KR20030022759A - 트랜스제닉 동물 내에서 표적 분자를 생성시키는 방법, 및그 표적 분자를 정제하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물학적 시스템 내에 존재하는 표적 분자의 생성 및 정제를 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 시스템 및 방법에서는 친화성 매질로서 다가 결합 폴리펩티드의 트랜스제닉 발현을 이용하여 그러한 표적 분자를 정제한다. 상기 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드는 표적 분자, 예를 들어, 표적 분자의 결합성 에피토프, 및 매트릭스 양자 모두에 결합한다.
Description
치료 및 진단 목적으로 폴리펩티드를 제조 및 정제하는 방법은 최근 수년간 중요한 산업이 되었다. 초기의 재조합 폴리펩티드 발현에 대한 시도들에서는 박테리아 내의 플라스미드 발현 벡터를 이용하였다. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,397호에서는 박테리아 내에서의 면역글로불린의 재조합 발현을 공개한다. 이러한 접근법들은, 박테리아를 파열시키거나 세포용해(lysis)시킴으로써 박테리아 단백질의 복합물 일부 및 기타 박테리아 치환체로 존재하는 재조합 폴리펩티드를 수득할 필요가 있다는 점의 제한이 있다. 또한, 부적당한 폴리펩티드 폴딩 (folding)으로 귀결될 수 있는 박테리아 내의 재조합 폴리펩티드에 대한 비-자연적 산화 상태로부터 추가적인 제한이 초래되었다.
이러한 문제들의 일부는 포유동물 세포 배양 발효 시스템에서 폴리펩티드를 재조합 발현시킴에 의하여 감소되었다. 미국 특허 제5,639,640호는 포유동물 세포 배양에 있어서의 인간 여포 자극 호르몬(FSH)의 재조합 발현을 공개한다. 불행하게도, 그러한 포유동물 세포 배양 발효 시스템은 그 작동에 매우 고비용이 소요되며, 그에 의하여 생성된 폴리펩티드는 성장 배지에 존재하는 단백질의 복합 혼합물의 일부이다.
이러한 시스템들에 존재하는 문제점들을 극복하기 위한 노력을 통하여 다양한 트랜스제닉(transgenic) 동물 시스템에 있어서의 재조합 폴리펩티드의 트랜스제닉 발현이 이루어졌다. 이러한 노력을 통하여 폴리펩티드의 고농도 트랜스제닉 발현을 이루어 낼 수 있었고, 그에 의하여 재조합 폴리펩티드의 생성을 위한 고가의 포유동물 세포 배양 발효 시스템에 대한 필요가 없어졌다. 그러나, 포유동물 세포 배양 시스템에 대한 실용적인 대안이 되기 위해서는 동물들의 건강을 유지시키는 것이 중요하다. 또한, 그에 의하여 생성되는 폴리펩티드는 유단백질의 복합 혼합물의 치환체를 잔존시켜, 그러한 혼합물로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법이 필요하다.
도 1은 표적 분자 및 다가 결합 폴리펩티드가 개별적인 소스(source)로부터 유래되는 실시 태양을 묘사한다.
도 2는 표적 분자 및 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드가 동일한 소스로부터 유래되는 실시 태양을 묘사한다.
도 3은 매트릭스에도 결합되는 제2 다가 결합 폴리펩티드의 촉매 부분에 의하여 표적 분자의 제거 가능한 에피토프가 제거되는 실시 태양을 묘사한다. 상이한 매트릭스는 표적 분자/제1 다가 결합 폴리펩티드 보다는 제2 다가 폴리펩티드에 의하여 결합된다.
발명의 요약
본 발명은 트랜스제닉 동물 내에서 표적 분자를 생성시키는 방법 및 그러한 표적 분자를 정제하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 표적 분자는 표적 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 본 발명은, 표적 폴리펩티드가 발현되어, 트랜스제닉 동물의 유즙(milk) 내로 불활성 형태로 분비된 후, 활성화될 수 있다는 발견에 일부 기초를 두고 있다. 이를 통하여, 동물 내에서 활성 형태의 단백질이 생성됨에 의하여 발생할 수 있는 합병증을 피할 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 동물의 유즙 내에, 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인을 비롯한 특정 단백질을 생성시키는 것은 그 동물의 건강상 문제들을 야기시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 방법은 그러한 문제들을 최소화할 수 있다. 본 발명은 또한 유즙과 같은 생물학적 시스템 내에 존재하는 이들 표적 분자 및 기타 표적 분자를 정제하는 시스템 및 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이러한 시스템 및 방법에서는, 예를 들어, 유즙 내로의 친화성 리간드(affinity ligand)와 같은 다가 결합 폴리펩티드의 트랜스제닉 발현을 이용하여, 그러한 표적 분자를 정제할 수 있다. 상기 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드는 표적 분자 및 미리 선택된 리간드(예, 상 분리성 매트릭스의 미리 선택된 리간드) 양자 모두에 결합할 수 있다.
따라서, 하나의 실시 양태(aspect)에 있어서, 본 발명은 트랜스제닉 동물 내에서 표적 폴리펩티드를 생성시키는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이러한 방법은 폴리펩티드를 불활성 상태로 생성시키는 단계; 상기 불활성 폴리펩티드를 수득하는 단계; 및 상기 폴리펩티드를 활성화시킴으로써 표적 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함한다.
바람직한 실시 태양(embodiment)에 있어서, 트랜스제닉 동물의 조직 또는 생성물, 예를 들어, 유즙과 같은 트랜스제닉 동물의 유체 내에 상기 폴리펩티드를 불활성 상태로 생성시킨다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 트랜스제닉 동물로부터 불활성 단백질을 포함하는 조직 또는 생성물(예, 유즙)을 수득한다.
한 실시 태양에 있어서, 표적 폴리펩티드에 결합하여 그것을 불활성화시키는 결합 폴리펩티드와 그 표적 폴리펩티드를 공-발현(co-expression)시킴으로써 표적 폴리펩티드를 불활성화시킨다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드 및 상기 표적 폴리펩티드는 조직 또는 생성물(예, 유즙 등의 유체) 내에서 복합체로 존재한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드 및 결합 폴리펩티드는 리간드 및 반대 리간드(counterligand)이며, 예를 들어, 상기 결합 폴리펩티드는 수용체 또는 리간드, 또는 어느 하나의 단편이다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드는 항체 또는 그 단편이다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드를 암호하는 핵산은 조직 특이적 프로모터, 예를 들어, 포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드를 암호하는 핵산은 조직 특이적 프로모터, 에를 들어, 포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에 있다. 상기 표적 폴리펩티드를 암호하는 핵산 및 상기 결합 폴리펩티드를 암호하는 핵산 양자 모두가 동일한 타입의 프로모터, 예를 들어, 동일한 타입의 조직 특이적 프로모터의 제어 하에 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 양자 모두 포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 양자 모두 동일하거나 상이한 유즙 특이적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 상기 유즙 특이적 프로모터는 예를 들어, 카세인, 락토글로불린, 락트알부민 또는 유장(whey) 산 단백질(WAP) 프로모터일 수 있다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드를 암호하는 핵산은 또한 상기 결합 폴리펩티드에 대한 외인성 아미노산 1종 이상을 암호하는 서열을 암호한다. 예를 들어, 상기 핵산은 상기 결합 폴리펩티드의 정제에 유용한 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드에 외인성인 아미노산 1종 이상을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 미리 선택된 리간드에 결합할 수 있는 아미노산(들)을 첨가할 수 있는데, 상기 리간드는, 예를 들어, 말토스 결합 단백질(MBP) 리간드, 셀룰로스 결합 도메인(CBD) 리간드, 6X HIS 리간드 등의 상기 결합 폴리펩티드의 정제에 유용한 리간드 일 수 있다. 미리 선택된 리간드에 결합할 수 있는 상기 아미노산(또는 아미노산들)은 또한 본 명세서에서 결합 부분(binding moiety)(예, 미리 선택된 리간드 또는 매트릭스에 결합할 수 있는 결합 부분)으로 언급된다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 활성화 전에 상기 조직 또는 생성물(예, 유즙과 같은 유체)로부터 불활성 폴리펩티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 미리 선택된 리간드, 예를 들어, 6X HIS 리간드(예, 금속 킬레이팅 컬럼), CBD 리간드(예, 셀룰로스) 또는 MBP 리간드(예, 말토스)에 상기 결합 폴리펩티드/표적 폴리펩티드 복합체의 결합 부분을 결합시킴으로써 상기 불활성 폴리펩티드를 유즙 등의 유체로부터 분리한다.
또 다른 실시 태양에 있어서, 폴리펩티드의 활성화에 필요한 부위의 개질, 예를 들어, 개열 부위(cleavage site)의 개질에 의하여 상기 표적 폴리펩티드를 불활성화시킨다. 상기 개열 부위는 예를 들어 상기 폴리펩티드의 일부를 제거할 수 있는 개열 부위, 예컨대 상기 폴리펩티드의 프리(pre) 및/또는 프로(pro) 영역의 제거를 고려한 부위일 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 개열 부위를 개질시킴으로써, 프로세싱 효소(processing enzyme), 예를 들어, 상기 조직 또는생성물 내에서 자연적으로 발생하는 내인성 프로세싱 효소가 더 이상 상기 개열 부위를 인식하지 못하도록 한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 개열 부위와 같은 부위를 개질시킴으로써 불활성화시킨 상기 표적 폴리펩티드는 활성화될 수 있는 추가 부위, 예를 들어, 폴리펩티드의 프리 및/또는 프로-영역의 개열과 같은 개열을 일으킬 수 있는 추가 부위를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 단백질 가수분해적 개열을 위한 내인성 부위를 불활성화시키고, 새로운 부위를 제공할 수 있다. 상기 내인성 개열 부위를 개질시킴으로써, 및/또는 추가의 아미노산 또는 아미노산들을 첨가함으로써, 상기 새로운 부위를 제공할 수 있다. 상기 조직 또는 생성물 내에서 자연적으로 발생하는 어떠한 내인성 프로세싱 효소도 상기 새로운 부위를 개열시키지는 않는다. 예를 들어, 트랜스제닉 동물의 유즙 내에 존재하는 프로테아제에 의하여 개열되는 부위를 개질시킬 수 있고, 외인성 화학약품 또는 효소와의 접촉에 의하여 개열될 수 있는 부위를 상기 폴리펩티드에 첨가할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 외인성 화학약품은 산, 예를 들어, 시아노겐 브로마이드이다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 외인성 효소는 외인성 프로테아제, 예를 들어, 키모신이다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 추가 부위를 개열시킴으로써, 상기 표적 폴리펩티드가 어떠한 외래성 서열도 포함하지 않도록 한다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 부위를 개열시킴으로써, 상기 표적 폴리펩티드가 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1 이하의 외래성 아미노산 잔기를 포함하도록 한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드이다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 폴리펩티드는 호르몬, 성장 인자, 사이토카인이다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 폴리펩티드는 골기질 단백질(BMP; bone matrix protein), 예를 들어, BMP-2; 에리트로포이에틴; 인슐린; 인간 성장 인자, 형질전환 성장 인자(transforming growth factor-β)이다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물은 포유동물, 예를 들어, 염소, 젖소, 양, 토끼, 돼지, 말, 낙타, 라마, 마우스 또는 랫트이다.
