KR20030051623A

KR20030051623A - 클라미디아 감염증의 치료 및 예방에 효과적인 식물유래페놀 화합물, 합성 페놀 화합물 및 식물 추출물

Info

Publication number: KR20030051623A
Application number: KR10-2003-7002334A
Authority: KR
Inventors: 헤이키 부오레라; 피아 부오레라; 라이모 힐투넨; 마이자 레이노넨; 페카 사이쿠
Original assignee: 컨트롤-오엑스 오와이
Priority date: 2000-08-17
Filing date: 2001-08-16
Publication date: 2003-06-25
Also published as: WO2002014464A2; JP2004506656A; MXPA03001435A; PT1309333E; HUP0300732A2; BR0113463A; AR034141A1; KR100851357B1; DE60139783D1; CZ2003449A3; NO20030728D0; NO20030728L; CN100500141C; WO2002014464B1; EP1309333B1; SG90259A1; WO2002014464A3; ES2330306T3; AU2001282201B2; HUP0300732A3

Abstract

본 발명은 클라미디아 감염증의 치료 및 예방에 효과적인 천연 및 합성 화합물, 이를 함유한 식물 추출물 및 조성물, 및 이들의 혼합물에 관한 것이다. 약제, 식품첨가조성물 및 기능성 식료품은 식물유래 페놀 화합물, 합성 화합물 및 식물추출물을 이용하여 제조할 수 있다.

Description

클라미디아 감염증의 치료 및 예방에 효과적인 식물유래 페놀 화합물, 합성 페놀 화합물 및 식물 추출물 {Plant-Derived and Synthetic Phenolic Compounds and Plant Extracts, Effective in the Treatment and Prevention of Chlamydial Infections}

클라미디아(Chlamydiae)는 크기가 작은 그람음성 박테리아이고, 세포내에서번식(reproduction)시 독특한 경로를 이용하기 때문에 클라미디아속(genusChlamydia)을 포함하는 클라미디아레스목(orderChlamydiales)으로 분류된다. 클라미디아속은 초기에 하기 생화학적 특징에 기초하여 두개의 종, 즉 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis)와 클라미디아 프시타시(C. psittaci)로 나누었다.

	C. trachomatis	C. psittaci
클라미디아 응집체(inclusions) 에서 글리코겐의 축적 (iodine 염색)	+	-
설파제에 대한 민감도	+	-

초기에C. trachomatis는 동질적인(homogeneous) 그룹으로,C. psittaci는 아주 이질적인(heterogeneous) 그룹으로 여겨졌다. 새와의 접촉없이 호흡기 감염을 유발하는 클라미디아균(후에C. pneumoniae으로 밝혀짐)이 발견되었을 때, 이 균은 상기 언급한 생화학적 특징에 따라서C. psittaci의 그룹에 속하는 것으로 확신하였다.C. trachomatis와C. pneumoniae는 표면구조면에서 다르다. 즉,C. trachomatis의 표면구조에서 주요성분은 주요외막단백질(major outer membrane protein, MOMP)이고, 이 단백질은 4개의 부위에서 다양성을 보이고 있어서C. trachomatis의 분류에 이용하고 있으며, 현재C. trachomatis는 약 20개의 면역타입(immuno-types)으로 나누어진다.C. pneumoniae에서 MOMP는 보존도가 높고 단지 한개의 면역타입만이 발견된다. 또한, 이들 두종의 클라미디아는 조직에서 표적세포가 다르다. 즉,C. trachomatis의 표적세포는 생식기와 결막의 상피세포이고,C. pneumoniae의 경우 기도의 상피세포이다. 드물게 존재하는 임포그라눌로마 베네륨균(lymphogranuloma venereum strain, LGV)을 제외하고,C. trachomatis는C. pneumoniae의 표적세포인 식세포와 대식세포내에서 번식할 수 없다.C. pneumoniae는 헤파린 수용체(heparin receptor)를 통해서 세포내로 침투하고, LGV를 제외한C. trachomatis는 헤파린 수용체를 이용하지 않는다. 더욱이, 두 클라미디아종은 감염경로 및 감염에 의한 임상적 증상에 있어서 다른 양상을 나타낸다. 즉,C. pneumoniae는 기도를 통해서 전달되고, 단구세포(monocytes) 내로 침투하여 호흡계로 퍼진다. 반면,C. trachomatis는 주로 성적접촉을 통해서 전달된다. 또한, 이들 종에 의한 감염증을 치료하는 방법도 다르다. 즉,C. trachomatis에 의한 감염은 일반적으로 항생제를 일회 복용하여도 치료되지만,C. pneumoniae에 의한 감염의 치료시 3주 동안의 항생제 복용이 권장되고 있다.

이러한 클라미디아종에 의해서 유발된 또는 이러한 클라미디아종과 관련된 질병은 다음과 같다.

C. trachomatis:

- 결막염

- 자궁경부염

- 요도염

- 골반염증성 질환 (pelvic inflammatory disease, PID)

- 신생아 감염증, 예를 들면, 태아 폐렴 (infant pneumonitis)

- 복막염

- 간주위염

- 반응성 관절염(reactive arthritis)

C. pneumoniae:

- 상기도 감염증

- 기관지염

- 폐렴

- 만성폐쇄성 호흡기질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)

- 천식

- 혈관염

- 합병증을 동반하는 동맥경화증(atherosclerosis)

- 뇌염

- 다발성 경화증의 일부증상

- 만발성 알츠하이머질환(late onset of Alzheimer's disease)의 일부증상

1989년에, 새와의 접촉없이 호흡기 감염을 유발하는 클라미디아균은C. trachomatis와C. psittaci(상기에서 설명한 바와 같이 발견당시 이 그룹에 속하는 것으로 분류됨)과는 유전적으로 다르다는 것이 밝혀졌고, 따라서 별개의 종, 즉C. pneumoniae으로 명명되었다. 클라미디아균은C. trachomatis와 핵산서열을 비교했을 때 10% 미만의 상동성을 나타냈다.C. trachomatis는 인간C. pneumoniae균에는 없는 게놈외의 플라스미드를 함유하고 있다. 핵산 염기서열의 분석결과,C. pneumoniae는C. trachomatis보다 상당히 많은 유전자(약 200개)를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 최근에 클라미디아를 재분류하면서,C. pneumoniae는 완전히 다른 속, 클라미도필라(Chlamydophila)속으로 분류되었다. 따라서,C. trachomatis에 특징적인 모든 특성을C. pneumoniae에 적용할 수 없다.

C. pneumoniae와C. trachomatis는 인간에서 가장 흔하게 발견되는 클라미디아종으로서 흔하게 볼수 있는 심각한 질병을 유발한다.C. psittaci는 동물계에아주 넓게 퍼져있으며, 그러나 때때로 남성에서 감염증을 유발한다. 또한, C. pecorum은 반추동물에서 감염증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 현재 클라미디알레스(Chlamydiales)목에서 새로운 속과 종의 분류가 진행중이다.

C. pneumoniae는 인간에서 가장 흔하게 발견되는 클라미디아이고, 대부분의 사람은 평생에 걸쳐 두세번 정도 이 종에 감염된다.C. pneumoniae는 쉽게 폐내로 침투하여 대식세포와 혈관의 상피세포에서 번식할 수 있다. 호흡기가C. pneumoniae에 의해서 감염되었때 임상적 증상은 감염된 사람의 연령에 따라서 다양하게 나타나는 데, 예를 들면, 어린이의 경우 가벼운 증상의 상기도감염(upper respiratory tract infection)을 유발하고, 성년에서는 심각한 폐렴을 유발한다. 폐렴의 5-10%는C. pneumoniae에 의해서 유발된다.C. pneumoniae는 기도를 감염시키면서 사람에서 사람으로 전파된다. 이러한 감염은 학교를 다니는 연령대에서 좀 더 흔하게 나타나므로 일부 사람은 분명히 효과적인 전파자 역할을 한다. 북유럽에서C. pneumoniae에 의한 감염은 약 6년 간격으로 2-3년 동안 유행하는 양상을 띤다.

클라미디아 감염증은 잠행적(incidious)이고 잠복적인 성격을 띠고 있으며, 무엇보다도 이러한 감염에 의한 만성 만기합병증(chronic late complications)이 가장 중요하다. 역학연구결과,C. pneumoniae에 의한 만성감염과 동맥경화증 사이에 중요한 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 클라미디아 감염증은 급성심근경색증(acute myocardial infarction, AMI)과 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 더욱이,C. pneumoniae에 의한 만성감염은 분명히 천식 및 만성폐쇄성 호흡기질환의 발병과 관련성이 있을 것으로 사료된다.

