KR20030012171A - 산사음료의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산사음료의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 산사 열매를 세척하여 이물질을 제거하고 열매의 물기를 제거한 후, 마쇄하여 착즙한 산사착즙물에 과당, 정백당, 솔비톨, 오렌지농축액, 파인애플농축액, 구연산나트륨, 사과향을 첨가하여 산사음료를 제조한다.
본 발명의 산사음료는 산사착즙액 40%를 첨가하여 제조한 음료의 기능성 검정결과, 혈당강하 측정에서 53%, 면역활성 125%, 유방암세포억제 58% 등의 효과가 있는 것으로 나타난 바와 같이 산사를 향후 기능성음료로 제공하는 데 있다.
Description
본 발명은 산사음료의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 산사 열매를 세척하여 이물질을 제거하고 열매의 물기를 제거한 후, 마쇄하여 착즙한 산사착즙물에 과당, 정백당, 솔비톨, 오렌지농축액, 파인애플농축액, 구연산나트륨, 사과향을 첨가하여 산사음료를 제조한다.
산사(학명은Crataegue pinnatifidaBUNGE)는 낙엽고목으로서 6∼7m까지 자라기도 하며 우리나라 중부의 전지역에 야생하고 있다. 민간에서는 음식적체, 식물중독, 요통, 자궁수축등에 사용되기도 하는 식물이다. 이런 산사를 이용한 음료 개발을 위한 가공적성을 구명하고자 먼저 산사의 일반성분을 조사하였다.
일반성분을 분석하기 위하여 A.O.A.C.법에 따라 수분은 105℃ 건조에 의한중량 감소율을 백분율로 표시하였고, 조 단백질은 캘달(Kjeldahl) 분해장치로 분해하여 질소 자동분석기로 정량하였고, 조 지방은 시료 2-3g을 원통 여지에 넣고 속시렛(Soxhlet) 추출기 내에서 15-18시간 에테르(Ether) 추출 후 건조 평량하였으며, 조 회분은 시료 10-20g을 도가니에 평취하여 500-600℃에서 5-10시간 작열 회화시켜 정량하였고, 조섬유는 조섬유 측정장치로 분석하여 그 결과를 다음의 표 1에 나타냈다.
표 1. 산사의 일반성분(단위:%)
| 구 분 | 수 분 | 회 분 | 조단백질 | 조섬유 | 조지방 |
| 산사열매 | 11.01 | 3.82 | 4.10 | 18.48 | 2.78 |
상기의 분석결과로부터 산사는 조섬유가 다른 작물에 비해 18배 이상 높은 것으로 나타났다.
한편 본 발명에 관련된 종래기술들은 대부분 열매를 건조하여 추출한 형태로 사용하여 그 맛이나 향기, 주요성분들이 손실된 제품을 개발하는 내용되어 있는바 본 발명과는 기술적 분야를 달리한다.
본 발명은 산사열매에 함유된 혈당강하, 면역활성, 유방암세포억제 등의 기능성성분을 착즙한 산사착즙액에 과당, 정백당, 솔비톨, 오렌지농축액, 파인애플농축액, 구연산나트륨, 사과향을 첨가하여 기능성 산사음료를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 산사음료 제조공정도이다.
본 발명의 산사음료의 제조방법은
산사열매를 세척하여 이물질을 제거하고 물기를 제거한 후, 분쇄하여 잔사를 제거하고 산사착즙액을 얻는 단계와,
상기의 산사착즙액 35-45w%에 부재료를 첨가하여 반응기에서 40℃ 이하에서 30분∼1시간 동안 균일하게 교반한 후 여과하여 용기에 충진하는 단계와,
산사음료를 80∼90℃에서 20∼40분간 살균하여 냉각한 후 저장하는 단계를 포함한다.
상기에서 부재료는 공지의 식품첨가물이면 어느 것을 사용하여도 좋으나 보다 좋게는 과당 10w%, 정백당 2w%, 솔비톨1w%, 오렌지농축액 1w%, 파인애플농축액 1w%, 구연산나트륨 0.1w%, 사과향 0.05w%, 정제수 39.85∼49.85w% 사용한다.
본 발명에서 다양한 온도 및 시간으로 실험한바 산사착즙액과 부재료를 첨가시 40℃ 이하에서 30분∼1시간 동안 균일하게 교반하고, 산사음료를 80∼90℃에서 20∼40분간 살균한 것이 기호도가 좋은 산사음료를 제조할 수 있었다.
이하 본 발명을 다음의 실시예 및 비교예에 의하여 설명하고자 한다. 그러나 이들이 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니다.