다른 실시 양태에 있어서, 본 발명은 표적 폴리펩티드의 트랜스제닉적 생산 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이러한 방법은 조직 특이적 프로모터, 예를 들어, 포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에 표적 폴리펩티드를 암호하는 핵산, 및 조직 특이적 프로모터, 예를 들어, 포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에 있고, 상기 표적 폴리펩티드에 결합하는 폴리펩티드를 암호하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 동물을 제공하는 단계; 상기 표적 폴리펩티드 및 상기 결합 폴리펩티드가 상기 트랜스제닉 동물의 조직 또는 생성물, 예를 들어, 상기 트랜스제닉 동물의 유즙에서 발현되도록 하는 단계; 상기 결합 폴리펩티드로부터 상기 표적 폴리펩티드를 분리시킴으로써 상기 표적 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드 및 결합 폴리펩티드는 리간드 및 반대 리간드이며, 예를 들어, 상기 결합 폴리펩티드는 수용체 또는 리간드, 또는 어느 하나의 단편이다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합폴리펩티드는 항체 또는 그 단편이다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드를 암호하는 핵산은 또한 상기 결합 폴리펩티드에 대한 외인성 아미노산 1종 이상을 암호하는 서열을 암호한다. 예를 들어, 상기 핵산은 상기 결합 폴리펩티드의 정제에 유용한 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드에 대한 외인성 아미노산 1종 이상을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 미리 선택된 리간드에 결합할 수 있는 아미노산(들)을 첨가할 수 있는데, 상기 리간드는, 예를 들어, 말토스 결합 단백질(MBP) 리간드, 셀룰로스 결합 도메인(CBD) 리간드, 6X HIS 리간드 등의 상기 결합 폴리펩티드의 정제에 유용한 리간드 일 수 있다. 미리 선택된 리간드에 결합할 수 있는 상기 아미노산(또는 아미노산들)은 또한 본 명세서에서 결합 부분(예, 미리 선택된 리간드 또는 매트릭스에 결합할 수 있는 결합 부분)으로 언급된다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드 및 상기 표적 폴리펩티드는 상기 트랜스제닉 동물의 유즙 등과 같은 조직 내에 복합체로 존재한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 활성화 전에 상기 조직 또는 생성물(예, 유즙과 같은 유체)로부터 불활성 표적 폴리펩티드를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 미리 선택된 리간드, 예를 들어, 6X HIS 리간드(예, 금속 킬레이팅 컬럼), CBD 리간드(예, 셀룰로스) 또는 MBP 리간드(예, 말토스)에 상기 결합 폴리펩티드/표적 폴리펩티드 복합체의 결합 부분을 결합시킴으로써 상기 불활성 폴리펩티드를 유즙 등의 유체로부터 분리한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 상기 프로모터는 카세인 프로모터, 예를 들어, 베타 카세인 프로모터; 락토글로불린 프로모터, 예를 들어, 베타 락토글로빈 프로모터; 유장산 단백질 프로모터; 락토알부민 프로모터이다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합 폴리펩티드 및 상기 표적 폴리펩티드는 동일한 타입의 조직 특이적 프로모터의 제어 하에 있다. 예를 들어, 양자 모두 포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 양자 모두 동일하거나 상이한 유즙 특이적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물은 인간이 아닌 포유동물이다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 포유동물은 염소, 젖소, 양, 토끼, 돼지, 말, 라마, 낙타, 마우스 또는 랫트이다.
다른 실시 양태에 있어서, 본 발명은 표적 폴리펩티드를 수득(예를 들어, 정제)하는 트랜스제닉 시스템을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이러한 시스템은 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 발현시키는 동물(예를 들어, 포유동물)을 포함한다. 상기 다가 결합 폴리펩티드는 상기 표적 폴리펩티드에 결합하는 제1 결합 부분 및 미리 선택된 리간드(예를 들어, 매트릭스의 미리 선택된 리간드)에 결합하는 제2 결합 부분을 포함한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 트랜스제닉 포유동물은 조직-특이적 방법으로 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 발현시킨다. 예를 들어, 상기 트랜스제닉 포유동물은 조직 또는 생성물(예를 들어, 유즙, 소변 또는 혈액과 같은 유체) 내에 상기 다가 결합 폴리펩티드를 발현시킨다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 포유동물은 유즙 내에 트랜스제닉 다가 폴리펩티드를 발현시키고, 상기 다가 결합 폴리펩티드를 암호하는 핵산은 포유동물 상피 세포 내에서의 발현을 지시하는 프로모터, 예를 들어, 카세인, 락토글로불린, 락트알부민 또는 유장 산 단백질(WAP) 프로모터의 제어 하에 있다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 트랜스제닉 포유동물은 염소, 젖소, 양, 토끼, 돼지, 말, 낙타, 라마, 마우스 또는 랫트이다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 다가 결합 폴리펩티드는 생성물(예를 들어, 유체) 중에 고농도로, 예를 들어, 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 발현된다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 시스템은 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 결합할 수 있는 매트릭스를 추가로 포함한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드는 결합성 에피토프, 예를 들어, 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분에 의하여 결합되는 에피토프를 포함한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합성 에피토프는 제거 가능하다. 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드의 잔류물(remainder)로부터 개열시켜, 상기 결합성 에피토프를 제거할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 촉매 부분에 의하여 상기 결합성 에피토프를 제거할 수 있다. 상기 촉매 부분은 제2 다가 결합 폴리펩티드의 부분, 예를 들어, 제2 트랜스제닉적 생성 다가 결합 폴리펩티드의 부분인 것이 바람직하다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 제2 다가 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 제2 트랜스제닉적 생성 다가 결합 폴리펩티드는 제1 촉매 도메인 및 제2 결합 부분을 포함한다. 상기 제2 결합 부분은 미리 선택된 리간드, 예를 들어, 상기 제1 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스와는 상이한 매트릭스의 미리 선택된 리간드에 특이적으로 결합한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드 및 다가 결합 폴리펩티드 양자 모두는 트랜스제닉적으로 유즙 내로 발현된다. 상기 표적 폴리펩티드 및 다가 결합 폴리펩티드는 별개의 동물 또는 동일한 동물에 의하여 발현될 수 있다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드 및 상기 제1 및 제2 다가 폴리펩티드는 트랜스제닉적으로 유즙 내에서 발현될 수 있다. 이들 폴리펩티드 모두는 상이한 동물들에 의하여 발현될 수 있으며, 2 이상은 동일한 동물에 의하여 생성될 수 있다.
하기 시스템은 다가 결합 폴리펩티드를 매트릭스에 접촉시키고, 그 다음에 표적과 접촉시키는 것에 관한 것이나, 그 반대의 순서도 모든 실시 태양에 있어서 동등하게 적합하다.
다른 실시 양태에 있어서, 본 발명은 생물학적 시스템으로부터 표적 폴리펩티드를 수득(예를 들어, 정제)하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 표적 폴리펩티드는 결합성 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 방법은 생물학적 시스템에서 유래한 표적 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 트랜스제닉적으로발현된 다가 결합 폴리펩티드와 접촉시켜 반응 생성물을 형성시키고, 그에 의하여 생물학적 시스템으로부터 표적 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함한다. 상기 다가 결합 폴리펩티드는 상기 표적 분자에 결합하는, 예를 들어, 상기 표적 분자의 에피토프에 결합하는 제1 결합 부분, 및 매트릭스에 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분이 상기 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 결합할 수 있도록 상기 조성물 및 상기 다가 결합 폴리펩티드를 유지시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 결합할 수 있는 매트릭스와 상기 혼합물을 접촉시키는 단계, 및 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 상기 매트릭스에 결합하도록 하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 상기 혼합물의 임의의 비결합 성분을 제거하는 단계, 및 상기 혼합물로부터 표적 폴리펩티드를 용출 등의 방법으로 수득함으로써 표적 폴리펩티드를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드는 결합성 에피토프, 예를 들어, 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분에 의하여 결합되는 에피토프를 포함한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합성 에피토프는 제거 가능하다. 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드의 잔류물로부터 개열시켜, 상기 결합성 에피토프를 제거할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 촉매 부분에 의하여 상기 결합성 에피토프를 제거할 수 있다. 상기 촉매 부분은 제2 다가 결합 폴리펩티드의 부분, 예를 들어, 제2 트랜스제닉적 생성 다가 결합 폴리펩티드의 부분인 것이 바람직하다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 제2 다가 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 제2 트랜스제닉적 생성 다가 결합 폴리펩티드는 제1 촉매 도메인 및 제2 결합 부분을 포함한다. 상기 제2 결합 부분은, 예를 들어, 상기 제1 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스와는 상이한 매트릭스와 같은 매트릭스에 특이적으로 결합한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 생물학적 시스템에서 유래한 상기 조성물은 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 트랜스제닉 포유동물에서 수득한 생성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 생성물은 예를 들어, 유즙, 소변 또는 혈액과 같은 유체일 수 있다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 생물학적 시스템에서 유래한 상기 조성물은, 예를 들어, 상기 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 포함하는 유즙, 소변 또는 혈액과 같은 유체 등의 샘플과 접촉시킨다.
상기 유즙은 상기 트랜스제닉 다가 결합 단백질을 고농도로 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 포함할 수 있다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드 및 다가 결합 폴리펩티드 양자 모두는 트랜스제닉적으로 유즙내로 발현된다. 상기 표적 폴리펩티드 및 다가 결합 폴리펩티드는 별개의 동물 또는 동일한 동물에 의하여 발현될 수 있다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드 및 상기 제1 및 제2 다가 폴리펩티드는 트랜스제닉적으로 유즙 내에서 발현될 수 있다. 이들 폴리펩티드 모두는 상이한 동물들에 의하여 발현될 수 있으며, 2 이상은 동일한 동물에 의하여 생성될 수 있다.
하기 방법은 다가 결합 폴리펩티드를 매트릭스에 접촉시키고, 그 다음에 표적과 접촉시키는 것에 관한 것이나, 그 반대의 순서도 모든 실시 태양에 있어서 동등하게 적합하다.
다른 실시 양태에 있어서, 본 발명은 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 결합성 에피토프를 포함하는 표적 폴리펩티드를 발현 및/또는 수득, 예를 들어, 정제하는 데 사용할 수 있는 다수 동물 트랜스제닉 시스템(multiple animal transgenic system)을 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 시스템은 예를 들어, 표적 폴리펩티드에 결합하는, 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 결합하는 제1 결합 부분 및 매트릭스에 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 발현시키는 트랜스제닉 포유동물과 같은 제1 트랜스제닉 동물을 포함한다. 상기 제1 트랜스제닉 동물은 상기 다가 결합 폴리펩티드를 생성물, 예를 들어, 유즙, 혈액 또는 소변과 같은 유체 내로 발현시키는 것이 바람직하다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 다가 결합 폴리펩티드는 제1 트랜스제닉 동물의 유즙 내에 고농도로 존재한다. 예를 들어, 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 제1 트랜스제닉 동물은 트랜스제닉 포유동물이다. 상기 트랜스제닉 포유동물은 조직-특이적 방법으로 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 트랜스제닉 포유동물은 예를 들어, 유즙, 소변 또는 혈액과 같은 유체 내에 상기 다가 결합 폴리펩티드를 발현시킨다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 포유동물은 유즙 내에 트랜스제닉 다가 폴리펩티드를 발현시키고, 상기 다가 결합 폴리펩티드를 암호하는 DNA 서열은 포유동물 상피 세포 내에서의 발현을 지시하는 프로모터, 예를 들어, 카세인, 락토글로불린, 락트알부민 또는 유장 산 단백질(WAP) 프로모터의 제어 하에 있다.
상기 시스템은 예를 들어, 결합성 에피토프를 포함하는 표적 폴리펩티드와 같은 표적 폴리펩티드를 발현시키는 트랜스제닉 포유동물과 같은 제2 트랜스제닉 동물을 추가로 포함한다. 상기 제2 트랜스제닉 동물은 예를 들어, 유즙, 혈액 또는 소변과 같은 유체 내에 상기 표적 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직하다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드는 상기 제2 동물의 유즙 내에 고동도로 존재한다. 예를 들어, 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 제2 트랜스제닉 동물은 트랜스제닉 포유동물이다. 상기 제2 트랜스제닉 포유동물은 조직-특이적 방법으로 표적 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 트랜스제닉 포유동물은 예를 들어, 유즙, 소변 또는 혈액과 같은 유체 내에 상기 표적 폴리펩티드를 발현시킨다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 포유동물은 유즙 내에 상기 표적 폴리펩티드를 발현시키고, 상기 표적 폴리펩티드를 암호하는 DNA 서열은 포유동물 상피 세포 내에서의 발현을 지시하는 프로모터, 예를 들어, 카세인, 락토글로불린, 락트알부민 또는 유장 산 단백질(WAP) 프로모터의 제어 하에 있다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 시스템은 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 결합할 수 있는 매트릭스를 추가로 포함한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 결합성 에피토프는 제거 가능하다. 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드의 잔류물로부터 개열시켜, 상기 결합성 에피토프를 제거할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 촉매 부분에 의하여 상기 결합성 에피토프를 제거할 수 있다. 상기 촉매 부분은 제2 다가 결합 폴리펩티드의 부분, 예를 들어, 제2 트랜스제닉적 생성 다가 결합 폴리펩티드의 부분인 것이 바람직하다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 제2 다가 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 제2 트랜스제닉적 생성 다가 결합 폴리펩티드는 제1 촉매 도메인 및 제2 결합 부분을 포함한다. 상기 제2 결합 부분은 매트릭스, 예를 들어, 상기 제1 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스와는 상이한 매트릭스에 특이적으로 결합한다. 상기 제2 다가 결합 폴리펩티드는: 상기 제1 다가 결합 폴리펩티드를 발현시키는 동일한 트랜스제닉 동물; 상기 표적 폴리펩티드를 생성하는 트랜스제닉 동물; 또는 상기 제1 다가 결합 폴리펩티드 또는 상기 표적 폴리펩티드를 생성하는 동물과는 다른 트랜스제닉 동물에 의하여 생성시킬 수 있다.
