MXPA02003702A

MXPA02003702A - Metodos de producir una molecula objetivo en un animal transgenico y purificacion de la molecula.

Info

Publication number: MXPA02003702A
Application number: MXPA02003702A
Authority: MX
Inventors: Yann Echelard
Original assignee: Genzyme Transgenics Corp
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-10-16
Publication date: 2002-09-18
Also published as: HUP0203537A2; EP1220606A1; AU781944B2; AU8025400A; CN1387399A; NO20021686L; WO2001026455A1; CN1322003C; KR100772465B1; CA2382741A1; NO20021686D0; KR20030022759A; BR0014860A; NZ518263A; EP1220606A4; JP2003511048A; IL149003A0; RU2002112460A

Abstract

La invencion provee sistemas y metodos para la produccion y purificacion de moleculas objetivo presentes en sistemas biologicos. Los sistemas y metodos de acuerdo con la invencion utilizan expresion transgenica de polipeptidos de ligadura multi-valentes, como medio de afinidad, para purificar tales moleculas objetivo. Los polipeptidos de ligadura multi-valentes, transgenicos, se ligan tanto a las moleculas objetivo, v.gr., un epitope capaz de ligadura de una molecula objetivo, como una matriz.

Description

MÉTODOS DE PRODUCIR UNA MOLÉCULA OBJETIVO EN UN ANIMAL TRANSGÉNICO Y PURIFICACIÓN DE LA MOLÉCULA OBJETIVO Antecedentes de la Invención La producción y la purificación de polipéptidos para fines terapéuticos y de diagnóstico se han convertido en una importante industria en años recientes. Los intentos tempranos de expresión de polipéptidos recombinantes utilizaron vectores de expresión en bacterias. Por ejemplo, la patente US 4,816,397 divulga la expresión recombinante de inmunoglobulinas en bacterias. Estos enfoques estaban limitados por la necesidad de partir por abertura o lisar las bacterias para obtener el polipéptido recombinante, que estaba presente como parte de una sopa compleja de proteínas bacterianas y otros sustituyentes bacterianos. Limitaciones adicionales fueron resultado de estados de oxidación no nativos para el polipéptido recombinante en la bacteria, lo que puede dar como resultado un doblado inapropiado del polipéptido. Algunos de estos problemas fueron atenuados por la expresión recombinante de polipéptidos en sistemas de fermentación de cultivo celular de mamífero. La patente US 5,639,640 divulga la expresión recombinante de la hormona estimulante de folículos (FSH) humana en cultivo celular de mamífexo. Desafor-tunadamente, tales sistemas de fermentación de cultivo celular de mamífero son extremadamente costosos de operar, y los polipéptidos producidos con ellos son parte de una mezcla compleja de proteínas presentes en el medio de cultivo. Los esfuerzos por superar los problemas presentes en estos sistemas dieron como resultado la expresión transgénica de polipéptidos recombinantes en diversos sistemas animales transgénicos. Este esfuerzo ha permitido expresión transgénica de polipéptidos de alto nivel, con ello eliminando la necesidad de costosos sistemas de fermentación de cultivo celular de mamífero para la producción de polipéptidos recombinantes. Sin embargo, para ser una alternativa práctica a los sistemas de cultivo celular de mamífero, es importante conservar la salud de los animales. Mas aún, los polipéptidos producidos con ello permanecen como un sustituyente de una mezcla compleja de proteínas de leche y se necesitan métodos para purificar los polipéptidos a partir de tal mezcla. Compendio de la Invención La presente invención se refiere a métodos para producir moléculas objetivo en animales transgénicos y métodos de purificar tales moléculas objetivo. La molécula objetivo es de preferencia un polipéptido objetivo. La invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que un polipéptido objetivo puede ser expresado y secretado en una forma inactiva a la leche de un animal transgénico y luego activado. Esto puede permitir evitar las complicaciones que pueden surgir produciendo la proteína en forma activa en el animal. Por ejemplo, se ha encontrado que la producción de ciertas proteínas, incluyendo enzimas, factores de crecimiento, hormonas y citocinas, en la leche de un animal transgénico, puede ocasionar problemas de salud en el animal. Los métodos de la invención pueden minimizar tales problemas. La invención también se refiere a sistemas y métodos para la purificación de estas y otras moléculas objetivo presentes en sistemas biológicos tales como leche. Estos sistemas y métodos pueden utilizar, por ejemplo, expresión transgénica de polipéptidos de ligadura multi -valente, tales como ligandos por afinidad, a la leche, para purificar tales moléculas objetivo. De preferencia, los polipéptidos transgénicos de ligadura multi-valente pueden ligarse tanto a una molécula objetivo como a un ligando pre-seleccionado, v.gr., un ligando pre-seleccionado de una matriz separable en fases. En consecuencia, en un aspecto, la invención se refiere a un método de producir un polipéptido objetivo en un animal transgénico. El método incluye: producir el polipéptido en un estado inactivo; obtener el polipéptido inactivo; y activar el polipéptido, para con ello proveer el polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el polipéptido es producido en un estado inactivo en un tejido o producto, v.gr., un fluido del animal transgénico, tal como leche. En una forma de realización preferida, un tejido o producto, v.gr., leche, conteniendo la proteína inactiva, es obtenido del animal transgénico . En una forma de realización, el polipéptido objetivo es inactivado por co-expresión del polipéptido objetivo con un polipéptido de ligadura que se liga a e inactiva el polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura y el polipéptido objetivo existen como un complejo en el tejido o producto, v.gr., fluido, v.gr., leche. En una forma de realización preferida, el polipéptido objetivo y el polipéptido de ligadura son un ligando y contra-ligando, v.gr., el polipéptido de ligadura es un receptor o ligando, o un fragmento de cualquiera de ellos. En otra forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura es un anticuerpo o fragmento del mismo. En una forma de realización preferida, el ácido nucleico que codifica el polipéptido objetivo está bajo el control de un promotor específico de tejidos, v.gr., un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias. En una forma de realización preferida, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de ligadura está bajo el control de un promotor específico de tejidos, v.gr., un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias. De preferencia, tanto el ácido nucleico que codifica el polipéptido objetivo como el ácido nucleico que codifica el polipéptido de ligadura están bajo el control del mismo tipo de promotor, v.gr., el mismo tipo de -?-promotor específico de tejidos. Por ejemplo, ambos pueden estar bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, v.gr., ambos pueden estar bajo el control del mismo o un diferente promotor específico de leche. El promotor específico de leche puede ser, v.gr., un promotor de caseína, de lactoglobulina, de lactoalbúmina o de proteína de ácido de suero de leche (WAP) . En una forma de realización preferida, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de ligadura también codifica una secuencia que codifica al menos un aminoácido exógeno al polipéptido de ligadura. Por ejemplo, el ácido nucleico puede incluir además un aminoácido útil en_ la purificación del polipéptido de ligadura. En una forma de realización preferida, al menos un aminoácido exógeno al polipéptido de ligadura puede ser añadido, v.gr., un aminoácido o aminoácidos añadidos que pueden ligarse a un ligando pre-seleccionado, v.gr., un ligando usado para purificación del polipéptido de ligadura, v.gr., un ligando 6X HIS, un ligando del dominio de ligadura de celulosa (CBD) , un ligando de proteína de ligadura de maltosa (MBP) . Este aminoácido (o aminoácidos) que puede ligarse a un ligando preseleccionado es también referido en la presente como una fracción de ligadura, v.gr., una fracción de ligadura capaz de ligarse a un ligando o matriz pre-seleccionado. En una forma de realización preferida, el método incluye además separar el polipéptido inactivo del tejido o producto, v.gr., un fluido, v.gr., leche, antes de activación. En una forma de realización preferida, el polipéptido inactivo es separado de un fluido, v.gr., leche, por ligadura de la fracción de ligadura del complejo de polipéptido de ligadura/polipéptido objetivo a un ligando pre-seleccionado, v.gr., un ligando 6X HIS (v.gr., una columna de quelación de metal), ligando CBD (v.gr., celulosa), o un ligando MBP (v.gr., maltosa) . En todavía otra forma de realización, el polipéptido objetivo es inactivado por modificación de un sitio necesario 10 para activar el polipéptido, v.gr., modificación de un sitio de corte. El sitio de corte puede ser, por ejemplo, un sitio de corte que permite la remoción de una po ción del polipéptido, • v.gr., un sitio que permite la remoción de una región pre y/o pro del polipéptido. En una forma de realización preferida, el sitio 15 de corte es modificado tal que ya no sea reconocido por una enzima de procesamiento, v.gr. , una enzima de procesamiento endógena que ocurre naturalmente en el tejido o producto. En formas de realización preferidas, el polipéptido objetivo inactivado por modificación de un sitio, v.gr., un sitio • de corte, puede además incluir un sitio adicional que permite activación, v.gr., que permite corte tal como corte de una región pre o pro de un polipéptido. En una forma de realización preferida, un sitio endógeno para corte protelítico puede ser inactivado y suministrarse un nuevo sitio. El nuevo sitio puede 25 ser suministrado modificando el sitio de corte endógeno y/o añadiendo un aminoácido o aminoácidos adicionales . De preferencia, el nuevo sitio no es cortado por ninguna enzima de procesamiento endógena que ocurre naturalmente en el tejido o producto. Por ejemplo, un sitio cortado por una proteasa presente en la leche del animal transgénico puede ser modificado, y un sitio que puede ser cortado por contacto con un producto químico o enzima exógeno puede añadirse al polipéptido. En una forma de realización preferida, el producto químico exógeno es: un ácido, v.gr., bromuro cianógeno. En otra forma de realización preferida, la 10 enzima exógena es una proteasa exógena, v.gr., químosina. En una forma de realización preferida, el sitio adicional es cortado tal que el polipéptido objetivo no incluya • ninguna secuencia extraña. En otra forma de realización preferida, el sitio es cortado tal que el polipéptido objetivo 15 incluya menos de 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos extraños . En una forma de realización preferida, el polipéptido objetivo es un polipéptido humano. En una forma de realización preferida, el polipéptido es: una hormona, un factor de creci¬ • miento, una citocina. En una forma de realización preferida, el polipéptido es: proteína de matriz de hueso (BMP), v.gr., BMP-2; eritropoyetina; insulina; factor de crecimiento humano; factor de crecimiento de transformación ß. En una forma de realización preferida, el animal 5 transgénico es un mamífero, v.gr., una cabra, vaca, oveja, un conejo, cerdo, caballo, camello, una llama, un ratón, o una rata. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la producción transgénica de un polipéptido objetivo. El método incluye: proveer un animal transgénico que tiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido objetivo bajo el control de un promotor específico de tejidos, v.gr., un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, y un ácido nucleico que codifica un polipéptido que se liga al polipéptido objetivo y que está bajo el control de un promotor específico de tejidos, v.gr., un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias; permitir al polipéptido objetivo y al polipéptido de ligadura ser expresados en un tejido o producto del animal transgénico, v.gr. , la leche del animal transgénico; separar el polipéptido objetivo del polipéptido de ligadura, para con ello proveer el polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de ligadura también codifica una secuencia que codifica al menos un aminoácido exógeno al polipéptido de ligadura. Por ejemplo, el ácido nucleico puede además incluir un aminoácido útil en la purificación del polipéptido de ligadura. En una forma de realización preferida, al menos un aminoácido exógeno al polipéptido de ligadura puede ser añadido, v.gr., un aminoácido o aminoácidos añadidos que pueden ligarse a un ligando pre-seleccionado, v.gr., un ligando usado para purificación del polipéptido de ligadura, v.gr., un ligando 6X HIS, un ligando de dominio de ligadura de celulosa (CBD) , un ligando de proteína de ligadura de maltosa (MBP) . Este aminoácido (o aminoácidos) que puede ligarse a un ligando preseleccionado también es referido en la presente como una fracción de ligadura, v.gr., una fracción de ligadura capaz de ligarse a un ligando o matriz pre-seleccionado. En una forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura y el polipéptido objetivo existen como un complejo en el tejido, por ejemplo la leche del animal transgénico. En una forma de realización preferida, el método incluye además separar el polipéptido objetivo inactivo del tejido o producto, v.gr., un fluido, v.gr., leche, antes de activación. En una forma de realización preferida, ~el polipéptido inactivo es separado de un fluido, v.gr., leche, ligando la fracción de ligadura del complejo de polipéptido de ligadura/ polipéptido objetivo a un ligando pre-seleccionado, v.gr., un ligando 6X HIS (v.gr., una columna de quelación de metal), ligando CBD (v.gr., celulosa), o un ligando MBP (v.gr., maltosa) . En una forma de realización preferida, el promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias es: un promotor de caseína, v.gr., un promotor de beta-caseína; un promotor de lactoglobulina, v.gr., un promotor de beta-lactoglo-bina; un promotor de proteína ácido de suero de leche; un promotor de lactoalbúmina. En una forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura y el polipéptido objetivo están bajo el control del mismo tipo de promotor específico de tejidos, v.gr., ambos están bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, v.gr., ambos están bajo el control de los mismos o diferentes promotores específicos de la leche. En una forma de realización preferida, el animal transgénico es un mamífero no humano. En una forma de realización preferida, el mamífero es: una cabra; una vaca; una oveja; un conejo; un cerdo; un caballo; una llama; un camello; un ratón; una rata . En otro aspecto, la invención se refiere a un sistema transgénico para obtener, v.gr., purificar, un polipéptido objetivo. El sistema incluye un animal, v.gr., un mamífero, que expresa un polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. El polipéptido de ligadura multi-valente incluye una primera fracción de ligadura que se liga al polipéptido objetivo y una segunda fracción de ligadura que se liga a un ligando preseleccionado, v.gr., un ligando pre-seleccionado de una matriz. En una forma de realización preferida, el mamífero transgénico expresa un polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico en una manera específica a tejido, v.gr., el mamífero transgénico expresa el polipéptido de ligadura multi-valente en un tejido o producto, v.gr., un fluido (v.gr., leche, orina o sangre) . En una forma de realización preferida, el mamífero expresa el polipéptido multi-valente, transgénico en leche y el ácido nucleico que codifica el polipéptido de ligadura multivalente está bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, v.gr., un promotor de caseína, un promotor de lactoglobulina, un promotor de lactoalbú-mina o un promotor de la protelna acida de suero de leche (WAP) . En una forma de realización -preferida, el mamífero transgénico es una cabra, vaca, oveja, un conejo, cerdo, caballo, camello, una llama, un ratón o una rata. En una forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura multi-valente es expresado a altos niveles en el producto, v.gr., el fluido, v.gr., al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. En una forma de realización preferida, el sistema incluye además una matriz a la cual puede ligarse la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente. En una forma de realización preferida, el polipéptido objetivo incluye un epítope susceptible de ligadura, v.gr., un epítope que es ligado por la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente. En una forma de realización preferida, el epítope susceptible de ligadura es removible, v.gr., el epítope susceptible de ligadura puede ser removido, v.gr., cortado, del resto del polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el epítope susceptible de ligadura puede ser removido por una fracción catalítica. De preferencia, la fracción catalítica es parte de un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, v.gr., un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, producido transgénicamente . En una forma de realización preferida, el segundo polipéptido de ligadura multivalente, v.gr., el segundo polipéptido de ligadura multi-valente, producido transgénicamente, incluye un primer dominio catalítico y una segunda fracción de ligadura, que se liga específicamente a un ligando pre-seleccionado, v.gr., un ligando pre-seleccionado de una matriz, v.gr., una matriz que es diferente que la matriz ligada específicamente por la segunda fracción de ligadura del primer polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. En una forma de realización preferida, tanto el polipéptido objetivo como el polipéptido de ligadura multivalente son expresados de manera transgénica en la leche. El polipéptido objetivo y el polipéptido multi-valente pueden ser expresados por animales separados o por el mismo animal. En otra forma de realización preferida, el polipéptido objetivo y los polipéptidos multi-valentes primero y segundo son expresados de manera transgénica en la leche. Todos estos polipéptidos pueden ser expresados por animales diferentes, o dos o mas pueden ser producidos por el mismo animal. Aunque el siguiente sistema se refiere a poner en contacto un polipéptido de ligadura multi-valente con la matriz y luego con el objetivo, siendo igualmente apropiado, para todas las formas de realización, el orden opuesto. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para obtener, v.gr., purificar, un polipéptido objetivo a partir de un sistema biológico. De preferencia, el polipéptido objetivo incluye un epítope susceptible de ligadura. El método incluye: poner en contacto una composición que incluye un polípéptido objetivo de un sistema biológico con un polipéptido de ligadura multi-valente, expresado de manera transgénica, para formar una mezcla de reacción, para con ello obtener el polipéptido objetivo del sistema biológico. De preferencia, el polipéptido de ligadura multi-valente incluye una primera fracción de ligadura que se liga a la molécula objetivo, v.gr., se liga a un epítope de la molécula objetivo, y una segunda fracción de ligadura que se liga a una matriz. En una forma de realización preferida, el método incluye además : mantener la mezcla de la composición y el polipéptido de ligadura multi-valente, tal que la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente puede ligarse al polipéptido objetivo, v.gr., el epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el método incluye además: poner en contacto la mezcla con una matriz a la cual pueda ligarse la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multivalente, y permitir a la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente ligarse con la matriz. En una forma de realización preferida, el método incluye además: remover cualesquiera componentes no ligados de la mezcla, y obtener, v.gr., levigando, el polipéptido objetivo de la mezcla para con ello obtener el polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el polipéptido objetivo incluye un epítope susceptible de ligadura, v.gr., un epítope que es ligado por la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-va ente . En una forma de realización preferida, el epítope susceptible de ligadura es removible, v.gr., el epítope susceptible de ligadura puede ser removido, v.gr., cortado, del resto del polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el epítope susceptible de ligadura puede ser removido por una fracción catalítica. De preferencia, la fracción catalítica es parte de un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, v.gr., un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, producido transgénicamente. En una forma de realización preferida, el segundo polipéptido de ligadura multivalente, v.gr. , el segundo polipéptido de ligadura multi-valente, producido transgénicamente, incluye un primer dominio catalítico y una segunda fracción de ligadura que se liga específicamente a una matriz, v.gr., una matriz que es diferente que la matriz ligada específicamente por la segunda fracción de ligadura del primer polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. En una forma de realización preferida, la composición de un sistema biológico puede ser un producto obtenido de un animal transgénico, v.gr., un mamífero transgénico. Por ejemplo, el producto puede ser un fluido, v.gr., leche, orina o sangre. En una forma de realización preferida, la composición del sistema biológico es puesta en contacto con una muestra, v.gr., un fluido, v.gr., leche, orina o sangre, que contiene el polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. De preferencia, la leche contiene altos niveles de la proteína de ligadura multi-valente, transgénica, v.gr., al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. En una forma de realización preferida, tanto el polipéptido objetivo como el polipéptido de ligadura multivalente son expresados de manera transgénica en la leche. El polipéptido objetivo y el polipéptido multi-valente pueden ser expresados por animales separados o por el mismo animal . En otra forma de realización preferida, el polipéptido objetivo y los polipéptidos multi -valentes primero y segundo son expresados de manera transgénica en la leche. Todos estos polipéptidos pueden ser expresados por animales diferentes o pueden producirse dos o mas por el mismo animal. Aunque el siguiente método se refiere a poner en contacto un polipéptido de ligadura multi-valente con la matriz y luego el objetivo, es igualmente apropiado el orden opuesto para todas las formas de realización. En otro aspecto, la invención se refiere a un sistema transgénico animal múltiple, que puede ser usado para expresar y/u obtener, v.gr., purificar, un polipéptido objetivo, v.gr., un polipéptido objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura .

