KR20020089772A

KR20020089772A - 생체 접착제용 폴리에틸렌글리콜 수화젤

Info

Publication number: KR20020089772A
Application number: KR1020010028654A
Authority: KR
Inventors: 노광; 박민구; 이혁종; 현창민; 이은정; 이재승; 김윤하; 김근수; 이지원; 이정훈
Original assignee: 선바이오(주)
Priority date: 2001-05-24
Filing date: 2001-05-24
Publication date: 2002-11-30
Also published as: KR100444944B1

Abstract

본 발명은 생체 친화적인 고분자로 이루어진 수화젤에 관한 것으로, 아민기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 폴리머와, 아민기와 반응하여 펩티드 결합을 형성할 수 있는 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 폴리머를 1:10 내지 10:1의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 접착제용 수화젤 제조용 조성물 및 이를 이용한 수화젤의 제조 방법에 따르면, 종래의 천연 생체 고분자들을 이용하는 경우에 발생하기 쉬운 결합 강도 저하나 감염 위험 등의 문제를 발생시키는 일 없이, 수술시 봉합용 생체 접착제, 출혈 방지제, 화상 드레싱 등 의학적으로 유용하게 사용할 수 있는 폴리에틸렌글리콜 수화젤을 제공할 수 있다.

Description

생체 접착제용 폴리에틸렌글리콜 수화젤{POLYETHYLENE GLYCOL HYDROGEL FOR BIOADHESIVE}

본 발명은 생체 친화적인 고분자로 이루어진 수화젤에 관한 것으로, 상세하게는 폴리에틸렌글리콜 폴리머 간의 결합에 의해 화학 합성 물질만으로 이루어진 수화젤(hydrogel)을 제공함으로써 수술시 봉합용 생체 접착제(bioadhesive), 출혈 방지제, 화상 드레싱(burn/wound dressing) 등 의학적으로 유용하게 사용하도록 하는 것이다.

수화젤(hydrogel)은 수용액에서 팽윤하지만 용해되지는 않는 천연 혹은 합성 폴리머의 구조물로 정의된다. 수화젤에서는 폴리머 뼈대의 친수성 기능기로 인해 물을 흡수할 수는 있으나, 구조물 내 잔기 간의 교차결합으로 인해 물에 용해되지는 않는다. 천연 폴리머로는 교차 결합된 덱스트란(dextran), 콜라겐(collagen), 알부민(albumin) 및 키토산(chitosan) 등이 사용되며, 합성 폴리머로는 폴리메타크릴레이트[poly(methacrylate)], 폴리아크릴아마이드[poly(acrylamide)], 폴리비닐피롤리돈[poly(N-vinyl pyrrolidone)], 폴리에틸렌글리콜[poly(ethyleneglycol);PEG, H-(-OCH₂CH₂-)n-OH] 및 폴리비닐알콜[poly(vinyl alcohol)] 등이 사용된다. 수화젤로서 합성 폴리머를 사용할 경우에는, 천연 폴리머를 동물로부터 순수 분리해내는 과정 중에 발생할 수 있는 바이러스나 프리온(prion) 등의 감염 문제를 배제할 수 있다는 장점이 있다.

수화젤은 생의학(biomedical) 분야에 적용될 수 있는 많은 장점들을 갖는다. 즉, 수화젤은 수용액을 흡수하고 내포할 수 있어 생체조직과 유사하며 산소, 영양분, 대사물질 같은 저분자 물질들에 대해 투과성을 가진다. 또한, 팽윤된 수화젤의 표면구조는 부드러워서 생체 내에서 주위의 세포나 조직들에 대하여 마찰로 인한 자극을 줄일 수 있으며, 수용성 용매와의 계면장력이 낮아서 단백질 흡착과 변성을 감소시킬 수 있다.

이밖에도 의학 분야에서 수화젤의 응용분야는 광범위하여, 카테터(catheter)와 봉합사(suture) 같은 수술 도구의 피복 물질, 혈액 투석막, 화상 드레싱, 출혈 방지제, 인공 연골, 인공 심장 판막 등에 사용할 수 있으며, 또한 용질 투과성이 높아서 약물 송달체로 이용되기도 한다(A. M. Mathuret al., Methods for synthesis of hydrogel networks: A Review.Rev. Macromol. Chem. Phys., C36(2),405-430(1996)).

