KR20020068291A - Ｌ-글루탐산의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에는 L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물을, 미생물의 생육에 적합한 제1 pH에서 배양하는 단계 및 미생물에 의한 L-글루탐산 생산에 적합하고 상기 제1 pH 보다는 낮은 제2 pH에서 당해 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 발효에 의한 L-글루탐산의 생산 방법이 기재되어 있다.
Description
본 발명은 발효에 의해 L-글루탐산을 생산하는 방법에 관한 것이다. L-글루탐산은 조미료 등의 원료로서 널리 사용되고 있다.
L-글루탐산은 주로, 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 미크로박테리움(Microbacterium) 속에 속하는 소위 L-글루탐산 생산 코리네형 세균 또는 이의 돌연변이주를 이용하여 발효시킴으로써 생산되어 왔다[참조: Amion Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, pp.195-215, 1986]. 기타 세균성 균주를 사용하여 발효시킴으로써 L-글루탐산을 생산하는 방법으로서, 바실루스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 페니실리움(Penicillium) 속 등에 속하는 미생물을 사용하는 방법(미국 특허 제3,220,929호); 슈도모나스(Pseudomonas), 아르트로박터(Arthrobacter), 세라티아(Serratia), 칸디다(Candida) 속 등에 속하는 미생물을 사용하는 방법(미국 특허 제3,563,857호); 바실루스, 슈도모나스, 세라티아, 아에로박터 아에로게네스(Aerobacter aerogenes)[현재 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes)로 지칭됨] 속 등에 속하는 미생물을 사용하는 방법(일본 특허공보 제32-9393호); 에스케리키아 콜라이의 돌연변이주를 사용하는 방법(일본 특허공개공보 제5-244970호) 등이 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 발명자들은 클렙시엘라(Klebsiella), 에르위니아(Erwinia) 또는 판토에아(Pantoea) 속에 속하는 미생물을 사용함으로써 L-글루탐산을 생산하는 방법을 제안하였다(일본 특허공개공보 제2000-106869호).
또한, 재조합 DNA 기술 사용을 통하여 L-글루탐산 생합성 효소의 활성을 증진시킴으로써 L-글루탐산 생산능을 개선시키는 각종 기술이 보고되어 있다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 유도된 시트레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 도입하는 것이 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속 세균에서의 L-글루탐산 생산능 증강에 유효하다는 사실이 보고되어 있다[참조: 일본 특허공보 제7-121228호]. 또한, 일본 특허공개공보 제61-268185호에는 코리네박테리움 속 세균으로부터 유도된 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 보유하는 세포가 기재되어 있다. 또한, 일본 특허공개공보 제63-214189호에는 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자, 이소시트레이트 데하이드로게나제 유전자, 아코니테이트 하이드라타제 유전자 및 시트레이트 신타제 유전자를 증폭시킴으로써 L-글루탐산 생산능을 증대시키는 기술이 기재되어 있다.
전술된 미생물 육종 또는 개선된 생산 방법에 의해 L-글루탐산 생산성을 상당히 증대시키긴 하였지만, 미래의 수요 증가를 추가로 충족시키기 위해서는, L-글루탐산을 저비용으로 보다 효율적으로 생산하는 방법을 개발할 필요가 있다.
배양물 내에 축적된 L-아미노산이 결정화됨에 따라 발효가 수행되는 방법이 공지되어 있다[일본 특허공개공보 제62-288호]. 이러한 방법에서는, 배양물 중에 축적된 L-아미노산을 침전시킴으로써 이러한 배양물 중의 L-아미노산 농도를 특정의 수준 이하로 유지시킨다. 구체적으로는, 배양물의 온도와 pH를 조정하거나 계면활성제를 배지에 가함으로써 발효 동안에 L-트립토판, L-티로신 또는 L-루이신을 침전시킨다.
