ES2210369T3 - Un metodo de union cruzada de polimeros que contienen aminoacidos utilizando agentes de entrecruzamiento quimicos fotoactivables. - Google Patents

Abstract

METODO DE RETICULACION MOLECULAR DE POLIMEROS QUE CONTIENEN AMINOACIDOS, MEDIANTE FOTOACTIVACION QUIMICA DE RETICULANTES QUE SE HAN COMBINADO CON DICHOS POLIMEROS. SE PUEDE UTILIZAR UN COLAGENO RETICULADO MEDIANTE ESTE METODO, COMO BIOADHESIVO PARA EL CIERRE SIN SUTURAS DE LA PIEL Y DEL OJO, O COMO MATERIAL SUPERHIDRATADO PARA LENTES DE CONTACTO, LENTES DE CONTACTO DE VENDAJE HUMEDO, LENTES O MATERIAL DE IMPLANTE CORNEAL, O COMO MECANISMO DE SUMINISTRO DE MEDICAMENTOS.

Description

Un método de unión cruzada de polímeros que contienen aminoácidos utilizando agentes de entrecruzamiento químicos fotoactivables.

Esta invención se refiere a métodos para entrecruzar molecularmente polímeros que contienen aminoácidos mediante reactivos químicos fotoactivables de unión cruzada que han sido combinados con los polímeros. Más particularmente, la invención se refiere a métodos para entrecruzar molecularmente colágeno mediante la fotoactivación de reactivos de unión cruzada heterobifuncionales que han sido combinados con colágeno. Tras la fotoactivación, los grupos reactivos de estos reactivos bifuncionales entrecruzan el colágeno formando puentes entre las cadenas laterales de aminoácidos en la molécula de colágeno.

Antecedentes de la invención

Los agentes químicos de entrecruzamiento se han usado para estudiar la organización molecular de las membranas celulares y para entender el modo en que varias moléculas interaccionan unas con otras en la superficie interior o exterior de la membrana. (Peters, K., Richards, F.M., Ann. Rev. Biochem. 46:523-51 (1977). Los estudios estructurales proteínicos utilizando entrecruzamientos químicos empezaron durante la década de 1950 con el trabajo de Zahn (Angew. Chem. 67:561-572, 1955; Makromol. Chem. 18:201-216, 1955; Mkromol. Chem. 72:126-152 (1958) y continuó en la década de 1960, principalmente con el trabajo de Wold y sus colegas (J. Biol. Chem. 236:106-111 (1961). Además, los agentes de entrecruzamiento han sido usados para entrecruzar artificialmente y estabilizar el tejido (Nimni, M., Biorheology, 17:51-82 (1980)). Las técnicas de entrecruzamiento para los estudios de sistemas de membrana discutidos anteriormente han hecho uso de reactivos bifuncionales, que están clasificados tanto como homo- o hetrobifuncionales. Los reactivos homobifuncionales tienen dos sitios reactivos idénticos. Los reactivos heterobifuncionales tienen dos sitios de unión diferentes, uno fotosensible y otro convencional. En general, ambos tipos de reactivos bifuncionales actúan para formar entrecruzamientos químicos mediante la introducción de puentes entre las cadenas de aminoácidos.

La utilidad de los reactivos homobifuncionales como agentes del entrecruzamiento en estudios de membrana ha sido limitada debido a varios problemas potenciales inherentes incluyendo entrecruzamientos colisionales aleatorios, largo tiempo de reacción, dificultad en controlar reacciones y el entrecruzamiento no selectivo. Los entrecruzamientos dependientes de colisión aleatoria pueden suceder en una frecuencia significativa, ya que las moléculas se entrecruzan inespecíficamente durante las colisiones aleatorias en membranas fluidas. Tal formación indiscriminada de entrecruzamientos puede resultar en una elevada multiplicidad de productos entrecruzados que son difíciles de analizar. Es posible, por lo tanto, que la baja proporción de productos entrecruzados no fuera detectada. Estos entrecruzamientos colisionales aleatorios fueron evitados en algunos sistemas de membrana con el uso de agentes fotosensibles de entrecruzamiento rápidos. (Ji, T.H., Biochimica et Biophysical Acta, 559:39-69 (1979)).

En contraposición, el entrecruzamiento con reactivos heterobifuncionales fotosensibles, puede ser fácilmente, rápidamente y secuencialmente controlado. El entrecruzamiento con reactivos heterobifuncionales es llevado a cabo uniendo el sitio convencional del reactivo a un grupo amino vía un enlace amida, dejando el segundo sitio fotoactivable sin unir. Tras la fotoactivación mediante el uso de irradiación ultravioleta o visible, el sitio fotoactivable se convierte en una especie de muy elevada reactividad química, que entonces forma un enlace covalente con otro grupo amino. La absorción de radiación ultravioleta o visible mediante el reactivo bifuncional puede dar lugar a dos clases generales de especies producidas mediante la escisión de enlaces químicos. La fragmentación puede ser tanto en un enlace sencillo, resultando en la formación de dos radicales libres, o en un doble enlace de carbono o nitrógeno. Se sabe que dos tipos de grupos fotosensibles resultan de la fragmentación de un doble enlace a un carbono o nitrógeno: un derivado azida y un derivado diazo. Los nitrenos son generados a partir de azidas, y carbenos son generados a partir de fotólisis de derivados diazo. Ambos nitrenos y carbenos son compuestos de muy elevada reactividad
química.

Un método común usado para la fotoactivación de compuestos hetorobifuncionales es la irradiación con una lámpara ultravioleta de onda corta, por ejemplo, luz mineral USV-11. El tiempo medio de fotólisis con esta lámpara varía dependiendo de los reactivos y está en el orden de 10 a 50 segundos. Un método alternativo, que tiene varias ventajas, es la fotólisis flash para un período extremadamente corto, normalmente del orden de milisegundos.

El colágeno es la proteína simple animal más abundante. Es el principal componente estructural de los tejidos de mamíferos y representa alrededor del 30% de todas las proteínas de mamíferos (Nimni, M., Biorheology, 17:51-82 (1980) La estructura molecular del colágeno consiste de tres cadenas polipeptídicas helicoidales entrecruzadas de unos 1.050 residuos de largo, enrolladas unas con otras para formar una triple hélice.

Hay una gran cantidad de uniformidad en la composición de aminoácidos del colágeno. La Glicina forma alrededor del 33 por ciento y la prolina e hidroxiprolina forman alrededor del 25 por ciento de la cantidad total de residuos en las cadenas polipeptídicas. Prolina e hidroxiprolina contribuyen a la rigidez de la molécula en que la beta C está unida al nitrógeno peptídico mediante la cadena lateral, formando un anillo de cinco miembros permitiendo así relativamente un poco de libertad de rotación. Es este efecto de cierre mediante los residuos de prolina e hidroxiprolina, y la formación del enlace de hidrógeno en el grupo hidroxilo de la hidroxiprolina, que da al colágeno su gran estabilidad. Los otros residuos de aminoácidos en la estructura incluyen el 10 por ciento de alanina y el 20 por ciento de cadenas laterales polares de arginina, lisina, asparagina y glicina. Éstos no juegan un papel particularmente importante en la triple hélice pero sin embargo son importantes en los enlaces intermoleculares que conducen a la formación de fibras.

El entrecruzamiento de las moléculas de colágeno ocurre extracelularmente y conduce a la formación de la fibra de colágeno. Esta característica organización de la fibra es responsable de la integridad funcional de los tejidos tales como hueso, cartílago, piel y tendón, y de la integridad estructural de vasos sanguíneos y la mayoría de órganos.

Ambos entrecruzamientos intra- e intermoleculares en el colágeno son derivados a partir de residuos de lisina e hidroxilisina. Los entrecruzamientos intramoleculares son formados cuando residuos especificos de lisina e hidroxilisina en el colágeno son desaminados oxidativamente a aldehídos unidos a péptido. El cobre, un cofactor con el enzima lisil oxidasa, causa que esta modificación tenga lugar. La formación actual del entrecruzamiento tiene lugar vía condensación aldólica, una reacción espontánea no enzimática donde las lisinas que están localizadas cerca de la región terminal son convertidas a aldehídos. Los entrecruzamientos intermoleculares se forman entre aldehídos unidos a péptido y grupos amino sin modificar de otros residuos de lisina e hidroxilisina. Éstos son entrecruzamientos de tipo base de Schiff, también conocidos como entrecruzamientos aldamina (grupo aldehído y amino). Este tipo del entrecruzamiento también se considera que es el más importante fisiológicamente.

El entrecruzamiento del colágeno es un requisito previo para que la fibra de colágeno resista al estrés físico al que está expuesta. En pasadas investigaciones, los agentes químicos, en particular el glutaraldehído, se encontró que tenían aplicación para la biosíntesis de entrecruzamientos intramoleculares e intermoleculares. El entrecruzamiento artificial del colágeno con glutaraldehído ha sido utilizado comercialmente para estabilizar válvulas cardíacas de cerdo que son entonces utilizadas en sustituciones de válvulas artificiales (Nimni, M., Biorheology, 17:51-82 (1980)). El colágeno es entrecruzado en esta técnica con un 25 por ciento de glutaraldehído (comercial) a pH neutro. La química exacta del entrecruzamiento glutaraldehído no está clara, pero se forman enlaces de base Schiff de glutaraldehído con dos residuos de lisina.

Muchos estudios han sido conducidos para desarrolar una sustancia, tanto natural como sintética, que pueda ser utilizada como un medio no traumático para ayudar a reparar los tejidos después de cirugía. El mayor interés en el uso quirúrgico de materiales adhesivos poliméricos empezó temprano en los años sesenta (Silverstone et al., Arch. Surg. 81:98 (1962). El trabajo inicial estaba limitado a sistemas solubles en agua tales como caseína y alcohol polivinílico, pero más tarde se amplió para incluir todos los adhesivos sintéticos disponibles y otros plásticos. El esfuerzo en este punto fue limitado a materiales sin conocida toxicidad local o general. El esfuerzo de 1962 de Silverstone y sus colaboradores fue mayormente dirigido hacia la amplia aplicación de técnicas de enlace en la cirugía arterial. Además del refuerzo de aneurismas inoperables, los usos contemplados incluyeron el reforzamiento de junturas después de la sutura arterial o implante, y la anastomosis sin sutura de pequeñas arterias. Aunque otros materiales han sido investigados, el más ampliamente utilizado de los tejidos adhesivos son los cianoacrilatos. Estas son unas series homólogas de moléculas orgánicas que polimerizan y se adhieren a tejidos vivos húmedos. El metil-alfacianoacrilato (MCA) en particular, ha sido utilizado desde 1960 por muchos investigadores como tejido adhesivo para la no sutura de huesos. El MCA es un material monomérico fluido, que bajo presión moderada, se polimeriza en segundos para producir una película adherente, fuerte y delgada. Aunque se ha mostrado que el MCA es histotóxico, trabajar con homólogos elevados de los n-alquil-alfacianoacrilatos ha indicado que si uno prosigue con las series homólogas, esta histotoxicidad disminuye. Los efectos tóxicos de los polímeros sintéticos sobre tejidos se refieren en parte a sus productos de descomposición y a la velocidad en la que son liberados. Todos los policianoacrilatos se degradan en medio acuoso mediante el mismo mecanismo - la escisión del esqueleto carbono-carbono del polímero, y la liberación final de formaldehído y otros productos de descomposición. Este mecanismo de degradación es esencialmente el mismo para todos los alquil cianoacrilatos, aunque la velocidad es bastante diferente y depende de la naturaleza del radical.

