KR20030083433A - Ｃ형 간염 억제제 ｎ-아미노피롤리딘 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 C형간염바이러스(Heptatitis C virus)의 치료용 화합물에 관한 발명으로서, 특히 신규 유사 펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

Ｃ형 간염 억제제 Ｎ-아미노피롤리딘 {Hepatitis C inhibitor N-aminopyrrolidines}
본 발명은 C형간염바이러스(Heptatitis C virus)의 치료용 화합물에 관한 발명으로서, 특히 신규 유사 펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
C형간염바이러스(Heptatitis C virus, 이하 "HCV"라고 한다)는 C형 급성간염 및 C형 만성간염의 주요 원인으로 현재 전세계적으로 1~2 % 이상이 감염된 것으로 추정되고 있으며, A형간염 또는 B형간염과 달리 만성 간염으로의 이행율 및 사망률이 매우 높은 것으로 알려져 있다.
C형간염을 효과적으로 치료할 수 있는 약제를 규명하고자 하는 다양한 연구가 진행되어 왔다. C형간염을 효과적으로 치료하기 위해, 현재 주로 이용하는 방법은 인터페론-알파(Interferon-α; INF-α)를 단독으로 투여하여 치료하는 방법 및 다른 바이러스 치료제와 병용하여 치료하는 방법이 이용되고 있다. 최근까지 인터페론-알파 단독투여 및 인터페론-알파와 리바비린의 병용 투여방법이 임상에서 만성 C형간염환자에 대한 효과가 입증된 유일한 약물이다. 그러나 현재 이용되고 있는 상기 치료 방법들은 치료유지율이 낮으며 인터페론-알파의 심각한 부작용인 망막증, 갑상선염, 급성췌장염, 및 우울증 등을 유발하며, 또한 리바비린과의 병용치료 방법에서도 이러한 부작용은 경감되지 않는다.
따라서, 상기의 인터페론-알파(Interferon-α; INF-α)를 단독으로 투여하여 치료하는 방법 및 다른 바이러스 치료제와 병용하여 치료하는 방법의 부작용 및 한계를 극복한 C형간염치료에 대한 효과적인 항바이러스제의 개발을 위한 연구결과가 보고되고 있으며, 이중 HCV의 성장에 필수적인 비구조단백질(Non-Structure)중 하나인 NS3(Non-Structure Region3)의 단백분해과정을 조절하는 NS3 프로테아제(NS3 Protease)를 억제하는 NS3 프로티아제 억제제(NS3 Protease Inhibitor)의 연구가 가장 활발히 진행되고 있다.
예를 들어, 선행기술문헌 WO99/38888 및 WO01/32691에서 NS3 프로테아제 억제제로서 활성을 갖는 특정 서열의 폴리펩타이드를 보고(Instituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare사)하고 있으며, WO98/17679, WO99/50230 및 WO01/74768에서는 NS3 프로티아제 억제활성을 갖는 C-잔기와 P2 부위를 변형한 유사펩타이드를 보고(Vertex Pharmaceutical Inc.)하고 있다. 또한, WO99/07733, WO99/07734 및 WO00/09558에서는 NS3 프로티아제에 억제활성을 갖는 6개의 아미노산으로 구성된 유사 펩타이드를 개시(Boehringer Ingelheim Ltd)하고 있으며, WO00/09543 및 00/59929에서 NS3 프로티아제 억제활성을 갖는 3개의 아미노산으로 구성된 유사펩타이드를 개시하고 있다.
이밖에도, 선행기술문헌 WO01/02424에서 C-잔기의 카보닐을 보론산으로 변형한 화합물을 개시(Du Pont Pharmaceutical Comp.)하고 있고, WO01/07407에서 사이클릭보란으로 변형한 화합물을 개시하고 있다.
그러나, 상기의 선행기술문헌에 개시된 화합물들은 모두 3개 이상의 아미노산으로 구성된 펩타이드 혹은 유사 펩타이드 화합물로서, 생체내에서의 대사 안정성 및 생체이용율이 낮아 치료 약물로서 개발이 어려우므로, C형간염 치료제로 개발하기에는 어려움이 많은 것으로 보고되고 있다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 연구를 거듭한 결과, 새로운 기본구조를 갖는 N-아미노피롤리딘 유도체가 NS3 프로티아제를 효과적으로 억제하며, 저분자량의 비펩타이드로서 세포막을 투과할 수 있으며, 생체내에서 우수한 약동력학적 성질을 갖을 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 NS3 프로티아제에 우수한 억제 활성을 갖는 N-아미노피롤리딘 유도체, 그의 무독성 염, 에스테르화 화합물, 라세미체 화합물, 부분입체이성질체 및 광학이성질체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 목적은 이들을 유효성분으로 포함하는 NS3 프로티아제 억제 조성물을 제공하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 목적은 이들을 유효성분으로 포함하는 NS3 프로티아제 억제제의 용도를 제공하는 것을 포함한다.
본 발명에 따라, NS3 프로티아제에 억제 활성을 갖는 하기 화학식1의 화합물로 표시되는 N-아미노피롤리딘 유도체, 그의 무독성 염, 에스테르화 화합물, 라세미체 화합물, 부분입체이성질체 및 광학이성질체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기식에서, R1및 R2는 수소; 직쇄상 또는 분지상 C1-C3알킬; C2-C3알켄; C3-C5알킨; R1과 R2가 서로 고리를 이루어 C3-C6시클로알킬, R7로 치환된 C3-C6시클로알킬; R7로 치환된 C1-C3알킬; R7로 치환된 C2-C5의 알켄; 또는 R7로 치환된 C3-C5의 알킨을 나타내고,
R7은 할로겐; 직쇄상 또는 분지상 C1-C3알킬; C2-C5알켄; C3-C5알킨; 니트로; 시아노; 카복실기; 하이드록실기; 또는 티올기를 나타내며,
R3는 R8로 치환된 C6-C14아릴; C6-C14아릴이 치환된 C1-C3알킬; R8로 치환된 C6-C7시클로알킬; 또는 R8로 치환된 C5-C14헤테로아릴을 나타내고,
R8은 수소; 할로겐; C1-C3의 알킬; 메톡시; 페닐; 시아노; 니트로; 카보닐;트리플루오로메틸; 하이드록실; 또는 티올기를 나타낸다.
R4는 수소; 또는 C1-C5알킬을 나타내고,
A는 R5NHCH(R6)(CH2)n의 구조를 갖는 알킬이고, 여기서 R5는 수소; t-부톡시카보닐; 또는 C1-C5알킬을 나타내고,
R6는 수소; R9에 의해 치환된 C1-C4알킬; R9에 의해 치환된 C3-C6시클로알킬; R9에 의해 치환된 C3-C6아릴; 또는 R9에 의해 치환된 C3-C6아릴알킬을 나타내며,
R9는 수소; 할로겐; 직쇄상 또는 분지상 C1-C3알킬; 메톡시; 페닐; 하이드록실; 또는 카복실기를 나타내고,
n은 0 또는 1이다.
본 발명의 화합물 중, 바람직하게는 R1및 R2가 각각 독립적으로 수소 또는 메틸이거나, 또는 R1과 R2가 함께 고리를 이루어 시클로프로필 또는 2-비닐시클로프로필을 형성하는 것을 특징으로 하는 화합물을 나타낸다.
본 발명의 화합물 중, R3는 바람직하게는 다음과 같으며,
이때, B는 수소; 페닐; C1-C4알킬; 할로겐; 니트로; 시아노; 카복실; 또는 메톡시를 나타낸다.
본 발명의 화합물중, R4는 바람직하게는 수소; 또는 메틸이며, A는 바람직하게는 다음과 같으며,
이때, R6은 상기에서 정의한 것과 동일하다.
본 발명의 화합물 중, 바람직한 예는 다음과 같다.
화합물 번호 R1, R2 R3 R4 A
1 수소
2 수소
3 수소
4 수소
5 수소
6 수소
7 수소
8 수소
9 수소
10 수소
11 수소
화합물 번호 R1, R2 R3 R4 A
12 수소
13 수소
14 수소
15 수소
16 수소
17 메틸
본 발명에 따른 N-아미노피롤리딘 유도체, 그의 무독성 염, 에스테르화 화합물, 라세미체 화합물, 부분입체이성질체 및 광학이성질체를 제조하기 위한 중간체인 화학식2의 화합물은 다음과 같다.
