KR101419706B1

KR101419706B1 - 생체내에서의 항염증 효능이 증가된 염증치료용 루테올린 혼합 조성물을 제조하는 방법 및 항염증이 증가된 염증치료용 루테올린 혼합 조성물

Info

Publication number: KR101419706B1
Application number: KR1020120156213A
Authority: KR
Inventors: 최인욱; 박용곤; 하상근; 최희돈; 임진선
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-07-15
Also published as: KR20140086115A

Abstract

본 발명은, 루테올린에 하기 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물을 첨가함으로써 생체내에서의 항염증 효능이 증가된 루테올린 혼합 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 생체내에서의 루테올린의 항염증 효능을 증가시키기 위하여 특정한 구조의 천연 화합물을 생체내 루테올린 간 대사의 competitor로서 혼합하는 혼합 조성물의 제조방법 및 그 제조방법에 의하여 제조된 생체내에서의 항염증 효능이 증가된 루테올린 혼합 조성물을 제공할 수 있다.

Description

생체내에서의 항염증 효능이 증가된 염증치료용 루테올린 혼합 조성물을 제조하는 방법 및 항염증이 증가된 염증치료용 루테올린 혼합 조성물{Method of Manufacturing Mixing Composition of Luteolin with improved anti-inflammatory property and The Composition manufactured by the method}

본 발명은 항염증 효능이 증가된 루테올린 혼합 조성물을 제조하는 방법 및 항염증이 증가된 루테올린 혼합 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 루테올린의 생체내에서의 대사체 연구를 통하여 항염증 효능을 증가 및/또는 유지시키는 제조방법 및 그 제조방법에 의하여 제조된 루테올린 혼합 조성물에 관한 것이다.

'파이토(Phyto)'는 그리스어로 식물을 의미하는 말로 파이토케미칼이란 식물 속에 들어있는 화학물질을 말한다. 이들 화학물질은 원래 식품이 함유한 당질, 단백질, 지방, 무기질, 비타민 등의 영양소와는 다른 것으로 주로 식품의 색과 맛, 그리고 향을 제공하는 물질을 의미한다. 현재까지 밝혀진 파이토케미칼의 수는 1000종류가 넘고 연구를 통해 이들 중 다수가 우리 몸을 질병으로부터 보호하는 기능을 보유하고 있음이 보고되고 있다. 예를 들자면 면역시스템을 자극하기도 하고 암의 성장을 돕는 발암물질로부터 우리 몸을 보호하거나 바이러스, 박테리아 및 질병의 원인 물질로부터 몸을 방어하는 역할을 하며, 또한 DNA 손상을 막거나 손상된 DNA복원을 도와주기도 하고 산화 혹은 노화된 세포들의 손상을 막거나, 오염된 물질로부터의 노출을 막아주기도 한다. 때로는 암세포 성장속도를 늦추어 에스트로겐이나 인슐린과 같은 호르몬 조절을 도와주기도 한다.

파이토케미컬에는 대표적으로 카로티노이드와 플라보노이드가 있다.

카로티노이드는 브로콜리, 당근, 익힌 토마토, 잎채소, 고구마, 겨울 호박, 살구, 멜론, 오렌지, 수박과 같이 색이 진한 과일과 야채에 함유되어 있는데 이것은 암세포의 성장을 억제하고 항산화제와 면역증강의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

플라보노이드는 사과, 감귤류 과일, 양파, 콩, 두부 우유와 같은 콩 제품과, 커피, 차에 함유되어 있는데 이것은 감염과 암 성장의 억제효과가 있고 면역력과 체내 효소의 독을 제거하는 물질을 증가시켜 주는 것으로 알려져 있다.

상기 파이토케미컬들은 생체내에서 대사과정을 거쳐 다른 형태의 화학형으로 전환되는 효소적 과정을 거치게 되는 것으로 알려져 있다. 주로 약물의 대사과정으로 많이 연구된 Phase 1 및 Phase 2의 대사과정을 유사하게 거칠 것으로 예상이 되는데, 종류에 따라 다르긴 하지만, 대체적으로 생체내에서 전환된 대사체들은 배설이 잘되게 하기 위한 목적에 따라 생리활성이 감소되는 것이 일반적이다.