한편, 생체 접착제(bioadhesive)는 수술시 조직을 봉합하거나 출혈 방지제로 사용되는 것으로, 이상적인 생체 접착제의 조건은 조직에 대한 적당한 결합 강도를 가질 것, 조직에 용이하게 결합하기 위하여 점성이 있어야 할 것, 그리고 독성이없으며 생체 내에서 생체 친화적이어야 한다는 것이다. 생체 접착제의 구성성분으로는 피브린(fibrin), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 알부민(albumin), PEG 등이 사용된다. 피브린 성분은 결합 강도가 낮고 점성이 낮을 뿐 아니라, 인간 혈액에서 분리하기 때문에 감염의 위험이 존재한다.

미국특허 제5,209,776호(1993. 5. 11)에서는, 수술후 조직을 봉합하거나 조직 및 보철물을 피복 하는데 알부민과 PEG 등, 두 가지 성분으로 구성된 생체 접착제를 사용하는 시도를 하였다. 첫 번째 성분은 천연 또는 합성 펩티드(peptide)로서 변형, 교차결합, 절단 또는 단축된 변형체나 유도체로 알부민, 알파-글로불린(α-globulin), 베타-글로불린(β-globulin), 감마-글로불린(γ-globulin), 트롬빈 (thrombin), 콜라겐, 케라틴(keratin), 피브리노젠(fibrinogen), 피브로인 (fibroin), 피브린 및 피브로넥틴(fibronectin) 등이 사용될 수 있고, 두 번째 성분은 첫 번째 성분과 결합해서 매트릭스(matrix), 졸(sol) 또는 젤(gel)을 형성할 수 있는 성분으로 PEG, 히아루론산(hyaluronic acid), 헤파린(heparin), 콜라겐, 프럭토우즈(fructose), 덱스트란(dextran), 아가로우즈(agarose), 알긴산(alginic acid), 펙틴(pectin), 메틸 셀룰로우즈(methylcellulose), 하이드록시 셀룰로우즈 (hydroxycellulose), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 폴리비닐알콜 (polyvinyl alcohol) 등이 사용될 수 있는 것으로 기술하고 있다. 각 성분의 농도는 결합 강도와 점성 등을 고려하여 사용되는데, 첫 번째 성분의 농도는 총 중량의 8∼35 % 범위 내에서 사용되고, 두 번째 성분의 농도는 0.1∼90 %의 넓은 범위에서 사용되었다. 실시예에서는 25 %의 알부민과 10 ㎎/㎖ 농도의 히아루론산 등의 혼합물을 사용하여 상대점도 7(물; 1, 젤; 10)인 생체 접착제를 제조하고 있다.

미국특허 제5,578,310호(1996. 11. 26)에서는 피부와 점막 표면에 사용할 수 있는 국소용 생체 접착제 연고에 PEG 등의 성분을 사용하고 있다. 주성분은 PEG, 비이온성 계면활성제(non-ionic surfactant), 하이드록시프로필메틸 셀룰로우즈 (hydroxypropylmethyl cellulose), 미네랄 오일 등이다. 실시예에서는 분자량 8,000의 PEG를 35∼40 % 농도로 사용하고, 비이온성 계면활성제는 안정한 수용성 유탁액(emulsion)을 만들기 위해 0.7 % 첨가되고, 하이드록시프로필메틸 셀룰로우즈는 22∼35 % 농도로 사용되었으며, 입자 크기는 20∼400 마이크론(micron)이었다. 미네랄 오일은 28∼37 % 농도로 첨가되었으며, 이밖에도 피부나 점막표면의 상처나 궤양 부위에 적용하기 위해 연고에 TGF-α등의 약리물질들이 포함되었다.

미국특허 제5,714,165호(1998. 2. 3)에서는 구강내 아프타성 궤양(aphthous ulcers) 치료를 위한 것으로, PEG 등을 포함하는 구강내 생체 접착제를 기술하고 있다. 이 생체 접착제의 기본 성분은 분자량 65,000∼70,000인 메틸비닐에테르 (methylvinyl ether) 및 말레산/무수물(maleic acid/anhydride)의 수용성 염 3∼15 %와 70∼90 %의 PEG 혼합물로 이루어진다. PEG는 분자량 400인 PEG 400의 40∼60 %와 분자량 3350인 PEG 3350의 20∼50 % 혼합물을 사용하였다.

미국특허 제5,328,955호(1994. 7. 12)에서는 콜라겐과 친수성, 합성 PEG 폴리머를 공유결합시켜 비면역원성 조성의 생체 의료용 혼합물을 제조하고 있다. 사용된 콜라겐의 농도는 10∼100 ㎎/㎖이고 PEG는 분자량 100∼20,000 범위의 것으로, 두 성분 간의 비율은 콜라겐:PEG가 1:1 또는 1: 20 이었다. 여기에 치료용 약리물질을 콜라겐-PEG 결합물로서 형성시키거나 또는 결합물과 혼합물 형태로 섞은 다음에 사용하고 있다. 사용된 PEG에는 다양한 형태, 특히 직선 구조의 SG-PEG(PEG-succinimidyl glutarate), SS-PEG(PEG-succinimidyl succinate) 및 SC-PEG(PEG-succinimidyl carbonate) 등 활성화된 형태가 포함되었다.

