KR20030046122A

KR20030046122A - 녹차 추출물 유래의 고순도 ＥＧＣｇ 분리 방법

Info

Publication number: KR20030046122A
Application number: KR1020010076527A
Authority: KR
Inventors: 조남훈; 이상준; 김완기; 박현우; 심영철
Original assignee: 주식회사 태평양
Priority date: 2001-12-05
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2003-06-12
Also published as: KR100418605B1

Abstract

본 발명은 녹차 추출물로부터 항산화 효능이 우수한 에피갈로카테킨 갈레이트[(-)Epigallocatechin Gallate, EGCg]를 고순도로 대량 분리하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 녹차 추출물에 카페인을 첨가함으로써 녹차 카테킨 혼합물로부터 EGCg와 ECg를 선택적으로 분리하고, EGCg-카페인과 ECg-카페인이 형성된 침전물을 아스코르빈산과 같은 유기산이 첨가된 수용액을 사용하여 효율적으로 용해시키고, 아스코르빈산과 같은 유기산이 첨가된 용리액을 이용하여 칼럼 크로마토그래피함으로써 안정성과 생산성이 뛰어난 고순도 EGCg을 분리하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

녹차 추출물 유래의 고순도 ＥＧＣｇ 분리 방법 {Process for the production of high purified (-)Epigallocatechin Gallate from Green tea extract}

본 발명은 녹차 추출물 유래의 고순도 에피갈로카테킨 갈레이트[(-)Epigallocatechin gallate, EGCg]를 분리하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 녹차 추출물에 카페인을 첨가함으로써 녹차 카테킨 혼합물로부터 EGCg와 에피카테킨 갈레이트(Epicatechin gallate, ECg)만을 선택적으로 침전 및 분리하고, 이를 합성 흡착제 충진물을 채운 칼럼 크로마토그래피에 로딩한 후 아스코르빈산(ascorbic acid)과 같은 유기산을 첨가한 용리액에서 용리시킴으로써 EGCg의 안정성과 그 생산성을 높인 고순도 EGCg를 분리하는 방법에 관한 것이다.

다른 식물에 비하여 녹차에는 특징적으로 볼 수 있는 성분 중 폴리페놀류가 다량 함유되어 있어 일반식물과는 달리 항암효과, 항산화효과, 항균효과 등의 여러 생리활성이 있는 것으로 알려져 있다. 그 폴리페놀류 중에서 카테킨(catechin)은 녹차의 효능을 나타내는 성분으로 가장 잘 알려져 있다. 자연계에 존재하는 녹차 카테킨에는 크게 8가지 성분이 존재하는데 이 중 에피카테킨[(-)EC], 에피갈로카테킨[(-)EGC], 에피카테킨 갈레이트[(-)ECg]및 에피갈로카테킨 갈레이트[(-)EGCg]등이 일반적인 차 카테킨으로 지칭된다. 그 중에서도 EGCg는 차 카테킨류 중에서도 구성 비율이 가장 높고, 각종 기능적인 효과도 뛰어난 것으로 알려져 있다. 일반적으로 차 잎의 총 건중량 중 10~15%가 차 카테킨 함량이며 이 중에서 EGCg가 50~60%를 차지하고 있으나 재배 기후, 토양 또는 녹차의 종에 따라 함량의 차이가 있는 것으로 알려져 있다.

최근, 녹차의 인체에 대한 건강 효능은 세계적으로 주목을 받고 있고, 세계각국에서 생체 효능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 녹차 카테킨 중 EGCg는 항산화효과부터 콜레스테롤 저하, 중성지방 상승억제, 항종양, 항암 및 피부미용, 비만억제, 중금속 제거, 돌연변이원성 억제작용, 혈압강하, 중추신경계 활성화 작용, 심장혈관질환 억제에 이르는 다양한 효과가in vitro및in vivo임상시험 결과 보고되고 있다. 이에, 녹차 카테킨으로부터 고순도의 EGCg를 효율적으로 추출하여 정제하고 대량생산을 가능하게 하는 제조기술이 제안되고 있다.