따라서, 플라보노이드 등의 파이토케미컬의 효능에 관한 연구는 생체내에서 실질적으로 흡수 및 이용되는 대사체가 효능을 잃지 않도록 하거나, 기존의 효능을 더욱 증가시키는 대사과정에 대한 연구가 매우 중요함을 알 수 있다.

한편, 염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상이 나타난다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric Oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드신타제 (nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX(시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다.

또한, 시클로옥시게나제도 2종류의 이소형태가 존재하는데, 시클로옥시게나제-1(cyclooxygenase-1, COX-1)은 세포내에 항상 존재하여 세포보호작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 작용을 나타내는 것에 반하여, COX-2는 염증반응시 세포내에서 급격히 증가되어 염증 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. NO와 PGs의 정도를 향상시키는 iNOS 및 COX-2를 포함하는 전사 염증 인자는 다양한 경화(sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 및 결장암(colon cancer)을 포함하는 만성 질환의 병인에 관련한다.

TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되고 있다. 여러 염증질환과 알러지 현상에 TNF-α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, TNF-α는 호중성 백혈구를 활성화 시켜 과산화수소 생성을 증가시킴으로써 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다. 따라서, 발암촉진 단계와 밀접한 관계가 있는 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 사이토카인인 TNF-α의 발현을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 프로스타글란딘 PGE2의 생성 억제를 통해 초기염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다. 세균감염 하에서 항생제로 치료시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇼크(endotoxin shock)을 일으키며, 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우, 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 생체내에서의 루테올린의 항염증 효능을 증가시키기 위하여 특정한 구조의 천연 화합물을 생체내 루테올린 간 대사의 competitor로서 혼합하는 혼합 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의하여 제조된 생체내에서의 항염증 효능이 증가된 루테올린 혼합 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 것으로, 루테올린에 하기 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물을 첨가함으로써 생체내에서의 항염증 효능이 증가된 루테올린 혼합 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물은 플라보노이드(flavonoids) 및 카로티노이드(carotinoids)에 속하는 화합물인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 플라보노이드는 플라보놀(flavonol) 그룹, 플라본(flavone) 그룹, 플라바논(flavanone) 그룹 및 플라바놀(flavanol) 그룹으로 이루어진 군에 속하는 화합물 중 선택되는 1종 이상의 화합물인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 플라보노이드는 퀘르세틴(quercetin), 에리오딕티올(eriodyctiol) 및 에피카테킨(epicatechin)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 루테올린; 및 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물을 포함하는 항염증이 증가된 루테올린 혼합 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 의하면, 생체내에서의 루테올린의 항염증 효능을 증가시키기 위하여 특정한 구조의 천연 화합물을 생체내 루테올린 간 대사의 competitor로서 혼합하는 혼합 조성물의 제조방법 및 그 제조방법에 의하여 제조된 생체내에서의 항염증 효능이 증가된 루테올린 혼합 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 루테올린의 standard sample(20μM)의 retention time을 나타낸 HPLC분석 그래프.
도 2는 HepG2세포를 이용한 루테올린 대사체 생성의 경시적 변화를 분석한 그래프.
도 3은 HepG2 세포와 휴먼 유래 일차배양 헤파토사이트를 통한 루테올린의 대사체 생성 패턴을 비교한 그래프.
도 4는 β-Glucuronidase, sulfatase, COMT inhibitor를 이용한 루테올린의 대사체의 생성을 규명하는 그림.
도 5는 루테올린과 루테올린 0, 6, 24시간 대사체가 Raw 264.7 cell의 NO 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 6은 루테올린 간 대사체의 Raw 264.7 cell에서의 흡수 정도를 나타낸 분석결과.
도 7은 COMT inhibitor의 첨가가 루테올린의 간 대사체 생성에 미치는 영향을 나타내는 분석 결과.
도 8은 COMT inhibitor 첨가에 따른 루테올린 대사체의 NO, TNF-α, IL-1β 생성억제력 변화를 나타낸 그래프.
도 9는 루테올린과 첨가물질인 퀘르세틴, 에리오딕티올, 에피카테킨의 세포 독성실험을 MTT 분석법으로 측정한 독성 실험 결과.
도 10는 루테올린에 COMT competitor로서의 퀘르세틴을 첨가하였을 때의 효능을 분석한 그래프.
도 11은 루테올린, 퀘르세틴, 에리오딕티올 및 에피카테킨의 각각 단독물질의 항염증 효과를 나타낸 그래프.
도 12는 루테올린 및 루테올린에 첨가물질을 혼합한 혼합물에 의하여 NO의 생성이 억제되는 효과를 나타낸 그래프.