＜실시예 1＞
산사열매 100g을 정제수로 세척하여 이물질을 제거하고 물기를 제거한 후, 고속회전 마쇄기로 분쇄하여 잔사를 제거하고 산사착즙액 50g을 얻었다.
상기의 산사착즙액 35w%에 부재료로 과당 10w%, 정백당 2w%, 솔비톨 1w%, 오렌지농축액 1w%, 파인애플농축액 1w%, 구연산나트륨 0.1w%, 사과향 0.05w%, 정제수 49.85w%를 첨가하고 40℃ 이하에서 30분∼1시간 동안 균일하게 교반하여 혼합물을 완전히 용해시킨 후, 미세여과기로 여과하여 용기에 충진하고 80℃에서 30분간 후 살균하여 냉각저장하였다.
＜실시예 2＞
산사열매 100g을 정제수로 세척하여 이물질을 제거하고 물기를 제거한 후, 고속회전 마쇄기로 분쇄하여 잔사를 제거하고 산사착즙액 50g을 얻었다.
상기의 산사착즙액 40w%에 부재료로 과당 10w%, 정백당 2w%, 솔비톨 1w%, 오렌지농축액 1w%, 파인애플농축액 1w%, 구연산나트륨 0.1w%, 사과향 0.05w%, 정제수 44.85w%를 첨가하고 40℃ 이하에서 30분∼1시간 동안 균일하게 교반하여 혼합물을 완전히 용해시킨 후, 미세여과기로 여과하여 용기에 충진하고 80℃에서 30분간 후 살균하여 냉각저장하였다.
＜실시예 3＞
산사열매 100g을 정제수로 세척하여 이물질을 제거하고 물기를 제거한 후,고속회전 마쇄기로 분쇄하여 잔사를 제거하고 산사착즙액 50g을 얻었다.
상기의 산사착즙액 45w%에 부재료로 과당 10w%, 정백당 2w%, 솔비톨 1w%, 오렌지농축액 1w%, 파인애플농축액 1w%, 구연산나트륨 0.1w%, 사과향 0.05w%, 정제수 39.85w%를 첨가하고 40℃ 이하에서 30분∼1시간 동안 균일하게 교반하여 혼합물을 완전히 용해시킨 후, 미세여과기로 여과하여 용기에 충진하고 80℃에서 30분간 후 살균하여 냉각저장하였다.
＜시험예 1＞
산사음료 제조시 산사착즙액 35wt%, 40wt%, 45wt% 첨가한 실시예 1 내지 실시예 3의 방법으로 제조한 산사음료의 브릭스(Brix), pH, 탁도, 색도 및 관능검사 등의 품질특성을 측정하였다.
브릭스(Brix), pH, 탁도, 색도 등의 품질특성을 통상적으로 식품 또는 음료의 품질특성을 측정하는 공지의 방법을 이용하여 측정하였으며, 색, 향, 맛 및 종합적인 기호도는 30인의 식품관련 관능검사 요원(남 15명, 여 15명)으로 하여금 측정하여 그 결과를 5점 척도법으로 표 2에 나타내었다.
표 2. 산사 음료의 품질특성
| 구분 | Brix | pH | 탁도 | 색 도 | 관능검사(5점 척도법) | |||||
| L | a | b | 색 | 향 | 맛 | 종합 | ||||
| 실시예 1 | 14.4 | 4.43 | 0.41 | 87.62 | -3.55 | 19.19 | 3.4 | 3.4 | 3.5 | 3.43 |
| 실시예 2 | 14.7 | 4.45 | 0.41 | 87.60 | -3.62 | 19.01 | 3.4 | 3.5 | 3.5 | 3.46 |
| 실시예 3 | 14.8 | 4.45 | 0.42 | 87.51 | -3.83 | 18.82 | 3.4 | 3.5 | 3.4 | 3.43 |
실시예 1 내지 실시예 3과 같이 산사착즙액의 첨가비율을 달리하여 음료를 제조한 결과, 산사착즙액의 첨가비율과 관계없이 Brix, pH, 탁도, 색도 등은 큰 차이를 나타내지 않았으나 관능검사결과에서 산사착즙액 40wt% 첨가한 실시예 2의 산사음료가 가장 우수한 것으로 나타났다.
＜시험예 2＞; 산사음료의 기능성검정
상기의 관능검사에서 양호한 결과를 보인 산사착즙액 40%를 첨가하여 제조한 산사음료의 혈당강하, 면역활성, 유방암세포억제 등의 기능성 검정을 후술하는 시험예 3에 기재한 방법에 의하여 측정하고 그 결과를 아래의 표 3에 나타냈다.
