙류 중 2종 이상을 용제에 함유시켜 액제화한 음료조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.

한 양태로서, 주성분으로 구연산 1 내지 10중량%, 아연 1 내지 5중량% 및 알부민 0.01 내지 1중량%를 균질하게 혼합시킨 열정제수에 강화제로서 비타민류, 아미노산류, 칼슘염류 중 2종 이상을 첨가하고, 여기에 첨가제로서 감미제, 산미제, 교미제, 보존제, 착향제, 천연과즙류 중 2종 이상을 용제에 함유시켜 액제화한 음료조성물을 제조한다. 본 발명의 음료조성물의 제조방법을 구체적으로 설명하면, 열정제수에 주성분으로 구연산 1 내지 10중량%, 아연 1 내지 5중량% 및 알부민 0.01 내지 1중량%를 혼화시킨 다음, 여기에 감미제를 1 내지 30중량%를 넣고 용해시킨 후, 산미제 0.05 내지 1중량%를 첨가하여 용해시킨다. 따로 정제수에 비타민류0.001 내지 0.2중량% 및 칼슘염류 0.01 내지 0.1중량%를 가하여 용해시킨다. 상기에서 제조한 2가지 혼합액을 교반시킨다. 여기에 추가적인 첨가제로서 무수카페인 0.01 내지 1중량% 혹은 착향제 0.1 내지 1중량%를 가할 수 있다. 별도로 열정제수에 교미제 0.01 내지 3중량%를 가하여 용해시키고, 또한 보존제 0.001 내지 0.1중량%를 따로 열정제수에 넣어 용해시킨 다음 제조된 교미제 및 보존제를 구연산, 아연 및 알부민이 함유된 액제에 혼화하여 완전히 용해시킨 다음, 서서히 교반시키고 호모게나이저(Homogenizer, NISSEI)로 통과시켜 충분히 균질화시킨 후, 100 메쉬(mesh)로 여과하고 정제수 적량을 첨가한 후 순간멸균기(Miura, Japan)로 멸균시킨 다음 100㎖ 음료조성물을 수득하는 단계로 본 발명의 음료조성물을 제조한다.

상기 열거된 강화제 및 첨가제로서 다음과 같은 강화제 및 첨가제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 강화제로서 비타민류로는 비타민 A, B₁, B₂, C, D₂, B₃, E, 엽산 등 식품 공전 및 식품첨가물공전에 수재된 모든 비타민류를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 비타민 B₂또는 비타민 C 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 아미노산류로는 L-라이신, DL-메치오닌, L-발린, 비오틴, L-시스테인, L-시스틴, L-트립토판, L-트레오닌, L-페닐알라닌, L-글리신 등을 사용할 수 있다. 칼슘염류로는 판토텐산칼슘, 글루콘산칼슘, 탄산칼슘, 구연산칼슘, 식물성칼슘, 동물성칼슘, 오이스터쉘파우더칼슘 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 첨가제로서 감미제는 고과당, 백당, 포도당, 아스파탐,스테비오사이드, D-솔비톨, 글리실리진산 염류 등 식품공전 및 식품첨가물 공전에 수재된 모든 감미제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 포도당 또는 백당 등을 2종 이상 혼합하여 사용한다. 산미제는 DL-사과산, 호박산, D-주석산, 아디핀산등 식품공전 및 식품첨가물공전에 수재된 모든 산미제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DL-사과산 또는 D-주석산 등을 사용한다. 교미제는 식품공전 및 식품첨가물공전에 수재된 모든 교미제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 염화나트륨, 호박산이나트륨 또는 L-글루타민산나트륨 등을 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있으며, 그 양은 음료의 양, 종류 및 각 주성분의 사용량에 따라서 가감될 수 있다. 보존제는 안식향산 및 그의 유도체(예, 안식향산나트륨) 데히드로초산 및 그의 염류(예, 데히드로초산나트륨), 솔빈산 및 그의 염류(예, 솔빈산칼슘)등 식품공전 및 식품첨가물공전에 수재된 모든 보존제를 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 착향제는 천연 또는 인공향료로서 사과향, 딸기향, 오렌지향, 혼합과일향, 요구르트 향, 드링크향중 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 천연과즙류로는 사과, 배, 파인애플, 귤, 그레이프후르츠, 복숭아, 살구, 딸기, 레몬, 자두, 메론 등의 천연과즙농축액을 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 음료조성물을 예시적으로 대략적인 조성을 보면, 주성분으로서 구연산 1 내지 10중량%, 아연 1 내지 5중량% 및 알부민 0.01 내지 1중량%를 함유하고, 강화제로서 비타민류는 비타민 B₂0.001 내지 0.1%, 비타민 C 0.001 내지 0.1중량%, 칼슘염류는 글루콘산칼슘 0.01 내지 0.1중량% 또는 판토텐산칼슘 0.01 내지 0.1중량%를 함유한다.