L-아미노산 침전을 수반하여 발생되는 발효를 수행하는 방법이 상기한 바와 같이 공지되어 있긴 하지만, 이러한 방법에 적합한 아미노산은 수용해도가 비교적 낮은 것이며, 이 방법을 L-글루탐산과 같이 고도로 수용성인 아미노산에 적용한 예는 전혀 공지되어 있지 않다. 또한, 상기 배지는 L-글루탐산을 침전시키기 위해 낮은 pH여야 한다. 그러나, 상기한 바와 같은 L-글루탐산 생산 세균은 산성 조건하에서 생육할 수 없으므로, L-글루탐산 발효는 중성 조건하에서 수행한다[참조: 미국 특허 제3,220,929호 및 제3,032,474호; K.C. Chao & J.W. Foster, J. Bacteriol., 77, pp.715-725(1959)]. 따라서, 침전을 수반하는 발효에 의해 L-글루탐산을 생산하는 방법은 공지되어 있지 않다. 더우기, 대부분의 호산성 세균의생육은 아세트산, 락트산 및 석신산 등의 유기산에 의해 억제되는 것으로 공지되어 있다[참조: Yasuro Oshima Ed., "Extreme Environment Microorganism Handbook", p.231, Science Forum; R.M. Borichewski, J. Bacteriol., 93, pp.597-599(1967) etc.]. 따라서, 다수의 유기체가 산성 조건하에서 유기산이기도 한 L-글루탐산에 감수성인 것으로 간주되며, 산성 조건하에서 L-글루탐산 생산능을 나타내는 미생물에 관하여 조사하였다는 보고가 전혀 없었다.
상기한 상황하에서, 본 발명의 목적은 미생물의 생육이 L-글루탐산의 생산과 양립할 수 있게 함으로써 생산 효율을 추가로 개선시킨, 발효에 의한 L-글루탐산의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 L-글루탐산 생산 세균에 의한 L-글루탐산 생산에 적합한 pH가 상기 세균의 생육에 적합한 pH와 상이하고, 이러한 차이점에 근거하여, L-글루탐산을 효율적으로 생산할 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 이로써, 본 발명자들은 본 발명을 완성하였다.
도 1은 pTWVEK101에서 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans)로부터 유도된 DNA 단편의 제한 효소 지도이다.
도 2는 엔테로박터 아글로메란스로부터 유도된sucA유전자와 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 유도된sucA유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 아미노산 서열을 비교 도시한 것이다(상단: 엔테로박터 아글로메란스, 칼럼: 에스케리키아 콜라이; 다음에도 동일하게 적용될 것이다).
도 3은 엔테로박터 아글로메란스로부터 유도된sucB유전자와 에스케리키아 콜라이로부터 유도된sucB유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 아미노산 서열을 비교 도시한 것이다.
도 4는 엔테로박터 아글로메란스로부터 유도된sucC유전자와 에스케리키아 콜라이로부터 유도된sucC유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 아미노산 서열을 비교 도시한 것이다.
도 5는 엔테로박터 아글로메란스로부터 유도된sdhB유전자와 에스케리키아 콜라이로부터 유도된sdhB유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 아미노산 서열을 비교 도시한 것이다.
도 6은gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자를 함유하는 플라스미드 pMWCPG의 작제를 도시한 것이다.
도 7은 광범위한 숙주 범위의 플라스미드 RSF1010의 복제 기점과 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하는 플라스미드 RSF-Tet의 작제를 도시한 것이다.
도 8은 광범위한 숙주 범위의 플라스미드 RSF1010의 복제 기점, 테트라사이클린 내성 유전자,gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자를 함유하는 플라스미드 RSFCPG의 작제를 도시한 것이다.
도 9는gltA유전자를 함유하는 플라스미드 pSTVCB의 작제를 도시한 것이다.
본 발명은 다음 사항을 제공한다:
(1) L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물을, 미생물의 생육에 적합한 제1 pH에서 배양하는 단계 및 미생물에 의한 L-글루탐산 생산에 적합하고 상기 제1 pH 보다는 낮은 제2 pH에서 당해 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 발효에 의한 L-글루탐산의 생산 방법.
(2) 제2 pH가 3 내지 5인, (1)에 따르는 방법.