동맥경화증은 만성 염증상태이고, 동맥경화증의 플라크(atheriosclerotic plaques)의 절반이상에서C. pneumoniae입자(particles)가 거품세포(foam cells)와 평활근세포에서 발견되었다. AMI 환자에서 종종 클라미디아성 리포폴리사카리드(lipopolysaccharide, LPS)에 대한 면역반응이 일어나고, 이러한 현상은 감염이 심해졌슴을 의미한다. 또한, 손상된 심장판막에서 클라미디아 검출이 가능하고, 클라미디아는 특히 복부대동맥류에서 풍부하게 존재한다. 또한,C. pneumoniae는 대뇌경색과 일과성 대뇌허혈발작과 관련성이 있는 것으로 밝혀졌다. 아직까지 손상부위에서 발견되는 클라미디아가 손상이 진행되는 과정에서 어떤 역할을 수행하는지에 대해서 정확히 알려지지 않았으나, 이러한 질환이 느린 속도로 진행되는 데 관여하는 한가지 분명한 요소는 만성 클라미디아 감염증인 것으로 사료된다. 그러나, 동물모델에서C. pneumoniae는 동맥경화증을 유발하고 이의 진행속도를 촉진한다. 역학조사와 임상실험에 따르면,C. pneumoniae에 의한 만성감염은 분명히 동맥경화증 및 AMI와 연관성이 있다. 최근의 한 연구에서,C. pneumoniae감염은 심장 기능에 있어서 위험한 요소로 명시하고 있다.C. pneumoniae감염은 흡연과 연관되어 나타나는 경우가 많고, 따라서 흡연자는 클라미디아성 만성감염에 걸리기 쉽다.

항생제를 이용한 치료는 심장마비의 위험을 감소시키는 것으로 나타났고, 이러한 항생제 치료는 통상의 염증마커(common inflammation marker, CRP)와 혈청 피브리노겐 함량에 영향을 줄 수 있다. 대부분의 산업화된 국가에서, 클라미디아에 아주 효과적인 항생제를 다른 균에 의한 감염을 치료하는 데 사용하였을 때 심장질환에 의한 사망률이 감소하기 시작했다.

C. trachomatis는 여성의 생식기 감염의 주원인이다. 또한, 임신가능한 여성에서 박테리아 검사시 음성반응을 보이는 요로감염의 일부는C. trachomatis에 의해서 유발된 것이다.C. trachomatis는 만성 자궁내막증의 일반적인 원인이며, PID는 여성에서 나타나는C. trachomatis감염에 의한 가장 일반적인 합병증이다.C. trachomatis감염은 거의 특정한 증상을 나타내지 않으며, 심지어 자궁외임신 및 불임은 이러한 감염의 잠행적(incidious)이고 잠복적인 감염 특성에 의해서 유발되어 형성되는 폐쇄성 흉터의 합병증으로서 알려져 있다. 클라미디아 보균자로 태어난 어린이의 약 절반에서 합병증으로서C. trachomatis폐렴을 동반한 봉입체 결막염(inclusion conjunctivitis)이 발병한다. 또한C. trachomatis는 남성의 생식기 감염을 유발한다.

클라미디아는 테트라사이클린(tetracyclines)과 에리트로마이신 (erythromycin)에 민감하고, 리팜피신(rifampicin)과 새로 나온 플루오로키놀론 (fluorokinolones)의 일부 또한 클라미디아에 대한 항균활성을 나타낸다. 또한, 예를 들면C. pneumoniae와는 반대로,C. trachomatis는 설파제에 민감하다. 이러한 약제를 이용한 치료에도 불구하고, 클라미디아 감염증은 재발하는 경우가 많고, 만성이 될 위험성이 있다. 클라미디아는 세포내에서만 번식하므로, 근래에 세포내에 효과적으로 축적될 수 있는 새로운 마크로리드(macrolide) 항생제 및 아잘리드 (azalides)가 초기 치료약으로 사용되었던 테트라사이클린과 에리트로마이신의 대체치료제로 사용되고 있다. 복합적인 증상을 나타내는 클라미디아 감염증을 치료하고자 하는 경우에 가능하면 치료는 장기간 지속되어야 하고, 예를 들면 클라미디아에 의해 유발된 라이터 질환(Reiter's disease)의 치료시 3개월간의 치료기간이 권장된다.

현재 클라미디아 감염증을 예방할 수 있는 백신은 없는 상태이다. 면역반응의 특성이 완전히 알려지지 않았고, 발생할 수 있는 과민반응은 면역반응과 관련되어 있다.

유럽특허 제 377722호는 심장경색의 위험을 측정하는 방법, 심장 및 혈관 질환을 진단할 수 있는 방법 및 클라미디아에 대해 효과적인 약제의 사용을 기재하고 있다. 여기서, 테트라사이클린 (tetracyclines), 에리크로마이신 (erythromycin), 리팜피실린 (rifampicillin) 및 플루오로키놀론 (fluorokinolones)은 클라미디아에 의해서 유발된 만성심장질환의 치료 또는 예방에 적당한 약제로서 기술되어 있다.

국제특허 제 WO98/50074호는C. pneumoniae에 의한 감염을 치료하기 위한 항-클라미디아제들(anti-chlamydiae agents)의 조합을 기재하고 있고, 이러한 활성요소들의 각각은 클라미디아의 생활사(life cycle) 중 특정단계에서 효과를 나타낸다.

미국특허 제 5,830,874호는C. pneumoniae에 의해서 유발되는 클라미디아성 동맥육아종(arterial chlamydial granuloma)의 진단방법 및 클라미디아성 동맥육아종의 치료를 위한 치료 조성물을 기재하고 있다. 여기서, 클라미디아에 대해 치료적 효과를 갖는 화합물로서 테트라사이클린, 에리트로마이신, 클라리트로마이신 (clarithromycins), 아지트로마이신 (azitromycin), 키놀론 (kinolones) 등을 소개하고 있다.

일본특허 제 10139686호는C. pneumoniae에 의해서 유발되는 동맥경화증을 치료학적으로 활성이 있는 화합물로서 2-(3,4-디메톡시신나모일)-아미노벤젠산 (2-(3,4-dimetoxycinnamoyl)-aminobenzoic acid)을 100-1000 mg의 일회 복용량으로 하여 치료하는 방법을 기재하고 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 클라미디아 감염증을 치료하는 데 이용될 수 있는 새로운 화합물 및 조성물에 대한 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 클라미디아 감염증의 치료 및 예방에 효과적인 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 페놀 화합물 및 이의 유도체, 이들을 포함하는 식물 추출물 및 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 클라미디아 감염증의 치료 및 예방에 있어서 상기 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이의 유도체, 이들을 포함하는 식물 추출물 및 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이의 유도체, 및 식물 추출물은 약제학적 제제, 식품첨가 조성물 및 건강에 이로운 기능성 식료품의 제조에 사용될 수 있다.

시키메이트(shikimates) 또는 생합성 경로를 통해서 시킴산(shikimic acid)으로 부터 형성되는 화합물, 아세테이트-말로네이트(acetate-malonate) 생합성 경로를 통해서 형성되는 화합물, 및 상기 두 경로를 조합해서 형성되는 화합물은 식물에서 유래한 페놀 화합물(phenolic compounds) 그룹에 속한다. 단순구조의 아로메이트(simple aromates), 페놀(phenols), 쿠마린(coumarins), 리그난(lignans), 리그닌(lignins)및 이들의 유도체는 상기 화합물에 속한다. 단순구조의 아로메이트는 주로 페닐프로판(phenylpropane) 유도체와 페닐메탄 유도체를 포함한다. 구조적으로 페놀 화합물인 플라보노이드(flavonoids)는 광범위하게 분포하는 식물 색소 그룹을 형성한다. 플라보노이드는 선태류, 돌나물과 식물(stonecrop family) 및 다른 하등식물을 포함한 모든 식물계에 존재한다. 플라보노이드의 대부분은 고등식물과 관다발식물에서 발견되며, 모든 과일, 야채, 및 포도주, 특히 적포도주 및 차(tea)에서 발견된다. 플라보노이드는 천연적으로 주로 글리코시드(glycosidic) 형태로 존재하지만, 페놀 및 설페이트(sulphates) 유리형태, 소위 아글리콘(aglycon) 형태로 존재하거나 탄수화물 또는 단백질에 결합된 형태로 존재할 수 있다. 대부부의 경우에, 플라보노이드는 폴리페놀 화합물(polyphenolic compounds)의 화학구조를 갖는다. 8,000개 이상의 플라보노이드가 식물에서 동정되었고, 이들은 많은 기능을 가지고 있다. 이들의 쓴 맛은 유해 곤충으로 부터 식물을 보호하는 기능을 하고, 또한 항생제 특성이 있어서 바이러스 및 박테리아로부터 식물을 보호하는 역할을 한다. 현재의 지론에 따르면, 플라보노이드는 영양적으로 중요한 화합물은 아니지만, 건강에 유익한 효과를 갖는 것으로 사료된다. 이러한 효과는 분명히 식물에 함유되어 있는 비타민 및 미네랄 성분과는 무관한 것이다. 플라보노이드의 섭취를 피할 수 있는 사람은 거의 없지만, 플라보노이드 섭취는 흡수특성과 생물학적 이용성, 및 부수적으로 동시에 획득한 플라보노이드의 상호작용에 의존적이다.