첨가제로서 감미제인 백당 1.0 내지 20중량%, 포도당 1.0 내지 10.0중량%, 산미제인 DL-사과산 0.05 내지 1중량%, 교미제인 L-글루타민산나트륨 0.01 내지 1.0중량%, 염화나트륨 0.01 내지 1.5중량% 또는 호박산이나트륨 0.01 내지 1.0중량%, 보존제인 안식향산나트륨 0.05 내지 0.1중량%, 솔빈산 0.05 내지 0.1 중량%를 함유하고, 필요시 무수카페인 0.01 내지 1.0중량% 또는 착향제 0.1 내지 1중량%를 첨가할 수 있다.

본 발명은 하기 실험예 및 실시예로서 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실험예 및 실시예는 단지 본 발명의 구현예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실험예

구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물의 항암효과

⑴ 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물의 제조

본 발명자들은 하기 실험예에서 사용하기 위한 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 다음과 같이 제조하였다. 1 내지 10중량%인 구연산 1 내지 5중량%인 아연 원자흡광용 표준용액(zinc atomic absorption standard solution, Sigma)(Sigma) 1㎖ 및 0.01 내지 1중량%인 알부민 (Sigma) 1㎖을 혼합하여 제조하였다. 상기 활성성분에 10N 수산화나트륨을 적정량 첨가하여 pH를 7.5로 조절하였고, 세공크기 0.22㎛ 밀리포어(미국 매사추세츠 베드포드 소재 MilliporeCorporation) 여과기로 여과하여 살균하였다.

배양 배지에 처리할 희석비 1:50의 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 제조하기 위해 상기 활성성분 2g을 멸균수 100㎖에 용해하여 수득한다.

⑵ 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 처리에 따른 세포 생존율 조사

구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물이 세포의 성장과 생존에 미치는 영향을 조사하였다. 세포주로는 WI-38(사람 폐 섬유아세포, ATCC 번호: CCL-75), NIH:OVCAR-3(사람 난소 아데노암종, ATCC 번호: HTB-161) 및 SK-OV-3(사람 난소 아데노암종, 복수, ATCC 번호: HTB-77)세포를 첫 번째 실험군(도 1)으로 사용하였고, 사람 폐 섬유아세포 WI-38, 293cell(사람 신장 상피세포, 아데노바이러스 5 DNA로 형질전환, ATCC 번호: CRL-1573), NIH3T3(마우스 근육 섬유아세포 ATCC 번호: CRL-1658), 사람 난소 선암 세포 SK-OV-3(복수), 사람 난소 선암 세포 NIH:OVCAR-3 및 MDA-MB(사람 유선 상피암 세포, ATCC 번호: HTB-26)세포를 두 번째 실험군(도 2)으로 사용하였다.

상기 세포를 3×10³세포/well이 되도록 96-웰 평판에 넣은 다음 12시간 배양하였다. 배양 배지로는 열불활성화 FBS(fetal bovine serum, 소 태반 혈청) 10% (v/v), 스트렙토마이신 100㎍/㎖, 페니실린 100U/㎖ 및 L-글루타민 100㎍/㎖을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Life Technology, Inc., USA)를 사용하였다. 첫 번째 실험군에는 20배, 50배, 100배, 200배 및 400배 희석한 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 첨가하였고, 두 번째 실험군에는 2.5%, 5%,10% 농도의 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 첨가하였다. 이를 37℃에서 이산화탄소 5% 및 산소 95%가 공급되는 상태에서 24시간 동안 배양하였다.