지금까지 알려진 녹차에서의 고순도 EGCg 제조방법으로, 유럽 EP1077211호(발명의 명칭:EGCg 생산공정)에서는 다공성 극성 충진물이 채워진 칼럼 크로마토그래피와 용리액으로서 알코올과 같은 유기용매를 사용하여 고순도 EGCg 분리하는 공정에 대해 제시하였다. 상기 특허에서 제시한 공정 중 XAD-7 충진제를 이용한 방법은 물/이소프로판올(isopropanol)(9:1 v/v)를 용리액으로 사용하여 90%이상의 EGCg를 분리하였고 총 EGCg 함량 중 73.5%를 회수하였다. 또한, 충진물이 채워진 칼럼의 조업온도를 60℃로 유지하기 위해 자동 온도조절장치를 사용한 특징이 있다. 그러나, XAD-7 충진물과 자동 온도조절장치를 사용하여 고순도 EGCg를 분리한 상기 특허의 방법은 주(主) 용리액에서의 EGCg농도가 0.064%로서 분말화하는 정제공정에서 많은 시간과 비용이 소요되어 전체적인 제조 효율이 다소 떨어지는 문제점이 있다. 또한, 칼럼 온도를 일정하게 유지하기 위해 자동 온도조절장치를 사용함으로써 이 장치를 갖추기 위한 추가적인 비용이 드는 문제점이 있다.

미국 US4613672호(발명의 명칭:차 카테킨 생산공정)에서는 용리액으로 아세톤/테트라하이드로푸렌/클로로포름(acetone/tetrahydrofuran/chloroform)을 사용하고 C₁₈을 역상 칼럼으로 사용한 HPLC(고속액체크로마토그래피)법으로 EGCg를 분리한 결과, 90%이상의 고순도 EGCg를 분리하였고 총 EGCg 함량 중 72%를 회수하였다. 그러나, 상기 방법은 용리액에 사용된 유기용매의 종류가 많고 매우 유독하며 최종 산물에 이러한 유독 유기용매가 잔류되어 있을 우려가 있어 식품으로서의 안전성과 작업상의 애로점이 있다. 또한, 상업적 이용을 위한 제조방법이 아닌 실험상 C₁₈충진물이 채워진 칼럼을 이용한 HPLC법으로서 고순도의 EGCg를 분리한 것이기 때문에 보다 저렴한 고순도의 EGCg를 공급하기에는 충진물의 재평가가 이루어져야 하는 문제점이 있다.

미국 US6210679호(발명의 명칭:녹차로부터 무카페인-카테킨 분리방법)은 95%이상의 무카페인-EGCg를 분리하는 공정으로서, 4단계 연속 공정이며 각 공정마다 폴리아마이드(polyamide) CC6 또는 C₁₈충진물이 충진된 칼럼을 사용하여 순차적으로 EGCg의 순도를 높이는 공정이다. 그러나, 4단계 연속공정을 거쳐 EGCg의 순도를 순차적으로 높이기 위해서는 두 종류의 충진물을 사용하여야 하는 번거로움이 있고, 한 단계로 고순도 EGCg를 높이는 것이 아니라 4단계 연속공정을 거쳐야 하므로 제조공정이 다소 복잡한 문제점이 있다.

국내공개특허 특1999-007629호(발명의 명칭:녹차로부터 항암성분의 추출 및 정제공정)에는 녹차로부터 물을 사용하여 추출하는 공정, 클로로포름과 에틸아세테이트를 사용하여 층 분리에 의해 분배하는 공정, 준-제조용 액체 크로마토그래피를 사용하여 EGCg를 정제하는 공정 및 역상 액체 크로마토그래피를 이용하여 EGCg를분리하는 공정으로 구성된 카테킨 추출공정이 공개되어 있다. 상기 발명에서는 15㎛인 Lichrospher 100RP-18이 채워진 칼럼(250X4.60mm)을 이용한 HPLC법으로 녹차로부터 90%이상의 EGCg를 분리하였다. 그러나, 상기 방법도 상업적인 이용이 아닌 실험상의 연구결과로서, 보다 저렴한 고순도의 EGCg를 상업상 이용이 가능하도록 대량 공급하기 위해서는 충진물의 재평가가 이루어져야 하는 문제점이 있다.