상기의 화학식2의 화합물에서 R1, R2및 R3는 상기 화학식1의 화합물에서 정의한 것과 동일하다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 매질 또는 보조제와의 혼합물을 포함하는 항 C형 간염바이러스적으로 유효한 양의 화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 화합물의 약제학적 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명은 세린 프로테아제 억제제(Serine protease inhibitor) 또는 NS3 프로테아제 억제제(NS3 protease inhibitor)의 개발을 위한 하기 화학식2의 화합물의 용도가 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 화학식1의 화합물의 제조방법은 다음 반응식1과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
상기 반응식에서 반응I단계는 N-t-부톡시카보닐-피롤리딘-2-카복실산과 아마이드커플링 하고, 반응II단계는 상기 반응에 의해 t-부톡시카보닐기가 이탈되는것을 보호하는 단계이다. 또한, 반응III단계는 니트로소반응을 통하여 화학식3의 화합물 1-니트로소피롤리딘 유도체를 제조한 후, 반응IV단계에서 니트로소기를 환원하여 화학식4의 화합물 1-아미노피롤리딘을 제조하고, 반응V단계에서 A-COOH와 아마이드커플링을 한다. 이때, A는 상기에서 정의한 바와 동일하다.
또한, 단계VI에서 상기에서 정의한 R4치환기 도입이 필요한 경우에는, 알킬 화 반응으로 R4를 도입하고, 반응VII단계에서 카복실보호기 PG를 제거하여 목적화합물을 얻는다. 이때 반응VI단계는 얻고자하는 화학식1의 화합물의 구조에 따라 생략할 수 있다.
상기 제조방법의 각 반응단계에 있어서, 반응I단계 및 반응V단계의 아마이드커플링 방법은 공지된 방법(Principles of Peptide Synthesis, 2nd Ed., 1993)에 따라 제조할 수 있으며, 바람직하게는 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 디이소프로필카보디이미드, 또는 1-에칠-3-(3-메칠아미노프로필)카보디이마이드(EDAC)와 같은 수용성 카보디이미드를 사용할 수 있다. 또한, 이 반응은 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)을 첨가함으로써 반응을 향상시킬 수 있다. 반응용매로는 디클로로메탄, 아세토나이트릴, 또는 N,N-디메칠포름아마이드를 사용할 수 있으며, 사용가능한 염기로는 트리에칠아민, 디이소프로필에칠아민, N-메칠모르폴린, N,N-디메칠아미노피리딘 또는 N-메칠피롤리딘을 첨가하여 반응혼합물의 pH를 약염기로 조절할 수 있다. 반응온도는 통상적으로 상온 내지 50 ℃이며, 반응시간은 통상 10 분 내지 14 시간이다.
또한, 상기 제조방법의 각 반응단계에 있어서, 반응II단계 및 반응VII단계에서는 공지의 기술(Theodora W. Greene., Peter G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 3rd Ed., 1999)을 이용하여 아미노기 및 카복실기의 이탈을 보호함으로써 아마이드커플링의 수율을 증가시킬 수 있다. 이때, 카복실기의 이탈을 보호하기 위해 사용하는 보호기 PG는 메칠, 또는 에칠을 나타내며, 사용가능한 염기로는 수산화나트륨, 수산화리튬, 또는 수산화칼륨이 가능하다. 또한, 이 반응의 반응용매는 증류수 또는 테트라하이드로퓨란/증류수의 혼합용매가 사용가능하며,반응온도는 실온 내지 100℃이하로 가온하며, 반응시간은 10분에서 24시간이다. 또한, 본 발명에서 아미노기의 이탈을 방지하기 위해 사용할수 있는 바람직한 보호기로는 t-부틸옥시카보닐(BOC)가 있으며, 사용가능한 산으로는 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 염산이 있다. 또한, 반응용매는 증류수 또는 디클로로메탄이 사용가능하며, 반응온도는 0℃ 내지 실온이고, 반응시간은 10분에서 24시간이다.
또한, 상기 제조방법의 각 반응단계에 있어서, 반응III단계인 니트로소화반응은 공지의 방법(Bioorg.Med.Chem.Lett.,9,1721-1726,1999 ;Tetrahedron Lett.,2701-2704,1975)을 이용하여 반응시킬 수 있다. 이 반응은 통상적으로 2가 아민/ 아질산 (HNO2), 또는 아질산나트륨을 처리하여 N-니트로소화합물을 제조할수 있으며, 바람직하게는 초산과 같은 산성조건하에서 아질산나트륨 (NaNO2)를 처리하여 제조한다. 사용가능한 반응용매는 증류수와 같은 극성용매이며, 반응온도는 0℃에서 실온이며, 반응시간은 1시간에서 12시간이다. 이때. 본 발명에서는 반응수율과 화합물의 순도가 다음 반응의 화합물을 얻는데 문제가 없으므로 특별한 정제과정 없이 다음 반응을 진행한다.
또한, 상기 제조방법의 각 반응단계에 있어서, 반응IV단계인 니트로소기의 환원 반응은 공지의 방법(J.Org.Chem.,49, 3470-3473,1984 ;Ind.J.Chem., 30,1116-1118,1991)을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명에서 바람직하게는 염산과 같은 산성조건하에서 아연가루를 처리하여 제조한다. 사용가능한 반응용매는 증류수이며, 반응온도는 0℃ 내지 실온이며, 반응시간은 1시간에서 12시간이다.
또한, 상기 제조방법의 각 반응단계에 있어서, 반응VI단계인 알킬화반응은 염기로써 트리에칠아민, 디아이소프로필에칠아민, 수소화나트륨, 또는 중탄산나트륨이 사용가능하다. 이때, 요오드화칼륨 또느 테트라부틸암모늄 요오드와 같은 촉매를 사용하여 반응수율을 높일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이것이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 화합물 1의 합성
단계1. N-t-부톡시카보닐-4-트란스-벤질옥시-L-프롤린(1.45g), HOBT(0.91g), EDAC(1.55g), 그리고 트리에틸아민(1.9 ml)을 디클로로메탄(25 ml)에 녹이고 2-(R,S)-아미노부틸산 메틸에스테르 (0.76g)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색의 잔사를 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개 용매 = 디클로로메탄/에틸아세테이트)로 정제하여 미황색 무정형의 목적화합물 1a (1.6 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.9(m,3H), 1.45(s,9H), 1.70(m,1H), 1.90(m,1H), 2.10(m,1H), 2.45(m,1H), 3.50(m,1H), 3.70(s,3H), 3.90(m,1H), 4.20(m,1H), 4.50(m,4H), 7.30(m,5H)
단계2. 화합물 1a (1.6 g)를 에틸아세테이트(50.0 mL)에 녹이고 무수 염산 가스를 과량 통과시킨 후 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 감압농축하여 미황색 고형의 목적화합물 1b (1.5 g)를 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6) δ 0.90(m,3H), 1.70(m,2H), 1.90(m,1H), 2.65(m,1H), 3.35(m,1H), 3.65(s,3H), 4.20-4.40(m,3H), 4.55(s,2H), 7.35(m,5H)
단계3. 화합물 1b (0.5 g)를 증류수 (20.0 mL)에 녹이고 진한염산 (1.0 mL)과 아질산나트륨 (0.15 g)를 천천히 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 중탄산나트륨으로 중화한 후 에틸아세테이트로 추출 (10.0 mL x 2)하였다.유기용매층을 소금물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 백색 고형의 목적화합물 1c (0.34 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.90(t,3H), 1.75(m,1H), 1.90(m,1H), 2.35(m1H), 2.60(m1H), 3.75(s,3H), 4.15(m,1H), 4.30(m,1H), 4.50(m,3H), 4.80(m1H), 7.30(m5H)
단계4. 화합물 1c (0.34 g)를 초산 (5.0 mL)과 증류수 (5.0 mL)의 혼합용액에 녹이고 아연가루 (0.63 g)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물중 불용성물질을 여과하여 제거하고 중탄산나트륨으로 중화한 후 에틸아세테이트로 수회 (10.0 mL x 3) 추출하였다. 유기용매층을 소금물로 수회 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 무정형의 목적화합물 1d (0.12 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.90(m,3H), 1.75(m1H), 1.80-2.0(m3H), 2.4-2.5(m,1H), 2.8-2.9(m,1H), 3.55(m,1H), 3.75(m,3H), 4.10(m,1H), 4.40(m,1H), 4.50(m,2H), 7.30(m,5H)
단계5. N-t-부톡시카보닐-γ-(시클로헥실)-L-글루타민산(89 mg), HOBT (49 mg), EDAC (1.3 mg)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 녹이고 화합물 1d (60 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 반고형 물질을 얻는다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄/에틸아세테이트)로 정제하여 무색 반고형의 목적화합물 1e (45 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.90(m,3H), 1.25-1.40(m,3H), 1.40(s,9H), 1.55(m,1H), 1.70(m,4H), 1.80-2.10(m,7H), 2.40(m,2H), 2.55(m,1H), 2.95(m,1H), 3.55(m,1H), 3.75(s,3H), 3.80(m,1H), 4.10(m,1H), 4.45-4.60(m,4H), 4.75(m,1H), 7.35(m,5H)
