CA2620633A1 - Polymeres biodegradables modifies, leur preparation et leur usage pour la fabrication de biomateriaux et de pansements - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation en milieu aqueux d'un polymèr e biodégradable modifié comprenant au moins deux étapes. La première de celles - ci est une étape de réaction entre un aminoacide, un peptide ou un polypepti de et I'anhydride maléique pour former un composé ayant une fonction acide viny l- carboxylique insature. Dans la seconde étape de réaction, le diacide insatur e obtenu a la première étape est mis en réaction avec un polymère biodégradabl e ayant au moins une fonction amine primaire, tel une protéine fibreuse ou un glycosaminoglycane. Le polymère préférentiellement utilisé est du collagène ou du chitosane. L'invention concerne également le polymère biodégradable modif ié obtenu avec ce procédé. L'invention concerne de plus un biomatériau ou un pansement contenant le polymère biodégradable modifié ayant des propriétés biocompatibles, cyto-compatibles, hémostatiques, bactéricides et cicatrisantes, et son usage médical, biomédical, pharmaceutique ou cosmétiqu e.

Description

POLYMERES BIODÉGRADABLES MODIFIÉS, LEUR PRÉPARATION ET LEUR
USAGE POUR LA FABRICATION DE BIOMATÉRIAUX ET DE PANSEMENTS
1. Domaine de l'invention La présente invention a pour objet un nouveau procédé chimique en milieu aqueux permettant de modifier des polymères biodégradables. Le procédé comprend une première étape de réaction en milieu aqueux entre un acide aminé, un peptide ou un polypeptide avec l'anhydride maléique pour former un acide vinyl-carboxylique qui est lors d'une seconde étape de réaction mis en présence avec un polymère biodégradable possédant au moins une fonction amine primaire tel un glycosaminoglycane, tel que le chitosane, ou une protéine fibreuse, telle que le collagène ou l'élastine.

La présente invention a également pour objet les polymères modifiés biodégradables obtenus selon le procédé et leur usage dans les domaines médical, pharmaceutique et cosmétique, particulièrement pour la fabrication de biomatériaux et de pansements ayant des propriétés de bio- ou cyto-compatibilité et des propriétés hémostatiques, bactéricides et/ou cicatrisantes.

2. Description de l'art antérieur 2.1. Les biomatériaux Le domaine lié aux pansements de cicatrisation ou chirurgicaux, aux biomatériaux ou aux colles fibrines a fait l'objet d'un développement intense depuis un siècle, et principalement dans le but d'augmenter l'effet hémostatique de ces différents produits et de favoriser ainsi la coagulation du sang. Les résultats de ces développements ont fait l'objet à ce jour de centaines de communications écrites dans des revues spécialisées et journaux ou de brevets d'invention.

Il est bien connu de l'Homme de l'art qu'une hémorragie s'arrête d'elle-même selon le processus naturel de la coagulation sanguine. Cependant, les conséquences d'une hémorragie peuvent varier selon l'importance et l'origine de celle-ci. Une petite coupure de l'épiderme ne peut être comparée à une forte hémorragie provoquée lors d'une opération chirurgicale entraînant une importante perte de sang et nécessitant une transfusion sanguine.

Le pouvoir adhésif du caillot sanguin dû à la présence d'un réseau de fibrine polymérisée est bien connu depuis 1909 où Bergel confirma que la fibrine peut être utilisée comme substance de collage physiologique aux propriétés cicatrisantes.

Cette découverte permet quelques années plus tard à Grey (1915) d'utiliser des tampons de fibrine pour coaguler des hémorragies cérébrales et hépatiques.
Cependant, il faudra attendre 1949 pour voir Cronkite, puis Tidrick et Warner, utiliser du fibrinogène combiné à de la thrombine, pour la fixation de greffes cutanées.

Finalement, grâce à d'importants travaux de recherche de E. J. Cohn en 1946, portant sur le fractionnement des protéines plasmatiques, des protéines de coagulation ont commencé à être exploitées et quelques années après le mécanisme des différentes protéines participant à cette coagulation a été compris.

Malgré les progrès importants dans le domaine de la guérison des plaies par des substances biologiques, on vit apparaître dans les années 60 sur le marché un adhésif tissulaire à base de produits synthétiques tel un adhésif de la famille cyanoacrylate très puissant, polymérisé en quelques secondes. Toutefois, son utilisation provoquait une toxicité cellulaire importante. D'autres colles synthétiques de la même famille apparaissent alors mais avec des radicaux plus longs possédant des propriétés hémostatiques, bactériostatiques et cicatrisantes. Cependant, ces colles posaient aussi des problèmes de réactions inflammatoires, et de toxicité tissulaire encore trop importants.

3 En 1967, les colles à base de formaldéhyde contenant de la gélatine, de la résorcine et du formol furent présentées. Elles apportaient une certaine amélioration du point de vue de la toxicité mais également des réactions allergiques et une histotoxicité
liée à la présence du formol. Les réactions inflammatoires, les toxicités tissulaires, et les allergies entraînent le rejet de ces adhésifs peu biocompatibles.

Dans le brevet US 3,364,200 (1968), Ashton et al. rapportent que les tampons de gaze hémostatiques conventionnels et autres articles de ce type, imprégnés d'un matériau hémostatique tel que le chlorure ferrique, la thrombine, ou équivalent, ont été utilisés en chirurgie depuis des années pour stopper les saignements. Cependant, ces matériaux hémostatiques chirurgicaux sont critiqués car ils ne peuvent pas être laissés in situ dans une plaie refermée, à cause du risque de réaction des tissus avoisinants à ces corps étrangers. De plus, si ces matériaux sont laissés à l'intérieur d'une plaie cicatrisée, il faudra rouvrir la plaie en brisant le caillot sanguin formé impliquant de nouveaux saignements. Ashton et al mentionnent donc qu'il existe un besoin vital pour des matériaux hémostatiques qui pourraient rester dans une plaie refermée sans toutefois causer de réactions sérieuses des tissus avoisinants. Dans cette optique, Ashton et al.
proposent l'utilisation de la cellulose oxydée qui non seulement présente des propriétés hémostatiques, mais qui est aussi absorbable par les tissus animaux. Ashton et al.
proposent donc des matériaux hémostatiques en cellulose oxydée ayant une stabilité
accrue contre la détérioration pendant le stockage. La cellulose oxydée utilisée provient de pâte de bois, du coton, de linters de coton, de ramie, de jute, de papier ou de matériaux similaires, et aussi de cellulose régénérée ou de rayonne produites par les procédés "viscose" ou de Bemberg. Cette invention a conduit à la commercialisation de SurgicelfTM par Johnson & Johnson.

L'utilisation des propriétés adhésives de la fibrine par l'intermédiaire d'une très forte concentration de fibrinogène et de Facteur XIII avec un inhibiteur de la fibrinolyse pour effectuer un collage expérimental de nerf a été développée dès 1972 par H.
Matras.
Suite à ses travaux, on vit apparaître sur le marché européen dès 1978 la première colle biologique élaborée et fabriquée par Immuno AG (Vienna, Austria). Cette colle est utilisée pour arrêter l'hémorragie et est constituée de protéines de coagulation d'origine

4 PCT/CA2006/001468 humaine contenant principalement le fibrinogène et le facteur XIII. Ce composé
est mélangé juste avant son utilisation avec une solution antifibrinolytique d'origine bovine :
l'Aprotinine. Cette solution est mélangée au fur et à mesure lors de son application sur les plaies avec une solution de thrombine d'origine bovine. Depuis lors, plusieurs autres produits semblables sont disponibles, notamment en chirurgie.

Parallèlement aux développements des colles biologiques, les substances ayant des propriétés hémostatiques naturelles ou transformées chimiquement sont introduites sur le marché. Ces nouveaux produits sont appelés également pansements biologiques et parmi les substances utilisées, on trouve les polysaccharides portant seulement les motifs glucosiques comme la cellulose et ses dérivés cellulosiques, les gommes et les alginates extraits à partir des algues. Les polysaccharides contenant un ou plusieurs groupes amines ou une unité répétitive d'une fonction amine sont appelés des aminopolysaccharides ou glycosaminoglycanes.

Les glycosaminoglycanes sont donc des longues chaînes de polysaccharides non ramifiées faites de la répétition d'un même motif disaccharide. Les disaccharides de ce motif comportent un monosaccharide portant un groupe carboxylique appelé acide galacturonique et un deuxième saccharide portant un groupe N-acétylamine:
appelé
acétylglucosamine ou N-acétylgalactosamine. Ces glycosaminoglycanes se trouvent en abondance dans les tissus conjonctifs, en particulier dans les tissus osseux et cartilagineux. Les glycosaminoglycanes les plus utilisés sont par exemple, l'acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine, le dermatane, le sulfate d'héparane ou l'héparine. Ces mêmes tissus conjonctifs contiennent aussi des protéines fibreuses de structure collagène et élastine, ces deux protéines ayant également des applications médicales très intéressantes dans le domaine de la guérison des plaies.

D'autre types de glycosaminoglycanes se trouvent dans les carapaces des invertébrés:
comme la Chitine [R-(1,4)-2-acétamido-2-diseoxy-D-glucose ou poly N-acéty-D-glycosamine]. La déacétylation de la chitine conduit à la formation du chitosane [([3-1,4)-2-amino-2-désoxy-D-glucose]. La chitine est le deuxième polysaccharide naturel le plus abondant après la cellulose.

Il est bien connu que les glycosaminoglycanes et les protéines fibreuses ont des propriétés naturelles biocompatibles, biodégradables, hémostatiques et cicatrisantes.
Ces caractéristiques permettent de les classer comme des biopolymères ou des biomatériaux. De nombreuses applications médicales ou esthétiques ont été
développées avec ces biomatériaux, surtout dans le domaine de la guérison des plaies.
Chaque biopolymère natif a ses propres propriétés biologiques et physicochimiques, certains ont des propriétés biomécaniques plus fragiles ou se dégradent in vivo plus rapidement que d'autres. Selon l'utilisation désirée, beaucoup de travaux sur leur modification structurale par voie chimique ont été apportés à ces biopolymères pour obtenir un biomatériau mécaniquement et chimiquement plus robuste, plus absorbant ou biochimiquement plus actif. Certaines modifications visent à modifier les propriétés en volume ou en surface des biopolymères pour que ces nouveaux biomatériaux apportent une absorption exponentielle de leur épaisseur lorsqu'ils sont en contact avec le milieu aqueux.

K. Park et al. (Biodegradable Hydrogels for Drug Delivery - Technomic, Publishing Co., Inc. 1993, page 107) ont classé les polysaccharides selon les sources suivantes:
i. Algues : Agar-agar, furcelleran, alginate, carrageenan;
ii. Végétales : extrait de plante (amidon, pectine, cellulose), gommes exudates (gomme Arabique, tragacanth, karaya, ghatti) et gommes de graines (gomme de guar, gomme de graine de caroube) iii. Microbienne : xanthane, pullulane, scléroglucane, curdlane, dextrane, gellane.
iv. Animale : chitine et chitosane, Sulfate de Chondroïtine, Sulfate de dermatane, héparine, kératane, acide hyaluronique.

Les polymères synthétiques tels que les polyols et leurs dérivés, les poly(vinylalcools), les polyvinylpyrrolidones, les polyesters, ou les polyanhydrides sont très bien exploités pour différentes applications pharmaceutiques et médicales. Ces polymères, considérés comme des matériaux biodégradables, sont souvent appelés hydrogels .

Les biomatériaux cités plus haut peuvent être réalisés et utilisés seuls en tenant compte de leurs propriétés hémostatiques ou en leur incorporant des protéines de coagulation tels que le fibrinogène et la thrombine, et des protéines favorisant la cicatrisation. Les ingrédients pharmaceutiquement acceptables peuvent également être ajoutés comme les antibiotiques, des agents antibactériens, des agents anti-cancéreux, etc.

2.2. Modification des biomatériaux Tel que mentionné ci-dessus, la première étape du procédé selon l'invention de modification des polymères biodégradables consiste en une réaction entre l'anhydride maléique et un acide aminé ou l'un de ses dérivés.