상기의 모든 공개 방법으로 녹차 추출물에서 고순도의 EGCg를 분리할 경우 우려가 될 수 있는 문제점을 보완하고 인체에 대한 안정성 및 상업상 생산성을 높이기 위한 고순도 EGCg의 분리방법의 개발이 절실한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 녹차 추출물로부터 녹차의 유효성분인 녹차 카테킨 EGCg를 분리하는데 소요되는 시간과 비용을 줄여 공정의 생산성을 높이고, 안정한 EGCg를 획득하기 위해 연구한 결과, 카페인을 이용한 1차 선택적 침전법으로 EGCg 및 ECg를 선택적으로 침전시키고, 침전물의 용해도를 높이기 위해 침전물 수용액 제조시 유기산을 첨가하여 일정시간 가열하고, HP-20을 포함한 합성 흡착제를 채운 하나의 칼럼에서 로딩한 후 유기산을 첨가한 물과 알코올 용리액에서 용리함으로써 녹차 추출물에서 90%이상의 고순도 EGCg를 분리하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 녹차 추출물에 카페인을 첨가하여 녹차 카테킨 성분 중 EGCg와 ECg만를 선택적으로 결합 및 침전시킨 후, 할로겐화 유기용매를 사용하여 상기 인위적으로 첨가된 카페인을 제거하며, 또한 용매-용매 추출을 용이하게 해주고 침전물의 용해도를 증가시키며 EGCg의 안정성을 높이기 위해 유기산을 첨가사용함으로써 90% 이상의 EGCg를 고순도로 분리하는 방법을 제공하는데 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

도 1은 85%이상 폴리페놀을 함유한 녹차 추출물의 크로마토그램.

도 2는 카페인 처리 유무에 대한 차 카테킨의 침전률 변화(녹차 추출물 1g기준).

도 3은 녹차 추출물과 카페인 혼합시 온도 변화에 따른 상등액에서의 차 카테킨 변화.

도 4는 카페인을 처리한 후 상등액의 크로마토그램.

도 5는 카페인을 첨가한 후 침전물의 크로마토그램.

도 6은 15% 에탄올 수용액(0.01% 아스코르빈산 첨가)으로 용리하였을 경우 90%이상의 고순도 EGCg 크로마토그램.

도 7은 15% 에탄올 수용액(0.01% 아스코르빈산 첨가)으로 용리하였을 경우 고순도 ECg 크로마토그램.

도 8은 본 발명 고순도 EGCg 분리공정도.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명 공정은 (1) 녹차 카테킨에서 EGCg를 선택적으로 분리하는데 시간과 비용이 많이 드는 단점을 보완하기 위해 카페인을 첨가사용하여 녹차 카테킨 중 EGCg와 ECg만를 선택적으로 침전시키는 1차 선택적 침전법을 이용하였고, (2) 할로겐화 유기용매를 사용하여 인위적으로 첨가된 카페인을 제거하는 단계에서 용매-용매 추출을 용이하게 해주고 침전물의 용해도를 증가시키며 EGCg의 안정성을 높이기 위해 유기산을 첨가한 후 가열하였으며, (3) 카페인이 제거된 침전물 수용액을 칼럼 크로마토그래피에서 용리하는 동안 화학적 변성이 일어날 우려가 있으므로 이를 억제하기 위해 용리액에 유기산을 첨가하여 사용하였다는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 다음의 공정으로 이루어진다.

1) 85%이상의 폴리페놀을 함유한 녹차 추출물(zhejiang Chemicals I./E. Corp., China)과 카페인을 각각 용해시켜 수용액을 제조하는 단계.

2) 상온~80℃ 온도범위에서 상기 녹차 추출물과 카페인 수용액을 혼합하는 단계.

3) 혼합한 상기 녹차추출물-카페인 수용액을 0~10℃온도로 2~24시간동안 빛이 차단된 곳에서 정치하여 침전물을 형성하는 단계.

4) 상기 형성된 침전물을 24시간 이내에 상등액과 분리하여 침전물 수용액을제조하는 단계.

5) 상기 침전물 수용액에 산을 첨가하고 가열하여 침전물 수용액을 용해시키는 단계.

6) 카페인만을 선택적으로 분리할 수 있는 할로겐화 유기용매를 사용하여 상기 침전물 수용액에 함유되어 있는 카페인을 분리하는 단계.

7) 합성 흡착제를 채운 칼럼크로마토그래피에 카페인이 제거된 상기 침전물 수용액을 로딩한 후 유기산이 첨가된 물 알코올 용리액에서 용리하는 단계.

8) 유기산이 첨가된 DW로부터 알코올의 농도를 15%까지 높여주면서 90%이상의 고순도 EGCg를 분리하는 단계.

9) EGCg를 분리한 후 알코올 농도를 25%까지 높여주어 고순도 ECg를 분리하는 단계.

녹차 추출물과 카페인 용액을 각각 준비한 후 혼합함으로써, 카페인의 물리화학적 특성인 수소결합 및 소수성효과(hydrophobic effect)에 의해 galloyl기가 포함된 녹차 폴리페놀류 EGCg, ECg만을 선택적으로 카페인과 함께 침전시킨다.