Ha sido descrito que los homólogos mas elevados menos tóxicos de los cianoacrilatos polimerizan instantáneamente en sustatros de tejidos y por esa razón son más efectivos induciendo la homeostasis. Sin embargo, la polimerización instantánea es un inconveniente en aplicaciones quirúrgicas donde se requiere la unión de dos superficies juntamente, o en la adhesión de superficies cortadas de un órgano. En estos casos, se requiere suficiente tiempo de trabajo para aproximar las superficies de los tejidos antes de que se pueda llevar a cabo la adhesión.

Las técnicas de aplicación de adhesivos de tejido han sido investigadas con el fin de dar respuesta a estas demandas quirúrgicas. (Matsumoto, T., Tissue Adhesives Insurgent, Med Exam. Pub. Co., N.Y. (1972). Los adhesivos de tejidos se aplicaron utilizando una pistola espray o mediante un método de goteo. La polimerización del adhesivo ocurrió más rápidamente cuando éste fue aplicado mediante el espray. La diferencia en la velocidad de polimerización fue explicada mediante el hecho de que rociando con el espray, los monómeros formaron una película de propagación, consiguiendo más superficie disponible para el iniciador y así obteniendo una velocidad de polimerización más rápida.

En muchas técnicas quirúrgicas el uso del método del espray discutido anteriormente tiene una ventaja diferente, pues no es posible aplicar el monómero uniformemente y en una película fina con el sistema de goteo. Sin embargo, rociar con el espray, tiene un inconveniente en que el monómero polimeriza más rápidamente y hace necesario que el cirujano trabaje más rápido. Por lo tanto están claras las ventajas y la necesidad de un adhesivo en el que el cirujano pueda controlar la velocidad de polimerización.

Además, aunque los informes indican que los tejidos adhesivos de cianoacrilato ofrecen ventajas cuando se usan para la reparación o la homeostasis de órganos dañados, se sabe que la presencia de fragmentos del polímero entre la incisión de la piel retrasa la curación de la herida. Esto es porque los fragmentos de polímero previenen la proliferación de fibroblastos y vasos microcirculatorios sobre las superficies heridas. Los estudios conducidos comparando la fuerza de extensión de las heridas cerradas por suturas versus los adhesivos de cianoacrilato, han mostrado que el pegamento permanece en el tejido durante un largo período de tiempo, y que la fuerza de extensibilidad máxima se obtiene más tarde que en el cierre de heridas por suturación.

La aplicación de adhesivos de cianoacrilato en procedimientos de oftalmología se introdujo en 1963 (Bloomfield, S. et al., Amer. J. Ophthal., 55:742-748 (1963). Ya que el mantenimiento del delicado balance metabólico y de presión en el ojo es vital para sus funciones ópticas y electrofisiológicas y depende de la integridad de la capa exterior, una considerable atención en oftalmologia ha estado siempre dirigida hacia métodos de reparación de cualquier proceso que desestabilice la córnea o la esclerótica. Las primeras experiencias con los adhesivos de cianoacrilato en el ojo no fueron particularmente alentadoras. Se encontró que los metil-2-cianoacrilatos tenían una fuerza de unión adecuada, peró se probó que eran demasiado tóxicos.

A lo largo del siglo pasado, un número de otras sustancias que no son cianoacrilatos han sido propuestas para unir un tejido con otro, pero como con los cianoacrilatos, ninguno parece ser completamente exitoso.

Las gelatinas entrecruzadas son el mayor competidor con los cianoacrilatos para la atención y el interés de investigadores que trabajan en tejidos bioadhesivos. La gelatina es una proteína que se encuentra de forma natural en los animales, con propiedades adhesivas innatas. Los pesos moleculares de las gelatinas varían de 30.000 a 120.000 y químicamente son algo similares al tejido conectivo. En 1965, Braunwald y Tatooles (Surgery, 19:460 (1946)) informaron del uso exitoso de la gelatina entrecruzada para controlar hemorragias de heridas del hígado y los riñones en perros. Aún después, Bonchek y Braunwald (Ann. Surg., 165:420 (1967) también describen el uso de gelatina entrecruzada para reparar incisiones en perros. El principal problema con la gelatina como bioadhesivo, es que es elevadamente susceptible de degradación enzimática.

Se han usado otras sustancias con algunas propiedades adhesivas para ayudar a las heridas oculares a que se curen de una manera rápida y firme. Parry y Laszlo informaron del uso de trombina para un rápido y eficiente sellado de las heridas conjuntivales en incisiones córneas escleróticas en cirugía de cataratas. (Brit. J. Opthal., 30:176-178 (1946) Town usó fibrina en cataratas, glaucoma y cirugía plástica traumática y en queratoplastia (Trans. Amer. Acad. Ophthal. Otolaryng., 54:131-133, (1949). Pero Young y Favata apuntaron que la trombina imparte menos fuerza de extensión que los materiales de sutura ordinarios. (War. Med., 6:80-85 (1944). Otro adhesivo que ha sido investigado es el sellante de fibrina (FS) que es un material adhesivo natural compuesto de fibrinógeno, factor VIII, factor de crecimiento plaquetario, trombina antiplasmina, y cloruro de calcio. El FS ha sido utilizado en cirugía vascular para limitar la pérdida de sangre y minimizar la magnitud del trauma de los vasos y la reacción cuerpo-extraño mediante el descenso del número de suturas necesarias para conseguir una anastomosis arterial técnicamente satisfactoria. Sin embargo, el FS causa un aumento en la cantidad de linfocitos infiltrados en muestras en el período postoperatorio temprano. Por lo tanto, tal como admiten los autores, estudios detallados definen su papel y representaciones (Ikeossi-O'Connor, M. G., Journal of Surgical Oncology, 23:151-152 (1983).

Un adhesivo de fibrina humana ha sido usado en cirugía oral (Bull. Grupo. int. Rech. sc. Stomat. et Odont., 27:171-180 (1984). La sustancia está constituida de dos componentes. Una, es fibrinógeno altamente concentrado y factor VIII juntamente con otras proteínas plasmáticas, tales como albúmina y globulina. El segundo componente es una solución de trombina y cloruro de calcio, un agente catalítico. El factor VIII induce al colágeno presente en el tejido conectivo a polimerizarse con la fibrina, formando un puente entre colágeno y fibrina. Algunos inconvenientes conocidos de este adhesivo de fibrina son que una vez que está preparado, éste debe ser usado en un corto período de tiempo (así que el cirujano debe poseer precisión y velocidad en la técnica de operación), y la posible transmisión de virus de la hepatitis y del SIDA.

WO-A-93 02718, publicada el 18 de Febrero de 1993, relata el uso de colágeno entrecruzado y revela colágeno y proteoglicanos (glicosaminocano) entrecruzados utilizando difenilfoforilazida. WO-A-90 12055, publicada el 18 de Octubre de 1990, la patente americana US-A-5 294 314, publicada el 15 de Marzo de 1994, y US-A-4 433 043, publicada el 21 de Febrero de 1984, se refiere al colágeno entrecruzado mediante agentes de entrecruzamiento químicos fotoactivables. JP-A-06 306095 da a conocer colágenos entrecruzado, en donde el entrecruzamiento se obtiene mediante fotorreacción, por ejemplo, con fenilazida. La patente americana US-A-5 292 362, publicada el 8 de Marzo de 1994, revela una composición para unir juntamente tejidos separados que comprenden colágeno (opcionalmente entrecruzado), proteoglicanos y opcionalmente un cromóforo.

La discusión anterior describe los esfuerzos para utilizar una variedad de sustancias de origen tanto natural como artificial como adhesivos de tejidos. Ninguno de estos esfuerzos ha sido completamente exitoso. Aún permanece la necesidad y el deseo de un adhesivo de tejidos que sea simple y práctico en cuanto a su aplicación, que no sea tóxico, que no retarde la curación de las heridas, que sea absorbido fácilmente e inofensivamente y que sea eliminado pro vías metabólicas normales una vez que haya servido a su propósito, y que no sea carcinogenético o que no presente otros problemas potenciales a largo término.

Lo siguiente es una lista de criterios deseables para bioadhesivos, uno o más de los cuales no ha sido cumplido por los materiales anteriores.

1. Facilidad de aplicación.

2. Control de polimerización.

3. Flexibilidad del enlace resultante.

4. Fuerza del enlace.

5. Transparencia.

6. Baja toxicidad.

7. Biodegradabilidad.

Resumen de la invención

La implementación práctica de las técnicas descritas anteriormente ha estado plagada de muchos problemas. Contrariamente a las prácticas anteriores, descubrimos inesperadamente que el uso de reactivos de entrecruzamiento fotoactivables combinados con polímeros que contienen aminoácidos produce un producto entrecruzado molecularmente elevado tras la fotoactivación. El colágeno entrecruzado por este método puede entonces ser utilizado como un bioadhesivo para cierres sin sutura del ojo o cualquier otra herida en el cuerpo, o como un material superhidratado para lentes de contacto, material de vendaje húmedo de lentes de contacto, material de implante de lentes o córneas, un vendaje oclusivo embebido, parche injertado, material de implante para reemplazar la silicona en cirugía plástica cosmética, material de recubrimiento de junturas artificiales o como un mecanismo de reparto de fármacos que libera la medicación.

Además, se aprecia que este método es igualmente aplicable para unir polímeros que contienen aminoácidos con otros polímeros o materiales inorgánicos. Las aplicaciones clínicas potenciales de esta técnica incluirían aparatos prostéticos de fijación de forma segura en su lugar, y la incorporación de centros de colágenos en lentes de contacto.