단계6. 화합물 1e (38 mg)를 테트라하이드로퓨란 (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (1.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산 수용액으로 산성화하고 아세토니트릴로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압농축하여 얻어진 잔사를 에터로 수회 세척하여 미황색의 반고형 목적화합물 1 (18 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.95(m,3H), 1.25(m,3H), 1.40(s,6H), 1.60(m,1H), 1.75-2.05(m,8H), 2.40(m,2H), 2.90(m,1H), 3.70(m,2H), 4.00-4.30(m,3H), 4.55(m,2H), 7.35(m,5H)
실시예 2. 화합물 2의 합성
단계1. N-t-부톡시카보닐-L-발린 (59 mg), HOBT (49 mg), EDCA (103 mg), 그리고 트리에틸아민 (0.75 mL)을 디클로로메탄 (2 mL)에 녹이고 화합물 1d (60 mg)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색의 반고형 물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄/에틸아세테이트)로 정제하여 무색 액상 목적화합물 2a (45 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.90(m,10H), 1.45(s,9H), 1.75(m,1H), 1.90(m,1H), 2.00(m,1H), 2.55(m,1H), 2.95(m,1H), 3.50(m,1H), 3.70(s,3H), 3.75(m,2H), 4.10(m,1H), 4.40(d, 1H), 4.60(d, 1H), 7.30(m,5H)
단계2. 화합물 2a (38 mg)을 THF (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (2.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산 수용액으로 산성화하고 아세토니트릴로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 얻어진 잔사를 에틸에터로 수회 세척하여 미황색의 목적화합물 (15 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.90(m,8H), 1.20(m,1H), 1.40(s,9H), 1.70(m,1H), 1.90(m,2H), 2.00(m,2H), 2.45(m,1H), 2.85(m,1H), 3.70(m,2H), 4.10-4.25(m,2H), 4.50(m,2H), 7.35(m,5H)
실시예 3. 화합물 3 의 합성
단계1. 트란스-2(R)-(1-메톡시카보닐시클로프로필)아미노카보닐-4(R)-페닐옥시피롤리딘 염산 염 (0.2 g)을 증류수 (10.0 mL)와 진한염산 (1.0 mL)에 녹이고 아질산나트륨 (61 mg)을 천천히 가한 후 실온에서 12 시간동안 교반하였다. 반응혼합물을중탄산나트륨으로 중화하고 에틸아세테이트로 수회 (10.0 mL x 2) 추출하였다. 유기용매층을 소금물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 반고형상 목적화합물 3a (0.2 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.20(m,2H), 1.55(m,2H), 2.50(m,1H), 2.85(m,1H), 3.65(s,3H), 4.35(dd,1H), 4.85(m,2H), 5.10(m,1H), 6.85(m,2H), 7.05(m,1H), 7.30(m,2H)
단계2. 화합물 3a (0.2 g)를 증류수 (4.0 mL)와 초산 (4.0 mL)의 혼합용액에 녹이고 아연가루 (0.8 g)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물중불용성 물질을 여과 제거하고 에틸아세테이트로 수회 (10.0 mL x 3) 추출하였다. 유기용매층을 소금물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 무정형의 목적화합물 3b (0.14 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15(m, 2H), 1.55(m,2H), 2.20(m,1H), 2.65(m,1H), 3.05(dd,1H), 3.65(s, 3H), 3.80(m,2H), 4.85(m,1H), 6.85(m,2H), 7.00(m,1H), 7.30(m,2H)
단계3. N-t-부톡시카보닐-γ-(시클로헥실)-L-글루타민산 (109 mg), HOBT (59 mg), EDAC (126 mg), 그리고 트리에틸아민 (0.9 mL)를 디클로로메탄 (2.0 mL)에 녹이고 화합물 3b (70 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 반고형 물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 백색 반고형상의 목적화합물 3c (20 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15-1.40(m,5H), 1.45(s,9H), 1.60(m,6H), 1.75(m,2H), 1.85(m,2H), 2.05(m,1H), 2.25(m,1H), 2.40(m,2H), 2.80(m,1H), 3.70(s,3H), 3.95(m,2H), 4.75(m,2H), 5.10(m,1H), 5.30(m,1H), 6.85(m,2H), 6.95(m,1H), 7.30(m,2H)
단계4. 화합물 3c (17 mg)를 THF (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (2.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산로 산성화한 후 아세토니트릴으로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 얻어진 잔사를 에테르로 수회 세척하여 미황색의 목적화합물 3 (12 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15-1.30(m,5H), 1.45(m,1H), 1.55(m,3H), 1.75(m,1H), 1.85(m,1H), 2.15(m,1H), 2.25(m,1H), 2.35(m,1H), 2.55(m,3H), 3.50-3.70(m,1H), 4.00(m,2H), 4.35(m,1H), 4.55(t,1H), 4.65(m,1H), 5.15(m,1H), 6.90(m,3H), 7.30(m,2H)
실시예 4. 화합물 4 의 합성
단계1. N-t-부톡시카보닐-L-발린 (72 mg), HOBT (59 mg), EDAC (126 mg), 그리고 트리에틸아민 (0.91 mL)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 녹이고 화합물 3b (70 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색의 반고형 물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 백색 무정형의 목적화합물 4a (30 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.90(d,3H), 1.05(d,3H), 1.10(m,2H), 1.40(s,9H), 1.75(m,1H), 1.90(m,2H), 2.20(m,1H), 2.80(m,1H), 3.70(s, 3H), 3.80(m,1H), 4.00(m,2H), 4.30(m,1H), 4.80(m,1H), 5.10(m,1H), 5.20(m,1H), 6.90(d,2H), 7.00(t,1H), 7.30(m,2H)
단계2. 화합물 4a (25 mg)를 테트라하이드로퓨란 (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (2.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산로 산성화하고 아세토니트릴로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 얻는 잔사를 에터로 수회 세척하여 미황색 고형 목적화합물 4 (18 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.00-.20(m,12H), 1.30(m,1H), 1.40(m,1H), 1.60(m,3H), 2.30(m,3H), 2.60(m,1H), 4.00(m,2H), 4.10(s,1H), 4.60(m,1H), 4.90(m,1H), 5.10(m,1H), 6.90(m,3H), 7.20(m,2H)
실시예 5. 화합물 5 의 합성
단계1. N-t-부톡시카보닐-4-트란스-벤질옥시-L-프롤린 (1.45 g), HOBT (0.91 g), EDAC (1.55 g), 그리고 트리에틸아민 (1.9 mL)을 디클로로메탄 (25.0 mL)에 녹이고 1-아미노시클로프로판-1-카복실산 메틸에스터 염산염 (0.75 g)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색의 액상 물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄/에틸아세테이트)로 정제하여 미황색 무정형의 목적화합물 5a (1.0 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15(m,2H), 1.45(s,9H), 1.55(m,2H), 2.15(m,1H), 2.55(m,1H), 3.50(m,1H), 3.65(s,3H), 3.85(m,1H), 4.10-4.40(m,2H), 4.50(s,2H), 7.30(m,5H)
단계2. 화합물 5a (1.0 g)를 에틸아세테이트 (50.0 mL)에 녹이고 무수 염산 가스를 과량 통과 시킨 후 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 감압농축하여 미황색의 고형 목적화합물 5b (1.0 g)를 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.10(m, 2H), 1.40(m, 2H), 1.90(m, 1H), 2.65(m, 1H), 3.35-3.40(m, 2H), 3.60(s, 3H), 4.30(m, 2H), 4.55(s, 2H), 7.40(m, 5H)