미국특허 제5,858,746호(1999. 1. 12)에서는 생체 접착제로 PEG 테트라아크릴레이트(tetraacrylate, 분자량 18,500) 등의 폴리머들을 사용하였다. 실시예에서는 래트 좌골신경을 절단해서 2∼3 ㎜의 틈을 만든 다음, 광개시제 (photoinitiator)를 포함하는 PEG 테트라아크릴레이트(분자량 18500) 10 % 용액을 가하고 장파장 자외선(365 ㎚)에 10 초간 노출시켜 중합반응을 유발하여 접착하는 것을 개시하고 있다. 이 때, 중합반응 과정에서 자외선의 사용은 조직의 손상을 가져올 수 있어 이를 상쇄하거나 보완할 기작이 필요하다고 언급하고 있다.

이와 같이 종래의 생체 접착제 관련 발명에서는 주로 천연 생체 고분자를 PEG 등의 화학 합성 고분자와 결합시켜 사용하고 있는데, 피브린, 젤라틴, 콜라겐, 알부민과 같은 천연 생체 고분자들은 결합 강도가 낮고 점성이 낮을 뿐 아니라 생체로부터 분리하는 과정에서 바이러스나 프리온 등의 감염 위험이 존재한다는 문제가 있다.

이상에서 언급한 바와 같은 천연 생체 고분자들의 문제점을 고려하여, 본 발명의 목적은 PEG와 PEG 간의 결합에 의해 화학 합성 고분자 만으로 이루어지는 수화젤 제조용 조성물, 및 이를 이용하여 수화젤을 제조하는 방법을 제공함으로써,수술시 봉합용 생체 접착제, 출혈 방지제, 화상 드레싱 등 의학적으로 유용하게 사용할 수 있도록 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 아민기를 갖는 PEG 폴리머와, 아민기와 반응하여 펩티드 결합을 형성할 수 있는 반응기를 갖는 PEG 폴리머를 1:10 내지 10:1의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 접착제용 수화젤 제조용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 아민기를 갖는 PEG 폴리머와, 아민기와 반응하여 펩티드 결합을 형성할 수 있는 반응기를 갖는 PEG 폴리머를 혼합하는 것을 특징으로 하는 생체 접착제용 수화젤의 제조 방법을 제공한다.

여기에서, PEG 폴리머는 분자량이 1,000∼100,000 범위에 있는 것이 바람직하고, 분자량이 10,000∼20,000 범위에 있는 것이 더욱 바람직하다.

이들 각각의 PEG 폴리머는 인산염 완충액 또는 생리식염수 중에 5∼50 중량%의 농도로 하여 pH 7∼11에서 혼합하여 수화젤을 제조할 수 있다.

본 발명에서는, 생체 친화적인 고분자인 PEG 폴리머를 두 가지 이상 사용하여 중성 내지 염기성 수용액 하에서 서로 반응시킴으로써 이들 간의 펩티드 결합을 통해 수화젤 구조를 형성하도록 하였으며, 이를 수술시 봉합용 생체 접착제, 출혈 방지제, 화상 드레싱 등 의학적으로 유용하게 사용할 수 있게 하였다.

이하에서는, 본 발명의 PEG 수화젤의 제조 방법을 더욱 상세히 설명한다.

1. 수화젤을 구성하는 PEG 폴리머의 구조

본 발명의 PEG 수화젤은 2 가지 주요 성분으로 구성되어, 중성 내지 염기성 수용액에서 서로 반응하여 펩티드 결합을 통해 수화젤 구조를 형성하고 있다.

첫 번째 성분은 NHS(N-hydroxy succinimide)를 이탈기로 갖도록 활성화된 폴리머들로서, 아민기와 반응하여 펩티드 결합을 이룰 수 있는 성질을 갖는 PEG이며, 4-arm-PEG-SG(4-arm-polyethylene glycol-succinimidyl glutarate), 펜단트 PEG-SG(pendant polyethylene glycol-succinimidyl glutarate), 4-arm-PEG-SS(4-arm-polyethylene glycol-succinimidyl succinate), 펜단트 PEG-SS(pendant polyethylene glycol-succinimidyl succinate) 등이 이에 속하는데, 이하 PEG A로 통칭한다.