본 발명은, 루테올린에 하기 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물을 첨가함으로써 생체내에서의 항염증 효능이 증가된 루테올린 혼합 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

이하, 본 발명을 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

루테올린과 같은 플라보노이드 및 카로티노이드들은 생체내에서 여러가지 대사과정을 거쳐 대사체들을 생성하게 된다. 그 중 간에서 일어나는 간 대사는 Phase 1 및 Phase 2로 나뉘어 물질에 따라 다양한 여러 가지 효소들에 의하여 이루어지게 된다. 이러한 간 대사의 예로는 산화, 환원반응 및 메틸레이션(methylation) 효소에 의한 메틸화 반응, 설페이션(sulfation) 효소에 의한 반응, 글루쿠로닌 결합 반응(glucuronidation) 등을 들 수 있으며, 이러한 반응에 의하여 생체내에서의 물질들은 주로 생체이용성 등의 효율이 줄어들어 배출되는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 루테올린이 생체내에 흡수된 후에도 항염증 효과와 같은 효능을 그대로 유지케 하거나, 증가시키는 것을 목적으로 하는 것으로서 루테올린의 대사과정에서의 경쟁자(competitor)를 천연물질 중에 선별하여 첨가함으로써 루테올린의 항염증 효능을 유지할 수 있도록 하는 데 있으며, 그러한 천연물질로서 상기 화학식 1의 카테콜기를 내부에 작용기로서 함유하고 있는 물질이 그와 같은 작용을 하는 것을 발견하여 본 발명에 이르렀다.

루테올린은 하기의 화학식 2로 표시되는 화합물로서 내부에 카테콜기를 작용기로 함유하고 있다.

[화학식 2]

상기 루테올린의 메틸레이션을 포함한 대사를 억제시키는 물질에 관하여 탐색을 하는 가운데, 상기 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 내부에 작용기로 함유하고 있는 물질들이, 생체내간대사 과정에서 메틸레이션 효소의 기질로서 상기 루테올린과 경쟁을 함으로써, 루테올린의 메틸레이션 작용을 억제시켜 초기 대사과정이 일어나지 않게 하는 것을 발견하였으며, 결과적으로 항염증 효능을 잃지 않는 것을 실험적으로 확인하였다.

상기 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물은 플라보노이드(flavonoids) 및 카로티노이드(carotinoids)에 속하는 천연물질인 것이 바람직하다.

또한, 상기 플라보노이드는 카테콜기를 작용기로 함유하고 있는 물질이면 그 대상이 될 수 있으며, 예를 들어 플라보놀(flavonol) 그룹, 플라본(flavone) 그룹, 플라바논(flavanone) 그룹 또는 플라바놀(flavanol) 그룹에 속하는 화합물일 수 있다.

상기 플라보노이드 중 카테콜기를 작용기로 함유하고 있는 물질의 예로 퀘르세틴(quercetin), 에리오딕티올(eriodyctiol) 및 에피카테킨(epicatechin)의 구조식을 다음의 식으로 나타내었다.

[퀘르세틴]

[에리오딕티올]

[에피카테킨]

본 발명의 다른 일면은 루테올린; 및 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물을 포함하는 항염증이 증가된 루테올린 혼합 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

[실시예]

1. 재료 및 방법

가) 시료 및 시약

본 실험에 사용된 퀘르세틴(quercetin)과 루테올린(luteolin), 에리오딕티올(eriodictyol), 에피카테킨(epicatechin)은 Sigma Co.(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였으며, HepG2(hepatocellular carcinoma) 세포는 ATCC (HB-8065)에서 분양받아 사용하였다.