단계3. 화합물 5b (0.5 g)를 증류수 (20.0 mL)에 녹이고 진한 염산 (1.0 mL)과 아질산나트륨 (0.15 g)을 천천히 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 중탄산나트륨으로 중화한 후 에틸아세테이트로 수회 (10.0 mL x 2) 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 백색 고형의 목적화합물 5c (0.43 g)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.10(m,2H), 1.55(m,2H), 2.30(m,1H), 2.70(m,1H), 3.65(s,3H), 4.15(m,1H), 4.35 (m,1H), 4.55(m,2H), 4.75(dd,1H), 4.85(m,1H), 7.30(m,5H)
단계4. 화합물 5c (0.43 g)를 초산 (5.0 mL)과 증류수 (5.0 mL)의 혼합용액에 녹이고 아연가루 (0.8 g)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물중 불용성물질을 여과하여 제거하고 중탄산나트륨으로 중화한 후 에틸아세테이트로 수회 (10.0 mL x 3) 추출하였다. 유기용매층을 소금물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 무정형의 목적화합물 5d (0.2 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15(m,2H), 1.55(m,2H), 2.05(m,1H), 2.35-2.50(m,1H), 2.70-2.80(m,1H), 2.90-3.10(m,1H), 3.55(m,1H), 3.65(s, 3H), 4.10(m,1H), 4.40(m,1H), 4.50(m,1H), 7.35(m,5H)
단계5. N-t-부톡시카보닐-γ-(시클로헥실)-L-글루타민산 (89mg), HOBT (49 mg), EDAC (103 mg), 그리고 트리에틸아민 (0.75 mL)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 녹이고 화합물 5d (60 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 액상물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 백색 반고형의 목적화합물 5e (35 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.10(m,2H), 1.20-1.35(m,7H), 1.40(s,9H), 1.55(m,3H), 1.70(m,2H), 1.85(m,3H), 2.00(m,2H), 2.35(m,2H), 2.50(m,1H), 2.95(dd,1H), 3.55(dd,1H), 3.65(s,3H), 3.70(m,1H), 3.95(m,1H), 4.10(m,1H), 4.45(d,1H), 4.55(d,1H), 4.75(m,1H), 5.25(m,1H), 7.30(m,5H)
단계6. 화합물 5e (38 mg)를 테트라하이드로퓨란 (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (2.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산로 산성화한 후 아세토니트릴로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 반고형의 목적화합물 5 (15 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.05-1.25(m,3H), 1.45(s,9H), 1.55(m,2H), 1.75(m,1H), 1.85(m,1H), 2.05(m,1H), 2.40(m,2H), 2.90(m,1H), 3.50(m,1H), 3.60(m,1H), 3.65(m,1H), 3.90(m,1H), 4.05(m,1H), 4.45(m,2H), 7.35(m,5H)
실시예 6. 화합물 6 의 합성
단계1. N-t-부톡시카보닐-발린 (59 mg), HOBT (49 mg), EDAC (103 mg), 그리고 트리에틸아민 (0.75 mL)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 화합물 5d (60 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 액상물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 목적화합물 6a (30 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.90(m,6H), 1.15(m,2H), 1.45(s,9H), 1.50(m,1H), 1.60(m,1H), 2.05(m,2H), 2.55(m,1H), 2.90(dd,1H0, 3.50(dd,1H), 3.65(s,3H), 3.70(m,2H), 4.10(m,1H), 4.45(d,1H), 4.60(d,1H), 4.95(m,1H), 7.35(m,5H)
단계2. 화합물 6a (25 mg)를 THF (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (1.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산로 산성화한 후 아세토니트릴으로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색의 목적화합물 6 (12 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.90(m,8H), 1.15(m,1H), 1.20(m,1H), 1.40(s,9H), 1.55(m,1H), 2.00(m,1H), 2.10(m,1H), 2.40(m,1H), 2.85(m,1H), 3.65(m,2H), 4.05(m,1H), 4.50(m,2H), 7.30(m,5H)
실시예 7. 화합물 7 의 합성
단계1. N-t-부톡시카보닐-3-메틸-4-아미노부틸산 (59 mg), HOBT (49 mg), EDAC (103 mg), 그리고 트리에틸아민 (0.75 mL)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 녹이고 화합물 5d (60 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 액상 물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 목적화합물 7a (41 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15(m,3H), 1.35(m,6H), 1.45(s, 9H), 1.55(m,3H), 1.95(m,1H), 2.40(d,1H), 2.55(m,2H), 2.85(dd,1H), 3.65(s,3H), 3.70(m,2H), 4.05(m,1H),4.40(d,1H), 4.55(d,1H), 5.05(s,1H), 7.30(m,5H)
단계2. 화합물 7a (32 mg)를 테트라하이드로퓨란 (1 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (2.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산로 산성화한 후 아세토니트릴로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색 목적화합물 7 (18 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.10(m,2H), 1.30(m,6H), 1.40(s,9H), 2.00(s,1H), 2.40(m,3H), 2.65(m,1H), 2.85(dd,1H), 3.60(m,1H), 4.05(m,1H), 4.50(m,3H), 7.30(m,5H)
실시예 8. 화합물 8 의 합성
단계1. 트란스-2(R)-(1-메톡시카보닐시클로프로필)아미노카보닐-4(R)-(2-니프탈렌)옥시피롤리딘 (0.2 g)을 증류수 (10.0 mL)에 녹이고 진한염산 (1.0 mL)과 아질산나트륨 (53 mg)을 천천히 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 중탄산나트륨으로 중화한 후 에틸아세테이트로 수회 (10.0 mL x 2) 추출하였다. 유기용매층을 소금물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 고형의 목적화합물 8a (0.18 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.80-0.90(m,2H), 1.10-1.20(m,2H), 2.35-2.70(m,2H), 3.65(s,3H), 3.85-4.05(m,1H), 4.50(m,1H), 4.80-5.30(m,1H), 5.40(m,1H), 7.15(m,1H), 7.40(m,3H), 7.85(m,3H)
단계2. 화합물 8a (0.18 g)을 초산 (4.0 mL)과 증류슈 (4.0 mL)의 혼합용액에 녹이고 아연가루 (0.61 g)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물중 불용성물질을 여과하여 제거하고 중탄산나트륨으로 중화한 후 에틸아세테이트로 수회 (10.0 mL x 3) 추출하였다. 유기용매층을 소금물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색 무정형의 목적화합물 8b (0.15 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15(m,2H), 1.55(m,2H), 2.30-2.55(m,2H), 2.70-3.00(m,1H), 3.10-3.40(m,1H), 3.65(s,3H), 3.80-4.05(m,2H), 4.95(m,1H), 7.05(m,2H), 7.30(m,1H), 7.40(m,1H), 7.70(m,3H)
단계3. N-t-부톡시카보닐-γ-(시클로헥실)-L-글루타민산 (105 mg), HOBT (57 mg),EDAC (120 mg), 그리고 트리에틸아민 (0.88 mL)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 녹이고 화합물 8b (75 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 액상 물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 무색 액상의 목적화합물 8c (29 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15(m,2H), 1.20-1.35(m,7H), 1.40(s,9H), 1.60(m,3H), 1.70(m,2H), 1.85(m,3H), 2.00-2.15(m,2H), 2.30-2.40(m,2H), 2.90(m,1H), 3.70(s,3H), 3.75(m,1H), 3.95(m,1H), 4.05(m,1H), 4.55(m,1H), 4.70-4.85(m,2H), 5.25(m,2H), 7.05(m,1H0, 7.35(m,1H), 7.45(m,2H), 7.75(m,3H)