세포 생존율은 공지된 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)2,5-디페닐-2H-테트라조리움 브로미딘)검정법으로 측정하였다(Hansen, M.B. et al., J. Immunol. Methods, 172, 203-210 (1989)). 20㎕ MTT 용액(PBS(phosphate buffered saline, 인산염 완충 염수)중 10㎎/㎖인 MTT)을 각각의 웰에 첨가하였고, 평판을 37℃에서 4시간 배양하였다. 배지를 제거한 후, DMSO(dimethyl sufoxide, 디메틸 설폭시드) 200㎕에 포마잔(formazan) 결정을 용해시켜 각각의 웰에 첨가하였다. 이를 10분 동안 실온에서 흔들어 혼합하고, Bio-Rad 모델 3550 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader, Richmond, CA)를 사용하여 540㎚에서 측정하였다. 이때, 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리하지 않은 DMEM-FBS와 MTT가 첨가된 웰을 대조군으로 사용하였다.

실험 결과, 첫 번째 실험군은 도 1에 나타낸 바와 같이 20배 내지 100배 희석한 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 난소암 세포주 NIH:OVCAR-3(C) 및 SK-OV-3(D)의 경우에 세포 생존율이 감소하였다. 반면, 같은 농도와 조건으로 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 WI-38(A) 세포주는 세포 생존율의 변화가 미세하였다. WI-38(A) 세포주의 생존율은 1:50으로 희석된 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리하였을 때 약 70∼75%였고, 반면에 OVCAR-3(C) 와 SK-OV-3(D)의 세포 생존율은 약 18∼22%였다.

두 번째 실험군은 도 2에 나타낸 바와 같이 2.5% 내지 5% 농도의 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 난소암 세포주 NIH:OVCAR-3, SK-OV-3의 경우에 세포 생존율이 최대 70% 정도 감소하였다. 반면, 같은 농도와 조건으로 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 정상 세포인 293cell 세포주의 세포 생존율은 최대 10% 정도 감소하였다.

상기 결과에서, 1:20 내지 1:50의 희석비 또는 2.5 내지 5% 농도의 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 정상세포는 세포 생존율이 크게 감소하지 않았지만, 난소암 세포주의 경우 세포 생존율이 크게 감소함을 알 수 있다.

⑶ 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 및 항암제 택솔(Taxol), 시스플라틴(Cisplatin) 처리에 따른 세포 생존율 조사.

구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물이 정상세포인 293cell 세포주의 성장과 생존에 미치는 영향을 조사하였다. 배양조건은 ⑵와 동일하게 수행하였고 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물의 농도는 2.5%, 5%, 10%로 첨가하였다. 또한, MTT 검정측정은 ⑵와 동일하게 실시하였다.

실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 2.5% 내지 5% 농도의 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 세포주 293cell의 경우에 세포 생존율이 약 20 내지 40% 정도 감소하였고, 반면, 같은 농도와 조건으로 택솔을 처리한 293cell의 경우에 세포 생존율은 약 80% 정도 감소하였다. 한편, 같은 농도와 조건으로 시스플라틴을 처리한 293cell의 경우에 세포 생존율은 거의 변화가 없었다.

상기 결과에서, 2.5 내지 5% 농도의 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 정상세포와 같은 농도와 조건으로 기존 항암제인 Taxol을 처리한 정상세포를 비교하여 볼 때, 2.5 내지 5% 농도의 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 정상세포에서 세포 생존율의 감소가 미세함을 알 수 있다.

⑷ 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 및 조성물의 각 성분처리에 따른 SK-OV-3의 세포 생존율 조사

구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 및 조성물의 각 성분처리가 난소암 세포주 SK-OV-3의 성장과 생존에 미치는 영향을 조사하였다. 배양조건은 ⑵와 동일하게 수행하였고 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 및 조성물의 각 성분농도는 최소 0.2%에서 최대 2%의 차이를 두어 최대 10% 까지 첨가하였다. 또한, MTT 검정측정은 ⑵와 동일하게 실시하였다.