다음은 PEG A를 구성하는 여러 가지 PEG의 구조를 나타낸다. 이들의 분자량 범위는 1,000∼100,000이 바람직하고, 구조 내에서 n 값의 범위는 20∼2,500이 바람직하다. 구조내 중앙의 코아물질(core molecule)은 펜타에리트리톨 (penta-erythritol)로 화학식은 C(CH₂OH)₄이다.

상기 화학식은 4-arm-PEG-SG의 구조를 나타내며, n은 20∼90의 정수인 것이 바람직하다.

상기 화학식은 펜단트 PEG-SG의 구조를 나타내며, n은 100∼2,500의 정수, m은 4∼20의 정수, 그리고 p는 2∼100의 정수인 것이 바람직하다.

상기 화학식은 4-arm-PEG-SS의 구조를 나타내며, n은 20∼90의 정수인 것이 바람직하다.

상기 화학식은 펜단트 PEG-SS의 구조를 나타내며, n은 100∼2,500의 정수, m은 4∼20의 정수, 그리고 p는 2∼100의 정수인 것이 바람직하다.

본 발명의 PEG 수화젤을 형성하는 두 번째 성분은 자유 아민기를 포함하는 PEG로 4-arm-PEG-아민(NH₂)과 펜단트 PEG-아민 등이 이에 속하는데, 이하 PEG B로 통칭한다. 본 PEG B 대신에 천연 폴리머인 알부민과 키토산이 사용될 수도 있다.

다음은 PEG B를 구성하는 여러 가지 PEG의 구조를 나타낸다. 4-arm-PEG-아민은 4개의 각 말단에 하나의 아민기를 포함하며 사용되는 분자량의 범위는 1,000∼100,000이 바람직하다. 구조 내에서 n 값의 범위는 20∼2,500이 바람직하고, 구조내 중앙의 코아물질은 펜타에리트리톨(C(CH₂OH)₄)이다.

상기 화학식은 4-arm-PEG-아민의 구조를 나타내며, n은 20∼90의 정수인 것이 바람직하다.

상기 화학식은 펜단트 PEG-아민의 구조를 나타내며, n은 100∼2,500의 정수, m은 4∼20의 정수, 그리고 p는 2∼100의 정수인 것이 바람직하다. 이 펜단트 PEG-아민은 분자량 5,000∼100,000의 PEG 뼈대에 분자량 약 100∼5,000의 가지(arm)를 결합시켜 5∼20개의 자유아민기를 제공하도록 합성된 PEG 폴리머이다.

2. 수화젤 형성시 결합 반응

본 발명의 PEG 수화젤은 위와 같은 PEG A와 PEG B가 중성 내지 염기성 수용액에서 서로 반응해서 펩티드 결합을 통해 수화젤 구조를 형성한다. PEG A는 반응 그룹으로 NHS를 가져 반응성이 높으며, 중성 내지 염기성 조건 (pH 7∼11) 하에서 PEG B의 아민기(NH^-상태)가 PEG A의 NHS 이탈기 그룹과 PEG 뼈대 간의 결합을 끊고 새로운 펩티드 결합으로 연결된다. PEG A와 PEG B는 중량비로 1:10 내지 10:1의 범위에서 반응할 수 있다. 이 범위를 벗어나도 양자 간의 반응은 가능하지만 수화젤이 형성되는 양이 감소되므로 바람직하지 못하다.

3. 수화젤 형성(gelation)과 형성시간(gelation time)의 조절

본 발명의 PEG 수화젤 형성에 소요되는 시간은 구성 PEG 폴리머들의 농도에비례한다. PEG 폴리머의 농도 범위는 5∼50 %가 바람직한데, 이 농도가 5 % 보다 낮을 경우에는 물성이 졸(sol)에 가깝게 되고, 50 % 보다 높을 경우에는 경도가 높게 되어 물성이 생물질로 사용하기에 적합하지 않다. 기본적인 구성 폴리머들 외에 약리물질 등의 성분을 추가하면 젤 형성 시간이 단축된다는 것이 확인되었는데, 이는 약리물질 등이 첨가됨으로써 폴리머 간의 물리적 거리가 가까워져 단위시간 당 젤 형성 시간이 짧아지게 되기 때문인 것으로 생각된다.