2.2.1. Réaction entre un acide aminé ou l'un de ses dérivés et l'anhydride maléique La réaction entre un anhydride maléique et un acide aminé a fait l'objet de plusieurs brevets ou articles scientifiques.

Le brevet japonais JP56012351 (Uesugi Hideyuki et al., 1981) décrit l'obtention d'un N-acylaminoacide par la réaction d'un anhydride maléique ou succinique avec un aminoacide en présence d'un solvant organique inerte tel que le tétrahydrofurane (THF) ou le dioxane, conduisant par exemple à l'obtention du N-p-carboxypropionyl-DL-a-alanine. La réaction est effectuée à une température comprise entre 40 et 1100, est utilisée comme un intermédiaire dans la synthèse de composés organiques tels que des tensio-actifs ou dans l'extension de la chaîne de composés à haut poids moléculaire comme les polyamides ou polyesters.

Le brevet japonais JP 59197459 (Itou Fumisaku et al., 1984) décrit une méthode d'obtention de matériaux composés de polyamides résistant aux impacts et à la fatigue due à la flexion à partir d'anhydride maléique greffé sur un élastomère qui est ensuite mis en réaction avec un acide aminé.

Le brevet US 5,665,693 (Kroner et al., 1997) décrit une méthode de préparation de détergents ou de nettoyants contenant un très faible taux de phosphate ou en absence de phosphate. Cette méthode consiste à faire réagir l'anhydride maléique, l'acide maléique et ou l'acide fumarique sur des protéines ou des protéines hydrolysées qui n'ont pas dépassé le stade du dipeptide. La réaction a eu lieu à une température comprise entre 120 à 300 C sous haute pression et dans un mélange de solvants aqueux et organiques.

Le brevet japonais JP 2000319240 ({mai Masaru et al., 2000) décrit une méthode de production d'un acide maléinamique par réaction de l'anhydride maléique sur un acide amino carboxyle en présence d'un sel d'ammonium et dans un solvant hydrocarboné
non polaire.

Butlet P. J. G. et al. (Biochemical journal (1967), vol. 108, p.78-79; et (1969), vol. 112, p.
679-689) ont montré que l'anhydride maléique réagit rapidement et spécialement avec des groupes aminés des protéines et des peptides avec formation des maleyl-protéines.
Le groupe maleyl-aminé est très stable à pH neutre ou alcalin mais facilement hydrolysé
à pH acide. Cette caractéristique permet de bloquer des groupements aminés de façon réversible. Le groupe maleyl pourrait être enlevé à cause des formes protonées des groupes carboxyliques libres qui catalysent l'hydrolyse des liaisons amide.

Dixon H. B. F. et al. (Biochemical journal, (1968), vol. 109, p. 312-314) ont également mis en évidence le blocage réversible des groupes aminés des protéines, par l'utilisation de l'anhydride citraconique (ou anhydride 2-méthylmaléique) ou l'anhydride 2,3-diméthylmaléique à la place de l'anhydride maléique.

Riley M. et al. (Biochemical journal, (1970), vol. 118, p. 733-739) ont eux aussi développé la réaction réversible des groupes aminés des protéines avec l'anhydride exo-cis-3,6-endoxo-A-tétrahyd rophthalique.

De Wet P. J. (Agroanimalia, (1975), 7(4), p. 101-104), décrit l'obtention de la maléylméthionine par la réaction de l'anhydride maléique sur la L-méthionine.
Selon l'auteur, ce composé est stable à pH 5,0 et hydrolysé à 60% à pH 2,20 après 8 heures.
Cette réversibilité de la réaction de l'anhydride maléique avec un a-amino acide est proposée comme une méthode possible pour la protection contre la déamination dans le rumen.

Toutefois, aucun des documents mentionnés ci-dessus ne décrit l'obtention d'un composé maiéyl-aminoacide directement par la réaction d'un anhydride maléique avec un acide aminé en milieu aqueux.

2.2.2. Modification d'un polymère biodégradable Tel qu'également mentionné ci-dessus, la seconde étape du procédé selon l'invention consiste en la modification d'un polymère biodégradable et notamment le collagène ou le chitosane.

Les protéines fibreuses, tels le collagène, et les glycosaminoglycanes, tel le chitosane, sont souvent transformés ou polymérisés pour obtenir des produits avec des caractéristiques nouvelles correspondantes à des nouvelles utilisations demandées ou attendues. Ces produits trouvent de très nombreuses applications dans les domaines médical, pharmaceutique, esthétique ou cosmétique.

2.2.2.1. le collagène Le collagène est une glycoprotéine fibreuse contenue dans les tissus conjonctifs et interstitiels. De structure moléculaire de taille élevée, il constitue un élément très important de la matrice extracellulaire du corps humain. Il y a différents types de collagène selon leur localisation avec des propriétés qui lui permettent de se classer comme l'un des principaux éléments essentiels de la peau, des tendons, des cartilages et des os. Le collagène est inextensible et résiste bien à la traction. Il est notamment indispensable au processus de cicatrisation.

De par ses propriétés hémostatique et cicatrisante, le collagène trouve de très nombreuses applications intéressantes dans le domaine biomédical. On note quelques applications majeures suivantes du collagène :

- produits chirurgicaux (hémostats topiques et fils de suture), - implants (implants orthopédiques, dentaires ou vessie), - produits cosmétiques injectables (rides et ridules faciales, cicatrices), - ophtalmologie (écran de cornée, lentilles de contact, solution viscoélastique), - substituant de peaux.

L'extraction, l'isolation et la transformation du collagène permettent d'obtenir un biomatériau médical absorbable. Au fur et à mesure des besoins grandissants et la nécessité d'adaptation du produit aux sites utilisés, l'état naturel du collagène a été
modifié soit par polymérisation chimique ou physique (chaleur, radiation, greffage, mélange à d'autres polymères) pour que le produit fabriqué à base de collagène soit plus efficace et réponde mieux aux attentes des cliniciens et au confort des patients tel que la sécurité d'utilisation du produit (non toxique, non-immunogène et non-inflammatoire), l'efficacité, la biocompatibilité, la biorésorbabilité, la tolérance, l'élasticité
ou la maniabilité.

L'une des premières applications du produit à base de collagène a été le contrôle du saignement excessif. Le produit le plus ancien qui a été préparé pour cela est le GelfoamTM . Le brevet US 2,465,357 (Correll, 1949) décrit en effet une éponge de gélatine perméable aux liquides et insoluble dans l'eau, possédant les caractéristiques physïques d'une éponge tout en étant absorbable par les corps animaux.
L'éponge selon l'invention est une substance poreuse qui doit être relativement molle lorsqu'elle est mouillée et doit présenter plusieurs interstices fins pour y loger une certaine quantité
d'agent thérapeutique et permettre une libération lente de celui-ci. L'éponge agit également comme un matériau efficace pour absorber les flux libres de fluides comme le sang et les exsudats autour d'une plaie. Les chirurgiens ont utilisé ce produit hémostatique dès 1940, mais il s'est avéré peu efficace. La gélatine ne joue qu'un rôle passif dans l'hémostase topique où le saignement est contrôlé mécaniquement par une pression exercée sur la plaie ou sur la coupure. L'effet hémostatique passif de la gélatine ne sert que pour une utilisation restreinte où le besoin d'une éponge de gélatine permettant l'absorption du sang abondant est nécessaire. Ces éponges sont des produits lyophilisés et fabriquées à partir d'une solution de gélatine purifiée et traitée spécialement. Placées sur la plaie, elles permettent d'absorber une quantité
de liquide corporel équivalente à plusieurs fois leur poids.

De par la faible efficacité des éponges de gélatine, la recherche s'est vite orientée vers l'isolation du collagène, la purification et la transformation de celui-ci pour réaliser un produit plus performant. Un pansement topique à base de collagène est apparu sur le marché aux alentours de 1980. Le développement de cette matière s'est poursuivi avec d'autres applications comme la protection cornéenne, suivi du collagène injectable pour un traitement cosmétique des rides et des cicatrices. Les brevets portant sur l'isolation, les transformations, les applications et les méthodes de fabrication de ces produits avec le collagène sont innombrables, et nous citons ici quelques brevets portant sur la polymérisation ou le greffage du collagène seul ou mélangé à un glycosaminoglycane par voie chimique. Les auteurs visent en général l'obtention d'un biomatériau absorbable et efficace et aux multiples usages tels que :

- un pansement actif pour aider l'arrêt d'hémorragie pendant la chirurgie, - le traitement des plaies dentaires, - la fermeture des plaies, - le traitement des brûlures, - le traitement des incontinences, - la protection des yeux après l'abrasion ou la chirurgie de la cataracte, - un substitut de greffe de la peau, - un substitut de greffe des os, - l'élimination des rides, des acnés et des cicatrices, ou - la prévention des adhésions post-opératoires.

Le collagène natif ne peut être utilisé pour toutes les applications citées ci-dessus. La raison souvent évoquée est sa dégradation rapide in vivo, son manque d'élasticité qui l'empêche de s'adapter au contour des plaies et aussi sa faible force de traction. C'est pourquoi les auteurs cités ci-après cherchent à modifier l'état naturel du collagène pour lui trouver de nouvelles applications. Les modifications du collagène sont souvent portées sur la polymérisation ou la greffe d'autres groupements ou d'autres polymères d'origine naturelle ou chimique. En général, le changement de la structure initiale du collagène réduit considérablement la réaction immunologique.

Différents types et grades de collagène (avec et sans télopeptides) sont commercialement disponibles. Ces collagènes sont d'origine animale ou humaine.
Par nature, le collagène a des caractéristiques biochimiques et physicochimiques qui conviennent relativement bien pour son usage en biomatériaux. Ces caractéristiques sont en particulier une bonne biocompatibilité, une biodégradabilité et une propriété
hémostatique remarquable. Par contre le collagène a une force de traction mécanique trop faible. Les produits à base de collagène comme les implants médicaux, chirurgicaux ou cosmétiques ont rencontré des défauts d'usage comme la difficulté de manipulation manuelle. Le collagène étant difficilement pliable, il s'avère difficile de suivre le contour d'une blessure. En outre, la biodégradabilité du collagène pour certaine application est considérée comme trop rapide, par exemple l'implant demande une longue période pour procurer des actions palliatives et curatives. Pour répondre aux attentes des patients, les produits médicaux à base de collagène doivent être modifiés chimiquement et souvent par couplage du collagène à un autre groupe chimique.
Depuis que l'on connaît que le constituant majeur de la peau est le collagène, une approche logique du développement du substitut de la peau a conduit à étudier le comportement du collagène reconstitué placé en contact avec les tissus vivants.
Cette approche a été explorée par un grand nombre de chercheurs utilisant une procédure générale d'extraction et de purification à différents degrés du collagène d'origine animale. Ce collagène purifié a été ensuite converti en film ou autres structures pour usage tels que des pansements hémostatiques ou des implants dans un tissu vivant pour pouvoir déterminer leur comportement in vivo. En fait, la purification du collagène a pour but de digérer par des enzymes protéolytiques la partie non-hélicale du collagène souvent appelée télopeptides pour réduire sensiblement l'immuno-réaction.

Du collagène modifié par voie enzymatique a été préparé et testé par Rubin et Stenzel [Rubin, A. L. and Stenzel, K. H., in Biomaterials (Stark, L. and Aggarwal, G., Eds.), Plenum Press, N. Y. (1969)] qui montrent que le traitement ne provoque pas d'immuno-réaction comparé à un collagène non modifié. Cette différence de comportement s'expliquerait en ce que l'enzyme utilisée enlève efficacement les télopeptides du collagène sans pour autant détruire la structure moléculaire initiale.