단계4. 화합물 8c (25 mg)를 테트라하이드로퓨란 (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (2.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산로 산성화한 후 아세토니트릴로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색 목적화합물 8 (18 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15-1.30(m,5H), 1.45(m,1H), 1.60(m,2H), 1.75(m,1H0,1.85(m,1H), 2.10-2.25(m,3H), 2.45(m,2H), 2.65(m,3H), 3.55(m,1H), 4.10(m,2H), 4.40(m,1H), 4.65(t,1H), 5.35(m,1H), 7.10(m,1H), 7.30(m,2H), 7.40(m,1H), 7.75(m,3H)
실시예 9. 화합물 9 의 합성
단계1. N-t-부톡시카보닐-L-발린 (70 mg), HOBT (57 mg), EDAC (120 mg), 그리고 트리에틸아민 (0.9 mL)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 녹이고 화합물 8b (75 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색 액상 물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 백색 반고형의 목적화합물 9a (27 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.95(d,3H), 1.05(d,3H), 1.15(m,2H), 1.45(s,9H), 1.85(m,1H), 2.05(m,2H), 2.30(m,1H), 2.90(m,1H), 3.65(s,3H), 3.70(m,1H), 3.90(m,2H),4.05(m,1H), 4.30(m,1H), 4.75(m,1H), 5.20(m,2H), 7.05(dd,1H), 7.35(m,1H), 7.40(m,2H), 7.70(m,3H)
단계2. 화합물 9a (21 mg)를 테트라하이드로퓨란 (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (2.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산로 산성화한 후 아세토니트릴으로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색의 목적화합물 9 (12 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 0.90-1.00(m,4H), 1.05(m,2H), 1.20(m,6H), 1.30(s, 4H), 1.45(s,2H), 1.55(m,1H), 1.95(m,1H), 2.40(m,1H0, 2.65(m,1H), 4.00-4.10(m,3H), 4.60(m,1H), 5.30(m,1H), 7.05(m,1H0, 7.25(m,2H0, 7.40(m,1H), 7.75(m,3H)
실시예 10. 화합물 10 의 합성
단계1. 4-트란스-(2-페닐퀴놀린-4-일)옥시-L-프롤린 메틸 에스테르 염산염 (10.0 g)을 증류수 (100.0 mL)에 녹이고 진한 염산 (4.0 mL)과 아질산나트륨 (2.7 g)을 천천히 가한 후 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물 중 생성된 백색 고형물질을 여과하여 모으고 증류수와 에터로 세척한 후 감압하에서 건조하여 목적화합물 10a (8.8 g)를 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6+TFA-d1) 2.60(m,1H), 2.95(m,1H), 3.70(s,3H), 4.70(dd,1H), 4.90(t,1H), 5.15(dd,1H), 6.10(s,1H), 7.70-8.35(m,10H)
단계2. 화합물 10a (8.8 g)를 테트라하이드로퓨란 (100.0 mL)에 녹이고 수산화리튬 (3.3 g)을 증류수 (100.0 mL)에 녹여 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다.감압하에서 유기용매를 제거하고 수층을 2N 염산로 산성화한 후 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물중 생성된 고형물질을 여과하여 모아 감압하에서 건조하여 목적화합물 10b (7.0 g)를 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6+TFA-d1) 2.55(m,1H), 2.95(m,1H), 4.70(dd,1H), 4.80(t,1H), 5.15(dd,1H), 6.10(s,1H), 7.65-8.45(m,10H)
단계3. 화합물 10c (7.0 g), HOBT (3.9 g), EDAC (6.6 g), 그리고 트리에틸아민 (5.4 mL)을 디클로로메탄 (100.0 mL)에 녹이고 1-아미노시클로프로판-1-카복실산 메틸에스테르 염산염 (3.0 g)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색 액상물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 백색 고형의 목적화합물 10c (3.6 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15(m,2H), 1.55(m,2H), 2.60(m,1H), 3.10(m,1H), 3.65(s,3H), 4.55(dd,1H), 5.05(m,2H), 5.40(m,1H), 7.05(s,1H), 7.45(m,5H), 7.70(t,1H), 8.05(m,3H)
단계4. 화합물 10c (1.0 g)를 초산 (10.0 mL)과 증류수 (10.0 mL)의 혼합용액에 녹이고 아연가루 (0.4 g)를 천천히 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물중 불용성 물질을 여과하여 제거하고 중탄산나트륨으로 중화한 후 에틸아세테이트로 수회 (5.0 mL x 3) 추출하였다. 유기용매층을 소금물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색 무정형의 목적화합물 10d (0.9 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.15(m,1H), 1.25(m,1H), 1.55(m,1H), 1.65(m,1H), 2.50(m,1H), 2.60(m,1H), 3.15(dd,1H), 3.50(d,1H), 3.70(s,3H), 4.10(m,2H), 5.20(s,1H), 7.10(s,1H0, 7.50(m,4H), 7.70(t,1H), 8.10(m,4H)
단계5. N-t-부톡시카보닐-γ-(시클로헥실)-L-글루타민산 (88 mg), HOBT (45 mg), EDAC (77 mg), 그리고 트리에틸아민 (56 uL)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 녹이고 화합물 10d (60 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색 액상물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 목적화합물 10e (40 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.20-1.40(m,9H), 1.25(s,9H), 1.55(m,3H), 1.70-1.80(m,5H), 2.10(m,1H), 2.45(m,2H), 2.60(m,2H), 2.80(m,1H), 3.50(m,1H), 3.65(s,3H),4.20(m,1H), 4.65(m,1H), 5.65(m,1H), 7.60(m,5H), 7.85(m,1H), 8.05(m,3H), 8.30(dd,1H)
단계6. 화합물 10e (30 mg)를 THF (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (2.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산으로 산성화한 후 아세토니트릴으로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 고형의 목적화합물 10 (20 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.20(m,4H), 1.35(s,9H), 1.45(m,1H), 1.60(m,2H), 2.65(m,2H), 2.85(m,2H), 3.00(m,1H), 4.20(m,1H), 4.35(m,1H), 4.70(m,1H), 5.90(s,1H), 7.75-7.85(m,5H), 8.05(m,3H), 8.25(m,1H), 8.40(m,1H)
실시예 11. 화합물 11 의 합성
단계1. 3-t-부톡시카보닐-아미노-3-메틸부틸산 (58 mg), HOBT (45 mg), EDAC (77 mg), 그리고 트리에틸아민 (56 μL)을 디클로로메탄 (2.0 mL)에 녹이고 화합물 10d (60 mg)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색 액상 잔사를 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 목적화합물 11a (32 mg)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.20(m,4H), 1.40(s,9H), 1.50-1.65(m,5H), 2.35(m,1H), 2.65(d,1H), 2.80(d,1H), 2.85(m,1H), 3.05(m,1H), 3.70(s,3H), 4.10(m,1H), 4.90(m,1H), 5.30(s,1H), 5.45(m,1H), 7.15(s,1H), 7.45(m,4H), 7.75(t, 1H), 8.10(m,4H)