(3) 제1 pH에서의 배양이, 알칼리화 물질을 상기 배지에 가함으로써 이러한 배지의 pH를 제1 pH로 유지시키면서 수행되는, (1) 또는 (2)에 따르는 방법.
(4) 제1 pH에서의 배양 후, 알칼리화 물질의 첨가량을 조절함으로써 배지의 pH를 저하시키는 단계를 포함하는, (3)에 따르는 방법.
(5) 제1 pH에서의 배양이, 세포의 양이 예정량에 도달할 때까지 지속되는, (1) 내지 (4) 중의 어느 하나에 따르는 방법.
(6) 상기 미생물이 엔테로박터 속에 속하는, (1) 내지 (5) 중의 어느 하나에 따르는 방법.
(7) 미생물이 엔테로박터 아글로메란스인, (6)에 따르는 방법.
(8) 제1 pH가, 상기 미생물의 슈크로즈-동화 능력을 저하시키지 않는 pH인, (6) 또는 (7)에 따르는 방법.
(9) 제1 pH에서의 배양이, 배지 중의 슈크로즈가 소모될 때까지 지속되는, (8)에 따르는 방법.
(10) 미생물이, 특정의 pH에서, 포화 농도의 L-글루탐산과 탄소원을 함유하는 액체 배지에서 상기 탄소원을 대사시킬 수 있고, 상기 pH의 액체 배지에서 L-글루탐산의 포화 농도를 초과하는 양의 L-글루탐산을 축적시키는 능력을 갖는, (1) 내지 (9) 중의 어느 하나에 따르는 방법.
(11) 특정의 pH가 5.0 이하인, (10)에 따르는 방법.
(12) L-글루탐산 생산에 적합한 pH가, 상기 미생물에 의해 생산된 L-글루탐산이 배지 중에 침전되는 pH이고, 이러한 pH의 배지에서 배양하는 동안, L-글루탐산 침전을 수반하면서 L-글루탐산이 생성 및 축적되는, (10) 또는 (11)에 따르는 방법.
본 발명의 방법에 따라서, 효율적으로 L-글루탐산을 생산할 수 있다. 또한, 당원으로서 광범위한 원료를 사용할 수 있다.
본 발명은 다음에 보다 상세히 설명될 것이다.
본 발명에 따르는 생산 방법은 L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물(이하, "L-글루탐산 생산 세균"으로 칭하기도 함)을, 이러한 미생물의 생육에 적합한 제1 pH에서 배양하는 단계 및 미생물에 의한 L-글루탐산 생산에 적합하고 상기 제1 pH 보다는 낮은 제2 pH에서 당해 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 발효에 의한 L-글루탐산의 생산 방법이다.
L-글루탐산 생산 세균에 의한 L-글루탐산 생산에 적합한 배양용 pH는 종종 이러한 L-글루탐산 생산 세균의 생육에 적합한 배양용 pH와 상이하고, 생산에 적합한 pH가 종종 더 낮다. 이러한 특성을 근거로 하여, 중성 pH에서 세포를 생육시킨 다음, pH를 산성 pH로 변화시켜 L-글루탐산을 생성시킴으로써, 보다 높은 생산성을 수득할 수 있게 되었다.
제1 pH와 제2 pH는 사용될 L-글루탐산 생산 세균의 특성들을 충족시키도록 선택된다. 이들 pH 값은 당해 분야의 숙련인에 의해 용이하게 측정될 수 있다.예를 들면, 미생물의 생육에 적합한 pH는, 각종 pH 값으로 조정된 배지에서 L-글루탐산 생산 세균을 배양하고, 흡광도 등에 근거하여 세포의 양을 측정한 다음, 이러한 세포의 양을 비교함으로써 결정할 수 있다. L-글루탐산의 생산에 적합한 pH는, 각종 pH 값의 배지에서 L-글루탐산 생산 세균을 배양하고, 각종 pH 값의 배지에 축적된 L-글루탐산의 양을 측정한 다음, 이러한 세포의 양을 비교함으로써 결정할 수 있다.
제1 pH는 미생물의 생육에 적합하기만 한다면 특별히 제한되지 않지만, 통상 5 내지 8이다.