Aunque el método descrito en nuestra invención puede ser usado para entrecruzar cualquier polímero que contenga grupos de aminoácidos, un uso preferido del método es un entrecruzamiento biocompatible (esto significa que dichos polímeros no son elevadamente inmunogénicos, no provocan una respuesta inflamatoria, y no promueven un crecimiento fibrótico excesivo) los polímeros que contienen aminoácidos, más preferiblemente polímeros que contienen aminoácidos que son de origen animal, aún más preferiblemente polímeros que contengan aminoácidos que se encuentran naturalmente como polímeros o proteínas extracelulares, y más preferiblemente colágeno, combinaciones de diferentes tipos de colágeno, y combinaciones del colágeno con proteoglicanos (glucosaminoglicanos, GAGs). Por lo tanto, la descripción siguiente, está principalmente dirigida al entrecruzamiento del colágeno, combinaciones de diferentes tipos de colágeno, y combinaciones del colágeno con proteoglicanos, pero la invención no pretende estar restringida a este uso.

En una realización de la invención, se produce el colágeno entrecruzado que es útil como bioadhesivo. Los adhesivos de tejidos han sido utilizados en el pasado, pero estos sufren varios problemas incluyendo toxicidad y baja biocompatibilidad. Por otro lado, nuestro adhesivo no es tóxico y es biocompatible ya que esta hecho de colágeno, el componente principal de los tejidos de mamíferos. Además, el material satisface todos los criterios deseables para los bioadhesivos enumerados anteriormente, incluyendo la facilidad de aplicación, capacidad para controlar la polimerización, flexibilidad de aplicación, capacidad para controlar la polimerización, flexibilidad del enlace resultante, elevada fuerza del enlace, transparencia, baja toxicidad y biodegradabilidad.

En esta realización, el colágeno purificado procesado se mezcla con reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales fotoactivables. El sitio convencional del agente de entrecruzamiento se une a los grupos de aminoácidos de las moléculas de colágeno, dejando el otro sitio fotoactivable sin enlazar. Esta mezcla se aplica entonces al tejido. Con una fotoactivación apropiada, los sitios fotoactivables de los reactivos de entrecruzamiento se unen a los grupos de aminoácidos del colágeno en la mezcla y el colágeno en la córnea, piel y otros órganos. Se produce de esta manera el cierre de una herida sin material de sutura. Tal como se ha discutido anteriormente, ha sido difícil controlar la velocidad de polimerización de bioadhesivos previamente conocidos. La rápida polimerización crea problemas al cirujano que debe trabajar rápidamente antes de que el adhesivo "se fije". Sin embargo, nuestros materiales adhesivos, pueden ser aplicados en la córnea u otras partes del cuerpo y una vez que los tejidos estén en la posición adecuada, se usarán longitudes de onda específicas de luz para la activación final, consecuentemente entrecruzándose o fijando el
adhesivo.

Otros materiales que son útiles de acuerdo con todas las realizaciones de la presente invención son combinaciones de diferentes tipos de colágenos con proteoglicanos. Ciertas combinaciones del colágenos presentan propiedades ventajosas para la implantación biológica in vivo, por ejemplo, tienen una mayor rigidez estructural, muestran resistencia a la degradación, son fácilmente manipulables, tienen una gran biotolerabilidad, y tienen bajas propiedades inmunoestimulatorias. Ciertas combinaciones de colágenos con proteoglicanos exhiben la propiedad beneficiosa de promover la migración de células fibroblasto hacia el sitio de implantación, y consecuentemente promueven el proceso de curación.

En otra realización de la invención, se produce una forma superhidratada inesperada del colágeno que tiene aplicación en muchas áreas de medicina. El colágeno y otras sustancias hidratadas tienden a secarse muy rápidamente debido a la evaporación. Esta desecación cambia las características del material de colágeno. Sin embargo, en el método de nuestra invención los entrecruzamientos moleculares de las moléculas de colágeno son una red ideal de atrapamiento de agua, haciendo posible tener y retener un contenido extremadamente elevado de agua.

El colágeno superhidratado producido mediante el método de nuestra invención sería un material de lentes de contacto extremadamente importante. Las lentes de contacto blandas se deshidratan mientras están en el ojo humano. Éstas se vuelven incómodas y cambian su acomodación debido a su deshidratación. Nuestro material utilizado como una lente de contacto blanda proporcionaría unas lentes extremadamente confortables que no se deshidratarían.

Además proponemos que como material de implante de lentes superhidratado con agua unida en sus intersticios, las lentes intraoculares no adsorberán medicación en la proporción de las lentes intraoculares de hidrogel actualmente en uso. Esta propiedad de baja adsorción es una ventaja importante de nuestro material.

Nuestro colágeno elevadamente entrecruzado es también de gran uso para cirujanos plásticos quienes en estos momentos utilizan silicona para cirugía de implantación e inyectan colágeno, que no está elevadamente entrecruzado, debajo de la piel para eliminar arrugas. El colágeno pobremente entrecruzado actualmente usado en estas técnicas debe ser reinyectado periódicamente porque está sujeto a descomposición. El colágeno elevadamente entrecruzado de nuestra invención resiste la descomposición y es útil como un implante permanente o semipermanente o material de inyección para cirujanos plásticos para ser usado en cirugía cosmética y reconstructiva.

El gel de colágeno superhidratado producido mediante el método de nuestra invención puede tener incorporado un gel de agarosa de baja fusión que contenga una mezcla medicamentosa. El colágeno entonces será depositado encima del tejido, donde el gel de agarosa de bajo punto de fusión se disuelve, liberando de esta manera el fármaco unido en un área diana específica del cuerpo.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 muestra los diagramas histológicos para colágeno entrecruzado y colágeno no entrecruzado.

Fig. 2 muestra los diagramas histológicos para colágeno entrecruzado y colágeno no entrecruzado.

Fig. 3 muestra los diagramas histológicos para colágeno entrecruzado y colágeno no entrecruzado.

Fig. 4 es una gráfica de porcentaje de peso original versus tiempo para la deshidratación de lentes de colágeno entrecruzado y lentes de colágeno no entrecruzado.

Fig. 5 muestra las micrografías de elección de lentes de transmisión hechas de colágeno bovino tipo I y colágeno humano tipo V entrecruzado con HSAB y luz UV.

Fig. 6 es una gráfica de porcentaje de peso original versus tiempo para que la deshidratación de las lentes de colágeno entrecruzado y lentes de colágeno no entrecruzado para la gelatina.

Fig. 7 es una tabla que muestra los títulos de anticuerpos en suero de ratón después de la implantación de varios materiales para el uso de acuerdo con la presente invención.

Fig. 8 muestra la fórmula estructural y los datos químicos de agentes de entrecruzamiento químico representativos comercialmente disponibles.

Fig. 9 es una tabla que resume las propiedades químicas del colágeno.

Fig. 10 muestra una explicación en forma de diagrama para la formación de pequeñas burbujas en una solución de colágeno o gel.

Fig. 11 muestra la abertura de un disco de colágeno de manera que un lado de deja libre, disponible para contactar con un entorno neutralizador.

Fig. 12 muestra un proceso de neutralización utilizando una diferencia de potencial (en colágeno modificado y + aceptor de gel).

Fig. 13 es una gráfica de porcentaje de peso original versus tiempo para la deshidratación de las lentes de colágeno entrecruzado y las lentes de colágeno no entrecruzado.

Fig. 14 es una gráfica de porcentaje de peso original versus tiempo para la deshidratación de las lentes de colágeno entrecruzado y las lentes de colágeno no entrecruzado para gelatina.

Fig. 15A muestra una representación en forma de diagrama de una "sutura" de tejidos, tal como se representa mediante una sección en forma de disco. La Fig. 15B muestra una vista microscópica de la sutura formada en la Fig. 15A.

Descripción detallada de la invención

Hasta este momento, diez tipos de colágeno han sido identificados basándose en sus diferencias estructurales. El colágeno tipo I es el más abundante en la córnea y tiene la incidencia más baja de antigenicidad.

Realizaciones preferidas del método de entrecruzamiento de la invención utilizan dos preparaciones comerciales de este tipo de colágeno I - Vitrogen 100 (u otro "Atelocolágeno") y Cola de Rata Tipo I. El Vitrogen 100 es colágeno dérmico bovino solubilizado con pepsina purificado fabricado por la Collagen Corp. En este colágeno, el telopéptido responsable de la antigenicidad de la molécula de colágeno ha sido escindido enzimaticamente. El colágeno Cola de Rata Tipo I es un colágeno no tratado con pepsina fabricado por Collaborative Research, Inc.

Otras realizaciones preferidas utilizan combinaciones de diferentes tipos de colágeno o combinaciones de colágeno y proteoglicanos. Por ejemplo, una realización hace uso de una mezcla de colágeno tipo I y colágeno tipo V, más preferiblemente colágeno bovino tipo I y colágeno humano tipo V, un colágeno humano tipo I y tipo V, o colágeno bovino tipo I y colágeno placentario humano tipo V, más preferiblemente aún colágeno tipo I y colágeno tipo V en una proporción de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, o 10:1, más preferiblemente una proporción de 3:1. Otros materiales incluyen todavía combinaciones de colágeno placentario humano tipos I, IV, V, y/o IX y colágeno no humano tipos I, IV, V y IX, tales como colágeno de cola de canguro tipo I, y/o colágeno de cola de rata tipo I. Una realización alternativa hace uso de gelatina de piel de pescado fría, gelatina de piel de ternera y similares como materiales que tengan propiedades inmunoestimuladoras reducidas. Todavía otra realización más hace uso de proteoglicanos y/o combinaciones de colágeno y proteoglicanos que tienen las propiedades descritas en Stryer, Bioquímica, 3ª Edición, Pág. 275-276. Los proteoglicanos presentan la propiedad ventajosa de promocionar un influjo de células fibroblásticas hacia el área de implantación, y consecuentemente promocionar el proceso de curación.

La concentración de colágeno en el método de la invención varía dependiendo del uso deseado del producto entrecruzado. Los límites pueden variar de 2,5 mg/ml a 10 mg/ml. Estas concentraciones de preparación de colágeno pueden ser obtenidas mediante dos métodos bien conocidos: haciendo diálisis del colágeno contra tampón acetato a pH 5, o liofilizando cantidades conocidas del colágeno y resuspendiendo entonces el colágeno en ácidos débiles tales como HCL 0,012 N o CH_{3}COOH.

El pH de la preparación del colágeno se puede dar como una proeza en un ámbito de pH 2.0 en la preparación tamponada establecida por Harry S. Geggel et al. ("Collagen Gel for Ocular Surface," Investigative Ophthalmology & Visual Sciences (1984) a un pH fisiológico de 7,4.