나) HepG2 세포 대사체의 추출 및 분리

HepG2 세포를 DMEM media를 사용하여 6well plate에 2×10⁶/ml로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 overnight incubation하였다. 루테올린(luteolin)의 최종농도를 20μM으로 희석하여 세포에 처리한 후 3, 6, 24시간 incubation하였다. 이때, HepG2 세포에 처리하지 않고 DMEM media에 20μM 루테올린(luteolin)을 처리한 실험군을 대사체가 추출되지 않은 control군(0시간)으로 설정하였다. 얻어진 상등액은 -70℃에 보관하여 실험에 사용하였다.

다) HPLC를 이용한 HepG2 세포 대사체 함량 분석

HepG2 세포와 함께 루테올린(luteolin) 20μM을 각각 37℃에서 3, 6, 24시간 인큐베이션(incubation)한 후 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액의 1.5배의 100% methanol로 루테올린(luteolin)의 대사체를 추출하였다. 이 추출 과정에서 대사체의 안정성(stability)을 높이기 위해 1mM의 아스코빅산(ascorbic acid)을 첨가하여 상등액의 산성화 조건을 유지시켰다. 이후, 14,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 13mm 0.45μm 100units의 PVDF SYRINGE FILTER에 통과시킨 후 HPLC분석에 이용하였다. HepG2 세포를 이용한 루테올린(luteolin) 대사체의 HPLC 분석 조건은 표 1에 나타내었다.

Instrument	Waters 2545 Quaternary Gradient Module
Column	ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6×250mm, 5μm
Flow rate	1mL/min
UV detecter	370nm(Quercetin), 350nm(Luteolin)
Solvent	A - Water : tetrahydrofuran : trifluoroacetic acid (98:2:0.1) B - Acetonitrile
Gladient	17% B(2min), 25% B(5min), 35% B(8min), 50% B(5min),100% B(5min), 17% B(15min)

라) 대식세포에서 HepG2 세포 대사체의 항염증 효과

Raw 264.7 세포를 96well plate에 2×10⁵/well로 분주하여 6시간 인큐베이션(incubation)하였다. DMEM배지를 제거하고, 0시간, 6시간 HepG2 세포 대사체 시료 180㎕를 30분간 처리한 후 LPS 1㎍/㎖을 20㎕ 넣고 18시간 인큐베이션하였다. 원심분리하여 얻은 상등액 100㎕에 Griess reagent 시약을 100㎕ 넣고 15분간 반응하여 ELISA 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Standard로 NaNO₂를 사용하여 표준곡선을 산출하였다.

마) 루테올린(Luteolin)의 농축

루테올린 대사체를 통과시키기 전에 Amberlite XAD7HP (SIGMA, XAD7-500G) resin을 80% MeOH로 2회, Water로 2회 워싱(washing)하였다. 루테올린(luteolin)의 대사체가 포함된 상등액에 1.5배의 100% 메탄올(MeOH)을 넣어 가볍게 섞어 XAD7HP 컬럼에 통과시켰다. Water 2회로 resin에 침착된 대사체 이외의 불순물을 제거하였다. 그 다음 80% MeOH로 대사체를 회수하였다. 80% MeOH로 회수한 대사체를 Evaporator를 통해 농축시킨다. 완전 농축시킨 후 80% MeOH로 회수하고 14000rpm, 5min, 4℃ 처리해 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 13mm 0.45μm 100units의 PVDF SYRINGE FILTER에 통과시킨 후 HPLC분석하여 루테올린(luteolin)의 농축된 농도를 산출하였다.

바) Primary human hepatocyte culture

Pooled mixed gender cyropreserved human hepatocyte는 In Vitrogen (Lot. No. Hue110, 10 donors)에서 구입하였고 사용하기 전까지 액체질소 탱크에 보관하였다. 실험에 앞서 헤파토사이트(hepatocyte)는 2분 이내에 37℃에서 해동한 후 Williams Medium E에 희석하고 100×g에서 10분간 원심분리하였다. 헤파토사이트펠렛(Hepatocyte pellet)은 Williams Medium E를 사용하여 재부유시켰으며 트립판 블루(trypan blue)로 염색한 후에 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 세포수를 측정하였다. 대사체 생성 실험을 위해 24 well plate에 0.7×10⁶cell/well로 세포를 seeding 하여 실험에 이용하였다.