Dans le brevet US 3,742,955 (1973), Battista et al. rapportent que le collagène traité ou préparé est utile en chirurgie pour le traitement des plaies, et que E.
Peacock etal. dans Ann.. Surg. 161, 238-47, February, 1965, ont rapporté que le collagène possédait des propriétés hémostatiques lorsqu'il était utilisé comme pansement. Battista et al. ont découvert que la fibre de collagène et les produits fibreux dérivés du collagène, lorsqu'ils sont préparés adéquatement et lorsqu'ils sont mouillés par le sang, non seulement provoquent l'hémostase, mais montrent aussi des propriétés d'adhésion aux surfaces biologiques dans les animaux à sang chaud, totalement inattendues.
Battista et al. proposent aussi une méthode de préparation de fibres de collagène finement divisées et de produits fibreux dérivés du collagène, utiles comme agents hémostatiques et possédant des propriétés d'adhésion uniques telles que décrites ci-dessus. Cette invention a conduit à la mise sur le marché d'Avitene par ACECON.
Le brevet US 4,488,911 (Luck et a1.,1984) décrit une méthode de préparation de collagène en solution (CIS), dans laquelle du collagène natif est extrait d'un tissu animal et dilué dans une solution acide aqueuse, puis digéré par une enzyme telle que la pepsine, trypsine ou PronaseTM. La digestion enzymatique permet de retirer les portions télopetides des molécules de collagène, et d'isoler du collagène atélopeptide en solution. Le collagène atélopeptide ainsi obtenu est substantiellement non-immunogène et substantiellement non-réticulé du fait de l'élimination des régions réticulées principales. Le collagène en solution peut ensuite être précipité par dialyse dans un environnement de cisaillement modéré pour produire des fibres de collagène qui ressemblent à des fibres de collagène natif. Les fibres précipitées et reconstituées peuvent en outre être réticulées par chauffage ou radiation en présence d'un agent chimique réticulant tel que par exemple un aldéhyde comme le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde. Les produits obtenus peuvent être utilisés comme implants médicaux du fait de leur biocompatibilité et leur immunogénicité réduite.

Malgré la structure protéinique inchangée après sa purification, le collagène purifié ou collagène atélopeptides se dégrade plus rapidement in vivo lors de son implantation chez les mammifères. Pour cette raison, le collagène atélopeptide polymérisé a été
réticulé ou greffé de radicaux chimiques pour augmenter son réseau fibreux et permettre au produit modifié de résister plus longtemps à sa biodégradabilité
in vivo, d'augmenter sa force de traction ou la viscosité en solution.

De nombreuses études ont été entreprises pour développer les possibilités de couplage du collagène grâce à la présence et la disponibilité de nombreux groupements amines (NH2) sur sa structure molécualire. Parmi les nouvelles inventions, on trouve quatre principaux groupes de couplage pour cette protéine.

Groupe 1 :

Le premier groupe utilise un agent réticulant ou polymérisant qui forme un pont entre les mêmes molécules ou par l'intermédiaire de ce pont d'autres molécules pourraient venir se greffer sur ce pont.

Les réactifs les plus fréquemment utilisés sont des mono ou dialdéhydes entraînant par exemple la formation d'un pont méthylène avec le formaldéhyde ou la formation d'une liaison imine et aldol avec la glutaraldéhyde, un agent de réticulation bifonctionnel, qui réagit avec des amines libres. Le problème majeur produit par ces formations est dû à
la présence de groupe terminal aldéhyde (-CHO) qui, une fois ce groupe relargué, va se transformer en un polymère de dialdéhydes cytotoxique et irritant.

Le brevet US 2,900,644 (Rosenberg et al., 1959) décrit une méthode de préparation d'un implant tubulaire à partir d'une artère carotide de boruf dont la solidité est renforcée par un traitement avec du formaldéhyde. Toutefois, l'utilisation du collagène polymérisé par un aldéhyde révèle des réactions inflammatoires.

Pour réduire les réactions inflammatoires, Grillo et al. (J. Surg. Res., (1961), vol. 2, p.
69) ont suggéré la polymérisation contrôlée du collagène par le formaldéhyde pour ralentir la vitesse de résorption de celui-ci. Gillo et al. ont montré
également que la réponse immune due aux implants de collagène reconstitué était minime.

Dans le brevet US 3,093,439 (Bothwell et al., 1963), les auteurs utilisent un diaidéhyde d'amidon obtenu par réaction d'oxydation de l'amidon avec l'iodate pour traiter les artères carotides de boeuf, lesquels sont utilisés comme implants.

Le brevet US patent 3,157,524 (Artandi), décrit des méthodes de préparation d'éponges de collagène utilisant du formaldéhyde. Avec le même agent de réticulation, l'inventeur a aussi obtenu des tubes poreux de collagène.

Le brevet US 3,823,212 (Chvapil et al., 1974) décrit une méthode d'obtention de membranes ou d'éponges à base de collagène réticulé en traitant le collagène avec le glutaraldéhyde à basse température, de -5 à-40 C et sur une durée d'un jour à

jours. Des antibiotiques peuvent être ajoutés dans le collagène pendant sa préparation.
Les produits obtenus ont trouvé des applications médicales telles que le traitement des brûlures ou des abrasions de la peau (où des larges surfaces affectées doivent être recouvertes pour éviter les infections des blessures), aider la guérison des plaies en procurant des composés thérapeutiques actifs, ou prévenir la macération des plaies et une lente absorption des exsudations.

Le brevet US 4,060,081 (Yannas et al., 1977) décrit l'utilisation du collagène et de mucopolysaccharides comme peau synthétique, réticulé en utilisant le glutaraldéhyde.

Une autre utilisation du glutardialdéhyde pour réticuler le collagène a été
décrite dans le brevet US 4,131,650 (Braumer et al., 1978). Les auteurs décrivent un traitement de la peau par application sur celle-ci d'une pâte à base d'eau sur laquelle est placée un feuillet contenant au moins 3 % en poids de collagène soluble dans l'eau et ayant une perméabilité à l'eau de plus d'environ 0,1 g/dm2/min, le collagène étant transporté à
travers la pâte et absorbé par la peau. De préférence, le feuillet a une épaisseur d'environ 0,01 à 0,03 mm et présente un taux de réticulation correspondant à
celui obtenu pour environ 0,1-0,5 % en poids de glutardialdéhyde utilisé dans un milieu acide.
Le feuillet peut aussi contenir un agent cosmétique actif tel que acide aminé, peptide, protéine, hormone, extrait placentaire, phosphatide, extrait tissulaire, cellules fraîches et vitamines. La pâte peut être séchée par chauffage, produisant une rétraction du feuillet pour augmenter le contact avec la peau.

Une autre réaction de polymérisation du collagène conjugué aux enzymes (alkaline phosphatase) par le glutaraldéhyde a été décrite dans le brevet US 4,409,332 (Jefferies etal., 1983). Ces auteurs ont obtenu un gel à base de collagène polymérisé en absence de réaction inflammatoire pour produire des membranes implantables, des fils de suture, un gel injectable et biocompatible, un support transportant des médicaments, un collagène injectable utilisé comme implant et une méthode pour l'augmentation du tissu mou.

Le brevet US 4,424,208 (Wallace et al., 1984) décrit une formulation de collagène améliorée, appropriée pour une utilisation dans l'augmentation des tissus mous. La formulation de Wallace comprend du collagène fibrillaire atélopeptide reconstitué (tel que par exemple le Zyderm ) en combinaison avec des particules de collagène atélopeptide réticulé dispersées dans un milieu aqueux. L'addition de particules de collagène réticulé améliore la persistance de l'implant ou son habilité à
résister à la rétraction après implantation. L'agent réticulant utilisé est le glutaraldéhyde.

Le brevet US 4,582,640 (Smestad et al., 1986) décrit la préparation d'un CIS
atélopeptide réticulé par du gluturaldéhyde (GAX) utilisable dans des implants médicaux. Le collagène est réticulé dans des conditions favorisant des liaisons intra-fibres plutôt que inter-fibres et le produit obtenu présente une plus grande persistance qu'un collagène atélopeptide non-réticulé. Le produit est commercialisé par la société
Collagen Corporation sous la marque Zyplast .

Le brevet US 4,597,762 (Walter et al., 1986) décrit une méthode de préparation de collagène de type I et la polymérisation de celui-ci par le diaidéhyde glutarique en présence de ficine et de L-cystéine. Le produit obtenu est pour l'usage en médecine humaine et vétérinaire.

Les brevets US 4,600,533; US 4,655,980; US 4689,399 et US 4,725,671 (Chu et al.) décrivent l'obtention de membranes de collagène possédant des propriétés particulières par diverses techniques de formation de gels, en combinaison avec des méthodes permettant de transformer ces gels sous forme de solides. Les propriétés de ces membranes, ou de toutes autres formes solides, peuvent être modifiées soit en réticulant la préparation de collagène après la formation de la membrane ou du gel, soit, préférentiellement, en mélangeant du collagène réticulé avec le collagène solubilisé
dans le mélange de départ utilisé pour préparé le gel. Les agents réticulant utilisés sont le formaidéhyde, le glutaraldéhyde, le glyoxal, etc. Les membranes de collagènes ainsi préparées sont utilisées dans le domaine médical.

Les brevets US 4,980,403 (Bateman et al.); US 5,374,539 (Nimni et al.) et US

5,411,887 (Sjôlander) décrivent tous l'utilisation d'un agent de réticulation, comme le glutaraldéhyde, pour polymériser le collagène, lequel sert à fabriquer des produits pour les applications médicales humaines et vétérinaires tels que des bioprothèses ou des gels et des films pour le traitement des plaies.

Un désavantage majeur à l'utilisation du collagène réticulé est la réaction biologique négative due au relargage de l'aldéhyde, un réactif souvent utilisé pour polymériser le collagène et le rendre insoluble dans plusieurs applications. Le détachement de l'aldéhyde lié au collagène réticulé démontre une cytotoxicité des cellules, spécifiquement pour le fibroblaste (Speer et al. J. Biomedical Materials Research 1980, 14, p. 753; Cook et al. British J. Exp. Path. 1983, 64, p. 172). Des travaux récents suggèrent que les polymères de glutaraldéhyde, à la différence du glutaraldéhyde sous forme monomérique, forment des liaisons réticulaires entre les molécules de collagène et que ces liaisons peuvent se réarranger pour libérer du glutaraldéhyde et des polymères de glutaraldéhyde (Cheung, D. T. et Nimni, M. D., Connective Tissue Research 10,187-217,1982).

Groupe 2 :

Des agents de couplage du collagène utilisés pour éviter la réaction secondaire et parasite due aux aldéhydes libres constituent le deuxième groupe de couplage.
Parmi ces nouveaux agents de couplage, on cite :
- la réaction d'acylation par l'intermédiaire d'un anhydride (composés dicarboxyliques) produisant une liaison amide ou ester, les anhydrides les plus souvent utilisés étant les anhydrides succinique, maléique, glutarique, benzoïque, laurique, diglycolique, méthylsuccinique ou méthyl glutarique;
- la réaction de sulfonation et de phosporylation par des halogènes sulfonylés et phosphorylés qui établissent une liaison intra et intercaténaire;
- l'utilisation de carbodiimides, de diisocyanates ou de diamines permettant de créer des liaisons d'amides;
- la formation d'un pont disulfure -S-S- ; ou - l'obtention d'une fonction aldéhyde avec des polysaccharides, laquelle vient s'additionner sur le collagène pour étendre le réseau du polymère.

Le brevet US 4,404,970 (Sawyer) décrit la modification du collagène en faisant réagir les fonctions acides de celui-ci avec des amines en présence d'EDC (1-éthyl-3,3-diméthylaminopropyl)carbodiimide.

Les brevets US 4,703,108 and US 4,970,298 (Silver et al.) enseignent la préparation d'une matrice, d'une éponge ou d'un film à base de collagène par mise en contact du collagène avec un agent de réticulation choisi parmi un carbodiimide et un ester actif dérive du N-hydroxysuccinimide suivi d'une forte déshydratation.

Le brevet US 4,713,446 (DeVore et al., 1987) décrit un collagène modifié
chimiquement préparé par réaction du collagène natif avec des dérivés d'acide di- ou tri-carboxylique tels que des halogénures, des sulfonyle, des anhydrides ou des esters en tant qu'agents de couplage. Cette réaction est contrôlée de façon à limiter le degré de réticulation. La réaction a lieu au niveau des fonctions amine résiduelles de la lysine se trouvant sur le collagène. Le produit obtenu est dissout dans un tampon physiologique donnant ainsi une solution viscoélastique ayant des applications thérapeutiques variées dans le domaine chirurgical et particulièrement en ophtalmologie. Les agents de réticulation sont en particulier, l'amino succinique, le chlorure succinique, l'amine phthalique ou glutanique.

