ES2211923T3

ES2211923T3 - Prepaciones adhesivas biocompatibles.

Info

Publication number: ES2211923T3
Application number: ES96108503T
Authority: ES
Inventors: Wonza M. Rhee; Prema R. Rao; George H. Chu; Frank A. Delustro; Carol F.H. Harner; Naomi Sakai; Jacqueline A. Schroeder
Original assignee: Cohesion Technologies Inc
Current assignee: Angiotech Biomaterials Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-29
Publication date: 2004-07-16
Anticipated expiration: 2016-05-29
Also published as: EP0747066A3; ATE255918T1; EP0747066A2; US5786421A; JPH0999052A; JP4831848B2; DE69630990T2; DE69630990D1; US5744545A; EP0747066B1; CA2172906C; US5936035A; CA2172906A1; JP2007296401A

Abstract

SE DESCRIBEN COMPOSICIONES CON BASE DE COLAGENO UTILIZADAS PARA LA ADHESION DE TEJIDOS O LA ADHESION DE TEJIDOS A LOS MATERIALES SINTETICOS DE IMPLANTES. LAS COMPOSICIONES INCLUYEN COLAGENO EN ENLACE CRUZADO CON UN POLIMERO HIDROFILICO SINTETICO ACTIVADO MULTIFUNCIONALMENTE. LA COMPOSICION PREFERENTE INCLUYE COLAGENO FIBRILAR, UN AGENTE DE DESAGREGACION DE FIBRAS Y UN POLIMERO HIDROFILICO SINTETICO ACTIVADO MULTIFUNCIONALMENTE. TAMBIEN SE DESCRIBEN LOS METODOS PARA UTILIZAR LAS COMPOSICIONES CON EL FIN DE UNIR UN TEJIDO NATIVO A LA SUPERFICIE DE OTRO TEJIDO NATIVO, A UN TEJIDO NO NATIVO O A UN IMPLANTE SINTETICO. ASIMISMO, SE DESCRIBEN LOS METODOS PARA UTILIZAR LAS COMPOSICIONES PARA EVITAR LA FORMACION DE ADHESIONES QUIRURGICAS.

Description

Preparaciones adhesivas biocompatibles.

Campo de la invención

De un modo general, esta invención se refiere a composiciones útiles como adhesivos biológicos o quirúrgicos; más específicamente, se refiere a composiciones bioadhesivas que comprenden colágeno reticulado usando un polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado así como al uso de tales composiciones para llevar a cabo la adhesión entre una primera superficie y una segunda superficie, en la que al menos una de las superficies primera y segunda es, preferentemente, una superficie tisular originaria y al uso de tales composiciones para impedir la formación de adhesiones tras la cirugía.

Antecedentes de la invención

La patente de Estados Unidos Nº 5.024.742, expedida el 18 de junio de 1991 a Nesburn y col., describe un método de reticulación de polímeros que contienen aminoácidos con agentes de reticulación heterobifuncionales y fotoactivables, teniendo, los agentes de reticulación, un sitio fotoactivable y un sitio ordinario, que comprende: i) seleccionar uno o más polímeros que contienen aminoácidos y ii) combinar los polímeros con los agentes de reticulación de tal forma que el sitio ordinario en el agente de reticulación se una al polímero y el sitio fotoactivable se desuna. Tras la fotoactivación, la reticulación se forma cuando el sitio fotoactivo se une a otro polímero que contiene aminoácidos. La composición de colágeno reticulado resultante puede usarse como bioadhesivo para el cierre sin sutura del ojo o cualquier otra herida.

La patente de Estados Unidos Nº 5.156.613, expedida el 20 de octubre de 1992 a Sawyer, describe un método para reunir o reconstruir un tejido biológico que comprende aplicar energía al tejido mientras se proporciona una sustancia de relleno y desnaturalizar o fundir la sustancia y el tejido biológico adyacente con la energía para provocar el mezclamiento de la sustancia y el tejido desnaturalizados o fundidos reuniendo o reconstruyendo, de este modo, el tejido. También se reivindica un método para reunir o reconstruir un tejido biológico que comprende aplicar energía óptica o de radiofrecuencia mientras se proporciona una sustancia de relleno de colágeno al tejido biológico; desnaturalizar o fundir el colágeno y el tejido adyacente con la energía aplicada para provocar el mezclamiento del colágeno y el tejido desnaturalizados o fundidos y reunir o reconstruir el tejido.

La patente de Estados Unidos Nº 5.162.430, expedida el 10 de noviembre de 1992 a Rhee y col., describe conjugados de colágeno y polímero sintético preparados mediante la unión covalente del colágeno a los polímeros hidrófilos sintéticos tales como diversos derivados de polietilenglicol.

La patente de Estados Unidos Nº 5.192.316, expedida el 9 de marzo de 1993 a Ting, describe una lente para la implantación directa sobre la membrana de Bowman de una córnea viva para corregir las propiedades ópticas del ojo. La lente está hecha de un polímero sintético que es permeable al agua y forma un hidrogel. Preferentemente, la lente incluye un aditivo para aumentar la adhesión de la lente a la córnea y/o para estimular el crecimiento de células epiteliales. El aditivo puede ser fibronectina, colágeno, proteína de cierre celular, factor antigelatina, un péptido biológicamente activo, globulina insoluble en frío, condronectina, laminina, factor de crecimiento epitelial (EGF, abreviadamente en inglés "epithelial growth factor") o una mezcla de los mismos.

La patente de Estados Unidos Nº 5.209.776, expedida el 11 de mayo de 1993 a Bass y col., describe una composición para unir tejidos separados o para revestir tejidos o materiales protésicos que comprende: i) al menos un primer componente seleccionado de péptidos naturales o sintéticos, variantes o derivados modificados, reticulados, cortados o acortados y ii) al menos un segundo componente, que es diferente del primer componente, adaptado para servir de apoyo al primer componente para formar una matriz, sol o gel con el primer componente. El primer componente puede ser, por ejemplo, albúmina, \alpha-globulinas, \beta-globulinas, \gamma-globulinas, transtiretina, fibrinógeno, trombina, colágeno, elastina, queratina, fibroína, fibrina o fibronectina. El segundo componente puede ser, por ejemplo, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de queratano, heparina, sulfato de heparano, colágeno, fructosa, dextranos, agarosa, ácido algínico, pectinas, metilcelulosa, hidroxicelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, CMC, glicerina, manitol, sorbitol, polivinilalcohol o polietilenglicol.

La patente de Estados Unidos Nº 5.219.895, expedida el 15 de junio de 1993 a DeVore y col., describe una composición de colágeno, útil como adhesivo en aplicaciones médicas, en la que la composición se forma mediante polimerización de colágeno derivado, modificado con un agente de acilación y/o un agente de sulfonación. La polimerización se realiza mediante radiación UV explosiva, luz fluorescente y/o un iniciador. El agente de acilación puede ser anhídrido glutárico, anhídrido succínico, anhídrido láurico, anhídrido diglucólico, anhídrido metil succínico, anhídrido metil glutárico, anhídrido dimetil glutárico o anhídrido exo-3,6-epoxi-1,2,3,4-tetrahidroftálico. La unión del tejido blando comprende aplicar una composición de colágeno polimerizable sobre, al menos, una porción de una superficie de al menos uno de un primer y segundo tejido; exponer la superficie tisular a un iniciador para polimerizar el colágeno y poner en contacto los dos tejidos para formar una unión entre ellos.

La patente de Estados Unidos Nº 5.290.552, expedida el 1 de marzo de 1994 a Brown y col., describe una composición adhesiva quirúrgica que comprende fibrinógeno, factor XIII, colágeno, trombina e iones de Ca^{2+} en un medio acuoso. El colágeno es fibrilar, insoluble a valores de pH de aproximadamente 5, fluidificado, tiene la estructura helicoidal natural de las fibrillas de colágeno y es capaz de provocar la gelificación del adhesivo. La trombina y el Ca^{2+} están presentes en una cantidad suficiente para catalizar la polimerización del fibrinógeno para formar un coágulo.

La patente de Estados Unidos Nº 5.328.955, expedida el 12 de julio de 1994 a Rhee y col., describe diversas formas activadas de polietilenglicol y diversos enlaces que pueden usarse para producir conjugados de colágeno y polímero sintético que tienen un intervalo de propiedades físicas y químicas.

La publicación de patente europea Nº 341.007, de Matrix Pharmaceuticals, Inc., describe una composición adhesiva quirúrgica que comprende, en una composición acuosa, plasma del paciente a ser tratado, colágeno en una cantidad suficiente para espesar la composición (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5-30 mg/ml) y trombina en una cantidad suficiente para catalizar la polimerización del fibrinógeno presente en el plasma para producir un coágulo (por ejemplo, aproximadamente, 1-1000 N1Hu trombina).

La publicación de patente europea Nº 466.383, de Bausch & Lomb, Inc., describe una composición adhesiva adecuada para aplicaciones quirúrgicas que comprende una solución acuosa de colágeno natural que tiene un índice de temperatura de fusión de 35-45ºC. La composición comprende una mezcla de colágeno reticulado densamente y colágeno sin reticular. El colágeno reticulado densamente se consigue mediante reticulación térmica. La publicación PCT Nº WO 9.213.578, de Bausch & Lomb, Inc., describe una composición adhesiva quirúrgica que comprende un colágeno acuoso o solución de gelatina con un índice de temperatura de fusión (MIT, abreviadamente en inglés "melt index temperature") de 33-60ºC. la cicatrización de las heridas se promueve mediante la puesta en contacto de, al menos, una superficie de la herida con una composición que comprende: a) una dispersión de células epiteliales en cultivo en una solución de colágeno acuoso o b) una solución acuosa que contiene un biopolímero y factores de crecimiento purificados que se presentan de un modo natural, en la que la composición tiene un MIT de 33-60ºC y una viscosidad de menos de 50.000 mPa.s a 10ºC por encima del MIT.