사) β-glucuronidase, sulfatase를 이용한 conjugated된 대사체 동정

실험에 사용된 샘플 대사체의 글루쿠로니데이션(glucuronidation), 설페이션(sulfation)된 형태를 동정하기 위해 β-glucuronidase와 sulfatase 효소를 이용하였다. β-glucuronidase 가수분해의 경우 0.2M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)(ph 6.8)에 β-glucuronidase를 100U 첨가하여 37℃에서 90분간 반응하였다. sulfatase를 이용한 가수분해의 경우 0.1M 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer)(ph 5.0)에 sulfatase를 10U 첨가하여 37℃에서 120분간 반응하였다. 또한, sulfatase는 β-glucuronidase 활성을 함께 가지고 있으므로 β-glucuronidase inhibitor인 saccharic acid 1,4-lactone (30 mM)도 함께 처리하였다. 대사체는 HPLC (Waters Corp)를 이용하여 분석하였다.

아) TNF-α와 IL-1β 측정

Raw 264.7 세포(2×10⁵cells/well)는 96-well plate에 배양되었다. 세포에서 분비된 TNF-α와 IL-1β 등의 사이토카인(cytokines)의 생성에 미치는 샘플의 효능을 평가하기 위해 LPS(1μg/ml) 처리 후, 18시간에 배양액을 원심분리하여 상층액을 취하고, TNF-α와 IL-1β의 ELISA kit(R&D Systems)를 이용하였다. 대식세포 활성은 양성대조군으로 LPS를 처리하여 비교하였다. TNF-α와 IL-1β 농도를 측정하기 위해 포획 항체(capture antibody)로서 monoclonal anti-rat TNF-α와 IL-1β를 이용하였고 detection antibody로 polyclonal anti-rat TNF-α와 IL-1β antibody를 이용하였다. Biotynylate된 anti-TNF-α와 IL-1β는 streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) conjugate와 chromogenic substrate와 배양한 후 측정하였다. 최종 반응액은 450nm에서의 흡광도를 측정하여 대조군(standard)과의 비교를 통해 TNF-α와 IL-1β 농도를 산출하였다.

자) 루테올린(Luteolin) 대사체 생성조절

루테올린 대사체 생성을 조절하기 위해 catechol-O-methyltransferase (COMT) inhibitor인 Ro 41-0960(Sigma)를 사용하였다. Human 간세포주인 HepG2에 루테올린 단독 혹은 Ro 41-0960을 함께 처리하여 6시간 동안 배양하였다. 6시간 배양 후, 배지 상층액을 취하여 항염증 효능을 Raw 264.7 세포에서 평가하였다. 또한 Ro 41-0960에 의한 루테올린 대사체 생성 조절은 배지 상층액을 2배 볼륨의 MeOH를 가해 프로테인(protein)을 침전시키고 14,000×g로 원심분리한 후 HPLC 분석을 통해 확인하였다.

2. 결과

가) 항염증 플라보노이드의 간 대사체 형성

1) 루테올린

HepG2세포를 이용하여 루테올린의 대사체 산물을 HPLC 분석을 통해 검토하였다. 루테올린 standard를 이용하여 루테올린의 retention time이 18.2min임을 확인하였다(도 1).

도 1은 루테올린의 standard sample(20μM)의 retention time을 나타낸 HPLC분석 그래프이다.

루테올린의 HepG2 세포에서 생성되는 대사체 형성 패턴을 검토하였다. HepG2세포와 루테올린을 1시간 인큐베이션한 경우, 22.6min 피크의 대사체가 먼저 생성되고, 3, 6시간 인큐베이션하면 그 면적이 더 증가하였고, 또한 14～16.5min 피크 면적도 뒤따라 현저하게 증가하였다. 이후 24시간 인큐베이션하면 22.6min 피크 면적이 감소되면서 13.5～16min 피크 면적이 더 증가하였다.(도 2)

도 2는 HepG2세포를 이용한 루테올린 대사체 생성의 경시적 변화를 분석한 그래프이다.