단계2. 화합물 10a (20 mg)를 테트라하이드로퓨란 (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (2.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산으로 산성화한 후 아세토니트릴로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 감압농축하여 백색 고형의 목적화합물 11 (10 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.20(s,12H), 1.45(s,3H), 1.55(m,1H), 1.85(m,1H), 2.00(m,1H), 2.45(m,2H), 2.65(m,1H), 2.90(m,1H), 4.20(dd,1H), 4.40(m,1H), 4.60(m,2H), 4.85(s,1H), 7.75(m,5H), 8.10(m,3H), 8.20(m,1H), 8.45(m,1H)
실시예 12. 화합물 12 의 합성
단계1. 1-(R,S)-[4-(R)-(7-메톡시-2-페닐-퀴놀린-4-일옥시)-피롤리딘-2-(S)-카보닐]아미노-2-(R,S)-비닐시클로프로판-1-카복실산 에틸 에스테르 염산염 (0.3 g)을 증류수 (5.0 mL)에 녹이고 얼음물에서 진한 염산 (2.0 mL)과 아질산나트륨 (0.1 g)을 천천히 가한 후 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 중탄산나트륨으로 중화하고 에틸아세테이트로 수회 (10.0 mL x 2) 추출하였다. 유기용매층을 소금물로 세척하고 무수 황산 마그네슘으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 액상물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = n-헥산 / 에틸아세테이트)로 정제하여 백색 고형의 목적화합물 12a (0.2 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.20(m,1H), 1.45(m,1H), 1.85(m,1H), 2.20(m,1H), 2.55(m,1H), 3.10(m,1H), 3.65-3.50(m,1H), 3.95(s,3H), 4.15(m,3H), 5.15-5.00(m,2H), 5.40-5.35(m,2H), 5.75(m,1H), 7.10-7.00(m,2H), 7.50(m,4H), 7.80(d,1H), 8.05(d,2H)
단계2. 화합물 12a (0.2 g)를 초산 (4.0 mL)과 증류수 (10.0 mL)의 혼합용액에 녹이고 아연가루를 가한 후 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물 중 불용성 물질을 여과하여 제거하고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기용매층을 소금물로 세척하고 감압농축하여 미황색의 무정형 목적화합물 12b (0.1 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.25(t,3H), 1.60(m,1H), 1.90(m,1H), 2.20(m,1H), 2.45(m,1H), 2.65(m,1H), 3.15(m,1H), 3.55(m,1H), 3.95(s,3H), 4.15(m,2H), 4.20(m,1H), 5.15(m,2H), 5.35(m,1H), 5.75(m,1H), 6.90(d,1H), 7.10(m,1H), 7.45(m,4H), 8.05(m,3H)
단계3. N-t-부톡시카보닐-γ-시클로헥실-L-글루타민산 (0.1 g), EDAC (0.1 g), HOBT (0.1 g), 그리고 트리에틸아민 (0.1 mL)를 디클로로메탄 (10.0 mL)에 녹이고 화합물 12b (0.1 g)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색 잔사를 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개 용매 = n-헥산 / 에틸아세테이트)로 정제하여 목적화합물 12c 를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.25(m,8H), 1.40(s,9H), 1.65(m,5H), 1.90(m,2H), 2.20(m,1H), 2.50(m,1H), 2.80(m,1H), 3.90-3.75(m,1H), 3.95(s,3H), 4.15(m,3H), 5.35-5.15(m,3H), 5.75(m,1H), 6.95(m,1H), 7.15(m,1H), 7.45(m,4H), 8.05(m,2H)
단계4. 화합물 12c (24 mg)를 테트라하이드로퓨란 (2.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 수용액 (1.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 2N 염산으로 산성화한 후 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기용매층을 감압증류하여 얻은 잔사를 다시 에틸아세테이트에서 재결정하여 백색 고형의 목적화합물 12 (14 mg)를 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.25-0.80(m,5H), 1.35(s,9H), 1.60-1.45(m,8H), 2.15(m,1H), 2.30(m,1H), 2.55(m,1H), 3.25(m,1H), 3.60(m,1H), 3.9(m,1H), 4.05(s,3H), 5.1(m,1H), 5.35(d,1H), 6.50(m,2H), 7.55(d,1H), 7.75(m,4H), 8.15(d,2H), 8.45(d,1H)
* 실시예 13~15의 합성
실시예 13. 화합물 13 의 합성 : R= HCOOC(CH 2 ) 2 -
단계1. N-t-부톡시카보닐-γ-시클로헥실-L-글루타민산 (0.2 g), HOBT (0.1 g), EDAC (0.2 g), 그리고 트리에틸아민 (0.1 mL)를 디클로로메탄 (10.0 mL)에 녹이고 화합물 (0.2 g)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 감압농축하여 미황색의 액상물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 미황색 무정형의 목적화합물 13a (0.1 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.25(t,3H), 1.40(s,9H), 1.55-1.25(m,6H), 1.65(m,4H),1.75(m,2H), 1.90(m,1H), 2.05(m,1H), 2.20(m,1H), 2.40(m,2H), 2.75(m,1H), 3.20(dd,1H), 3.85(m,1H), 3.95(s,3H), 4.00(m,1H), 4.10(m,2H), 4.70(m,1H), 5.10(m,2H), 5.35(m,1H), 5.75(m,1H), 7.15-6.90(m,2H), 7.45(m,3H), 8.05(m,3H)
단계2. 화합물 13a (24 mg)를 테트라하이드로퓨란 (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 (1.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산으로 산성화한 후 아세토니트릴로 추출하였다. 유기용매층을 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 감압농축하여 미황색 고형의 목적화합물 13 (37 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.25(m,1H), 1.40(s,9H), 1.45(m,1H), 1.80-1.60(m,3H), 1.95(m,1H), 2.25(m,1H), 2.40(m,1H), 2.45(m,1H), 2.65(m,1H), 3.90(m,1H), 4.05(s,3H), 4.10(m,1H), 5.05(t,1H), 5.3(m,1H), 5.6(s,1H), 5.8(m,1H), 7.55(m,3H), 7.85(m,3H), 8.10(d,2H), 8.50(d,1H)
실시예 14. 화합물 14 의 합성 : R= 수소
출발물질을 N-BOC-글라이신으로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 13과 동일한 방법으로 제조하였다.
단계1. 화합물 14a
1H NMR (CDCl3) δ 1.25(t,3H), 1.40(s,9H), 1.50(m,1H), 1.70(m,2H), 1.90(m,1H), 2.20(m,1H), 2.40(m,1H), 2.75(m,1H), 3.20(m,1H), 3.65(m,1H), 3.85(m,1H), 3.95(s,3H), 4.15(m,2H), 5.15(m,2H), 5.30(m,1H), 5.75(m,1H), 7.15-6.90(m,2H), 7.45(m,3H), 8.05(m,3H)
단계2. 화합물 14
1H NMR (CDCl3) δ 1.35(s,2H), 1.40(s,9H), 1.45(m,1H), 1.70(m,1H), 2.20(m,1H), 2.50(m,1H), 2.65(m,1H), 3.60(s,1H), 3.95(m,1H), 4.05(s,3H), 4.10(m,1H), 5.10(t,1H), 5.30(t,1H), 5.60(m,1H), 5.80(m,1H), 7.50(m,3H), 7.70(m,3H), 8.10(m,2H), 8.50(d,1H)
실시예 15. 화합물 15 의 합성 : R= 벤질
출발물질을 L-페닐알라닌으로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 13과 동일한 방법으로 제조하였다.
단계1. 화합물 15a
1H NMR (CDCl3) δ 1.25(t,3H), 1.40(s,9H), 1.45(m,1H), 1.70(m,2H), 1.90(m,1H), 2.20(m,1H), 2.30(m,1H), 2.55(m,1H), 2.70(m,1H), 2.90(m,1H), 3.05(m,1H),3.70(m,1H), 3.95(s,3H), 4.10(m,2H), 5.05(m,1H), 5.15(dd,1H), 5.35(m,1H), 5.80(m,1H), 6.90(s,1H), 7.15(dd,1H), 7.45(m,3H), 8.05(m,3H)
단계2. 화합물 15
1H NMR (CDCl3) δ 1.30(m,1H), 1.35(s,9H), 1.40(m,1H), 1.65(m,1H), 2.15(m,1H), 2.45(m,1H), 2.60(m,1H), 2.85(m,2H), 3.80(m,2H), 4.05(s,3H), 4.10(m,1H), 5.10(m,1H), 5.30(m,1H), 5.45(s,1H), 5.75(m,1H), 6.85(m,1H), 7.10(m,3H), 7.40(d,1H), 7.50(d,1H), 7.60(s,1H), 7.75(m,3H), 8.10(m,2H), 8.35(m,1H), 9.00(d,1H)
실시예 16. 화합물 16 의 합성 : R= 이소-프로필
출발물질을 L-발린으로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 13과 동일한 방법으로 제조하였다.