El sistema incluye un primer animal transgénico, v.gr., mamífero transgénico, qué expresa un polipeptido de ligadura multi-valente, transgénico, que incluye una primera fracción de ligadura que se liga al polipéptido objetivo, v.gr., se liga al epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo, y una segunda fracción de ligadura que se liga a una matriz. De preferencia, el primer animal transgénico expresa el polipéptido de ligadura multi-valente en un producto, v.gr., un fluido, v.gr., leche, sangre u orina. En una forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura multi-valente está presentes en altos niveles en la leche del primer animal transgénico, v.gr., en niveles de al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. En una forma de realización preferida, el primer animal transgénico es un mamífero transgénico. De preferencia, el mamífero transgénico expresa un polipéptido de ligadura multivalente, transgénico, en una manera específica a tejido, v.gr., el mamífero transgénico expresa el polipéptido de ligadura multivalente en un fluido, v.gr., leche, orina o sangre. En una forma de realización preferida, el mamífero expresa el polipéptido multi-valente, transgénico en leche y la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de ligadura multi-valente está bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, v.gr., un promotor de caseína, de lactoglobulina, de lactoalbúmina o de proteína acida de suero de leche (WAP) .

El sistema incluye además un segundo animal transgénico, v.gr., un mamífero transgénico, que expresa un polipéptido objetivo, v.gr., un polipéptido objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura. De preferencia, el segundo animal transgénico expresa el polipéptido objetivo en - una muestra, v.gr., un fluido, v.gr., leche, sangre, orina. En una forma de realización preferida, el polipéptido objetivo está presente en altos niveles en la leche del segundo animal, v.gr., en niveles de al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. En una forma de realización preferida, el segundo animal transgénico es un mamífero transgénico. De preferencia, el segundo mamífero transgénico expresa un polipéptido objetivo en una manera específica a tejido, v.gr., el mamífero transgénico expresa el polipéptido objetivo en un fluido, v.gr., leche, orina o sangre. En una forma de realización preferida, el mamífero expresa el polipéptido objetivo en leche y la secuencia de ADN que codifica el polipéptido objetivo está bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, v.gr., un promotor de caseína, lactoglobulina, lactoalbúmina o de proteína acida de suero (WAP) . En una forma de realización preferida, el sistema incluye además una matriz a la cual puede ligarse la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente. En una forma de realización preferida, el epítope susceptible de ligadura es removible, v.gr., el epítope suscepti-ble de ligadura puede removerse, v.gr., cortarse, del resto del polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el epítope susceptible de ligadura puede ser removido por una fracción catalítica. De preferencia, la fracción catalítica es parte de un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, v.gr., un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, producido de manera transgénica. En una forma de realización preferida, el segundo polipéptido de ligadura multi-valente, v.gr., el segundo polipéptido de ligadura multi-valente, producido de manera transgénica, incluye un primer dominio catalítico y una segunda fracción de ligadura que se liga específicamente a una matriz, v.gr., una matriz que es diferente de la matriz específicamente ligada por la segunda fracción de ligadura del primer polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. El segundo polipéptido de ligadura multi-valente puede ser producido por ya sea: el mismo animal transgénico que expresa el primer polipéptido de ligadura multi-valente; el animal transgénico que produce el polipéptido objetivo; o un animal transgénico distinto del animal que produce el primer polipéptido de ligadura multi-valente o el polipéptido objetivo. Aunque el siguiente sistema se refiere a poner en contacto un polipéptido de ligadura multi-valente con la matriz y luego al objetivo, es igualmente apropiado el orden opuesto para todas las formas de realización. En otro aspecto, la invención provee un método para expresar y/u obtener un polipéptido objetivo, v.gr. , un polipéptido objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura, de un producto, v.gr., un fluido, v.gr., lecho, sangre, orina. El método incluye: obtener un producto, v.gr., un fluido, v.gr., leche, que incluye un polipéptido objetivo a partir de un animal transgénico; y poner en contacto el producto, v.gr., un fluido, v.gr., leche, que incluye el polipéptido objetivo, con un péptido de ligadura multi-valente, transgénico, para formar una mezcla de reacción. De preferencia, el polipéptido de ligadura multivalente incluye una primera fracción de ligadura que puede ligar el polipéptido objetivo y una segunda fracción de ligadura que puede ligar un ligando pre-seleccionado, v.gr., un matriz. En una forma de realización preferida, el método incluye además mantener la mezcla del polipéptido objetivo y el polípéptido multi-valente tal que la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente se ligue al polipéptido objetivo, v.gr., un epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el método incluye además: poner en contacto la mezcla con una matriz a la cual se liga la segunda fracción de ligadura, y permitir que la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multivalente se ligue a la matriz. El método puede incluir además remover cualesquiera componentes sin ligar de la mezcla, y remover de manera selectiva, v.gr., levigar, el polipéptido objetivo de la mezcla.