나) 플라보노이드 간 대사체 구명

1) Primary hepatocytes와 HepG2에서의 플라보노이드의 대사 차이분석

간암세포주인 HepG2 Cell(Human Hepatocellular Caricinoma)과 primary cell인 헤파토사이트(hepatocyte)의 대사체 생성 패턴의 차이를 검토하였다. HepG2 세포에 처리한 방법과 동일하게 primary hepatocyte에 루테올린 20uM을 처리하여 각각 0, 6, 24시간 인큐베이션하였다. 그 결과 primary hepatocyte의 루테올린 대사체 생성 패턴이 HepG2 Cell의 대사체 생성 패턴과 유사함을 관찰할 수 있었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 HepG2 Cell과 human primary hepatocyte를 통한 루테올린의 대사체 생성 패턴을 비교한 그래프이다.

HPLC 패턴 분석결과, primary hepatocyte와 HepG2의 루테올린 대사패턴은 크게 차이나지 않는 것으로 감안하여 리플리케이션(replication)이 가능하고 많은 양의 대사체 생성에 적합한 HepG2를 루테올린의 간 대사를 위한 cell culture로 사용하기로 하였다.

2) 루테올린 대사체 구명

루테올린의 대사체를 규명하기 위해 루테올린과 HepG2세포를 0, 6, 24시간 인큐베이션하여 XAD7HP 컬럼을 통과시킨 샘플(L-0hrXAD, L-6hrXAD, L-24hrXAD)에 대해 β-Glucuronidase, sulfatasae, COMT inhibitor처리를 하였다. 기존의 연구결과로 retention time 22.6min에 생성되는 대사체 피크는 메틸레이션(methylation)된 루테올린(leu-Me)일 가능성이 있고, 14-16min에 생성되는 대사체 피크는 luteolin-glc, luteolin-sulf일 가능성이 예상되었기 때문에, L-6hrXAD샘플에 대해서는 COMT inhibitor를, L-24hrXAD샘플에 대해서는 β-Glucuronidase, sulfatase를 각각 처리하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 L-6hrXAD 샘플에 COMT inhibitor를 처리하면 22.6min 대사체 피크가 소멸되고 루테올린 피크 지역(area)이 증가하였다(도 4a). 또한, L-24hrXAD 샘플에 β-Glucuronidase를 처리하면 14-15min에서 생성되는 두 개의 peak가 소멸되었고 22.6min 피크 지역(area)이 증가하였다. 다음으로 L-24hrXAD 샘플에 β-Glucuronidase활성을 포함하는 sulfatase를 처리하면 15-16min에 생성되는 두 개의 대사체 피크가 거의 소멸되고 22.6min peak area가 증가하였다(도 4b). 이 결과로부터 14-15min에서 생성되는 두 개의 대사체 피크는 luteolin-glu, 15-16min에 생성되는 대사체 피크는 luteolin-sulf, 22.6min에 생성되는 대사체 피크는 luteolin-Me일 가능성이 시사되었다. 또 22.6min 대사체 피크가 먼저 생성되는 점과, β-Glucuronidase, sulfatase를 처리하였을 때 22.6min 대사체 피크가 증가하는 점을 고려해볼 때, 14-16min에 생성되는 대사체 피크는 Me-luteolin-glu, Me-luteolin-sulf일 가능성이 크다고 여겨진다.

도 4는 β-Glucuronidase, sulfatase, COMT inhibitor를 이용한 루테올린의 대사체의 생성을 규명하는 그림이다.

이상과 같은 결과를 종합해 보면, 루테올린은 헤파토사이트에 흡수되어 제일 먼저 Phase II enzyme인 COMT의 작용으로 4'에 메틸레이션(methylation)이 일어나며, 이렇게 형성된 diosmetin이 또 다른 Phase II enzyme인 sulfotransferase(SULT)의 작용으로 diosmetin-sul conjugates를 우선적으로 형성하며, 마지막 단계로 UDP-glucuronosyltransferase(UGT)의 작용으로 diosmetin-glc conjugate를 형성하는 것으로 판단된다.