La publicación de patente europea Nº 575.273, de Flamel Technologies, describe derivados de colágeno reticulado que son solubles en agua y/o disolventes orgánicos apróticos polares y que contienen grupos -SH libres o sustituidos en residuos de cisteína o derivados de cisteína unidos a la molécula de colágeno, al menos en parte, a través de grupos espaciadores. También se describe colágeno reticulado insoluble en el que los puentes intercatenarios son, al menos en parte enlaces disulfuro formados por residuos de cisteína unidos a la molécula de colágeno, al menos en parte, a través de grupos espaciadores. Las composiciones reivindicadas son útiles como adhesivos biológicos o quirúrgicos.

La publicación de patente japonesa Nº 6.070.972, de Nippon, describe una composición para adherir tejidos biológicos que consiste en: i) un ingrediente adhesivo que comprende un hidrolizado parcial de la proteína del colágeno, agua y un compuesto fenólico polihídrico; y ii) un ingrediente de resistencia que consiste en una solución acuosa que contiene al menos uno del formaldehído, glutaraldehído y gliceraldehído.

El documento EP-A-0656214 describe conjugados de colágeno y polímero que comprenden colágenos modificados químicamente, que se encuentran en forma sustancialmente no fibrilar a pH 7, unidos covalentemente a polímeros hidrófilos sintéticos para producir sustancias ópticamente claras para el uso en aplicaciones oftalmológicas u otro tipo de aplicaciones médicas.

Ahora se describe una descripción detallada de las realizaciones preferidas de la presente invención, que incluyen composiciones bioadhesivas que comprenden colágeno reticulado usando polímeros hidrófilos sintéticos multifuncionalmente activados y los métodos para el uso de estas composiciones para llevar a cabo la adhesión entre una primera superficie y una segunda superficie, en los que al menos una de las superficies primera y segunda es una superficie tisular originaria.

Resumen de la invención

De este modo, la presente invención proporciona una composición bioadhesiva que comprende colágeno fibrilar, un agente de desensamblaje de fibras (preferentemente, un alcohol biocompatible) y un polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado, en la que el agente de desensamblaje de fibras está presente en una cantidad suficiente para hacer al colágeno sustancialmente no fibrilar a pH 7 y en la que el colágeno y el polímero sintético se unen covalentemente para formar un conjugado de colágeno y polímero sintético.

La invención también proporciona dicha composición para el uso en un método para llevar a cabo la unión no quirúrgica de una primera superficie a una segunda superficie, que comprende las etapas de: mezclar el colágeno fibrilar y el agente de desensamblaje de las fibras en una cantidad suficiente para hacer al colágeno sustancialmente no fibrilar a pH 7; mezclar el colágeno resultante y el polímero hidrófilo sintético para iniciar la reticulación entre ellos; aplicar la mezcla de colágeno y polímero sintético a una primera superficie antes de que haya ocurrido una reticulación sustancial entre el colágeno y el polímero sintético; y poner en contacto la primera superficie con la segunda superficie para llevar a cabo la adhesión entre ellas. Al menos una de las superficies primera y segunda es, preferentemente, una superficie tisular originaria.

La invención también proporciona dicha composición para el uso en un método para impedir la formación de adhesiones después de la cirugía, que comprende las etapas de: mezclar el colágeno fibrilar y el agente de desensamblaje de las fibras en una cantidad suficiente para hacer al colágeno sustancialmente no fibrilar a pH 7; mezclar el colágeno resultante y el polímero hidrófilo sintético para iniciar la reticulación entre ellos; aplicar la mezcla de colágeno y polímero sintético al tejido que comprende, que rodea o adyacente a un sitio quirúrgico antes de que haya ocurrido una reticulación sustancial entre el colágeno y el polímero sintético; permitir que el colágeno y el polímero sintético continúen la reticulación in situ hasta que se consiga el equilibrio de reticulación; y llevar a cabo el cierre del sitio quirúrgico, opcionalmente, mediante metodologías ordinarias.

Las composiciones adhesivas a base de colágeno no fibrilar de la presente invención son, preferentemente, ópticamente claras, haciendo a las composiciones y los métodos de la presente invención particularmente apropiados para el uso en las aplicaciones oftalmológicas en las que la claridad óptica es un requerimiento. Además, las composiciones de la presente invención comprenden componentes biocompatibles y no inmunógenos que dejan productos atóxicos y no potencialmente inflamatorios o inmunógenos en el sitio de administración del tejido.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra los resultados de la calorimetría por exploración diferencial (DSC, abreviadamente en inglés "differential scanning calorimetry") del colágeno succinilado sin reticular (muestra A) y de las formulaciones de colágeno succinilado que contienen 10, 20, 50 y 91 mg/ml de SG-PEG difuncionalmente activado (muestras B, C y D, respectivamente).

La figura 2 muestra los resultados de la DSC de las formulaciones de colágeno metilado que contienen 2, 10, 30 y 72 mg/ml de SG-PEG difuncionalmente activado (muestras E, F, G y H, respectivamente).

La figura 3 muestra los resultados de la DSC del colágeno metilado sin reticular.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención

De acuerdo con la presente invención, las composiciones adecuadas para el uso como adhesivos biológicos o quirúrgicos se preparan mediante reticulación del colágeno con un polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado. Tal como se usan el presente documento, los términos "bioadhesivo", "adhesivo biológico" y "adhesivo quirúrgico" se usan de un modo intercambiable para referirse a composiciones biocompatibles capaces de llevar a cabo una unión temporal o permanente entre las superficies de dos tejidos originarios o entre una superficie tisular originaria y una superficie tisular no originaria o una superficie de un implante sintético.

Para preparar las composiciones bioadhesivas de la presente invención, primero se necesita proporcionar colágeno y un polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado. Tal como se usa en el presente documento, el término "colágeno" tiene la intención de incluir colágeno de cualquier tipo, colágeno de cualquier fuente, incluyendo, pero no estando limitado al, colágeno extraído de tejidos o análogos de colágeno producidos de un modo recombinante, derivados de colágeno, colágenos modificados y colágenos desnaturalizados tales como la gelatina.

El colágeno es el componente proteínico principal del hueso, cartílago, piel y tejido conectivo de los animales. El colágeno en su forma natural es, típicamente, una molécula rígida con forma de varilla de, aproximadamente, 300 nanómetros (nm) de longitud y 1,5 nm de diámetro. Contiene tres polipéptidos de colágeno que forman una triple hélice apretada. Los polipéptidos de colágeno se caracterizan por una sección media larga que tiene la secuencia repetida -Gly-X-Y-, en la que X e Y son, frecuentemente, prolina o hidroxiprolina, unida a cada extremo mediante las regiones "telopeptídicas", que constituyen menos del, aproximadamente, 5 por ciento (%) de la molécula. Las regiones telopeptídicas de las cadenas de colágeno son, típicamente, responsables del reticulado entre las cadenas y de la inmunogenia de la proteína.

De un modo general, se puede usar colágeno de cualquier fuente para preparar las composiciones de la presente invención; por ejemplo, el colágeno puede ser extraído y purificado a partir de una fuente humana o una fuente de otro mamífero, tal como dermis bovina o porcina y placenta humana o puede ser producido de un modo recombinante o de otro modo. La preparación a partir de piel bovina de colágeno purificado y sustancialmente no antigénico en solución es, básicamente, un procedimiento en tres etapas que implica la solubilización, el tratamiento enzimático y la purificación, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.140.537, expedida el 20 de febrero de 1979 a Luck y col., y en la patente de Estados Unidos Nº 4.488.911, expedida el 18 de diciembre de 1984 a Luck y col. El documento EP-A-0652731 describe métodos para extraer y purificar colágeno a partir de placenta humana. El documento EP-A-0681431 describe métodos para producir colágeno humano recombinante en la leche de animales transgénicos, que incluyen las vacas transgénicas. El término "colágeno" o "sustancia colágena", tal como se usa en el presente documento, se refiere a todas las formas de colágeno, incluyendo aquellas que han sido procesadas o modificadas de otro modo.

Puede usarse el colágeno de cualquier tipo, inicialmente fibrilar, que incluye, pero no está limitado a, los tipos I, II, III, IV o cualquier combinación de los mismos, aunque el tipo I es el generalmente preferido. Puede usarse o bien el colágeno atelopeptídico o bien el colágeno que contiene telopéptidos; sin embargo, cuando se usa el colágeno de una fuente xenogénica, tal como el colágeno bovino, se prefiere, generalmente, el colágeno atelopeptídico debido a su inmunogenia reducida en comparación con el colágeno que contiene telopéptidos.

Se prefiere el colágeno que no ha sido previamente reticulado mediante métodos tales como calentamiento, irradiación o mediante agentes de reticulación química para el uso como material de partida en la práctica de la presente invención, aunque puede usarse colágeno previamente reticulado. El colágeno fibrilar atelopeptídico sin reticular está suministrado comercialmente por Collagen Corporation (Palo Alto, CA) en concentraciones de colágeno de 35 mg/ml y 65 mg/ml con los nombres comerciales Zyderm® I Collagen y Zyderm II Collagen, respectivamente. El colágeno fibrilar atelopeptídico reticulado con glutaraldehído está suministrado comercialmente por Collagen Corporation a una concentración de colágeno de 35 mg/ml con el nombre comercial de Zyplast® Collagen.