하기 시스템은 다가 결합 폴리펩티드를 매트릭스에 접촉시키고, 그 다음에 표적과 접촉시키는 것에 관한 것이나, 그 반대의 순서도 모든 실시 태양에 있어서 동등하게 적합하다.
다른 실시 양태에 있어서, 본 발명은 유즙, 혈액 또는 소변 등의 유체와 같은 생성물로부터, 결합성 에피토프를 포함하는 표적 폴리펩티드와 같은, 표적 폴리펩티드를 발현 및/또는 수득하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 트랜스제닉 동물로부터 표적 폴리펩티드를 포함하는 생성물(예, 유즙과 같은 유체)을 수득하는 단계; 및 상기 표적 폴리펩티드를 포함하는 생성물(예, 유즙과 같은 유체)을 트랜스제닉 다가 결합 펩티드와 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성시키는 단계를 포함한다. 상기 다가 결합 폴리펩티드는 상기 표적 폴리펩티드와 결합할 수 있는 제1 결합 부분 및 미리 선택된 리간드(예, 매트릭스)와 결합할 수 있는 제2 결합 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분이 상기 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 결합하도록 상기 표적 폴리펩티드 및 상기 다가 폴리펩티드의 혼합물을 유지시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 상기 혼합물을 상기 제2 결합 부분이 결합하는 매트릭스와 접촉시키는 단계, 및 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 상기 매트릭스에 결합하도록 하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 상기 혼합물의 임의의 비결합 성분을 제거하는 단계, 및 상기 혼합물로부터 표적 폴리펩티드를 용출 등의 방법으로 선택적으로 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 다가 결합 폴리펩티드는 트랜스제닉 동물의 유즙 내에서 발현된다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 다가 폴리펩티드는 상기 표적 폴리펩티드를 발현시키는 동물과 동일한 트랜스제닉 동물의 유즙 내에서 발현되거나, 그러한 트랜스제닉 동물과는 상이한 트랜스제닉 동물의 유즙 내에서 발현된다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드는 상기 동물에서 유래한 유즙 내에 고농도, 예를 들어, 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재한다.
하기 방법은 다가 결합 폴리펩티드를 매트릭스에 접촉시키고, 그 다음에 표적과 접촉시키는 것에 관한 것이나, 그 반대의 순서도 모든 실시 태양에 있어서 동등하게 적합하다.
다른 실시 양태에 있어서, 본 발명은 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 결합성 에피토프를 포함하는 표적 폴리펩티드를 발현 및/또는 수득, 예를 들어, 정제하는 데 사용할 수 있는 트랜스제닉 동물 시스템을 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 시스템은 그 포유동물 조직 내에서 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 발현시키는 트랜스제닉 동물을 포함한다. 상기 다가 결합 폴리펩티드는 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 예를 들어, 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부분, 및 매트릭스에 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 트랜스제닉 동물은 그 포유동물 조직 내에서 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 결합성 에피토프를 포함하는 표적 폴리펩티드를 발현시킨다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 포유동물은 유즙 내에서 상기 트랜스제닉 다가 폴리펩티드를 발현시키고, 상기 다가 결합 폴리펩티드를 암호하는 DNA 서열은 포유동물 상피 세포 내에서의 발현을 지시하는 프로모터, 예를 들어, 카세인, 락토글로불린, 락트알부민 또는 유장 산 단백질(WAP) 프로모터의 제어 하에 있다.바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 포유동물은 유즙 내에서 상기 표적 폴리펩티드를 발현시키고, 상기 표적 폴리펩티드를 암호하는 DNA 서열은 포유동물 상피 세포 내에서의 발현을 지시하는 프로모터, 예를 들어, 카세인, 락토글로불린, 락트알부민 또는 유장 산 단백질(WAP) 프로모터의 제어 하에 있다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 다가 결합 폴리펩티드는 트랜스제닉 동물의 유즙 내에 고농도로, 예를 들어, 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재한다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드는 동일한 트랜스제닉 동물의 유즙 내에 고농도로, 예를 들어, 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재한다. 상기 다가 결합 폴리펩티드 및 상기 표적 분자 양자 모두는 고농도로, 예를 들어, 각각 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 시스템은 상기 제2 결합 부분이 특이적으로 결합하는 매트릭스를 추가로 포함한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프는 제거 가능하다. 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드의 잔류물로부터 개열시켜, 상기 결합성 에피토프를 제거할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 촉매 부분에 의하여 상기 결합성 에피토프를 제거할 수 있다. 상기 촉매 부분은 제2 다가 결합 폴리펩티드의 부분, 예를 들어, 제2 트랜스제닉적 생성 다가 결합 폴리펩티드의 부분인 것이 바람직하다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 제2 다가 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 제2 트랜스제닉적 생성 다가 결합 폴리펩티드는 제1 촉매 도메인 및 제2 결합 부분을 포함한다. 상기 제2 결합 부분은 매트릭스, 예를 들어, 상기 제1 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스와는 상이한 매트릭스에 특이적으로 결합한다. 상기 제2 다가 결합 폴리펩티드는: 상기 제1 다가 결합 폴리펩티드 및/또는 표적 폴리펩티드를 발현시키는 동물과 동일한 트랜스제닉 동물에 의하여 발현될 수 있고; 또는 상기 제1 다가 결합 폴리펩티드 및/또는 상기 표적 폴리펩티드를 발현시키는 트랜스제닉 동물과는 상이한 트랜스제닉 동물에 의하여 발현될 수 있다.
하기 시스템은 다가 결합 폴리펩티드를 매트릭스에 접촉시키고, 그 다음에 표적과 접촉시키는 것에 관한 것이나, 그 반대의 순서도 모든 실시 태양에 있어서 동등하게 적합하다.
다른 실시 양태에 있어서, 본 발명은 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 결합성 에피토프를 포함하는 표적 폴리펩티드를 발현 및/또는 수득, 예를 들어, 정제하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이러한 방법은 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드 및 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 결합성 에피토프를 포함하는 표적 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 트랜스제닉 동물에서 유래한 유즙을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 다가 결합 폴리펩티드는 표적 폴리펩티드에 결합할 수 있는, 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드 상의 결합성 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 부분 및 매트릭스에 결합할 수 있는 제2 결합 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 방법은 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분을 상기 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 결합시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 그러한 혼합물을 상기 제2 결합부분이 특이적으로 결합하는 매트릭스와 접촉시키는 단계, 및 상기 다가 결합 펩티드의 제2 결합 부분을 상기 매트릭스에 결합시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 상기 혼합물의 임의의 비결합 성분을 제거하는 단계, 및 상기 혼합물로부터 표적 폴리펩티드를 용출 등의 방법으로 선택적으로 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 다가 결합 폴리펩티드는 트랜스제닉 동물의 유즙 내에 고농도로, 예를 들어, 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재한다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드는 동일한 트랜스제닉 동물의 유즙 내에 고농도로, 예를 들어, 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재한다. 상기 다가 결합 폴리펩티드 및 상기 표적 분자 양자 모두는 고농도로, 예를 들어, 각각 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
하기 방법은 다가 결합 폴리펩티드를 매트릭스에 접촉시키고, 그 다음에 표적과 접촉시키는 것에 관한 것이나, 그 반대의 순서도 모든 실시 태양에 있어서 동등하게 적합하다.
이러한 시스템들 및 방법들은 종래에 존재하는 시스템들에 비하여 많은 이점을 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 시스템들 및 방법들은, 그들이 친화성 리간드를 분리 정제할 필요성 및 기능화된(functionalized) 친화성 매트릭스에 그들을 결합시킬 필요성을 제거하기 때문에, 상기 생물학적 분자를 정제하는 비용 및 시간을 매우 감축시킨다.
본 발명의 목적을 위하여, 하기 용어들은, 다른 명시가 없는 한, 본 섹션에서 기술한 바와 같은 의미를 갖는다. "에피토프" 또는 "결합성 에피토프(bindable epitope)"는 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 3차원 분자 형태이다. "결합 부분(binding moiety)"은 에피토프에 특이적으로 결합하는 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 폴리펩티드 부분이다.
"폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용한다. 상기 폴리펩티드는 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 그러한 폴리펩티드들은 약 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 기타 펩티드 또는 기타 비-펩티드 분자와의 분자간 회합(intermolecular association) 뿐만 아니라, 2차, 3차 또는 4차 구조를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분자간 회합은 공유 결합(예, 다이설파이드 결합을 통한 공유 결합), 또는 킬레이트화를 통한 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 수소 결합, 이온-이중 극자 상호작용, 이중 극자-이중 극자 상호작용, 또는 상기의 임의의 조합을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. "폴리펩티드 부분(polypeptide portion)"은 약 3 내지 약 100개의 인접 및/또는 비인접 아미노산을 포함하며, 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있다.
"펩티드-함유 에피토프"는 펩티드의 아미노산 잔기에서 유래한 면역학적 결정자(immunological determinant)의 적어도 일부로 이루어지는 에피토프이다. "탄수화물-함유 에피토프"는 분자의 탄수화물 부분에서 유래한 면역학적 결정자의 적어도 일부로 이루어지는 에피토프이다. "지질-함유 에피토프"는 분자의 지질 부분에서 유래한 면역학적 결정자의 적어도 일부로 이루어지는 에피토프이다. "면역학적 결정자"는 에피토프의 전체 3차원 형태에 기여하는 3차원 형태이다.
"아미노산 잔기에서 유래한 면역학적 결정자"는 전체 또는 일부 측쇄 및/또는 알파-탄소 및/또는 어느 한쪽 또는 양자 모두의 펩티드 결합 및/또는 아미노산 잔기의 아미노 터미널 및/또는 카복시 터미널이 그 3차원 형태에 기여하는 면역학적 결정자이다.
"트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드(transgenic multivalent binding polypeptide)"는 생물학적 시스템에 존재하는 표적 분자의 결합성 에피토프에 결합하는 제1 결합 부분, 및 매트릭스에 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 트랜제닉적으로 생성된 폴리펩티드이다.
"표적 분자(target molecule)"는 정제해야할 임의의 분자이다. 용어 "표적 폴리펩티드"가 상기 시스템들 및 방법들의 상기 설명을 통하여 사용되었을 지라도, 임의의 실시 태양에 있어서 본 명세서에 기술된 기타 표적 분자를 사용할 수 있다.
"생물학적 시스템(biological system)"은 시험관내 세포 또는 조직 추출물, 진핵 또는 원핵 세포 배양물, 조직 배양물, 기관 배양물, 살아있는 식물 및 동물, 및 살아있는 식물 또는 동물의 추출물을 포함한다.
"매트릭스(matrix)"는 생물학적 시스템에서 분리된 상(phase)일 수 있는 물질이다.
"특이적 결합(specifically bind)"은 유즙에 존재하는 조건을 비롯한 특정 조건들인 프로세스 결합 조건들(process binding condition), 예를 들어, pH 4-9및 이온세기 50 mM 내지 1 M 하에서, 친화성이 104M-1이상, 더욱 바람직하게 106M-1이상, 가장 바람직하게 109M-1이상인 공유 또는 비공유 회합을 형성하는 것을 의미한다.
"제거 가능한 에피토프(removable epitope)"는, 바람직하게는 화학적 또는 효소적 개열에 의하여, 분자에서 물리적으로 분리될 수 있는 에피토프이다.
발현이 "고농도(high level)"라는 것은 약 0.1 mg/㎖ 이상, 바람직하게 약 0.5 mg/㎖, 가장 바람직하게 약 1 mg/㎖ 이상인 것을 의미한다.