단계1. 화합물 16a
1H NMR (CDCl3) δ 0.90(m,6H), 1.25(t,3H), 1.40(s,9H), 1.75(m,1H), 1.90(m,1H), 2.10(m,1H), 2.20(m,1H), 2.45(m,1H), 2.75(m,1H), 3.10(m,1H), 3.70(m,1H), 3.90(m,1H), 3.95(s,3H), 4.05(m,1H), 4.15(m,2H), 5.10(m,1H), 5.20(m,1H),5.30(dd,1H), 5.80(m,1H), 6.90(s,1H), 7.15(dd,1H), 7.45(m,3H), 8.05(m,3H)
단계2. 화합물 16
1H NMR (CDCl3) δ 0.95(m,6H), 1.30(m,1H), 1.40(s,9H), 1.45(m,1H), 1.65(m,1H), 2.10(m,1H), 2.40(m,1H), 2.60(m,1H), 3.65(m,1H), 3.90(m,1H), 4.05(s,3H), 4.10(m,1H), 5.05(m,1H), 5.30(m,1H), 5.60(s,1H), 5.75(m,1H), 7.50(m,2H), 7.55(s,1H), 7.65(m,3H), 8.05(d,1H), 8.45(d,1H),
실시예 17. 화합물 17 의 합성
단계1. 1-(N-아미노-4-트란스-(2-페닐퀴놀린-4-일)옥시-L-프롤린)아미노-1-(2-비닐시클로프로필)아세트산 에틸 에스테르 염산 염(1.0 g)과 탄산칼륨 (0.6 g)을 1,4-디옥산 (10.0 mL)과 증류수 (10.0 mL)의 혼합용액에 녹이고 디-t-부틸 카보네이트 (BOC2O ; 0.7 g)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물 중 유기용매를 감압 농축하여 제거하고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기용매층을 증류수와 소금물로 세척하고 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 감압농축하여 무색 액상물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = n-헥산 / 에틸아세테이트)로 정제하여 무색 액상의 목적화합물 17a (0.4 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.20(t,3H), 1.40(s,9H), 1.90(m,1H), 2.15(m,2H), 2.35(m,1H), 2.75(m,1H), 2.90-3.10(m,1H), 3.85(m,2H), 4.10(m,2H), 5.10-5.30(m,3H), 5.80(m,1H), 7.10(m,1H), 7.45(m,4H), 7.70(m,1H), 8.05(m,4H)
단계2. 화합물 17a (0.4 g)를 N,N-디메틸포름아마이드 (1.0 mL)에 녹이고 얼음물로 냉각한 후 질소 기류하에서 수소화나트륨 (0.1 g, 60 %)을 가하고 15 분간 교반하였다. 이 반응혼합물에 요오드메탄 (0.1 mL)을 천천히 가하고 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 에틸아세테이트로 희석하여 증류수로 수회 세척하고 감압 농축하여 얻어진 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = n-헥산 / 에틸아세테이트)로 정제하여 목적화합물 17b (0.2 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.20(t,3H), 1.45(s,9H), 1.60(s,3H), 1.90(m,1H), 2.15(m,1H), 2.40(m,1H), 2.65(m,1H), 3.10(s,3H), 4.15(m,3H), 5.15~5.35(m,3H), 5.75(m,1H), 7.10(s,1H), 7.50(m,4H), 7.70(m,1H), 8.10(m,4H)
단계3. 화합물 17b (0.2 g)를 에틸아세테이트 (5.0 mL)에 녹이고 무수 염산 가스를과량 통과시킨 후 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 감압 농축하여 백색 무정형의 목적화합물 17c (0.2 g)를 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6+ TFA-d1) δ 1.20(t,3H), 1.60-1.80(m,2H), 2.40(m,2H), 2.60(m,1H), 3.05(s,3H), 3.80(m,2H), 4.10(m,2H), 4.60(m,1H), 5.00(m,1H), 5.30(m,1H), 5.60(m,1H), 7.80-7.95(m,5H), 8.15-8.25(m,4H), 8.45(m,1H)
단계4. N-t-부톡시카보닐-γ-시클로헥실-L-글루타민산 (0.2 g), HOBT (0.1 g), EDAC (0.1 g), 그리고 트리에틸아민 (0.1 mL)을 디틀롤메탄에 녹이고 화합물 17c (0.2 g)를 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 증류수와 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척하고 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 감압 농축하여 미황색의 액상물질을 수득하였다. 이 잔사를 실리카젤 컬럼 크로마토그라피 (전개용매 = 디클로로메탄 / 에틸아세테이트)로 정제하여 미황색 무정형의 목적화합물 17d (0.1 g)를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.10(m,2H), 1.25-1.40(m,9H), 1.40(s,9H), 1.45(m,1H), 1.65(m,3H), 1.75(m,3H), 2.15(m,1H), 2.40(m,3H), 2.60(m,1H), 3.05(s,3H), 4.05(t,1H), 4.15(m,1H), 4.30(m,2H), 4.55(m,1H), 4.70(m,1H), 5.20(m,2H), 5.30(m,1H), 5.40(m,1H), 5.65(m,1H), 7.10(s,1H), 7.45(m,4H), 7.70(m,1H), 8.05(m,3H)
단계5. 화합물 17d (0.1 g)를 테트라하이드로퓨란 (1.0 mL)에 녹이고 1N 수산화리튬 (1.0 mL)을 가한 후 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응혼합물을 1N 염산으로 산성화하고 아세토니트릴로 추출하였다하였다기용매층을 무수 황산나트륨으로 건조하여 얻은 잔사를 에틸아세테이트로 재결정하여 미황색 목적화합물 17 (20 mg)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.10(s,6H), 1.30(s,3H), 1.55-1.80(m,2H), 2.05(m,2H), 2.35(m,1H), 2.45-2.70(m,4H), 3.05(s,3H), 3.20(m,1H), 4.20(m,1H), 4.40(m,1H), 5.20(dd,1H), 5.35(m,1H), 5.40(dd,1H), 5.75(m,1H), 5.90(dd,1H), 7.75(m,4H), 7.90(m,1H), 8.15(m,4H), 8.25(m,1H)
실험예 1. 재조합 HCV NS3 프로테아제의 클로닝, 발현 및 정제
외부적 협력을 통하여 얻은 폴리단백질 전구체를 암호화하는 HCV cDNA로부터 NS3 프로테아제를 암호화하는 유전자 서열을 PCR로 생성시킨다. 생성된 NS3 유전자 서열 말단에는 제한효소 (BamHI / SacI)에 의해 절단되는 부위를 넣어 클로닝 시킨 후, 대장균내로 형질전환 시킨다. [참고 ; Kim, J. L. 등,Crystal structure of the Hepatitis C Virus protease NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide. Cell.87, 343-355.1996] 대장균에서 NS3 프로테아제 발현은 항생제 엠피실린과 카나마이신을 넣고 3 시간 동안 25 ℃에서 배양시켜서 발현시킨 후, 원심분리 하여 대장균을 침강시키고 회수한다. 대장균 침전물을 용해 완충액 중에 현탁시킨다. RNase 와 DNase를 첨가하고 얼음에 정치현탁액을 초음파로 처리한 다음 현탁액을 10,000 rpm으로 원심분리하여 세포의 불용성 잔여물 제거하고, 상층 액은 사용하기 전까지 -20 ℃에 보관한다. Ni-NTA 레진에 보관용 완충용액을 제거하고, Native lysis 완충액를 컬럼에 통과시켜준다. 세균 추출액으로부터의 상등액을 미리 평준화시킨 컬럼상에 부하한다. 형질 전환된 대장균의 대량 배양 및 대장균의 파쇄에서 획득한 대장균 부유액을 컬럼에 가한 후, 용출 완충용액 [50 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl, 30% Glycerol]을 준비하고, 컬럼에 가하여 레진으로부터 단백질을 용출 시킨다. [참고 ; Mori, A 등,Enzymatic characterization of purified NS3 serine proteinase of Hepatitis C Virus expressed in Escherichia coli.FEBS Letters378, 37-42. 1996, 와A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins.2000. Qiagen.]