Los reactivos de entrecruzamiento son entonces añadidos a la preparación de colágeno. Las técnicas de entrecruzamiento de nuestra invención hacen uso de reactivos heterobifuncionales que contienen grupos reactivos que forman un puente entre cadenas laterales de aminoácidos en la molécula de colágeno. Los agentes de entrecruzamiento bifuncionales que pueden ser usados en el método de la invención son seleccionados del grupo que consiste de compuestos diazo, compuestos aril azida y compuestos alquil azida e incluyen pero no están limitados al N-hidroxisuccinimida éster del ácido 4-azidobenzoico (HSAB) y N-hidroxisuccinimida éster del ácido 6-(4-azido-2-nitrofenil-amino)hexanoico (SANAH). Estos agentes de entrecruzamiento están disponibles en Sigma, Corp.

Único en el método de la invención, es el hecho de que mientras un extremo de los reactivos bifuncionales forma enlaces peptídicos con las cadenas laterales de aminoácidos del colágeno, el otro extremo permanece sin unir hasta que se fotoactiva mediante luz ultravioleta de onda corta. Este extremo es entonces convertido a un compuesto altamente reactivo llamado "nitreno" o "carbeno", el que a su vez se une a una cadena lateral de aminoácidos de cualquier molécula de tejido de colágeno y/o colágeno en la preparación.

Las concentraciones de las mezclas del reactivo de entrecruzamiento utilizadas en la invención pueden variar entre 5 mM y 25 mM disueltos en un disolvente compatible biológicamente como el DMSO. La concentración del disolvente no puede ser inferior al 50% o los reactivos empezarán a precipitar. La concentración óptima del reactivo de entrecruzamiento es 10 mM establecida por la mezcla de reactivo-colágeno (fotoactivado) llevada a cabo en Geles de Tris-Borato.

La fotoactivación de los reactivos puede ser conseguida en un campo de longitud de onda de 220 nanómetros (nm) a 310 nm. La longitud de onda de óptima absorción es aproximadamente 265 nm con un tiempo de fotoactivación que no excede los 20 minutos. La duración de la fotoactivación, sin embargo, variará dependiendo del tipo de agente de entrecruzamiento utilizado.

La eficiencia del entrecruzamiento de nuestro reactivo es elevadamente dependiente del número de cadenas laterales de aminoácidos que tiene disponibles. Además, el exceso de agente de entrecruzamiento puede enmascarar el proceso de entrecruzamiento debido a la unión competitiva potencial y a la reconfiguración interna. Esto significa que el reactivo libre competirá por los sitios activos de los reactivos unidos a cadenas laterales de aminoácidos vía un procedimiento de unión peptídica. Para minimizar este acontecimiento, la mezcla de colágeno y reactivo de entrecruzamiento pre-fotoactivada, debería pasar a través de una columna Sephadex G-25. Las fracciones pueden ser recogidas y pasadas por un Espectrofotómetro 260-320 nm para la determinación de las fracciones pico de reactivo de colágeno. Las fracciones recogidas pueden entonces ser combinadas y están listas para la fotoactivación.

Los siguientes ejemplos intentan ilustrar más aún la práctica de la invención.

Ejemplo 1 Procedimiento para la preparación de colágeno tamponado

a. Utilizando el método de R. Thoft ("Collagen Gel for Ocular Surface," Investig. Ophth. & Vis. Science) mezcla Na_{2}HPO 0,2M enfriada (4ºC), a igual volumen con 1,3M de NaCl también a la misma temperatura. Adicionamos un volumen igual de NaOH 0.1M a la solución tamponada.

b. Adicionamos ocho veces (8x) el volumen de Vitrogen equivalente a la solución tamponada.

c. Adicionar solución de rojo de fenol fría (5 mg/100 ml) si el indicador de pH es necesario.

Nota: La concentración de colágeno en la preparación final no puede ser inferior a 1,45 mg/ml.

Ejemplo 2 Proceso para el entrecruzamiento de colágeno

a. Utilizando el método de H. Geggel y R. Thoft (Investig. Ophth. & Visual Sciences, 1984), la fracción combinada de una mezcla de reactivos de colágeno tamponados son vertidos en placas de cultivo estériles de 35mm o en bases de tiras de polimetil metacrilato (PMMA) que cubren las curvaturas y profundidades específicas. Las mezclas de gel pre-entrecruzado son guardadas a 4 [grados] C hasta que están preparadas para el pretratamiento y la fotoactivación.

b. Las placas o bases son entonces situados en una incubadora envuelta de agua de tejido de cultivo a 37ºC con 5% CO_{2}, 95% de aire durante 15 minutos.

c. Las placas o bases son entonces entrecruzadas mediante la fotoactivación con luz UV de onda corta (luz mineral 254mm lámpara UV Modelo UVGL-25) durante 15-20 minutos.

Ejemplo 3 Procedimiento para el entrecruzamiento de colágeno

a. Fracciones combinadas de reactivo de colágeno tamponado de columnas de Sephadex son vertidas en placas de cultivo estériles de 35mm o bases de PMMA y se guardan a 4ºC hasta que estén listas para su uso.

b. Utilizando el método de T. Elsdale y T. Bard, J. (Cell Biol., 54:626-637, (1972), las placas o bases son situadas en una cámara de hidróxido de amonio durante entre 3 y 30 minutos dependiendo del grado de rigidez deseada.

c. Los geles son entonces fotoactivados durante 15-20 minutos para lograr el entrecruzamiento.

Ejemplo 4 Lavado y almacenamiento de geles entrecruzados

a. Los geles son retirados de las placas de cultivo y bases de PMMA y lavados dos veces con H_{2}O destilada.

b. Los geles se ponen en una placa de cristal y se usa un trépano de 6 ó 8 mm. de diámetro para sacar geles circulares que son puestos en tubos de ensayo individuales que contienen 10 mL de tampón fosfato.

c. Se reemplaza cada 60 minutos el tampón fresco durante 4 a 6 horas.

d. Los geles son almacenados en Solución de Sal Equilibrada o en cloruro sódico 0,9%.

Nota: El lavado continuo exhaustivo se puede realizar con PBS, BSS, NaCl (irrigación) o H_{2}O destilada.

Ejemplo 5 Compatibilidad del tejido y durabilidad de colágeno entrecruzado comprendiendo colágeno tipo I y tipo V

Ratones BALB/c (machos, de 6-8 semanas, 30 gramos) fueron anestesiados con Ketamina (50 mg/kg) y Xilazina (50 mg/kg) intraperitonealmente.

Las lentes de colágeno fueron hechas mediante la combinación de colágeno bovino tipo I y colágeno humano tipo V (proporción 3:1) y agente de entrecruzamiento HSAB. Las lentes fueron dializadas en agua destilada esterilizada hasta que todo el HSAB en exceso fue eliminado. Fueron puestas en remojo con gentamicina durante 4 horas.

Las lentes de colágeno no entrecruzado fueron tratadas tal y como se describe anteriormente.

Se afeitó el pelo del ratón de la región escapular media. La piel se limpió con yodo y se usó un escalpelo de talla 10 disponible para hacer una incisión de 2 cm a través de la piel en la región subcutánea, se utilizaron tijeras romas estériles para diseccionar tejido a través del tejido subcutáneo hasta que se formó una pequeña cavidad. Las lentes de tanto colágenos entrecruzados HSAB o colágenos no entrecruzados fueron situadas en la cavidad subcutánea. La piel se cerró con suturas de prolene 6.0 interrumpidas. Las suturas se retiraron en una semana.

Los animales fueron sacrificados con inyecciones intraperitoneales letales de Ketamina (150 mg/kg) y Xilazina (150 mg/kg) a 2 semanas, 1 mes, 2 meses y 3 meses. La piel y los tejidos subcutáneos de la región escapular media fueron aislados y procesados en bloques de parafina, y seccionados para el microscopio óptico. Las secciones se tiñeron tanto con hematoxilina/eosina o con Tricromo de Masson.

Los ratones toleraron el procedimiento quirúrgico bien, sin complicaciones. El área de incisión se curó en un período de tiempo similar para las lentes entrecruzadas y las no entrecruzadas. No había ningún signo anormal de inflamación o de proceso de curación. Tal como se ha visto histológicamente, a las dos semanas (véase Figuras 1-3) las lentes de colágeno entrecruzadas y las no entrecruzadas estaban intactas con tejido conectivo y grasa envolviendo las lentes. Alrededor de éstas había algunas células polimorfonucleadas y colágenos (tal se ha visto con la tinción de Tricromo). Las lentes aparecieron homogéneas y sin células.

Después de 3 meses (ver figuras 1-3). Los sitios de las incisiones se habían curado completamente, y el pelo ha crecido sobre la herida en los animales entrecruzados y los no entrecruzados. Histológicamente, las lentes estaban envueltas por células de grasa, células de tejido conectivo y algunas áreas de músculo. Las lentes no entrecruzadas sufrieron invasión celular en la periferia que pareció dejar pequeños "agujeros o con apariencia de queso Suizo". Por contra, el colágeno entrecruzado no tuvo estas áreas de invasión celular. Las células parecían acumularse en el margen exterior de la lente pero no se infiltraban en el mismo grado como las no entrecruzadas. La tinción de Tricromo de Masson mostró que las lentes se tiñeron de un color azul claro mientras que las capas de colágeno pesadas de la dermis se tiñeron de color azul oscuro. Otra vez el colágeno no entrecruzado presentaba áreas de infiltración celular y lo que parecía ser digestión. Los colágenos entrecruzados eran más resistentes y no tenían los agujeros dentro de la
sustancia.

Antes del sacrificio, se recogió el suero y se midieron los niveles de anticuerpos para el colágeno de tipo I. Las lentes de colágeno entrecruzadas y no entrecruzadas tuvieron niveles de anticuerpos similares unas con las otras (ver las Figuras 1-3).

Este dato indicó que, en 3 meses, la lente de colágeno entrecruzado HSAB se muestra más intacta que la lente de colágeno no entrecruzado. Ninguna lente provocó una respuesta inflamatoria por parte del animal y los dos sanaron a la misma velocidad. Los anticuerpos para el colágeno de tipo I estaban en niveles similares en los animales entrecruzados y los no entrecruzados.

Ejemplo 6 Velocidad de deshidratación de lentes de colágeno entrecruzado versus las lentes de colágeno no entrecruzado

Las lentes estaban hechas de (a) Colágeno placentario humano tipo 1 y tipo V (proporción 3:1) entrecruzado con HSAB y luz UV (b) Colágeno bovino tipo I y colágeno humano placentario tipo V (proporción 3:1) entrecruzado con HSAB y luz UV, (c) Colágeno bovino tipo I y colágeno humano placentario tipo V (proporción 3:1) entrecruzado con glutaraldehído 25%, (d), que están fuera del alcance de la presente invención, colágeno bovino tipo I entrecruzado con glutaraldehído 0,25%. Todas las lentes fueron enjuagadas en series de agua destilada y entonces fueron cortadas a tamaño y grosor idéntico. Los pesos húmedos se midieron a las 0 horas, y entonces cada hora hasta que las lentes estuvieron completamente secas, reflejado por un peso constante. El dato fue calculado como % de peso original.