En una forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura multi-valente es expresado en la leche de un animal transgénico. En una forma de realización preferida, el polipéptido multi-valente es expresado en la leche del mismo animal transgénico que expresa el polipéptido objetivo o se expresa en la leche de un animal transgénico diferente. En una forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, está presente en altos niveles en la leche del animal, v.gr., en niveles de al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. Aunque el siguiente método se refiere a poner en contacto un polipéptido de ligadura multi-valente con la matriz y luego con el objetivo, es igualmente apropiado el orden opuesto para todas las formas de realización. En otro aspecto, la invención se refiere a un sistema animal transgénico usado para expresar y/u obtener, v.gr., purificar, un polipéptido objetivo, v.gr., un polipéptido objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura. El sistema incluye un animal transgénico que expresa en su tejido mamario una primera fracción de ligadura que se liga específicamente al polipéptido objetivo, v.gr., se liga a un epítope susceptible de ligadura de un polipéptido objetivo, y una segunda fracción de ligadura que se liga a una matriz. En adición, el animal transgénico expresa en su tejido mamario un polipéptido objetivo, v.gr., un polipéptido objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura.

En una forma de realización preferida, el mamífero expresa el polipéptido multi-valente transgénico en leche y la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de ligadura multivalente está bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, v.gr., un promotor de caseína, lactoglobulina, lactoalbúmina, o de proteína acida de suero de leche (WAP) . En una forma de realización preferida, el mamífero expresa el polipéptido objetivo en leche y la secuencia de ADN que codifica el polipéptido objetivo está bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, v.gr., un promotor de caseína, lactoglobulina, lactoalbúmina, o proteína acida de suero de leche (WAP) . En una forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura multi-valente está presente en altos niveles en la leche del animal transgénico, v.gr., en niveles de al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. En otra forma de realización preferida, el polipéptido objetivo está presente en altos niveles en la leche del mismo animal transgénico, v.gr., en niveles de al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. De preferencia, tanto el polipéptido de ligadura multi-valente como la molécula objetivo están presentes en altos niveles, v.gr., cada uno está presente en niveles de al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. En una forma de realización preferida, el sistema incluye además una matriz a la cual se liga específicamente la segunda fracción de ligadura.

En una forma de realización preferida, el epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo es removible, v.gr., el epítope susceptible de ligadura puede ser removido, v.gr., cortado, del resto del polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el epítope susceptible de ligadura puede ser removido por una fracción catalítica. De preferencia, la fracción catalítica es parte de un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, v.gr., un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, producido de manera transgénica. En una forma de realización preferida, el segundo polipéptido de ligadura multivalente, v.gr., el segundo polipéptido de ligadura multi-valente, producido de manera transgénica, incluye un primer dominio catalítico y una segunda fracción de ligadura que se liga de manera específica a una matriz, v.gr., una matriz que es diferente que la matriz ligada específicamente por la segunda fracción de ligadura del primer polipéptido de ligadura multivalente, transgénico. El segundo polipéptido de ligadura multivalente puede ser: expresado por el mismo animal transgénico que expresó el primer polipéptido de ligadura multi-valente y/o polipéptido objetivo; expresado por un animal transgénico diferente del animal transgénico que expresó el primer polipéptido de ligadura multi-valente y/o el polipéptido objetivo. Aunque el siguiente sistema se refiere a poner en contacto un polipéptido de ligadura multi-valente con la matriz y luego con el objetivo, es igualmente aplicable el orden opuesto para todas las formas de realización. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para expresar y/u obtener, v.gr., purificar, un polipéptido objetivo, v.gr., un polipéptido objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura. El método incluye: obtener leche de un animal transgénico, que incluye una mezcla de un polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, y un polipéptido objetivo, v.gr., un polipéptido objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura. De preferencia, el polipéptido de ligadura multivalente incluye una primera fracción de ligadura que puede ligarse al polipéptido objetivo, v.gr., un epítope susceptible de ligadura en el polipéptido objetivo, v.gr., un epítope susceptible de ligadura en el polipéptido objetivo, y una segunda fracción de ligadura que puede ligarse a una matriz. El método puede adicionalmente incluir: permitir a la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente ligarse al polipéptido objetivo, v.gr., un epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo. En una forma de realización preferida, el método puede incluir además : poner en contacto tal mezcla con una matriz a la cual se liga de manera 'específica la segunda fracción de ligadura, y permitir que la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente se ligue a la matriz. En una forma de realización preferida, el método puede incluir además: remover cualesquiera componentes no ligados de la mezcla, y remover selectivamente, v.gr., levigando, el polipépti- do objetivo de la mezcla. En una forma de realización preferida, el polipéptido de ligadura multi-valente está presente en altos niveles en la leche del animal transgénico, v.gr., en niveles de al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. En otra forma de realización preferida, el polipéptido objetivo está presente en altos niveles en la leche del mismo animal transgénico, v.gr., en niveles de al menos 0.1, • 1, 5, 10 mg/ml. De preferencia, tanto el polipéptido de ligadura multi-valente como la molécula objetivo están presentes en altos 10 niveles, v.gr., cada uno está presente en niveles de al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. Aunque el siguiente método se refiere a poner en • contacto el polipéptido de ligadura multi-valente con la matriz y luego con el objetivo, es igualmente apropiado el orden opuesto 15 para todas las formas de realización. Estos sistemas y métodos aportan muchas ventajas sobre los sistemas previamente existentes. En particular, los sistemas y métodos de acuerdo con la invención reducen en gran medida el tiempo y el costo de purificar tales moléculas biológicas, debido • a que evitan la necesidad de purificar por separado los ligandos de afinidad y acoplarlos a una matriz de afinidad funcionalizada. Para fines de la invención, los siguientes términos tienen los significados señalados en esta sección, a menos que se manifiesta de manera explícita lo contrario. En "epítope" u 5 "epítope susceptible de ligadura" es una forma molecular tridimensional que es ligada de manera específica por una fracción de ligadura. Una "fracción de ligadura" es una porción de polipéptido de un polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, que se liga específicamente a un epítope. Un "polipéptido", una "proteína", y un "péptido" son términos usados en la presente de manera intercambiable. El polipéptido puede ser glicosilado o no glicosilado. Tales • polipéptidos pueden incluir alrededor de tres, cuatro, cinco, seis o mas aminoácidos, y pueden incluir además estructuras 0 secundarias, terciarias o cuaternarias, así como asociaciones intermoleculares con otros péptidos u otras moléculas no de péptido. Tales asociaciones inter-moleculares pueden ser • mediante, sin limitación, enlace covalente (v.gr., a través de eslabones bisulfuro) , o mediante quelación, interacciones 5 electrostáticas, interacciones hidrófobas, enlace con hidrógeno, interacciones ión-dipolo, interacciones dipolo-dipolo, o cualquier combinación de los anteriores. Una "porción de polipéptido" comprende de alrededor de tres a alrededor de 100 aminoácidos contiguos y/o no contiguos, y pueden ser glicosilados o no glicosilados. Un "epítope que contiene péptido" es un epítope compuesto al menos en parte por un determinante inmunológico de un residuo de aminoácido de un péptido. Un "epítope que contiene carbohidrato" es un epítope que comprende al menos en parte un 5 determinando inmunológico de una porción de carbohidrato de una molécula. Un "epítope que contiene lípido" es un epítope que comprende al menos en parte un determinante inmunológico de una porción de lípido de una molécula. Un "determinante inmunológico" es una forma tridimensional que contribuye a la forma tridimensional global de un epítope. Un "determinante inmunológico de un residuo de aminoácido" es un determinante inmunológico en cual su forma tridimensional es contribuida en todo o en parte por una cadena lateral y/o carbono alfa y/o cualquiera cr ambos enlaces péptidos y/o el término amino y/o carboxi de un residuo de aminoácido. Un "polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico" es un polipéptido producido transgénicamente que incluye una primera fracción de ligadura que se liga a un epítope susceptible de ligadura de una molécula objetivo presente en un sistema biológico, y una segunda fracción de ligadura que se liga a una matriz . Una "molécula objetivo" es cualquier molécula que va a ser purificada. Aunque el término "polipéptido objetivo" es usado en toda la anterior descripción de los sistemas y métodos, otras moléculas objetivo descritas en la presente pueden usarse en cualquiera de las formas de realización. Un "sistema biológico" incluye células in vi tro o extractos de tejidos, cultivos de células eucarióticas o procarióticas, cultivos de tejidos, cultivos de órganos, plantas y animales vivos, y extractos de plantas o animales vivos.

Una "matriz" es un material que puede ser separado en fases a partir de un sistema biológico. "Que se liga específicamente" significa que forma una asociación covalente o no covalente con una afinidad de al menos 104 M"1, con mayor preferencia 106 M"1, con la mayor preferencia al menos 109 M"1, bajo condiciones de ligadura de proceso, v.gr., pH de 4 a 9 e intensidad iónica de 50 mM a 1M, las cuales condiciones incluyen específicamente las condiciones presentes en la leche. Un "epítope removible" es un epítope que puede ser separado físicamente de una molécula, de preferencia por corte químico o enzimático. "Altos niveles" de expresión significa al menos 0.1 mg/ml, de preferencia al menos 0.5 mg/ml, y con la mayor preferencia al menos alrededor de 1 mg/ml . "Levigar de manera selectiva" se refiere a disociar la molécula objetivo del polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, de preferencia sin disociar el polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico de la matriz. Como se usa en la presente, un "animal transgénico" es un animal no humano en el cual, una o mas, y de preferencia esencialmente todas las células del animal contienen un ácido nucleico heterólogo, introducido por vía de la intervención humana, tal como por técnicas transgénícas conocidas en la materia. El transgén puede ser introducido a la célula, directa o indirectamente, por medio de la introducción a un precursor de la célula, por vía de manipulación genética deliberada, tal como por micro- inyección o por infección con un virus recombinante. Los mamíferos son definidos en la presente como todos los animales, excluyendo seres humanos, que tienen glándulas mamarias y producen leche. Como se usa en la presente, un "animal lechero" se • refiere a un animal productor de leche. En formas de realización preferidas, el animal lechero produce grandes volúmenes de leche 0 y tienen largos períodos de lactancia, v.gr., vacas o cabras. Como se usa en la presente, el término "planta" se refiere ya sea a una planta entera, una parte de planta, una • célula de planta, o un grupo de células de planta. La clase de plantas que pueden usarse en el método de la invención es 5 generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores susceptibles a técnicas de transformación, incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Incluye plantas de una variedad de niveles de grado de repetición del número básico de cromosomas, incluyendo poliploides, diploides y haploides.