Le brevet US 4,837,285 (Berg et al., 1989) décrit la réticulation de la matrice collagène sous forme de billes, effectuée en dispersant ces billes dans une solution de carbodimine. La réticulation peut avoir lieu en combinaison avec une forte déshydratation à des températures entre 50 et 200 C sous un vide inférieur à
50 torr pour 2 à 92 heures.

Le brevet US 4,958,008 (Petite et al., 1990) décrit un procédé chimique permettant le blocage du groupement acide présent sur le collagène et empêchant ainsi l'utilisation du glutaraldéhyle qui pourrait entraîner certaines toxicités et induire des phénomènes de calcification. Le procédé décrit dans ce brevet consiste en la réticulation du collagène par l'introduction de groupements azide qui comprend essentiellement une estérification des groupes d'acide libre du collagène, la transformation de ces groupes estérifiés en groupes hydrazides suivie d'une transformation en groupes azide par l'action d'acide nitreux et caractérisée en ce que chaque étape est effectuée après une étape de rinçage par une solution aqueuse saline.

Le brevet US 5,412,076 (Gagnieu C., 1995) décrit un collagène modifié réticulé
soluble dans l'eau ou dans un solvant organique aprotique et polaire, les groupements libres de thiol appartenant aux résidus de cystéine ou ses analogues sont réticulés par la formation de ponts disulfide et ce pour donner des gels ou des produits réticulés en présence d'agents d'oxydation doux, cette méthode permet un excellent contrôle de la vitesse de réaction et du degré de réticulation. Les diverses applications sont dans le domaine des adhésifs, des biomatériaux pour la formation de prothèses, d'implants ou d'autres articles médicaux.

Le brevet US 5,332,802 (Kelman et al., 1994) décrit la production d'un collagène chimiquement modifié, réticulé, télopeptide issu d'un même donneur humain pour réimplanter dans le même donneur. La modification chimique du tissu faite par acylation et/ou estérification et cela pour former un collagène autoimplantable sous la forme d'une solution.

Le brevet US 5,874,537 (Kelman et al., 1999) décrit des compositions à base de collagène pour des utilisations en tant qu'adhésifs ou de scellants à usage médical.
Avant la polymérisation, les monomères de collagène solubles ou partiellement fibrillés pour solution sont chimiquement modifiés avec un agent acylant, un agent sulfonant pour une combinaison des deux. Les compositions de collagène préparées ainsi peuvent être utilisées comme des adhésifs médicaux pour lier des tissus mous ou alors comme films scellants ayant une variété d'usages médicaux tels que la fermeture de blessures ou l'enrobage de tendons afin de prévenir la formation d'adhésion après une opération chirurgicale.

Les brevets US 5,866,165 et US 5,972,385 (Liu et al., 1999) décrivent la préparation et l'utilisation d'une matrice de support permettant la production de tissus tels que des os, du cartilage ou des tissus mous. Un polysaccharide est mis en réaction avec un agent oxydant pour ouvrir les anneaux de sucre du polyssacharide et former ainsi des groupes aldëhyde qui réagissent pour former des liens covalents dans le collagène. De façon préférentielle, le polysaccharide utilisé est l'acide hyaluronique.

Le brevet US 6,165,488 (Tardy et al., 2000) décrit un procédé similaire utilisant une macromolécule polyaldéhyde d'origine naturelle obtenue par la réticulation du collagène avec un periodate pour des utilisations en tant que matériaux biocompatibles, biorésorbables et non toxiques à usage médical ou thérapeutique.

Le brevet US 6,309,670 (Heidaran et al., 2001) décrit une méthode de traitement de tumeurs des os comprenant l'administration d'une matrice composée d'un collagène, d'un polysaccharide et d'un facteur de différentiation. Le polysaccharide réagit avec un agent oxydant pour ouvrir les anneaux de sucre formant ainsi des groupes aldéhyde qui comme vu précédemment réagissent pour former des liants covalents dans le collagène. Les polysaccharides utilisés sont l'acide hyaluronique, le dextrane ou le sulfate de dextrane.

Le brevet US 6,127,143 (Gunasekaran, 2000) décrit l'utilisation d'une méthode de phosphorylaton pour obtenir un produit biocompatible à partir d'un collagène purifié qui est produit en utilisant deux traitements enzymatiques protéolytiques et un agent de réduction. Avant la phosphorylation, le collagène purifié est délipidé et ensuite traité par compression, déshydratation, dispersions et séchage pour former des fibres de collagène. Le collagène purifié et biocompatible peut être utilisé en transplantation ou en hémostase et peut être combiné à des composés tels que des antibiotiques, des antiviraux, facteurs de croissance ou autres composés utiles pour les usages biomédicaux.

Les brevets US 5,492,135; 5,631,243 et 6,448,378 (DeVore et al., 1996, 1997, 2002) décrivent la préparation d'un film de collagène qui est rapidement dissout à
35 C et utilisé à libération du médicament au niveau d'un tissu spécifique du corps.
Ce film de collagène est fabriqué à partir d'un collagène pauvre télopeptide qui est modifié avec l'anhydride glutarique.

Le brevet US 6,335,007 (Shimizu et al., 2002) décrit un gel de collagène qui est obtenu par réticulation d'un polyanion avec un carbodiimide. Les polyanions utilisés sont l'acide alginique, la gomme arabique, l'acide polyglutamique, l'acide polyacrylique, l'acide polyaspartique, l'acide polymalique, les carbométhylcellulose tel qu'un amino carboxylé
et des carbodiimides solubles dans l'eau tel que le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide. Le produit revendiqué consiste en un kit pour produire le gel de collagène comprenant une solution aqueuse de collagène, une solution aqueuse de polyanion et une solution aqueuse du carbodiimide. Le kit utilisé
comme un adhésif directement sur le corps humain avec des propriétés hémostatiques, obstruantes ou remplissantes pour la fabrication de vaisseaux sanguins artificiels, de tubes artificiels ou d'oesophages artificiels.

Les brevets 6,969,400 et 6,911,496 (Rhee et al., 2005) décrivent une composition d'un polymère réticulé comprenant un premier polymère synthétique contenant de multiple groupes nucléophiliques attachés de façon covalente à un second polymère synthétique contenant une multitude de groupes électrophysiques. Le premier polymère synthétique est préférablement un polypeptide ou un polyéthylène glycol qui a été modifié
pour contenir plusieurs groupes nucléophiles tels que des amines primaires ou des thiols. Le second polymère synthétique peut être un polymère hydrophile ou hydrophobe contenant ou ayant été modifié pour contenir un ou plusieurs groupes électrophiles tels que des groupes succinimidyl. Des compositions peuvent également contenir d'autres composés tels que des polysaccharides naturels ou des protéines tels que les glycosaminoglycanes ou les collagènes et/ou des agents biologiques. Ce brevet enseigne également des méthodes pour l'utilisation des compositions de polymère réticulé afin d'améliorer l'adhésion entre une première et une seconde surfaces;
l'augmentation des tissus pour prévenir la formation d'adhésion chirurgicale ou pour recouvrir les surfaces des implants synthétiques.

Le brevet US 6,962,979 (Rhee et al., 2005) décrit des compositions de biomatériaux réticulés qui sont préparés en utilisant des polymères hydrophobes et un agent réticulant. Les polymères hydrophobes utilisés sont principalement ceux contenant deux ou plus de groupes réactifs succinimidyl incluant le subérate de disuccinimidyl, le subérate de bis(suifosuccinimidyl) et le dithiobis(succinimidylpropionate).
Les conipositions de biomatériaux réticulés préparées, utilisant des mélanges de composés hydrophobes et d'agents réticulant hydrophiles sont aussi enseignés dans ce brevet.
Les compositions peuvent être utilisées pour préparer des implants aux utilisations médicales variées.

Le brevet US 6,916,909 (Nicolas et al., 2005) décrit de nouveaux collagènes peptidiques qui sont modifiés par greffage des fonctions thiol libres ou substituées contenues dans les radicaux mercaptoamine. L'essence de cette invention est d'obtenir des collagènes thiol qui peuvent être réticulés de façon suffisante et contrôlée en formant des ponts sulfurés et qui sont également biocompatibles.

Le brevet US 6,790,438 (Constancis et al., 2004) décrit un collagène modifié
peptidique pour prévenir les adhésions post-opératoires. Là encore, le collagène peptidique est modifié par le greffage des fonctions thiol présentes sur les radicaux mercaptoamine qui sont exclusivement greffés sur les acides aspartiques et glutamiques des chaînes de collagène en formation de liaisons amine.

Groupe 3 :

Le troisième groupe porte sur des réactions de copolymérisation entre le collagène et un polymère par une liaison covalente en donnant une conformation plus ou moins croisée.
Les polymères les plus associés avec le collagène sont les dérivés acryliques, les acrylonitriles, les styrènes, les polyuréthanes, les polyalcools et les silicones.

Le brevet US 4,452,925 (Kuzma et al., 1984) décrit des hydrogels préparés par polymérisation d'un mélange comprenant une quantité importante d'un monomère organique possédant un groupement éthylénique polymérisable tel que N,N-diméthylacrylamide, 2-hydroxyéthyl méthacrylate, diméthylaminoéthyl méthacrylate ou méthoxytriéthylène glycol méthacrylate, et une petite quantité de collagène solubilisé.
Les réactifs utilisés sont au moins partiellement solubles dans le milieu réactionnel aqueux. Les hydrogels ainsi préparés constituent des articles de forme nouvelle utiles dans les domaines médical et cosmétique.

Groupe 4 :

Le quatrième groupe de couplage du collagène consiste à réaliser un réseau dense par création de liaisons covalentes uniquement entre les molécules de collagène sans incorporation d'autres groupes de molécules. Ce groupe comprend :

- l'irradiation par rayon ultraviolet, bêta ou gamma produisant une désamination et permettant ainsi un couplage au niveau des liaisons d'imine et d'aldol ou des radicaux libres libérés par ces sources de rayons, lesquels forment des structures avec les ponts covalents. Cette méthode de couplage ne peut être réalisée qu'avec une source de faible énergie; l'utilisation d'une source de haute énergie conduisant à une hydrolyse ou une dénaturation du collagène;

- la déshydratation sous pression et à haute température (? 100 C) conduit à
la formation d'une liaison d'amide et d'ester aussi bien des intra et intermolécules de lysinoalanines. Les carbodiimides comme les cyanamide et dicyclohexylcarbodiimide sont des réactifs utilisés dans ce procédé;

- l'oxido-réduction produisant une désamination par oxydation du terminal des groupes aminés avec la formation d'un groupe d'aldéhydes. Cette méthode utilise souvent des cations (Cu2+, Fe2+, AI3+) en présence des sulfites ou des nitrites et est très largement utilisée dans la tannerie du cuir; et - l'activation fonctionnelle des carboxyles produisant des acides azides ayant une réactivité très sélective envers les fonctions amines (-NH2) qui conduisent à la formation d'une liaison amide.

Le brevet US 4,614,794 (Easton et al., 1986) décrit l'obtention d'un biomatériau à partir d'un mélange de collagène et d'alginate de sodium. Après une étape de lyophilisation, ces composés sont transformés en un complexe couplé, dit déhydrothermal, par chauffage à 115 C, sous vide, pendant 48 heures.

Le brevet US 5,331,092 (Huc et al, 1994) décrit une méthode de réticulation ou de couplage entre des molécules de collagène en chauffant le produit lyophilisé
de collagène à 110 C, sous un vide de 400 microbars pendant 10 heures.

Le brevet US 4,931,546 (Tardy et al., 1990) décrit le couplage entre les molécules de collagène, à pH neutre ou basique, grâce à des fonctions d'aldéhyde formées par l'action d'un acide périodique ou de ses sels de sodium avec la molécule de collagène.

Le brevet US 4,958,008 (Petite et al. 1990) décrit une méthode d'obtention d'un biomatériau pour la préparation d'une bioprothèse à base de collagène qui s'est couplé
grâce à la formation d'un groupe d'azide-collagène et l'amine du terminal de la lysine du collagène en donnant une liaison amide. Cette formation donne une réaction de couplage interne du réseau de collagène.