천연 페놀화합물이 항산화 효과를 갖는다는 것은 이미 오래전부터 알려진 사실이며, 일부 연구는 이들의 항산화 효과 및 자유 라디칼(free radicals)의 포획에 대해서 다루고 있다. 현재의 연구결과에 따르면, 플라보노이드의 가장 중요한 특징은 LDL 콜레스테롤의 산화를 방지할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 혈관의 내피하조직(subendothelium)에서 일어나는 LDL 콜레스테롤의 산화는 동맥경화를 유발하는 인자이다. 연구에 따르면, 음식물로부터 플라보노이드의 불충분한 섭취는 심장 및 혈관 질환에 의해서 유발되는 사망의 주요 원인이다. 플라보노이드와 관련하여 인간을 대상으로 한 연구에서, 가장 중요하게 작용하는 것으로 관찰된 일부 플라보이드 중 퀘르세틴(quercetin)은 LDL 콜레스테롤의 산화를 방지하는 것으로 확인되었고, 산화된 LDL 콜레스테롤은 동맥경화증의 진행과 관련이 있기 때문에 이러한 퀘르세틴의 효과는 관상질환에 걸릴 위험도를 낮추는 것으로 사료된다.

네델란드에서 실시된 연구에 따르면, 식품으로부터 플라보노이드의 일일 섭취량은 0-30 mg의 범위에서 다양하게 나타난다. 물고기를 대상으로 실시한 실험에서, 플라보노이드는 심장 및 혈관질환으로 의한 사망을 어느 정도 예방하는 효과를 나타내고, 이때 플라보노이드의 섭취량에 있어서 차이는 일일 총섭취량이 약 2-6 mg으로 다소 작았다. 네델란드에서 실시된 연구에서, 플라보놀(flavonols)을 제공할 수 있는 음식물과 심장 및 혈관 질환에 의한 사망율사이에 역관계가 관찰되었다. 또한 플라보놀 및 플라본(flavones)의 섭취와 심장경색의 위험사이에 역관계가 관찰되었다. 더욱이, 플라보노이드는 염증 및 면역반응뿐만 아니라 세포의 다른 다수의 기능에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 일부 플라보노이드와 그 외 다수의 천연 페놀 화합물은 세포내로의 칼슘 유입을 저해하거나 증가시킬 수 있고, 자세한 내용은 하기 표1에 요약되어 있다.

칼슘채널을 저해하는 약제는 심장 산소결핍증에 의해서 유발된 가슴통증과 같은 심장 및 혈관 질환, 심근경색, 동맥경화증 및 고혈압을 치료하는 데 있어서중요한 역할을 수행한다. 이러한 약제는 칼슘채널에 작용하여 칼슘의 세포내로의 유입을 저해함으로써 관상동맥을 확장시키고 혈관의 말초저항(peripheral resistance)을 저하시키고, 이때 심부담도가 감소한다. 칼슘 저해제를 자주 사용함에 따라 칼슘채널 저해효과를 갖는 천연 화합물을 스크리닝하기 위한 프로그램이 개발되었다. 이러한 스크리닝에서, 랫트(rat) 뇌하수체의 후엽에 있는 종양에서 유래한 확립 세포주(continuous cell line, GH₄C₁) 및 한번에 하나의 세포에 있는 각각의 칼슘채널을 조사할 수 있는 패치 클램프 기술(patch clamp technique)을 이용하였다. 스크리닝 결과, 칼슘채널을 저해하거나 활성화시키는 효과가 있는 천연 화합물 및 추출물이 발견되었고, 이러한 화합물은 식물유래 단순구조의 페놀(simple phenols), 쿠마린(coumarins), 플라보노이드 및 상기 화합물을 다량 함유하는 추출물을 포함한다. 이러한 화합물의 일부는 베라파밀(verapamil)과 유사한 칼슘채널 저해효과를 가지며, 또한 일부 화합물은 세포내로의 칼슘 유입을 향상시키는 효과를 가진다.

본 발명은 클라미디아 감염증의 치료 및 예방에 효과적인 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 이들을 포함하는 식물 추출물 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 클라미디아 감염증의 치료 및 예방에 있어서 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 이들을 포함하는 식물 추출물 및 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 이들을 포함하는 식물 추출물 및 조성물, 및 클라미디아 감염증의 치료 및 예방에 있어서 이들의 용도의 특징적인 특성은 본 발명에서 첨부한 특허청구범위에 기술되어 있고, 또한 건강에 유익하고 클라미디아 감염증의 치료 및 예방에 유용한 약제 또는 식품의 제조에 있어서 상기 화합물, 추출물 및 조성물의 용도의 특징적인 특성이 본 발명의 특허청구범위에 기술되어 있다.

놀랍게도 일부 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 및 상기 식물유래 화합물을 포함하는 식물 추출물, 분획 및 부분 분획(partial fractions)은 클라비디아에 대해 강한 저해활성을 갖는다. 본 발명에 따르면, 식물유래 페놀 화합물은 생합성 경로를 통해서 시킴산(shikimic acid)으로 부터 형성되는 페놀 화합물, 아세테이트-말로네이트(acetate-malonate) 생합성 경로를 통해서 형성되는 페놀 화합물, 및 상기 두 경로를 조합해서 형성되는 페놀 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은, 예를 들면, 단순한 구조의 아로메이트(aromates), 페놀(phenols), 쿠마린(coumarins), 리그난(lignans), 리그닌(lignins) 및 플라보노이드(flavonoids)는 과일 및 채소류와 같은 식물 및 이의 부산물, 특히 감귤열매, 야채, 딸기, 양파, 차(tea), 적포도주에서 수득될 수 있다.

일부 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 및 상기 식물유래 화합물을 포함하는 식물 추출물, 분획 및 부분 분획은 이들의 혼합물 형태로 사용될 수 있고, 필요에 따라서 알리신(alliicine) 또는 알리신의 유도체와 같은 마늘에 함유된 설퍼(sulphur) 화합물과 조합으로 사용될 수 있다.

바람직한 식물유래 천연 페놀 화합물은 플라보노이드, 페닐메탄과 페닐프로판 유도체, 페놀산(phenolic acids), 트리터펜(triterpenes), 쿠마린 및 카테신, 및 이들을 포함하는 추출물 및 부분 분획; 단순구조의 페놀, 플라보노이드, 이들의 유도체, 폴리페놀, 디터펜 페놀(diterpene phenols)과 디터펜 키논(diterpene kinones)을 포함하는 분획; 및 탄닌(tannin)과 디터펜 분획이 제거된 분획을 포함한다. 또한 상기 화합물에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 및 약제학적으로 허용되는 염, 에스터 및 상기 언급한 화합물의 유도체가 바람직하다.

본 발명의 실시예에서 정의된 바와 같이, 바람직한 화합물 및 이들의 유도체는 30% 또는 그 이상의 항-클라미디아 효과(봉입체(inclusions) 형성의 저해)를 가지며, 더욱 바람직하게는 90% 또는 그 이상의 항-클라미디아 효과를 가진다. 바람직한 화합물 및 추출물의 예는 하기에 나타낸 바와 같다.