Los colágenos para el uso en la presente invención están, generalmente, en suspensión acuosa a una concentración de, aproximadamente, 20 mg/ml a, aproximadamente, 120 mg/ml; preferentemente, de, aproximadamente, 30 mg/ml a, aproximadamente, 90 mg/ml.

El colágeno no fibrilar se produce en la presente invención porque tiene una consistencia pegajosa y es, generalmente, más viscoso que el colágeno fibrilar (para unas concentraciones dadas equivalentes de proteína de colágeno), haciéndolo particularmente útil en las composiciones destinadas para el uso como bioadhesivos. El término "colágeno no fibrilar" se refiere a cualquier sustancia de colágeno modificada o no modificada que está, sustancialmente, en forma no fibrilar a pH 7, como se indica mediante la claridad óptica de una suspensión acuosa del colágeno.

Los colágenos para el uso en las composiciones bioadhesivas de la presente invención parten de la forma fibrilar y, seguidamente, se hacen no fibrilares mediante la adición de uno o más agentes de desensamblaje de fibras. Los agentes de desensamblaje de fibras deben estar presentes en una cantidad suficiente para hacer al colágeno sustancialmente no fibrilar a pH 7, como se describe anteriormente. Los agentes de desensamblaje de fibras para el uso en la presente invención incluyen, sin limitación, diversos alcoholes, aminoácidos, sales inorgánicas y carbohidratos biocompatibles, siendo los alcoholes biocompatibles los particularmente preferidos. Los alcoholes biocompatibles preferidos incluyen glicerol y propilenglicol. No se prefieren los alcoholes no biocompatibles tales como etanol, metanol e isopropanol para el uso en la presente invención debido a sus efectos potencialmente nocivos sobre el cuerpo del paciente que los recibe. Los aminoácidos preferidos incluyen la arginina. Las sales inorgánicas preferidas incluyen el cloruro sódico y el cloruro potásico. Aunque pueden usarse en la práctica de la presente invención los carbohidratos, tales como diversos azúcares que incluyen la sacarosa, no son tan preferidos como otros tipos de agentes de desensamblaje de fibras porque pueden tener efectos citotóxicos in vivo.

Puede usarse el colágeno que ya está en la forma no fibrilar junto con el colágeno fibrilar para preparar las composiciones de la invención. Tal como se usa en el presente documento, el término "colágeno no fibrilar" tiene la intención de incluir tipos de colágeno que no son fibrilares en la forma natural así como colágenos que hayan sido modificados químicamente tales como los que están en forma no fibrilar a pH neutro o alrededor del pH neutro. Los tipos de colágenos que no son fibrilares (o microfibrilares) en la forma natural incluyen los tipos IV, VI y VII.

Los colágenos modificados químicamente que están en forma no fibrilar a pH neutro incluyen el colágeno succinilado y el colágeno metilado, ambos pudiéndose preparar de acuerdo con los métodos descritos en la patente de Estados Unidos Nº 4.164.559, expedida el 14 de agosto de 1979 a Miyata y col. nuestros experimentos han indicado que debido a su pegajosidad inherente, el colágeno metilado es particularmente preferido para el uso en las composiciones bioadhesivas (véanse los ejemplos 3-5 más adelante).

El colágeno fibrilar es opaco y menos pegajoso que el colágeno no fibrilar. Sin embargo, las mezclas de colágeno no fibrilar y fibrilar existen en las composiciones designadas y pueden ser preferidas para el uso en las composiciones adhesivas destinadas a la persistencia a largo plazo in vivo, si la claridad óptica no es un requerimiento. Se ha encontrado que las mezclas de colágeno metilado (no fibrilar) y colágeno fibrilar reticulado con polímeros hidrófilos sintéticos son útiles como bioadhesivos (véase el ejemplo 5 más adelante).

También puede usarse en la práctica de la invención una composición que comprende una mezcla de colágeno fibrilar reticulado y particulado y colágeno fibrilar sin reticular, que se describe en el documento EP-A-0713707. El colágeno fibrilar reticulado y particulado es, preferentemente, colágeno fibrilar reticulado con glutaraldehído y comprende, preferentemente, del, aproximadamente, 25 al, aproximadamente, 95%, más preferentemente, del, aproximadamente, 60 al, aproximadamente, 80% en peso de la composición final. El colágeno fibrilar sin reticular comprende, preferentemente, del, aproximadamente, 5 al, aproximadamente, 75%, más preferentemente, del, aproximadamente, 20 al, aproximadamente, 40% en peso de la composición final. Primeramente, se combinan el colágeno fibrilar reticulado y particulado y el colágeno fibrilar sin reticular y, seguidamente, se reticulan juntos usando un polímero hidrófilo sintético.

También se ha encontrado que el colágeno desnaturalizado, conocido normalmente como gelatina, es útil en los métodos de la invención.

Las composiciones bioadhesivas a base de colágeno de la presente invención también pueden ser formuladas para contener agentes biológicamente activos para facilitar la adhesión de los tejidos o la cicatrización de los tejidos adheridos. El término "agente biológicamente activo" o "agente activo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas orgánicas que ejercen efectos biológicos in vivo. Los ejemplos de agentes activos incluyen, sin limitación, enzimas, antagonistas o agonistas de receptores, hormonas, factores de crecimiento, médula ósea autógena, antibióticos, agentes antimicrobianos y anticuerpos. El término "agente activo" también tiene la intención de incluir diversos tipos celulares que pueden incorporarse en las composiciones de la invención. El término "agente activo" también tiene la intención de incluir combinaciones o mezclas de dos o más agentes activos, como se definen anteriormente.

Los agentes activos preferidos para el uso en las composiciones de la presente invención incluyen factores de crecimiento, tales como factores de crecimiento transformadores (TGF, abreviadamente en inglés "transforming growth factors"), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF, abreviadamente en inglés "fibroblast growth factors"), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF, abreviadamente en inglés "platelet derived growth factors"), factores de crecimiento epidérmico (EGF, abreviadamente en inglés "epidermal growth factors"), péptidos activados del tejido conectivo (CTAP, abreviadamente en inglés "connective tissue activated peptides"), factores osteogénicos y análogos, fragmentos y derivados de tales factores de crecimiento biológicamente activos. Los miembros de la familia supergénica de factores de crecimiento transformadores (TGF), que son proteínas reguladoras multifuncionales, son los particularmente preferidos. Los miembros de la familia supergénica TGF incluyen los factores de crecimiento transformadores \beta (por ejemplo, TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3); las proteínas morfogénicas del hueso (por ejemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); los factores de crecimiento de unión a heparina (por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento similar a insulina (IGF, abreviadamente en inglés "insulin-like growth factor"), inhibinas (por ejemplo, inhibina A, inhibina B); factores de diferenciación y crecimiento (por ejemplo, GDF-1) y activinas (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB).

Los factores de crecimiento pueden aislarse de fuentes naturales, tales como células de mamífero, o pueden prepararse sintéticamente, tal como mediante técnicas de ADN recombinante o mediante diversos procedimientos químicos. Además, pueden usarse análogos, fragmentos o derivados de estos factores, con la condición de que al menos muestren algo de la actividad biológica de la molécula natural. Por ejemplo, pueden prepararse análogos mediante la expresión de genes alterados por mutagénesis dirigida u otras técnicas de ingeniería genética.

Los agentes biológicamente activos pueden incorporarse en el colágeno mediante mezclamiento. De un modo alternativo, los agentes pueden unirse covalentemente al colágeno usando un agente de reticulación, tal como un polietilenglicol activado funcionalmente, o pueden unirse por afinidad al colágeno usando un ligando de unión. Los procedimientos para la unión covalente de los agentes biológicamente activos, tales como factores de crecimiento, al colágeno usando un polímero hidrófilo sintético, tal como un polietilenglicol activado funcionalmente, se describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.162.430, expedida el 10 de noviembre de 1992 a Rhee y col. los procedimientos para la unión por afinidad de agentes biológicamente activos al colágeno a través de ligandos de unión, tales como heparina, se describen en la solicitud EP 96102340.5 (publicada como EP 732,105).

Generalmente, el agente biológicamente activo se incorpora al colágeno después de que el colágeno se haya mezclado con un agente de desensamblaje de fibras. El tipo y la cantidad del agente activo usado dependerá, entre otros factores, del sitio particular y la dolencia a ser tratada y de la actividad biológica y la farmacocinética del agente activo seleccionado.

Cuando se incorporan agentes biológicamente activos en las composiciones de la invención, los alcoholes biocompatibles (y, en particular, el glicerol) son los agentes de desensamblaje de fibras preferidos, porque se ha mostrado que ciertos factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento transformador \beta, retienen su actividad en composiciones que contienen glicerol.

Para preparar las composiciones bioadhesivas a base de colágeno de la presente invención, el colágeno se reticula usando un polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado. El término "multifuncionalmente activado" se refiere a polímeros hidrófilos sintéticos que tienen, o han sido modificados químicamente para tener, dos o más grupos funcionales localizados en diversos sitios a lo largo de la cadena de polímero que son capaces de reaccionar con grupos nucleófilos, tales como grupos amino primarios (-NH_{2}) o grupos tiol (-SH) de otras moléculas, tales como colágeno. Cada grupo funcional de una molécula de polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado es capaz de unirse covalentemente con una molécula de colágeno llevándose a cabo, de este modo, la reticulación entre las moléculas de colágeno. Los tipos de polímeros sintéticos hidrófilos multifuncionalmente activados incluyen los polímeros difuncionalmente activados, tetrafuncionalmente activados y los ramificados en estrella.