La combinación de colágeno bovino tipo I y colágeno bovino tipo V entrecruzado con HSAB tuvo la velocidad de deshidratación más lenta, con un 50% de deshidratación un poco por encima de las 2 horas. Las lentes hechas de colágeno bovino tipo I entrecruzado con glutaraldehído, que están fuera del alcance de la presente invención, fueron las que se deshidrataron más rápidamente, con un 50% de deshidratación a los 55 minutos. (véase la Figura 4). Las lentes bovinas tenían aproximadamente un 90% de agua. La combinación de dos colágenos extendió el tiempo de deshidratación aún sin ningún agente de entrecruzamiento (dato no mostrado). Las velocidades de deshidratación eran mayores si se añadía sulfato de condroitina (2,3%) a la lente (dato no mostrado). La rehidratación de las lentes liofilizadas era de 5 a 10 veces más rápida (dependiendo de la composición) en las muestras entrecruzadas comparadas con las no entrecruzadas.

Estos resultados indican que el agente de entrecruzamiento HSAB producía una lente más hidrofílica que el colágeno entrecruzado con glutaraldehído. También la adición de un segundo colágeno extendió el tiempo de deshidratación tanto con o sin la adición del agente de entrecruzamiento. La lente de colágeno entrecruzado atrapa agua y la libera lentamente.

Ejemplo 7 Microscopía de transmisión de electrones de las lentes de colágeno bovino tipo I y colágeno humano tipo V entrecruzado con HSAB y luz UV

Las lentes hechas de colágeno bovino tipo I y colágeno humano tipo V (proporción 3:1) fueron entrecruzadas con HSAB y luz UV. Las muestras se bañaron a conciencia con agua hasta que se retiró el exceso de agente de entrecruzamiento. Las lentes se fijaron con 4% glutaraldehído/paraformaldehído, post-fijadas en tetróxido de osmio y embebidas en resina de Epon-Araldite. Las secciones fueron cortadas con un cuchillo de cristal, teñidas y visualizadas con un microscopio de transmisión de electrones.

Las lentes aparecieron como fibrillas homogéneas dispuestas al azar con huecos centrales de un "espacio claro" (véase la Figura 5). Ampliaciones más grandes mostraron que las fibrillas eran similares en anchura y no tenían estrías.

Estos resultados indicaron que las lentes de colágeno entrecruzado con HSAB mantienen su naturaleza fibrilar con fibrillas pequeñas dispuestas aleatoriamente y espacios interfibrilares.

Ejemplo 8 Estudios de las propiedades de las gelatinas de la de piel de pescado frías

Las gelatinas de piel de pescado frías en concentraciones variadas se utilizaban con y sin HSAB o glutaraldehído como agente de entrecruzamiento. La gelatina de piel de pescado tenía propiedades diferentes en comparación a los colágenos mamíferos. La gelatina de piel de pescado es un líquido marrón y en gel de electroforesis SDS tiene múltiples bandas de pesos moleculares. Cuando entrecruzamos la gelatina de pescado con HSAB y luz UV el resultado fue un gel esponjoso, hidrofílico y consistente que tenía una buena consistencia y podía ser manipulado con fórceps o cortado con un escalpelo. En contraste, cuando se fijaba en glutaraldehído, la lente se volvió dura y casi como de plástico. Cuando se cortó, la lente se despedazó en fragmentos más pequeños. Este comportamiento fue muy diferente del de los colágenos de mamíferos.

La velocidad de deshidratación para las gelatinas de pescado entrecruzadas con glutaraldehído fue aproximadamente de 50% de deshidratación a las 1^{1}/_{2} horas. Éste fue aumentado hasta 3^{1}/_{2} horas cuando el sulfato de condroitina se añadió a la gelatina de pescado entrecruzada.

A grandes rasgos de "adhesividad entre dedos", la gelatina de pescado no entrecruzada exhibió adhesividad mientras que los colágenos mamíferos no lo hicieron. Con filtración de gel separamos los fragmentos de gelatina de pescado en los >300.000 kDa y los que están entre 300.000-100.000 kDas. El ensayo repetido de la "adhesividad entre dedos" mostró que la fracción >300.000 mantuvo su comportamiento adherente mientras que el material de más bajo peso molecular descendió en adherencia. Cuando la gelatina de pescado de >300.000 kDa se entrecruzó con HSAB y se convirtió en una lámina muy delgada, entonces se mantuvo la naturaleza adherente. Cuando una lámina fina de este material se pone en la parte posterior de la mano, éste se pega a la piel y no se despega hasta que se saca frotando o se gasta.

Finalmente, una lente de gelatina de pescado entrecruzada con HSAB se puso en la región medio escapular del ratón. Los animales se sacrificaron a 2 semanas, 1 mes, 2 meses y 3 meses, y los tejidos se prepararon para microscopía óptica. Algunas secciones se tiñeron con hematoxilina/eosina y otras con Tricromo de Masson. Cuando se visualizaron mediante el microscopio óptico, la lente era densa y no se cortó bien porque era demasiado consistente. Hubo una reacción del tejido mínima alrededor de las lentes y durante 3 meses hubo pocas células que se infiltraron en la porción periférica de las lentes. En el momento del sacrificio, se recogió el suero y se utilizó el método ELISA para medir los anticuerpos para gelatinas. No se encontraron había anticuerpos en ninguno de los tiempos examinados (vea la Figura 6).

Estos resultados indican que la gelatina de piel de pescado fría se comporta de manera muy diferente a los colágenos o gelatinas de los mamíferos. Nuestros estudios sugieren que éste tiene una naturaleza más adhesiva. Es tolerado en los ratones al igual que los colágenos mamíferos.

Ejemplo 9 Valoración de los efectos inmunoestimuladores de varios colágenos y composiciones de gelatina

Se realizó un ensayo ELISA con el suero del ratón de acuerdo con la metodología estándar bien conocida en el campo para valorar las propiedades de varios colágenos y materiales de implantes de gelatina. Los resultados están resumidos en la Fig.5.

Ejemplo 10 Desarrollo de materiales biopoliméricos para el implante de córnea

Nuestros experimentos se han centrado en la creación de material biopolimérico que puede ser utilizado como transplante par la corrección de condiciones patológicas agudas y crónicas de la córnea.

Los requerimientos básicos para este material son:

- inactividad química y biológica

- transparencia

- elevada fuerza de tensión

- elevada hidrofilia

Para crear un producto que se pareciese a éste que lo reemplazaría, buscamos ingredientes de fuentes vivas. Uno de estos ingredientes es el colágeno, un polímero largo de aminoácidos, un componente estructural abundante en tejidos de la córnea. De manera simplista, la síntesis de colágeno comprende las siguientes reacciones:

-

reacción de poliadición (crecimiento del polímero mediante la adición de monómeros al centro activo después de tres pasos de iniciación);

-

los pasos de la propagación (creando estructura estereoquímica);

-

los pasos de la terminación (estipulando el peso molecular y la distribución del peso molecular);

-

varios pasos de modificación (hidroxilación, glicosilación)

-

policondensación (formación de microfilamentos y fibras)

La estructura normal de la córnea requiere la presencia no solo del colágeno de tipo I -material de construcción básico- sino que también necesita colágenos reguladores (tipos II y V) y colágenos de estabilización (tipos IV y IX), la presencia y proporción de los cuales se diversifica con la transición del estroma corneal primario al secundario.

La lista de componentes no celulares importantes de la córnea también incluye los glicosaminoglicanos (GAGs)-principio básico de la sustancia base (en sulfato de queratina 66%), glicoproteínas, albúminas, globulinas, glucosa, cristaloides, y agua.

En nuestros experimentos, hemos utilizado ventajosamente tanto el producto casi manufacturado -solución de colágeno de tipo I 0,3% (vitrogen, celtrix) en ácido clorhídrico 0,012n, o colágeno liofilizado soluble en ácido (tipos I, IV, V, IX; SIGMA*), la fuente del cual es:

- placenta humana (colágeno tipos I, IV, V, IX)

- cola de canguro (tipo I)

- cola de rata (tipo I)

Como resultado de la neutralización, la solución de colágeno acídico se transformó en un gel que era susceptible al secamiento y que era inestable en diferentes enzimas debido a una estructura floja que carece de conexiones intra- e interfilamentosas.

Consecuentemente, nuestro estudio estaba dirigido hacia el desarrollo de un colágeno modificado con unas cualidades nuevas, útiles y beneficiosas. Para alcanzar este propósito, se ha dado prioridad a los agentes de entrecruzamiento naturales y artificiales que promueven los pasos de propagación y la policondensación de microfilamentos.

Candidatos para agentes artificiales de entrecruzamiento incluyen agentes de entrecruzamiento que son homo- y heterobifuncionales, fotoactivos, y aquellos que no requieren calor para la fotólisis de grupos nitro. Nuestra elección final fue el agente de entrecruzamiento fotorreactivo HSAB (Fig. 8) por cada una de las siguientes razones:

- es específico para los grupos amino de las moléculas de colágeno

- no se queda atrás respecto a otros agentes de entrecruzamiento en cuanto a fuerza de los enlaces químicos

- reacciona bajo condiciones favorables hacia el experimento final en comparación a SIAB o sulfa-SIAB, que es infectivo a pH <7 o después de calentamiento.

- es incoloro (en comparación al rojo SANPAH o al amarillo brillante DFNBD)

- a pesar de la acción irritante inherente a otros agentes de entrecruzamiento, el HSAB es relativamente no tóxico (en comparación al DFNDB, que se considera elevadamente tóxico).

El sulfo-HSAB soluble en agua es el preferido debido a que es soluble en DMSO, y porque exhibe las mejores características físicas del producto final.

El número de moles de agente de entrecruzamiento requeridos para el entrecruzamiento de 1 mol de colágeno se calculo en la suma de residuos de lisina en diferentes cadenas de diferentes tipos de moléculas de colágeno. (Fig. 9).

La proporción del peso del agente de entrecruzamiento seco y el peso del colágeno seco es de 1:10 (teniendo en cuenta el pequeño exceso de agente de entrecruzamiento).

El cálculo del volumen de DMSO basado en la capacidad de este disolvente único de mantener el agente de entrecruzamiento en una condición de disolución después de la adición del HCl 0,012 (solvente del colágeno). La "proporción crítica" para el disolvente se determina a través de la titulación, que mostró que preferiblemente el volumen de HCl (o cualquier otra solución) no debe exceder el 40% (65 partes de HCl en 100 partes de DMSO). Con el aumento del volumen de HCl, el DMSO no puede mantener el HSAB en solución y posteriormente sedimentó como un precipitado (cristales ligeramente rosas, claros que pueden tener la forma de cruces o prismas dependiendo de factores exteriores).