- 아피게닌(apigenin), 루테오린(luteolin), 플라본(flavone)과 같은 플라본(flavones)

- 퀘르세틴(quercetin), 함네틴(rhamnetin), 모린(morin)과 같은 플라보놀 (flavonols)

- 나린긴(naringin)과 같은 플라보논(flavonones)

- 게니스테인(genistein)과 같은 이소플라본(isoflavones)

- 메틸 갈레이트(methyl gallate), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 옥틸 갈레이트(octyl gallate), 도데실 갈레이트(dodecyl gallate), 이소프로필 갈레이트(isopropyl gallate)와 같은 페닐메탄-유래 화합물

- 페닐프로판-유래 화합물:

예: - 움벨리페론(umbelliferone), 스코폴레틴(scopoletin), 메톡시 프소 라렌(methoxy psoralen), 잔토톡신(xanthotoxin), 쿠마린(coumarin)과 같은 쿠마린(coumarins)

- (-)-에피갈로카테킨((-)-epigallocatechin), (-)-에피카테킨((-)-epicatechin), (+)-카테킨((+)-catechin), (-)-에피카테킨 갈레이트((-)-epicatechin gallate)과 같은 플라반-3-올(flavan-3-ols)

- 합성 화합물:

예: 쿠마린(coumarins), 2′-메톡시-α-나프토-플라본(2′-methoxy-α-naphto-flavone), 6,2′-디메톡시플라본(6,2′-dimethoxyflavone), 6-메틸쿠마린 (6-methylcoumarin), 알파-나프토플라본(alpha-naphtoflavone), 로타논(rotanone), 7-디에틸-아미노-3-테노일쿠마린(7-diethyl-amino-3-thenoylcoumarin)과 같은 플라보노이드(flavonoids) 및 쿠마린 106(coumarin 106)

- 천연 식물 추출물:

예: 다음과 같은 식물에서 유래한 추출물: 멘타 로기폴리아(Mentha longifolia), 멘타 아벤시스(Mentha arvensis), 갈레옵시스 스페시오사(Galeopsis speciosa), 살비아 오피시나리스(Salvia officinalis), 티머스 불가리스(Thymus vulgaris), 루멕스 아세토셀라(Rumex acetocella), 로사 루고사(Rosa rugosa), 베로니카 론기폴리아(Veronica longifolia), 심피툼 아스페룸(Symphytum asperum), 아테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris), 콘발라리아 마자리스(Convallariamajalis), 퀘르커스 로버(Quercus robur), 도커스 카로타(Daucus carota), 프라가리아 이누마(Fragaria iinumae), 브라시카 오레라세아(Brassica oleracea), 브라시카 나푸스(Brassica napus), 메디카고 사티바(Medicago sativa), 시트루스 시넨시스(Citrus sinensis), 프로엠 프로(Phloem flour), 바시눔 미르티루스(Vaccinum myrtillus).

식물유래 페놀 화합물, 및 이들을 포함하는 식물 추출물 및 부분 분획은 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 식물 또는 식물의 일부로부터 수득될 수 있다. 줄기, 뿌리 또는 잎은 목적하는 추출물을 획득하기 위하여 적절히 탈수하여 침연(macerated)하거나 단지 탈수하고, 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 정제된다.

식물유래 페놀 화합물에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 유도체는 일반적으로 구매가능한 물질이거나, 공지의 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

하기 표1에서, 본 발명에 따른 바람직한 식물유래 페놀 화합물과, 이들 화합물들의 화학구조, 세포내로의 칼슘의 유입을 촉진하는 효과 및 항산화 효과가 요약되어 있다.

표1에서 제시되는 화합물의 화학구조 A, B, C, D, E는 하기 구조를 갖는다. 플라본(flavones)과 플라보놀(flavonols)는 A 구조, 플라바논(flavanones)는 B 구조, 이소플라본(isoflavones)는 C 구조, 페닐메탄 유도체는 D 구조, 페닐프로판 유도체는 E 구조를 갖는다. 치환그룹 R_1-7은 표1에서 제시된 각각의 기능기를 의미한다.

실시예 1 내지 4에서 식물유래 페놀 화합물인 퀘르세틴(quercetin), 모린(morin), 함네틴(rhamnetin), 옥틸 갈레이트(octyl gallate)의C. pneumoniae와C. trachomatis에 대한 항-클라미디아 효과를 조사하였다. 전처리된 숙주세포를 사용했을 때, 이들 화합물 모두는 0.5-50 ㎍의 농도에서C. pneumoniae의 성장을 저해하였고, 퀘르세틴, 모린 및 함네틴은C. trachomatis의 성장을 부분적으로 저해하는 효과를 나타냈다. 따라서,C. pneumoniae감염의 치료 및 예방을 위한 바람직한 화합물의 예는 퀘르세틴, 모린, 함네틴, 옥틸 갈레이트과 같은 페놀 화합물을 포함하고,C. trachomatis감염의 치료 및 예방을 위한 바람직한 화합물의 예는 퀘르세틴, 모린, 함네틴, 및 이들을 포함하는 추출물 및 부분 분획(partial fractions)을 포함한다.

또한, 실시예 5에서, 다른 식물유래 페놀 화합물, 일부 합성 플라보노이드 및 쿠마린, 및 식물유래 페놀 화합물과 마늘의 혼합물은 50 ㎍의 농도 범위에서 탁월한 항-클라미디아 효과를 나타냈다. 이와 유사하게, 마늘에 함유된 알리신(alliicine)은C. pneumoniae에 대해서 항-클라미디아 효과를 나타냈다.

실시예 6에서 천연 식물추출물 및 식이성 식물추출물은 탁월한 항-클라미디아 효과를 나타냈다.

화합물, 추출물 및 분획은 실시예에서 정의된 바와 같이 바람직하게는 30% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 90% 또는 그 이상의 항-클라미디아 효과 (봉입체(inclusions) 형성의 저해)를 갖는 것이다.

본 발명에 따른 클라미디아에 효과적인 화합물은 항산화제이고, 세포내로의 Ca²⁺의 유입을 촉진 또는 저해하는 효과가 있다.

옥틸 갈레이트(octyl gallate)는 통상적으로 식물첨가제로서 사용되는 화합물이다.

식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 식물 추출물, 분획, 및 이들의 혼합물은 아글리콘(aglycon)으로서 계산된 일일 투여량을 25 ㎍ 내지 3000 mg의 농도 범위로 하여 활성 성분으로서 투여될 수 있다. 본 발명에 따라서 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 식물 추출물, 분획, 및 이들의 혼합물은 캡슐, 정제, 연고, 액상제제 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 공지된 형태의 약제학적 제제로 제조될 수 있다. 이러한 약제학적 제제는 아글리콘(aglycon)으로서 계산된 일일 투여량이 25 ㎍ 내지 3,000 mg 범위, 바람직하게는 25 ㎍ 내지 500 mg 범위의 단위투여량으로 상기 활성 성분을 포함할 수 있다.

또한, 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 식물 추출물, 분획, 및 이들의 혼합물은 식품에 첨가되거나, 초본제제(herbal preparations), 양념(spices), 과립 등과 같은 식품으로 적당한 조성물로 제조될 수 있고, 이러한 조성물은 일일 음식물(daily nourishment) 또는 건강에 유익한 기능성 식품으로 사용되거나 일일 음식물 또는 기능성 식품에 첨가될 수 있으며, 여기서 상기 기능성 식품은 건강식(pro-health products)으로서 거의 가공처리된 식품(ready-prepared foods), 포리지(porridges), 샐러드 드레싱, 드링크제, 유제품, 식용지방, 냉동식품, 냉장건조식품, 특화식품(speciality food stuffs), 감자칩, 디핑소스(dipping sources) 등이 있다. 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체는 본 발명에 따른 조성물에서 아글리콘(aglycon) 형태 또는 글리코시드(glycosidic) 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 식물 추출물, 분획, 및 이들의 혼합물은 화합물로서 안정하다. 본 발명에 따른 화합물 및 제제는 급성 클라미디아 감염증의 치료과정에서 사용될 수 있고, 또는 클라미디아 감염증을 예방하기 위해서 일일 음식물과 함께 연속적이면서 규칙적으로 복용될 수 있다. 본 발명에 따른 식물유래 페놀 화합물, 이에 상응하는 합성 화합물 및 이들의 유도체, 식물 추출물, 분획 및 이들의 혼합물; 및 이들을 포함하는 새로운 조성물은 위험성이 있는 사람에서 심장 및 혈관 질환의 발병 및 악화를 효과적으로 예방하고 진행속도를 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물 및 제제는 급성C. trachomatis감염의 치료 및 예방, 및 불임, 자궁외 임신, 자궁경부암과 같은 말기 합병증을 예방하는 목적으로 사용될 수 있으며, 그 외 클라미디아와 관련된 감염 및 합병증의 치료 및 예방을 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에서 상세히 설명된다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서, 본 발명에 따른 화합물 및 식물추출물의C. trachomatis와C. pneumoniae에 대한 직접적인 항-클라미디아 효과 및 사용된 숙주세포(HL 세포, 인간 폐조직, 표준 이배체 세포주)에 대한 독성이 기술되어 있다.