Los polietilenglicoles multifuncionalmente activados y, en particular, ciertos polietilenglicoles difuncionalmente activados, son los polímeros hidrófilos sintéticos preferidos para el uso en la preparación de las composiciones de la presente invención. El término "difuncionalmente activado" se refiere a moléculas de polímeros hidrófilos sintéticos que tienen, o han sido modificadas químicamente para tener, dos grupos funcionales capaces de reaccionar con grupos nucleófilos en otras moléculas, tales como colágeno. Los dos grupos funcionales de un polímero hidrófilo sintético difuncionalmente activado se localizan, generalmente, en extremos opuestos de la cadena de polímero. Cada grupo funcionalmente activado de una molécula de polímero hidrófilo sintético difuncionalmente activado es capaz de unirse covalentemente con una molécula de colágeno llevándose a cabo, de este modo, la reticulación entre las moléculas de colágeno.

Las moléculas de polietilenglicol (PEG), para el uso en la presente invención, se modifican químicamente para proporcionar grupos funcionales en dos o más sitios a lo largo de la longitud de la molécula de PEG, para que pueda suceder la unión covalente entre el PEG y los grupos reactivos del colágeno. Se muestra más adelante la estructura de algunas formas activadas específicas de PEG, como productos de reacción generales obtenidos haciendo reaccionar formas difuncionalmente activadas de PEG con colágeno. En las fórmulas 1-8, el término COL representa al colágeno; el término PEG representa polímeros que tienen la estructura repetida (OCH_{2}CH_{2})_{n}.

El primer PEG activado es succinimidilglutarato de PEG difuncionalmente activado, denominado, en el presente documento, (SG-PEG). La fórmula estructural de esta molécula y el producto de reacción obtenido haciéndolo reaccionar con el colágeno se muestran en la fórmula 1.

SG-PEG: Succinimidilglutarato de PEG difuncionalmente activado

1

Otra forma difuncionalmente activada de PEG se denomina PEG succinimidilo (S-PEG). La fórmula estructural de este compuesto y el producto de reacción obtenido haciéndolo reaccionar con el colágeno se muestran en la fórmula 2. En la fórmula estructural general del compuesto, el subíndice 3 se sustituye por una "n". En la realización mostrada en la fórmula 1, n = 3, porque hay tres grupos CH_{2} repetidos en cada lado del PEG.

La estructura en la fórmula 2 da como resultado un conjugado que incluye un enlace "éter", que es menos propenso a hidrólisis. Este es distinto del conjugado mostrado en la fórmula 1, en el que se proporciona un enlace éster. El enlace éster es propenso a hidrólisis en condiciones fisiológicas.

SE-PEG, n = 3: PEG difuncionalmente activado succinimidilo (enlace éter)

2

Aún otra forma difuncionalmente activada de polietilenglicol, en la que n = 2, se muestra en la fórmula 3, así como el conjugado formado haciendo reaccionar el PEG activado con el colágeno.

SE-PEG, n = 2: PEG difuncionalmente activado succinimidilo (enlace éter)

3

Se proporciona otra realización preferida de la invención similar a los compuestos de fórmulas 2 y 3 cuando n = 1. La fórmula estructural del conjugado de colágeno y polímero sintético resultante se muestran en la fórmula 4. Se indica que el conjugado incluye tanto un enlace éter como un enlace peptídico. Estos enlaces son estables en condiciones fisiológicas.

SE-PEG, n = 1: PEG difuncionalmente activado succinimidilo (enlace éter)

4

Otra forma difuncionalmente activada de PEG se denomina PEG succinimidilsuccinamida (SSA-PEG). La fórmula estructural de este compuesto y el producto de reacción obtenido haciéndolo reaccionar con el colágeno se muestran en la fórmula 5. En la estructura mostrada en la fórmula 1, n = 2; sin embargo, también pueden usarse en la práctica de la invención los compuestos relacionados en los que n = 1 o n = 3-10.

La estructura en la fórmula 5 da como resultado un conjugado que incluye un enlace "amida" que, como el enlace éter previamente descrito, es menos propenso a hidrólisis y, por tanto, es más estable que un enlace éster.

SSA-PEG, n = 2: PEG difuncionalmente activado succinimidilsuccinamida

5

Aún se proporciona otra forma difuncionalmente activada de PEG cuando n = 0. Este compuesto se denomina succinimidilcarbonato de PEG (SC-PEG). La fórmula estructural de este compuesto y el conjugado formado mediante reacción del SC-PEG con el colágeno se muestran en la fórmula 6.

SC-PEG, n = 0: Succinimidilcarbonato de PEG difuncionalmente activado

6

Todos los derivados de polietilenglicol activado representados en las fórmulas 1-6 implican la inclusión del grupo succinimidilo. Sin embargo, pueden unirse grupos de activación diferentes en sitios a lo largo de la longitud de la molécula de PEG. Por ejemplo, el PEG puede derivarse para formar propionaldehído de PEG difuncionalmente activado (A-PEG), que se muestra en la fórmula 7 así como el conjugado formado mediante la reacción del A-PEG con el colágeno. El enlace mostrado en la fórmula 6 se denomina enlace -(CH_{2})_{n}-NH-, en el que n = 1-10.

A-PEG: Propionaldehído de PEG difuncionalmente activado

7

Aún otra forma de polietilenglicol activado es éter glucidil PEG difuncionalmente activado (E-PEG), que se muestra en la fórmula 8 así como el conjugado formado haciéndolo reaccionar con el colágeno.

E-PEG: Éter glucidil PEG difuncionalmente activado

8

Muchas de las formas activadas de polietilenglicol descritas anteriormente están ahora suministradas comercialmente por Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama y Union Carbide, South Charleston, West Virginia. Las diversas formas activadas de polietilenglicol y los diversos enlaces que pueden usarse para producir los conjugados de colágeno y polímero sintético que tienen un intervalo de propiedades físicas y químicas se describen, adicionalmente, en detalle en la patente de Estados Unidos Nº 5.328.955, expedida el 12 de julio de 1994 a Rhee y col.

La concentración usada de polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado para preparar las composiciones de la presente invención variará dependiendo de diversos factores, incluyendo el tipo y el peso molecular del polímero sintético usado y de la concentración proteínica del colágeno de la suspensión de colágeno. En general, se ha encontrado que se prefieren las concentraciones de polímero sintético en el intervalo de, aproximadamente, 0,1 a, aproximadamente, 10% en peso de la composición final para el uso en las composiciones y métodos de la presente invención. Por ejemplo, una composición final que tiene un peso total de 1 gramo (1000 miligramos) contendría de, aproximadamente, 1 a, aproximadamente, 100 miligramos de polímero sintético multifuncionalmente activado.

Los polietilenglicoles multifuncionalmente activados preferidos para el uso en la presente invención son el SG-PEG difuncionalmente activado (como se representa en la fórmula 1) y el SE-PEG difuncionalmente activado (mostrado en las fórmulas 2-4).

En un método general para preparar las composiciones bioadhesivas preferidas de la invención, se mezclan una suspensión acuosa de colágeno fibrilar con un agente de desensamblaje de fibras en una cantidad suficiente para hacer al colágeno sustancialmente no fibrilar a pH 7. Seguidamente, el colágeno no fibrilar resultante se mezcla con un polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado para iniciar la reticulación entre el colágeno y el polímero sintético.

Uso y administración

En un método general para llevar a cabo la unión de una primera superficie a una segunda superficie: 1) se proporcionan el colágeno y un polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado; 2) se mezclan el colágeno y el polímero sintético para iniciar la reticulación entre el colágeno y el polímero sintético; 3) se aplica la mezcla de colágeno y polímero sintético a una primera superficie antes de que haya ocurrido una reticulación sustancial entre el colágeno y el polímero sintético y 4) se pone en contacto la primera superficie con una segunda superficie para llevar a cabo la adhesión entre la primera superficie y la segunda superficie. Al menos una de las superficies primera y segunda es, preferentemente, una superficie tisular originaria.

Por ejemplo, el colágeno y el polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado se proporcionan, generalmente, en jeringuillas separadas, seguidamente, los contenidos de ambas se mezclan usando una técnica de mezclamiento de jeringuilla a jeringuilla justo antes de la administración a una primera superficie. Generalmente, el polímero sintético se usa en forma estéril y seca (como se describe en el documento EP-A-0697218) para impedir la pérdida de la capacidad de reticulación debido a la hidrólisis que, típicamente, ocurre tras la exposición de los polímeros hidrófilos a medios acuosos.

Preferentemente, el colágeno y el polímero sintético se mezclan durante un mínimo de 20 (más preferentemente, al menos 30) pasos para asegurar el mezclamiento adecuado del polímero seco con el colágeno. Ya que, generalmente, la reticulación entre el colágeno y el polímero sintético se inicia durante el procedimiento de mezclamiento, es importante administrar la mezcla de reacción del colágeno y el polímero sintético a la primera superficie tan pronto como sea posible después del mezclamiento.

La mezcla de reacción del colágeno y el polímero sintético puede expulsarse desde la abertura de una jeringuilla u otro dispositivo de extrusión apropiado y echarse sobre la primera superficie. Tras la aplicación, la mezcla de reacción del colágeno y el polímero sintético expulsada puede extenderse sobre la primera superficie usando una espátula, si fuera necesario. De un modo alternativo, el polímero sintético y el colágeno que resulta del mezclamiento del colágeno fibrilar y el agente de desensamblaje de fibras pueden mezclarse en una placa o recipiente de mezclamiento apropiados y, seguidamente, aplicarse a la primera superficie usando una espátula.