표 3. 산사 음료의 기능성 검정 결과(%/㎍/㎖)
| 산사착즙액 40wt% 함유음료 | 혈당강하 | 면역활성 | 유방암(MCF7)세포억제 |
| 활 성 | 53 | 125 | 58 |
산사음료의 기능성 검정결과, 혈당강하 측정에서 53%, 면역활성 125%, 유방암세포억제 58% 등의 효과가 있는 것으로 나타나 향후 기능성 음료로서의 상품화가 유력시 되는 것으로 나타났다.
＜시험예 3＞ : 기능성 검정
산사열매 추출물 및 산사잎 추출물의 기능성은 항암, 세포독성, 항 돌연변이, 혈당강하, 고혈압 저해, 간기능개선, 면역활성, 항산화, 항균 등을 검정하였다.
1) 항암 활성
(1) 세포 주 및 배지조성
산사열매 추출물의 항암 활성에 이용된 세포주는 암세포로 인간 간암세포인 Hep3B(hepatocellular carcinoma, human), 인간 폐암세포인 A549(Lung carcinoma, human), 인간 유방암세포인 MCF7(brest adenocarcinoma, pleural effusion, human)을 사용하였고 시료 자체의 세포 독성을 알아 보기 위한 정상세포로는 인간 정상 간세포인 WRL68(Human embryo liver)을 사용하였다.
실험에 사용된 세포들 중 Hep3B, MCF7, WRL68은 DMEM배지를 A549는 RPMI 1640배지에서 10% heating-inactivated FBS(fetal bovin serum)으로 적응시켜 배양하였다.
(2) SRB assay
SRB(sulforhodamine B)assay는 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 실험 대상 세포인 WRL68, Hep3B, MCF7(10% FBS, DMEM 배지)과 A549(10% FBS, RPMI 1640 배지)의 농도를 4∼5×104cell/㎖으로 96 well plate의 각 well에 100㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO2)한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0㎎/㎖로 100㎕씩 첨가하여 48시간 배양하였다.
배양이 완료된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10%(w/v)TCA(trichloroacetic acid) 100㎕를 가하여 4℃에서 1시간동안 방치한 후 증류수로 4∼5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1%(v/v) acetic acid에 녹인 0.4%(w/v) SRB용액을 100㎕씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다.
결합되지 않은 SRB 염색액은 1% acetic acid로 4∼5회 정도 세척, 건조시킨 후에 10mM Tris buffer 100㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
산사를 가공식품으로 개발하기 위해 인체에 대한 안전성검사의 일환으로 인간의 정상 간세포인 WRL-68을 이용한 세포독성 측정 결과세포생육이 60%이상 유지되어 인체에 대한 세포독성은 전혀 없는 것으로 나타났다(표 4 참조).
표 4. 정상세포 독성 및 암 유발 관련 기능성
| 시료 | 용매 | WRL68(정상간세포) | |||||
| 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 3.82 | 6.48 | 9.92 | 18.32 | 21.75 |
| EtOH | 12.98 | 45.26 | 18.70 | 20.22 | 24.43 | ||
| 잎 | DH2O | 4.77 | 16.28 | 20.78 | 24.31 | 27.46 | |
| EtOH | 8.67 | 15.36 | 19.59 | 21.44 | 33.69 | ||
| 효과기준 | 50% 이하 | ||||||
| 검정방법 | SRB assay |
산사의 암세포 생육 억제능을 측정한 결과, 인간 간암세포(Hep3B)에 대해서는 대부분 에탄올 추출물이 증류수 추출물보다, 잎 보다는 열매추출물에서 억제활성이 더 높게 나타났으며, 간암세포의 경우 전체적으로 20∼70%의 억제율을 나타내었고 특히 산사의 경우 최고농도에서 두 가지 추출물 모두 65% 이상의 좋은 억제율을 나타내었다(표 5 참조). 이러한 결과는 유방암세포에서는 더욱 현저하게 나타났으며(표 6 참조), 폐암세포에 대한 실험에서도 거의 비슷한 억제율과 경향을 나타내었다(표 7 참조). 특히 유방암세포에 대해 산사 잎, 열매의 증류수 추출물은 80%이상의 높은 활성을 보여 앞으로 항암물질의 탐색도 유효할 것으로 사료된다.