카페인-EGCg 및 카페인-ECg 침전물로부터 카페인을 제거하기 위해 용매-용매 추출법을 사용한다. 침전물을 수용액에 용해시킬 때 아스코르빈산, 사과산 또는 붕산과 같은 유기산이 함유된 수용액을 첨가한 후 가열하여 용해시키면 쉽게 용해되어 시간과 비용을 줄일 수 있다. 이후, 클로로포름과 같은 할로겐화 유기용매를 사용하여 용매-용매 추출로 카페인을 용이하게 제거한다.

수용액에 포함된 EGCg와 ECg을 각각 순수 분리하기 위해, 세파덱스 HP-20과같은 합성 흡착제가 채워진 칼럼 크로마토그래피를 이용한다. 이 때 사용한 용리액은 알코올 용매와 물의 혼합액을 사용하는데, 100% DW(증류수)로부터 시작하여 점차적으로 알코올 농도를 증가시킨 용리액에서 고순도 EGCg를 분리한다. 수득한 90% 이상의 고순도 EGCg 수용액을 combiHT XDB-C18 컬럼 및 THF 용리액을 이용하거나 또는 세파덱스 LH-20 컬럼 및 100% 에탄올, 100% 아세토니트릴 또는 에탄올-아세토니트릴 혼합 유기용매 용리액을 이용하여 99% 이상의 EGCg를 실험적으로 분리할 수 있다.

기존의 방법에서는 EGCg를 분리한 후 산을 처리함으로써, 칼럼 크로마토그래피에서의 정제 및 용리시 수분에 의해 쉽게 산화되어 발생할 수 있는 EGCg의 산화적 변성을 억제할 수 없었다. 본 발명에서는 이러한 단점을 보완하기 위하여 용리액에 아스코르빈산과 같은 유기산을 첨가하여 안정성과 회수율을 높여주었다. 이때, 칼럼 크로마토그래피에 사용된 HP-20 흡착제는 용리액에 유기산이 포함되어 있어도 분리능에는 전혀 문제가 없다.

본 발명에서 제조된 90% 이상의 고순도 EGCg와 ECg 수용액을 건조 분말화하여 다양한 용도로 사용할 수 있다.

이하, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 하지만 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 녹차 추출물과 카페인 혼합시 각 성분의 중량비에 따른 침전율 평가

폴리페놀을 85%이상 함유하는 녹차 추출물(zhejiang Chemicals I./E. Corp.,China)을 원료로 사용하였다. 카페인이 포함된 녹차 폴리페놀의 성분비를 UV흡광도를 이용한 HPLC로 확인하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, 85% 이상의 폴리페놀을 함유한 녹차 추출물의 카테킨 및 일반성분을 표 1에 정리하여 나타내었다.

화합물	함량 (%)
카페인	16.93
EGC	1.73
EC	5.61
EGCg	40.85
ECg	22.60
Ash	<0.5%
Arsenic(As, AS₂O₃)	<2PPM
heavy Metals(ppm/max)	<10ppm
Agricultural chemical residue	<1000CFU/gm
Total bacteria	<100CFU/gm
Yeast and mold	negative
E.coli	negative
Salmonela	negative

상기와 같은 녹차 추출물에 카페인을 처리하여 침전물을 제조하였다. 카페인 처리 유무에 대한 녹차 카테킨의 침전률 변화를 측정한 결과, 카페인 처리구에서 카테킨의 함량이 높게 나타나는 것을 알 수 있다(도 2). 이에, 상기 85% 이상 폴리페놀 함유 녹차 추출물에 인위적으로 카페인의 중량을 달리하여 첨가함으로써 추출용액 중 카페인의 농도 변화에 따른 EGCg와 ECg 등 차 카테킨의 침전율을 평가하였다.

상기 추출한 85% 이상의 폴리페놀 함유 녹차 추출물을 카페인 1을 기준으로 하여 중량대비 1/6~7배(w/w)의 여러 농도로 첨가한 후 침전율을 평가한 결과, 카페인:녹차 추출물 중량비가 1:1이상일 때 상등액에서의 EGCg 감소율이 98%이상으로 나타났다. 또한 85%이상의 폴리페놀 함유 녹차 추출물을 1로 기준하여 카페인의 중량대비 0.02~1배(w/w)로 첨가하여 평가한 결과, 녹차 추출물:카페인 중량비가 1:0.2(w/w)이상일 때 침전율이 가장 높았다. 따라서, 85%이상의 폴리페놀 함유 녹차 추출물:카페인은 5:1인 중량비가 가장 효율적인 침전율을 보였다.