제2 pH는 바람직하게는 생성된 L-글루탐산이 침전되는 pH이며, 이러한 pH는 통상 3 내지 5이다. 발효에 의해 L-글루탐산을 생산하는데 있어서, 배지 중에 고농도로 축적된 L-글루탐산에 의한 생산성 저하가 생산성 향상을 방해하는 것으로 간주된다. 예를 들면, 미생물 세포는 L-글루탐산에 대한 방출 시스템과 흡수 시스템을 가지고 있으므로, 일단 배지 내로 방출된 L-글루탐산이 다시 세포 내로 흡수될 경우에는, 생산 효율이 감소될 뿐만 아니라 L-글루탐산을 생합성시키기 위한 반응이 억제된다. 생성된 L-글루탐산이 침전되는 pH에서 배양을 수행함으로써, 고농도의 L-글루탐산 축적으로 인한 생산성 저하를 미연에 방지할 수 있다.
제1 pH와 제2 pH는 본 발명의 이점이 획득될 수 있는 한은 배양 동안에 엄밀하게 일정하지 않을 수 있으며, 이들은 변동될 수도 있다.
L-글루탐산 생산 세균은 심지어 이의 생육에 적합한 pH에서도 L-글루탐산을 생산하므로, pH는 이와 같이 생산된 L-글루탐산에 의해 떨어진다. 따라서, 제1 pH에서의 배양은, 알칼리화 물질을 배지에 가함으로써 배지의 pH를 제1 pH로 유지시키면서 수행하는 것이 바람직하다.
알칼리화 물질은 이것이 L-글루탐산 생산 세균의 생육이나 L-글루탐산 생산에 불리한 영향을 미치지 않는 한은 특별히 제한되지 않지만, 암모니아 기체가 바람직하다.
배지의 pH는 산성 물질을 가함으로써 제1 pH에서 제2 pH로 낮출 수 있다. 그러나, pH는 상기한 바와 같은 배양 동안에 L-글루탐산 생산 세균에 의해 생산된 L-글루탐산에 의해 떨어진다. 따라서, 알칼리화 물질의 첨가량을 조절함으로써 배지의 pH를 제1 pH에서 제2 pH 수준으로 낮추는 것이 바람직한데, 이는 산성 물질의 첨가가 생략될 수 있기 때문이다.
제1 pH에서의 배양은, L-글루탐산 생산 세균이, 제2 pH에서의 배양에서 만족할 만한 양의 L-글루탐산을 생산하기에 충분할 정도로 생육될 때까지 지속시킬 수 있다. 생육 지표로서, 세포의 양을 언급할 수 있다. 따라서, 제1 pH에서의 배양은 세포의 양이 예정량에 도달할 때까지 지속시키는 것이 바람직하다. 이러한 예정량은 당해 분야의 숙련인에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 양은 세포의 양이 각종 양에 도달할 때까지 L-글루탐산 생산 세균을 제1 pH에서 배양하고, 제2 pH에서의 배양에서 생산된 L-글루탐산의 양을 측정한 다음, 이들을 비교함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면, 제2 pH에서 더 많은 양의 L-글루탐산을 생성시키기 위해, 더 많은 세포를 제1 pH에서 생성시킬 수 있다. 따라서, 이러한 관점에서, 세포의 예정량을 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 해당 pH는 건조세포 중량을 기준하여 5g/L 이상의 양에서 제2 pH로 이동시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 생산 방법에서 사용되는 L-글루탐산 생산 세균은 특정의 배지에서 배양될 때 이러한 배지에 상당량의 L-글루탐산을 축적시키는 미생물이다. 이의 예에는 엔테로박터 속에 속하는 미생물이 포함된다. 엔테로박터 아글로메란스가 바람직하다.