표 5. 간암세포(%/mg/ml)
| 시료 | 용매 | Hep3B(인간간암세포) | |||||
| 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 19.2 | 28.39 | 39.17 | 45.25 | 65.10 |
| EtOH | 13.47 | 20.31 | 48.27 | 55.17 | 69.51 | ||
| 잎 | DH2O | 19.16 | 32.23 | 41.21 | 55.07 | 64.27 | |
| EtOH | 16.45 | 24.49 | 55.70 | 75.37 | 84.14 | ||
| 효과기준 | 50% 이상 | ||||||
| 검정방법 | SRB assay |
표 6. 유방암세포(%/mg/ml)
| 시료 | 용매 | MCF-7(인간유방암세포) | |||||
| 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 17 | 23 | 37 | 48 | 52 |
| EtOH | 22 | 31 | 42 | 55 | 64 | ||
| 잎 | DH2O | 22 | 44 | 54 | 69 | 75 | |
| EtOH | 25 | 39 | 50 | 68 | 78 | ||
| 효과기준 | 50% 이상 | ||||||
| 검정방법 | SRB assay |
표 7. 폐암세포(%/mg/ml)
| 시료 | 용매 | A549(인간폐암세포) | |||||
| 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 17 | 23 | 37 | 48 | 52 |
| EtOH | 22 | 31 | 42 | 55 | 64 | ||
| 잎 | DH2O | 22 | 44 | 54 | 69 | 75 | |
| EtOH | 25 | 39 | 50 | 68 | 78 | ||
| 효과기준 | 50% 이하 | ||||||
| 검정방법 | SRB assay |
2) 항돌연변이원성
(1) Rec-assay
a) 균주 및 전처리
항돌연변이원성에 사용된 균주는 Franca Zani 박사(Italy)으로부터 분양 받은Bacillus subtilisPB 1652 rec+(repair proficient)와 PB 1791 rec-(repair deficient)이며 동결건조된 이 균주를 Clean bench에서 메스를 이용하여 nutrient agar를 고화 시킨 petri-dish에 접종시킨 후 24∼48시간 배양을 하였다. 배양이 완료되면 멸균된 TSB 액체 배지에 1백금이 취하여 37℃에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다.
b) Spore agar plate 조제 및 실험 방법
배양이 완료된 0.1㎖ spore 액이 첨가된 soft broth agar 10㎖를 petri -dish에 분주하여 고화시킨 후 paper disc를 올려놓고 각 추출물은 20㎕씩, 대조구인 MNNG는 10㎕ 접종하고 37℃에서 12∼24시간 배양한 후 Inhibition zone을 측정하였다.
c) 돌연변이원성 측정
무균 상태인 clean-bench하에서 여러 돌연변이원성 물질 중 강한 돌연변이원 물질인 MNNG(2㎍/㎕)를 돌연변이원성(DNA-damaging activity) 대조구로 하여 20㎍/paper disc의 양으로 멸균 처리된 paper disc에 첨가하였고 각 추출물을 4∼100㎍/paper disc가 되도록 첨가하고 rec(+)균과 rec(-)균에 의해 형성된 Inhibition zone(㎝)의 차이로 돌연 변이원성을 측정하였다.
d) 항돌연변이원성 측정
돌연변이원성을 확인한 후에 MNNG(10㎍/p.disc)와 추출물(50, 100㎍/p.disc)을 1 : 1 (10㎕:10㎕)로 혼합하여 돌연변이원성 측정과 같은 방법으로 배양한 후 각기 형성된 Inhibition zone을 비교하여 각 추출물이 돌연변이원 물질인 MNNG의 돌연변이원성을 어느 정도 억제하는가를 rec(+)균과 rec(-)균의 difference zone(㎝)과 difference ratio (sample + MNNG / MNNG)로 나타내었다. 대조구는 MNNG만 처리한 것으로 하였다.
산사의 돌연변이 유발 실험 결과, clear zone이 생성되지 않은 것을 확인함으로서 산사는 자체 돌연변이원성이 없는 것으로 판단되었다(표 8 참조).
산사의 추출물(50, 100㎍/paper disc)과 MNNG(10㎍/paper disc)를 1:1로 혼합하여 추출물 농도에 따른 돌연변이원 억제 효과를 실험하였다. 대조구인 MNNG(20㎍/paper disc)에 비해 MNNG와 추출물이 1:1로 혼합된 것이 비교적 높은 항돌연변이원성을 보였다. 대조구로 쓰인 강력한 돌연변이원성 물질인 MNNG를 기준으로 나머지 추출물의 항돌연변이원성을 측정한 결과 산사는 약 40% 정도의 억제율을 보였다. 이러한 항돌연변이원성은 산사의 추출물들이 MNNG와 균주의 DNA나 RNA와의 결합을 어느 정도 억제함으로서 항돌연변이원성을 지닌다고 추론할 수 있다(표 9 참조).