2.2.2.2. Le chitosane Le chitosane est issu de la chitine désacétylée est un polysaccharide composé
de la distribution aléatoire de D-glucosamine liée par R-(1-4) (unité désacétylée) et de N-acétyl-D-glucosamine (unité acétylée). De par sa propriété hémostatique, son affinité vis à vis des lipides, le chitosane est devenu depuis plus de deux décennies une substance très exploitée pour ses applications dans le domaine médical, pharmaceutique, cosmétique et diététique. Les applications médicales sont aussi basées sur les caractéristiques du chitosane, tels que sa biocompatibilié (minimise les réactions inflammatoires), sa biorésorbabilité et biodégradabilité. De plus, le chitosane est bien connu pour être un bon substrat pour la colonisation cellulaire stimulant ainsi la croissance des cellules et augmentant la vitesse de cicatrisation de plaies ouvertes en stimulant la réponse immunitaire et la reconstruction des tissus, en prévenant les infections microbiennes et en absorbant l'exsudat. En effet, le chistosane a également des propriétés antibactériennes et antimicrobiennes.

Le brevet US 4,031,025 (Vanlerberghe et al., 1977) décrit la méthode d'acylation du chitosane avec un anhydride diacide saturé ou insaturé. Le produit obtenu est utilisé
dans la préparation cosmétique comme agent hydratant de la peau. Les anhydrides saturés utilisés sont l'anhydride succinique, l'anhydride acétoxysuccinique, l'anhydride méthylsuccinique, l'anhydride diacétyltartarique et anhydride diglycolique.
Les anhydrides insaturés sont l'anhydride maléique, l'anhydride itaconique ou l'anhydride citraconique. Les dérivés de chitosane obtenus portent donc un groupement d'acide correspondant à l'anhydride utilisé par la formation d'une liaison covalente avec les amines de chitosane.

Le brevet US 4,424,346 (Hall et al., 1984) décrit l'obtention de dérivés de chitine et de chitosane pour leur utilisation dans la chélation des métaux, dans la formulation pharmaceutique et cosmétique, dans la séparation chromatographique, dans l'immobilisation des enzymes, etc. Ces dérivés sont obtenus par une modification des résidus d'amine sur la polyglucosamine avec formation des groupes :

(a) -N=CHR ou -NHCH2R
(b) -NHR' (c) -NHR" et (d) -NH-CH2COOH ou -NH-glycéryl où R. est un radical aromatique portant au moins un groupement hydroxyle ou carboxyle ou un ligand macrocyclique ; R' est un résidu d'une aldose ou d'une cétose et R" est résidu d'un aldéhyde organométallique.

Le brevet US 4,659,700 (Jackson et al., 1987) décrit la préparation d'un gel à
base de chitosane, du glycérol et de l'eau pour une application sur les plaies.

Les brevets US 4,651,725 (Kifune et al., 1987) et 4,699,135 (Motosugi et al., 1987) revendiquent la préparation des filaments de chitine pour la fabrication des pansements des plaies. La chitine est simplement mise en solution dans de la diméthylacétamide en présence du chlorure de lithium (LiCI) à température ambiante. Cette solution est extrudée sous pression à l'aide d'une pompe dans un bain coagulant contenant du méthanol. Les fibres de chitine sont traitées avec une solution de soude à 40%
et à
80 C pendant 3 heures. Ensuite les fibres sont neutralisées avec HCI, lavées et séchées.

Le brevet US 6,509,039 (Nies, 2003) décrit l'obtention de nouveaux dérivés de chitosane en faisant réagir de celui-ci avec de l'anhydride pyromellitique et avec de d'anhydride polymaléique d'un poids moléculaire jusqu'à 1000. Les dérivés de chitosane obtenus servent à produire des capsules pharmaceutiques, des implants médicaux, des matériaux de suture et des recouvrements des plaies.

Liu et al. [J. Mater. Sci. Mater. Med. (2004) v ol. 15(11); pp. 1199-1203]
décrit la modification du chitosane par greffage de l'arginine en utilisant l'EDC (1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide et le NHS (N-hydroxysuccinimide) comme agents de couplage. Selon les auteurs, le polymère obtenu est un bon candidat comme biomatériau anticoagulant.

Le brevet US 6,756,363 (Nordquist et al., 2004) décrit la préparation d'une solution visco-élastique à base de chitosane glycosylé. Ce dérivé de chitosane est obtenu en présence d'un monosaccharide tel que galactose, glucose et ribose via la formation d'une base de Schiff suivie d'un réarrangement d'Amadori. Le produit obtenu est utilisé
dans la chirurgie opthalmique, utilisé comme solution de lavage pour la prévention d'adhésion des organes suite à une opération chirurgicale, pansements hémostatiques, substrat polymérique naturel pour séparer des tissus dans la prévention du collage de tendon et de ligament après la chirurgie orthopédique et pour aider la régénération tissulaire après la chirurgie dentaire.

2.3. Problèmes associés à la modification des polymères biodégradables Les problèmes rencontrés dans le domaine de la présente invention sont de différentes natures.

En premier lieu, la modification doit permettre une amélioration et non l'inverse des propriétés physiques du polymère biodégradable à modifier choisi, telles que la force de traction et la maniabilité.

En second lieu, les polymères une fois modifiés doivent rester des biomatériaux biocompatibles et biodégradables. Si le polymère utilisé est un biomatériau, il doit le rester après sa modification. Les réactions chimiques de modifications se passent généralement en milieu organique pouvant détériorer prématurément la chaîne polymère ou fragiliser celle-ci. En milieu aqueux, les composés chimiques utilisés tels que l'EDC ou le NHS peuvent également se retrouver prisonniers du matériau et rendre celui-ci toxique et donc non biocompatible.

Finalement, l'agent de couplage utilisé pour modifier le polymère ne doit pas entraîner de réactions parasites de réticulation des chaînes polymères, et ce pour éviter là encore la dénaturation du polymère biodégradable utilisé et conserver ainsi ses propriétés initiales.

Il existe donc un réel besoin pour un nouveau procédé de synthèse de nouveaux biomatériaux biocompatibles, cytocompatibles et biodégradables utilisables dans le domaine médical, pharmaceutique ou cosmétique, particulièrement pour la fabrication de pansements aux propriétés hémostatiques, bactériostatiques et/ou cicatrisantes.
3. Sommaire de l'invention La présente invention a pour but de répondre aux besoins ci-dessus évoqués.

Plus précisément, un premier objet de la présente invention est un procédé de préparation d'un polymère biodégradable modifié comprenant :

(a) une première étape de réaction en milieu aqueux entre un aminoacide, un peptide ou un polypeptide et l'anhydride maléique pour former un acide vinyl-carboxylique;
et (b)Une seconde étape de réaction en milieu aqueux entre l'acide vinyl-carboxylique obtenu à l'étape (a) et un polymère biodégradable ayant au moins une fonction amine primaire pour obtenir le polymère biodégradable modifié désiré.

Un second objet de la présente invention est le polymère biodégradable modifié
obtenu par le procédé décrit ci-dessus et son utilisation pour la fabrication de biomatériaux ayant des propriétés biocompatibles, hémostatiques et cicatrisantes.

Un autre objet de la présente invention est un pansement comprenant le biomatériau tel que défini ci-dessus. Le pansement hémostatique selon l'invention est biocompatible et a des propriétés hémostatiques et cicatrisantes La présente invention répond aux difficultés rencontrées dans le domaine des biomatériaux et permet de réaliser très simplement des biomatériaux destinés à
être utilisé dans la fabrication de pansement biologique, de substitut de la peau, de prothèse et/ou d'implant. Ces biomatériaux ont des propriétés à la fois hémostatique, cicatrisante et antiseptique, et sont également biocompatible, cytocompatible et biodégradable.
Les avantages de la présente invention sont essentiellement dus à
l'utilisation lors du procédé de modification du polymère d'un milieu aqueux permettant de conserver les propriétés initiales du polymère et de limiter la présence de composés chimiques résiduels dans le matériau rendant celui-ci impropre à son utilisation comme biomatériau.

De plus, l'utilisation d'un acide dicarboxylique insaturé pour modifier un polymère biodégradable aminé permet d'éviter les réactions parasites de réticulation de ces polymères.

L'invention et ses avantages ressortiront mieux de la description non limitative qui suit de différents modes préférés de l'invention.

4. Description détaillée de l'invention Tel que mentionné ci-dessus, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un polymère biodégradable modifié. Le procédé comprend de façon générale une première étape (a) de réaction en milieu aqueux entre un aminoacide, un peptide ou un polypeptide et l'anhydride maléique (aussi nommé anhydride but-2-ènoïque) pour former un acide vinyl-carboxylique. Dans une seconde étape (b), une réaction en milieu aqueux a lieu entre l'acide vinyl-carboxylique obtenu à
l'étape (a) et un polymère biodégradable. Pour que la seconde étape (b) puisse avoir lieu, il faut que le polymère biodégradable utilisé ait au moins une fonction amine primaire qui réagit avec la double liaison de l'acide vinyl-carboxylique. A l'issu de la seconde étape, on obtient le polymère biodégradable modifié.

4.1. Synthèse du composé acide vinyl-carboxylique D'un point de vue schématique, la réaction chimique générale qui a lieu dans l'étape a) du procédé selon l'invention peut être représentée de la façon suivante :

O
HOOC-R-NH2 + O >. HOOC-R-NH-CO-CH=CH-COOH
I II
O

dans laquelle R représente un résidu d'acide aminé, de peptide ou de polypeptide de formule générale (I) HOOC-R-NH2.

Le résidu R peut être choisi de façon à ce que la formule générale (I) représente préférentiellement un acide aminé essentiel. Plus préférentiellement, l'acide aminé
essentielle est choisi parmi la glycine, la L-alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, la sérine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la cystéine, la tyrosine, l'histidine, la lysine et l'arginine.

Le résidu R peut également être choisi de façon à ce que la formule générale (I) représente un acide aminé non essentiel. Préférentiellement, l'acide aminé non essentiel est choisi parmi les résidus présentés dans le tableau 1 ci-dessous :

Valeur de R Nom de l'acide aminé correspondant De formule HOOC-R-NH2 -(CH2)2- P alanine CH3-CH2-CH a ou 2-aminobutyrique CH3-CH-CH2- (3 ou 3-aminobutyrique -(CH2)3- y ou 4-aminobutyrique CH3-CH2-CH2-CH 2-aminopentanoïque ou norvaline CH3-CH2-C-CH3 2-amino-2-methylbutyrique ou isovaline 5-aminopentanoïque ou -(CH2)4- 5-aminovalérique 2-aminohexanoïque ou 2-aminocaproque ou CH3-(CH2)3-CH norieucine -(CH2)5- 6-aminohexanoïque -(CH2)6- 7-aminoheptanoïque Tableau 1 Le résidu R peut être également choisi de façon à ce que la formule (I) représente un peptide ou un polypeptide.

Finalement, le résidu R peut également être choisi de façon à ce que la formule (I) représente une molécule aromatique, pourvu que les composés de formule (I) aromatique soient solubles dans l'eau.

L'avantage d'utiliser l'acide maléique réside dans la formation du composé
acide vinyl-carboxylique de formule (II) possédant une double liaison située en a d'une fonction acide dicarboxylique. En conséquence, la double liaison est activée et réagira, préférentiellement en milieu aqueux acidulé, avec la ou les fonctions amines du polymère biodégradable à modifier dans l'étape (b) du procédé.

De plus, la fonction amine ne réagira pas dans ces conditions avec les fonctions acides de la molécule de formule (II), évitant ainsi toute réaction de réticulation entre plusieurs chaînes polymères.

En conséquence, la partie aminoacide, peptidique ou polypeptidique de la molécule de formule II demeurera libre une fois que celle-ci sera greffée sur le polymère biodégradable.

La réaction de l'étape (a) se réalise préférentiellement en milieu aqueux et à
une température comprise entre environ 20 et 100 C, préférentiellement entre environ 20 et 80 C et plus préférentiellement entre environ 20 et 60 C.
Le terme environ utilisé dans le présent mémoire descriptif représente l'erreur qui peut être commise lors de la lecture d'une température, d'une masse, d'une durée ou d'uri volume selon l'appareil utilisé pour réaliser cette mesure. L'erreur est généralement admise comme étant de 10% de la valeur lue.