실시예 1: 식물유래 페놀 화합물의C. pneumoniaeK7 균주(임상적으로 분리한 균)에 대한 (봉입체 형성의 저해와 같은) 직접적인 항-클라미디아 효과

결과 (화합물의 처리농도: 50 μM)

화합물(처리농도: 50 μM)	DMSO 대조군의 저해도(%)	DMSO 대조군(전처리됨)^*의 저해도(%)
퀘르세틴(quercetin)	90	90
모린(morin)	99	96
함네틴(rhamnetin)	99	59
옥틸 갈레이트(octyl gallate)	100	100
DMSO	0	0

*: 숙주세포는 감염전에 조사하고자 하는 화합물로 하루동안 처리하였다. 숙주세포를 24웰 플레이트에 넣은 후, 조사하고자 하는 화합물을 테스트 절차와 동일한 농도로 유지배지 1 ml에 넣어 각 웰에 첨가하였다. 이 실험의 목적은 상기 화합물이 숙주세포 자체에 대해 나타내는 효과를 조사하는 것이고, 여기서 상기 효과는 감염을 저해하는 요소가 될 수 있다. 테스트는 하기에 기술되어 있는 방법에 따라서 실시되었다.

결과 (화합물의 처리농도: 0.5 μM)

화합물(처리농도: 0.5 μM)	DMSO 대조군의 저해도(%)	DMSO 대조군(전처리됨)^*의 저해도(%)
퀘르세틴(quercetin)	68	77
모린(morin)	80	62
함네틴(rhamnetin)	73	50
옥틸 갈레이트(octyl gallate)	82	62
DMSO	0	0

실시예 2:C. pneumoniae에 대한 감염성 저해효과

결과 (화합물의 처리농도: 50 μM)

화합물(처리농도: 50 μM)	DMSO 대조군의 저해도(%)	DMSO 대조군(전처리됨)^*의 저해도(%)
퀘르세틴(quercetin)	76	0
모린(morin)	94	76
함네틴(rhamnetin)	100	67
옥틸 갈레이트(octyl gallate)	100	100
DMSO	0	0

결과 (화합물의 처리농도: 0.5 μM)

화합물(처리농도: 0.5 μM)	DMSO 대조군의 저해도(%)	DMSO 대조군(전처리됨)^*의 저해도(%)
퀘르세틴(quercetin)	58	0
모린(morin)	81	53
함네틴(rhamnetin)	100	75
옥틸 갈레이트(octyl gallate)	59	42
DMSO	0	0

*: 숙주세포는 감염전에 조사하고자 하는 화합물로 하루동안 처리하였다.숙주세포를 24웰 플레이트에 넣은 후, 조사하고자 하는 화합물을 테스트 절차와 동일한 농도로 유지배지 1 ml에 넣어 각 웰에 첨가하였다. 이 실험의 목적은 상기 화합물이 숙주세포 자체에 대해 나타내는 효과를 조사하는 것이고, 여기서 상기 효과는 감염을 저해하는 요소가 될 수 있다. 테스트는 하기에 기술되어 있는 방법에 따라서 실시되었다.

실시예 3:C. trachomatis에 대한 직접적인 항-클라미디아 효과

C. trachomatis는 McCoy 세포를 이용하여 배양하였고, 실험은C. pneumoniae의 경우와 동일한 방법에 따라서 실시하였다.

결과 (화합물의 처리농도: 50 μM)

화합물(처리농도: 50 μM)	DMSO 대조군의 저해도(%)	DMSO 대조군(전처리됨)^*의 저해도(%)
퀘르세틴(quercetin)	0	100
모린(morin)	0	100
함네틴(rhamnetin)	0	100
옥틸 갈레이트(octyl gallate)	14	88

결과 (화합물의 처리농도: 0.5 μM)

화합물(처리농도: 0.5 μM)	DMSO 대조군의 저해도(%)	DMSO 대조군(전처리됨)^*의 저해도(%)
퀘르세틴(quercetin)	0	20
모린(morin)	0	100
함네틴(rhamnetin)	0	17
옥틸 갈레이트(octyl gallate)	0	0

실시예 4: 일부 조사된 샘플의 숙주세포에 대한 독성도의 결정

독성도는 숙주세포를 감염시키지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일한 방법에 따라서 측정하였다. 생존도는 크립판 블루 염색(trypan blue staining)을 통해서 결정되었다.

샘플:

Q= 퀘르세틴

M= 모린

R= 함네틴

OG= 옥틸 갈레이트

HL-C= 영양배지에서만 자란 HL 세포

HL-CD= DMSO가 첨가된 배지에서 자란 HL 세포

독성 테스트 HL-C

독성 테스트 HL-C (전처리됨)

실시예 5: 식물유래 페놀 화합물, 일부 합성 화합물 및 이들의 혼합물의C. pneumoniae에 대한 직접적인 항-클라미디아 효과

화합물은 50 μM의 농도로 처리되었다.

1. 천연 플라보노이드

화합물	저해도(%)
아피게닌(Apigenin)	100
루테오린(Luteolin)	100
플라본(Flavone)	90
비텍신(Vitexin)	3
비텍신-2″-O-함노시드(Vitexin-2"-O-rhamnoside)	11
루테오린-7-글루코시드(Luteolin-7-glucoside)	23
루테오린-3′,7-글루코시드(Luteolin-3',7-glucoside)	45
퀘르세틴(Quercetin)	90
함네틴(Rhamnetin)	100
이소함네틴(Isorhamnetin)	70
모린(Morin)	100
퀘르시트린(Quercitrin)	50
루틴(Rutin)	46
나린게닌(Naringenin)	16
나린긴(Naringin)	66
다이드제인(Daidzein)	51
게니스테인(Genistein)	60
다이드진(Daidzin)	0
게니스틴(Genistin)	37
프로시아니딘 B1(Procyanidin B1)	30
르로시아니딘 B2(Procyanidin B2)	0

2. 천연 페놀산(phenolic acids)

화합물	저해도(%)
벤조산(Benzoic acid)	44
갈릭산(Gallic acid)	27
시린그산(Syringic acid)	32
카페산(Caffeic acid)	78
페룰산(Ferulic acid)	14
메틸 갈레이트(Methyl gallate)	100
프로필 갈레이트(Propyl gallate)	100
옥틸 갈레이트(Octyl gallate)	100
도데실 갈레이트(Dodecyl gallate)	100

3. 천연 트리테르펜(triterpene)

화합물	저해도(%)
레스베라트롤(Resveratrole)	54

4. 천연 쿠마린(Coumarins) 및 카테신(Cathecins)

화합물	저해도(%)
스코포레틴(Scopoletin)	96
메톡시 프소라렌(Methoxy psoralen)	100
움벨리페론(Umbelliferone)	75
잔토톡신(Xanthotoxin)	94
쿠마린(Coumarin)	28
(-)-에피카테친 갈레이트((-)-Epicatechin gallate)	85
(-)-에피갈로카테친((-)-Epigallocatechin)	58
(-)-에피카테친((-)-Epicatechin)	75
(+)-카테친((+)-Catechin)	76

5. 합성 플라보노이드(Flavonoids) 및 쿠마린(Coumarins)

화합물	저해도(%)
3-(α-아세토닐벤질)-4-히드록시쿠마린(3- (α-acetonylbenzyl)-4-hydroxycoumarin)	0
쿠마린 102	63
쿠마린 106	100
2′-메톡시-α-나프토플라본(2'-methoxy-a-naphtoflavone)	100
6,2′-디메톡시플라본(6,2'-dimethoxyflavone)	73
6-메틸쿠마린(6-Methylcoumarin)	71
알파-나프토플라본(Alpha-naphtoflavone)	92
로테논(Rotenone)	100
7-디에틸아미노-3-텐노일쿠마린(7-diethylamino-3-thenoylcoumarin)	100
3-(2-벤조사조일)움벨리페론(3-(2-benzoxazoyl)umbelliferone)	28
쿠마린 30	50
3-벤조일벤조(F)쿠마린(3-benzoylbenzo(F)coumarin)	62
6,8-디브로모쿠마린-3-카르복실산(6,8-dibromocoumarin-3-carboxylic acid)	0
4-메틸-3-페닐쿠마린(4-methyl-3-phenylcoumarin)	0

6. 혼합물

화합물	저해도(%)
오크틸갈레이트(Octylgallate)	100
오크틸갈레이트 1/10	53
오크틸갈레이트 1/100	17
갈릭(Garlic)	26
갈릭 1/10	25
갈릭 1/100	19
오크틸갈레이트 50% + 갈릭 50%	100
오크틸갈레이트 50% + 갈릭1/10	47
오크틸갈레이트 50% + 갈릭1/100	34
오크틸갈레이트 50% + 갈릭1/1000	6

실시예 6: 식물추출물의C. pneumoniae에 대한 효과

61개의 천연 및 식이용 식물유래 물질을 이용하여 제조한 101개의 추출물의C. pneumoniae에 대한 저해효과 및 생존도에 대해서 스크리닝을 실시하였고, 이때 추출물의 농도는 40 ㎍/웰이었다.