표 8. DNA-손상으로 인한 돌연변이 유발
| 시료 | amount test(㎍/disk) | Inhibition halodiameter | DNA-damaging activity(rec-/rec+) | |||
| rec+ | rec- | |||||
| 산사 | 열매 | DH2O | 50 | 0.8 | 0.8 | 1 |
| 10 | 0.8 | 0.8 | 1 | |||
| EtOH | 50 | 0.8 | 0.8 | 1 | ||
| 100 | 0.8 | 0.8 | 1 | |||
| 잎 | DH2O | 50 | 0.8 | 0.8 | 1 | |
| 100 | 0.8 | 0.8 | 1 | |||
| EtOH | 50 | 0.8 | 0.8 | 1 | ||
| 100 | 0.8 | 0.8 | 1 | |||
| MNNG | 20 | 1.23 | 3.02 | 2.45 | ||
| 안정성 및 효과기준 | 1 이하 | |||||
| 검정방법 | Rec assay |
표 9. 항돌연변이원성
| 시료 | amounttest(㎍/disk) | Inhibition halodiameter(cm) | differnce zone(cm) | differnce ratio(sample/MNNG) | |||
| rec+ | rec- | ||||||
| 산사 | 잎 | DH2O | 50 | 1.0 | 2.4 | 1.4 | 0.83 |
| 100 | 1.0 | 2.3 | 1.3 | 0.77 | |||
| EtOH | 50 | 1.0 | 2.2 | 1.2 | 0.71 | ||
| 100 | 1.0 | 2.0 | 1.0 | 0.60 | |||
| 열매 | DH2O | 50 | 1.0 | 2.0 | 1.0 | 0.60 | |
| 100 | 1.0 | 2.0 | 1.0 | 0.60 | |||
| EtOH | 50 | 1.0 | 2.2 | 1.2 | 0.71 | ||
| 100 | 1.0 | 2.2 | 1.2 | 0.71 | |||
| MNNG | 10 | 1.25 | 2.72 | 1.67 | 1 | ||
| 효과기준 | 0.55 이상 | ||||||
| 검정방법 | Rec assay |
3) 혈당 강하 기능 측정
생체 내에서 혈당 상승의 결정적인 역할을 하는 알파-글루코시다제(α-glucosidase)를 이용하여 실험을 수행하였다. 먼저 효소를 10mM PIPES buffer에 용해시켜 효소액을 제조하고 20mM maltose와 각 추출물을 각각 10㎕, 40㎕, 10㎕를 혼합하여 최종 부피를 60㎕로 각 추출물을 농도별로 혼합한 후 37℃에서 20분간 배양한다. 반응액 60㎕에 1㎖ DNS 시약을 첨가하고 100℃ 물에서 열탕 처리(10min)하여 반응을 정지시킨 후에 540nm에서 흡광도를 측정하여 효소 반응으로 생성된 환원당을 정량하여 각 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 효소활성 저해율을 계산하였다.
알파-글루코시다제는 생체 내 혈당 상승에 결정적인 역할을 수행할 뿐만 아니라 다양한 생체내 불균형(metabolic disorder)과 당뇨병, 여과성 병원체의 결부(viral attachment), 박테리아 감염(bacterial infection), 암 생성(cancer formation)에 관여한다. 본 실험에서는 기질(maltose)에 산사추출물들을 첨가해서 추출물에 의한 효소활성 억제율을 검색 한 것으로 그 결과, 산사의 잎, 열매 두 가지 추출물의 1.0mg/ml의 농도에서 각각 75%, 78%의 높은 활성을 보였였다(표 10 참조). 이상의 결과를 보면, 산사의 추출물은 당뇨 조절을 위한 기능성 식품으로의 활용가능성이 매우 클것으로 판단된다.
표 10. α-glucosidase(혈당강하) 효과(%/mg/ml)
| 시료 | 용매 | 농도 | |||||
| 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 24 | 29 | 52 | 62 | 69 |
| EtOH | 31 | 36 | 42 | 69 | 75 | ||
| 잎 | DH2O | 39 | 48 | 59 | 68 | 78 | |
| EtOH | 34 | 42 | 53 | 66 | 72 | ||
| 효과기준 | 50% 이상 | ||||||
| 검정방법 | α-glucosidase 효소 활성억제 |
4) 고혈압 저해능 측정
ACE(angiotensin converting enzyme)는 고혈압을 유도하는 효소이므로 이 효소의 억제 활성을 측정하기 위해 ACE reagent를 사용했다. 실험 전에 모든 반응물을 37℃로 유지시켜 놓은 후 37℃ 증류수 10㎖에 ACE reagent one vial을 용해시키고 1㎖씩 취하여 effendorf tube에 넣었다. 각 effendorf tube 에 농도별 추출물과 ACE calibrator를 100㎕씩 첨가한 후 37℃에서 5분간 반응시켜 340nm에서 흡광도를 측정하여 이것을 초기 A 값으로 정하고 다시 5분이 지난 후 측정한 흡광도를 최종 A라 정하였다. 대조구로는 추출물 대신 증류수 100㎕를 첨가한 것으로 하였다. Control의 ACE(U/L) 값은 아무 것도 첨가하지 않았을 때의 흡광도 변화를 측정한 것으로 하였으며 ACE의 활성 계산은 다음 공식에 준하여 산출하였다.