카페인과 85%이상의 폴리페놀 함유 녹차 추출물을 혼합하여 침전시킬 경우 85%이상의 폴리페놀 녹차추출물은 비중이 0.40g/㎖이고, 상온에서의 카페인 용해도는 0.2g/10㎖로 낮다. 따라서, 두 물질을 같이 혼합하여 수용액을 제조하면 두 물질이 완전 용해되지 않는 상태에서 침전이 일어나 침전율이 떨어질 우려가 있으므로 녹차 추출물과 카페인을 각각 다른 수용액에 용해시킨 다음 두 수용액을 섞어 주었다.

실시예 2 : 녹차 추출물과 카페인 혼합시 정치 시간에 따른 침전율 평가

85%이상의 폴리페놀 함유 녹차 추출물과 카페인 혼합액의 정치 시간에 따른 EGCg와 ECg의 침전율을 평가하였다.

상기 실시예 1에서 준비한 녹차 추출물:카페인 질량비가 5:1로 침전율이 높은 수용액을 각각 만들고 두 수용액을 혼합한 다음, 빛이 차단된 곳에서 0~10℃, 2~24시간 동안 정치시킨 후 카테킨 중 EGCg와 ECg의 침전율 변화를 측정하였다

그 결과, 6시간 정치의 경우 침전율은 85.7%, 24시간의 경우 84.8% 침전율을 보여 시간이 지남에 따라 침전율의 차이는 크게 나타나지 않았다. 따라서, 녹차 추출물과 카페인을 각각 용해시킨 후 서로 혼합하여 6시간을 정치시킨 다음 침전물과 상등액을 분리하였다.

실시예 3 : 녹차 추출물과 카페인 혼합시 조업온도에 따른 침전율 평가

85%이상의 폴리페놀 함유 녹차 추출물과 카페인 혼합액의 상온~80℃ 온도 범위의 조업온도 변화에 따른 EGCg와 ECg의 침전율을 평가하였다.

녹차 추출물과 카페인 질량비를 5:1로 각각 수용액을 만들고 두 수용액을 혼합한 다음 상온~80℃ 범위에서 10분간 중탕시킨 후, 빛이 차단된 곳에서 0~10℃온도에서 6시간동안 정치시켰다. 녹차 추출물과 카페인 혼합시의 온도에 따른 상등액에서의 차 카테킨의 변화를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 온도에 따른 녹차 추출물과 카페인의 침전율의 차이는 크게 나타나지 않았으며 온도 증가에 의해 녹차 카테킨의 함량도 변하지 않았으므로, 상온에서 침전시켰다.

또한, 상온에서 녹차 추출물과 카페인을 혼합한 후 혼합액을 빛에 노출되지 않는 곳에서 0~10℃의 온도로 정치시켜야 하는데, 이는 녹차 카테킨은 빛에 노출되면 광산화 반응에 의한 화학적 변성이 일어나기 쉽고, 녹차 추출물과 카페인이 반응하여 형성된 침전물은 겔 형태로서 0~10℃에 정치시킬 경우 침전물의 물성이 단단해져 침전물과 상등액을 보다 쉽게 분리할 수 있기 때문이다.

상기 여러 최적 조건하에서 녹차 추출물과 카페인 혼합시 상등액과 침전물의 총 회수율을 평가한 결과, EGCg와 ECg의 회수율은 100%에 가까워 화학적인 변화는 나타나지 않았음을 알 수 있었으며 EGC와 EC는 회수율은 89.25%, 95.19%로 나와 EGCg와 ECg보다는 낮게 평가되었다(표 2). 그 분석 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

성분	총 회수율 (%)
EGC	89.25
EC	95.19
EGCg	100.94
ECg	100.80
[주]조건: 침적 시간 6시간, 조업온도 상온

실시예 4 : 침전물의 용해도 평가

클로로포름과 같은 할로겐화 유기용매로 침전물에 함유된 카페인을 효율적으로 제거하기 위해서는 용매-용매 추출이 용이하여야 하는데, 침전물은 겔 형태로 물에는 잘 녹지 않는 단점이 있어 용매-용매 추출하기 전에 우선 침전물을 용해시켜야 한다. 이에, 유기산을 첨가하여 침전물의 용해도를 평가하였다.