Más reacciones se desarrollaron bajo condiciones óptimas para la reacción de entrecruzamiento:

- Interacción de la solución acídica de colágeno con la solución de HSAB en DMSO (tº= 0º + 4ºC, t= 15 minutos)

- Neutralización del HCl en una cámara de hidróxido de amonio (t\approx 15') y creación de una gelatina fina consistente.

- Fotoactivación del agente de entrecruzamiento mediante luz UV de onda corta (254 nm) 1200 joules para cada lado de la película de colágeno.

- La diálisis, que retira el exceso del agente de entrecruzamiento y el DMSO (potencialmente peligroso para los tejidos vivos).

Aunque estas reacciones parecen prometedoras, están comprometidas debido a que la "proporción crítica" lleva a la neutralización parcial (¡demasiado DMSO con pH alrededor de 7,0!) de la solución de colágeno acídico y la formación del gel que hace imposibles más manipulaciones. Para minimizar la formación de gel, descubrimos que un sacrificio de la "proporción crítica" puede ser compensado mediante la eliminación del agente de entrecruzamiento mediante ultracentrifugación. Tal y como se discutió anteriormente, están siendo usados diferentes tipos de colágenos a partir de diferentes fuentes.

Respecto a las varias composiciones y correlaciones de diferentes componentes, debería indicarse que:

- No hemos observado el mejor resultado esperado a partir de la mezcla y exposición sucesiva de los tipos de colágeno I, IV, V, y IX (es decir, unidades estabilizadotas, reguladoras y estructurales).

- La composición óptima fue colágeno tipo I (vitrogen liofilizado) y colágeno V (soluble en ácido, a partir de placenta humana) en proporción 3:1.

Se ha descubierto que el colágeno tipo V tiene influencia en la organización estructural de los filamentos de colágeno tipo I. El tipo V aparece primero en la córnea durante el linchamiento del estroma primario, y persiste constantemente en el estroma maduro (secundario) que es extremadamente rico en este tipo de colágeno.

Análisis histoquímicas de inmunofluorescencia muestran que las moléculas tipo V ocupan los epítopos del colágeno tipo I (evidencia indirecta de interacción cercana en la córnea humana) (Linsenmayer et al., Ann. of the New York Academy of Sciences, 580:143-159 (1990) y Linsenmayer et al., J. Cell Biol. 96:124-132 (1983).

Análisis inmunoelectromiscroscópicos (evidencia directa) confirman la conclusión anterior (Linsenmayer et al., Ann. of the New York Academy of Sciences, 580:143-159 (1990) y Birk, et al., J. Cell Biol. 106:999-1008 (1988).

La presencia y cantidad (%) del tipo V determina el diámetro (proporción inversa) y la estriación visible (proporción directa) de las fibrillas de colágeno de tipo I (Linsenmayer et al., Ann. of the New York Academy of Sciences, 580:143-159 (1990) y Adachi et al., Connect. Tissue Res. 14:257-2665 (1986). El papel más importante del colágeno tipo V en la córnea es que actúa como una proteína de regulación en la fusión del segmento de la fibrilla mediante la alteración de la superficie de la fibrilla y así de esta manera inhibe o promueve la asociación lateral (como una cremallera). (Birk et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 580:143-159 (1990). Después de apuntar esta información, describimos abajo la secuencia de procedimientos fisico-químicos y las composiciones cuantitativas de todos los reactivos en el experimento final (óptimo):

1.

HSAB - 1,2 mg

DMSO - 0,150 ml

2.

Añadir: El colágeno Tipo I - 9,0 mg

0,012 n HCL - 0,450 ml

mezclar, homogenizar, tº= 0º + 4ºC

3.

Añadir: El colágeno TIPO V - 3,0 mg

\rightarrow

proporción final de colágenos Tipo I a Tipo V= 3:1

4.

Calentando a +37ºC durante 2 minutos

S.

Ultracentrifugación a 0º + 4ºC durante 2 minutos

6.

Neutralización del sobrenadante en cámara de NH_{4}OH (hasta aclaramiento completo = 15 minutos)

7.

Exposición a luz UV (onda corta 254 nm, 1200 joules para cada lado de la película de colágeno)

8.

Diálisis: almacenamiento en agua destilada a 0º + 4ºC.

Tal como se muestra anteriormente, los mejores resultados requieren el calentamiento de colágeno modificado. Postulamos que el calentamiento ayuda a descubrir residuos de lisina inaccesibles y hacerlos disponibles para interacción covalente con el agente de entrecruzamiento. Se deben tomar precauciones con todas las manipulaciones de colágeno modificado debido al calentamiento por encima de 42ºC o más de 2' en medio ácido, y la combinación de los dos puede desnaturalizar el colágeno y desactivar el agente de entrecruzamiento. La mezcla y la homogenización deben ser muy suaves, y la temperatura del medio en estos procedimientos debe ser aproximadamente 0ºC.

Las dificultades que hemos encontrados, y las posibles maneras para explicar y anular o eliminar estas mismas, están descritas a continuación:

1. Formación de precipitado:

Este problema se encuentra cuando la composición de nuestros disolventes diverge de la "proporción crítica" (% de DMSO tiene que ser al menos 60). La manera más fácil para reducir la precipitación, tal como se indica anteriormente, es mediante ultracentrifugación. Nuestro método de desintegración de precipitación con ultrasonicación (U.S.) no fue satisfactorio. La U.S. pareció ser:

- Un arma poderosa contra la precipitación;

- Una fuerza adicional de mezcla que produce bolas de colágeno fuertes más friables y que da a conocer los sitios activos para futuras reacciones;

- Razonablemente segura, porque no desestabiliza macromoléculas de colágeno a temperaturas cercanas a 0ºC.

Independientemente de estas características beneficiosas, hemos descartado la ultrasonicación porque después de romper los precipitados, da una apariencia "lechosa" al colágeno y no hemos sidos capaces de mejorar significativamente sus características ópticas.

2. La dificultad para alcanzar una masa homogénea durante la mezcla puede ser explicada por:

- La naturaleza del colágeno liofilizado (el disolvente entra dentro lentamente y el proceso de disolución es muy desigual);

- La temperatura del proceso (la baja temperatura incrementa la viscosidad de la solución de colágeno);

- La policondensación inmediatamente después de la adición del colágeno tipo V (la solución se vuelve muy espesa);

- La manipulación manual y el control visual

Consecuentemente es deseable operar con soluciones más líquidas (= 0,1-0,3%) y concentrar éstas justo antes de la formación del gel.

\newpage

3. Formación de burbujas en la solución de colágeno o gel. Hay tres explicaciones:

(a) Las burbujas son debidas a gas disuelto en nuestros materiales y condensado en diferentes "sitios activos" (precipitación del agente de entrecruzamiento, partículas de polvo, nuestras partículas) durante el calentamiento;

(b) Las burbujas se originan debido a que las partículas pequeñas que persisten en la solución viscosa crecen con el calentamiento y se forman. Cuando el gel se asienta, todas las fuerzas apuntan hacia los centros de las estructuras homogéneas, químicamente equivalentes, y apuntan hacia fuera de cualquier superficie e irregularidad química o estructural (Fig. 10).

Estas fuerzas comprimen una pequeña cantidad de agua, incrementando el tamaño de las burbujas (hay un crecimiento visible durante la neutralización) y aumentando los defectos en los puntos de heterogeneidades estructu-
rales.

(c) Las burbujas son probablemente un producto derivado de la reacción. Es también probable que combinaciones de todas las posibilidades enumeradas estén implicadas. La centrifugación de colágeno modificado disminuye dramáticamente la cantidad de burbujas. Posiblemente, debido a que comprime pequeñas burbujas y elimina algunos sitios activos que pueden promover la condensación de gas.

4. El color amarillento del colágeno modificado después de la exposición a la luz UV. Este signo obligatorio de entrecruzamiento no es un gran problema. El color no tiene tanto alcance como para ser capaz de destruir la percepción del color o ser cosméticamente inaceptable.

5. Turbidez: Un tratamiento adecuado de este problema debería empezar con una discusión de las causas de la transparencia de la córnea. Inicialmente, la estructura periódica del estroma corneal incluye:

-

fibrillas de igual medida

-

todas las fibrillas son estrictamente paralelas una con otra dentro de una única lámina

-

la rotación de figuras paralelas de una lámina a otra es constante en el espacio.

Todos estos factores son responsables de que la córnea no sea sólo transparente, sino también increíblemente fuerte, elástica y resistente a muchas influencias mecánicas externas. Hemos discutido que los resultados óptimos se obtienen cuando somos capaces de crear una estructura periódica similar. Consecuentemente la pregunta es cómo hacer que las moléculas de colágeno cáusticas (véase las fotos de las transparencias) caigan en una dirección de manera que puedan ser "congeladas" mediante el agente de entrecruzamiento. La carga eléctrica de estas moléculas es casi cero. Consecuentemente, no pueden ser alineadas solo mediante un campo electromagnético externo. Aunque es posible cargar las moléculas de colágeno acoplándolas con "transportadores de carga", esta técnica no lograría el alineamiento de la molécula porque el campo magnético externo empujaría las moléculas de colágeno a sitios aleatorios en direcciones opuestas. Aunque pueda haber una posibilidad de resíntesis estrictamente orientada de la molécula de colágeno utilizando el transportador de carga y el campo magnético externo de una matriz sintética con una estructura unidireccional de filamentos finos (precolágeno I, carboxi- y aminopeptidasas), tales síntesis son muy caras. Mediante el uso de una matriz sintética, probablemente seremos capaces de lograr dos objetivos (fuerza de tensión y transparencia) de una vez, y producir algunas variantes de nuestro producto (cristal claro, pero muy frágil) aceptable para el transplante.

Alternativamente, si decidimos utilizar nuestro colágeno modificado óptimamente sintetizado que satisface los requisitos de transplante, tenemos que disminuir su turbidez.