ACE(U/L) = (Initial A - Final A)test/ (Initial A - Final A)control×
active of ACE reagent (50U/L)
생체 내에서 혈압 상승의 주요 기작은 레닌 안지오텐신 시스템(renin angiotensin system)이 주요 역할을 하는데 안지오텐신(Ⅰ)(angiotensin(Ⅰ))의 히스티딜루신 디펩티드(histidylleucine dipeptide)를 분해하여 강력한 혈관 수축 작용을 일으키는 vasocontrictor인 안지오텐신(Ⅱ)(angiotensin(Ⅱ))로 전환을 유도하는 효소이고 안지오텐신(Ⅱ)는 신체 내에서 알도스테린(aldosterine)의 분비를 촉진함으로써 물과 소디움(sodium)의 배설을 억제하며 혈관 이완작용을 가진 브래디키닌(bradykinin)을 불활성화 시킴으로 결과적으로 혈압을 상승시키는 역할을 한다.
따라서 직접적으로 ACE를 억제하면 고혈압의 치료가능성이 제시 될 수 있다고 볼 수 있고 실제로 정상인에게도 현저한 혈압 강하 작용이 밝혀졌다.
본 실험에서는 ACE가 FAPGG를 FAP와 GG로 분해시키는 원리를 이용한 것으로 산사 잎, 열매 추출물의 1.0mg/ml의 농도에서 50%이상의 높은 효소활성 억제율을 보였으나 나머지 시료의 경우는 30% 이하의 낮은 억제 활성을 보였다(표 11 참조).
표 11. 고혈압 조절능(ACE)(%/mg/ml)
| 시료 | 용매 | 농도 | |||||
| 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 26 | 29 | 35 | 49 | 59 |
| EtOH | 24 | 37 | 42 | 51 | 63 | ||
| 잎 | DH2O | 16 | 23 | 38 | 46 | 52 | |
| EtOH | 20 | 28 | 39 | 52 | 62 | ||
| 효과기준 | 50% 이상 | ||||||
| 검정방법 | ACE system |
5) 간 기능 개선 활성 측정
(1) 해독작용 - Glutathione S-transferase 측정
시료의 해독작용 정도를 측정하기 위하여 간의 중요 해독기전 중의 하나인GST(gultathion-S-transferase)의 활성을 측정하였다. 조제된 반응시약에 대조구로 추출물이 제외된 반응액을 대조구로 하였으며, 각 추출물을 농도별로 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 기질로서 1-chloro-2, 4dinitro benzene을 첨가한 후 다시 37℃에서 2분간 반응시켰다. 반응후 20% TCA를 가하여 반응을 종결시키고 원심분리한 후 상등액을 340nm에서 흡광도를 측정한 뒤 다음과 같이 GST의 specific activity와 활성율을 계산하였다.
Total activity (units) = (A340/ 9.6) × 희석배수 × (3ml / 0.1) ×
crude extract(㎖)
Specific activity ( units/㎖ protein ) = total activity / total protein
활성율 (%) = specific activitytest/ specific activitycontrol× 100
GST는 환원 글루타치온(reduced glutathione)에 다양한 친전자체를 결합시키는 반응을 촉매하는 주요 해독기전으로 많은 연구가 이루어 졌으며, 다양한 발암원들이 대부분 친전자체이므로 이들 발암물질을 해독하는 경로도 중요하게 여겨진다.
따라서 GST의 활성 측정은 화학적 발암원을 해독하거나 불활성화 시킬 수 있는 약재나 천연물질 규명에 이용될 수 있다. 본 실험의 결과는 산사잎 에탄올 추출물 1.0mg/ml의 농도가 136%로 가장 높은 것으로 나타났다(표 12 참조).
표 12. 간해독능력 : Glutathione S transferase 활성능(%/mg/ml)
| 시료 | 용매 | 농도 | ||
| 0.4 | 1.0 | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 110 | 111 |
| EtOH | 105 | 111 | ||
| 잎 | DH2O | 112 | 124 | |
| EtOH | 119 | 136 | ||
| 효과기준 | 100% 이상 | |||
| 검정방법 | GST 활성 |
6) 면역 활성 측정
면역이란 우리 몸의 내, 외부로부터의 자극 및 손상에 대항하는 방어기작을 총칭한다. 면역활성의 측정은 면역물질의 측정, 면역세포의 생육도 측정 등을 통하여 이루어지는데 면역 세포의 증가 및 감소는 우리 몸 면역계의 이상을 실질적으로 나타내주는 지표라 할 수 있을 것이다.