수화젤의 구조는 구성 폴리머의 농도에 의해 조절이 가능하고, 이외에도 구성 폴리머의 분자량에 의해서도 조절이 가능하다. 분자량이 크면 클수록 수화젤의 구조는 성긴 구조가 되고 분자량이 작을수록 구조는 세밀해진다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 4-arm-PEG-SG의 합성

펜타에리트리톨 1 g(7.35 mmol)과 모노토실화된 PEG(monotosylated PEG) 63.3 g(MW. 2,000, 4 당량)을 DMF 300 ㎖에 넣고 질소 대기 하에서 약 24 시간 동안 환류, 교반하였다. 반응 후 증류수를 첨가하여 녹이고 디클로로메탄(600 ㎖, 500 ㎖)으로 추출하였다. 추출된 유기층을 브라인(brine)으로 2 회 세척하고 황산마그네슘으로 건조, 여과한 후 유기용매를 감압 증류로 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전 화합물을 감압 여과한 후 진공 감압 하에 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 4-arm-(pentaerythritol core) PEG 화합물 60 g을 얻었다.

4-arm-(pentaerythritol core) PEG 화합물 60 g(MW. 10,000, 6 mmol)을 톨루엔 300 ㎖에 녹인 후 무수 글루타르산(glutaric anhydride) 11 g(96 mmol, 16 당량)을 첨가하여 17 시간 동안 환류, 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 증류하여 용매를 제거하고, 증류수 500 ㎖를 가한 후 디에틸에테르로 2 회 세척하고 디클로로메탄(600 ㎖, 500 ㎖)으로 추출하였다. 추출된 유기층을 브라인으로 2 회 세척한 후 황산마그네슘으로 건조, 여과하고 유기용매를 감압 증류로 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전 화합물을 감압 여과한 후 진공 감압 하에 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 4-arm-PEG-글루타르산(glutaric acid) 화합물 58 g을 얻었다.

4-arm-PEG-글루타르산 화합물 58 g(MW. 10,228, 5.7 mmol)을 디클로로메탄 300 ㎖에 녹인 후 온도를 0∼5 ℃로 유지하면서 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide) 5.3 g(45.6 mmol, 8 당량)을 넣어주고, 디사이클로헥실카보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide) 9.4 g(45.6 mmol, 8 당량)을 디클로로메탄 100 ㎖에 녹여 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 15 시간 동안 교반한 후 감압 여과하여 부산물인 디사이클로헥실우레아(dicyclohexylurea)를 제거하고 감압 증류로 유기 용매를 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고 침전 화합물을 감압 여과한 후 진공 감압 하에서 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 4-arm-PEG-SG(4-arm-PEG-succinimidyl glutarate) 화합물 56 g을 얻었다.

실시예 2: 펜단트 PEG-SG의 합성

분자량 5,000∼100,000의 PEG를 아크릴산(acrylic acid), 개시제로서t-부틸 퍼옥시벤조에이트(t-butyl peroxybenzoate), 분산제로서 노난(nonane)과 반응시켜 가지형(branch)의 PEG 프로피온산을 얻었다. 이 과정은 다음 반응식 1과 같다.

가지형의 PEG 프로피온산을 분자량 100∼5,000의 PEG, N,N'-디사이클로헥실 카보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodimide) 및 4-(디메틸아미노)-피리딘[4-(dimethylamino)-pyridine]과 반응시켜 곁가지형(pendant) PEG를 얻었다. 이 과정은 다음 반응식 2와 같다.

펜단트 PEG를 무수 글루타르산(glutaric anhydride)과 반응시켜 펜단트 PEG 글루타르산(glutaric acid)을 얻었다. 이 과정은 다음 반응식 3과 같다.

펜단트 PEG 글루타르산을 N-하이드록시석신이미드 및 디사이클로헥실카보디이미드와 반응시켜 펜단트 PEG-SG(pendant PEG-succinimidyl glutarate)를 얻었다. 이 과정은 다음 반응식 4와 같다.

위 반응식 1, 2, 3 및 4에서 m, n 및 p는 앞서 정의한 바와 같다.

실시예 3: 4-arm PEG-SS의 합성

펜타에리트리톨 1 g(7.35 mmol)과 모노토실화된 PEG(monotosylated PEG) 63.3 g(MW. 2,000, 4 당량)을 DMF(dimethyl formamide) 300 ㎖에 넣고 질소 대기 하에서 약 24 시간 동안 환류, 교반하였다. 반응 후 증류수를 첨가하여 녹이고 디클로로메탄(600 ㎖, 500 ㎖)으로 추출하였다. 추출된 유기층을 브라인(brine)으로 2 회 세척하고 황산마그네슘으로 건조, 여과한 후 유기용매를 감압 증류로 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전 화합물을 감압 여과한 후 진공 감압 하에 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 4-arm-(pentaerythritol core) PEG 화합물 60 g을 얻었다.