• El término polipéptido objetivo "purificado", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que está sustancialmente libre de material celular cuando se produce por medio de una célula que expresa el polipéptido objetivo. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye 5 preparaciones del polipéptido objetivo en el cual se separa el polipéptido es separado de los componentes celulares de las células en las que se produce. En una forma de realización, el lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipéptido objetivo teniendo menos de alrededor de 30% (en peso seco) de polipéptido no objetivo (también referido en la presente como una "impureza de proteína" o "proteína contaminante"), de manera mas preferencia menos de alrededor de 20% del polipéptido no objetivo, todavía con mayor preferencia menor de alrededor de 10% del polipéptido no objetivo, y con la mayor preferencia menor de alrededor de 5% del polipéptido no objetivo. Otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 bosqueja una forma de realización donde la molécula objetivo y el polipéptido de ligadura multi-valente son de fuentes separadas . La figura 2 bosqueja una forma de realización donde la molécula objetivo y el polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, son de la misma fuente. La figura 3 bosqueja una forma de realización donde un epítope removible de la molécula objetivo es removido por una fracción catalítica de un segundo polipéptido de ligadura multivalente que también se liga a una matriz. Una diferente matriz es ligada por el segundo polipéptido multi-valente que la molécula objetivo/primer polipéptido de ligadura multi-valente. Descripción Detallada de la Invención La invención se refiere a la expresión transgénica y purificación de polipéptidos de sistemas biológicos. De manera mas particular, la invención se refiere a sistemas transgénicos para expresión y purificación de polipéptidos, y a métodos que usan tales sistemas. Las patentes y las publicaciones citadas en la presente reflejan el conocimiento disponible a los técnicos en la materia, y son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. La invención provee sistemas y métodos para la purificación de moléculas objetivo presentes en sistemas biológicos. Los sistemas y métodos de acuerdo con la invención utilizan la presencia de polipéptidos de ligadura multi -valentes, v.gr., polipéptidos de ligadura multi-valentes, producidos de manera transgénica, como medios de afinidad, para purificar tales moléculas objetivo. De preferencia, los polipéptidos de ligadura multi -valentes se ligan tanto a la molécula objetivo como a una matriz, v.gr., una matriz separable en fases. Estos sistemas y métodos proveen muchas ventajas sobre los sistemas previamente existentes. Los sistemas y métodos de acuerdo con la invención reducen grandemente el tiempo y el costo de purificar tales moléculas objetivo debido a que evitan la necesidad de purificar por separado el ligando de afinidad y funcionalizar la matriz de afinidad. En ciertas formas de realización, la molécula objetiva por purificarse es un polipéptido. En estas formas de realización, la invención provee sistemas y métodos para tanto la expresión como purificación de las moléculas objetivo, con ello simplificando de manera adicional el proceso de producción y reduciendo su costo. Tanto el polipéptido objetivo como el polipéptido de ligadura multi-valente pueden ser expresados de manera transgénica, v.gr., en leche de animal, ya sea en animales separados o el mismo animal . Aunque los siguientes métodos y sistemas se refieren generalmente a poner en contacto el polipéptido de ligadura multi-valente con la matriz y luego con el objetivo, es igualmente apropiado el orden opuesto para todas las formas de realización. La invención provee un sistema transgénico para purificación de una molécula objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura. El sistema puede incluir un animal transgénico que expresa, v.gr., en tejido mamario, un polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. El polipéptido multivalente incluye una primera fracción de ligadura que se liga a un polipéptido objetivo, v.gr., se liga a un epítope susceptible e ligadura de un polipéptido objetivo, y una segunda fracción de ligadura que se liga a una matriz. De preferencia, el sistema incluye además una matriz a la cual se liga de manera específicamente la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente.

El animal transgénico puede expresar el polipéptido de ligadura multi-valente en una manera específica a tejido. Tal expresión específica a tejido puede ser obtenida teniendo la secuencia que codifica la proteína objetivo bajo el control de un promotor específico a tejido, v.gr., un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias. Los promotores específicos de la leche pueden incluir: promotores de caseína (v.gr., promotores de a-caseína, ß-caseína, ?-caseína o ?-caseína) ; promotores de WAP; ß-lactoglobina; y lactoalbúmina. Las moléculas objetivo pueden incluir: ácidos nucleicos, nucleótidos, nucleósidos, carbohidratos, lípidos, hormonas, factores de crecimiento, co- factores de enzima, otros ligandos que ocurren naturalmente, y polipéptidos. Los epítopes susceptibles de ligadura de la molécula objetivo pueden incluir: epítopes que contienen carbohidrato, epítopes que contienen lípido, y epítopes que contienen péptido, así como epítopes que comprenden cualquier combinación de éstos. Las moléculas objetivo pueden ser una molécula endógena o exógena. La invención puede también incluir un sistema transgénico animal múltiple para expresión y/o purificación de un polipéptido objetivo, v.gr., un polipéptido objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura. El sistema puede incluir un primer animal transgénico que expresa, v.gr., en tejido mamario, un polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. El polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico puede incluir una primera fracción de ligadura que se liga específicamente al polipéptido objetivo, v.gr., un epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo, y una segunda fracción de ligadura que se liga específicamente a una matriz. El sistema puede incluir además un segundo animal que expresa, v.gr., en tejido mamario, un polipéptido objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura. El sistema puede incluir además una matriz a la cual se liga de manera específicamente la segunda fracción de ligadura . El segundo animal puede ser un animal transgénico que expresa un polipéptido objetivo. Por ejemplo, el segundo animal puede ser un animal transgénico que expresa el polipéptido objetivo en una manera específica a tejido, v.gr., expresa el polipéptido objetivo en su tejido mamario. El epítope susceptible de ligadura de una molécula objetivo puede ser un epítope removible. Por ejemplo, el epítope puede ser removido por una fracción catalítica de un segundo polipéptido de ligadura multivalente, v.gr. , un segundo polipéptido multi-valente, producido de manera transgénica. Un segundo polipéptido de ligadura multivalente, transgénico, puede incluir un primer dominio catalítico y una segunda fracción de ligadura que se liga específicamente a una matriz. De preferencia, la matriz ligada de manera específica por la segunda fracción de ligadura del segundo polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, es diferente que la matriz ligada específicamente por la segunda fracción de ligadura del primer polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. El dominio catalítico de un segundo polipéptido de ligadura multivalente puede catalizar el corte del epítope' susceptible de ligadura del epítope removible. Por ejemplo, el dominio catalítico puede tener una actividad de amidasa. La invención puede también referirse a un solo sistema transgénico animal para expresión y/o purificación de un • polipéptido objetivo, v.gr., un polipéptido objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura. El sistema incluye: un 10 animal transgénico que expresa, v.gr., en tejido mamario, un polipéptido objetivo. El polipéptido de ligadura multi-valente puede incluir una primera fracción de ligadura que se liga a un epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo y una segunda fracción de ligadura que se liga a una matriz. 15 El polipéptido de ligadura multi-valente y el polipéptido objetivo pueden ser expresados en el mismo o en diferentes tejidos. Por ejemplo, la secuencia de codificación del polipéptido objetivo puede estar bajo el control de un promotor general y la secuencia de codificación del polipéptido de ligadura multi¬ • valente puede estar bajo el control de un promotor específico a tejido, o viceversa; la secuencia de codificación del polipéptido objetivo puede estar bajo el control de un promotor específico a tejido y la secuencia de codificación del polipéptido multivalente puede estar bajo el control de un promotor específico a 5 tejido para un tipo de tejido diferente, v.gr., la secuencia de codificación del polipéptido objetivo puede estar bajo el control de un promotor específico a la orina y la secuencia de codificación del polipéptido de ligadura multi-valente puede estar bajo el control de un promotor específico de la leche; tanto la secuencia que codifica el polipéptido de ligadura multi-valente como la secuencia que codifica el polipéptido objetivo pueden estar bajo el control de promotores específicos a tejido para el mismo tipo de tejido, v.gr., la secuencia que codifica el polipéptido de ligadura multi-valente puede estar bajo el control de un promotor específico de la leche y la secuencia que codifica el polipéptido objetivo puede estar bajo el control de otro o el mismo promotor específico de la leche. De preferencia, el polipéptido de ligadura multivalente y el polipéptido objetivo son expresados en la leche del animal transgénico. El polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico está, de preferencia, presente en niveles suficientes en la leche para ligar al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% o toda la molécula objetivo. Por ejemplo, el polipéptido de ligadura multi-valente puede estar presente en altos niveles, v.gr., al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml, en la leche del animal transgénico. En adición, el polipéptido objetivo está, de preferencia, presente en altos niveles, v.gr., al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml en la leche del mismo animal transgénico . El sistema puede incluir además una matriz a la cual se liga de manera específica la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente. El epítope susceptible de ligadura de una molécula objetivo puede ser un epítope removible. Por ejemplo, el epítope puede ser removido por una fracción catalítica de un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, v.gr., un segundo polipéptido multi-valente, producido de manera transgénica. Un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico puede incluir un primer dominio catalítico y una segunda fracción de ligadura que se liga específicamente a una matriz. De preferencia, la matriz ligada específicamente por la segunda fracción de ligadura del segundo polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, es diferente que la matriz ligada de manera específica por la segunda fracción de ligadura del primer polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. El dominio catalítico de un segundo polipéptido de ligadura, multi-valente, puede catalizar el corte del epítope susceptible de ligadura del epítope removible. Por ejemplo, el dominio catalítico puede tener una actividad de amidasa. El polipéptido objetivo puede ser expresado en una forma inactiva en el tejido mamario del animal. Este aspecto puede ser particularmente ventajoso en situaciones en las que no se desea que el polipéptido objetivo lleve a cabo su función biológica en el tejido mamario. Por ejemplo, la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente puede ligarse al polipéptido objetivo en una manera que le impida llevar a cabo su función biológica hasta que sea levigado de manera selectiva o el epítope susceptible de ligadura puede ser un epítope removible en el cual el polipéptido objetivo no es biológicamente activo hasta que se remueve el epítope. En algunas formas de realización, la fracción de ligadura puede remover un epítope removible. La invención también se refiere a métodos para obtener, v.gr., purificar, una molécula objetivo que incluye un epítope susceptible de ligadura de un sistema biológico. El método puede utilizar cualquiera de los sistemas antes descritos. El método puede incluir: poner en contacto un polipéptido de ligadura multi-valente, v.gr., cualquier polipéptido de ligadura multivalente descrito en la presente, con una composición de materia de un sistema biológico, para formar una mezcla de reacción. La composición de materia puede incluir una molécula objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura. Dentro de la mezcla, la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente pude ligarse al epítope susceptible de ligadura de la molécula objetivo. De preferencia, la mezcla de reacción es mantenida tal que la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente se ligue al epítope susceptible de ligadura de la molécula objetivo. La mezcla puede ser puesta en contacto adicionalmente con una matriz a la cual se liga la segunda fracción de ligadura. En presencia de la matriz, la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multivalente puede ligarse a la matriz, y cualesquiera componentes no ligados de la mezcla pueden ser removidos. La molécula objetivo puede entonces obtenerse, v.gr., levigarse, de la composición de materia. El método puede también incluir proveer una muestra, v.gr., un fluido, v.gr., leche, orina, sangre, que incluye una molécula objetivo. La muestra puede ser puesta en contacto con un polipéptido de ligadura multi-valente descrito en la presente, para obtener la molécula objetivo. Por ejemplo, una muestra que incluye un polipéptido objetivo puede obtenerse de un animal, v.gr., un animal transgénico. De preferencia, la muestra puede ser obtenida de un animal que expresa la molécula objetivo en su leche, v.gr., la muestra puede ser obtenida ordeñando al animal. El animal puede ser cualquier animal transgénico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifique el polipéptido objetivo bajo el control de un promotor específico de la leche. La invención también se refiere a métodos para obtener, v.gr., purificar, una molécula objetivo, v.gr., una molécula objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura. El método puede incluir: proveer un fluido, v.gr., leche, que incluye una molécula objetivo, v.gr., un polipéptido objetivo, y un polipéptido de ligadura multi-valente, un polipéptido de ligadura multivalente descrito en la presente. Por ejemplo, el fluido, v.gr., leche, puede obtenerse de un animal transgénico que expresa el polipéptido objetivo y el polipéptido de ligadura multi-valente en el fluido, v.gr., leche. El método incluye además poner en contacto el fluido con una matriz a la cual se liga la segunda fracción de ligadura. En presencia de la matriz, la segunda fracción de ligadura del péptido de ligadura multi-valente puede ligarse a la matriz, y pueden removerse cualquiera componentes no ligados de la mezcla. La molécula objetivo puede ser entonces obtenida, v.gr., levigada, de la composición de materia. De preferencia, la composición de materia de un sistema biológico es puesta en contacto con leche que contiene niveles suficientes de un polipéptido de ligadura multi-valente para obtener al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% o toda la molécula objetivo de la composición de materia. Por ejemplo, la leche puede contener altos niveles de la proteína de ligadura multi-valente, transgénica, debido a su expresión en el tejido mamario y secreción a la leche. De preferencia, el polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico está presente en la leche a niveles de al menos 0.1, 1, 5, 10 mg/ml. Losa sistemas biológicos incluyen, por ejemplo, plantas, hongos, bacterias y productos animales. Las composiciones de sistemas biológicos pueden incluir: medios acondicionados, extractos de tejidos, órganos y fluidos corporales (v.gr., sangre, plasma, suero, sudor, saliva, orina, leche, etc.). Tales plantas, hongos, bacterias y productos animales pueden incluir polipéptidos expresados a partir de genes suministrados endógena o exógenamente . En cualquiera de los métodos, el epítope susceptible de ligadura de una molécula objetivo puede ser un epítope removible. Por ejemplo, el epítope puede ser removido por una fracción catalítica de un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, v.gr., un segundo polipéptido multi-valente producido de manera transgénica. Un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico puede incluir un primer dominio catalítico y una segunda fracción de ligadura que se liga específicamente a una 10 matriz. De preferencia, la matriz ligada de manera específica por la segunda fracción de ligadura del segundo polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico es diferente de la matriz • ligada específicamente por la segunda fracción de ligadura del primer polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico. El 15 dominio catalítico de un segundo polipéptido de ligadura multivalente puede catalizar el corte del epítope susceptible de ligadura del epítope removible. Por ejemplo, el dominio catalítico puede tener una actividad de amidasa. Cuando el epítope es un epítope removible, el polipéptido objetivo puede * ser obtenido de la mezcla removiendo el epítope de la molécula objetivo. El polipéptido objetivo puede ser expresado en una forma inactiva en el tejido mamario del animal. Este aspecto puede ser particularmente ventajoso en situaciones en las cuales 25 no se desea que el polipéptido objetivo lleve a cabo su función biológica en el tejido mamario. Por ejemplo, la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente puede ligarse al polipéptido objetivo en una manera que le impida llevar a cabo su función biológica hasta que sea selectivamente levigado o el epítope susceptible de ligadura puede ser un epítope removible en el cual el polipéptido objetivo no es biológicamente activo hasta que se remueve el epítope. En algunas formas de realización, la fracción de ligadura puede remover un epítope removible. Fracción de ligadura de polipéptidos de ligadura multi-valentes sue se ligan a una molécula objetivo Los polipéptidos de ligadura multi -valentes de la invención incluyen una primera fracción de ligadura que puede ligarse a una molécula objetivo, v.gr., un epítope susceptible de ligadura de una molécula objetivo. Primeras fracciones de ligadura preferidas incluyen: un anti-cuerpo, un fragmento Fab o F(ab)2 del mismo, o una porción de polipéptido que comprende una región determinante de complementariedad de un anti-cuerpo que se liga de manera específica a un epítope susceptible de ligadura de la molécula objetivo, un ligando o receptor que se liga a un epítope susceptible de ligadura de una molécula objetivo, o cualquier otra porción de polipéptido que se liga de manera específica a un epítope susceptible de ligadura de la molécula objetivo, v.gr., un polipéptido seleccionado para ligadura en, v.gr., un despliegue de fagos o un ensaye de dos híbridos.