상기의 최적조건으로 제조한 침전물 수용액에 대하여, 침전물 질량 1을 기준하여 아스코르빈산과 같은 유기산을 0.1~3배의 질량비로 첨가하여 용해한 결과, 아스코르빈산과 같은 유기산을 첨가한 경우의 용해도가 훨씬 증가하였다. 따라서, 유기산을 첨가하는 경우, 침전물을 용해시키기 위해 소요되는 시간을 절약할 수 있으며, 클로로포름과 같은 할로겐화 유기용매를 사용하여 카페인을 제거할 때 발생할 수 있는 화학적 변화를 억제해 주는 장점을 가지고 있다. 특히, 아스코르빈산이 구연산(citric acid), 사과산(malic acid), 붕산(boric acid)등과 같은 산보다 침전물의 용해도가 훨씬 높았으며 침전물의 중량대비 2배 이상일 경우 완전 용해되었다. 유기산의 종류 및 침전물과 산의 질량비에 따른 침전물의 용해도 평가 결과룰 표 3에 나타내었다.

	0 (질량비)	0.5	1	2	3
아스코르빈산	+	+++	++++	+++++	+++++
구연산	+	++	+++	++++	++++
사과산	+	++	+++	++++	++++
붕산	+	+	++	++	+++
[주] 침전물 질량비 1 기준, 상온, 최대값:+++++

아스코르빈산과 같은 유기산만을 첨가하여 용해시킬 경우 첨가된 아스코르빈산에 대한 비용이 많이 소요된다는 단점이 있다. 따라서, 가열하여 이에 대한 병행 실험을 하였다. 우선, 아스코르빈산을 침전물에 첨가한 후 중탕기에서 흔들어 주면서 가열하였다. 그 결과, 온도를 증가시키면 상온에서 용해시키기 위해 첨가되는 산보다 적은 양의 산이 첨가되어도 침전물이 용해되었으며, 특히 아스코르빈산의 경우 침전물 질량대비 0.5배 이상 첨가하고 50℃이상 가열하면 완전히 용해되어 아스코르빈산과 같은 유기산을 사용한 방법보다 시간과 비용을 절약할 수 있다.

또한, 용매-용매 추출법에 의해 할로겐화 유기용매로 분리된 카페인은 진공 농축하여 재사용할 수 있다는 장점이 있다.

실시예 5 : 용리액 부피율을 달리한 칼럼에서의 고순도 EGCg의 분리

내부 직경 10cm, 길이 110cm 부피 8.65L인 칼럼에 입자크기가 0.32mm이하인 합성 충진제 HP-20 충진물 4.5kg을 채워 실험하였다. 이 충진물을 물과 메탄올로 완전히 씻어내고 칼럼에 채운 후 초기 용리액인 0.01% 아스코르빈산이 첨가된 수용액으로 안정화시켰다. 그 후, 카페인을 제거한 상기 EGCg 및 ECg 용액을 이 칼럼에 로딩하였다. EGCg와 ECg의 안정성을 높이기 위해 0.01% 아스코르빈산을 용리액으로 첨가하였다. 용리액에 아스코르빈산을 첨가하지 않은 경우에 90%이상의 고순도 EGCg가 함유되어 있는 최종 산물은 붉은 갈색을 띠게 되나, 아스코르빈산을 첨가하면 무색에 가까운 투명한 색을 띠어 색깔에 의한 사용범위의 제한이 없으므로 화장품등 다양한 용도로 사용할 수 있는 장점이 있다.

크로마토그래피에서 용출되는 첫번째 용출액은 아스코르빈산이 첨가된 100% DW로서 이는 클로로포름과 같은 할로겐화 유기용매에서 완전히 제거되지 않은 카페인을 제거하고 잔존하는 EGC를 제거하기 위한 것이다. 침전물 200g을 칼럼에 흡착시켰을 경우 용리액은 0.01% 아스코르빈산이 첨가된 수용액으로 25L정도 사용하였고 100㎖/min 유속으로 흘려주었다.

카페인과 EGC를 제거한 후 5% 에탄올 수용액(0.01% 아스코르빈산 첨가)을 사용하여 잔존하는 EC를 제거하였다. 이때 용리액은 20L정도를 20㎖/min 유속으로 흘려주었다.