C. pneumoniae에 대해 가장 큰 활성을 갖는 것으로 결정된 천연 식물추출물에 대한 스크리닝 결과는 하기에 나타낸 바와 같고, 여기서 실험결과는 실험을 4회 실시하여 계산한 것이다.

식물	과	저해도(%)	생존도
N48. 멘타 로기폴리아(Mentha longifolia)	라비아테아(Labiateae)	100	OK
N53. 멘타 아벤시스(Mentha arvensis)	라비아테아	100	OK
N44. 갈레옵시스 스페시오사(Galeopsis speciosa)	라비아테아	100	OK
N57. 살비아 오피시나리스(Salvia officinalis)	라비아테아	100	OK
N57. 살비아 오피시나리스(Salvia officinalis)	라비아테아	100	OK
N58. 티머스 불가리스(Thymus vulgaris)	라비아테아	100	OK
N34. 루멕스 아세토셀라(Rumex acetocella)	폴리고나세아(Polygonaceae)	100	희박
N30. 로사 루고사(Rosa rugosa)	로사세아(Rosaceae)	100	OK
N28. 베로니카 론기폴리아(Veronica longifolia)	스크로푸라리아세아(Scrophulariaceae)	100	희박
N8. 심피툼 아스페룸(Symphytum asperum)	보라기나세아(Boraginaceae)	100	희박
N22. 아테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris)	아스테라세아(Asteraceae)	100	OK
N37. 콘발라리아 마자리스(Convallaria majalis)	콘발라리아세아(Convallariaceae)	100	-
퀘르커스 로버(Quercus robur)	파가세아(Fagaceae)	100	-

C. pneumoniae에 대해 100% 저해효과를 나타낸 가장 큰 활성을 갖는 것으로 결정된 천연 식물추출물에 대한 스크리닝 결과는 하기에 나타낸 바와 같고, 여기서 실험결과는 실험을 4회 실시하여 계산한 것이다.

식물	과	저해도(%)	생존도
D8. 도커스 카로타(Daucus carota)	움벨리페라(Umbelliferae)	100	-
D14. 프라가리아 이누마(Fragaria iinumae)	로사세아(Rosaceae)	100	희박
D16. 브라시카 오레라세아(Brassica oleracea)	크루시페라(Cruciferae)	100	OK
D17. 브라시카 나푸스(Brassica napus)	크루시페라(Cruciferae)	100	OK
D21. 메디카고 사티바(Medicago sativa)	레구미노사(Leguminosae)	100	OK
D23. 시트루스 시넨시스(Citrus sinensis)	루타세아(Rutaceae)	100	희박
D25. 프로엠 프로(Phloem flour)	폴리고나세아(Polygonaceae)	100	OK
D30. 바시눔 미르티루스(Vaccinum myrtillus)	에리카세아(Ericaceae)	100	OK
D31. 바시눔 미르티루스(Vaccinum myrtillus)	에리카세아(Ericaceae)	100	OK

유기적으로 배양된 식물과 정상적으로 자란 식물사이에 활성도에 있어서 유의성 차이는 관찰되지 않았다.

본 실험에서,C. pneumoniae봉입체(inclusions)(n=4)에 대해 100% 저해효과를 나타낸 식물추출물은 활성이 있는(active) 것으로 판단하였다. 특히, 라비아테아(Labiateae)과 에 속하는 5개의 식물은 활성이 있는 것으로 나타났다. 살비아 오피시나리스(Salvia officinalis)로 부터 탈수하여 침연(macerated)시켜 수득한 추출물과 단지 탈수하여 수득한 추출물은 추출방법에는 차이가 있었지만, 이들 모두C. pneumoniae에 대해 활성이 있는 것으로 나타났다.

본 발명에서 이용한 미생물학적 방법은 하기에 기술한 바와 같다.

1. HL 세포의 배양 및 계대배양

HL 세포는 3일 간격으로 계대배양된다. 숙주세포는 감염 실시 전날 접종된다. 세포는 1×PBS 10 ml을 이용하여 세척하고 트립신 처리(1:10 희석, 배양 플라스크당 1.5-2.0 ml 사용; 무균작업대(laminar flow cabinet)에 5분 둔 후 37℃ CO₂배양기에서 2분 동안 반응시킨다)하여 회수한다. 세포 현탁액은 영양배지(RN) ml당 3.5×10⁵세포가 되도록 희석한다. 배양은 37℃, 5% CO₂조건하에서 실시하고, RN 영양배지는 매주 1-2회 교환해준다. HL 세포는 동결배지(7.5% FCS(RN) 1 ml + DMSO 1 ml)를 이용하여 액체질소에 동결시켜 보관할 수 있다.

2. 클라미디아의 정제

기본소체(Elementary Body, EB)는 클라미디아의 감염성 세포외 형태이다. 미리 클라미디아로 감염시켜 동결 저장한 HL 세포 현탁액을 필요한 양만큼 녹인다. HL 세포를 잘 현탁시킨 후 2분 동안 초음파처리 한다 (진폭(amplitude) 24-25에서 20초 동안 초음파처리하고 10초 동안 냉각시키는 과정을 6회 실시). 이때, HL 세포는 파괴되고 클라미디아은 손상을 받지 않는다.

초음파처리된 세포 현탁액을 1,600 rpm(550×g)에서 10분 동안 원심분리한 후, 클라미디아가 있는 상층액을 취하고 HL 세포 찌꺼기는 버린다. 상층액에 5 ml PBS을 첨가하여 혼합한 후 1분 동안 초음파처리를 실시한다 (10초 동안 초음파처리하고 5초 동안 냉각시키는 과정을 6회 실시).

수득한 클라미디아는 -70℃에 동결한 상태로 저장될 수 있다.

3. 클라미디아 테스트 절차

배양된 HL 세포를C. pneumoniaeEB로 감염시킨다. EB는 숙주세포에 침투한 후 대사적으로 활성이 있는 망상체(reticulate body, RB)로 전환하여 엔도솜 액포(endosome vacuole) 또는 봉입체(inclusion)에서 2분열에 의해서 증식한다. 일정시간(약 72시간)이 경과한 후,C. pneumoniaeRB는 다시 EB 변환하여 응축하여 봉입체를 파괴한 후 숙주세포를 파괴하여 EB 형태로 방출된다. 이러한 원리를 이용하여 본 발명에서는 숙주세포가 파괴되기 전 형성된 봉입체를 증명하는 것이다.

in vitro 조건에서 HL 세포는C. pneumoniae에 대한 숙주세포로 사용되고, McCoy 세포는C. trachomatis에 대한 숙주세포로 사용된다.

HL 세포와 McCoy 세포의 감염

감염시키기 하루 전에 숙주세포를 다음과 같이 24웰 플레이트에 접종한다. 배양된 숙주세포를 트립신 처리하여 수거하고, 액체 영양배지 5 ml에 현탁시킨 후 버커 챔버(Burker's chamber)를 이용하여 세포수를 계산한다. 각 웰에 2.5×10⁵-4×10⁵개의 세포를 분주한다. 이때, 세포를 염색할 경우 커버 글래스(직경: 13 mm)를 웰에 먼저 넣은 후 세포를 분주한다. 각 웰에 최종부피가 1 ml이 되도록 액체 영양배지를 첨가한다. 다음 날, 세포를 목적하는 박테리아로 감염시킨다.

감염에 사용된 클라미디아 입자(particles)를 함유하는 용액은 완전히 혼합된 것이다. 기존의 액체 영양배지는 흡입하여 제거한다. -70℃에 저장되어 있는 접종원을 10³IFU 농도로 희석하여 용액의 총부피가 24웰 플레이트에서 웰당 적어도 200 ㎕이 되도록 한다. 숙주세포를 1시간 동안 1,600 rpm(550×g)에서 원심분리함으로써 감염시킨다. 영양배지를 제거하고 사이클로헥사미드(cyclohexamide)와 조사하고자 하는 화합물(0.2% DMSO)를 함유한 유지배지를 웰당 1 ml씩 넣은 후, 35℃, 5% CO₂조건하에서 배양한다.C. pneumoniae에 의해서 감염된 숙주세포는 3일 동안 배양한다. 2-3일 후, 유지배지를 제거하고 각 웰을 1×PBS 1 ml을 이용하여 세척한다. 추후에 감염에 사용하기 위하여 SPG 200 ㎕을 각 웰에 첨가한 후 파이펫 팁을 이용하여 세포를 수거하여 튜브로 옮긴다. 이와 같이 수거된 세포는 상기와 같은 특정 화합물에 의한 감염성(클라미디아성 효과)의 저해정도를 조사하는 실험에서 새로운 세포를 감염시키는 데 사용된다.