실험예 2. 재조합 HCV NS3 프로테아제/NS4A 보조인자 펩타이드 형광 분석
실험예 1에 설명된 프로토콜에 따라서 상기 효소를 클로닝하여, 발현시키고 제조한다. 상기 효소를 질소 탱크에 보관하고, NS4A 보조인자 펩타이드를 함유하는 검정용 완충용액에서 사용직전에 희석시킨다. NS3 프로테아제/NS4A 보조인자 펩타이드 형광 검정법용으로 사용되는 기질은 EBANS와 DABSYL 표지 팹타이드를 사용한다. 50 mM Tris-HCl, 1 mM DTT (DL-dithiothreitol), 15 % 글리세롤 완충용액에 효소와 기질을 희석하여 사용한다. 상기 펩타이드 기질 EBANS와 DABSYL 표지 펩타이드와 재조합 NS3 프로테아제 및 NS4A 펩타이드 보조인자와 함께 억제제의 부재 또는 존재 하에서 배양시킨다. 배양 후 형광흡광기를 사용하여 측정한다. 억제제의 부재 또는 존재 하에서 결과 차이를 NS3-NS4A 프로테아제의 활성값으로 삼고 시험물질이 얼마나 이 효소 활성도를 저해하는지 억제 %를 계산한다. [참고 Fowler, A 등Development of a high throughput scintillation proximity assay for Hepatitis C Virus NS3 protease that reduces the proportion of competitive inhibitors identified. J. Biological Chemistry.275(20). 15106-15113. 2000, Narjes, F 등 α-Ketoacids are potent slow binding inhibitors of the Hepatitis C virus NS3 protease. Biochemistry.39, 1849-1861. 2000]
A. 시약
트리스-HCl (울트라푸어), 글리세롤 (울트라푸어), DTT, 디메칠설폭사이드 (DMSO)는 시그마-알드리치사로부터 구입하여 사용한다.
검정용 완충액 : 50 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 15 % glycerol
기질 : EBANS와 DABSYL 표지 펩타이드, 3 μM 최종농도(-20 ℃에서 보관된 10 μM 스톡용액으로부터)
효소 : HCV NS3 프로티아제 10 nM 최종농도
NS4A 보조인자 펩타이드: 5 uM (-20℃에서 보관된 50 μM 스톡용액으로부터)
B. 프로토콜
상기 검정은 96개-웰 폴리스티렌 플레이트 (코스타사) 중에서 수행한다. 각 웰은 다음을 함유한다:
검정 완충액중 기질 30 mL ;
1% DMSO/검정용 완충액중 ±억제제 10 μL;
NS3 프로티아제/NS4A 보조인자 펩타이드 60 μL;
블랭크(억제제 및 효소가 없음) 및 대조물(억제제가 없음)을 또한 동일한 검정용 플레이트 상에 제조한다.
효소 반응은 효소/NS4A 펩타이드 용액을 첨가함으로써 개시되며 검정용 혼합물이 들어간 96개-웰 폴리스티렌 플레이트를 형광흡광기를 37 ℃에서 측정한다. 억제제의 부재 또는 존재하에서 결과 차이를 계산한 후 약물 반응 그래프를 그려 Litchfield-wilcoxon 방법으로 IC50을 계산한다.
본 발명의 대표적인 화합물을 실험예 2의 방법으로 NS 프로테아제 억제 활성을 측정한 결과는 다음 화합물 표1과 같다.
화합물번호 IC50(μM)
11 2.60
12 1.00
13 0.29
17 1.90
실험예 3. 선택성 검정
본 발명의 대표적인 화합물을 각종 효소에 대하여 선택적 특이성 실험을 실시하였다. 예를 들어 화합물 12 와 13 은 여러 프로테아제에 대해 다음과 같은 억제활성 (IC50)을 갖는 것으로 밝혀졌다. : HNE > 10 μM ; Tryptase > 10 μM ; Cathepsin K > 10 μM ; Cathepsin B > 10 μM ; Caspase 3 > 10 μM ; Caspase 7 > 10μM.
이들 결과는 상기 화합물이 NS3 프로티아제에 대해 고도로 특이적인 효과를 가짐을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. NS3 프로티아제에 억제 활성을 갖는 하기 화학식1의 화합물로 표시되는 N-아미노피롤리딘 유도체, 그의 무독성 염, 에스테르화 화합물, 라세미체 화합물, 부분입체이성질체 및 광학이성질체:
    상기식에서, R1및 R2는 수소; 직쇄상 또는 분지상 C1-C3알킬; C2-C3알켄; C3-C5알킨; R1과 R2가 서로 고리를 이루어 C3-C6시클로알킬; R7로 치환된 C3-C6시클로알킬; R7로 치환된 C1-C3알킬; R7로 치환된 C2-C5의 알켄; 또는 R7로 치환된 C3-C5의 알킨을 나타내고, R7은 할로겐; 직쇄상 또는 분지상 C1-C3알킬; C2-C5알켄; C3-C5알킨; 니트로; 시아노; 카복실기; 하이드록실기; 또는 티올기를 나타내며,
    R3는 R8로 치환된 C6-C14아릴; C6-C14아릴이 치환된 C1-C3알킬; R8로 치환된 C6-C7시클로알킬; 또는 R8로 치환된 C5-C14헤테로아릴을 나타내고, R8은 수소; 할로겐; C1-C3의 알킬; 메톡시; 페닐; 시아노; 니트로; 카보닐; 트리플루오로메틸; 하이드록실; 또는 티올기를 나타낸다.
    R4는 수소; 또는 C1-C5알킬을 나타내고,
    A는 R5NHCH(R6)(CH2)n의 구조를 갖는 알킬이고,
    여기서 R5는 수소; t-부톡시카보닐; 또는 C1-C5알킬을 나타내고,
    R6는 수소; R9에 의해 치환된 C1-C4알킬; R9에 의해 치환된 C3-C6시클로알킬; R9에 의해 치환된 C3-C6아릴; 또는 R9에 의해 치환된 C3-C6아릴알킬을 나타내며,
    R9는 수소; 할로겐; 직쇄상 또는 분지상 C1-C3알킬; 메톡시; 페닐; 하이드록실; 또는 카복실기를 나타내고,
    n은 0 또는 1이다.
  2. 제 1항에 있어서, R1및 R2가 각각 독립적으로 수소 또는 메틸이거나, 또는 R1과 R2가 함께 고리를 이루어 시클로프로필 또는 2-비닐시클로프로필을 형성하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항에 있어서 R3가 하기의 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물;
    상기식에서, B는 수소, 페닐, C1-C4알킬, 할로겐, 니트로, 시아노, 카복실 또는 메톡시이다.
  4. 제1항에 있어서, R4가 수소 또는 메틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제1항에 있어서, A가 하기의 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물:
    상기 식에서, R6은 제1항에서 정의한 것과 동일하다.
  6. 제1항에 있어서, 하기 화학식 1a로 표시되는 화합물:
  7. 제6항에 따르는 화합물의 에스테르 화합물.
  8. 약제학적으로 허용가능한 담체 매질 또는 보조제와의 혼합물을 포함하는 항 C형 간염바이러스적으로 유효한 양의 제1항에 정의된 화학식 1의 화합물 또는 그의약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 화합물의 약제학적 조성물.
  9. 세린 프로테아제 억제제, HCV NS3 프로테아제 억제제, 또는 화학식 1의 화합물을 합성하기 위한 하기 화학식 2의 N-아미노피롤리딘 유도체:
    상기식에서, R1및 R2는 수소; 직쇄상 또는 분지상 C1-C3알킬; C2-C3알켄; C3-C5알킨; R1과 R2가 서로 고리를 이루어 C3-C6시클로알킬; R7로 치환된 C3-C6시클로알킬; R7로 치환된 C1-C3알킬; R7로 치환된 C2-C5의 알켄; 또는 R7로 치환된 C3-C5의 알킨을 나타내고, R7은 할로겐; 직쇄상 또는 분지상 C1-C3알킬; C2-C5알켄; C3-C5알킨; 니트로; 시아노; 카복실기; 하이드록실기; 또는 티올기를 나타내며,
    R3는 R8로 치환된 C6-C14아릴; C6-C14아릴이 치환된 C1-C3알킬; R8로 치환된C6-C7시클로알킬; 또는 R8로 치환된 C5-C14헤테로아릴을 나타내고, R8은 수소; 할로겐; C1-C3의 알킬; 메톡시; 페닐; 시아노; 니트로; 카보닐; 트리플루오로메틸; 하이드록실; 또는 티올기를 나타낸다.
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