"선택적 용출(selectively eluting)"은, 바람직하게는 매트릭스에서 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 해리시키지 않으면서, 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드에서 표적 분자를 해리시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어 "트랜스제닉 동물(transgenic animal)"은 그 동물의 세포의 1 이상이, 바람직하게는 본질적으로 모두가, 당업계에 공지된 트랜스제닉 기술을 이용하는 등으로 인간이 개재함으로써 도입시킨 이종성 핵산을 함유하는 인간이 아닌 동물이다. 트랜스유전자(transgene)는, 세포의 전구체 내로의 도입을 통하여, 주의 깊은 유전학적 조작을 통하여, 예를 들어, 마이크로인젝션 (microinjection)을 통하여, 또는 재조합 바이러스를 이용한 감염을 통하여 직접적으로 또는 간접적으로 세포내로 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어 "포유동물"은 유선(mammary gland)을 가지며, 유즙을 생산하는 모든 동물로서 인간을 제외한 동물로 정의한다.
본 명세서에서 사용한 용어 "낙농동물(dairy animal)"은 유즙을 생산하는 동물을 의미한다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 낙농동물은 다량의 유즙을 생산하며, 젖 분비 기간이 긴, 예를 들어, 젖소 또는 염소와 같은 동물이다.
본 명세서에서 사용한 용어 "식물"은 식물 전체, 식물의 부분, 식물 세포, 또는 식물 세포의 일군을 의미한다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 식물군은 일반적으로, 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 양자 모두를 비롯하여, 형질전환 (transformation) 기술에 이용할 수 있는 고등 식물군 만큼 넓다. 상기에는 배수체(polyploidy), 2배체(diploid) 및 1배체(haploid)를 비롯한 다양한 배수성 (ploidy) 레벨의 식물이 포함된다.
본 명세서에서 사용한 용어 "정제된" 표적 폴리펩티드는 표적 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 의하여 생성되는 경우 세포질 물질이 거의 없는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "세포질 물질이 거의 없는(substantially free of cellular material)"은, 표적 폴리펩티드를 그것이 생성되는 세포의 세포질 성분에서 분리시킨 표적 폴리펩티드의 제조를 포함한다. 한 실시 태양에 있어서, "세포질 물질이 거의 없는"은 비-표적 폴리펩티드(또한, 본 명세서에서 "단백질 불순물" 또는 "오염 단백질"로도 언급함)를 약 30% (건조 중량으로) 이하로 함유하고, 더욱 바람직하게는 비-표적 폴리펩티드를 약 20% 이하로 함유하며, 더욱 더 바람직하게는 비-표적 폴리펩티드를 약 10% 이하로 함유하고, 가장 바람직하게는 비-표적 폴리펩티드를 약 5% 이하로 함유하는 표적 폴리펩티드의 제조를 포함한다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명 및 청구범위로부터명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 생물학적 시스템으로부터 유래한 폴리펩티드의 트랜스제닉 발현 및 정제에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 폴리펩티드의 발현 및 정제를 위한 트랜스제닉 시스템, 및 그러한 시스템을 이용하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서 인용한 특허 및 간행물은 당업자가 이용할 수 있는 지식을 반영한 것이며, 그러한 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 참고 인용되어 포함되는 것이다.
본 발명은 생물학적 시스템에 존재하는 표적 분자의 정제를 위한 시스템 및 정제 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 시스템 및 방법은 친화성 매질로서 트랜스제닉적으로 생성된 다가 결합 폴리펩티드와 같은 다가 결합 폴리펩티드의 존재를 이용하여 그러한 표적 분자를 정제하는 것이다. 상기 다가 결합 폴리펩티드는 상기 표적 분자 및 매트릭스(예, 상 분리성 매트릭스) 양자 모두에 결합하는 것이 바람직하다. 이들 시스템 및 방법은 이전에 존재하던 시스템에 비하여 많은 이점을 제공한다. 본 발명에 따른 시스템들 및 방법들은, 그들이 친화성 리간드를 분리 정제할 필요성 및 친화성 매트릭스를 기능화시킬 필요성을 제거하기 때문에, 상기 표적 분자를 정제하는 비용 및 시간을 매우 감축시킨다. 특정 실시 태양에 있어서, 정제될 생물학적 분자는 폴리펩티드이다. 이러한 실시 태양에 있어서, 본 발명은 상기 표적 분자를 발현 및 정제하는 양자 모두를 위한 시스템 및 방법을 제공함으로써 제조 공정을 더욱 단순화시키고, 그 비용을 더욱 감소시킨다. 표적 폴리펩티드 및 다가 결합 폴리펩티드 양자 모두는 별개의 동물 또는 동일한 동물의, 예를 들어, 동물 유즙 내로 트랜스제닉적으로 발현될 수 있다. 하기 방법 및 시스템은 다가 결합 폴리펩티드를 매트릭스에 접촉시키고, 그 다음에 표적과 접촉시키는 것에 관한 것이나, 그 반대의 순서도 모든 실시 태양에 있어서 동등하게 적합하다.
본 발명은 결합성 에피토프를 포함하는 표적 분자의 정제를 위한 트랜스제닉 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 예를 들어 포유동물 조직 내에 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 발현시키는 트랜스제닉 동물을 포함할 수 있다. 상기 다가 폴리펩티드는 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 결합하는 제1 결합 부분, 및 매트릭스에 결합하는 제2 결합 부분을 포함한다. 상기 시스템은 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 특이적으로 결합하는매트릭스를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
트랜스제닉 동물은 조직 특이적 방법으로 다가 결합 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 그러한 조직 특이적 발현은 조직-특이적 프로모터, 예를 들어, 포유동물 상피 세포 내에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에 표적 단백질을 암호하는 서열을 보유함에 의하여 얻어질 수 있다. 유즙 특이적 프로모터에는 카세인 프로모터(예, α-카세인, β-카세인, κ-카세인 또는 λ-카세인 프로모터), WAP 프로모터, β-락토글로빈 및 락트알부민 등이 포함될 수 있다.
표적 분자에는 핵산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 탄수화물, 지질, 호르몬, 성장 인자, 효소 보조 인자, 기타 자연 발생적 리간드 및 폴리펩티드 등이 포함될 수 있다. 표적 분자의 결합성 에피토프에는 탄수화물-함유 에피토프, 지질-함유 에피토프 및 펩티드-함유 에피토프, 및 이들의 임의 조합을 포함하는 에피토프가 포함될 수 있다. 표적 분자는 내인성 또는 외인성 분자일 수 있다.
본 발명은 또한 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드의 발현 및/또는 정제를 위한 다수 동물 트랜스제닉 시스템을 포함할 수 있다. 상기 시스템은 예를 들어, 포유동물 조직 내에서 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 발현시키는 제1 트랜스제닉 동물을 포함할 수 있다. 상기 트랜스제닉 다가 폴리펩티드는 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 결합하는 제1 결합 부분, 및 매트릭스에 결합하는 제2 결합 부분을 포함한다. 상기 시스템은 예를 들어, 포유동물 조직 내에서, 결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드를 발현시키는 제2 동물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 시스템은 상기제2 결합 부분이 특이적으로 결합하는 매트릭스를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제2 동물은 표적 폴리펩티드를 발현시키는 트랜스제닉 동물일 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 동물은 조직 특이적 방법으로 표적 폴리펩티드를 발현시키는, 예를 들어, 그 포유동물 조직에서 표적 폴리펩티드를 발현시키는 트랜스제닉 동물일 수 있다. 표적 분자의 결합성 에피토프는 제거 가능한 에피토프일 수 있다. 예를 들어, 제2 다가 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 제2 트랜스제닉적으로 생성된 다가 폴리펩티드의 촉매 부분에 의하여 상기 에피토프를 제거할 수 있다. 제2 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드는 제1 촉매 도메인 및 매트릭스에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함할 수 있다. 상기 제2 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스는 상기 제1 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스와는 상이한 것이 바람직하다. 제2 다가 결합 폴리펩티드의 촉매 도메인은 제거 가능한 에피토프로부터 결합성 에피토프를 개열시키는 것을 촉매할 수 있다. 예를 들어, 상기 촉매 도메인은 아미다아제 활성을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 표적 폴리펩티드, 예를 들어, 결합성 에피토프를 포함하는 표적 폴리펩티드의 발현 및/또는 정제를 위한 단일 동물 트랜스제닉 시스템을 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 시스템은 예를 들어, 포유동물 조직 내에서 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드를 발현시키고, 예를 들어, 포유동물 조직 내에서 표적 폴리펩티드를 발현시키는 트랜스제닉 동물을 포함한다. 다가 결합 폴리펩티드는 상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 결합하는 제1 결합 부분 및 매트릭스에 결합하는 제2 결합 부분을 포함할 수 있다.
상기 다가 결합 폴리펩티드 및 상기 표적 폴리펩티드는 동일하거나 상이한 조직 내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드 암호화 서열은 일반적인 프로모터의 제어 하에 있고, 상기 다가 결합 폴리펩티드 암호화 서열은 조직 특이적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있으며, 또는 상기와 역으로도 가능하다; 또한, 상기 표적 폴리펩티드 암호화 서열은 조직 특이적 프로모터의 제어 하에 있고, 상기 다가 폴리펩티드 암호화 서열은 상이한 조직 타입에 대하여 조직 특이적인 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 폴리펩티드 암호화 서열은 소변 특이적 프로모터의 제어 하에 있으며, 상기 다가 결합 폴리펩티드 암호화 서열은 유즙 특이적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다; 또한, 상기 다가 결합 폴리펩티드 암호화 서열 및 상기 표적 폴리펩티드 암호화 서열 양자 모두가 동일한 조직 타입에 대하여 조직 특이적인 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 다가 결합 폴리펩티드 암호화 서열이 유즙 특이적 프로모터의 제어 하에 있고, 상기 표적 폴리펩티드 암호화 서열이 동일하거나 다른 유즙 특이적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
상기 다가 결합 폴리펩티드 및 상기 표적 폴리펩티드는 트랜스제닉 동물의 유즙에서 발현되는 것이 바람직하다. 상기 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드는 상기 표적 분자의 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 표적 분자 전체에 결합하기에 충분한 농도로, 상기 유즙 내에 존재하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 다가 결합 폴리펩티드는 상기 트랜스제닉 동물의 유즙 내에 예를 들어 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 고농도로 존재할 수 있다. 또한, 상기 표적 폴리펩티드는 동일한 트랜스제닉 동물의 유즙 내에 예를 들어 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 고농도로 존재하는 것이 바람직하다.
상기 시스템은 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 특이적으로 결합하는 매트릭스를 추가로 포함할 수 있다.
표적 분자의 결합성 에피토프는 제거 가능한 에피토프일 수 있다. 예를 들어, 제2 다가 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 제2 트랜스제닉적 생성 다가 폴리펩티드의 촉매 부분에 의하여 상기 에피토프를 제거할 수 있다. 제2 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드는 제1 촉매 도메인 및 매트릭스에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함할 수 있다. 상기 제2 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스는 제1 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스와는 상이한 것이 바람직하다. 제2 다가 결합 폴리펩티드의 촉매 도메인은 제거 가능한 에피토프로부터 결합성 에피토프를 개열시키는 것을 촉매할 수 있다. 예를 들어, 상기 촉매 도메인은 아미다아제 활성을 가질 수 있다.
상기 표적 폴리펩티드는 동물의 포유동물 조직 내에 불활성 형태로 발현시킬 수 있다. 이러한 실시 양태는 상기 표적 폴리펩티드가 상기 포유동물 조직에서 그 생물학적 기능을 수행하도록 하는 것이 바람직하지 않은 상황에서 특히 유익할 수 있다. 예를 들어, 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분은 그것이 선택적으로 용출될 때까지 그 표적 분자가 생물학적 기능을 수행하지 않도록 하는 방식으로 표적 폴리펩티드와 결합할 수 있다. 또는, 결합성 에피토프가, 표적 폴리펩티드가 그 에피토프가 제거될 때까지 생물학적으로 활성이 아닌 제거 가능한 에피토프일 수 있다. 몇몇 실시 태양에 있어서, 상기 결합 부분은 제거 가능한 에피토프를 제거할 수 있다.