L'un des avantages du procédé selon la présente invention, est l'utilisation de l'eau comme solvant de réaction, évitant ainsi une destruction des chaînes polymères prématurée due à l'utilisation d'un solvant organique. Toutefois, il est bien connu de l'Homme de l'art que l'anhydride maléique réagit dans l'eau pour retourner à
son état hydraté. A cause de cette réaction d'hydrolyse de l'anhydride en milieu aqueux, le rapport molaire entre l'anhydride maléique et l'acide amino-carboxylique (I) utilisée dans l'étape (a) est compris entre environ 1/1 et 2/1, plus préférentiellement ce rapport est compris entre 1,2/1 et 2/1, et encore plus préférentiellement le rapport molaire entre l'anhydride maléique et l'acide amino-carboxylique (I) est d'environ 1,5/1.

Le composé de formule (I) utilisé dans l'étape a) du procédé selon l'invention est préférentiellement présent dans le milieu réactionnel de façon à ce que sa concentration soit très forte. Plus préférentiellement le milieu réactionnel est saturé par le composé de formule (I). Selon le degré de solvatation du composé de formule (I), un chauffage peut être appliqué pour faciliter sa dissolution et pour accélérer la réaction de couplage.
La formation de l'acide vinyl-carboxylique (II) (ou produit de couplage) est instantanée sous forme de poudres fines. Le produit de couplage est récupéré par filtration sous vide et lavé plusieurs fois à l'eau pour enlever l'acide maléique formé par l'hydrolyse de l'anhydride maléique. L'eau de lavage est préférablement refroidie à environ 4 à 10 C
pour éviter la perte de proçuit de couplage. Le produit de couplage est ensuite séché à
l'air. II est à noter que le rendement obtenu diminue lorsque l'encombrement stérique du radical R augmente.

4.2. Couplage de l'acide vinyl-carboxylique avec un polymère biodégradable Dans la seconde étape b) du procédé selon l'invention, l'acide dicarboxylique insaturé
de formule générale (II) est mis en réaction avec un polymère naturel biodégradable possédant au moins une fbnction amine présente sur sa structure moléculaire.

Le nombre de fonctions amines du polymère biodégradable est variable et dépend de la nature du polymère biodégradable choisi.

Tel que déjà mentionné, la double liaison de l'acide vinyl-carboxylique, obtenu à l'étape a) du procédé, est activée par la présence de la fonction acide carboxylique et réagit, préférentiellement en milieu aqueux acidulé, avec la ou les fonctions amines du polymère biodégradable.

Selon un mode préféré de l'invention, le polymère naturel biodégradable utilisé est une protéine fibreuse ou un glycosaminoglycane.

Il faut comprendre que de par leur taille moléculaire élevée et la complexité
de leur structure moléculaire, la détermination du taux de modification (ou taux de greffage) d'une protéine fibreuse ou d'un glycosaminoglycane est complexe. En général, ce taux de modifications peut être déterminée par des méthodes physico-chimiques telles que des mesures de viscosité des solutions des polymères modifiés (voir l'article Durand A.
et al, Biomacromolecules, 2006, vol 7(3), pp 958-64, relatif à préparation de polysaccharides modifié hydrophobiquement). Cependant, il n'est pas toujours nécessaire de connaître ce taux de modifications. Seuls les changements notables des propriétés du polymère avant et après sa modification, tel la viscosité en solution, l'élasticité du polymère, la malléabilité en autres, permettent de conclure que ceux-ci ont bien été modifiés.

4.2.1. Modification d'une protéine fibreuse Couplage avec l'acide vinyl-carboxylique de formule (II) Plus préférentiellement, la protéine fibreuse utilisée est le collagène ou l'élastine.
Encore plus préférentiellement, la protéine fibreuse utilisée est le collagène.
Autrement dit, selon un mode préféré de l'invention, l'étape b) du procédé
comprend une réaction de couplage de façon covalente entre l'acide vinyl-carboxylique de formule (II) sur des molécules de collagène.

4.2.1.1. Préparation du collagène La source de collagène peut être préparée à partir des tendons, ligaments, peaux ou toutes autres sources contenant du collagène et bien connue de l'homme de l'art.
L'origine des sources de collagène peut être sélectionnée chez des animaux terrestres :
équins, porcins, bovins, reptiles y compris les volatiles et les marins. Le placenta d'origine humaine peut être utilisé pour isoler le collagène humain. Bref toutes sources et tous types de collagène peuvent être utilisés pour effectuer leur couplage avec l'acide vinyl-carboxylique de formule générale (II) obtenu selon l'étape (a) du procédé décrit ci-dessus.

Le collagène utilisé peut être natif ou brut, ou traité enzymatiquement par pepsine ou ficin ou papain pour enlever le télopeptide. Le collagène peut également être purifié ou pré-modifié chimiquement.

De très nombreuses méthodes de préparation du collagène ont été décrites et très bien connues dans l'art. Les méthodes conventionnelles pour la préparation du collagène :
(pur, soluble dans l'acide, collagène monomère en solution et collagène natif) sont incorporées ci-contre comme références, par exemples décrits dans les brevets US
Nos. 3,934,852; 3,121,049; 3,131,130; 3,314,861; 3,530,037; 3,949,073;
4,233,360;
4,488,911; 4,216,204; 4,455,302 et 5,138,030.

Selon un mode préféré de l'invention, le collagène utilisé dans l'étape (b) du procédé est d'origine volatile tel que le poulet, l'oie, le canard ou d'autres types d'oiseaux.
Préférentiellement, le volatile choisi est un poulet âgé d'environ 6 à 10 semaines dont on prélève les pattes. Les pattes sont récupérées après l'abattage et utilisées dans les 24 heures ou peuvent être conservées à-20 C pour une utilisation ultérieure.
Les pattes sont lavées à l'eau déminéralisée, ensuite désinfectées avec une solution d'éthanol à
70%, puis fendues longitudinalement le long des métatarses et des doigts, et sont mises à tremper dans une solution stérile du chlorure de sodium à une concentration comprise entre 2 à 4 M (mol/L), préférablement à 2 M, pendant 1 à 4 semaines à une température comprise entre environ 2 et 8 C. Les écailles entourant les pattes sont retirées et les tendons, les ligaments et la peau sont enlevés des os et puis coupés en petits morceaux. Ces matériaux sont ensuite mis en contact sous agitation dans une solution de T'ris(hydroxyméthyl)aminométhane (appelé couramment Tris) à 1 % (p/v =
poids /
volume) - Citrate de sodium à 2.40% (p/v), à pH = 7,30-7,50 pendant 24 heures et à une température comprise entre environ 2 et 8 C pour éliminer les débris membranaires et le sang.

Les matériaux sont ensuite récupérés par une simple filtration et lavés avec de l'eau stérile et ensuite mis en contact sous agitation avec une solution d'acide acétique 0,5 M
ou 3% (v/v = volume / volume) pendant 2 heures à température ambiante.

Par température ambiante on comprend une température de la pièce à
laquelle l'opérateur travaille et pouvant être comprise généralement entre 15 et 30 C.

Les matériaux sont broyés en utilisant un mixeur domestique pendant une durée d'au moins une (1) minute (min.), préférentiellement par à-coups de quatre (4) fois quinze (15) secondes (s), ou jusqu'à l'obtention d'une consistance pâteuse.

La solution de collagène ainsi obtenue est additionnée d'un deuxième volume d'acide acétique 0,5 M (ou 3% v/v) et l'agitation continue encore pendant 4 heures à
température ambiante.

Une solution de pepsine (Sigma) dans l'acide acétique 0,5 M (ou 3% v/v) est ajoutée dans la solution de collagène permettant de purifier le collagène sans les télopeptides.
La solution est agitée à température ambiante pendant au moins 24 heures, préférablement entre 24 à 72 heures. La solution est ensuite centrifugée. Le résidu est ainsi écarté et la solution contenant le collagène est récupérée. La solution du collagène est refroidie à une température comprise entre environ 0 et 2 C et ensuite son pH est ajustée à environ 9 avec une solution de NaOH (10N et 1 N) préalablement refroidie à
une température d'environ 0 à 2 C pour désactiver la pepsine en excès. La température de la solution doit être maintenue constamment à entre environ 0 et 2 C durant l'ajustement du pH.

Cette solution est ensuite centrifugée à basse température comprise entre environ 0 et 2 C à une vitesse de rotation d'environ 4200 rpm (round per minute) pendant une heure. Le surnageant contenant le collagène purifié, très visqueux, est récupéré. Le résidu contenant la pepsine désactivée et les télopeptides est éliminé. Le collagène purifié est isolé par addition du NaCI solide sous agitation à une concentration finale de 2,5 M par litre de solution de collagène ou par addition d'une solution à 1 M
d'acétate de sodium. Le collagène précipité est récupéré par centrifugation, solubilisé à
nouveau dans une solution d'acide acétique à 0,5 M (ou 3% v/v) et reprécipité à
nouveau dans une solution de NaCI (1 M) ou d'acétate de sodium (1 M). Le collagène récupéré
par centrifugation est lavé deux fois avec une solution de NaCI 0,3 M. Finalement le collagène atélopeptide purifié est dissous dans l'acide acétique à 1%(v/v) et prêt à être couplé avec l'acide carboxylique insaturé.

Le collagène atélopeptide récupéré après le dernier lavage peut être déshydraté par l'éthanol ou l'acétone, séché et conservé pour une utilisation ultérieure.

4.2.1.2. Réaction de couplage du collagène avec l'acide vinyl-carboxylique de formule (II) Le collagène, tel que le collagène atélopeptide obtenu selon le procédé décrit ci-dessus, est dissous dans une solution d'acide acétique à environ 1%(v/v).

L'acide vinyl-carboxylique de formule générale (II) (que l'on nomme également ci-après l'agent de couplage) est ajouté dans la solution de collagène sous agitation pendant une heure. La solution devient visqueuse et est chauffée à 37 C pendant 15 minutes ou jusqu'à la dissolution complète de l'agent de couplage. La solution de collagène couplé
devient plus fluide et l'agitation est maintenu pendant environ une à 4 heures à environ 20 C.

Par la suite, le collagène couplé est précipité en ajoutant une équivalence de 1 M NaCI
solide ou 1 M acétate de sodium par litre de solution de collagène. Le précipité est récupéré par centrifugation pendant 45 minutes à une vitesse de rotation d'environ 4200 rpm et à une température d'environ 2 à 4 C. Le collagène couplé est dissous à
nouveau dans une solution d'acide acétique à 1% (p/v), et le collagène est précipité
pour une deuxième fois en ajoutant une solution à 0,8 M de NaCI ou 1 M d'acétate de sodium sous agitation. L'agitation est maintenue pendant environ une à 4 heures pour compléter la précipitation.

Le nouveau matériau obtenu est récupéré par centrifugation ou filtration et lavé ensuite par une solution de Tris(hydroxyméthyl)aminométhane 1% (p/v), à pH = 7,00 0,30.
Finalement le biomatériau récupéré par centrifugation est déshydraté par de l'éthanol pur et séché à 20-25 C sous une hotte à flux laminaire.

4.2.2. Modification d'un glycosaminoglycane avec un acide vinyl-carboxylique de formule (II) Tel que mentionné ci-dessus, selon un mode préféré de l'invention, le polymère naturel biodégradable utilisé dans l'étape b) du procédé selon l'invention est un glycosaminoglycane.

Plus préférentiellement, le glycosaminoglycane utilisé est le chitosane issu de la chitine.
Le chitosane utilisé doit contenir au moins 75% de groupements amine (NH2-), ce qui revient à de la chitine désacétylée à un taux d'au moins 75%.

Selon un mode encore plus préféré de l'invention, le chitosane utilisé est du chitosane commercial provenant des carapaces de crabe avec un taux de désacétylation supérieur à 85% (Chitosane référencé C3646 chez Sigma).

Le chitosane est mis en solution dans l'acide acétique à 3% p/v. L'acide vinyl-carboxylique est ajouté en poudre sous forte agitation. Le mélange est chauffé
à environ 60 C et cette température est maintenue jusqu'à la dissolution totale de l'acide. Le chauffage est ensuite coupé et l'agitation est maintenue pendant environ deux (2) heures.

Le chitosane couplé est précipité par addition d'une solution 1 M de NaCi ou 1 M
d'acétate de sodium par litre de solution de chitosane. Le précipité est récupéré par centrifugation ou par filtration et lavé au moins deux fois avec de l'eau pure.