Anti-cuerpos o fragmentos de los mismos Es bien sabido en la materia hacer anti-cuerpos y diversos derivados de anti -cuerpos. Por ejemplo, Jones y colaboradores, Nature 32.1:522-525 (1986) divulgan reemplazar las CDRs de un anti-cuerpo humano con las de un anti-cuerpo de ratón. Marx, Science 229 : 455-456 (1985) discute anti-cuerpos quiméricos que tienen regiones variables de ratón y regiones constantes humanas. Rodwell, Nature 342 : 99-100 (1989) discute los elementos de reconocimiento de peso molecular inferior derivados de la información de CDR de anti-cuerpo. Clackson, Br. , J. Rheumatol . 3052 : 36-39 (1991) discute anti-cuerpos monoclonales manipulados por ingeniería genética, incluyendo derivados del fragmento Fv, anti-cuerpos de cadena sencilla, anti-cuerpos quiméricos de proteína de fusión y anti-cuerpos de roedor humanizados. Reichman y colaboradores, Nature 332 : 323-327 (1988) divulgan un anti-cuerpo humano en el cual se han injertado regiones hiper-variables de rata. Verhoeyen y colaboradores, Science 239 : 1534-1536 (1988) enseñan injertar un sitio de ligadura de antígeno de ratón en un anti-cuerpo humano. Fracción de ligadura de polipéptidos de ligadura multi-valentes que se licran a una matriz Los polipéptidos de ligadura multi-valente de la invención también incluyen una segunda fracción de ligadura que se liga a una matriz. Segundas fracciones de ligadura pueden incluir, por ejemplo, anti-cuerpos o derivados de anti-cuerpo, en cuyo caso la matriz comprende el antígeno o su epítope que es ligado de manera específica por el anti-cuerpo. En tales formas de realización, la interacción ente el anti-cuerpo y el antígeno debe ser suficientemente ávida para impedir la disociación bajo condiciones que levigarían la molécula objetivo. Otros pares preferidos de segunda fracción de ligadura/matriz incluyen, sin limitación, polihistidina-quelato metálico de níquel (levigación con < 250 mM imidazola o bajo pH) , estreptavidina-biotina (levigación con 6 M urea, pH 4.0), péptido-MAb específico (levigación con pH 3.0 o 2-5 mM EDTA), S-péptido/ribonucleasa de la proteína S (levigación después de auto-corte) , glutaniona/S-transferasa glutaniona (levigación con 5-10 mM glutaniona reducida) , proteína A o dominio ZZ sintético de la proteína A-IgG (levigación a bajo pH) , región Fc de IgG/proteína A (levigación a bajo pH) , dominios de ligadura de maltosa/amilosa reticulada (levigación con 10 mM maltosa) y dominios de ligadura de celulosa (CBD) /celulosa o quitina (levigación con agua o < 4 M guanidinio o 1 M o mayor NaOH) . El par de dominios de ligadura de celulosa/ celulosa o quitina es actualmente el mas preferido. Para purificación de anti-cuerpos, la forma de realización mas preferida comprende una primera fracción de ligadura de la proteína L y una segunda fracción de ligadura de CBD. Moléculas objetivo La molécula objetivo puede ser una molécula endógena, v.gr., un polipéptido endógeno, o una molécula exógena, v.gr., polipéptido. Por ejemplo, el polípéptido exógeno puede ser un polipéptido que es expresado de manera natural en el animal pero no en un tejido particular o a menores niveles en el tejido en que se está expresando, o el polipéptido exógeno puede ser un polipéptido que no es expresado en el animal, v.gr., el animal es un animal no humano que expresa un polipéptido humano. De preferencia, la molécula objetivo incluye un epítope susceptible de ligadura. El epítope susceptible de ligadura puede ser un epítope removible. El epítope removible puede ser removido después de la levigación selectiva de la molécula objetivo. Tales epítopes removibles pueden ser derivados de porciones de polipéptido de proteínas, que son editadas después de traducción por auto-empalme, v.gr., las llamadas proteínas que contienen "inteína". De manera alternativa, el epítope removible puede ser unido al resto de la molécula objetivo por medio de un sitio específico de reconocimiento y corte de proteasa, con la condición de que ningún otro sitio semejante en la molécula objetivo esté disponible a la proteasa. De preferencia, la proteasa puede estar unida a la matriz. En algunas formas de realización, el polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico mismo puede incorporar la actividad de proteasa, ya sea como parte de la primera fracción de ligadura, o como una fracción de ligadura adicional, separada, unida de manera flexible. Cuando la actividad de proteasa es parte de la primera fracción de ligadura, se prefiere que tenga la capacidad de ligarse al epítope susceptible de ligadura bajo un conjunto de condiciones y que corte el epítope susceptible de ligadura bajo un segundo y diferente conjunto de condiciones. Mamíferos transgénicos Los métodos para generar animales transgénicos no humanos son conocidos en la materia. Tales métodos pueden implicar introducir construcciones de ADN en la línea germinal de un mamífero para hacer un mamífero transgénico. Por ejemplo, una o varias copias de la construcción se pueden incorporar en el genoma de un embrión de mamífero mediante técnicas transgénicas estándar. Aunque se prefieren bovinos y cabras, pueden usarse otros mamíferos no humano. Los mamíferos no humanos preferidos son los rumiantes, v.gr., vacas, ovejas, camellos o cabras. Ejemplos adicionales de animales no humanos preferidos incluyen bueyes, caballos, llamas, cerdos, ratones y ratas. Para técnicas de transferencia nuclear, el mamífero usado como la fuente de células, v.gr., células manipuladas por ingeniería genética, dependerá del mamífero transgénico por obtenerse. A guisa de ejemplo, el genoma de un bovino debe ser usado a partir de transferencia nuclear con oocito de un bovino. Los métodos para la preparación de una variedad de animales transgénicos son conocidos en la materia. Los protocolos para producir cabras transgénicas son conocidos en la materia. Por ejemplo, un transgén puede ser introducido en la línea germinal de una cabra por micro-inyección, como se describe, por ejemplo, en Ebert y colaboradores (1994) Bio/ Technology 12:699, o técnicas de transferencia nuclear como se describe, por ejemplo, en la solicitud PCT WO 98/30683. Un protocolo para la producción de un cerdo transgénico puede ser encontrado en White y Yannoutsos, Current Topics in Complement Research : 64 th Forum in Immunology, pp . 88-94; patente US 5,523,226; patente US 5,573,933; solicitud PCT WO 93/25071; y solicitud PCT WO 95/04744. Un protocolo para la producción de una rata transgénica puede ser encontrado en Bader y Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, supl. 3:S81-S87, 1996. Un protocolo para la producción de una vaca transgénica puede ser encontrado en la patente US 5,741,957, la solicitud PCT WO 98/30683, y Transgenic Animal Technology. A Handbook, 1994, Cari A. Pinkert, editor, Academic Press, Inc. Un protocolo para la producción de una oveja transgénica puede ser encontrado en la publicación PCT WO 97/07669, y Transgenic Animal Technology. A Handbook, 1994, Cari A. Pinkert, editor, Academic Press, Inc. Líneas celulares transfectadas Células manipuladas por ingeniería genética para producción de un mamífero transgénico por transferencia nuclear pueden ser obtenidas a partir de una línea celular en la cual se ha introducido un ácido nucleico de interés, v.gr., un ácido nucleico que codifica una proteína. Puede introducirse una construcción en una célula vía técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se usan en la presente, los términos "transfección" y "transformación" incluyen una variedad de técnicas para introducir una secuencia transgénica en una célula hospedera, incluyendo coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Además, vectores biológicos, v.gr., vectores virales, pueden ser usados como se describe mas adelante. Métodos adecuados para transformar o transfectar células hospederas pueden ser encontradas en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) , y otros manuales de laboratorio adecuados. Dos enfoques útiles son electroporación y lipofección. Se describen mas adelante ejemplos breves de cada uno. La construcción de ADN puede ser introducida de manera estable en una línea celular donadora, v.gr. , una célula embriónica, v.gr., una línea celular somática embriónica, por electroporación, usando el siguiente protocolo: las células son re-suspendidas en PBS a alrededor de 4 x 106 células/ml. Se añadieron 50 µg de ADN linealizado a la suspensión celular de 0.5 ml , y la suspensión fue colocada en una probeta de espacio libre de electrodo de 0.4 cm (Biorad) . Se llevó a cabo la electropora-ción usando un dispositivo de electroporación Biorad Gene Pulser, con un pulso de 330 voltios a 25 mA, 1,000 microFaradios y resistencia infinita. Si la construcción de ADN contiene un gen de resistencia a neomicina para selección, se seleccionan clonas resistentes a neomicina después de incubación con 350 µg/ml de G418 (GibcoBRL) por 15 días. La construcción de ADN puede ser introducida de manera estable en una línea celular donadora por lipofección usando un protocolo tal como el siguiente: alrededor de 2 x 105 células son dispuestas en una placa, en una cavidad de 3.5 cm, y transfectadas con 2 µg de ADN linealizado usando LipfectAMINE (GibcoBRL) . 48 horas después de la transfección, las células son divididas 1:1,000 y 1:5,000 y, si la construcción de ADN contiene un gene de resistencia a neomicina para selección, se añade G418 a una concentración final de 0.35 mg/ml. Las clonas resistentes a neomicina son aisladas y expandidas para crio-preservación así como transferencia nuclear. Expresión específica a te idos de proteínas Es a menudo deseable expresar una proteína, v.gr., una proteína heteróloga, en un tejido o fluido específico, v.gr., la leche, sangre u orina, de un animal transgénico. La proteína heteróloga puede ser recuperada del tej ido o fluido en el que se expresa. Por ejemplo, es a menudo deseable expresar la proteína heteróloga en leche. Los métodos para producir una proteína heteróloga bajo el control de un promotor específico de la leche son descritos mas adelante. En adición, se describen mas adelante otros promotores específicos a tejidos, así como otros elementos reguladores, v.gr., secuencias de señal y secuencias que acrecientan la secreción de proteínas no secretadas. Promotores específicos de la leche Los promotores de transcripción útiles son aquellos promotores que preferencialmente se activan en células epitelia¬ • les mamarias, incluyendo los promotores que controlan los genes que codifican las proteínas de la leche, tales como caseínas, ß-0 lactoglobulina (Clark y colaboradores, (1989) Bio/Technology 7.:487-492), proteína de ácido de suero de leche (Gorton y colaboradores, (1987) Bio/Technology 5 : 1183-1187) , y lactalbúmina • (Soulier y colaboradores, (1992) FEBS Letts . 297 : 13) . El promotor de gen de a, ß, y o ?-caseína de cualquier especie de 5 mamífero se puede usar para proporcionar expresión mamaria; un promotor preferido es el promotor del gen de ß- caseína de cabra (DiTullio, (1992) Bio/Technology 10:74-77). El promotor de proteína específico de leche o los promotores que se activan específicamente en tejido mamario se pueden aislar a partir de /ADNc O secuencias genómicas. Preferiblemente, son de origen genómico. La información de la secuencia de ADN está disponible para genes específicos de la glándula mamaria enlistados anteriormente, y cuando menos uno, y frecuentemente en varios 5 organismos. Véase, por ejemplo, Richards y colaboradores, J7 Biol . Chem. 256, 526-532 (1981) (o.-lactalbúmina de rata) ; Campbell y colaboradores, Nucleic Acids Res . 12, 8685-8697 (1984) (WAP de rata); Jones y colaboradores, J. Biol . Chem. 260, 7042-7050 (1985) (ß-caseína de rata); Yu-Lee y Rosen, J. Biol . Chem. 258, 10794-10804 (1983) (?-caseína de rata); Hall, Biochem J. 242,735-742 (1987) (a-lactalbúmina humana); Stewart, Nucleic Acids Res . 12, 389 (1984) (ADNc de asl y K caseína bovina) ; Gorodetsky y colaboradores, Gene 66 , 87-96 (1988) (ß-caseína bovina); Alexander y colaboradores, Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (K caseína bovina) ; Brignon y colaboradores, FEBS Lett 188, 48-55 (1977) (aS2 caseína bovina) ; Jamieson y colaboradores, Gene 61, 85-90 (1987) , Ivanov y colaboradores, Biol . Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988) , Alexander y colaboradores, Nucleic Acids Res . 17, 6739 (1989) (ß-lactoglobulina bovina) ; Vilotte y colaboradores, Biochími e 69, 609-620 (1987) (a-lactalbúmina bovina) . La estructura y la función de distintos genes de proteínas de la leche son realizados por Mercier & Vilotte, J". Dairy Sci . 16 , 3079-3098 (1993) (incorporada mediante referencia por entero para todos los propósitos) . Si son útiles secuencias de flanqueo adicionales para optimizar la expresión, estas secuencias se pueden clonar usando las secuencias existentes como sondas. Las secuencias reguladoras específicas de la glándula mamaria de diferentes organismos se pueden obtener seleccionando bibliotecas de estos organismos usando secuencias de nucleótidos cognados conocidas, o anti-cuerpos para las proteínas cognadas como sondas . Secuencias de señal Las secuencias de señal útiles son secuencias de señal específicas de la leche u otras secuencias de señales que dan como resultado la secreción de proteínas eucarióticas o procarióticas. Preferiblemente, la secuencia de señal se selecciona de secuencias de señales específicas de la leche, es decir, es a partir de un gen el cual codifica un producto secretado en leche. Más preferiblemente, la secuencia de señal específica de la leche se relaciona con el promotor específico de la leche usado en el sistema de expresión de esta invención. El tamaño de la secuencia de señal no es crítico para esta invención. Todo lo que se requiere es que la secuencia tenga un tamaño suficiente para efectuar la secreción de la proteína recombinante deseada, por ejemplo, en el tejido mamario. Por ejemplo, la secuencia de señales de genes que codifican caseínas, por ejemplo, , ß, ? o K caseínas, ß-lactoglobulina, proteína de ácido de suero de leche, y lactalbúmina son útiles en la presente invención. Una secuencia de señal preferida es la secuencia de señales de ß-caseína de cabra. También se pueden usar las secuencias de señales de otras proteínas secretadas, por ejemplo, inmunoglobulinas, o proteínas secretadas por células del hígado, células de riñon, o células pancreáticas. De preferencia, la secuencia de señal da como resultado la secreción de proteínas en, por ejemplo, orina o sangre . , , Otros promotores específicos a tejidos Pueden usarse otros promotores específicos a tejidos que aporten expresión en un tejido particular. Los promotores específicos a tejidos son promotores son a menudo expresados de manera esencialmente exclusiva en el tejido específico. Por ejemplo, si la proteína alterada es normalmente expresada en el hígado, puede usarse un promotor específico del hígado. Este será el caso cuando se usa ARNt supresor para alterar la albúmina de suero. En esta situación, una secuencia transgénica que codifica el ARNt supresor puede estar bajo el control de un promotor específico del hígado. Los promotores específicos a tejido que pueden usarse incluyen: un promotor específico neural, v.gr., nestina, Wnt-1, Pax-1, Engrailed-1, Engrailed-2, Sonic Hedgehog; un promotor específico de hígado, v.gr., albúmina, alfa-1 anti-tripsina; un promotor específico de músculo, v.gr., miogenina, actina, MyoD, miosina; un promotor específico de oocito, v.gr., ZP1, ZP2 , ZP3 ; un promotor específico de testículos, v.gr. , protamina, fertili-na, proteína-1 del complejo sinapto-enemal ; un promotor específico de la sangre, v.gr., globulina, GATA-1, porfobilinógeno desaminasa; promotor específico de pulmón, v.gr., la proteína C tensioactiva; un promotor específico de la piel o lana, v.gr., queratina, elastina; promotores específicos del endotelio, v.gr., Tie-1, Tie-2; y un promotor específico de hueso, v.gr., BMP.