4-arm-(pentaerythritol core) PEG 화합물 60 g(MW. 10,000, 6 mmol)을 톨루엔 300 ㎖에 녹인 후 무수 석신산(succinic anhydride) 9.6 g(96 mmol, 16 당량)을 첨가하여 17 시간 동안 환류, 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 증류하여 용매를 제거하고, 증류수 500 ㎖를 가한 후 디에틸에테르로 2 회 세척하고 디클로로메탄(600 ㎖, 500 ㎖)으로 추출하였다. 추출된 유기층을 브라인으로 2 회 세척한 후 황산마그네슘으로 건조, 여과하고 유기용매를 감압 증류로 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고, 침전 화합물을 감압 여과한 후 진공 감압 하에 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 4-arm-PEG-석신산(succinic acid) 화합물 60 g을 얻었다.

4-arm-PEG-석신산 화합물 60 g(MW. 10,460, 5.7 mmol)을 디클로로메탄 300 ㎖에 녹인 후 온도를 0∼5 ℃로 유지하면서 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide) 5.3 g(45.6 mmol, 8 당량)을 넣어주고, 디사이클로헥실카보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide) 9.4 g(45.6 mmol, 8 당량)을 디클로로메탄 100 ㎖에 녹여 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 15 시간 동안 교반한 후 감압 여과하여 부산물인 디사이클로헥실우레아(dicyclohexylurea)를 제거하고 감압 증류로 유기 용매를 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고 침전 화합물을 감압 여과한 후 진공 감압 하에서 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 4-arm-PEG-SS(4-arm PEG-succinimidyl succinate) 화합물 57 g을 얻었다.

실시예 4: 펜단트 PEG-SS의 합성

곁가지형(pendant) PEG를 얻는 과정은 실시예 2에서와 동일하다.

이후 펜단트 PEG를 무수 석신산(succinic anhydride)과 반응시켜 펜단트 PEG 석신산을 얻었다. 이 과정은 다음 반응식 5와 같다.

펜단트 PEG 석신산을 N-하이드록시석신이미드 및 디사이클로헥실카보디이미드와 반응시켜 펜단트 PEG-SS(pendant PEG-succinimidyl succinate)를 얻었다. 이 과정은 다음 반응식 6과 같다.

위 반응식 5 및 6에서 m, n 및 p는 앞서 정의한 바와 같다.

실시예 5: 4-arm-PEG-아민(NH ₂ )의 합성

4-arm-PEG 100 g(MW. 10000, 10 mmol)을 디클로로메탄 400 ㎖에 녹이고 트리에틸아민 11.2 ㎖(80 mmol, 8 당량)을 가해준 후, 디클로로메탄 100 ㎖에 녹인p-톨루엔설포닐 클로라이드 15.3 g(80 mmol, 8 당량)을 첨가하였다. 질소 대기 하의 상온에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 포화 염화암모늄 수용액으로 중화하고 디클로로메탄(1.5 ℓ, 1.3 ℓ)으로 2 회 추출하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조, 여과한 후 감압 증류하여 유기 용매를 제거하였다. 농축된 반응 혼합물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하고 진공 감압 하에서 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 4-arm-PEG-토실레이트(4-arm-PEG-tosylate) 화합물 103 g을 얻었다.

4-arm-PEG-토실레이트 103 g(MW. 10620, 9.7 mmol)과 프탈이미드 칼륨 (potassium phthalimide) 28.8 g(155.2 mmol, 16 당량)을 DMF 500 ㎖에 넣고 질소 대기 하에서 20 시간 동안 환류, 교반하였다. 반응 부산물을 여과하여 제거하고 증류수를 첨가한 후 디클로로메탄(1.3 ℓ, 1.1 ℓ)으로 2 회 추출하고 유기층을 황산마그네슘으로 건조, 여과하였다. 여액을 감압 농축시키고 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하였다. 침전 화합물을 감압 여과하고 진공 감압 하에서 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 4-arm-PEG-프탈이미드 화합물 97 g을 얻었다.

4-arm-PEG-프탈이미드 화합물 97 g(MW. 10576, 9.2 mmol)과 80 % 히드라진 수화물(hydrazine hydrate) 112 ㎖(1.84 mol, 200 당량)을 에탄올 500 ㎖에 넣고 17 시간 동안 환류, 교반하였다. 반응 혼합물을 상온으로 식히고 포화 염화암모늄 수용액으로 중화한 후 디클로로메탄(1.3 ℓ, 1.1 ℓ)으로 2 회 추출하고 유기층을 황산마그네슘으로 건조, 여과하였다. 여액을 감압 농축시키고 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 유도하였다. 침전 화합물을 감압 여과하고 진공 감압 하에서 12 시간 동안 건조하여 백색 분말 형태의 4-arm-(pentaerythritol core) PEG-아민 화합물 87 g을 얻었다.