Le précipité lavé est finalement récupéré par centrifugation ou filtration et déshydraté
avec de l'éthanol ou de l'acétone et séché à l'air et à environ 20-25 C.

La présente invention a également pour objet le polymère biodégradable modifié
obtenu par le procédé décrit ci-dessus ainsi que l'utilisation de ce polymère dans la fabrication de biomatériaux.

Les biomatériaux obtenus sont utilisables spécialement dans le domaine de la médecine et plus particulièrement en chirurgie, la pharmacie, la dermatologie, l'esthétique et la cosmétique. Les biomatériaux selon la présente l'invention sont biocompatibles. En effet, la présence des acides aminés, peptides ou polypeptides greffés le long de la chaîne polymère apporte ou accentue les propriétés de biocompatibilité. Le biomatériau sera ainsi toléré par les tissus, ce qui permettra d'accentuer les propriétés hémostatiques et cicatrisantes du polymère biodégradable originel.

Parmi ces produits, un mode préféré de l'invention concerne l'utilisation du polymère modifié selon l'invention pour fabriquer un pansement aux propriétés hémostatiques et cicatrisantes.
Le pansement selon l'invention peut être fabriqué sous forme de poudre, d'éponge, de gel, de film ou de crème.

L'éponge peut être fabriquée par le procédé de lyophilisation connu de l'art.

On comprendra que le pansement selon l'invention peut contenir également une certaine quantité de polymères biodégradables mais non-modifiés utilisés dans l'étape (b) du procédé selon l'invention et qui n'ont pas réagi.

Le film transparent peut être fabriqué par séchage sous ventilation à une température comprise entre environ 20 et 25 C. Le temps de séchage mentionné ci-dessus varie selon le volume et l'épaisseur du film ou de l'éponge.

La poudre, l'éponge, le film, la crème ou le gel peuvent être conditionnés individuellement dans des bouteilles de polypropylène ou des sachets d'aluminium et prêts à être stérilisés par rayon gamma, technique de stérilisation également bien connu également de l'art.

Des ingrédients acceptables pharmaceutiquement et solubles dans le même milieu que le collagène, tels que des antibiotiques, des antiseptiques, des anticancéreux ou leurs mélanges, sont incorporables avant la filtration et la lyophilisation.

Le polymère biodégradable de par la modification apportée à sa structure après le couplage avec l'acide vinyl-carboxylique de formule (II) influence la structure du réseau des chaînes polymères constituantes du matériau fabriqué.

En effet, le réseau de polymère obtenu est plus dense. Il en résulte que le phénomène d'écrasement des mailles (ou collapsage) lors du séchage des films préparé
avec ce composé peut être évité, se traduisant par un maintien de la dimension de maille (sans rétractibilité) lors du séchage à l'air ou par le froid et sous vide (lyophilisation) et une augmentation notable des propriétés suivantes :

- l'absorption de liquide avec une expansion tridimensionnelle du produit (surface et épaisseur);
- l'élasticité du polymère (force de traction augmentée);
- l'adhérence sur le tissu à traiter;
- la malléabilité;
- la maniabilité; et - la viscosité en solution.

Parmi d'autres applications possibles pour le polymère selon l'invention, on note les produits préparés pour un usage en médecine comme les tissus ou les organes artificiels de remplacement tels que la peau (traitement des brûlures), les os (prothèses et implants), les ligaments ou les tendons (implants).

Les pansements hémostatiques selon l'invention permettent une guérison plus rapide des plaies et ainsi permet de diminuer les cicatrices résiduelles.

Les biomatériaux selon l'invention peuvent être utilisés en esthétique et cosmétologie, pour lutter contre le vieillissement de la peau (rides), les cicatrices résiduelles accidentelles, de l'acné ou de brûlure.

On comprendra que les biomatériaux selon l'invention, et particulièrement ceux sous forme de poudre, peuvent être encapsulés sous forme de micro-billes, micro-capsules ou d'implants pour un relargage contrôlé in vivo.

5. Exemples Les exemples détaillés ci-dessous décrivent différentes synthèses de composés acides vinyl-carboxylique et leurs utilisations dans des procédés de préparation de nouveaux biomatériaux à base de collagène ou le chitosane.

5.1. Préparation du HOOC-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH

75g (1 mole) de glycine (HOOC-CH2-NH2) sont dissous dans 0,3L d'eau déminéralisée.
147g (1,5 mole) d'anhydride maléique en poudre sont additionnés sous forte agitation et en seule fois, dans la solution de glycine. Des précipités blancs et très fins apparaissent dans le milieu réactionnel dès la dissolution de l'anhydride. L'agitation est maintenue encore environ 30 minutes et le produit couplé obtenu est filtré sous vide, lavé
abondamment avec de l'eau déminéralisée refroidie à 2-4 C, jusqu'à ce que l'eau de lavage soit légèrement acide (pH = 4 à 5). Le pH est contrôlé avec du papier pH. Le produit obtenu après lavage est séché à l'air et à la température ambiante.

147 g de produit sec sont obtenus, ce qui équivaut à un rendement d'environ 85%.
Les spectres de résonance magnétique nucléaire du proton (RMN-'H) ont été
réalisés sur un Brucker AMX-400 opérant à 400 MHz.

RMN-'H (400 Mhz, DMSO) : â= 3,90 ppm (d, 1 H); â= 6,30 ppm (d, 1 H); 8= 6,41 ppm (d, 1 H); ô= 9,18 ppm (m, 1 H).

5.2. Préparation de l'acide vinyl-carboxylique de formule HOOC-CH2-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH
89,09 g(1 mole) de P-alanine (HOOC-CH2-CH2-NH2) sont dissous dans 0,3 L d'eau déminéralisée. 147 g (1,5 mole) d'anhydride maléique en poudre sont additionnés sous forte agitation et en seule fois, dans la solution. Des précipités blancs et très fins apparaissent dès la dissolution dans le milieu réactionnel de l'anhydride.
L'agitation est maintenue encore environ 30 minutes et le produit obtenu est filtré sous vide, lavé
abondamment avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que l'eau de lavage soit légèrement acide (pH -= 4 à 5 environ). Le pH est contrôlé avec du papier pH.
Le produit couplé après lavage est séché à l'air et à température ambiante.

140 g de produit sec sont obtenus avec un rendement d'environ 75%.
5.3 Préparation de l'aide vinyi-carboxylique de formule HOOC-(CH2)5-NH-CO-CH=CH-COOH

131g (1 mole) d'acide 6-aminohexanoïque (C6H1302N) sont dissous dans 0.5L
d'eau déminéralisée. 147g (1,5 mole) d'anhydride maléique en poudre sont additionnés sous forte agitation et en seule fois, dans la solution d'acide 6-aminohexanoïque.
Des précipités blancs et très fins apparaissent dès la dissolution de l'anhydride dans le milieu réactionnel. L'agitation est maintenue encore environ 30 minutes et le produit obtenu est filtré sous vide, lavé abondamment avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que l'eau de lavage soit légèrement acide (pH - 4-5 environ). Le pH est contrôlé avec du papier pH. Le produit couplé après lavage est séché à l'air et à
température ambiante.

164 g de produit sec (C,oHI505N) sont obtenus avec un rendement d'environ 71,6%.

RMN-'H(400 Mhz, DMSO) : S= 1,30 ppm (m, 2H); â= 1,48 ppm (m, 4H); â= 2,2 ppm (t, 2H); 8= 3,15 ppm (m, 2H); â= 6,26 ppm (d, 1 H); 8= 6,40 ppm (d, 1 H); S=
9,10 ppm (s, 1 H).

5.4 Préparation du collagène atélopeptide Les pattes des poulets âgés de 8 semaines sont récupérées 2 heures après l'abattage.
Ces pattes sont brossées, lavées et rincées à l'eau déminéralisée, ensuite désinfectées en trempant dans une solution d'éthanol à 70% pendant environ une (1) heure.
Les pattes sont fendues longitudinalement au niveau des métatarses et des doigts avant de les tremper dans une solution stérile du chlorure de sodium 2 M(mol/L), pendant 2 serriaines à une température comprise entre 2 et 8 C. La solution de NaCI 2 M
est changée 2 fois par semaine. Les écailles entourant les pattes sont retirées et les tendons, les ligaments et la peau sont enlevés des os et puis coupés en petits morceaux qui sont ensuite mis sous agitation dans une solution de Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris) 1%(p/v) - Citrate de sodium 2,40%
(p/v), pH =
7,30-7,50 pendant 24 heures et à 2-8 C pour éliminer les débris membranaires et le sang. Les matériaux sont récupérés par une simple filtration et lavés avec de l'eau stérile.

75 g de tendons, de ligaments et de peaux sont mis en contact sous agitation dans 1 L
d'acide acétique (0,5 M ou 3% (v/v)) pendant 2 heures à température ambiante, puis sont: broyés en utilisant un mixeur domestique. Le broyage dure au total 1 minute (4 x 15 secondes) ou jusqu'à l'obtention d'une consistance pâteuse. La solution de collagène est additionnée d'un deuxième volume (1 L) d'acide acétique (0,5 M
ou 3%) et l'agitation continue encore pendant 4 heures à température ambiante. 2,25g de pepsine d'origine porcine mucosa (Sigma) soit 3% en poids par rapport aux morceaux de poulet (selon le brevet US 6,448,378) sont dissous dans 10 ml d'acide acétique 0,5 M.
Cette solution est ajoutée dans la solution de morceaux de poulet. L'agitation continue pendant 64 heures à température ambiante. La solution est ensuite centrifugée à une vitesse de 4200 rpm pendant 1 heure à 2-4 C. Le surnageant contenant du collagène est récupéré et refroidi à 0-2 C. Le pH de la solution du collagène est ajusté
à pH = 9,0 0,10 avec une solution refroidie à environ 0-2 C de NaOH 10N et 1 N lorsque le pH de la solution atteint 8,0; pour dénaturer la pepsine. La température est constamment maintenue à environ 0-2 C durant l'ajustement du pH. (Brevet US 5,874,537). On laisse reposer la solution à environ 0-2 C pendant 16 heures et elle est centrifugée par la suite à 4200 rpm (Beckman J6-MC) pendant 1 heure et à 2-4 C. Deux parties sont séparées, la partie claire et très visqueuse contenant le collagène atélopeptide est transférée dans un bécher et gardée à 0-2 C, la remontée de la température au delà de 6 C
entraîne la formation des gels de collagène. Le résidu contenant de la pepsine et les télopeptides est éliminé. La solution de collagène ainsi obtenue peut être directement soumise à un couplage avec de l'acide vinyl-carboxylique choisi.

Une équivalence de 2,5 M de NaCI (ou 1 M d'acétate de sodium) solide est ajoutée sous agitation dans la solution de collagène refroidie à environ 0-2 C. Le collagène est précipité instantanément, l'agitation est poursuivie encore pendant 2 à 4 heures et laissée reposée pour toute une nuit à température ambiante. Le collagène est récupéré
par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et est remis en solution à
environ 0-2 C
dans une solution d'acide acétique à 3%. Le collagène est repurifié par une deuxième précipitation en ajoutant 1 M NaCI (ou 1 M d'acétate de sodium) solide dans la solution sous agitation. Le collagène précipité est récupéré par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et à 0-2 C. Le précipité est ensuite lavé avec une solution de Tris(hydroxymethyl)aminométhane 1%(p/v) à pH = 7-7,50. La solution de lavage est éliminée par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et à 0-2 C et le précipité est déshydraté par de l'éthanol pur et séché à 20-25 C.
La masse de collagène obtenue est de 9,40 g.
5.5 Préparation du collagène couplé

5.5.1 Couplage direct du collagène atélopeptïde Deux. (2) litres de solution de collagène atélopeptide préparée tel que précédemment (avant la lyophilisation) sont refroidis à 0-2 C, pH=9,0 ( 0,10). 10g d'acide vinyl-carboxylique de formule chimique HOOC-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH tels que préparés précédemment sont additionnés dans la solution de collagène, sous agitation pendant au moins 1 heure. La solution est chauffée à 37 C pendant au moins 30 minutes ou jusqu'à la dissolution totale de l'acide. On laisse la température descendre à
20 C avec agitation pour un temps additionnel de 2 à 4 heures. Le collagène couplé est précipité
en ajoutant dans la solution et sous agitation une équivalence de 2,5 M NaCI
ou 1 M
d'acétate de sodium solide dans la solution. Un précipité fin apparaît.
L'agitation est maintenue encore pendant 1 heure et le précipité est laissé au repos à
température ambiante pour toute une nuit. Le collagène couplé est récupéré par centrifugation à
4200 rpm pendant 1 heure et à 0-2 C. Le précipité est ensuite dissous à
nouveau dans un volume égal avant la première précipitation avec une solution d'acide acétique à 1%
(v/v). Une deuxième précipitation du collagène couplé a été faite en ajoutant dans la solution et sous agitation une équivalence de 0,8 M de NaCI ou 1 M d'acétate de sodium solide. Le collagène couplé est purifié à nouveau et est de nouveau récupéré
par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et à environ 0-2 C. Le collagène couplé
est ensuite lavé avec une solution de Tris(hydroxymethyl)aminométhane 1%(p/v), pH =
7,0-7,5. La solution de lavage est éliminée par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et à 0-2 C et le précipité est déshydraté par de l'éthanol pur et séché
à 20-25 C.
La masse de collagène modifié obtenue est de 8,20 g.