Además, pueden usarse promotores generales para expresión en diversos tejidos. Ejemplos de promotores generales incluyen ß-actina, ROSA-21, PGK, FOS, c-myc, Jun-A, y Jun-B. Secuencias aislantes Las construcciones del ADN de la invención además comprenden cuando menos una secuencia aislante. Los términos "aislante" , "secuencia aislante" y "elemento aislante" se usan intercambiablemente en la presente. Un elemento aislante es un elemento de control que aisla la transcripción de genes colocados dentro de su rango de acción pero que no" perturba la expresión del gen, ya sea negativamente o positivamente. Preferiblemente, una secuencia aislante se inserta en cualquiera de los lados de la secuencia de ADN que se va a transcribir. Por ejemplo, el aislante se puede colocar aproximadamente 200 pares de bases hasta aproximadamente 1 kb, 5Ü a partir del promotor, y cuando menos aproximadamente 1 kb a 5 kb a partir del promotor, en el extremo 30 del gen de interés. La distancia de la secuencia aislante del promotor y el extremo 3Ü del gen de interés se puede determinar por los técnicos en la materia, dependiendo de los tamaños relativos del gen de interés, el promotor y el realzador usado en la construcción. Además, se puede colocar más de una secuencia aislante 5Ü a partir del promotor o en el extremo 3Ü del transgén. Por ejemplo, dos o más secuencias aislantes se pueden colocar 5Ü del promotor. El aislante o los aislantes en el extremo 3D del transgén se pueden colocar en el extremo 3Ü del gen de interés, o en el extremo 30 de una secuencia reguladora 3Ü, por ejemplo, una región no traducida 3Ü (UTR) o una secuencia de flanqueo 3Ü . Un aislante preferido es un segmento de ADN que abarca el extremo 5Ü del lugar ß-globina de pollo y corresponde al sitio hipersensible constitutivo 5Ü de pollo como se describe en la publicación PCT WO 94/23046, cuyo contenido se incorpora en la presente mediante referencia. Construcciones de ADN Un cartucho que codifica una proteína heteróloga puede ser ensamblado como una construcción que incluye un promotor, v.gr., un promotor para un tejido específico, v.gr., para células epiteliales mamarias, v.gr., un promotor de caseína, v.gr., un promotor de ß-caseína de cabra, una secuencia de señal específica de leche, v.gr., una secuencia de señal de caseína, v.gr., una secuencia de señal de ß-caseína, y un ADN que codifica una proteína de fusión. La construcción también puede incluir una región no traducida 3Ü corriente abajo de la secuencia de ADN que codifica la proteína no secretada. Estas regiones pueden estabilizar la transcripción del ARN del sistema de expresión y de este modo aumenta la producción de la proteína deseada del sistema de expresión. Entre las regiones no traducidas 3Ü útiles en las construcciones de esta invención están las secuencias que proporcionan una señal poli A. Estas secuencias se pueden derivar, por ejemplo, del antígeno t pequeño SV40, la región no traducida 3Ü de caseína u otras secuencias no traducidas 3Ü muy conocidas en la materia. Preferiblemente, la región no traducida 3Ü se deriva de una proteína específica de la leche. La longitud de la región no traducida 30 no es crítica pero el efecto estabilizante de esta transcripción poli A parece importante para estabilizar el ARN de la secuencia de expresión. Opcionalmente, la construcción puede incluir una región no traducida 5Ü entre el promotor y la secuencia de ADN que codifica la secuencia de señales. Estas regiones no traducidas pueden ser de la misma región de control a partir de la cual el promotor se toma o pueden ser de un gen diferente, por ejemplo, se pueden derivar de otras fuentes sintéticas, semi -sintéticas o naturales. De nuevo su longitud específica no es crítica, sin embargo, parece ser útiles en mejorar el nivel de expresión. La construcción también incluye aproximadamente 10, 20, 30%, o más de la región de codificación N-terminal de un gen preferencialmente expresado en células epiteliales mamarias. Por ejemplo, la región de codificación N-terminal puede corresponder al promotor usado, v.gr., una región de codificación N-terminal de ß-caseína de cabra. La construcción puede ser preparada usando métodos conocidos en la materia. La construcción puede ser preparada como parte de un plásmido mas grande. Tal preparación permite la clonación y la selección de las construcciones correctas en una manera eficiente. La construcción puede estar ubicada entre sitios de restricción convenientes en el plásmido, de modo que puedan aislarse fácilmente de las secuencias de plásmido restantes para incorporación en el mamífero deseado. Proteínas objetivo heterólogas Secuencias transgénicas que codifican proteínas objetivo heterólogas pueden introducirse en la línea germinal de un mamífero no humano o pueden transfectarse a una línea celular, como se describió antes. La proteína puede ser una proteína compleja o muítimé-rica, v.gr., un homo o hetero-multímero, v.gr., proteínas que ocurren de manera natural como homo o hetero-multímeros, v.gr., homo o hetero-dímeros, trímeros o tetrámeros. La proteína puede ser una proteína que es procesada por remoción, v.gr., corte, del término N, el término C o fragmentos internos. Incluso pueden expresarse proteínas complejas en forma activa. Las secuencias que codifican proteína que pueden introducirse en el genoma de un mamífero, v.gr., bovinos o cabras, incluyen una proteína de suero, una proteína de leche, una proteína glicosilada o no glicosilada. La proteína puede ser de origen humano o no humano. La proteína heteróloga puede ser un agente terapéutico o farmacéutico potencial tal como, pero sin limitarse a: inhibidor de alfa-1 proteinasa, alfa-1 anti-tripsina, fosfatasa alcalina, angiogenina, anti -trombina III, cualquiera de los factores de coagulación de la sangre, incluyendo el factor VIII, factor IX y factor X, proteína de matriz de hueso (v.gr., BMP 1-15), quitinasa, eritropoyetina, super-óxído dismutasa extra-celular, fibrinógeno, glucocerebrosidasa, glutamato descarboxilasa, factor de crecimiento humano, albúmina de suero humana, inmunoglobulina, insulina, proteína básica de mielina, pro-insulina, pro-lactina, CD4 soluble o un componente o complejo deTLa misma, lactoferrina, lactoglobulina, lisozima, lactoalbúmina, factor de crecimiento de transformación (TGF), v.gr., TGF-ß, activador de plasminógeno de tejidos o un variante del mismo. Información de secuencias de nucleótidos está disponible para varios de los genes que codifican las proteínas heterólogas antes listadas, en al menos uno, y a menudo en diversos organismos. Ver, v.gr., Long y colaboradores (1984) Biochem . 23 (21) : 4828-4837 (alfa-1 anti-tripsina) ; Mitchell y colaboradores (1986) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 83:7182-7186 (fosfatasa alcalina) ; Schneider y colaboradores (1988) EMBO J. 7 (13) :4151-4156 (angiogenína) ; Bock y colaboradores (1988) Biochem. 27(16) : 6171-6178 (anti-trombina III) ; Olds y colaboradores (1991) Br. J. Haematol . 78 (3) : 408-413 (anti-trombina III); Lin y colaboradores (1985) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 82(22): 7580-7584 (eritropoyetina); patente US 5,614,184 (eritropoyetina); Horowitz y colaboradores (1989) Genomics 4(l):87-96 (glucocerebrosidasa) ; Kelly y colaboradores (1992) Ann . Hum . Genet . 56 (3) : 255-265 (glutamato descarboxilasa); patente US 5,707,828 (albúmina de suero humana); patente US 5,652,352 (albúmina de suero humana) ; Lawn y colaboradores (1981) Nucleic Acíd Res . 9 (22) :6103-6114 (albúmina de suero humana); Kamholz y colaboradores (1986) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 83 (13) .-4962-4966 (proteína básica de mielina) ; Hiraoka y colaboradores (1991) Mol . Cell Endocrinol . 75(l):71-80 (prolactina); patente US 5,571,896 (lactoferrina) ; Pennica y colaboradores (1983) Nature 301(5897) : 214-221 (activador del plasminógeno de tejidos); Sarafanov y • colaboradores (1995) Mol . Biol . 29:161-165, cuyo contenido se incorpora en la presente por referencia. 0 Polipéptidos de ligadura multi-valentes Puede prepararse una proteína de fusión de polipéptido de ligadura multi-valente con técnicas estándar de ADN recombinante, usando una molécula de ácido nucleico que codifique la proteína de fusión. Una secuencia de nucleótidos que codifica 5 una proteína de fusión puede ser sintetizada por métodos estándar de síntesis de ADN. Métodos de determinar si puede secretarse una proteína inactiva Uso de un ensaye de cultivo de tejidos Una construcción puede ser manipulada por ingeniería • para expresar una proteína inactiva que usa el sistema de expresión transiente de cultivo de tejidos de mamíferos. Por ejemplo, una construcción de gen puede ser ligada en un vector tal como pcDNAIIl o pCEP4. La transfección puede ser llevada a cabo usando técnicas estándar y pueden obtenerse muestras 5 representativas tanto de sobrenadante como de perlas celulares.