Hemos descubierto que mediante la neutralización en cámara de NM^{u}OH, el colágeno modificado situado entre dos microláminas gradualmente se aclara hacia el centro. Sin embargo el proceso de clarificación, es incompleto y consecuentemente el producto final (disco de colágeno) parece una diana con un intenso enturbiamiento en el centro (independientemente del tiempo de exposición al OH). Aunque el origen de este enturbiamiento no está claro, entendemos que el proceso de intercambio iónico entre la cámara (OH) y el colágeno (H^{+}), iones negativamente cargados de diferentes pesos moleculares están moviéndose en la misma dirección como los iones OH, lo que causa una turbidez desigual. Para compensar este efecto, abrimos el disco de colágeno y dejamos sólo un lado disponible para contactar con el medio neutralizador. (Fig. 11) Los otros lados están bloqueados por un gel diferente, que hace la función de un aceptor para los iones cargados negativamente que crean turbidez en los discos de colágeno. Nosotros podemos acelerar el proceso de neutralización utilizando una diferencia de potencial (en colágeno modificado y + en gel-aceptor). (Fig. 12)

Se debería advertir de que nuestro material final era óptimo no sólo en propiedades fisicoquímicas, sino que también en su capacidad para absorber y retener agua. El tiempo medio de deshidratación (Fig. 13) fue aproximadamente de 70 minutos. Al mismo tiempo, la adición del colágeno tipo IV a la composición óptima redujo T ^{1}/_{2} hasta varios minutos. La presencia de cualquier tipo de colágeno secundario extiende el tiempo de deshidratación dos veces o más de su original IV sin agentes de entrecruzamiento arbitrales. Indica que algunos tipos de colágenos pueden funcionar como agentes de entrecruzamiento naturales. Si el objetivo de la deshidratación es la concentración de solución diluida, tiene que hacerse sin ninguna adición (agentes de entrecruzamiento o colágenos) para mejorar los resultados subsecuentes de diferentes procedimientos.

La rehidratación de materiales liofilizados es de 5 a 10 veces más rápida (dependiendo de la composición) si son pretratados con agentes de entrecruzamiento. Nuestro intento para mejorar las características del producto final con otros agentes de entrecruzamiento específicos amino homobifuncionales, tales como glutaraldehído indica que no aclara el colágeno, pero incrementa su fragilidad y color amarillo aun en concentraciones tan bajas como 0,03%. La reacción con glutaraldehído muestra la presencia de grupos aminos adicionales disponibles, que no han reaccionado con HSAB (independientemente de su exceso).

En un esfuerzo para aumentar la fuerza de tensión, modificamos la molécula de colágeno. En el colágeno, la cantidad de grupos carboxilos libres excede la cantidad de grupos amino \sim 1,42 veces en la molécula nativa de colágeno. Para aumentar la cantidad de grupos amino, intentamos convertir el COOH en -NH_{2} mediante la reacción con etilendiamina + carbodiimida (EDC). Véase Kurzer et al., Chem. Rev. 67, p. 107 (1967), incorporado aquí por referencia. Sin embargo, las condiciones específicas de esta reacción de múltiples pasos, han tenido efectos perniciosos en las moléculas de colágeno. Hemos descubierto que EDS (H_{2}N - CH_{2} - CH_{2} - NH_{2}) etilendiamina, puede ser usada como una unión adicional entre las moléculas de colágeno durante la reacción con un grupo amino específico de un agente de entrecruzamiento (como HSAB):

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1

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Utilizando esta realización, cuando todos los componentes están preparados para el paso fotorreactivo, empieza a activar la luz UV activada, y observamos las siguientes reacciones:

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2

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Para obtener de producto:

3

Diferentes adiciones (sulfato de condroitina, dextrano) mejoran las características del producto. Los GAGs juegan un papel importante en la sustancia base de la córnea y en la organización estructural de las fibrilas de colágeno. (Por primera vez, los GAGs fueron extraídos por Woodin en 1952 (Woodin et al., Biochem. J. 51, p. 3198 (1952) y su composición fue descrita nueve años más tarde por Laurent y Anseth (Laurent et al., EXPTL Eye Res. 1,99.9 (1961). Hemos descubierto que el sulfato de condroitina se extiende en interacción química con el colágeno justo después del contacto entre estos dos componentes. El producto de esta reacción fueron fibras naturales, similares a las fibras de celulosa o algodón. Fuertes y transparentes, retienen pobremente el agua y eran absolutamente incomparables con el principal objetivo de los experimentos. Una reacción análoga fue descrita en Meyer en 1947 (Meyer, Physiol. Rev. 27, 45910 (1947). Hemos descubierto en la curación que los fibroblastos secretarían en el espacio de tejidos del alrededor, una mezcla de ácido hialurónico, sulfato de condroitina, y colágeno soluble, y que bajo la influencia de micropolisacáridos, el colágeno soluble precipitaría como fibras insolubles (Meyer, Physiol. Rev. 27, 45910 (1947). Los GAGs están siempre presentes en los tejidos conectivos, y son ventajosos para el uso en preparaciones de acuerdo con la presente invención debido a su influencia en los receptores de fibroblastos, y consecuentemente en el proceso de cicatrización.

Ejemplo 11 Desarrollo de materiales de implante incluyendo gelatina a partir de piel de pescado de agua fría

En esta realización, no solo no utilizamos diferentes tipos de colágeno, sino que también gelatina a partir de piel de pescado de agua fría (líquido 48%) y piel de ternera (polvo). Interaccionando con el agua, la gelatina forma emulsiones-coloides liofílicas (como albúmina o almidón) y puede ser transformada en el gel semisólido (conversión reversible gel-solución con enfriamiento-calentamiento). A diferencia de las soluciones de cristaloides homogéneas, todos los coloides son heterogéneos. Consisten de dos fases: partículas (fase dispersa) y medio (fase dispersa) (II). La característica importante de la gelatina es la imbibición, esto quiere decir, la cogida de fluido por un sistema coloidal resultando en un hinchamiento. La imbibición está afectada por el pH, la temperatura y la concentración de electrólitos.

Hemos probado la gelatina en diferentes proporciones con agentes de entrecruzamiento. El Glutaraldehído demostró ser el agente de entrecruzamiento preferido para la interacción efectiva con la gelatina. Las proporciones óptimas de reactivos están enumeradas en la Tabla 1.

TABLA Concentración de gelatina y agente de entrecruzamiento en la película de gel en relación a la fuente de gelatina

Fuente de gelatina	Concentración óptima	Concentración mínima	Concentración de glutaraldehído
Piel de pescado	10%	6%	0,25%
Piel de ternera	7%	3,25%	0,25%

La tabla 3 muestra que los productos finales del entrecruzamiento, teniendo igual fuerza de tensión, contienen diferentes cantidades de agua: la gelatina de ternera - 93% y la gelatina de pescado - 90%.

La gelatina de ternera es más transparente y tiene una coloración amarilla menos intensa. La gelatina que había sido pre-tratada con ultrafiltración (P.M. >100.000 daltons) tenía unas cualidades mucho mejores.

Después de la filtración, es más elástica, está menos teñida, tiene menos hinchamiento en el proceso de diálisis y es más estable en presencia de enzimas.

El sulfato de condroitina hace a la gelatina más hidrofílica y extiende el tiempo medio de deshidratación como mucho 3-4 veces en el ambiente normal (Fig. 14).

La rehidratación de la gelatina entrecruzada secada que contiene GAG debería ser llevada a cabo bajo una temperatura cercana a +20ºC. A temperaturas bajas (cerca de 0ºC), la gelatina que contiene GAG se hincha mucho más y el volumen final de ésta resulta ser más de 10 veces su volumen esperado.

Hemos sido capaces de rehidratar satisfactoriamente gelatina no entrecruzada con solución que contiene gutaraldehído. Algunos de los factores que influyen en la capacidad de rehidratar gelatina no entrecruzada están enumerado debajo:

A. Presión oncótica de la solución rehidratante

B. Concentración del agente de entrecruzamiento

C. Temperatura

A. Las macromoléculas que fueron añadidas por nosotros para rehidratar la solución retienen el agua, y por lo tanto aumentan la presión oncótica. Esto previene el hinchamiento rápido de las películas de gelatina secadas y vuelve el proceso de rehidratación uniforme y equilibrado. Las mejor solución de rehidratación es sulfato de condroitina al
4%.

B. El agente de entrecruzamiento con concentración del 1% (pero no 0,25% tal y como era en experimentos precedentes) une rápidamente las moléculas de gelatina en las partes superficiales de la lámina seca y previene la disolución inmediata de la gelatina. (La solución con concentración de 0,25% es inefectiva.)

C. La temperatura es directamente proporcional al tiempo de rehidratación.

Las láminas de gelatina rehidratada contienen hasta 98,5% de agua. Son frágiles y ligeramente amarillas, pero muy claras. Pueden ser utilizadas para la unión a la córnea sin suturas o intraestromalmente. También son buenas como vendajes húmedos para las superficies quemadas y como sistema de liberación de fármacos a largo término. (En el ambiente normal, películas de 1mm de grosor retienen el agua durante 10 horas).

Las láminas de gelatina-GAG no entrecruzadas secas (70% de gelatina, 30% de sulfato de condroitina) son sustancias extremadamente adhesivas y son opticamente casi neutras. Se unen firmemente a cualquier superficie húmeda y probablemente podrían ser usadas en queratoplastia sin sutura superficial o en epiqueratofaquia sin sutura superficial, con contacto restringido con el agua para prevenir el hinchamiento excesivo.

Haciendo preparaciones para la investigación de E.M., hemos encontrado un defecto de la gelatina de pescado.

Tal y como preparado para los experimentos, la lente se degradó completamente en el disolvente de tetróxido de Osmio, el oxidante más fuerte.

Debido a que proponemos transplantar todos los productos probados en tejidos vivos que son ricos en sustancias altamente oxidativas y digestivas, decidimos realizar para ellas más pruebas -comprobar su resistencia a algunos enzimas.

Descubrimos que la gelatina de pescado, especialmente sin filtrar, conteniendo ambos tipos de fibras de alto y bajo peso molecular, es muy inestable a la acción de la peroxidasa, Tripsina y colagenasa B. Si tomamos el tiempo de digestión en el enzima como el índice principal de estabilidad, entonces hemos determinado que la gelatina de pescado filtrada (todas las moléculas son mayores de 100.000 dalton) es 4 veces más estable a la acción de peroxidasa que la no filtrada, es 1-5 veces más estable a la acción de la colagenasa B y tripsina.

La adición de sulfato de condroitina aumenta unas diez veces la estabilidad de la gelatina de pescado filtrada en tripsina, pro no intensifica la resistencia a la peroxidasa y colagenasa B. La gelatina de ternera, incluso sin filtrar, es 10 veces más estable en colagenasa B que la gelatina de pescado filtrada. Siendo indigerida, la gelatina de ternera se mantiene en tripsina como mucho unas 140 veces más.

Esperamos que para gelatina de ternera filtrada los resultados sean aún mejores.

En el proceso de probar las lentes de colágeno, descubrimos una ventaja del colágeno entrecruzado (Tipo I y Tipo V). Era resistente a la digestión en colagenasa B durante 100 horas a temperatura ambiente, y se mantuvo estable en peroxidasa y tripsina después del décimo día de experimento (150 veces más que el colágeno no entrecruzado).