En un método alternativo para preparar la mezcla de reacción, el colágeno y el polímero sintético están contenidos en cámaras separadas de un bote o botella de pulverización con un pulverizador u otro dispositivo de pulverización apropiado. En este caso, realmente, el colágeno y el polímero sintético no se mezclan hasta que son expelidos desde el pulverizador o el dispositivo de pulverización.

Tras la aplicación de la mezcla de reacción del colágeno y el polímero sintético, la primera superficie se pone en contacto con una segunda superficie. Si las dos superficies se ponen en contacto antes de que haya ocurrido una reticulación sustancial entre el colágeno y el polímero sintético, las moléculas del polímero sintético también se unirán covalentemente con residuos de lisina de las moléculas de colágeno presentes en una de las dos o en ambas superficies, proporcionándose una adhesión mejorada.

Las dos superficies pueden mantenerse juntas de un modo manual o usando otros medios apropiados mientras la reacción de reticulación continúa hasta su conclusión. La reticulación entre el colágeno y el polímero sintético se completa, típicamente, dentro de los 20 a 60 minutos después del mezclamiento del colágeno con el polímero sintético.

Al menos una de las superficies primera y segunda es, preferentemente, una superficie tisular originaria. Tal como se usa en el presente documento, el término "tejido originario" se refiere a tejidos biológicos que son originarios del cuerpo del paciente específico a ser tratado. Tal como se usa en el presente documento, el término "tejido originario" tiene la intención de incluir tejidos biológicos que han sido empujados hacia arriba o extraídos de una parte del cuerpo de un paciente para implantarlos en otra parte del cuerpo del mismo paciente (tales como autotransplantes de hueso y autotransplantes de colgajos de piel, etc.). Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden usarse para adherir un pedazo de piel de una parte del cuerpo del paciente a otra parte del cuerpo, como en el caso de una víctima quemada.

La otra superficie puede ser una superficie tisular originaria, una superficie tisular no originaria o una superficie de un implante sintético. Tal como se usa en el presente documento, el término "tejido no originario" se refiere a tejidos biológicos que han sido extraídos del cuerpo de un paciente donante (que puede ser de la misma especie o de una especie diferente del paciente receptor) para implantarlos en el cuerpo de un paciente receptor (por ejemplo, transplantes de tejidos y órganos). Por ejemplo, las composiciones de polímero reticulado de la presente invención pueden usarse para adherir una córnea de un donante al ojo de un paciente receptor.

Tal como se usa en el presente documento, el término "implante sintético" se refiere a cualquier sustancia biocompatible destinada a la implantación en el cuerpo de un paciente no incluida en las definiciones anteriores de tejido originario y tejido no originario. Los implantes sintéticos incluyen, por ejemplo, vasos sanguíneos sintéticos, válvulas cardíacas, órganos artificiales, prótesis de huesos, lentes implantables, etc.

Debido a su claridad óptica, las composiciones bioadhesivas a base de colágeno no fibrilar que se obtienen de la presente invención son, particularmente, muy adecuadas para el uso en las aplicaciones oftalmológicas. Por ejemplo, puede unirse una lente sintética para la corrección de la visión a la membrana de Bowman de la córnea del ojo de un paciente usando los métodos de la presente invención. Como se describe en el documento EP-A-0656214, puede someterse a reticulación un colágeno modificado químicamente (tal como colágeno succinilado o metilado) que está en forma sustancialmente no fibrilar a pH 7 usando un polímero hidrófilo sintético; seguidamente, se moldea en una forma lenticular deseada y se permite que concluya la reticulación. Seguidamente, la lente de colágeno reticulado resultante puede unirse a la membrana de Bowman de una córnea desepiteliada del ojo de un paciente usando los métodos de la presente invención. Aplicando la mezcla de reacción del colágeno no fibrilar y el polímero sintético a la superficie anterior de la córnea y, seguidamente, poniendo en contacto la superficie anterior de la córnea con la superficie posterior de la lente antes de que haya ocurrido una reticulación sustancial entre el colágeno y el polímero sintético, el polímero sintético también se unirá covalentemente con las moléculas de colágeno tanto del tejido de la córnea como de la lente para anclar firmemente la lente en su lugar. (De un modo alternativo, la mezcla de reacción puede aplicarse primero a la superficie posterior de la lente que, seguidamente, se pone en contacto con la superficie anterior de la córnea).

En un método alternativo para llevar a cabo la adhesión entre dos superficies, que contienen ambas grupos nucleófilos (tales como grupos amino primarios (-NH_{2}) o grupos tiol (-SH)), se aplica un polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado a la primera superficie y, seguidamente, la segunda superficie se pone en contacto con la primera superficie. El polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado se unirá covalentemente a los grupos nucleófilos tanto en la superficie primera como en la segunda, llevándose a cabo la adhesión entre las dos superficies.

El polímero sintético puede estar en solución acuosa, tal como en agua o tampón fosfato salino (PBS, abreviadamente en inglés "phosphate-buffered saline"), o en solución no acuosa, tal como en un aceite biocompatible. La concentración del polímero sintético en la solución está, preferentemente, dentro del intervalo de, aproximadamente, 10 a, aproximadamente, 400 miligramos de polímero sintético por mililitro de solución. Si se usa una solución acuosa, el polímero sintético se mezcla, preferentemente, con el disolvente acuoso justo antes de la aplicación a la superficie que necesita adherirse para impedir la pérdida de adhesión debida a la hidrólisis del polímero sintético.

De un modo alternativo, el polímero sintético multifuncionalmente activado puede usarse en forma seca. Por ejemplo, el polímero sintético seco puede moldearse por compresión en forma de una lámina o membrana fina que, seguidamente, puede esterilizarse usando radiación gamma o, preferentemente, electrónica. La membrana o lámina seca resultante puede cortarse en el tamaño deseado y, seguidamente, aplicarse a una primera superficie para el uso en el método descrito anteriormente para llevar a cabo la adhesión entre dos superficies.

Las composiciones de la invención también pueden usarse para recubrir tejidos para impedir la formación de adhesiones después de la cirugía o la lesión de tejidos u órganos internos. En un método general para recubrir tejidos para impedir la formación de adhesiones después de la cirugía, se mezclan el colágeno y el polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado, seguidamente, se aplica una fina capa de la mezcla de reacción a los tejidos que comprenden, que rodean y/o adyacentes al sitio quirúrgico antes de que haya ocurrido una reticulación sustancial entre el colágeno y el polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado. La aplicación de la mezcla de reacción al sitio del tejido puede ser mediante extrusión, mediante brocha, por pulverización (como se describe anteriormente) o mediante cualquier otro medio conveniente.

Después de la aplicación de la mezcla de reacción en el sitio quirúrgico, se permite que la reticulación continúe in situ antes del cierre de la incisión quirúrgica. Una vez que se haya alcanzado el "equilibrio" de la reticulación (reticulación completa) entre el colágeno y el polímero sintético multifuncionalmente activado, los tejidos puestos en contacto con los tejidos que han sido recubiertos con las composiciones de la invención no se pegarán a los tejidos recubiertos. En este punto, el sitio quirúrgico puede cerrarse usando medios ordinarios (suturas, etc.).

El punto en que se consigue el equilibrio de reticulación se define, en el presente documento, como el punto en el que la composición no se siente más tiempo pegajosa o viscosa al tacto. De un modo general, se prefieren las composiciones que consiguen la reticulación completa en un relativamente corto periodo de tiempo (es decir, 5-15 minutos después de la mezcla del colágeno y polímero sintético) para el uso en la prevención de adhesiones quirúrgicas de forma que el sitio quirúrgico pueda cerrarse relativamente pronto después de la conclusión del procedimiento quirúrgico.

Las composiciones de la presente invención pueden usarse para bloquear o rellenar diversas luces y sopladuras en el cuerpo de un sujeto mamífero. Las composiciones también pueden usarse como biosellantes para sellar fisuras o hendiduras dentro de un tejido o estructura (tal como un vaso) o zonas de unión entre tejidos o estructuras adyacentes para impedir el escape de la sangre u otros fluidos biológicos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se publican para proporcionar a los expertos ordinarios en la técnica una descripción y explicación completas de cómo hacer las realizaciones preferidas de los conjugados, composiciones y dispositivos y no tienen la intención de limitar el alcance de lo que los autores de la invención refieren como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, peso molecular, etc.) pero deberían tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A no ser que se indique de otro modo, las partes son partes respecto al peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o está cerca de la atmosférica.

Ejemplo 1 Preparación de colágeno succinilado reticulado con PEG

Se ajustaron a pH 9 seis (6) litros de colágeno en solución (CIS, abreviadamente en inglés "collagen in solution") (3 mg/ml de colágeno en HCl pH 2) usando NaOH 0,1 M a temperatura ambiente para producir colágeno fibrilar. Se añadieron 1,35 gramos de polvo de anhídrido succínico al colágeno fibrilar y se mantuvo el pH entre 8,5 y 9, dando como resultado la formación de colágeno succinilado. Se ajustó el pH del colágeno succinilado a 7,2 y seguidamente, a 4,2, usando HCl 0,1 M, para precipitar el colágeno succinilado. Seguidamente, el colágeno succinilado se centrifugó y el sobrenadante se descartó. Se ajustó el pH del precipitado a 7,2 usando NaOH 0,1 M. El precipitado de colágenos succinilado se diluyó en agua y la concentración de colágeno de la solución de colágeno succinilado resultante se ajustó a 20 mg/ml.