실험결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 구연산만을 처리하였을 때, 2% 구연산 농도에서 크게 세포 생존율이 감소하였고 5% 구연산 농도에서 약 90% 정도 세포 생존율이 감소하였다. 또한, 구연산과 알부민을 같이 처리하였을 때, 2% 구연산+알부민 농도에서 크게 세포 생존력이 감소하였고 5% 구연산+알부민 농도에서 약 90% 정도 세포 생존율이 감소하였다. 그리고 구연산과 아연을 같이 처리하였을 때, 4% 구연산+아연 농도에서 크게 세포 생존율이 감소하였고 5% 구연산+아연 농도에서는 90% 정도 세포 생존율이 감소하였다. 마지막으로 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리하였을 때, 1.3% 조성물 농도에서 세포 생존율이 크게 감소하였고 3.4% 조성물 농도에서는 약 90%정도 세포 생존율이 감소하였다.

상기 결과에서, 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물의 성분중 구연산, 구연산과 알부민 및 구연산과 아연을 각각 처리하였을 보다, 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 난소암 세포주가 조성물의 낮은 농도에서 세포 생존율이 크게 감소함을 알 수 있었다.

⑸ 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 처리에 따른 DNA 분열의 유세포 측정

구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 처리가 세포 내 DNA 분열에 미치는 영향을 유세포 측정을 통해 분석하였다. WI-38, OVCAR-3 및 SK-OV-3 세포 2×10⁶에 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 100㎖를 처리하고 각각 6시간, 24시간 동안 ⑵와 동일한 방법으로 배양하였으며 대조군은 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리하지 않았다. 배양이 완료되면 세포를 회수하고 이를 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 그 다음 상기 세포를 4℃에서 24시간 동안 100% 에탄올로 투과시켜 고정하였다. 이를 PBS 500㎕에 현탁하고 37℃에서 30분간 RNase 20μg/㎖로 처리한 후 10분간 얼음으로 냉각시켰다. 상기와 같은 방법으로 분리한 DNA를 PI(Propidium Iodine)용액 50μg/㎕를 첨가하여 염색하고 DNA 분열을 유세포 측정기(Becton Dickinson FACS system)로 측정하였다. 이때, 프로피디움(propidium)형광은 냉각된 아르곤(argon) 이온 레이저 15㎽ 사용하여 발색시켰고, 발색되는 빛을 617 롱 패스 광학 필터를 사용하여 수집하였다. DNA 모델링은 모드피트(ModFit, Verity Software House, Topsham, Maine) 소프트웨어를 이용하였다.

실험 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 WI-38 세포의 세포 주기 분열시 G1(DNA 합성 준비시기)단계의 정점은 감소하는 반면에 G2(세포분열 준비시기)단계의 정점은 배양시간에 따라 점차 증가하였다. 이는 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물이 상기 세포의 성장과 분화에 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다. 한편, 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 OVCAR-3 와 SK-OV-3 세포의 경우에는 G1 단계가 정지되었다. 또한, 세포주기의 G0-G1 단계(sub-G1 부분)의 세포가 농축되었고 S(DNA 합성시기) 단계와 G2-M(유사분열)단계에서 유의적으로 세포가 감소되었으며 이로부터 세포 사멸이 유도되었음을 알 수 있었다.

⑹ 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 처리에 따른 DNA 방출에 의한 세포괴사 분석

상기 ⑸의 세포 사멸 기작이 세포괴사에 의한 것인지를 조사하기 위해 DNA 방출정도를 측정하였다. DNA 방출은 세포 DNA 분열 효소-결합 면역흡착 검정킷트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 괴사된 세포로부터 배지로 방출되는 5'-브로모-2'-디옥시-우리딘(BrdU)으로 표지된 DNA를 측정하였다. 즉, 세포를 티미딘 유사체 BrdU를 첨가하여 배양함으로써 세포의 게놈 DNA에 병합되도록 하였다. 상기 세포를 BrdU 존재하에 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 첨가하여 24시간 배양하여, 각기 다른 시간 간격으로 배양 상등액을 회수하였다. 이때, 사용한 세포 및 배양 방법은 ⑵와 동일하게 수행하였다. 한편, BrdU는 세포의 성장,자살 또는 괴사에 어떠한 영향도 주지 않는다. DNA 단편을 플레이트(Nunc-immuno flat-bottom plate)에 결합된 항-DNA 항체를 사용하여 포획하였고, 항-BrdU 항체-과산화효소를 사용하여 검출하였다. 광도측정은 690nm를 표준으로 하여 450nm에서 수행하였다.