엔테로박터 속에 속하는 미생물에 관해 언급하면, 이의 슈크로즈 동화 능력은 pH 4.5에서 급격하게 저하된다. 따라서, 이러한 경우, 제1 pH는 바람직하게는 상기 미생물의 슈크로즈-동화 능력을 저하시키지 않는 pH이다. 이러한 pH는 통상 5 내지 8이다. 광범위한 원료를 L-글루탐산 생산용 당원으로서 사용할 수 있기 때문에, 제1 pH를 상기 미생물의 슈크로즈-동화 능력에 이로운 pH가 되도록 한다. 예를 들면, 다량의 슈크로즈를 함유하는 당밀을 상기 원료로서 사용할 수 있다. 이러한 경우, 제1 pH에서의 배양은 배지 중의 슈크로즈가 소모될 때까지 지속시키는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 생산 방법에서 사용되는 L-글루탐산 생산 세균은 바람직하게는 특정의 pH에서 포화 농도의 L-글루탐산과 탄소원을 함유하는 액체 배지에서 상기 탄소원을 대사시킬 수 있고, 전술된 pH의 액체 배지에서 L-글루탐산의 포화 농도를 초과하는 양의 L-글루탐산을 축적시키는 능력을 갖는 미생물이다(이하, 이는 "L-글루탐산 축적 미생물"로 칭하기도 한다). 전술된 특정의 pH는 바람직하게는 L-글루탐산이 배지 중에 침전되는 pH이고, 이러한 pH는 통상 5.0 이하이다.
"포화 농도"는 액체 배지를 L-글루탐산으로 포화시킨 경우에 이러한 액체 배지에 용해된 L-글루탐산의 농도를 의미한다.
L-글루탐산 축적 미생물을 사용하는 경우에, L-글루탐산 생산에 적합한 pH는 바람직하게는 L-글루탐산이 배지에 침전되는 pH이다. 이러한 pH에서 배양을 수행함으로써, L-글루탐산의 침전을 수반하면서 상기 배지에서 L-글루탐산이 생성 및 축적된다.
L-글루탐산 축적 미생물은 다음과 같이 수득할 수 있다. 미생물 함유 샘플을, 특정의 pH에서 포화 농도의 L-글루탐산과 탄소원을 함유하는 액체 배지에 접종하고, 상기 탄소원을 대사시키는 균주를 선별한다. 특정의 pH는 특별히 제한되지는 않지만, 이는 통상적으로 약 5.0 이하, 바람직하게는 약 4.5 이하, 추가로 바람직하게는 약 4.3 이하이다. L-글루탐산 축적 미생물은 L-글루탐산의 침전을 수반한 발효에 의해 L-글루탐산을 생산하는데 사용된다. 이러한 pH가 너무 높을 경우에는, 해당 미생물이 침전에 충분한 양의 L-글루탐산을 생산하기가 어려워진다. 따라서, pH는 전술된 범위가 바람직하다.
L-글루탐산을 함유하는 수용액의 pH를 낮춘 경우에는, L-글루탐산의 용해도가 대략 γ-카복실 그룹의 pKa 값(4.25, 25℃) 부근에서 현저히 떨어진다. 이 용해도는 등전점(pH 3.2)에서 가장 낮아지며, 포화 농도에 상응하는 양을 초과하는 L-글루탐산이 침전된다. 배지 조성에 좌우되긴 하지만, L-글루탐산을 약 30℃에서, pH 3.2하에 10 내지 20g/L, pH 4.0하에 30 내지 40g/L 및 pH 4.7하에 50 내지 60g/L의 양으로 용해시킨다. 통상적으로, pH를 3.0 이하로 만들 필요는 없는데, 이는 pH가 특정 값 아래가 되면 L-글루탐산 침전 효과가 이의 상한치에 도달하기때문이다. 그러나, pH는 3.0 이하일 수도 있다.