본 발명은 또한 생물학적 시스템으로부터 결합성 에피토프를 포함하는 표적 분자를 수득, 예를 들어, 정제하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 본 방법은 전술한 시스템 중 임의의 것을 이용할 수 있다. 본 방법은 다가 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 임의의 다가 결합 폴리펩티드를 생물학적 시스템에서 유래한 물질의 조성물(composition of matter)과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 물질의 조성물은 결합성 에피토프를 갖는 표적 분자를 포함할 수 있다. 상기 혼합물 내에서, 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분은 상기 표적 분자의 결합성 에피토프에 결합할 수 있다. 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분이 상기 표적 분자의 결합성 에피토프에 결합하도록 상기 반응 혼합물을 유지시키는 것이 바람직하다. 상기 혼합물은 상기 제2 결합 부분이 결합하는 매트릭스와 추가로 접촉시킬 수 있다. 매트릭스가 존재하는 경우, 상기 다가 결합 펩티드의 제2 결합 부분은 매트릭스에 결합할 수 있고, 상기 혼합물의 임의의 비결합 성분을 제거할 수 있다. 그 후, 상기 표적 분자를 상기 물질의 조성물로부터 예를 들어, 용출 등의 방법으로 수득할 수 있다.
상기 방법은 또한 표적 분자를 포함하는 샘플, 예를 들어, 유즙, 소변 또는혈액 등의 유체를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 상기 샘플을 본 명세서에서 기술한 다가 결합 폴리펩티드와 접촉시켜 표적 분자를 수득할 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 동물, 예를 들어, 트랜스제닉 동물로부터 수득할 수 있다. 바람직하게, 그 유즙 내에서 표적 분자를 발현시키는 동물로부터 상기 샘플을 수득할 수 있다. 예를 들어, 동물의 젖을 짜서 상기 샘플을 수득할 수 있다. 상기 동물은 유즙 특이적 프로모터의 제어 하에 표적 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 트랜스제닉 동물일 수 있다.
본 발명은 또한 표적 분자, 예를 들어, 결합성 에피토프를 갖는 표적 분자를 수득, 예를 들어, 정제하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 방법은 표적 분자, 예를 들어, 표적 폴리펩티드, 및 다가 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 다가 결합 폴리펩티드를 포함하는 유체, 예를 들어, 유즙을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유체(예, 유즙) 내에 표적 폴리펩티드 및 다가 결합 폴리펩티드를 발현시키는 트랜스제닉 동물로부터 상기 유체(예, 유즙)를 수득할 수 있다. 상기 방법은 제2 결합 부분이 결합하는 매트릭스와 상기 유체를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 매트릭스의 존재에 있어서, 상기 다가 결합 펩티드의 제2 결합 부분은 매트릭스에 결합할 수 있고, 상기 혼합물의 임의의 비결합 성분을 제거할 수 있다. 그 후, 상기 표적 분자를 상기 물질의 조성물로부터 수득(예, 용출)할 수 있다.
생물학적 시스템에서 유래한 물질의 조성물을 충분한 농도의 다가 결합 폴리펩티드를 함유하는 유즙과 접촉시켜, 상기 물질의 조성물로부터 표적 분자를 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 표적 분자 전체를 수득하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 유즙은, 포유동물 조직 내에서의 트랜스제닉 다가 결합 단백질의 발현 및 상기 유즙 내로의 분비로 인하여, 트랜스제닉 다가 결합 단백질을 고농도로 함유할 수 있다. 상기 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드는 유즙 내에 0.1, 1, 5, 10 mg/㎖ 이상의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
생물학적 시스템은 예를 들어, 식물, 진균류, 박테리아 및 동물 생성물을 포함한다. 생물학적 시스템에서 유래한 조성물은 조절 배지, 조직 추출물, 기관 및 체액(예, 혈액, 혈장, 혈청, 땀, 타액, 소변, 유즙 등)을 포함할 수 있다. 그러한 식물, 진균류, 박테리아 및 동물 생성물은 내인성 또는 외인성 공급 유전자로부터 발현된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
상기 방법 중 임의의 방법에 있어서, 표적 분자의 결합성 에피토프는 제거 가능한 에피토프일 수 있다. 예를 들어, 제2 다가 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 제2 트랜스제닉적으로 생성된 다가 폴리펩티드의 촉매적 부분에 의하여 상기 에피토프를 제거할 수 있다. 제2 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드는 제1 촉매 도메인 및 매트릭스에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함할 수 있다. 상기 제2 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스는 상기 제1 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 매트릭스와는 상이한 것이 바람직하다. 제2 다가 결합 폴리펩티드의 촉매 도메인은 제거 가능한 에피토프로부터의 결합성 에피토프의 개열을 촉매할 수 있다. 예를 들어, 상기 촉매 도메인은 아미다아제 활성을 가질 수 있다. 에피토프가 제거 가능한 에피토프인 경우에, 표적 분자로부터 상기 에피토프를 제거함으로써 상기 혼합물로부터 상기 표적 폴리펩티드를 수득할 수 있다.
상기 표적 폴리펩티드는 동물의 포유동물 조직 내에 불활성 형태로 발현시킬 수 있다. 이러한 실시 양태는 상기 표적 폴리펩티드가 상기 포유동물 조직에서 그 생물학적 기능을 수행하도록 하는 것이 바람직하지 않은 상황에서 특히 유익할 수 있다. 예를 들어, 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분은 그것이 선택적으로 용출될 때까지 그 표적 분자가 생물학적 기능을 수행하지 않도록 하는 방식으로 표적 폴리펩티드와 결합할 수 있다. 또는, 결합성 에피토프가, 표적 폴리펩티드가 그 에피토프가 제거될 때까지 생물학적으로 활성이 아닌 제거 가능한 에피토프일 수 있다. 몇몇 실시 태양에 있어서, 상기 결합 부분은 제거 가능한 에피토프를 제거할 수 있다.
표적 분자에 결합하는 다가 결합 폴리펩티드의 결합 부분
본 발명의 다가 결합 폴리펩티드는 표적 분자, 예를 들어, 표적 분자의 결합성 에피토프에 결합할 수 있는 제1 결합 부분을 포함한다. 바람직한 제1 결합 부분으로는, 항체, 그 Fab 또는 F(ab)2단편, 또는 상기 표적 분자의 결합성 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 상보성 결정 영역을 포함하는 폴리펩티드 부분, 표적 분자의 결합성 에피토프에 결합하는 수용체 또는 리간드, 또는 표적 분자의 결합성 에피토프에 특이적으로 결합하는 임의의 기타 폴리펩티드 부분, 예를 들어, 예컨대, 파아지 디스플레이(phage display) 또는 2 하이브리드 분석(2 hybrid assay)에 있어서 결합을 위하여 선택된 폴리펩티드 등이 있다.
항체 또는 그 단편
항체들 및 다양한 항체 유도체들을 제조하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature321: 522-525 (1986)]에는 인간 항체의 CDR을 마우스 항체로부터 유래한 것으로 대체하는 방법이 공개되어 있다. 문헌[Marx, Science229: 455-456 (1985)]에서는 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 갖는 키메라성 항체에 대하여 논의하고 있다. 문헌[Rodwell, Nature342: 99-100 (1989)]에서는 항체 CDR 정보에서 유도된 저분자량 인식 인자(recognition element)에 대하여 논의하고 있다. 문헌[Clackson, Br. J. Rheumatol.3052: 36-39 (1991)]에서는 Fv 단편 유도체, 단일 사슬 항체, 융합 단백질 키메라성 항체 및 인간 적합성(humanized) 설치류 항체를 비롯한, 유전공학적으로 조작된 모노클로날 항체에 대하여 논의하고 있다. 문헌[Reichman et al., Nature332: 323-327 (1988)]에서는 래트 초가변성 영역이 그래프트(graft)된 인간 항체에 대하여 공개하고 있다. 문헌[Verhoeyen et al., Science239: 1534-1536 (1988)]에서는 인간 항체 상에 마우스 항원 결합 부위를 그래프팅하는 것에 대하여 교시하고 있다.
매트릭스에 결합하는 다가 결합 폴리펩티드의 결합 부분
본 발명의 다가 결합 폴리펩티드는 또한 매트릭스에 결합하는 제2 결합 부분을 포함한다. 제2 결합 부분은, 예를 들어, 항체 또는 항체 유도체를 포함할 수있는데, 여기에서, 매트릭스는 항체에 의하여 특이적으로 결합되는 항원 또는 그 에피토프를 포함한다. 그러한 실시 태양에 있어서, 상기 항체 및 항원 사이의 상호작용은 상기 표적 분자를 용출시킬 것인 조건 하에서 해리를 막기에 충분해야 한다. 기타 바람직한 제2-결합 부분-매트릭스 쌍으로는 폴리히스티딘-니켈 금속 킬레이트(<250 mM 이미다졸 또는 저 pH로 용출), 스트렙트아비딘-비오틴(6 M 요소, pH 4.0 으로 용출), FlagTM펩티드-특이적 MAb(pH 3.0 또는 2-5 mM EDTA로 용출), S-펩티드-S-단백질 리보뉴클레아제[자기 개열(self-cleavage) 후 용출], 글루타치온-S-트랜스퍼라아제-글루타치온(5-10 mM 환원 글루타치온으로 용출), 단백질 A-IgG의 합성 ZZ 도메인 또는 단백질 A(저 pH에서 용출), IgG Fc 영역-단백질 A(저 pH에서 용출), 말토스-결합 도메인-가교 결합 아밀로스(10 mM 말토스로 용출) 및 셀룰로스 결합 도메인(CBD)-셀룰로스 또는 키틴(물 또는 >4 M 구아니디늄 또는 1 M 이상의 NaOH로 용출) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 셀룰로스 결합 도메인-셀룰로스 또는 키틴 쌍이 현재 가장 바람직하다. 항체 정제에 있어서, 가장 바람직한 실시 태양은 단백질 L에서 유래한 제1 결합 부분 및 CBD에서 유래한 제2 결합 부분을 포함한다.
표적 분자
표적 분자는 내인성 분자, 예를 들어, 내인성 폴리펩티드, 또는 외인성 분자, 예를 들어, 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 외인성 폴리펩티드는 그 동물에서 자연적으로 발현되는 폴리펩티드이나, 특정 조직에서는 발현되지 않거나,또는 발현되는 조직에서 저농도로 발현되는 폴리펩티드일 수 있다. 또는, 상기 외인성 폴리펩티드는 동물(예를 들어, 이 동물은 인간 폴리펩티드를 발현시키는 인간이 아닌 동물임)에서 발현되지 않는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 표적 분자는 결합성 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 결합성 에피토프는 제거 가능한 에피토프일 수 있다. 상기 제거 가능한 에피토프는 상기 표적 분자의 선택적 용출 후 제거할 수 있다. 그러한 제거 가능한 에피토프는 자기-스플라이싱(self-splicing)에 의하여 번역 후 편집된 단백질, 예를 들어, 소위 "인테인(intein)"-함유 단백질의 폴리펩티드 부분으로부터 유도될 수 있다. 대안적으로, 상기 제거 가능한 에피토프는, 특이적 프로테아제 인식 및 개열 부위에 의하여 표적 분자의 잔류물에 결합될 수 있다. 그러나, 상기 표적 분자의 다른 그러한 부위는 상기 프로테아제에 접근할 수 없다는 것을 조건으로 한다. 상기 프로테아제는 매트릭스에 부착될 수 있는 것이 바람직하다. 몇몇 실시 태양에 있어서, 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드 그 자신은, 제1 결합 부분의 일부로서 또는 별개의 가요성-부착 추가 결합 부분으로서, 프로테아제 활성을 포함할 수 있다. 프로테아제 활성이 제1 결합 부분의 일부인 경우에, 그것은 한 세트의 조건 하에서 결합성 에피토프가 결합하고, 상이한 두 번째 세트의 조건 하에서 상기 결합성 에피토프가 개열되는 능력을 갖는 것이 바람직하다.
트랜스제닉 포유동물
인간이 아닌 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 방법은 포유동물의 생식선 내로 DNA 작제물을 도입하여 트랜스제닉 동물을생성시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 표준 트랜스제닉 기술을 이용해서, 상기 작제물의 1 또는 수 카피를 포유동물 배(embryo)의 게놈에 혼입시킬 수 있다.
소과 동물 및 염소가 바람직하지만, 기타 인간이 아닌 포유동물을 사용할 수 있다. 인간이 아닌 포유동물 중 바람직한 포유동물로는 반추동물, 예를 들어, 젖소, 양, 낙타 또는 염소가 있다. 인간이 아닌 포유동물 중 바람직한 포유동물의 추가 예로는 황소, 말, 라마, 돼지, 마우스 및 랫트 등이 있다. 핵 전이 기술 (nuclear transfer techniques)에 있어서, 세포, 예를 들어, 유전공학적으로 조작되는 세포의 원으로서 사용되는 포유동물은 수득할 트랜스제닉 포유동물에 따라 달라질 것이다. 예로서, 소과 동물 난모세포를 이용하는 핵 전이에 있어서, 소과 동물에서 얻어진 게놈이 사용되어야 한다.