실시예 6: 펜단트 PEG-아민의 합성

화학식 6의 구조를 갖는 펜단트 PEG-아민(pendant PEG-amine)은 직선형 (linear) 구조의 PEG를 아크릴산, 직선형의 PEG 디아민(PEG diamine)과 반응시켜얻을 수 있다. 이 펜단트 PEG 아민은 분자량 5,000 ∼ 100,000 달톤(dalton)범위에서 사용될 수 있는데, 사용 목적에 따라 첨가하는 아크릴산의 양을 변화시켜 가지 갯수 m을 4∼20 개 범위 내에서 조절할 수 있다. 구조 내의 n 값의 범위는 100∼2,500의 정수가 바람직하고, 부착된 PEG 디아민의 분자량은 2,000 달톤 (dalton) 범위에서 사용될 수 있다. 또한, p 값의 범위는 2∼100의 정수인 것이 바람직하다.

화학식 6의 펜단트 PEG-아민은 2 가지 방법으로 합성할 수 있는데, 그 첫 번째 방법은 다음과 같다:

먼저, 원하는 분자량의 PEG를 아크릴산, 개시제로서t-부틸 퍼옥시벤조에이트(t-Butyl peroxybenzoate), 분산제로서 노난(nonane)과 반응시켜 가지형의 PEG 프로피온산을 얻었다. 이 과정은 앞서의 반응식 1과 같다.

다음에, 가지형의 PEG 프로피온산을 직선형의 PEG 디아민, N,N'-디사이클로헥실 카보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodimide) 및 4-(디메틸아미노)-피리딘 [4-(dimethylamino)-pyridine]과 반응시켜 최종적으로 펜단트 PEG-아민을 얻었다. 이 과정은 다음 반응식 7와 같다.

위 반응식에서 m, n 및 p는 앞서 정의한 바와 같다.

화학식 6의 펜단트 PEG-아민을 합성하는 두 번째 방법은, 위 반응식 1에서 얻은 가지형 PEG 프로피온산을 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxy succinimide)와 반응시킨 후, 직선형의 PEG-디아민과 반응시켜서 최종적으로 펜단트 PEG-아민을 합성하는 것이다.

실시예 7: 수화젤 형성과 이의 조절

위 실시예에서 제조한 PEG A와 PEG B 폴리머로 수화젤을 형성시킬 때, 이들 폴리머의 농도는 10∼40 %(w/v)로 하였으며, 둘베코 PBS 완충액(Dulbecco's phosphate-buffered saline)에 용해시켜서 사용하였다. D-PBS 완충액의 조성은 0.2 g/ℓKCl, 0.2g/ℓKH₂PO₄, 0.047 g/ℓMgCl₂, 8 g/ℓ NaCl, 1.15 g/ℓNa₂HPO₄이고, 사용 pH 범위는 8.0∼9.0이다. 반응에 사용하는 폴리머는 활성기를 가지고 있어 수용액 하에서 반감기를 가지므로 반응 전에 용해시켜서 사용해야 한다. 수용액 하에서 4-arm-PEG-SG의 반감기는 약 20 분이고 4-arm-PEG-SS는 약 10분이다.

PEG A 와 PEG B 폴리머를 각각 다른 반응 용기에서 완충액에 용해시킨 후 두 용액을 섞어주면 수화젤이 형성된다. 수화젤의 형성 시간은 사용하는 폴리머의 농도와 완충액의 pH를 조절함으로써 조절이 가능하다. 즉, 폴리머 A와 폴리머 B의 농도를 증가시킬수록, 그리고 반응 완충액의 pH가 높을수록 수화젤의 형성 시간은 단축된다.

다음 표 1은 본 발명의 수화젤 형성에 사용된 PEG A 및 PEG B 폴리머 성분의농도를 변화시키면서 젤 형성 시간을 조절하는 실험 결과를 나타낸 것이다.