실험 면역 세포주 : Raji(RPM1-1640 medium)을 seeding하여 세포 정상 생육기에 도달(7일정도 소요)시킨 후 96-well Plate(5×104Cell/㎖로 농도 조절한 배지 100㎕/well)를 37℃에서 5% CO2상태로 24시간 incubation하고 각 농도로 100㎕의 sample을 투여한 후 37℃에서 5% CO2상태로 48시간 incubation한 후 상등액을 제거하고 차가운 10%(w/v) TCA(trichloroacetic acid) 100㎕를 가하여 4℃에서 1시간동안 방치한 후 증류수로 4∼5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1%(v/v) acetic acid에 녹인 0.4%(w/v) SRB용액을 100㎕씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 SRB 염색액은 1% acetic acid로 4∼5회 정도 세척, 건조시킨 후에 10mM Tris buffer 100㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
암세포 생육도(%) = test/control × 100
면역세포인 Raji의 생육을 증가시키는 정도를 측정하는 것이므로 세포생육이 증가함에 해당식품이 면역력을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 면역 기능 증강 효과는 인간 면역 세포인 B cell(Raji)을 이용하여 검증하였다. 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역 기능 증강 효과는 SRB assay를 사용하여 측정하였다.
인간 면역체계에서 항체 생성의 중요한 역할을 하는 human B세포(Raji)로 SRB assay를 이용하여 실험한 결과, Raji의 생육은 모든 시료에서 첨가 농도에 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 특히 산사 열매의 물, 에탄올 추출물이 160%이상의 높은 활성을 보였다(표 13 참조).
표 13. 면역활성(%/mg/ml)
| 시료 | 용매 | Raji cell(인간B-임파세포) | |||||
| 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 116 | 141 | 157 | 164 | 172 |
| EtOH | 105 | 133 | 143 | 154 | 162 | ||
| 잎 | DH2O | 114 | 122 | 124 | 132 | 136 | |
| EtOH | 110 | 121 | 132 | 135 | 141 | ||
| 효과기준 | 100% 이하 | ||||||
| 검정방법 | SRB assay |
7) 항산화 활성 측정
산화는 우리체 내에서 세포막 내 손상을 일으키고 노화를 촉진하며 발암이나성인병 등과도 밀접한 관련을 갖고 있다. 노화 및 성인병 예방의 측면에서 항산화 활성 물질이 요구되어지며 산화 억제 물질에 대한 검색으로 4.5×10-3리놀레닉산(linolenic acid) 수용액 5㎖에 샘플(sample) 0.5㎖를 넣어서 50℃에서 인큐베이션(incubation) 시키면서 마개 달린 test tube에 1.1㎖씩 4일마다 채취하여 TCA, TBA, BHT, SDS 각각 1, 2, 0.1, 1㎖ 혼합한 후 N2gas를 취입하고 밀봉한 후 비등 수욕조에서 15분간 인큐베이션(incubation)하고 방냉시킨 후 1㎖ 아세틱산(acetic acid)과 2㎖ 클로로포름(chloroform)을 혼합 진탕후 2,500rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 532nm에서 흡광도를 측정한다. 리놀레닉산는 필수 지방산이며 다가 불포화 지방산으로 산화되기 쉽다. 그러한 리놀레닉산에 대한 항산화성을 나타내는 해당식품은 노화 방지 및 성인병 예방에 효과적임을 시사한다.
산화억제물질에 대한 검색은 TBA법으로 측정하였다.
본 실험에 사용된 산사 추출물들은 산사 잎, 열매 에탄올 추출물이 최대 62%의 항산화 효과를 보이고 있는데 산사의 이러한 항산화능은 식물을 원료로서 식품을 제조할 경우 체내에서 필요한 식품내 필수지방산의 산화 억제로 식품의 안정성 연장 및 흡수 시 체내 활성라디탈의 소거 등의 작용으로 노화억제 및 체내 산화작용으로 발생하는 성인병 등의 예방에 효과적일 것이다(표 14 참조).