다양한 트랜스제닉 동물의 생산 방법이 당업계에 공지되어 있다. 트랜스제닉 염소 생산을 위한 프로토콜이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[예, Ebert et al. (1994)Bio/Technology12:699]에 기재된 방법에 따른 마이크로인젝션 또는 예컨대 PCT 출원 WO 98/30683에 기재된 방법에 따른 핵 전이 기술을 이용하여 염소의 생식선 내로 트랜스유전자를 도입시킬 수 있다. 트랜스제닉 돼지의 생산을 위한 프로토콜은 다수의 문헌[White and Yannoutsos,Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, pp. 88-94; 미국 특허 제5,523,226호; 미국 특허 제5,573,933호; PCT 출원 WO 93/25071; 및 PCT 출원 WO 95/04744]에서 발견할 수 있다. 트랜스제닉 랫트 생산을 위한 프로토콜은 다수 문헌[Bader and Ganten,Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,Supp. 3:S81-S87, 1996]에서 발견할 수 있다. 트랜스제닉 젖소의 생산을 위한 프로토콜은 다수의 문헌[미국 특허 제5,741,957호, PCT 출원 WO 98/30683 및Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc.]에서 발견할 수 있다. 트랜스제닉 양의 생산을 위한 프로토콜은 다수의 문헌[PCT 공개 WO 97/07669, 및Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc.]에서 발견할 수 있다.
트랜스펙트된 세포주
핵 전이에 의한 트랜스제닉 포유동물의 생산을 위한 유전공학적 조작 세포는 해당 핵산, 예를 들어, 단백질을 암호하는 핵산을 도입시킨 세포주로부터 얻을 수 있다.
통상의 형질전환 또는 트랜스펙션 기술을 통하여 작제물을 세포 내로 도입시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어 "트랜스펙션(transfection)" 및 "형질전환(transformation)"은 숙주 세포에 트랜스제닉 서열을 도입하기 위한 다양한 기술을 포함하는데, 이러한 기술로는 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공-침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 리포펙션(lipofection) 또는 일렉트로포레이션(electroporation) 등이 있다. 또한, 생물학적 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터를 이하에 기술한 바와 같이 사용할 수 있다. 숙주 세포를 형질전환시키거나 트랜스펙트시키기 위한 적당한 방법은 다수의 문헌[Sambrook et al.,MolecularCloning: A Laboratory Manuel, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)] 및 기타 적당한 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
유용한 두 가지 접근법은 일렉트로포레이션 및 리포펙션이다. 각각의 간략한 예를 이하에 기술한다.
하기 프로토콜을 이용한 일렉트로포레이션에 의하여, 공여체 세포주, 예를 들어, 배아 세포, 예컨대, 배아 체세포주 내로 DNA 작제물을 안정하게 도입시킬 수 있다: 상기 세포들을 PBS 중에 약 4 x 106세포/㎖로 재현탁시킨다. 선형화된 DAN 50 ㎍을 상기 세포 현탁액 0.5 ㎖에 첨가하고, 그 현탁액을 0.4 cm 전극 갭 크벳(cuvette)(Biorad) 내에 넣는다. 바이오래드 유전자 펄서 일렉트로포레이터 (Biorad Gene Pulser electroporator)를 사용하고, 25 mA에서 330 볼트 펄스, 1000 마이크로패러드 및 무한 저항을 이용하여 일렉트로포레이션을 수행한다. 상기 DNA 작제물이 선별을 위한 네오마이신 내성 유전자를 포함하고 있다면, 15일 동안 G418 (GibcoBRL) 350 ㎍/㎖로 항온처리한 후 네오마이신 내성 클론들을 선별한다.
하기와 같은 프로토콜을 이용한 리포펙션에 의하여, 공여체 세포주 내로 DNA 작제물을 안정하게 도입시킬 수 있다: 약 2 x 105개의 세포를 3.5 cmiameter 웰 내에 도말하고, 립펙트아민(LipfectAMINE)TM(GibcoBRL)을 이용하여 선형화된 DNA 2 ㎍ 으로 트랜스펙트시킨다. 트랜스펙션 후, 48 시간에, 세포들을 1:1000 및 1:5000로나누고, DNA 작제물이 선별을 위한 네오마이신 내성 유전자를 포함하고 있다면, G418을 0.35 mg/㎖의 최종 농도로 첨가한다. 네오마이신 내성 콜로니를 분리하고, 저온보존(cyropreservation) 및 핵 전이를 위하여 팽창시킨다.
단백질의 조직-특이적 발현
트랜스제닉 동물의 특이적 조직 또는 유체, 예를 들어, 유즙, 혈액 또는 소변 중에 단백질, 예를 들어, 이종성 단백질을 발현시키는 것이 종종 바람직하다. 상기 이종성 단백질은 그것이 발현되는 조직 또는 유체로부터 회수할 수 있다. 예를 들어, 유즙 내에서 이종성 단백질을 발현시키는 것이 종종 바람직하다. 이하에서, 유즙 특이적 프로모터의 제어 하에 이종성 단백질을 생산하는 방법을 기술한다. 또한, 이하에서는 기타 조직-특이적 프로모터, 및 비-분비형 단백질의 분비를 증대시키는 서열 및 신호 서열과 같은 기타 조절 인자도 기술한다.
유즙 특이적 프로모터
유용한 전사 프로모터는 포유동물 상피 세포에서 선택적으로 활성화되는 프로모터들인데, 예를 들어, 카세인, 베타 락토글로불린[Clark et al., (1989) Bio/Technology7: 487-492], 유장산 단백질(Gordon et al. (1987) Bio/Technology5: 1183-1187], 및 락트알부민[Soulier et al., (1992) FEBS Letts.297:13]과 같은 유단백질을 암호하는 유전자를 제어하는 프로모터가 있다. 카세인 프로모터는 임의의 포유동물 종의 알파, 베타, 감마 또는 카파 카세인 유전자에서 유도할 수 있다; 바람직한 프로모터는 염소 베타 카세인 유전자에서 유도한다[DiTullio, (1992) Bio/Technology10: 74-77]. 유즙-특이적 단백질 프로모터 또는 포유동물조직에서 특이적으로 활성화되는 프로모터는 cDNA 또는 게놈 서열에서 유도할 수 있다. 그들은 기원에 있어서 게놈성인 것이 바람직하다.
DNA 서열 정보는, 적어도 하나의 유기체에 있어서, 그리고 종종 몇몇 유기체에 있어서, 전술한 유선 특이적 유전자에 대하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981) (α-lactalbumin rat); Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984)(rat WAP); Jones et al., J. Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985) (rat β-casein); Yu-Lee & Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983) (rat γ-casein); Hall, Biochem. J. 242, 735-742 (1987) (α-lactalbumin human); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) (bovine αsl and κcasein cDNAs); Gorodetsky et al., Gene 66, 87-96 (1988) (bovine βcasein); Alexander et al., Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (bovine κcasein); Brignon et al., FEBS Lett. 188, 48-55 (1977) (bovine αS2 casein); Jamieson et al., Gene 61, 85-90 (1987), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) (bovine βlactoglobulin); Vilotte et al., Biochimie 69, 609-620 (1987) (bovine α-lactalbumin)]을 참조하라. 다양한 유즙 단백질 유전자의 구조 및 기능에 관해서는 문헌[Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993)]을 참조하라(본 명세서에서는 모든 목적을 위하여 이 문헌 전체를 참고 인용한다). 이종성 단백질의 발현을 최적화하는데 있어서 추가의 측면 서열(flanking sequence)이 유용하다면, 프로브와 같은 존재하는 서열을 이용하여그러한 서열을 클로닝할 수 있다. 프로브와 같은 동족체(cognate) 단백질에 대한 항체, 또는 공지된 동족체 뉴클레오티드 서열을 이용하여 상이한 유기체에서 유래한 라이브러리를 스크리닝함으로써 그러한 유기체에서 유래한 유선 특이적 조절 서열을 수득할 수 있다.
신호 서열
유용한 신호 서열은 유즙 특이적 신호 서열, 또는 진핵 또는 원핵 단백질의 분비를 초래하는 기타 신호 서열이다. 신호 서열은 유즙 특이적 신호 서열에서 선택하는 것이 바람직하다. 즉, 유즙 내로 분비되는 생성물을 암호하는 유전자로부터 유래하는 것이 바람직하다. 유즙 특이적 신호 서열은 작제물에 사용되는 유즙 특이적 프로모터와 관련된 것이 가장 바람직하며, 이에 대해서는 후술한다. 신호 서열의 크기는 임계적인 것이 아니다. 요구되는 모든 것은, 그 서열이 예를 들어 포유동물 조직에서 소정 재조합 단백질의 분비를 달설하기에 충분한 크기일 것이다. 예를 들어, 알파, 베타, 감마 또는 카파 카세인과 같은 카세인, 베타 락토글로불린, 유장산 단백질 및 락트알부민에 대하여 코딩하는 유전자로부터 유래한 신호 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 신호 서열은 염소 β-카세인 신호 서열이다.
신장 세포, 췌장 세포 또는 간 세포에 의하여 분비되는 단백질과 같은 기타 분비형 단백질에서 유래한 신호 서열을 또한 사용할 수 있다. 상기 신호 서열은 예를 들어 소변 또는 혈액 내로 단백질이 분비되게 하는 것이 바람직하다.
기타 조직 특이적 프로모터
특정 조직에서의 발현을 제공하는 기타 조직 특이적 프로모터를 사용할 수있다. 조직 특이적 프로모터는 다른 조직보다는 특정 조직에서 더욱 강력하게 발현되는 프로모터이다. 조직 특이적 프로모터는 종종 특이적 조직에서 본질적으로 배타적으로 발현된다. 예를 들어, 변경 단백질이 간에서 통상적으로 발현된다면, 간 특이적 프로모터를 사용할 수 있다. 이는 서프레서(suppressor) tRNA를 사용하여 혈청 알부민을 변경시키는 경우일 것이다. 이러한 상황에 있어서, 상기 서프레서 tRNA를 암호하는 트랜스제닉 서열은 간 특이적 프로모터의 제어하에 있을 수 있다.
사용할 수 있는 조직 특이적 프로모터의 예로는 다음과 같은 것이 있다: 신경 특이적 프로모터, 예를 들어, 네스틴(nestin), Wnt-1, Pax-1, 인그레일드 (Engrailed)-1, 인그레일드-2, 소닉 헤저그(Sonic hedgehog); 간 특이적 프로모터, 예를 들어, 알부민, 알파-1 안티립신(antirypsin); 근육 특이적 프로모터, 예를 들어, 미오제닌(myogenin), 액틴, MyoD, 미오신; 난모 세포 특이적 프로모터, 예를 들어, ZP1, ZP2, ZP3; 고환 특이적 프로모터, 예를 들어, 프로타민, 페르틸린, 연접실복합체 단백질-1; 혈액 특이적 프로모터, 예를 들어, 글로불린, GATA-1, 포르포빌리노겐 디아미나제(porphobilinogen deaminase); 폐 특이적 프로모터, 예를 들어, 표면 단백질 C; 피부 또는 털 특이적 프로모터, 예를 들어, 케라틴, 엘라스틴; 내피 특이적 프로모터, 예를 들어, Tie-1, Tie-2; 및 골 특이적 프로모터, 예를 들어, BMP.
또한, 몇몇 조직에서의 발현을 위하여 일반적인 프로모터를 사용할 수 있다. 일반적인 프로모터로는 β-액틴, ROSA-21, PGK, FOS, c-myc, Jun-A 및 Jun-B.