3) 루테올린 대사체의 항염증 효능

루테올린과 HepG2 세포를 통해 생성된 루테올린의 0, 6, 24시간 대사체가 항염증 효능을 지니는지 NO생성 여부를 통해 검토하였다. NO생성 측정 샘플로는 도 5에 나타내는 바와 같이, 루테올린을 직접 Raw 264.7 Cell에 처리한 루테올린 대조군(L-Std:positive control), 루테올린을 0, 6, 24시간 HepG2 세포에 적용시킨 L-0hr, L-6hr, L-24hr을 XAD7HP를 통과시킨 샘플을 적용하였다. 그 결과, 루테올린은 NO 생성을 농도 의존적으로 현저히 억제시켰다. 또한, 루테올린 6, 24시간 대사체의 NO 생성 억제 효과에 대해서는, 20uM L-6hrXAD에서는 NO생성 억제 효과를 띄지 않았으나, 50uM L-6hrXAD의 경우 50%정도 NO생성을 억제시켰다. L-6hrXAD는 luteolin-Me(Diosmetin) 대사체가 현저하게 생성되는 시간이므로 실제로 Diosmetin이 NO 생성 억제 효과를 띄는지 검토하였다. 그 결과 Diosmetin은 농도에 관련없이 NO 생성을 50%이상 억제시켰다. L-24hrXAD의 경우, 농도를 높혀도 NO 생성에는 영향을 미치지 않았다. 이와 같은 결과로 NO 생성 억제 효능은 루테올린이 가장 현저하였고 루테올린의 초기 대사체인 diosmetin에서도 어느 정도 효과가 기대되었다.

도 5는 루테올린과 루테올린 0, 6, 24시간 대사체가 Raw 264.7 cell의 NO 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

다음으로 Raw 264.7 cell의 NO 생성 억제 효과와 루테올린의 Raw 264.7 cell에 대한 흡수가 관련하는지 검토하였다. Raw 264.7 Cell에 18시간 LPS처리 후, L-0hrXAD, L-6hrXAD, L-24hrXAD 20uM에 해당하는 양을 Raw 264.7 cell에 처리하여 3시간 인큐베이션하였다. LPS의 효과를 비교하기 위해 LPS를 처리하지 않은 컨트롤 샘플도 검토하였다. 3시간 후에 medium과 Cell lysate를 회수하여 HPLC 분석을 하였다. 그 결과 NO 생성 억제 효과를 띄는 루테올린과 L-6hr(Diosmetin)은 Raw 264.7 Cell 안으로 흡수되었고, LPS 유도 후에는 더 많은 양의 루테올린과 L-6hr(Diosmetin)이 Raw 264.7 Cell안으로 흡수됨을 관찰할 수 있었다. NO 생성 억제 효과를 띄지 않는 L-24hrXAD는 Raw 264.7 Cell에 거의 흡수 되지 않았다.

도 6은 루테올린 간 대사체의 Raw 264.7 cell에서의 흡수 정도를 나타낸 분석결과이다.

루테올린과 diosmetin의 Raw 264.7 cell 내부로의 흡수가 LPS의 자극으로 증가됨과 동시에 Raw 264.7 cell에서의 다른 대사체(metabolites)로의 변환을 기대하였으나 luteolin이나 diosmetin의 대사체로의 전환은 일어나지 않은 것으로 판단된다. 이와 같은 결과는 luteolin의 구조가 diosmetin보다 특정 target protein의 발현을 suppressing하는데 더욱 효과적으로 작용할 것으로 판단된다.

다) 루테올린 간 대사체 생성억제 기술

1) COMT inhibitor를 이용한 루테올린의 간 대사 억제효능

루테올린의 경우, 간에서 COMT에 의해 메틸레이션되면서부터 항염증 효능이 급격히 저하되었는데, 이와 같이 간에서의 대사를 회피하기 위하여 COMT inhibitor인 Ro-41-0960을 루테올린과 함께 간에서 대사시켰을 때 항염증 효능의 변화를 관찰하였다. COMT inhibitor와 함께 6시간 동안 대사시켰을 때 COMT inhibitor를 첨가하지 않은 군에 비해 diosmetin으로의 대사가 확연히 억제되었음을 알 수 있었다(도 7).

도 7은 COMT inhibitor의 첨가가 루테올린의 간 대사체 생성에 미치는 영향을 나타내는 분석 결과이다.

이들 대사체가 Raw 264.7 cell의 NO 생성에 미치는 영향을 관찰한 결과, COMT inhibitor를 첨가하였을 때, 대사체의 NO와 TNF-α, IL-1β 생성억제능력이 향상되었으며(도 8), 이와 같은 결과는 루테올린의 대사체로의 전환을 COMT inhibitor가 어느 정도 억제할 가능성을 시사해주고 있다.