표 14. 항산화 활성(TBA법)(%/mg/ml)
| 시료 | 용매 | 농도 | |||||
| 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 14 | 29 | 45 | 51 | 56 |
| EtOH | 21 | 33 | 43 | 54 | 62 | ||
| 잎 | DH2O | 26 | 38 | 46 | 52 | 58 | |
| EtOH | 30 | 42 | 56 | 59 | 62 | ||
| 효과기준 | 50% 이하 | ||||||
| 검정방법 | TBA method |
8) 항균 활성 측정
1) 항균력 검색
* 공시균주 : Gram positive bacteria(Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, Staphylocoocus aureus),Gram negative bacteria(Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa)
* 배지 : Tryptic soy broth and agar
* 검색방법 : paper disc, bioscreen C로 항균력 검색은 TSB배지를 121℃에서 15분간 살균한 후 냉각하여 무균적으로 petri-dish에 15ml씩 분주하여 무균상에서 하룻밤 방치하여 굳힌 후 준비된 피검균 배양액 0.1ml를 평판배지에 주입하여 균일하게 도포한다. 각 시료를 멸균된 8.0mm filter paper disc(Whatman No.2)에 농도별로 흡수시킨 후 시험용 평판배지에 올려놓고 난 다음, 30℃의 인큐베이터에서 24-48시간 배양하면서 disc주변의 clear zone(mm)을 측정하여 항균력 조사한다. 최소저해농도 측정은 각 시료를 0.45㎛의 membrane filter(Whatman No.2)로 제균하고 농도별로 멸균한 broth에 첨가한다. 전배양된 각 균의 농도를 105CFU/㎖되도록 접종하여 bioscreen C로 35℃에서 24시간 배양하면서 피검균의 생육을 O.D값으로 측정한다.
항균력을 시료에 대한 paper disc방법으로 실험한 결과 항균력이 없는 것으로 나타났다(표 15 참조). Bio screen C방법을 이용한 최소저해농도 실험 결과, 산사열매의 에탄올 추출물이 일부 균주(BC, SA, PA)에 대해 저해를 보인 것을 제외하고는 나머지 균주에 대해서는 저해력을 나타내지 않았다(표 16 참조).
표 15. 항균력(mm:5mg/disc)
| 시료 | 용매 | 사용균주* | ||||||
| LM | BC | SA | ST | EC | PA | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| EtOH | 0 | 0 | 9 | 0 | 0 | 9 | ||
| 잎 | DH2O | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| EtOH | 0 | 0 | 9 | 0 | 0 | 9 | ||
| 효과기준 | 14 mm 이상 | |||||||
| 검정방법 | Paper disc법 |
* LM :L. monocytogenesATCC 19111 BC :B. cereusKCCM 11204
SA :Staphy. aureusKCCM 32395 ST :S. typhimuriumATCC 14028
EC :E. coliO157:H7 932 PA :Ps. aeruginosaATCC 27853
표 16. 최소저해농도
| 시료 | 용매 | 사용균주* | ||||||
| LM | BC | SA | ST | EC | PA | |||
| 산사 | 열매 | DH2O | + | + | + | + | + | + |
| EtOH | + | + | 5.0 | + | + | 5.0 | ||
| 잎 | DH2O | + | + | + | + | + | + | |
| EtOH | + | + | + | + | + | + | ||
| 효과기준 | 125 mg/ml 이상 | |||||||
| 검정방법 | Bioscreen C법 |
* LM :L. monocytogenesATCC 19111 BC :B. cereusKCCM 11204
SA :Staphy. aureusKCCM 32395 ST :S. typhimuriumATCC 14028
EC :E. coliO157:H7 932 PA :Ps. aeruginosaATCC 27853
본 발명의 산사음료는 기능성을 검정한 결과 산사착즙액 40%를 첨가하여 제조한 음료의 기능성 검정결과, 혈당강하 측정에서 53%, 면역활성 125%, 유방암세포억제 58% 등의 효과가 있는 것으로 나타난 바와 같이 향후 기능성 음료로의 상품화 전망이 매우 많다.
Claims (3)
- 산사열매를 세척하여 이물질을 제거하고 물기를 제거한 후, 분쇄하여 잔사를 제거하고 산사착즙액을 얻는 단계와,상기의 산사착즙액 35-45wt%에 부재료 55-65wt%를 첨가하여 반응기에서 40℃ 이하에서 30분∼1시간 동안 균일하게 교반한 후 여과하여 용기에 충진하는 단계와,산사음료를 80∼90℃에서 20∼40분간 살균하여 냉각한 후 저장하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 산사음료의 제조방법
- 제 1항에 있어서, 부재료는 과당 10w%, 정백당 2w%, 솔비톨1w%, 오렌지농축액 1w%, 파인애플농축액 1w%, 구연산나트륨 0.1w%, 사과향 0.05w%, 정제수 39.85∼49.85w%로 구성되는 것을 특징으로 하는 산사음료의 제조방법
- 특허청구범위 제 1항 또는 제 2항의 방법으로 제조된 산사음료
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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