5% 에탄올 수용액(0.01% 아스코르빈산 첨가)으로 잔존하는 카페인, EGC, EC를 제거한 후 15% 에탄올(0.01% 아스코르빈산 첨가)수용액으로 용리시키면 90%이상의 EGCg를 분리할 수 있게 된다. 이 때 15% 에탄올(0.01% 아스코르빈산 첨가)수용액은 20㎖/min으로 흘려주었으며 18L정도 사용되었다. 최초 침전물에 존재하는 총 EGCg중 70%이상의 EGCg를 회수하였고 90%이상의 고순도 EGCg가 함유된 용출액에서의 EGCg농도는 0.17%이었다. 15% 에탄올 수용액(0.01% 아스코르빈산 첨가)으로 용리한 결과 획득한 90% 이상의 고순도 EGCg 크로마토그램 결과를 도 6에 나타내었다. 또한, 고순도의 EGCg를 칼럼 크로마토그래피로 분리한 다음 25% 에탄올 수용액(0.01% 아스코르빈산 첨가)을 용리시켜 고순도의 ECg도 분리한 결과를 도 7에 나타내었다.

90% 이상의 고순도 EGCg가 함유된 용출액을 combiHT XDB-C18 충진물이 채워진 칼럼(150x21.2mm)과 Prep HPLC를 사용하여 280nm의 파장과 22% 테트라하이드로푸렌(THF)을 10㎖/min의 유속으로 흘려주어 99% 이상의 순수한 EGCg를 분리하거나, 세파덱스 LH-20이 채워진 칼럼 크로마토그래피에 100% 에탄올이나 100% 아세토나이트릴 또는 에탄올-아세토나이트릴 혼합 유기용매를 용리액으로 사용하여 90% 이상의 EGCg를 분리하였다.

상기에서 설명한 공정을 도 8에 나타내었다.

비교예 1

0.3~1.2mm이하의 입자 크기인 amberlite XAD-7 충진물 33.5L(26kg)을 내부 직경 15cm, 길이 200cm 그리고 35.4L부피인 칼럼 크로마토그래피에 채워 실험하였다. 이 충진물은 물과 물/이소프로판올(9:1 부피비)로 완전히 씻어내고 칼럼에 채운 후 초기 용리액인 물/이소프로판올(9:1 부피비)로 안정화시켰다. 충진물이 채워진 칼럼 크로마토그래피는 자동온도 조절장치를 사용하여 60℃를 유지하였다. 152.5g 순수 EGCg가 함유되어 있는 녹차추출물 0.4kg을 물/이소프로판올(9:1 부피비) 1.8kg에 녹여 칼럼에 용리시켰다. 유속은 50kg/h로 용리액을 흘려 주었다. 초기 용리액 144kg은 흘려주고 90%이상 고순도 EGCg가 함유되어 있는 174kg을 모았다. 이 때 주 용출액에 용해되어 있는 EGCg의 농도는 0.064%이다.

비교예 2

0.3~1.2mm이하의 입자 크기인 amberlite XAD-7 충진물 33.5L(26kg)을 내부 직경 15cm, 길이 200cm 그리고 35.4L부피인 칼럼 크로마토그래피에 채워 실험하였다. 이 충진물은 물과 물/이소프로판올(9:1 부피비)로 완전히 씻어내고 칼럼에 채운 후 초기 용리액인 물/이소프로판올(9:1 부피비)로 안정화시켰다. 충진물이 채워진 칼럼 크로마토그래피는 자동 온도 조절장치로 60℃를 유지하였다. 140.5g 순수 EGCg가 함유되어 있는 녹차추출물 0.4kg을 물/이소프로판올(9:1 부피비) 1.8kg에 녹여 칼럼에 용리시켰다. 유속은 50kg/h로 용리액을 흘려 주었다. 초기 용리액 200kg은 흘려주고 90%이상 고순도 EGCg가 함유되어 있는 117kg을 모았다. 이 때 주 용출액에 용해되어 있는 EGCg의 농도는 0.062%이다.

비교예 3

0.3~1.2mm이하의 입자 크기인 amberlite XAD-7 충진물 450ml을 내부 직경 2.4cm, 길이 100cm인 칼럼 크로마토그래피에 채워 실험하였다. 이 충진물은 물과 물/에탄올(9:1 부피비)로 완전히 씻어내고 칼럼에 채운 후 초기 용리액인 물/에탄올(9:1 부피비)로 안정화시켰다. 95%이상의 폴리페놀이 함유되어있는 녹차 추출물 20g을 20ml에 용해시켰다. 2.91g 순수 EGCg가 함유되어 있는 용액 14g을 칼럼에 용리시켰다. 유속은 16.9㎖/min로 용리액[물/에탄올(9:1 부피비)]을 흘려 주었다. 충진물이 채워진 칼럼 크로마토그래피는 60℃를 유지하였다. 초기 용리액 2.48L은 흘려준 후 23.6㎖/min로 유속을 바꿔 주었다. 주 용출액 4.95L를 모았고 이 때 주 용출액에 함유되어있는 EGCg의 농도는 0.470g/L이며 EGCg의 순도는 86.1%로 나타났다.