Como el sistema de cultivo de tejidos es relativamente rápido, pueden determinarse rápidamente las características de la proteína inactiva. Ensayes in vivo Una vez que se ha establecido que puede secretarse una proteína inactiva y que una proteína activa, v.gr. , BMP, puede entonces obtenerse usando, por ejemplo, el sistema de cultivo de tejidos, una construcción que expresa la proteína inactiva puede ser colocada en el sitio de clonación del sistema de expresión de glándula mamaria, tal como un sistema que incluye beta-caseína de cabra. Estas construcciones pueden ser usadas para generar ratones transgénicos. Esto permite probar la expresión de la proteína en la leche. Además, puede monitorearse la salud de la glándula mamaria y del animal . Métodos de determinar niveles de expresión Análisis de manchado Western Usando los ensayes antes descritos, se obtiene suficiente material para probar los niveles de expresión usando manchados Western. El manchado Western debe ser suficientemente sensible para recoger la señal de la proteína tipo silvestre que está siendo secretada. Si el nivel de expresión es, por ejemplo, 10 mg/l, entonces el nivel de la proteína en el ensaye sería de 10 ng/µl . Corriendo 10 µl en cada cavidad, deben verse 100 ng en el manchado . En adición, un anti-cuerpo monoclonal que es específico para moléculas activas puede ser usado para determinar los niveles de expresión de una proteína activa. Tales anti-cuerpos pueden ser usados para monitorear la eficiencia de doblez relativa de las proteínas secretadas. Tener un anti-cuerpo monoclonal específico para la proteína activa sería útil para determinar si se obtiene una proteína activa después del tratamiento enzimático de una proteína inactiva. Métodos de determinar la bio-actividad de una proteína La bio-actividad de las proteínas expresadas puede ser monitoreada por los métodos siguientes. Como las proteínas son inactivas y luego son activadas, la prueba de bio-actividad de una proteína puede ser llevada a cabo. La bio-actividad puede ser medida en un ensaye basado en células o en un modelo in vivo. Producción de una proteína inactiva modificando un sitio Una proteína puede ser producida de manera transgénica en una forma inactiva modificando un sitio necesario para activación de la proteína, v.gr., un sitio de corte. Por ejemplo, diversas proteínas requieren de corte de una pre y/o pro-región de la proteína a fin de obtener la proteína en forma activa. Tales proteínas incluyen la familia TGF-ß de moléculas que son activadas por corte durante la secreción. Por ejemplo, se produjo TGF-ß en la cual el sitio de corte KKRK fue reemplazado con la secuencia de reconocimiento de 10 aminoácidos de quimosina. La proteína fue secretada sin mordaza y luego procesada en un tubo de ensaye con la enzima quimosina para rendir la proteína activada. Se ha realizado una serie similar de experimentos con pro-insulina. De preferencia, se usan cortes enzimáticos que pueden funcionar en las moléculas ya dobladas y que tienen la capacidad de seguir la actividad de la proteína. Un sitio de activación de BMP-2 puede también ser modificado tal que el corte no ocurra durante la secreción de BMP-2 y se secrete en su forma pro. Reemplazando el sitio normal • de corte con aminoácidos de otra secuencia de reconocimiento (v.gr. , una secuencia de reconocimiento que no es cortada por una 0 proteasa endógena) , la pro- forma puede ser cortada después de la purificación. Un sitio de activación de BMP-2 tiene la siguiente secuencia: RKRLK. Esta secuencia puede ser modificada para • proveer un diferente sitio de corte que no es cortado durante la secreción de BMP-2, pero puede ser cortado después de secreción 5 usando una enzima proteolítica que no es normalmente expresada en el tejido o producto específico. Varios sitios proteolíticos exógenos pueden ser tratados para obtener una proteína inactiva. Estos incluyen sitios para corte por ácido, bromuro cianógeno, factor X, o quimosina. Analizando la secuencia de la proteína, pueden diseñarse los sitios potencíales. Diversas versiones de una proteína, tal como BMP con nuevos sitios de corte, pueden construirse y correrse a través del sistema de cultivo de tejidos. En adición, la proteína puede ser probada para 5 determinar si es secretada en una pro-forma inactiva. Tanto el sobrenadante del cultivo como perlas celulares pueden someterse a pruebas respecto de los niveles de la proteína. Las pro-formas pueden también probarse para demostrar que no tienen actividad biológica. Si la proteína inactiva es expresada en la glándula mamaria, se prefiere que el sitio de corte adicional no sea cortado por proteasas de suero pues la leche tiene proteína de suero en él a un bajo nivel. De preferencia, el sitio adicional es cortado tal que la proteína incluya menos de 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácidos extraños. Por ejemplo, si se desea una proteína BMP activa teniendo aminoácidos extras en su término N, debe diseñarse un sitio de modo que solamente la secuencia de BMP esté presente después del corte. El éxito del paso de corte puede ser monitoreado por análisis Western. De preferencia, se usa un anti-cuerpo capaz de reconocer la proteína activada, tal como BMP activa. Una vez que se corta la proteína, puede hacerse un ensaye de bio-actividad. Será importante correr proteína activa tipo silvestre a través de todo el sistema para asegurar que no esté teniendo lugar inactivación. Asimismo, puede probarse la proteína no procesada en cuanto a actividad. En adición, sí se encuentra que la proteína puede ser secretada en cultivo de tejidos como una proforma inactiva que puede entonces ser activada, las construcciones pueden entonces ser probadas en el sistema de leche de ratón.