Ejemplo 12 Desarrollo de suturas químicas

También hemos investigado el desarrollo de métodos para hacer suturas químicas para unir tejidos desconectados bruscamente. Como prototipos de tejidos vivos se utilizaron:

- gel de colágeno sin tratar

- gel de colágeno entrecruzado

- gelatina entrecruzada (filtrada, sin filtrar, de pescado, de ternera)

Como materiales para suturas químicas se utilizaron:

- NSAB

- Sulfo-NSAB

- Glutaraldehído

- Colágeno modificado (con HSAB o Sulfo-HSAB; antes de la neutralización)

- Gelatina inmediatamente preparada y glutaraldehído (líquido durante el "sellado")

Todas "las suturas fueron probadas en diferentes combinaciones con tejidos". Sólo una combinación fue satisfactoria donde el colágeno sin tratar como "tejido" y el colágeno modificado como "sutura" se utilizaron.

Después de la neutralización y la exposición a la luz UV, la sutura no se diferenció de los "tejidos" por la firmeza. Hemos discutido que los resultados positivos de este experimento dependen del uso de colágeno modificado (pH\sim5). Este colágeno se vuelve soluble en ácido y el colágeno previamente neutralizado otra vez en solución. Proporciona moléculas de "tejidos" y "suturas" con una oportunidad amplia de difusión mutua.

Para las suturas químicas se debería utilizar un líquido transportador del agente de entrecruzamiento, que cambia el estado de agregación en el proceso de reacción.

Hemos cambiado la composición de suturas haciéndolas menos peligrosas para el receptor. Nuestros resultados están descritos posteriormente, con referencia a la Fig. 15.

Suturas: Agente de entrecruzamiento en fase líquida, no transportador.

Tejidos: tal y como se muestra anteriormente.

La zona de contacto se muestra en la Figura 15b.

En la ampliación A, vemos la irregularidad del contacto.

En la ampliación B, vemos una pluralidad de puntos negros. Estos puntos son "suturas" - moléculas de agente de entrecruzamiento. Algunos de éstos se han unido a residuos de lisina, algunos están dispuestos en espacios intermarginales y algunos han migrado profundamente entre los filamentos de colágeno, habiendo sido forzados por enlaces químicos. Cada molécula de agente de entrecruzamientos fotorreactivo heterobifuncional deber unirse con otra molécula de agente de entrecruzamiento en el otro lado de la "herida". Sólo entonces las suturas químicas son efectivas después de la exposición de UV. El agente de entrecruzamiento homobifuncional (glutaraldehído) debe unirse a dos grupos amino, y otra vez en los lados opuestos de la "herida".

También ensayamos diferentes combinaciones de tipos de glutaraldehído y colágeno.

El colágeno tipo I (vitrogen) reacciona con glutaraldehído 0,25% en el transcurso de 15-20 minutos.

El producto final es muy claro y suficientemente fuerte para la implantación intralaminar o simple unión superficial, pero la considerable fragilidad que tiene hace imposible cualquier manipulación con las suturas.

La combinación de colágeno de Tipos I y V produce un producto final considerablemente fuerte y un poco turbio.

En ambos casos, el contenido de agua en los productos finales fue del 99%. De hecho, es agua pura - un buen material para lentes de contacto. Pero debemos señalar que la deshidratación de este producto es un proceso prácticamente irreversible. Todas las muestras deshidratadas eran bastantes hidrofóbicas, y la rehidratación fue lenta y muy incompleta. Hemos descubierto que este efecto está causado por la longitud del espacio de entrecruzamiento
BRAZO, y otros agentes de entrecruzamiento específicos grupo amino homobifuncionales, que son más largos en espacio, promoverán la rehidratación rápida.

Diferentes muestras de "tejidos" utilizadas en nuestros estudios de "suturación" química, se colocaron en placas de Petri bajo condiciones no estériles. Siete días después, se reveló la propagación bacteriana. En todos los casos, con una excepción, la propagación de bacterias no tuvo lugar en el colágeno entrecruzado. Por lo tanto, el colágeno entrecruzado parece ser un mal medio para la propagación de bacterias, o el agente de entrecruzamiento fotorreactivo heterobifuncional exhibe características bacteriostáticas y/o bactericidas.

Claims (26)

1. Un método de acoplamiento de polímeros que contienen aminoácidos ex-vivo, dicho método comprendiendo los pasos de:

proporcionar un primer tipo de polímero de colágeno y un segundo tipo de polímero de colágeno, en donde el primer tipo de polímero de colágeno y el segundo tipo de polímero de colágeno son de diferentes tipos de colágeno;

combinar el primer tipo de polímero de colágeno, el segundo tipo de polímero de colágeno, y un agente de entrecruzamiento heterobifuncional fotoactivable teniendo al menos un sitio fotoactivable y al menos un sitio convencional, en donde al menos uno de dichos sitios convencionales está acoplado al menos a uno de dichos primer tipo de polímero de colágeno y segundo tipo de polímero de colágeno; y

fotoactivar el agente de entrecruzamiento, en donde almenos uno de dichos sitios fotoactivable está acoplado al otro de dichos primer tipo y segundo tipo de polímeros de colágeno en la combinación.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho primer tipo de polímero de colágeno es colágeno tipo I.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dicho colágeno tipo I se selecciona del grupo constituido por colágeno bovino tipo I y colágeno placentario tipo I.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho segundo tipo de polímero de colágeno es colágeno tipo V.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho colágeno tipo V es colágeno humano tipo V.

6. El método de la reivindicación 2, en donde dicho segundo tipo de polímero de colágeno es colágeno tipo V, y en donde la proporción de colágeno tipo I a colágeno tipo V es 10:1 o inferior.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el agente de entrecruzamiento heterobifuncional fotoactivable se selecciona del grupo constituido por compuestos diazo, compuestos aril azida, y compuestos alquil azida.

8. El método de la reivindicación 1, en donde dicho primer tipo de polímero de colágeno se selecciona del grupo constituido por los tipos de colágeno humano I, IV, V y IX, y en donde dicho segundo tipo de polímero de colágeno se selecciona del grupo que consiste en colágeno no humano tipos I, IV, V y IX.

9. El método de la reivindicacón 1, en donde dichos primer y segundo tipo de polímeros de colágeno se combinan además con gelatina antes de la fotoactivación del agente de entrecruzamiento, dicha gelatina seleccionada del grupo que consiste en gelatina de piel de pescado y gelatina de piel de ternera.

10. Un polímero acoplado que contiene aminoácidos elaborado mediante el procedimiento definido en la reivindicación 1.

11. Una composición de polímeros acoplados que contienen aminoácidos que ha sido producida ex-vivo, comprendiendo:;

un primer tipo de polímero de colágeno;

un segundo tipo de polímero de colágeno; y

un agente de entrecruzamiento heterobifuncional fotoactivable teniendo al menos un sitio fotoactivable y al menos un sito convencional, en donde al menos uno de dichos sitios fotoactivable está acoplado al menos a uno de dichos primer y segundo tipo de polímero de colágeno, y en donde al menos uno de dichos sitios convencionales está acoplado al otro de dichos primer y segundo tipo de polímero de colágeno en la combinación, con la condición que el primer tipo de polímero de colágeno y el segundo tipo de polímero de colágeno sean de diferentes tipos de colágeno.

12. La composición de la reivindicación 11, en donde dicho primer tipo de polímero de colágeno es colágeno tipo I.

13. La composición de la reivindicación 12, en donde dicho colágeno tipo I se selecciona del grupo que consiste de colágeno bovino tipo I y colágeno placentario humano tipo I.

14. La composición de la reivindicación 11, en donde dicho segundo tipo de polímero de colágeno es colágeno tipo V.

15. La composición de la reivindicación 14, en donde dicho tipo de colágeno V es colágeno humano tipo V.

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16. La composición de la reivindicación 12, en donde dicho segundo tipo de polímero de colágeno es colágeno tipo V, y en donde la proporción de colágeno tipo I a colágeno tipo V es 10:1 o inferior.

17. La composición de la reivindicación 11, en donde el agente de entrecruzamiento heterobifuncional fotoactivable se selecciona del grupo que consiste en compuestos diazo, compuestos aril azida, y compuestos alquil azida.

18. La composición de la reivindicación 11, en donde dicho primer tipo de polímero de colágeno se selecciona del grupo que consiste en colágeno humano tipos I, IV, V, y IX, y en donde dicho segundo tipo de polímero de colágeno se selecciona del grupo que consiste en colágeno no humano tipos I, IV, V, y IX.

19. La composición de la reivindicación 11, en donde dicho primer y segundo tipo de polímeros de colágeno están además combinados con una gelatina antes de la fotoactivación del agente de entrecruzamiento y dicha gelatina se selecciona del grupo que consiste en gelatina de piel de pescado y gelatina de piel de ternera.

20. Un método de acoplamiento de polímeros que contienen aminoácidos comprendiendo los pasos de:

combinación de un polímero que contiene aminoácidos, un proteoglicano, y un agente de entrecruzamiento heterobifuncional fotoactivable teniendo al menos un sitio fotoactivable y al menos un sitio convencional, en donde al menos uno de dichos sitios convencionales está acoplado al menos a uno de dichos polímeros que contienen aminoácidos y dicho proteoglicano; y

fotoactivación del agente de entrecruzamiento, en donde al menos un sitio fotoactivable está acoplado al otro de dichos polímeros que contienen aminoácidos y dicho proteoglicano.

21. El método de la reivindicación 20, en donde dicho polímero que contiene aminoácidos es colágeno.

22. El método de la reivindicación 21, en donde dicho colágeno se selecciona del grupo que coniste en colágeno tipos I, IV, V, IX.

23. Un polímero que contiene aminoácidos producido por el procedimiento definido en la reivindicación 22.

24. Una composición de polímero que contiene aminoácidos acoplado que comprende:

un polímero que contiene aminoácidos;

un proteoglicano; y

un agente de entrecruzamiento heterobifuncional fotoactivable teniendo al menos un sitio fotoactivable y al menos un sitio convencional, en donde al menos uno de dichos sitios fotoactivable está acoplado al menos a uno de dichos polímeros que contiene aminoácidos y dicho proteoglicano, y en donde al menos uno de dichos sitios convencionales está acoplado a otro de dichos polímeros que contienen aminoácidos y dicho proteoglicano.

25. La composición de la reivindicación 24, en donde dicho polímero que contiene aminoácidos es colágeno.

26. La composición de la reivindicación 25, en donde dicho colágeno se selecciona del grupo que consiste de colágeno tipos I, IV, V, y IX.