또한, 미생물이 "탄소원을 대사시킬 수 있는"이란 표현은 상기 미생물이 증식할 수 있거나 또는 이것이 증식할 수 없는 경우일지라도 탄소원을 소비할 수 있다는 것을 의미하는데, 즉 이것이 당 또는 유기산과 같은 탄소원을 이화시킨다는 것을 지시해준다. 구체적으로는, 예를 들어, 미생물을 pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 보다 바람직하게는 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 4.0에서, 적당한 온도, 예를 들면, 28℃, 37℃ 또는 50℃하에 2 내지 4일 동안, 포화 농도의 L-글루탐산을 함유하는 액체 배지에서 배양하는 경우에 상기 미생물이 증식된다면, 이러한 미생물은 상기 배지 중의 탄소원을 대사시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 미생물을 pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 보다 바람직하게는 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 4.0에서, 적당한 온도, 예를 들면, 28℃, 37℃ 또는 50℃에서 2 내지 4일 동안, 포화 농도의 L-글루탐산을 함유하는 합성 액체 배지에서 배양하는 경우에, 상기 미생물이 증식되지 않는 경우일지라도 이것이 탄소원을 소비한다면, 이러한 미생물은 상기 배지 중의 탄소원을 대사시킬 수 있는 미생물이다.
탄소원을 대사시킬 수 있는 미생물에는 전술된 액체 배지에서 생육할 수 있는 미생물이 포함된다.
또한, 미생물이 "생육할 수 있다"라는 표현은 상기 미생물이 증식될 수 있거나 또는 이것이 증식될 수 없는 경우일지라도 L-글루탐산을 생산할 수 있다는 것을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들어, 미생물을 pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH4.5 내지 4.0, 보다 바람직하게는 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 4.0에서, 적당한 온도, 예를 들면, 28℃, 37℃ 또는 50℃에서 2 내지 4일 동안, 포화 농도의 L-글루탐산을 함유하는 액체 배지에서 배양하는 경우에 상기 미생물이 증식한다면, 이러한 미생물은 상기 배지에서 생육할 수 있다. 또한, 예를 들면, 미생물을 pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 보다 바람직하게는 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 4.0에서, 적당한 온도, 예를 들면, 28℃, 37℃ 또는 50℃에서 2 내지 4일 동안, 포화 농도의 L-글루탐산을 함유하는 합성 액체 배지에서 배양하는 경우에, 상기 미생물이 증식되지 않는 경우일지라도 이것이 상기 합성 액체 배지 중의 L-글루탐산의 양을 증가시킨다면, 이러한 미생물은 상기 배지에서 생육할 수 있는 미생물이다.
상기한 선별 과정을 동일한 조건하에서 2회 이상 반복하거나, pH 또는 L-글루탐산의 농도를 변화시키면서 2회 이상 반복할 수 있다. 초기 단계에 대한 선별은 포화 농도보다 낮은 농도로 L-글루탐산을 함유하는 배지에서 수행할 수 있으며, 그 후에는, 포화 농도의 L-글루탐산을 함유하는 배지에서 후속 선별을 수행할 수 있다. 또한, 탁월한 증식 속도와 같은 바람직한 특성을 갖는 균주를 선별할 수 있다.
L-글루탐산 축적 미생물은 상기한 특성 이외에도, L-글루탐산의 포화 농도에 상응하는 양을 초과하는 양으로 L-글루탐산을 액체 배지에 축적시키는 능력을 갖는 미생물이다. 전술된 액체 배지의 pH는 바람직하게는 전술된 특성을 갖는 미생물을 스크리닝하기 위해 사용된 배지의 pH와 동일하거나 이에 근접한다. 통상적으로,pH가 낮아짐에 따라 미생물은 고농도의 L-글루탐산에 감수성이 된다. 따라서, L-글루탐산에 대한 내성 측면에서 보면 pH가 낮지 않은 편이 바람직하지만, 이의 침전을 수반한 L-글루탐산의 생산 측면에서 보면 낮은 pH가 바람직하다. 이들 조건을 충족시키기 위해서는, pH가 3 내지 5, 바람직하게는 4 내지 5, 보다 바람직하게는 4 내지 4.7, 추가로 바람직하게는 4 내지 4.5, 특히 바람직하게는 4.0 내지 4.3의 범위일 수 있다.