La activación de la proteína puede también ser probada cuando se mezcla con leche de ratón y cabra. Pueden usarse ratones transgénicos para probar la capacidad de secretar una proteína en pro- forma. Por ejemplo, puede ligarse ADN modificado de^BMP-2 en un vector de expresión de beta-caseína de cabra. El ADN puede ser usado para generar ratones transgénicos que deben producir la proteína en su leche.

• Mas aún, pueden usarse ratones de control que expresan BMP-2 tipo silvestre. La leche puede ser obtenida de líneas representati¬ 10 vas, así como biopsias, para análisis Northern. La leche y muestras de tejidos pueden probarse en cuanto a expresión de las proteínas BMP-2 por análisis Western. De manera específica, la • producción de la proteína activa en leche puede ser probada usando las enzimas de corte apropiadas. La activación puede ser 15 monitoreada como se hizo con experimentos de expresión de cultivo de tej idos . Los intentos tempranos por producir BMP-2 en la glándula mamaria en forma activa dieron como resultado la inhibición del desarrollo de glándulas mamarias. De esta manera, • los niveles y los efectos de producir el tipo silvestre así como las formas novedosas de la proteína pueden monitorearse respecto del efecto sobre el tejido mamario. Producción d.e una proteína inactiva por co-expresión de la proteína y una proteína de ligadura 25 Una proteína puede ser producida de manera transgénica en una forma inactiva por co-expresión de la proteína con una proteína de ligadura que se liga a e inactiva la proteína. Por ejemplo, una proteína y una proteína de ligadura pueden ser un receptor y un ligando, o fragmentos de éstos o de cualquiera de ellos. La proteína de ligadura puede también ser un anti-cuerpo. En un aspecto, una proteína puede ser expresada como una proteína de fusión con la proteína de ligadura. Por ejemplo, la proteína BMP puede ser expresada como una proteína de fusión con su propio receptor. La asunción es que el receptor se ligará a la BMP y le impedirá interactuar con el receptor en la glándula mamaria o en el animal . El receptor puede ser enlazado a la BMP a través de un enlazador susceptible de corte. Una que se produce la versión inactiva, el enlazador puede ser cortado, permitiendo al receptor y la BMP disociarse y con ello activar la molécula de BMP. En un aspecto, el enlazador susceptible de corte no es reconocido por una enzima de procesamiento endógena que ocurre naturalmente en el tej ido o producto del animal transgénico, pero es reconocido por las enzimas de procesamiento en un sujeto a quien se administra el polipéptido inactivo. De esta manera, el polipéptido inactivo puede ser administrado a un sujeto, v.gr., un ser humano, tal que las enzimas de procesamiento presentes en el sujeto puedan cortar el polipéptido de ligadura del polipéptido objetivo con ello activando el polipéptido objetivo. Fusiones de proteína de ligadura/proteína pueden ser sometidas a pruebas de expresión, por ejemplo, en células COS. La expresión puede ser probada por análisis con anti-cuerpo monoclonal dirigido ya sea a la proteína o a la proteína de ligadura, v.gr., ya sea a BMP o a su receptor. La proteína de fusión puede también ser probada en cuanto a actividad. En adición, para obtener una proteína activa tal como BMP activa, la proteína de fusión puede ser cortada con la enzima apropiada y el corte puede ser monitoreado por manchado Western. La expectativa es que la proteína de fusión será inactiva hasta que sea cortada por la proteasa. Una proteína de fusión que incluye una proteína y una proteína de ligadura puede también someterse a prueba de expresión en leche. La construcción de fusión puede ser ligada, por ejemplo, en el vector de expresión de beta-caseína. El vector puede entonces usarse para generar ratones transgénicos. Estos ratones pueden ser sometidos a pruebas de su capacidad de expresar la proteína. En adición, los animales pueden ser sometidos a pruebas del efecto de la proteína sobre la glándula mamaria y el animal en general . También es posible expresar la proteína junto con un anti-cuerpo que es capaz de ligar e inactivar la proteína. Por ejemplo, la BMP y un anti-cuerpo contra BMP pueden usarse para producir BMP inactiva. Un anti-cuerpo de interés puede ser expresado en células COS junto con las proteínas, tales como BMP. El efecto del anti-cuerpo sobre la actividad de la BMP puede -ßß-entonces ser monitoreado. Una proteína activa, tal como BMP activa, puede ser obtenida siguiendo expresión con un anti-cuerpo que usa, por ejemplo, proteína A para ligar selectivamente la porción de anticuerpo del complejo proteína/anti -cuerpo . La proteína de ligadura puede además incluir al menos un aminoácido que es exógeno a la proteína de ligadura. Por ejemplo, un receptor de BMP puede incluir además una secuencia de aminoácidos exógena que es útil para purificación de la proteína de ligadura y/o el complejo proteína de ligadura/proteína. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos adicional puede usarse para ligarse a un ligando pre-seleccionado tal como un ligando 6X HIS, un ligando de dominio de ligadura de celulosa, o un ligando de dominio de ligadura de maltosa. Diversas proteínas de ligadura pueden ser sometidas a pruebas de su capacidad para ligarse a e inhibir una proteína. Todas las patentes y referencias citadas en la presente son incorporadas en su totalidad por referencia. Otras formas de realización están dentro de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un sistema Uransgénico para purificación de un polipéptido objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura, el sistema comprendiendo: un animal transgénico que tiene en su genoma un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ligadura multi-valente, bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, donde el polipéptido de ligadura multivalente comprende una primera fracción de ligadura que se liga 10 específicamente al epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo y una segunda fracción de ligadura que se liga específicamente a una matriz, con lo cual tal polipéptido de • ligadura multi-valente, transgénico es expresado en altos niveles en la leche del animal transgénico; y 15 una matriz a la cual se liga específicamente la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente. 2. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, donde el epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo es removible. • 3. El sistema de acuerdo con la reivindicación 2, donde la fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multivalente remueve el epítope susceptible de ligadura. 4. El sistema de acuerdo con la reivindicación 2, donde el sistema comprende además : 25 un segundo polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, que comprende un primer dominio catalítico y una segunda fracción de ligadura que se liga específicamente a una matriz, donde el dominio catalítico es capaz de remover el epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo; y una segunda matriz que se liga específicamente a la segunda fracción de ligadura del segundo polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, donde la matriz es diferente que la matriz ligada de manera específica por la segunda fracción de ligadura del primer polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico . 5. Un método de obtener un polipéptido objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura a partir de un producto, el método comprendiendo : poner en contacto un producto que comprende un polipéptido objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura con un polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, donde el polipéptido de ligadura multi-valente comprende una primera fracción de ligadura que se liga de manera específica al epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo y una segunda fracción de ligadura que se liga específicamente a una matriz, para con ello proveer una mezcla de reacción; poner en contacto la mezcla de reacción con una matriz que se liga de manera específica a la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente; y remover la mezcla de reacción que no se liga con la matriz, para con ello obtener el polipéptido objetivo. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, comprendiendo además levigar el polipéptido objetivo a partir de la matriz. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, donde el producto es leche. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 5, donde el polipéptido objetivo es un anti-cuerpo. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde 10 la primera fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, es proteína L o un fragmento de la misma. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, donde la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura 15 multi-valente, transgénico es un dominio de ligadura de celulosa (CBD) o fragmento del mismo. 11. Un sistema animal múltiple, transgénico, para obtener un polipéptido objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura, el sistema comprendiendo: » un primer animal transgénico que tiene en su genoma un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ligadura multivalente, bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, donde el polipéptido de ligadura multi-valente comprende una primera fracción de ligadura que 25 liga de manera específica el epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo y una segunda fracción de ligadura que se liga de manera específica a una matriz, con lo cual dicho polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico es expresado en altos niveles en la leche del animal transgénico; un segundo animal transgénico que tiene en su genoma un ácido nucleico que codifica un polipéptido objetivo bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias; y una matriz a la cual se liga de manera específica la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multivalente . 12. Un método de obtener un polipéptido objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura a partir de la leche, el método comprendiendo: poner en contacto leche que comprende un polipéptido objetivo teniendo un epítope susceptible de ligadura con un polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico, donde el polipéptido de ligadura multi-valente comprende una primera fracción de ligadura que se liga específicamente al epítope susceptible de ligadura del polipéptido objetivo y una segunda fracción de ligadura que se liga de manera específica a una matriz, para con ello proveer una mezcla de reacción; poner en contacto la mezcla de reacción con una matriz que se liga específicamente a la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente; y remover la mezcla de reacción que no se liga a la matriz, para con ello obtener el polipéptido objetivo. 13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, comprendiendo además levigar el polipéptido objetivo a partir de la matriz. 14. El método de la reivindicación 12, donde el polipéptido objetivo es un polipéptido producido de manera transgénica. 15. El método de acuerdo con la reivindicación 12, 10 donde el polipéptido de ligadura multi-valente, transgénico está presente en la leche de otro animal transgénico. 16. Un animal transgénico que tiene en su genoma un * ácido nucleico que codifica un polipéptido objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura bajo el control de un promotor 15 que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, y un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ligadura multivalente bajo el control de un promotor que dirige la expresión en células epiteliales mamarias, donde el polipéptido de ligadura multi-valente comprende una primera fracción de ligadura que se * liga de manera específica a un epítspe susceptible de ligadura de un polipéptido objetivo y una segunda fracción de ligadura que se liga de manera específica a una matriz. 17. Un método de obtener un polipéptido objetivo que tiene un epítope susceptible de ligadura, el método comprendien¬ 25 do: proveer leche a partir de un animal transgénico de la reivindicación 16; poner en contacEo la leche con una matriz que se liga específicamente a la segunda fracción de ligadura del polipéptido de ligadura multi-valente; y remover cualquier porción de la leche que no se ligue a la matriz, para con ello obtener el polipéptido objetivo. 18. El método de la reivindicación 17, comprendiendo además levigar el polipéptido objetivo a partir de la matriz.