인설레이터 서열(insulator sequence)
트랜스제닉 동물을 생산하기 위하여 사용하는 DNA 작제물은 1 이상의 인설레이터 서열을 포함할 수 있다. 용어 "인설레이터(insulator)", " 인설레이터 서열" 및 "인설레이터 인자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 인설레이터 인자는, 음성적으로 또는 양성적으로 유전자 발현을 교란시키지 않는 작용의 범위 내에서, 위치한 유전자의 전사를 격리시키는 조절 인자이다. 인설레이터 서열을 전사되는 DNA 서열의 어느 측부에 삽입하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 프로모터로부터 5', 약 200 bp 내지 약 1 kb, 그리고 당해 유전자의 3' 말단에서 프로모터로부터 적어도 약 1 kb 내지 5 kb 에 인설레이터를 위치시킬 수 있다. 당해 유전자의 3' 말단 및 프로모터로부터 인설레이터 서열의 거리는 당해 유전자의 상대적 크기, 작제물에 사용된 인핸서(enhancer) 및 프로모터에 따라 달라지며, 이는 당업자가 결정할 수 있다. 또한, 하나 이상의 인설레이터 서열을 트랜스유전자의 3' 말단에 또는 프로모터로부터 5'에 위치시킬 수 있다. 예를 들어, 2 이상의 인설레이터 서열을 프로모터로부터 5'에 위치시킬 수 있다. 트랜스유전자의 3' 말단의 인설레이터(들)을 당해 유전자의 3' 말단 또는 3' 조절 서열, 예를 들어, 3' 미번역 영역(UTR) 또는 3' 측면 서열의 3' 말단에 위치시킬 수 있다.
바람직한 인설레이터는 닭 β-글로빈 유전자좌의 5' 말단을 포함하는 DNA 분절인데, 이는 본 명세서에서 참고 인용하는 PCT 공개 94/23046에 기재되어 있는 바와 같은 닭 5' 구성형 과민성 부위에 상응하는 것이다.
DNA 작제물
이종성 단백질을 암호하는 카세트는, 프로모터, 예를 들어, 포유동물 상피 세포와 같은 특정 조직에 대한 프로모터, 예를 들어, 카세인 프로모터, 예를 들어, 염소 베타 카세인 프로모터, 유즙-특이적 신호 서열, 예를 들어, 카세인 신호 서열, 예를 들어, β-카세인 신호 서열, 및 이종성 단백질을 암호하는 DNA를 포함하는 작제물로 만들 수 있다.
또한, 상기 작제물은 비-분비형 단백질을 암호하는 DNA 서열 하류의 3' 미번역 영역을 포함할 수 있다. 그러한 영역은 발현 시스템의 RNA 전사체를 안정화시킬 수 있고, 그래서, 그 발현 시스템에서 얻어지는 소정 단백질의 수율을 증대시킬 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 작제물에 유용한 3' 미번역 영역 중에는 폴리 A 신호를 제공하는 서열이 있다. 그러한 서열은, 예를 들어, SV40 소형 t 항원, 카세인 3' 미번역 영역 또는 기타 당업계에 주지된 3' 미번역 서열로부터 유도될 수 있다. 한 실시 양태에 있어서, 3' 미번역 서열이 유즙 특이적 단백질로부터 유도된다. 3' 미번역 영역의 길이는 임계적인 것이 아니지만, 그의 폴리 A 전사체의 안정화 효과는 발현 서열의 RNA를 안정화시키는데 중요하다는 것은 분명하다.
임의로, 상기 작제물은 신호 서열을 암호하는 DNA 서열 및 프로모터 사이에 5' 미번역 영역을 포함할 수 있다. 그러한 미번역 영역은 프로모터가 취해지는 동일한 조절 영역에서 유래되는 것이거나, 상이한 유전자에서 유래되는 것일 수 있다. 예를 들어, 그들은 기타 합성, 반-합성 또는 자연적 소스에서 유도될 수 있다. 그들의 특이적 길이 또한 임계적인 것은 아니지만, 그들은 발현 수준을 개선시키는데 유용한 것으로 보인다.
상기 작제물은 또한 포유동물 상피 세포 중에서 선택적으로 발현되는 유전자의 N-터미널 코딩 영역을 약 10%, 20%, 30% 또는 그 이상 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 N-터미널 코딩 영역은 사용되는 프로모터에 상응할 수 있으며, 예를 들어, 염소 β-카세인 N-터미널 코딩 영역일 수 있다.
상기 작제물은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 작제물은 더 큰 플라스미드의 일부로서 제조할 수 있다. 그러한 제조 방법은 효율적인 방법으로 올바른 작제의 선택 및 클로닝을 가능하게 한다. 상기 작제물은, 소정 포유동물 내로 혼입시키기 위한 잔류 플라스미드 서열로부터 그들을 용이하게 분리시킬 수 있는 플라스미드 상의 편리한 제한 부위들 사이에 위치시킬 수 있다.
이종성 표적 단백질
이종성 표적 단백질을 암호하는 트랜스제닉 서열을 인간이 아닌 포유동물의 생식선 내로 도입시키거나, 전술한 바와 같은 세포주 내로 트랜스펙트시킬 수 있다.
상기 단백질은 복합 또는 다량체 단백질, 예를 들어, 호모다량체 (homomultimer) 또는 헤테로다량체(heteromultimer), 예컨데, 호모- 또는 헤테로- 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 호모다량체 또는 헤테로다량체로 자연적으로 발생하는 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 N-터미널, C-터미널 또는 내부 단편의 개열 등과 같은 제거에 의하여 프로세싱되는 단백질일 수 있다. 복합 단백질 조차도 활성 형태로 발현될 수 있다. 포유동물(예, 소과 동물 또는 염소)의 게놈 내로 도입될 수 있는 단백질 암호화 서열은 혈청 단백질, 유즙 단백질, 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 단백질을 포함한다. 단백질은 인간 기원이거나 인간이 아닌 동물 기원일 수 있다. 이종성 단백질은 잠재성 치료제 또는 약학제일 수 있는데, 그 예로는 하기와 같은 것들이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다: 알파-1 프로테이나아제 저해제, 알파-1 안티트립신, 알칼리성 포스파타아제, 앤지오제닌 (angiogenin), 안티트롬빈 Ⅲ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ 및 인자 Ⅹ를 비롯한 임의의 혈액 응고 인자, 골기질 단백질(예, BMP 1-15), 키티나아제, 에리트로포이에틴, 세포외 과산화 디스무타아제(extracellular superoxide dismutase), 피브리노겐, 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase), 글루타메이트 디카르복실라아제, 인간 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 면역글로불린, 인슐린, 마이엘린 염기성 단백질, 프로인슐린, 프로락톤, 가용성 CD4 또는 그 성분 또는 복합체, 락토페린, 락토글로불린, 라이소자임, 락트알부민, 형질전환 성장 인자(TGF), 예를 들어, TGF-β, 조직 플라스미노겐 활성화제 또는 그 변이체.
핵산 서열 정보는, 적어도 하나의 유기체에 있어서, 그리고 종종 몇몇 유기체에 있어서, 전술한 이종성 단백질을 암호하는 몇몇 유전자에 대하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌들[Long et al. (1984)Biochem. 23(21): 4828-4837 (aplha-1 antitrypsin); Mitchell et al. (1986)Prot. Natl. Acad. Sci. USA83: 7182-7186 (alkaline phosphatase); Schneider et al. (1988)EMBO J. 7(13): 4151-4156 (angiogenin); Bock et al. (1988)Biochem. 27(16): 6171-6178 (antithrombin Ⅲ); Olds et al. (1991)Br. J. Haematol. 78(3): 408-413 (antithrombin Ⅲ); Lin et al. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA82(22): 7580-7584 (erythropoeitin); 미국 특허 제5,614,184호 (erythropoietin); Horowitz et al. (1989)Genomics4(1): 87-96 (glucocerebrosidase); Kelly et al. (1992)Ann. Hum. Genet. 56(3): 255-265 (glutamte decarboxylase); 미국 특허 제5,707,828호 (human serum albumin); 미국 특허 제5,652,352호 (human serum albumin); Lawn et al. (1981)Nucleic Acid Res. 9(22): 6103-6114 (human serum albumin); Kamholz et al. (1986)Prot. Natl. Acad. Sci. USA83(13): 4962-4966 (myelin basic protein); Hiraoka et al. (1991)Mol. Cell Endocrinol. 75(1): 71-80 (prolactin); 미국 특허 제5,571,896호 (lactoferrin); Pennica et al. (1983)Nature301 (5897): 214-221 (tissue plasminogen activator); Sarafanov et al. (1995)Mol. Biol. 29: 161-165]을 참조하라. 이들 문헌은 본 명세서에 참고인용된다.
다가 결합 폴리펩티드
융합 단백질을 암호하는 핵산 분자을 이용하여, 표준 재조합 DNA 기술을 통하여 다가 결합 폴리펩티드 융합 단백질을 제조할 수 있다. 융합 단백질을 암호하는 핵산 서열은 표준 DNA 합성 방법에 의하여 합성할 수 있다.
불활성 단백질이 분비될 수 있는지 여부를 측정하는 방법
조직 배양 분석의 이용
포유동물 조직 배양 일시 발현 시스템을 이용하여 불활성 단백질을 발현시키기 위하여 작제물을 조작할 수 있다. 예를 들어, 유전자 작제물을 pcDNAII1 또는 pCEP4 등의 벡터에 라이게이트(ligate)시킬 수 있다. 표준 기법을 이용하여 트랜스펙션을 수행할 수 있고, 상청액 및 세포 펠릿 양자 모두의 대표적인 샘플을 수득할 수 있다. 상기 조직 배양 시스템은 비교적 신속하기 때문에, 불활성 단백질의 특성을 신속하게 측정할 수 있다.
생체내 분석
예를 들어, 조직 배양 시스템을 이용하여 불활성 단백질이 분비될 수 있고, 그 다음에 활성 단백질, 예를 들어, BMP가 얻어질 수 있다고 평가된다면, 염소 베타 카세인을 포함하는 시스템과 같은 유선 발현 시스템의 클로닝 부위에 불활성 단백질을 발현시키는 작제물을 배치시킬 수 있다. 상기 작제물들을 이용하여 트랜스제닉 마우스를 생산할 수 있다. 이는 유즙 내로의 단백질 발현 시험을 참작한다. 또한, 상기 유선 및 상기 동물의 건강을 모니터할 수 있다.
발현 농도를 측정하는 방법
웨스턴 블롯 분석법(Western Blot Analysis)
전술한 분석법을 이용하여, 웨스턴 블롯을 이용하여 발현 농도를 시험하기에 충분한 물질을 얻는다. 상기 웨스턴은 분비되는 야생형 단백질에 대한 신호를 포착하기에 충분히 민감해야 한다. 발현 농도가 예를 들어 10 mg/L 이라면, 분석물 중의 단백질의 농도는 10 ng/㎕ 일 것이다. 각 웰 상에 10 ㎕를 런닝(running)시킴으로써, 블롯 상에 100 ng 가 보여야 한다.
또한, 활성 분자에 특이적인 모노클로날을 이용하여 활성 단백질의 발현 농도를 측정할 수 있다. 그러한 항체들을 이용하여 분비 단백질의 상대적 폴딩 효율을 모니터할 수 있다. 상기 활성 단백질에 특이적인 모노클로날은 활성 단백질이불활성 단백질의 효소 처리 후 얻어지는지 여부를 측정하는데 도움이 될 것이다.
단백질의 생물학적 활성을 측정하는 방법
발현 단백질의 생물학적 활성은 다음의 방법으로 모니터할 수 있다. 상기 단백질들은 불활성이고, 그 후 활성으로 되기 때문에, 단밸질의 생물학적 활성 시험을 수행할 수 있다. 세포-계 분석법(cell-based assay) 또는 생체내 모델에서 상기 생물학적 활성을 측정할 수 있다.
한 부위를 개질시킴에 의한 불활성 단백질의 생산
단백질의 활성화를 위하여 필요한 부위, 예를 들어, 개열 부위를 개질시킴으로써 단백질을 불활성 형태로 트랜스제닉적으로 생산할 수 있다. 예를 들어, 일부 단백질은 활성형 단백질을 얻기 위하여 단백질의 프리-영역 및/또는 프로-영역의 개열을 요한다. 그러한 단백질들은, 분비 중의 개열에 의하여 활성화되는 TGF-β계 분자를 포함한다. 그러한 분자의 상기 개열 부위를 개질시킴으로써 분비 중에 개열이 발생하지 않도록 할 수 있다. 예를 들어, KKRK 개열 부위를 키모신 10 아미노산 인식 서열로 치환하여 TGF-β를 생산하였다. 단백질을 다듬지 않고 (unclipped) 분비시킨 후, 시험관 내에서 키모신 효소로 처리함으로써 활성화된 단백질을 수득하였다. 프로인슐린을 이용하여 유사한 일련을 실험을 수행하였다. 이미 폴딩 분자에 작용할 수 있고, 단백질의 활성을 따르는 능력을 갖는 효소적 개열을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, BMP-2의 활성화 부위를 개질시킴으로써, BMP-2의 분비중에 개열이 일어나지 않도록 하고, 그것이 프로 형태로 분비되도록 할 수 있다. 정상 개열 부위를 다른 인식 서열(예를 들어, 내인성 프로테아제에 의하여 개열되지 않는 인식 서열)의 아미노산으로 치환시킴으로써, 정제 후 프로 형태를 개열시킬 수 있다. BMP-2의 활성화 부위는 하기 서열을 갖는다: RKRLK. 이러한 서열을 개질시킴으로써, BMP-2의 분비 중에 개열되지 않지만, 특이적 조직 또는 생성물에서 통상 발현되지 않는 단백질 가수 분해 효소를 이용하여 분비 후에 개열될 수 있는 상이한 개열 부위를 제공할 수 있다.