비교예 4

입자 크기가 5~40미크론(micron)인 폴리아마이드 11 충진물 250g을 내부 직경 5cm, 길이 36cm인 칼럼 크로마토그래피에 채운 후 40℃를 유지하며 실험하였다. 21.11g 순수 EGCg가 함유되어 있는 녹차 추출물 3g을 에틸아세테이트 153㎖에 용해시켰다. 용리액은 에틸아세테이트/에탄올 gradient [500㎖ 에틸아세테이트, 1000㎖ 에틸아세테이트/에탄올(8.5:1.5 부피비), 1000㎖ 에틸아세테이트/에탄올(7:3 부피비), 2000㎖ 에틸아세테이트/에탄올(1:1 부피비)]로 흘려 주었다. 주 용리액 550㎖를 모았고 이 때 주 용출액에 함유되어있는 EGCg의 농도는 0.186%이며 EGCg의 회수율은 76%로 나타났다.

이상의 실시예 및 비교예에서 설명한 바와 같이, 본 발명 공정은 녹차추출물에 카페인을 첨가하여 EGCg 및 ECg를 선택적으로 침전시키고, 유기산을 첨가하여 침전물을 가열 용해시키며, 물 또는 알코올 수용액을 용리액으로 이용하여 칼럼 크로마토그래피함으로써 무색에 가까운 색깔로 안정화된 90%이상의 고순도 EGCg를 상업적으로 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있으므로, 천연 항산화제로서의 용도뿐만 아니라 피부미용에 이용할 수 있으며 따라서, 화장품 제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

녹차 추출물로부터 EGCg를 분리하는 방법에 있어서,

(1) 녹차 추출물과 카페인을 1:1~0.01(w:w) 질량비로 각각 용해시켜 수용액을 제조하는 공정;

(2) (1)에서 제조한 상기 녹차 추출물 및 카페인 수용액을 혼합한 후 상온~80℃ 범위에서 중탕하고 0~10℃, 2시간이상 빛에 노출되지 않는 곳에서 정치시켜 녹차 카테킨 성분 중 EGCg 및 ECg와 카페인을 선택적으로 결합시켜 상등액에 존재하는 EGC와 EC를 침전 분리하는 공정;

(3) 상기 침전물을 상등액과 분리한 후 침전물을 5~15%(w/v) 수용액으로 제조하고 이 침전물 수용액에 유기산을 1:0.1∼3(w:w)의 질량비로 첨가한 후 20∼80℃로 가열하여 침전물 수용액을 용해시키는 공정;

(4) 유기용매를 사용하여 침전물 수용액에서 카페인을 선택적으로 제거하는 공정; 및

(5) 합성 흡착제가 충진된 칼럼에 카페인을 제거한 상기 침전물 수용액을 로딩하고 0.0001~1% 유기산이 첨가된 0∼20% 알코올 수용액 용리액을 단계적으로 용리시켜 고순도 EGCg 수용액을 분리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 고순도 EGCg 분리방법.
제 1항 기재의 방법에,

(6) 상기 분리한 고순도 EGCg 수용액을 합성 흡착제가 충진된 칼럼에 로딩하고 0.0001~1% 유기산이 첨가된 20% 이상의 알코올 수용액을 용리액으로 용리시켜 고순도 ECg를 분리하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고순도 ECg 분리방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 공정 (3), 공정 (5) 또는 공정 (6)의 유기산이 아스코르빈산임을 특징으로 하는 고순도 EGCg 분리방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 카페인을 용출하는 상기 공정 (4)의 유기용매가 할로겐화 유기용매임을 특징으로 하는 고순도 EGCg 분리방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 공정 (5)의 알코올 수용액 용리액이 에탄올 수용액임을 특징으로 하는 고순도 EGCg 분리방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 공정 (5) 또는 공정 (6)의 합성 흡착제가 세파덱스 LH-20 또는 HP-20임을 특징으로 하는 고순도 EGCg 분리방법.