Se prepararon soluciones en PBS a diferentes concentraciones de SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800) como sigue: 10 mg de SG-PEG en 0,1 ml de PBS, 20 mg de SG-PEG en 0,1 ml de PBS, 50 mg de SG-PEG en 0,1 ml de PBS y 100 mg de SG-PEG en 0,2 ml de PBS. Cada una de las cuatro soluciones de reticulación se mezcló con 0,9 ml del colágeno succinilado 20 mg/ml usando mezclamiento jeringuilla a jeringuilla. Las cuatro composiciones de colágeno succinilado y SG-PEG tuvieron concentraciones finales de SG-PEG de 10, 20, 50 y 91 mg/ml, respectivamente. La concentración final de colágeno en las muestras fue, aproximadamente, 18 mg/ml.

Se observaron visualmente las cuatro formulaciones en busca de signos de reticulación a los 5 minutos y 2 horas después del mezclamiento. Como se muestra en la tabla 1, las formulaciones de colágeno succinilado que contienen 50 y 91 mg/ml de SG-PEG muestran signos de reticulación a los 5 minutos después del mezclamiento. Todas las cuatro formulaciones mostraron una reticulación significativa 2 horas después del mezclamiento, formándose geles ópticamente claros.

TABLA 1 Reticulación con PEG de colágeno succinilado

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Las temperaturas de fusión de las formulaciones de colágeno succinilado que contienen 10, 20, 50 y 91 mg/ml de SG-PEG (muestras B, C y D, respectivamente) se midieron usando calorimetría por exploración diferencial (DSC, abreviadamente en inglés "differential scanning calorimetry") y se compararon con la del colágeno succinilado sin reticular (muestra A). La DSC es una medida del grado de reticulación que se usa normalmente para evaluar la estabilidad del gel.

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Los resultados de la DSC se muestran en la figura 1. Las temperaturas de fusión de las formulaciones reticuladas (B, C y D) fueron significativamente mayores que la del colágeno succinilado sin reticular (A).

Ejemplo 2 Preparación de colágeno metilado reticulado con PEG

Se liofilizaron novena (90) mililitros de colágeno Zyderm® II sin lidocaína (Collagen Corporation, Palo Alto, CA), ajustados a una concentración de colágeno de 20 mg/ml, para formar colágeno liofilizado. Seguidamente, el colágeno liofilizado se cortó en pequeñas piezas.

Se añadieron a metanol 8,3 mililitros de ácido clorhídrico concentrado y 30 gramos de sulfato sódico para producir metanol ácido anhidro. Seguidamente, el sulfato sódico se eliminó mediante filtración del metanol ácido anhidro. Subsecuentemente, se mezcló, aproximadamente, 1 litro del metanol ácido anhidro con el colágeno liofilizado cortado.

Se formó el colágeno metilado después de la incubación a temperatura ambiente durante 7 días. Se evaporó el exceso de metanol. Subsecuentemente, la sustancia resultante se liofilizó, se dializó y la concentración de colágeno se ajustó a 20 mg/ml mediante la adición de Na_{2}HPO_{4} 0,02 M/NaCl 0,13 M, pH 7,3.

Se prepararon soluciones en PBS a diferentes concentraciones de SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800) como sigue: 3 mg de SG-PEG en 0,15 ml de PBS, 9 mg de SG-PEG en 0,15 ml de PBS, 15 mg de SG-PEG en 0,15 ml de PBS, 30 mg de SG-PEG en 0,15 ml de PBS, 45 mg de SG-PEG en 0,15 ml de PBS, 75 mg de SG-PEG en 0,15 ml de PBS, 111 mg de SG-PEG en 0,2 ml de PBS y 165 mg de SG-PEG en 0,2 ml de PBS. Cada una de las soluciones de reticulación se mezcló con 1,35 ml del colágeno metilado 20 mg/ml usando mezclamiento jeringuilla a jeringuilla. Las composiciones de colágeno metilado y SG-PEG tuvieron concentraciones finales de SG-PEG de 2, 6, 10, 20, 30, 50, 72 y 106 mg/ml, respectivamente. La concentración final de colágeno en las muestras fue, aproximadamente, 18 mg/ml.

Las formulaciones resultantes se evaluaron cualitativamente en elasticidad y resistencia del gel. Como se muestra en la tabla 2, las formulaciones que contienen 30 y 50 mg/ml de SG-PEG mostraron signos de reticulación inmediatamente después del mezclamiento. Las composiciones que contienen 2, 6, 10 y 20 mg/ml de SG-PEG requirieron, aproximadamente, 5 a 10 minutos, para reticular. Las composiciones que contienen 72 y 106 mg/ml de SG-PEG requirieron más de 10 minutos para que se formara el gel, formándose geles débiles e inelásticos. Las composiciones que contienen entre 2 y 20 mg/ml de SG-PEG dieron como resultado geles más resistentes y más elásticos. La composición que contiene 30 mg/ml de SG-PEG formó un gel con una resistencia buena pero con baja elasticidad, que podría ser útil en las aplicaciones en las que la elasticidad no es una característica deseada. Las composiciones de colágeno metilado que contienen más de 30 mg/ml de SG-PEG mostraron una elasticidad y resistencia del gel pobres. Todos los geles fueron ópticamente claros.

Las temperaturas de fusión de las formulaciones de colágeno metilado que contienen 2, 10, 30 y 72 mg/ml de SG-PEG (muestras E, F, G y H, respectivamente) se midieron usando calorimetría por exploración diferencial (DSC) y se compararon con la del colágeno metilado sin reticular. Los resultados de la DSC para las muestras sin reticular y reticuladas se muestran en las figuras 2 y 3, respectivamente. Los perfiles de la curva de fusión indican que las formulaciones reticuladas contienen una población heterogénea de moléculas, la mayoría de las cuales se funde a una temperatura mayor que el colágeno sin reticular.

Como se muestra en la tabla 2, las temperaturas de fusión de las formulaciones reticuladas fueron significativamente mayores que la del colágeno metilado sin reticular.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2 Reticulación con PEG de colágeno metilado 20 mg/ml

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Ejemplo 3 Administración in vitro y unión a córnea bovina de una lente polimerizable in situ

Se preparó colágeno metilado que tiene una concentración de colágeno de 30 mg/ml como se describe en el ejemplo 2. Se eliminó la membrana epitelial de la córnea de un ojo bovino extirpado usando una espátula roma de metal. Después de la desepitelización, se lavó la córnea con PBS y se secó a lo largo y ancho usando una esponja.

Se preparó una solución de 10 mg de SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800) en 0,1 ml de PBS. La solución de reticulación se mezcló con 0,9 ml del colágeno metilado 30 mg/ml usando mezclamiento jeringuilla a jeringuilla. Inmediatamente después del mezclamiento, se expulsaron, aproximadamente, 0,2 ml de la sustancia del colágeno metilado y el SG-PEG a partir de la abertura de una jeringuilla de 1,0 centímetros cúbicos y se echaron sobre la superficie de la córnea bobina desepiteliada.

La sustancia de colágeno metilado y SG-PEG se moldeó en el lugar de la córnea usando un molde de polimetilmetacrilato (PMMA) o polisulfona. La reticulación y la formación del gel de la mezcla colágeno-polímero sucedió en, aproximadamente, tres minutos, formándose una lente in situ sobre la córnea bobina.

Después de la formación del gel, se separó el molde de la sustancia de la mezcla colágeno-polímero. La superficie de la lente forma de in situ se irrigó con PBS. La lente estaba asegurada y no se movió por la irrigación. El cepillado suave de la lente con una espátula indicó que estaba unida, favorablemente, a la córnea. Se pudo eliminar la lente mediante "pelado" con una espátula.

Se realizó el examen histológico (a 100 x aumentos) de la córnea bobina antes y después de la eliminación de la lente de colágeno metilado y SG-PEG. El examen histológico antes de la eliminación de la lente mostró una interfaz íntima entre la lente y la córnea. Después de la eliminación de la lente, la superficie de la córnea no mostró daños o aberraciones obvios.

El experimento anterior se repitió usando una sustancia preparada a partir de colágeno succinilado, a un nivel de succinilación del 36% y a una concentración de colágeno de 30 mg/ml. Se disolvieron veinte (20) miligramos de SG-PEG difuncionalmente activado en 0,1 ml de PBS. Subsecuentemente, la solución de reticulación se mezcló con 0,9 mg del colágeno succinilado 30 mg/ml usando mezclamiento jeringuilla a jeringuilla y, seguidamente, se administró a una córnea bobina desepiteliada. La formación de gel sucedió en, aproximadamente, 10 minutos después de la administración de la sustancia de la mezcla colágeno-polímero a la córnea. La comparación cualitativa reveló que la sustancia de colágeno metilado y SG-PEG tiene una mejor unión a la córnea que la sustancia de colágeno succinilado y SG-PEG.

Ejemplo 4 Uso del colágeno metilado reticulado con PEG como bioadhesivo

Se prepararon las siguientes formulaciones usando colágeno metilado (a diversas concentraciones de colágeno) y diversas concentraciones de SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800). Las formulaciones se valoraron cualitativamente en su adhesión a sitios hemorrágicos de heridas en un conejo previamente sacrificado.