실험 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 WI-38(A) 세포에서는 DNA 방출을 검출할 수 없었으며 반면, OVCAR-3(B) 및 SK-OV-3(C) 세포의 경우에는 시간의 경과에 따라 DNA 방출이 점점 증가함을 알 수 있었다. 이로부터 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 처리가 OVCAR-3 및 SK-OV-3 세포의 세포괴사를 유도함을 알 수 있었다.

⑺ 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 처리에 따른 세포형태의 변화 측정

구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 처리에 따른 세포형태의 변화를 세포의 DNA를 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 상기 ⑸와 동일한 방법으로 세포에 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리하여 배양하였다. 배양이 완료된 세포를 PBS로 세척하고, 이를 PBS에 재현탁하고 최종농도가 2㎍/㎖ 되도록 DNA 염색액(Hoechst 33342)을 첨가하였다. 이를 암실에서 37℃로 30분간 배양하였다. 배양이 완료된 세포를 PBS로 세척하고, 현미경(Olympus)으로 관찰한 후 AX70 TRF 포토오토메트 시스템(0lympus 0ptical Co., Ltd.)으로 사진을 촬영하였다. 또한, 스케닝 공초점 현미경(λ_exc= 488㎚, λ_em= 522㎚; Bio-Rad, Richmond, CA)을 사용하여 핵의 응축, 막 수포의 형태 및 세포자살체의 이미지를 획득하였다.

실험 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 WI-38 세포에서는 형태적 변화가 나타나지 않았다. OVCAR-3 및 SK-OV-3 세포에서는 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리하지 않은 경우에는 건강한 핵을 관찰할 수 있었으나, 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 처리한 경우에는 세포괴사로 보여지는 핵의 형태적 변화를 관찰할 수 있었다. 이와 함께 염색질 응축, 분열 및 핵의 수축을 관찰할 수 있었다. 이러한 세포괴사는 스케닝 공초점 현미경을 사용한 경우에 더욱 뚜렷하게 관찰되었다. 응축된 염색질 덩어리의 가장자리가 불완전하게 나타났으며, 핵 주변으로 불규칙하게 흩어져 있는 형태가 관찰되었다. 세포질 변성과 원형질막의 파열에도 불구하고 세포의 전체외형은 유지되어 있었다.

⑻ 종양이 유도된 마우스 모델에서 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물 처리에 따른 영향

생체내에서의 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물의 영향을 조사하기 위하여 종양이 유도된 누드 마우스(BALB-c, Charles River Inc., Japan)를 사용하였다. 상기 마우스에 SK-OV-3 세포를 피하접종하여 암을 유발하였다. 즉, 마우스를 무균적 상태의 특정 조건에서 순화시킨 다음 PBS 200㎕에 SK-OV-3 세포(3×10⁶)를 현탁하여 5마리의 마우스(자성, 4주령)의 등 부위를 두 부분으로 나누어 주사하였다. 양쪽 접종부위에서 종양이 지름 1㎝로 자라게 한 후, 한 부위에는 구연산,아연 및 알부민을 함유한 조성물 200㎕를, 다른 부위에는 PBS를 동량으로 주사하였다. 24시간 후에, 마우스를 희생시키고 조직학 실험을 수행하기 위해 종양, 폐, 심장, 간 및 신장을 적출한 다음 10% 포르말린으로 고정하고 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin and eosin; H&E)으로 염색하였다.

실험 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 종양이 유도된 마우스에 구연산, 아연 및 알부민을 함유한 조성물을 주사하면 종양 괴사가 일어남을 관찰하였다. 반면에 종양 부위 이외의 다른 조직에는 손상이 관찰되지 않았다.