클라미디아 염색

염색하기 위해서 둔 커버 글래스 위에 있는 영양배지를 제거한다. 감염된 세포를 메탄올을 이용하여 커버 글래스 위에서 고정시킨다. 습윤실에서 커버 글래스를 각 웰어서 꺼내어 세포가 부착된 면을 아래로 하여 파라필름 위에 있는 적당한 형광물질이 부착된 단일클론 항체 위로 옮긴다. 커버 글래스를 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, PBS로 두번 세척하고 물로 한번 세척한다. 마지막으로, 건조시킨다. 커버 글래스를 세포가 부착된 면을 아래로 하여 고정제(예, 마운팅 배지(mounting medium))가 있는 물체 글래스(object glass) 위에 놓는다. 형광현미경하에서 관찰할 때, 클라미디아로 감염된 세포 배양 시료에서 빨간 색으로 염색된 배경에서 특징적인 애플-그린 형광을 띠는 봉입체가 관찰된다.

화학물질 및 시약

RN= FCS 영양배지: 3.5% L-글루타민과 10 mg 스트렙토마이신이 함유된 RPMI 1640 (Sigma) 100 ml, 7.5 ml FCS. 제조된 배지는 8℃에 보관한다.

유지배지: 50 ㎍ 사이클로헥사미드를 0.5 ㎍/ml 농도로 함유한 100 ml FCS 영양배지. 제조된 배지는 8℃에 보관한다.

PBS (Dulbecco's Phosphate buffered saline, Gibco), pH 7.4

SPG= 0.2 M 사카로스(saccharose, 37.5 g), 3.8 mM KH₂PO₄(0.26 g), 6.7 mM Na₂HPO₄×2H₂O (0.61 g), 5 mM 글루타믹산 (C5H9NO4) (0.36 g)을 milli-Q 정제수 500 ml에 녹여 제조. 멸균 후 -20℃에 보관.

FCS(Foetal Calf Serum, Gibco, 스코틀랜드)는 56℃에서 30분 동안 불활성화시키고 필터한 후 -70℃에 보관한다.