Formulación A

Se mezclaron novecientos (900) microlitros (\mul) de colágeno metilado (preparado como se describe en el ejemplo 1), que tienen una concentración de colágeno de 33 mg/ml, con, aproximadamente, 13,5 mg de SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800) en 150 \mul de PBS (tampón fosfato salino) (relación molar del SG-PEG respecto al colágeno: 40:1). Esta sustancia se echó sobre un sitio hemorrágico de una herida en el hígado de un conejo previamente sacrificado y se permitió que se formara el gel durante 1 minuto. Seguidamente, se colocó la piel encima del gel y se mantuvo en posición durante 1 minuto. Se eliminó la piel y se examinó el estado del gel. El gel de colágeno metilado y SG-PEG se adhirió muy bien al hígado pero no tan bien a la piel.

Formulación B

Se mezclaron novecientos (900) microlitros (\mul) de colágeno metilado, que tienen una concentración de colágeno de 33 mg/ml, con, aproximadamente, 27 mg de SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800) en 150 \mul de PBS (relación molar del SG-PEG respecto al colágeno: 80:1). Esta sustancia se echó sobre un sitio hemorrágico de una herida en el músculo de un conejo previamente sacrificado y se permitió que se formara el gel durante 1 minuto. Seguidamente, se colocó la piel encima del gel y se mantuvo en posición durante 1 minuto. Se eliminó la piel y se examinó el estado del gel. El gel de colágeno metilado y SG-PEG se adhirió muy bien al sitio de la herida pero no tan bien a la piel.

Formulación C

Se mezclaron 4,5 mililitros (ml) de colágeno metilado, que tienen una concentración de colágeno de 64 mg/ml, con, aproximadamente, 325 mg de SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800) en 0,5 ml de PBS (relación molar del SG-PEG respecto al colágeno: 100:1). Esta sustancia se echó sobre un sitio hemorrágico de una herida de un conejo previamente sacrificado y se permitió que se formara el gel durante 1 minuto. Seguidamente, se colocó la piel encima del gel y se mantuvo en posición durante 1 minuto. Se eliminó la piel y se examinó el estado del gel. El gel de colágeno metilado y SG-PEG se adhirió muy bien al sitio de la herida pero no tan bien a la piel.

Formulación D

Se mezclaron 1,8 mililitros (ml) de colágeno metilado, que tienen una concentración de colágeno de 35 mg/ml, con 71,4 mg de SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800) en 250 \mul de PBS (relación molar del SG-PEG respecto al colágeno: 100:1). Esta sustancia se mezcló usando mezclamiento jeringuilla a jeringuilla mediante 30 pasos de la sustancia entre las jeringuillas y, seguidamente, se echó sobre un sitio hemorrágico de una herida de un conejo previamente sacrificado. Una membrana de colágeno y SG-PEG (diámetro aproximado: 4,5 cm), que contenía una relación molar de SG-PEG respecto al colágeno de 2:1, se colocó inmediatamente sobre la sustancia de SG-PEG y colágeno extruída y se permitió que se formara el gel durante 1 minuto. Seguidamente, se colocó la piel encima de la membrana y se mantuvo en posición durante 1 minuto. Se eliminó la piel y se examinó el estado del gel. El gel de colágeno metilado y SG-PEG se adhirió muy bien al sitio de la herida y a la membrana.

Formulación E

Se mezclaron 1,8 mililitros (ml) de colágeno metilado, que tienen una concentración de colágeno de 35 mg/ml, con 71,4 mg de SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800) en 250 \mul de PBS (relación molar del SG-PEG respecto al colágeno: 100:1). Esta sustancia se mezcló usando mezclamiento jeringuilla a jeringuilla mediante 30 pasos de la sustancia entre las jeringuillas y, seguidamente, se echó sobre un sitio hemorrágico de una herida de un conejo previamente sacrificado, permitiéndose que se formara el gel durante 1 minuto. Seguidamente, se colocó la piel encima del gel y se mantuvo en posición durante 1 minuto. Se eliminó la piel y se examinó el estado del gel. El gel de colágeno metilado y SG-PEG se adhirió muy bien al sitio de la herida pero no tan bien a la piel.

Ejemplo 5 Formulaciones bioadhesivas que comprenden mezclas de colágeno metilado y colágeno fibrilar reticulado con PEG

Se realizaron los siguientes experimentos para valorar la adhesión a ojos bovinos (obtenidos de Ferara Meats, Santa Clara, CA) del colágeno fibrilar reticulado con PEG. Los experimentos se realizaron en menos de 24 horas después de la recolección de los ojos a partir de los animales sacrificados. Los ojos se lavaron y empaparon en PBS.

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Tres ojos se desepiteliaron, se lavaron en PBS y, seguidamente, se secaron. Se evaluaron tres formulaciones como sigue:

Se mezcló colágeno fibrilar (concentración de colágeno: 68 mg/ml) con SG-PEG difuncionalmente activado (peso molecular: 3800) en una relación molar del SG-PEG respecto al colágeno de 20:1 e, inmediatamente después, se aplicó a un ojo desepiteliado.

Se mezcló colágeno fibrilar (concentración de colágeno: 68 mg/ml) con SG-PEG difuncionalmente activado en una relación molar del SG-PEG respecto al colágeno de 20:1, la formulación se centrifugó para eliminar las burbujas de aire y, seguidamente, se aplicó a un ojo desepiteliado, aproximadamente, 2 minutos después del mezclamiento.

Se mezcló colágeno metilado (concentración de colágeno: 37,2 mg/ml) con SG-PEG difuncionalmente activado en una relación molar del SG-PEG respecto al colágeno de 20:1 e, inmediatamente después, se aplicó a un ojo desepiteliado. Se mezcló colágeno fibrilar (concentración de colágeno: 68 mg/ml) con SG-PEG difuncionalmente activado en una relación molar del SG-PEG respecto al colágeno de 20:1 e, inmediatamente después, se aplicó encima de la formulación de colágeno metilado y SG-PEG.

Después de 2 horas a temperatura ambiente, se valoró cualitativamente la unión de las formulaciones de colágeno y SG-PEG a los ojos. Se encontró que las composiciones que comprenden colágeno fibrilar y SG-PEG no se unían a los ojos desepiteliados. Se encontró que la composición que comprende colágeno metilado y SG-PEG se adhería muy bien al ojo desepiteliado.

Las formulaciones que se indican en la tabla 3, más adelante, se prepararon mediante mezclamiento del colágeno fibrilar (concentración de colágeno: 37,2 mg/ml) con colágeno metilado (concentración de colágeno: 37,2 mg/ml) y, seguidamente, mediante reticulación usando SG-PEG (peso molecular: 3800) difuncionalmente activado 0,4% (peso/volumen).

TABLA 3 Formulaciones bioadhesivas que comprenden mezclas de colágeno metilado y colágeno fibrilar reticulado usando SG-PEG difuncionalmente activado

Colágeno fibrilar (g)	Colágeno metilado (g)	% de colágeno fibrilar (p/p)
0,72	0,18	80
0,63	0,27	70
0,54	0,36	60
0,45	0,45	50
0,36	0,54	40
0,27	0,63	30

Cada una de las seis formulaciones se aplicó a un ojo bovino desepiteliado. Todas las formulaciones se adhirieron bien a los ojos desepiteliados; sin embargo, se encontró que la resistencia de la unión aumentaba con el aumento del contenido en colágeno metilado (es decir, con el descenso del contenido en colágeno fibrilar) de la formulación.

Ejemplo 6 Adhesión in vivo de diversas formulaciones a base de colágeno

Se abrió la vejiga de un cerdo previamente sacrificado y se inyectaron, en la pared interna de la vejiga, 0,2 cm^{3} de cada una de las diversas formulaciones a base de colágeno, como se indica en la tabla 4 más adelante, desde una jeringuilla de 1 cm^{3} y a través de una aguja de 0,416 mm. Seguidamente, la vejiga del cerdo se recubrió con una toalla empapada (para mantener la humedad del tejido) y se incubó a 37ºC durante, aproximadamente, una (1) hora.

El tejido que recubría la superficie superior de los implantes se extirpó para poner al descubierto los implantes. La unión de cada uno de los implantes al tejido subyacente se valoró cualitativamente como se indica en la tabla 4, más adelante.

TABLA 4 Unión de diversas formulaciones a base de colágeno a la pared de la vejiga del cerdo

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Todas las formulaciones reticuladas con PEG mostraron unión al tejido, aunque las composiciones reticuladas con PEG que comprenden colágeno fibrilar mostraron una unión más fuerte que la formulación de colágeno (metilado) no fibrilar reticulado con PEG, lo que indica que las relaciones del DSE-PEG respecto al colágeno metilado usadas en este experimento no fueron óptimas.

Ejemplo 7 Preparación de composiciones bioadhesivas a base de colágeno

Se sometió a autoclave un (1) mililitro de glicerol (obtenido de Sigma, St. Louis, MO) para esterilizarlo. Se unió una jeringuilla de 3 cm^{3} que contenía 1 ml de colágeno Zyderm® II (concentración proteínica de colágeno: 65 mg/ml; obtenido de Collagen Corporation, Palo Alto, CA) a una jeringuilla que contenía glicerol por medio de una llave de paso de tres vías. Seguidamente, se mezclaron el glicerol y el colágeno mediante, aproximadamente, 100 pasos usando mezclamiento jeringuilla a jeringuilla.

Se pesó un (1) gramo de sacarosa (obtenida de Sigma, St. Louis, MO) en un recipiente para pesar. Se añadió un mililitro de colágeno Zyderm II a la sacarosa en el recipiente para pesar. Se mezclaron la sacarosa y el colágeno hasta que el colágeno se volvió claro. Se llenó una jeringuilla de 3 cm^{3} con la mezcla de colágeno-sacarosa.