불활성 단백질을 얻기 위하여 몇몇 외인성 가수분해 부위를 시도해 볼 수 있다. 이들은 산, 시아노겐 브로마이드, 인자 Ⅹ 또는 키모신에 의한 개열을 위한 부위를 포함한다. 단백질 서열을 분석함에 의하여, 잠재적 부위를 설계할 수 있다. 새로운 개열 부위를 갖는 BMP와 같은 다양한 버전의 단백질을 작제할 수 있고, 그들을 조직 배양 시스템을 통하여 실행시킬 수 있다. 또한, 상기 단백질을 시험하여, 그들이 불활성 프로 형태로 분비되는지 여부를 측정할 수 있다. 단백질 농도에 대하여 배양 상청액 및 세포 펠릿 양자 모두를 실험할 수 있다. 또한, 프로 형태를 시험하여, 그들이 생물학적 활성을 갖고 있지 않다는 것을 보일 있다.
불활성 단백질이 유선 내에서 발현된다면, 유즙은 낮은 농도의 혈청 단백질을 갖기 때문에, 추가의 개열 부위가 혈청 프로테아제에 의하여 개열되지 않는 것이 바람직하다.
상기 추가의 부위는 개열되어, 상기 단백질이 외래성 아미노산 잔기를 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 이하로 포함하거나, 전혀 포함하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 그 N-터미널 상에 외래 아미노산을 갖는 활성 BMP 단백질이 바람직하다면, 단지 그 BMP 서열이 개열 후에 존재하도록 한 부위를 설계하여야만 한다.
개열 단계의 성공 여부는 웨스턴 분석법으로 모니터할 수 있다. 활성 BMP 와 같은 활성화 단백질을 인식할 수 있는 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 일단 단백질이 개열되면, 생물학적 활성에 대한 분석을 수행할 수 있다. 불활성화가 일어나고 있지 않음을 담보하는 전체 시스템을 통하여 야생형 활성 단백질을 런닝시키는 것이 중요할 것이다. 또한, 미처리 단백질의 활성에 대한 시험을 수행할 수 있다. 또한, 단백질이 추후 활성화될 수 있는 불활성 프로 형태로 조직 배양물 내에 분비될 수 있다는 것이 밝혀진다면, 그 작제물은 마우스 유즙 시스템 내에서 시험할 수 있다. 또한, 단백질의 활성화는 그것이 마우스 및 염소 유즙과 혼합되는 경우 시험할 수 있다.
트랜스제닉 마우스를 이용하여 단백질을 프로 형태로 분비할 수 있는 능력을 시험할 수 있다. 예를 들어, 개질된 BMP-2 DNA를 염소 베타 카세인 발현 벡터 내로 라이게이트시킬 수 있다. DNA를 이용하여, 그 유즙에 단백질을 생산할 것인 트랜스제닉 마우스를 생산할 수 있다. 또한, 야생형 BMP-2를 발현시키는 대조군 마우스를 이용할 수 있다. 노던 분석에 대한 생체 검사 뿐만 아니라 대표적인 선으로부터도 유즙을 얻을 수 있다. 웨스턴 분석에 의하여 BMP-2 단백질의 발현에 대하여 상기 유즙 및 조직 샘플을 시험할 수 있다. 특히, 적당한 개열 효소를 이용하여 유즙 내의 활성 단백질의 생성을 시험할 수 있다. 조직 배양 발현 실험으로 활성화를 수행하고 모니터할 수 있다.
유선 내에 BMP-2를 활성 형태로 생성시키려는 초기의 시도들은 유선 발달을 저해하는 결과를 초래하였다. 그래서, 포유동물 조직에 대한 효과를 위하여 단백질의 신규 형태 뿐만 아니라, 야생형을 생성하는 수준 및 효과를 모니터할 수 있다.
단백질 및 결합 단백질의 공-발현에 의한 불활성 단백질의 생성
단백질과, 그 단백질에 결합되어 그 단백질을 불활성화시키는 결합 단백질을 공 발현시키는 방법으로, 단백질을 불활성 형태로 트랜스제닉적으로 생산할 수 있다. 예를 들어, 단백질 및 결합 단백질은 수용체 및 리간드, 또는 어느 하나의 단편일 수 있다. 상기 결합 단백질은 항체일 수도 있다.
한 실시 양태에 있어서, 단백질을 결합 단백질과의 융합 단백질로 발현시킬 수 있다. 예를 들어, BMP 단백질을 그 자신의 수용체와의 융합 단백질로 발현시킬 수 있다. 상기 수용체는 BMP에 결합하여 유선 또는 동물 내에서 그것이 수용체와 상호작용하는 것을 방지할 것이라고 추정된다. 개열 가능한 링커를 통하여 상기 수용체를 BMP에 결합시킬 수 있다. 일단 불활성 버전이 생성되면, 상기 링커를 개열시켜 수용체 및 BMP가 해리되게 함으로써 BMP 분자를 활성화시킬 수 있다. 한 실시 양태에 있어서, 상기 개열 가능한 링커는 트랜스제닉 동물에서 유래한 조직 또는 생성물에서 자연적으로 발생하는 내인성 프로세싱 효소에 의하여 인식되지 않지만, 불활성 폴리펩티드가 투여되는 피검체 내의 프로세싱 효소에 의하여서는 인식된다. 따라서, 상기 불활성 폴리펩티드를 피검체(예, 인간)에게 투여함으로써 그 피검체 내에 존재하는 프로세싱 효소가 표적 폴리펩티드로부터 결합 폴리펩티드를 개열시키게 하여 그 표적 폴리펩티드를 활성화시킬 수 있다.
예를 들어, COS 세포내의 발현에 대하여 결합 단백질/단백질 융합물을 시험할 수 있다. 단백질 또는 결합 단백질, 예를 들어, BMP 또는 그 수용체에 관한 모노클로날 항체를 이용하여 분석함으로써 발현을 시험할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질을 그 활성에 대하여 시험할 수 있다.
또한, 활성 BMP와 같은 활성 단백질을 얻기 위하여, 적당한 효소를 이용하여 융합 단백질을 개열시킬 수 있고, 웨스턴 블롯으로 그 개열을 모니터할 수 있다. 상기 융합 단백질은 프로테아제에 의하여 개열될 때까지 불활성일 것으로 예상된다.
또한, 단백질 및 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질의 유즙 내에서의 발현에 대해서도 시험할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 작제물을 베타 카세인 발현 벡터 내로 라이게이트시킬 수 있다. 그 다음, 상기 벡터를 이용하여 트랜스제닉 마우스를 생산할 수 있다. 상기 단백질을 발현시키는 능력에 대하여 상기 마우스를 시험할 수 있다. 또한, 일반의 동물 및 유선에 대한 상기 단백질의 영향에 대하여 상기 동물들을 시험할 수 있다.
또한, 단백질에 결합하여 그것을 불활성화시킬 수 있는 항체와 함께 그 단백질을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, BMP 및 BMP에 대한 항체를 이용하여 불활성 BMP를 생산할 수 있다. BMP와 같은 단백질과 함께 당해 항체를 COS 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 그 다음, BMP 활성에 대한 항체의 효과를 모니터할 수 있다.
예를 들어, 단백질/항체 복합체의 항체 부분에 선택적으로 결합되는 단백질A를 이용하여 항체를 사용한 발현 후에 활성 BMP와 같은 활성 단백질을 얻을 수 있다.
결합 단백질은 그 결합 단백질에 대하여 외인성이 1종 이상의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, BMP 수용체는 결합 단백질 및/또는 결합 단백질/단백질 복합체의 정제에 유용한 외인성 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 아미노산 서열을 사용하여, 미리 선택된 리간드, 예를 들어, 6X HIS 리간드, 셀룰로스 결합 도메인 리간드, 또는 말토스 결합 도메인 리간드에 결합시킬 수 있다.
단백질에 대한 결합 및 저해에 관한 그 능력에 대하여 다양한 결합 단백질을 시험할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌들은 그 전체를 본 명세서에 참고인용하는 것이다. 기타 실시 태양은 하기 청구범위 내에 있다.
Claims (18)
- 결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드의 정제를 위한 트랜스제닉 시스템으로서,포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에서, 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부분 및 매트릭스에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 다가 결합 폴리펩티드를 암호하여 그러한 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드가 트랜스제닉 동물의 유즙 내에서 고농도로 발현되도록 하는 핵산을 그 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 동물; 및상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 특이적으로 결합하는 매트릭스를 포함하는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프는 제거 가능한 것인 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 다가 결합 폴리펩티드의 결합 부분은 상기 결합성 에피토프를 제거하는 것인 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 시스템이상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프를 제거할 수 있는 제1 촉매 도메인및 매트릭스에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 제2 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드; 및상기 제2 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 특이적으로 결합하며, 상기 제1 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 특이적으로 결합하는 상기 매트릭스와는 상이한 매트릭스인 제2 매트릭스를 추가로 포함하는 시스템.
- 생성물로부터 결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드를 수득하는 방법으로서,결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드를 포함하는 생성물을, 상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부분 및 매트릭스에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드와 접촉시킴으로써 반응 혼합물을 제공하는 단계;상기 반응 혼합물을, 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 특이적으로 결합하는 매트릭스와 접촉시키는 단계; 및상기 매트릭스에 결합하지 않은 반응 혼합물을 제거함으로써 표적 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드를 상기 매트릭스로부터 용출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 생성물이 유즙인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드가 항체인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제1 결합 부분이 단백질 L 또는 그 단편인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 셀룰로스 결합 도메인(CBD) 또는 그 단편인 방법.
- 결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드를 수득하기 위한 다수 동물 트랜스제닉 시스템으로서,포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에서, 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부분 및 매트릭스에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 다가 결합 폴리펩티드를 암호하여 그러한 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드가 트랜스제닉 동물의 유즙 내에서 고농도로 발현되도록 하는 핵산을 그 게놈 내에 포함하는 제1 트랜스제닉 동물;포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에서 표적 폴리펩티드를 암호하는 핵산을 그 게놈 내에 포함하는 제2 트랜스제닉 동물; 및상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분이 특이적으로 결합하는 매트릭스를 포함하는 시스템.
- 유즙으로부터 결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드를 수득하는 방법으로서,결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드를 포함하는 유즙을, 상기 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부분 및 매트릭스에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드와 접촉시킴으로써 반응 혼합물을 제공하는 단계;상기 반응 혼합물을, 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 특이적으로 결합하는 매트릭스와 접촉시키는 단계; 및상기 매트릭스에 결합하지 않은 반응 혼합물을 제거함으로써 표적 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드를 상기 매트릭스로부터 용출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드가 트랜스제닉적으로 생성되는 폴리펩티드인 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 트랜스제닉 다가 결합 폴리펩티드가 다른 트랜스제닉 동물에서 유래한 유즙 내에 존재하는 것인 방법.
- 포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에서 결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드를 암호하는 핵산, 및 포유동물 상피 세포에서의 발현을 지시하는 프로모터의 제어 하에서, 표적 폴리펩티드의 결합성 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 부분 및 매트릭스에 특이적으로 결합하는 제2 결합 부분을 포함하는 다가 결합 폴리펩티드를 암호하는 핵산을 그 게놈 내에 포함하는 트랜스제닉 동물.
- 결합성 에피토프를 갖는 표적 폴리펩티드를 수득하는 방법으로서,제16항의 트랜스제닉 동물에서 유래한 유즙을 제공하는 단계;상기 유즙을 상기 다가 결합 폴리펩티드의 제2 결합 부분에 특이적으로 결합하는 매트릭스와 접촉시키는 단계; 및상기 매트릭스에 결합되지 않은 유즙 부분을 제거함으로써 표적 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 표적 폴리펩티드를 상기 매트릭스로부터 용출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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