실시예 1

본 발명의 음료조성물 제조

⑴

100㎖ 중

구연산8.5g

아 연2.5g

알부민0.1g

백 당10g

포도당2.5g

DL-사과산0.3g

비타민 B₂0.005g

비타민 C0.005g

글루콘산칼슘0.015g

L-글루타민산 나트륨0.055g

염화나트륨0.035g

안식향산나트륨0.06g

솔빈산0.01g

정제수적 량

본 발명의 음료조성물 제조방법은 1) 열정제수 30ℓ에 교반하면서 구연산 8.5㎏(Sigma), 아연 2.5㎏(Sigma), 알부민 0.1㎏(Sigma)을 혼화시킨 다음, 백당 15㎏, 포도당 2.5kg을 넣고 용해시킨 후, DL-사과산 0.3㎏을 첨가하여 90℃를 유지하면서 15분간 시럽을 조제하였다.

2) 1)과는 별도로, 정제수 5ℓ에 비타민 B₂5g, 비타민 C 5g 및 글루콘산칼슘 15g를 순차적으로 첨가하여 50 내지 60℃를 유지하면서 용해시켰다.

3) 1)의 액에 2)의 액을 가하고 계속해서 50 내지 60℃를 유지하면서 1시간동안 교반시켰다.

4) 열정제수 10ℓ에 L-글루타민산나트륨 55g 염화나트륨 35g을 용해시켰다.

5) 미리 준비한 열정제수 5ℓ에 교반하면서 솔빈산 10g, 안식향산나트륨 60g을 넣어 용해시켰다(보존제).

6) 3)의 액에 4), 5)의 액을 혼화하여 완전히 용해시킨 다음, 서서히 교반하면서 충분히 균질화시킨 후, 100 메쉬(mesh)로 여과하고 정제수 적량을 넣어 전체량을 100ℓ로 맞춘 다음 순간멸균기를 통해 95℃에서 30초 동안 순간 멸균시킨 다음 자동충전기를 이용하여 100㎖ 병에 충전하였다.

⑵

100㎖ 중

구연산9.0g

아 연3.0g

알부민0.2g

백 당15g

포도당3.0g

D-주석산0.3g

비타민 B₂0.01g

비타민 C0.01g

판토텐산칼슘0.02g

무수 카페인0.04g

L-글루타민산 나트륨0.055g

호박산이나트륨0.04g

안식향산나트륨0.055g

솔빈산0.01g

정제수적 량

1) 열정제수 30ℓ에 교반하면서 구연산 9.0㎏(Sigma), 아연 3.0㎏(Sigma), 알부민 0.2㎏(Sigma)을 혼화시킨 다음, 백당 20㎏, 포도당 3kg을 넣고 용해시킨 후, D-주석산 0.3㎏을 첨가하여 90℃를 유지하면서 15분간 시럽을 조제하였다.

2) 1)과는 별도로, 정제수 5ℓ에 비타민 B₂10g, 비타민 C 10g 및 판토텐산칼슘 15g를 순차적으로 첨가하여 50 내지 60℃를 유지하면서 용해시켰다.

3) 1)의 액에 2)의 액을 가하고 계속해서 50 내지 60℃를 유지하면서 1시간동안 교반시켰다.

4) 열정제수 10ℓ에 L-글루타민산나트륨 55g 호박산이나트륨 40g을 용해시켰다.

5) 열정제수 5ℓ에 무수카페인 30g을 넣어 용해시켰다.

6) 미리 준비한 열정제수 5ℓ에 교반하면서 안식향산나트륨 55g, 솔빈산 10g을 넣어 용해시켰다(보존제).

7) 3)의 액에 4), 5)및 6)의 액을 혼화하여 완전히 용해시킨 다음, 서서히 교반하면서 충분히 균질화시킨 후, 100 메쉬(mesh)로 여과하고 정제수 적량을 넣어 전체량을 100ℓ로 맞춘 다음 순간멸균기를 통해 95℃에서 30초 동안 순간 멸균시킨다음 자동충전기를 이용하여 100㎖ 병에 충전하였다.

실시예 2

본 발명의 음료조성물에 대한 관능검사

상기와 같이 제조한 실시예 1의 ⑴ 및 ⑵의 음료조성물에 대하여 관능검사요원 30명을 대상으로 기호도에 대한 관능검사를 3회 반복 실시한 결과를 표 1에 나타내었다.