Claims

식물유래 페놀 화합물 또는 이를 포함하는 추출물, 분획 또는 부분분획, 또는 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 합성 유도체, 또는 선택적으로 상기 화합물과 마늘에서 유래한 설퍼(sulphur) 화합물과 혼합된 상기 화합물의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 클라미디아 감염증의 치료 및/또는 예방용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물 또는 이를 포함하는 추출물, 분획 또는 부분분획, 또는 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 합성 유도체의 항-클라미디아 효과는 본 발명의 실시예에서 정의된 바와 같은 봉입체(inclusions) 형성 저해효과로서 30% 또는 그 이상, 바람직하게는 90% 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물은 생합성 경로를 통해서 시킴산(shikimic acid)으로 부터 형성되는 페놀 화합물, 아세테이트-말로네이트(acetate-malonate) 생합성 경로를 통해서 형성되는 페놀 화합물 또는 상기 두 경로를 조합해서 형성되는 페놀 화합물, 또는 이를 포함하는 추출물 또는 분획 또는 부분분획 또는 단순구조의 페놀, 플라보노이드, 이들의 유도체, 폴리페놀, 디터펜 페놀(diterpene phenols)과 디터펜 키논(diterpene kinones)을 포함하는 분획,또는 상기 분획에서 탄닌(tannin)과 디터펜 분획이 제거된 분획인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물은 플라본(flavone), 플라보놀(flavonol), 플라보논(flavonone), 이소플라바노이드 (isoflavanoid), 페닐메탄-유래 화합물 또는 페닐프로판-유래 화합물이고, 상기 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 유도체는 합성 플라보노이드(flavonoid) 또는 합성 쿠마린(coumarin)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물, 분획 또는 부분분획은 천연 식물추출물 또는 식이용 식물추출물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물, 분획 또는 부분분획은 멘타 로기폴리아(Mentha longifolia), 멘타 아벤시스(Mentha arvensis), 갈레옵시스 스페시오사(Galeopsis speciosa), 살비아 오피시나리스(Salvia officinalis), 티머스 불가리스(Thymus vulgaris), 루멕스 아세토셀라(Rumex acetocella), 로사 루고사(Rosa rugosa), 베로니카 론기폴리아(Veronica longifolia), 심피툼 아스페룸(Symphytum asperum), 아테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris), 콘발라리아 마자리스(Convallaria majalis), 퀘르커스 로버(Quercus robur), 도커스 카로타(Daucus carota), 프라가리아 이누마(Fragaria iinumae), 브라시카 오레라세아(Brassica oleracea), 브라시카 나푸스(Brassica napus), 메디카고 사티바(Medicago sativa), 시트루스 시넨시스(Citrus sinensis), 프로엠 프로(Phloem flour), 또는 바시눔 미르티루스(Vaccinum myrtillus)의 추출물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 아피게닌(apigenin), 루테오린(luteolin), 플라본(flavone), 퀘르세틴(quercetin), 함네틴(rhamnetin), 모린(morin), 게니스테인(genistein), 메틸 갈레이트(methyl gallate), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 옥틸 갈레이트(octyl gallate), 도데실 갈레이트(dodecyl gallate), 이소프로필 갈레이트(isopropyl gallate), 움벨리페론(umbelliferone), 스코폴레틴(scopoletin), 메톡시 프소라렌(methoxy psoralen), 잔토톡신(xanthotoxin), 쿠마린(coumarin), (-)-에피갈로카테킨((-)-epigallocatechin), (-)-에피카테킨((-)-epicatechin), (+)-카테킨((+)-catechin) 및 (-)-에피카테킨 갈레이트((-)-epicatechin gallate)로부터 선택되는 식물유래 페놀 화합물, 쿠마린 106(coumarin 106), 2′-메톡시-α-나프토플라본(2′-methoxy-α-naphtoflavone), 6,2′-디메톡시플라본(6,2′-dimethoxyflavone), 6-메틸쿠마린 (6-methylcoumarin), 알파-나프토플라본(alpha-naphtoflavone), 로타논(rotanone) 및 7-디에틸-아미노-3-테노일쿠마린(7-diethyl-amino-3-thenoylcoumarin)로부터 선택되는 이에 상응하는 합성화합물 또는 이들의 유도체를포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 감염의 원인이C. pneumoniae일 경우 퀘르세틴(quercetin), 모린(morin), 함네틴(rhamnetin) 또는 옥틸 갈레이트(octyl gallate)를 포함하고, 감염의 원인이C. trachomatis일 경우 퀘르세틴(quercetin), 모린(morin) 또는 함네틴(rhamnetin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 식물유래 페놀 화합물 또는 이를 포함하는 추출물, 분획 또는 부분분획, 또는 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 합성 유도체, 또는 상기 화합물의 혼합물을 아글리콘(aglycon) 또는 글리코시드(glycosidic) 형태로 아글리콘으로서 계산된 양인 25 ㎍ 내지 3,000 mg의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
식물유래 페놀 화합물 또는 이를 포함하는 추출물, 분획 또는 부분분획, 또는 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 합성 유도체, 또는 선택적으로 상기 화합물과 마늘에서 유래한 설퍼(sulphur) 화합물과 혼합된 상기 화합물의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 건강용 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물 또는 이를 포함하는 추출물,분획 또는 부분분획, 또는 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 합성 유도체의 항-클라미디아 효과는 본 발명의 실시예에서 정의된 바와 같은 봉입체(inclusions) 형성 저해효과로서 30% 또는 그 이상, 바람직하게는 90% 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 건강용 조성물.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물은 생합성 경로를 통해서 시킴산(shikimic acid)으로 부터 형성되는 페놀 화합물, 아세테이트-말로네이트(acetate-malonate) 생합성 경로를 통해서 형성되는 페놀 화합물 또는 상기 두 경로를 조합해서 형성되는 페놀 화합물, 또는 이를 포함하는 추출물 또는 분획 또는 부분분획 또는 단순구조의 페놀, 플라보노이드, 이들의 유도체, 폴리페놀, 디터펜 페놀(diterpene phenols)과 디터펜 키논(diterpene kinones)을 포함하는 분획, 또는 상기 분획에서 탄닌(tannin)과 디터펜 분획이 제거된 분획인 것을 특징으로 하는 건강용 조성물.
제 10항 내지 제 12항의 어느 한 항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물은 플라본(flavone), 플라보놀(flavonol), 플라보논(flavonone), 이소플라바노이드 (isoflavanoid), 페닐메탄-유래 화합물 또는 페닐프로판-유래 화합물이고, 상기 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 유도체는 합성 플라보노이드(flavonoid) 또는 합성 쿠마린(coumarin)인 것을 특징으로 하는 건강용 조성물.
제 10항 내지 제 13항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물, 분획 또는 부분분획은 천연 식물추출물 또는 식이용 식물추출물인 것을 특징으로 하는 건강용 조성물.
제 10항 내지 제 14항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물, 분획 또는 부분분획은 멘타 로기폴리아(Mentha longifolia), 멘타 아벤시스(Mentha arvensis), 갈레옵시스 스페시오사(Galeopsis speciosa), 살비아 오피시나리스(Salvia officinalis), 티머스 불가리스(Thymus vulgaris), 루멕스 아세토셀라(Rumex acetocella), 로사 루고사(Rosa rugosa), 베로니카 론기폴리아(Veronica longifolia), 심피툼 아스페룸(Symphytum asperum), 아테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris), 콘발라리아 마자리스(Convallaria majalis), 퀘르커스 로버(Quercus robur), 도커스 카로타(Daucus carota), 프라가리아 이누마(Fragaria iinumae), 브라시카 오레라세아(Brassica oleracea), 브라시카 나푸스(Brassica napus), 메디카고 사티바(Medicago sativa), 시트루스 시넨시스(Citrus sinensis), 프로엠 프로(Phloem flour), 또는 바시눔 미르티루스(Vaccinum myrtillus)의 추출물인 것을 특징으로 하는 건강용 조성물.
제 10항 내지 제 15항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 아피게닌(apigenin), 루테오린(luteolin), 플라본(flavone), 퀘르세틴(quercetin), 함네틴(rhamnetin), 모린(morin), 게니스테인(genistein), 메틸 갈레이트(methylgallate), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 옥틸 갈레이트(octyl gallate), 도데실 갈레이트(dodecyl gallate), 이소프로필 갈레이트(isopropyl gallate), 움벨리페론(umbelliferone), 스코폴레틴(scopoletin), 메톡시 프소라렌(methoxy psoralen), 잔토톡신(xanthotoxin), 쿠마린(coumarin), (-)-에피갈로카테킨((-)-epigallocatechin), (-)-에피카테킨((-)-epicatechin), (+)-카테킨((+)-catechin) 및 (-)-에피카테킨 갈레이트((-)-epicatechin gallate)로부터 선택되는 식물유래 페놀 화합물, 쿠마린 106(coumarin 106), 2′-메톡시-α-나프토플라본(2′-methoxy-α-naphtoflavone), 6,2′-디메톡시플라본(6,2′-dimethoxyflavone), 6-메틸쿠마린 (6-methylcoumarin), 알파-나프토플라본(alpha-naphtoflavone), 로타논(rotanone) 및 7-디에틸-아미노-3-테노일쿠마린(7-diethyl-amino-3-thenoylcoumarin)로부터 선택되는 이에 상응하는 합성화합물 또는 이들의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강용 조성물.
제 10항 내지 제 16항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 감염의 원인이C. pneumoniae일 경우 퀘르세틴(quercetin), 모린(morin), 함네틴(rhamnetin) 또는 옥틸 갈레이트(octyl gallate)를 포함하고, 감염의 원인이C. trachomatis일 경우 퀘르세틴(quercetin), 모린(morin) 또는 함네틴(rhamnetin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 건강용 조성물.
식품으로 제조된 또는 일일 음식물에 첨가되는 것으로서 제 10항 내지 17항의 어느 한 항의 건강용 조성물의 용도.
클라미디아 감염증의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조에 사용되는 식물유래 페놀 화합물 또는 이를 포함하는 추출물, 분획 또는 부분분획, 또는 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 합성 유도체, 또는 선택적으로 상기 화합물과 마늘에서 유래한 설퍼(sulphur) 화합물과 혼합된 상기 화합물의 혼합물의 용도.
제 19항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물 또는 이를 포함하는 추출물, 분획 또는 부분분획, 또는 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 합성 유도체의 항-클라미디아 효과는 본 발명의 실시예에서 정의된 바와 같은 봉입체(inclusions) 형성 저해효과로서 30% 또는 그 이상, 바람직하게는 90% 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 또는 제 20항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물은 생합성 경로를 통해서 시킴산(shikimic acid)으로 부터 형성되는 페놀 화합물, 아세테이트-말로네이트(acetate-malonate) 생합성 경로를 통해서 형성되는 페놀 화합물 또는 상기 두 경로를 조합해서 형성되는 페놀 화합물, 또는 이를 포함하는 추출물 또는 분획 또는 부분분획 또는 단순구조의 페놀, 플라보노이드, 이들의 유도체, 폴리페놀, 디터펜 페놀(diterpene phenols)과 디터펜 키논(diterpene kinones)을 포함하는 분획, 또는 상기 분획에서 탄닌(tannin)과 디터펜 분획이 제거된 분획인 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 내지 제 21항의 어느 한 항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물은 플라본(flavone), 플라보놀(flavonol), 플라보논(flavonone), 이소플라바노이드 (isoflavanoid), 페닐메탄-유래 화합물 또는 페닐프로판-유래 화합물이고, 상기 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 유도체는 합성 플라보노이드(flavonoid) 또는 합성 쿠마린(coumarin)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 내지 제 22항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물, 분획 또는 부분분획은 천연 식물추출물 또는 식이용 식물추출물인 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 내지 제 23항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물, 분획 또는 부분분획은 멘타 로기폴리아(Mentha longifolia), 멘타 아벤시스(Mentha arvensis), 갈레옵시스 스페시오사(Galeopsis speciosa), 살비아 오피시나리스(Salvia officinalis), 티머스 불가리스(Thymus vulgaris), 루멕스 아세토셀라(Rumex acetocella), 로사 루고사(Rosa rugosa), 베로니카 론기폴리아(Veronica longifolia), 심피툼 아스페룸(Symphytum asperum), 아테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris), 콘발라리아 마자리스(Convallaria majalis), 퀘르커스 로버(Quercus robur), 도커스 카로타(Daucus carota), 프라가리아 이누마(Fragaria iinumae), 브라시카 오레라세아(Brassica oleracea), 브라시카 나푸스(Brassica napus), 메디카고 사티바(Medicago sativa), 시트루스 시넨시스(Citrus sinensis), 프로엠 프로(Phloem flour), 또는 바시눔 미르티루스(Vaccinum myrtillus)의 추출물인 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 내지 제 24항의 어느 한 항에 있어서, 상기 식물유래 페놀 화합물은 아피게닌(apigenin), 루테오린(luteolin), 플라본(flavone), 퀘르세틴(quercetin), 함네틴(rhamnetin), 모린(morin), 게니스테인(genistein), 메틸 갈레이트(methyl gallate), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 옥틸 갈레이트(octyl gallate), 도데실 갈레이트(dodecyl gallate), 이소프로필 갈레이트(isopropyl gallate), 움벨리페론(umbelliferone), 스코폴레틴(scopoletin), 메톡시 프소 라렌(methoxy psoralen), 잔토톡신(xanthotoxin), 쿠마린(coumarin), (-)-에피갈로카테킨((-)-epigallocatechin), (-)-에피카테킨((-)-epicatechin), (+)-카테킨((+)-catechin) 및 (-)-에피카테킨 갈레이트((-)-epicatechin gallate)로부터 선택되는 식물유래 페놀 화합물, 2′-메톡시-α-나프토플라본(2′-methoxy-α-naphtoflavone), 6,2′-디메톡시플라본(6,2′-dimethoxyflavone), 6-메틸쿠마린 (6-methylcoumarin), 알파-나프토플라본(alpha-naphtoflavone), 로타논(rotanone) 및 7-디에틸-아미노-3-테노일쿠마린(7-diethyl-amino-3-thenoylcoumarin)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 내지 제 25항의 어느 한 항에 있어서, 감염의 원인이C. pneumoniae일 경우 퀘르세틴(quercetin), 모린(morin), 함네틴(rhamnetin) 또는 옥틸 갈레이트(octyl gallate)이 사용되고, 감염의 원인이C. trachomatis일 경우 퀘르세틴(quercetin), 모린(morin) 또는 함네틴(rhamnetin)이 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 19항 내지 제 26항의 어느 한 항에 있어서, 식물유래 페놀 화합물 또는 이를 포함하는 추출물, 분획 또는 부분분획, 또는 이에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 합성 유도체, 또는 상기 화합물의 혼합물을 아글리콘(aglycon) 또는 글리코시드(glycosidic) 형태로 아글리콘으로서 계산된 양인 25 ㎍ 내지 3,000 mg의 양으로 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.