PEG A 폴리머	PEG B 폴리머	농도%(w/v)	젤 형성시간(초)	완충액 pH
4-arm-PEG-SG/-SS	4-arm-PEG-아민	각각 10 %	15 초/20 초	8.0
4-arm-PEG-SG/-SS	4-arm-PEG-아민	각각 20 %	5 초/7 초	8.0
4-arm-PEG-SG/-SS	4-arm-PEG-아민	각각 30 %	0 초/3 초	8.0
4-arm-PEG-SG/-SS	4-arm-PEG-아민	각각 40 %	0 초/0 초	8.0

상기 표에서 보듯이 PEG A로서 4-arm-PEG-SG 또는 4-arm-PEG-SS를 사용하고 PEG B로서 4-arm-PEG-아민을 사용하여 중량비 1:1로 반응시켰을 때, 각 폴리머의 농도를 증가시킬수록 수화젤 형성 시간이 단축되는 것을 알 수 있다.

한편, PEG A의 성분으로 펜단트 PEG-SG 또는 펜단트 PEG-SS를 사용하고 PEG B의 성분으로 펜단트 PEG-아민을 사용할 경우에는 젤 형성 시간이 2∼3 배 단축되었으며, 반응 완충액의 pH를 증가시킬수록 젤 형성 시간이 단축되었다.

실시예 8: SD 래트를 이용한 동물 실험

4-arm-PEG-SG를 PEG A 폴리머로 사용하고 4-arm-PEG-아민을 PEG B 폴리머로 사용하여 동물에서의 수화젤 형성을 실험하였다. 각 폴리머의 농도는 20 %(w/v)였다. 실험 동물로 사용된 수컷 래트는 평균 체중 200 g으로, 케타민과 자일라진 (xylazine)의 혼합액을 50 ㎎/㎏ 농도로 사용하여 마취시켰다. 실험에 사용한 주사기는 2 개의 플런저(plunger)의 반응액이 분출구에서 접한 뒤 외부로 용출되는 구조를 갖는 것으로 하였다. 폴리머 A와 폴리머 B 용액을 준비하는 동안 실험 동물 중 한 마리는 털을 깎아서 피부를 노출시키고 한 마리는 해부한 후 장기를 노출시켰다. 실험 동물의 피부나 장기(간, 심장, 폐 등)에 메스를 가하여 상처를 내서 출혈을 발생시킨 다음, 준비된 주사기의 폴리머 용액을 바로 분사시켜 수화젤 형성여부를 관찰하였다. 그 결과, 폴리머 용액을 분사하고 약 5 초후 수화젤이 형성되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 더 이상의 출혈이 방지되는 것도 확인하였다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 아민기를 갖는 PEG 폴리머와 아민기와 반응하여 펩티드 결합을 형성하는 PEG 폴리머를 혼합하여 수화젤을 제조하는 본 발명의 방법에 따르면, 종래의 천연 생체 고분자들을 이용하는 경우에 발생하기 쉬운 결합 강도 저하나 감염 위험 등의 문제를 발생시키는 일 없이, 수술시 봉합용 생체 접착제, 출혈 방지제, 화상 드레싱 등 의학적으로 유용하게 사용할 수 있는 PEG 수화젤을 제공할 수 있다.

Claims

아민기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 폴리머와, 아민기와 반응하여 펩티드 결합을 형성할 수 있는 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 폴리머를 1:10 내지 10:1의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 접착제용 수화제 제조용 조성물.
아민기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 폴리머와, 아민기와 반응하여 펩티드 결합을 형성할 수 있는 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 폴리머를 혼합하는 것을 특징으로 하는 생체 접착제용 수화젤의 제조 방법.
제 2 항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜 폴리머는 분자량이 1,000∼100,000 범위에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜 폴리머는 분자량이 10,000∼20,000 범위에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 아민기와 반응하여 펩티드 결합을 형성할 수 있는 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 폴리머가 다음 화학식 1 내지 4의 폴리머중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.

[화학식 1]

여기에서, n은 20∼90의 정수이다.

[화학식 2]

여기에서, n은 100∼2,500의 정수, m은 4∼20의 정수, 그리고 p는 2∼100의 정수이다.

[화학식 3]

여기에서, n은 20∼90의 정수이다.

[화학식 4]

여기에서, n은 100∼2,500의 정수, m은 4∼20의 정수, 그리고 p는 2∼100의 정수이다.
제 2 항에 있어서, 아민기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 폴리머가 다음 화학식 5 및 6의 폴리머중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.

[화학식 5]

여기에서, n은 20∼90의 정수이다.

[화학식 6]

여기에서, n은 100∼2,500의 정수, m은 4∼20의 정수, 그리고 p는 2∼100의 정수이다.
제 2 항에 있어서, 각각의 폴리에틸렌글리콜 폴리머를 인산염 완충액 또는 생리식염수 중에 5∼50 중량%의 농도로 하여 pH 7∼11에서 혼합하는 것을 특징으로 하는 생체 접착제용 수화젤의 제조 방법.