본 발명의 음료조성물에 대한 관능검사

검사항목	실시예 1-⑴	실시예 1-⑵
색상	4.2	4.1
맛	4.0	3.9
향	3.8	4.0
감촉(mouth feel)	4.1	4.1
전체적인 기호도	4.3	4.0

^*관능검사인원 30명

^**검사방법 : 5점 척도법

^***1 : 아주 싫다. 2 : 싫다. 3 : 보통이다. 4 : 좋다. 5 : 아주 좋다.

상기 표 1의 실험결과는 본 발명의 건강음료가 기능 및 관능적측면에서 선호할 수 있는 음료로서 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.

본 발명은 구연산, 아연 및 알부민을 주성분으로 하고, 강화제 및 첨가제인 감미제, 산미제, 교미제, 보존제, 착향제, 천연과즙 등을 함유함을 특징으로 하는 음료조성물 및 그의 제조방법으로서 체내에 쉽게 흡수되며, 간편하게 먹을 수 있도록 하여 인체에 유익한 효과를 주는데 유용될 수 있다.

Claims (9)

1. 구연산 1 내지 10중량%, 아연 1 내지 5중량% 및 알부민 0.01 내지 1중량%와 강화제를 포함하고, 감미제, 산미제, 교미제, 보존제, 착향제, 천연과즙 중 2종 이상을 용제에 함유함을 특징으로 하는 음료조성물.
2. 제 1항에 있어서, 강화제로는 비타민류, 아미노산류, 칼슘염류 중 2종 이상 함유함을 특징으로 하는 음료조성물.
3. 제 1항에 있어서, 감미제로는 고과당, 백당, 포도당, 아스파람, 스테비오사이드. D-솔비톨, 글리실리진산 염류 중 2종 이상 혼합하여 함유함을 특징으로 하는 음료조성물.
4. 제 1항에 있어서, 산미제로는 DL-사과산, 호박산, D-주석산, 아디핀산 중 1종 이상을 함유함을 특징으로 하는 음료조성물.
5. 제 1항에 있어서, 교미제로는 염화나트륨, 호박산이나트륨, L-글루타민산나트륨 중 2종 이상 혼합하여 함유함을 특징으로 하는 음료조성물.
6. 제 1항에 있어서, 보존제로는 안식향산나트륨, 솔빈산, 솔빈산칼슘 데히트로초산나트륨 중 2종 이상 혼합하여 함유함을 특징으로 하는 음료조성물.
7. 제 1항에 있어서 착향제로는 사과향, 딸기향, 오렌지향, 혼합과일향, 요구르트 향, 드링크향 중 단독 또는 2종 이상 혼합하여 함유함을 특징으로 하는 음료조성물.
8. 제 1항에 있어서, 천연과즙은 사과, 배, 파인애플, 귤, 그래이후르츠, 복숭아, 살구, 레몬 중 단독 또는 2종 이상 혼합하여 함유함을 특징으로 하는 음료조성물.
9. a) 열정제수를 교반하면서 구연산 1 내지 10중량%, 아연 1 내지 5중량% 및 알부민 0.01 내지 1중량%를 혼화시킨 다음, 감미제 1 내지 30중량%를 넣고 용해시킨 후, 산미제 0.05 내지 1중량%를 첨가하여 시럽을 조제하는 단계;

   b) 정제수에 강화제 0.001 내지 0.3중량%를 첨가하여 용해시키는 단계;

   c) a)의 액에 b)의 액을 가하고 1시간동안 교반시키는 단계;

   d) 열정제수에 교미제 0.01 내지 3중량%를 용해시키는 단계;

   e) 열정제수에 교반하면서 보존제 0.001 내지 0.1중량%를 넣어 용해시키는 단계;

   f) c)의 액에 d), e)의 액을 혼화하여 완전히 용해시킨 다음, 착향제, 천연과즙을 가하여 서서히 교반하면서 충분히 균질화시킨 후, 정제수 적량을 첨가하여음료조성물을 수득하는 단계로 이루어진 음료조성물을 제조하는 방법.