도 8은 COMT inhibitor 첨가에 따른 루테올린 대사체의 NO, TNF-α, IL-1β 생성억제력 변화를 나타낸 그래프이다.

천연물에서 COMT inhibitor 또는 luteolin 보다 COMT의 작용을 더 용이하게 받을 수 있는 물질(COMT competitor)에 대한 연구를 진행하기 위해, 간 대사에서 COMT의 작용을 용이하게 받는 물질로서 하기 화학식 1의 카테콜기를 작용기로 함유하고 있는 파이토케미컬 중 퀘르세틴, 에리오딕티올 및 에피카테킨을 루테올린 대사의 competitor로서 첨가물질로 선별하였다.

[화학식 1]

상기 첨가물질을 루테올린에 혼합한 혼합 조성물과 루테올린과의 간 대사 변화와 항염증 효능을 비교하였다.

라) MTT(colorimetric assay) 분석

루테올린과 첨가물질인 퀘르세틴, 에리오딕티올, 에피카테킨의 세포 독성실험은 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자주빛 formazan 생성물로 변하는 MTT 환원을 바탕으로 한 MTT 분석법으로 측정하였다. Sample을 단독 혹은 LPS와 함께 24시간동안 배양한 후에 MTT 용액 (0.5mg/ml)을 2시간 동안 처리하였다. MTT-formazan생성물은 DMSO를 사용하여 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과는 도 9에 나타내었으며, 이로부터 루테올린, 퀘르세틴, 에리오딕티올, 에피카테킨은 세포독성이 없음을 알 수 있다.

마) LPS 처리에 의하여 유도된 NO 생성억제 활성 측정

루테올린(10μM)에 퀘르세틴(10~30μM)을 혼합하였을 경우, 간 대사(6시간) 과정을 HPLC로 분석한 결과, 퀘르세틴의 첨가가 거의 농도 의존적으로 루테올린의 메틸레이션을 억제하고 반면에 퀘르세틴은 메틸레이션에 소진되고 있음을 보여주고 있다. 그에 따른 항염증 효능도 퀘르세틴을 첨가함으로서 루테올린이 가진 NO 생성억제효능보다 더욱 효과적인 결과를 보여주고 있다(도 10).

도 10는 루테올린에 COMT competitor로서의 퀘르세틴을 첨가하였을 때의 효능을 분석한 그래프이다.

도 11은 루테올린, 퀘르세틴, 에리오딕티올 및 에피카테킨의 각각 단독물질의 항염증 효과를 나타낸 그래프이다. 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이 각각 단독물질로서는 루테올린이 염증유발물질인 NO 생성에 대한 억제효능이 20μM 첨가 수준에서 상당히 효과적이었으나, 퀘르세틴, 에리오딕티올 및 에피카테킨은 LPS로 자극받은 Raw 264.7 cell의 NO 형성에 전혀 작용하지 않거나, 효과가 매우 적은 것으로 나타났다.

도 12에 루테올린 및 루테올린에 첨가물질을 혼합한 혼합물에 의하여 NO생성이 억제되는 효과를 나타내었다.

6시간 대사 후에 루테올린만을 첨가하였을 때의 NO생성은 루테올린을 첨가하지 않았을 때와 비교하여 약 70%정도가 되었으나, 퀘르세틴, 에리오딕티올 및 에피카테킨을 각각 10, 20, 30㎛ 첨가하고 6시간 대사 후 NO 생성은 최대 10% 이하까지 줄어들었고, 모든 경우에서 30%를 넘지 않았다.

Claims

루테올린에 하기 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물을 첨가함으로써 생체내에서의 항염증 효능이 증가된 염증치료용 루테올린 혼합 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물은 에리오딕티올(eriodyctiol) 또는 에피카테킨(epicatechin)인 것을 특징으로 하는 염증치료용 루테올린 혼합 조성물을 제조하는 방법.
[화학식 1]
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루테올린;및
화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물
을 포함하는 항염증이 증가된 염증치료용 루테올린 혼합 조성물에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 카테콜기를 작용기로 포함하는 화합물은 에리오딕티올(eriodyctiol) 또는 에피카테킨(epicatechin)인 것을 특징으로하는 염증치료용 루테올린 혼합 조성물.
[화학식 1]
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