5.5.2 Couplage du collagène atélopeptide purifié

10g du collagène atélopeptide déshydraté obtenu selon le procédé décrit ci-dessus sont finement moulus et dissous dans 500 ml d'acide acétique 1 % (v/v). La concentration finale du collagène est de 2% (p/v).

2,5 g d'acide vinyl-carboxylique insaturé de formule HOOC-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH
sont ajoutés dans la solution de collagène sous agitation pendant 1 heure et à
température ambiante. La solution de collagène devient plus visqueuse. La solution est portée à 37 C pendant au moins 30 minutes ou jusqu'à la dissolution complète de l'agent de couplage. Le collagène couplé est précipité en ajoutant dans la solution une équivalence d'l M NaCI ou 1 M d'acétate de sodium solide. L'agitation est maintenue pour au moins 1 heure ou toute la nuit à la température ambiante. Le précipité
est récupéré par centrifugation à 4200 rpm, pendant 1 heure et à 0-2 C. (Beckman J6-MC).
Le précipité est ensuite redissous dans un volume égal avant la première précipitation avec une solution d'acide acétique à 1 % (v/v). Une deuxième précipitation du collagène couplé a été faite en ajoutant dans la solution sous agitation une équivalence de 0,8 M
de NaCI ou 1 M d'acétate de sodium solide. Le collagène couplé et purifié à
nouveau et est récupéré par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et à 0-2 C. Le collagène couplé est ensuite lavé avec une solution de Tris(hydroxyméthyl)aminométhane 1%
(p/v), pH = 7,0-7,5. La solution de lavage est éliminée par centrifugation à
4200 rpm pendant 1 heure et à 0-2 C et le précipité est déshydraté par de l'éthanol pur et séché à
20-25 C.
La masse de collagène modifié obtenue est de 7,02 g.
5.6 Préparation du chitosane couplé

Le deuxième composé utilisé dans cette invention est le chitosane commercial provenant des carapaces de crabe désacétylées à 85% (Sigma C3646).

10 g de chitosane (1 %) sont dissous dans 1 L d'une solution d'acide acétique à 0,5 M ou 3%. Le pH de la solution est 3,40. La solution est filtrée pour éliminer les débris et les impuretés. 10g d'acide environ vinyl-carboxylique de formule :
HOOC-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH
sont ajoutés dans la solution de chitosane sous agitation et à température ambiante, le pH du mélange d'environ 3,50. Le mélange est chauffé à 55-60 C pendant au moins 1 heure ou jusqu'à la dissolution totale de l'agent de couplage. La température est abaissée à 20 C sous agitation, et ensuite le chitosane couplé est précipité
en ajoutant dans la solution sous agitation pendant au moins 1 heure 1 M NaCI ou 1 M
d'acétate de sodium solide. Le mélange est centrifugé à 4200 rpm pendant 1 heure à 0-2 C
(Beckman J6-MC) pour récupérer le chitosane couplé. Le précipité est lavé deux fois avec de l'eau pure et finalement le chitosane couplé est récupéré par centrifugation à
4200 rpm pendant 1 heure à environ 0-2 C. Le chitosane est déshydraté avec de l'éthanol et séché à la température ambiante. La masse de chitosane obtenue est de 9,55g.

5.7 Préparation de biomatériaux et de pansements hémostatiques.

5.7.1 Préparation d'un biomatériau à base de collagène ou de chitosane modifié

1 g de collagène couplé ou de chitosane couplé obtenu selon les exemples ci-dessus est dissous dans 100 mL d'une solution d'acide acétique à 1%(v/v). 1 mL d'une solution à
10% (v/v) de polyoxyéthylène sorbitan monooléate (TweenTM 80) est ajouté. Les bulles formées dues à la viscosité de la solution sont éliminées par ultrason ou le vide.

La solution ainsi préparée est un biomatériau qui peut être utilisé soit directement dans le domaine médical, biomédical, pharmaceutique ou cosmétique, soit pour la fabrication de pansements.

Des ingrédients pharmaceutiques acceptables tels que des antibiotiques, des bactéricides, ou des anticancéreux peuvent être incorporés dans ce biomatériau sous forme liquide avant de réaliser un pansement.

Tel que déjà mentionné, le pansement peut être préparé sous différente formes telles qu'une éponge, un film, une poudre, un gel ou une crème. La forme sera choisie selon l'usage voulu pour ce pansement.

5.7.2 Préparation des éponges hémostatiques La solution préparée ci-dessus est versée dans des moules antiadhésifs. Le volume de la solution est déterminé selon la dimension du moule et l'épaisseur du pansement. Les moules sont placés sur les tablettes d'un lyophilisateur à 20 C (FTS system) programmé
pour faire descendre la température des tablettes à 0 C, à raison de 1 C par minute. La température est maintenue à 0 C pendant'1 heure, ensuite la température continue à
descendre à-20 C et maintenue pendant 1 heure. Après ce temps, la température descend à-40 C et maintenue pendant 1 heure pour que la formation de la glace soit bien homogène sans formation des cristaux en surface. Un vide de 200 mtorr est alors fait après ce temps et en même temps la température des tablettes remonte à 20 C à
raison de 0,02 C par minute. Le vide est baissé à 20 mtorr et la température continue à
remonter à 30 C et maintenue encore 2 heures avant la fin du cycle de lyophilisation.
Les éponges ou les pansements lyophilisés sont sortis de leur moule et conditionnés individuellement dans des sachets d'aluminium. Ces sachets sont stérilisés au rayon ganima.

5.7.3 Préparation des films transparents La solution préparée ci-dessus est versée dans des moules en polycrystal, en polycarbonate ou en polystyrène. Le volume de la solution est déterminé selon la dimension du moule et l'épaisseur des films. Les moules sont ensuite placés sous la hotte à flux laminaire. Le séchage dure environ de 48 à 60 heures à
température ambiante. Les films sont décollés de leur moule et conditionnés individuellement dans des sachets d'aluminium. Ces sachets sont stérilisés au rayon gamma.

5.7.4 Préparation des poudres hémostatiques Le collagène couplé ou le chitosane couplé obtenu selon le procédé décrit est moulu poui- obtenir une poudre très fine. Cette poudre est conditionnée dans des flacons en polypropylène fermés par un bouchon. Ces flacons sont stérilisés au rayon gamma.
Les ingrédients pharmaceutiques acceptables tels que des antibiotiques, des bactéricides ou des anticancéreux peuvent être incorporés dans la poudre.

5.8 Essais de l'effet hémostatique des éponges à base de collagène modifié et de chitosane modifié

Les essais de l'effet hémostatique des pansements obtenus sous forme d'éponge ont été effectués sur les lapins au niveau du foie. Les pansements testés sont préparés avec du collagène modifié et du chitosane modifié selon le procédé décrit ci-dessus.

Chaque pansement a une surface d'environ 5 cm par 3 cm et une épaisseur d'environ 0,4 cm. Le témoin utilisé est une compresse pliée en 4 épaisseurs pour obtenir une épaisseur équivalente à celle des éponges hémostatiques.

Les lapins sont anesthésiés et incisés longitudinalement à l'abdomen, le foie exposé est coupé à l'extrémité du lobe d'un morceau d'environ 2cm x 0,5cm. Les éponges sont appliquées directement sur les plaies en tenant à la main sans appliquer une forte pression. Une pression manuelle plus forte est appliquée avec la compresse.
L'hémostase est observée toutes les 30 secondes (s) jusqu'à l'arrêt complet du saignement.

Le tableau 2 ci-dessous résume le temps d'arrêt du saignement.

Collagène couplé Chitosane couplé Compresse Lapin 1 2 3 Temps d'arrêt 90 s 110 s 250s Tableau 2 Les éponges hémostatiques ont également été appliquées sur des coupures accidentelles au niveau de l'épiderme humain. L'application de l'éponge a entraîné un arrêt rapide (mais non quantifié) du saignement et une cicatrisation accélérée de la plaie avec absence de cicatrice résiduelle.

Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en détail ci hautõ l'invention n'est pas limitée à ces seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ni de l'esprit de l'invention.

Claims (16)

1. Procédé de préparation d'un polymère biodégradable modifié, comprenant :

(a) une première étape de réaction en milieu aqueux entre un aminoacide, un peptide ou un polypeptide et l'anhydride maléique pour former un acide vinyl-carboxylique; et (b) une seconde étape de réaction en milieu aqueux entre l'acide vinyl-carboxylique obtenu à l'étape (a) et un polymère biodégradable ayant au moins une fonction amine primaire pour obtenir le polymère biodégradable modifié désiré.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'acide aminé est un acide aminé
essentiel choisi parmi la glycine, la L-alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, la sérine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la cystéine, la tyrosine, l'histidine, la lysine et l'arginine, ou acide aminé non essentiel choisi parmi la .beta.-alanine, l'acide 2-aminobutyrique, l'acide 3-aminobutyrique, l'acide 4-aminobutyrique, l'acide 2-aminopentanoïque, l'acide 2-amino-2-méthylbutyrique, l'acide 5-aminopentanoïque, l'acide 6-aminohexanoïque et l'acide 7-aminoheptanoïque.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le milieu aqueux utilisé
à l'étape (a) est de l'eau pure déminéralisée.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le polymère biodégradable utilisé à l'étape (b) est un glycosaminoglycane ou une protéine fibreuse.

5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le glycosaminoglycane est le chitosane.

6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel le chitosane a un taux de désacétylation supérieur à environ 75 %.

7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le taux de désacétylation du chitosane est supérieur ou égal à 85%.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le milieu aqueux utilisé dans l'étape b) est une solution d'acide acétique de concentration molaire d'environ 0,5 mol/L.

9. Procédé selon la revendication 4, dans lequel la protéine fibreuse est du collagène ou de l'élastine.

10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le collagène est un collagène natif ou un collagène atélopeptide.

11. Le polymère biodégradable modifié obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ledit polymère ayant des propriétés biocompatibles, hémostatiques et cicatrisantes.

12. Utilisation du polymère biodégradable modifié tel que défini dans la revendication 11, pour la fabrication d'un biomatériau ayant des applications médicales, biomédicales, pharmaceutiques ou cosmétiques.

13. Utilisation selon la revendication 12, dans laquelle le biomatériau comprend en outre un polymère biodégradable identique à celui utilisé dans l'étape b) du procédé
selon la revendication 1, un excipient pharmaceutiquement acceptable et/ou un ingrédient pharmaceutiquement acceptable choisi parmi les antibiotiques, les antiseptiques, les anticancéreux et leurs mélanges.

14. Utilisation selon la revendication 12 ou 13, dans laquelle le biomatériau est sous forme solide ou en solution aqueuse.

15. Un pansement comprenant le biomatériau tel que défini dans l'une quelconque des revendications 12 à 14, ledit pansement étant biocompatibles et ayant des propriétés hémostatiques et cicatrisantes.

16. Le pansement selon la revendication 15, sous forme d'éponge, de film, de poudre, de gel ou de crème.