Seguidamente, se mezclaron las mezclas de glicerol-colágeno y sacarosa-colágeno con diversas cantidades de SG-PEG difuncionalmente activado seco y estéril (DSG-PEG; peso molecular: 3800), contenido en una jeringuilla de 3 cm^{3}, usando mezclamiento jeringuilla a jeringuilla. Cuando la formulación de colágeno y el DSG-PEG habían sido adecuadamente mezclados, la composición resultante pudo echarse sobre una superficie, y, seguidamente, se puso en contacto con una segunda superficie para llevar a cabo la adhesión entre las dos superficies.

Ejemplo 8 Caracterización de las composiciones bioadhesivas a base de colágeno

Se prepararon las formulaciones enumeradas en la tabla 5 de acuerdo con los métodos descritos en los ejemplos anteriores y se evaluaron cualitativamente en sus características de adhesión (es decir, pegajosidad) y forma (es decir, características de manejo). Las formulaciones se valoraron sobre una escala de 0 a 3, indicando, una puntuación de 3, que la formulación fue muy pegajosa o tuvo una muy buena forma y, una puntuación de 0, que la formulación tuvo una pegajosidad o forma pobres.

TABLA 5 Caracterización de las formulaciones bioadhesivas a base de colágeno

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Todas las formulaciones de sacarosa/colágeno/DSG-PEG y glicerol/colágeno/DSG-PEG mostraron unas características de adhesión y unas propiedades de manejo excelentes. Las formulaciones de colágeno metilado/DSG-PEG no mostraron unas características de adhesión y manejo tan buenas, indicando que las relaciones del DSG-PEG respecto al colágeno metilado usadas en este experimento no fueron óptimas.

Ejemplo 9 Evaluación in vivo de las soluciones de SE-PEG difuncionalmente activado como bioadhesivos en córneas de conejo desepiteliadas

Se prepararon lentes preformadas de acuerdo con el siguiente procedimiento: se mezcló colágeno metilado (concentración de colágeno: 53 mg/ml) con 40 mg de SG-PEG difuncionalmente activado (DSG-PEG; peso molecular: 3800; obtenido de Shearwater Polymers, Huntsville, AL) y se conformó en forma de una película curva que tenía un espesor de, aproximadamente, 250 \mum. Se cortaron de la película lentes circulares que tenían un diámetro de 7-8 mm. Las lentes se colocaron en soluciones que comprendían 80 mg de DSG-PEG en 2 ml de PBS o 2 ml de glutaraldehído 0,2% y se permitió que se incubaran toda una noche.

Se desepiteliaron las córneas de diversos machos de conejos blancos de Nueva Zelanda usando un cuchillo tipo "gill". Se aplicó una solución que comprende 40 mg de SE-PEG difuncionalmente activado (DSE-PEG; peso molecular: 3800; obtenido de Shearwater Polymers, Huntsville, AL) en 200 \mul de PBS a la porción cóncava de las lentes de colágeno preformadas preparadas como se describe anteriormente. En 2 minutos, se aspiró el exceso de solución DSE-PEG usando una pipeta. Seguidamente, se aplicaron inmediatamente las lentes de colágeno preformadas a la superficie de las córneas desepiteliadas.

Se encontró que las lentes preformadas se adherían bien al tejido de la córnea desepiteliada con el "adhesivo" DSE-PEG. Las lentes pudieron quitarse fácilmente mediante manipulación suave con un cuchillo tipo "gill".

Ejemplo 10 Evaluación in vivo de las soluciones de SE-PEG difuncionalmente activado como bioadhesivos en córneas de conejo desepiteliadas

Se desepiteliaron las córneas de diversos machos de conejos blancos de Nueva Zelanda usando un cuchillo tipo "gill". Se aplicaron soluciones que comprenden 40, 53 ó 66 mg de SE-PEG difuncionalmente activado (DSE-PEG; peso molecular: 3800; obtenido de Shearwater Polymers, Huntsville, AL) en 200 \mul de PBS a la porción cóncava de las córneas de conejo desepiteliadas. En 2 minutos, se aspiró el exceso de solución DSE-PEG usando una pipeta. Seguidamente, las lentes de colágeno preformadas (obtenidas de Imedex, Lyon, Francia) se aplicaron inmediatamente a la superficie de las córneas desepiteliadas.

Después de 7 días, se observó la lente que se había adherido a la córnea de los conejos usando la solución DSE-PEG de 53 mg/ml. Se encontró que la porción central de esta lente en particular tenía una buena adhesión a la córnea; sin embargo, los bordes de la lente no se habían adherido firmemente a la córnea. Se observó que la porción central de la córnea era ligeramente opaca. Se cree que pudo haber deposición proteínica entre la lente y la córnea y que el DSE-PEG se unió covalentemente a la proteína depositada y la mantuvo en posición sobre la superficie de la córnea, dando como resultado la opacidad observada de la porción central del ojo.

Ejemplo 11 Evaluación in vivo de una solución de SE-PEG difuncionalmente activado como bioadhesivo en una córnea de primate desepiteliada

La córnea de un macaco (Macaca cynomologous) se desepitelió usando un cuchillo tipo "gill". Se aplicó una solución que comprende 40 mg de SE-PEG difuncionalmente activado (DSE-PEG; peso molecular: 3800; obtenido de Shearwater Polymers, Huntsville, AL) en PBS a la porción cóncava de una lente de colágeno preformada (obtenida de Imedex, Lyon, Francia). En 2 minutos, se aspiró el exceso de solución DSE-PEG usando una pipeta. Seguidamente, la lente de colágeno preformada se aplicó inmediatamente a la superficie del tejido de la córnea desepiteliada.

Después de 3 semanas, se encontró que la lente estaba firmemente unida a la córnea del mono. No se observó opacidad de la córnea. Se observó una mínima inflamación durante la primera semana después del procedimiento. Sin embargo, la inflamación disminuyó antes de la segunda semana.

Claims

1. Una composición bioadhesiva que comprende colágeno fibrilar, un agente de desensamblaje de fibras y un polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado, en la que el agente de desensamblaje de fibras está presente en una cantidad suficiente para hacer al colágeno sustancialmente no fibrilar a pH 7 y en la que el colágeno y el polímero sintético se unen covalentemente para formar un conjugado de colágeno y polímero sintético.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el agente de desensamblaje de fibras se selecciona del grupo constituido por: un alcohol, un aminoácido, una sal inorgánica y un carbohidrato biocompatibles.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que el agente de desensamblaje de fibras es un alcohol biocompatible seleccionado del grupo constituido por glicerol y propilenglicol.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el polímero hidrófilo sintético multifuncionalmente activado es un polietilenglicol multifuncionalmente activado.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que el polietilenglicol multifuncionalmente activado se selecciona del grupo constituido por SG-PEG difuncionalmente activado y SE-PEG difuncionalmente activado.

6. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para el uso en un método para llevar a cabo la unión no quirúrgica de una primera superficie a una segunda superficie, que comprende las etapas de:

: mezclar el colágeno fibrilar y el agente de desensamblaje de fibras en una cantidad suficiente para hacer al colágeno sustancialmente no fibrilar a pH 7;

: mezclar el colágeno resultante y el polímero sintético para iniciar la reticulación entre ellos;

: aplicar la mezcla de colágeno y polímero sintético a una primera superficie antes de que haya ocurrido una reticulación sustancial entre el colágeno y el polímero sintético; y

: poner en contacto la primera superficie con la segunda superficie para llevar a cabo la adhesión entre ellas.

7. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para el uso en un método para impedir la formación de adhesiones tras la cirugía, que comprende las etapas de:

: mezclar el colágeno fibrilar con un agente de desensamblaje de fibras en una cantidad suficiente para hacer al colágeno sustancialmente no fibrilar a pH 7;

: mezclar el colágeno resultante y un polímero hidrófilo multifuncionalmente activado para iniciar la reticulación entre ellos;

: aplicar la mezcla de colágeno y polímero sintético al tejido que comprende, que rodea o adyacente a un sitio quirúrgico antes de que haya ocurrido una reticulación sustancial entre el colágeno y el polímero sintético;

: permitir que el colágeno y el polímero sintético continúen la reticulación in situ hasta que se consiga el equilibrio de reticulación; y

: llevar a cabo el cierre del sitio quirúrgico.

8. La composición de la reivindicación 6 ó 7, en la que al menos una de las superficies primera y segunda es una superficie tisular originaria.

9. La composición de la reivindicación 8, en la que una de las superficies primera y segunda es una superficie tisular originaria y la otra de las superficies primera y segunda es una superficie tisular no originaria o una superficie de un implante sintético.

10. La composición de la reivindicación 8, en la que tanto la superficie primera como la segunda son superficies tisulares originarias.

11. La composición de cualquier reivindicación precedente, en la que el colágeno fibrilar está presente como parte de una mezcla de colágeno no fibrilar y colágeno fibrilar.

12. La composición de cualquier reivindicación precedente, en la que el colágeno fibrilar comprende una mezcla de colágeno fibrilar reticulado y particulado y colágeno fibrilar sin reticular.

13. La composición de la reivindicación 12, en la que el colágeno fibrilar reticulado y particulado comprende colágeno reticulado con glutaraldehído.

14. La composición de la reivindicación 12, en la que el colágeno fibrilar reticulado y particulado comprende del, aproximadamente, 25% al, aproximadamente, 95% y el colágeno fibrilar sin reticular comprende del, aproximadamente, 5% al, aproximadamente, 75% en peso de la composición.

15. La composición de cualquier reivindicación precedente, en la que el colágeno fibrilar es colágeno desnaturalizado.