L-글루탐산 축적 미생물 또는 이에 대한 육종 재료로서는, 예를 들면, 엔테로박터 속, 클렙시엘라 속, 세라티아 속, 판토에아 속, 에르위니아 속, 에스케리키아 속, 코리네박테리움 속, 알리사이클로바실루스(Alicyclobacillus) 속, 바실루스 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 등에 속하는 미생물을 언급할 수 있다. 이들 중에서, 엔테로박터 속에 속하는 미생물이 바람직하다. 이하, 본 발명의 미생물은 주로 엔테로박터 속에 속하는 미생물에 대해 설명될 것이다. 그러나, 당해 미생물은 이러한 엔테로박터 속에 속하는 것으로 제한되지 않으며, 다른 속에 속하는 미생물도 유사하게 사용될 수 있다.
엔테로박토 속에 속하는 미생물로서, 엔테로박터 아글로메란스, 바람직하게는 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주가 구체적으로 언급될 수 있다. 이러한 균주는 낮은 pH에서 L-글루탐산과 탄소원을 함유하는 배지에서 증식할 수 있는 균주로서, 일본 시즈오카켄 이와타시의 토양으로부터 분리하였다.
AJ13355의 생리학적 특성을 아래에 제시한다:
(1) 그람 염색: 음성
(2) 산소에 대한 거동: 임의의 혐기성
(3) 카탈라제: 양성
(4) 옥시다제: 음성
(5) 질산염 환원능: 음성
(6) 보게스-프로스카우어(Voges-Proskauer) 시험: 양성
(7) 메틸 레드 시험: 음성
(8) 우레아제: 음성
(9) 인돌 생성: 양성
(10) 운동성: 운동력 있음
(11) TSI 배지에서의 H2S 생성: 약하게 활성을 나타냄
(12) β-갈락토시다제: 양성
(13) 사카라이드-동화 특성:
아라비노즈: 양성
슈크로즈: 양성
락토즈: 양성
크실로즈: 양성
솔비톨: 양성
이노시톨: 양성
트레할로즈: 양성
말토즈: 양성
글루코즈: 양성
아도니톨: 음성
라피노즈: 양성
살리신: 음성
멜리비오즈: 양성
(14) 글리세로즈-동화 특성: 양성
(15) 유기산-동화 특성:
시트르산: 양성
타르타르산: 음성
글루콘산: 양성
아세트산: 양성
말론산: 음성
(16) 아르기닌 데하이드라타제: 음성
(17) 오르니틴 데카복실라제: 음성
(18) 리신 데카복실라제: 음성
(19) 페닐알라닌 데아미나제: 음성
(20) 색소 형성: 황색
(21) 젤라틴 액화능: 양성
(22) 생육 pH: pH 4에서는 생육 가능, pH 4.5 내지 7에서는 생육 양호함
(23) 생육 온도: 25℃에서는 생육 양호, 30℃에서는 생육 양호, 37℃에서는 생육 양호, 42℃에서는 생육 가능, 45℃에서는 생육 불가능.
이들 세균학적 특성에 근거하여, AJ13355는 엔테로박터 아글로메란스로 판정되었다.
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355는 1998년 2월 19일자로 다음 기탁 기관[통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소: National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry(현명칭, 산업기술 총합 연구소 생명공학공업기술 연구소: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)]에 기탁되었으며, 수탁번호 FERM P-16644를 부여받았다. 이어서, 이를 1999년 1월 11일자로 부다페스트 조약 규칙하에 국제 기탁으로 전환시켰으며, 수탁번호 FERM BP-6614를 부여받았다.
L-글루탐산 축적 미생물은 본래 L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물이거나, 또는 돌연변이 유발 처리, 재조합 DNA 기술 등의 사용을 통하여 육종함으로써 L-글루탐산 생산능이 부여되거나 증강된 미생물일 수 있다.
L-글루탐산 생산능은, 예를 들어, L-글루탐산을 생합성시키는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 증가시킴으로써 부여하거나 증강시킬 수 있다. L-글루탐산 생산능은 또한 L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분지되어 L-글루탐산 이외의 화합물을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하시키거나 제거함으로써 증강시킬 수 있다.
L-글루탐산을 생합성시키는 반응을 촉매하는 효소의 예로서, 글루타메이트 데하이드로게나제(이하, "GDH"로 칭하기도 함), 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 시트레이트 신타제(이하, "CS"로 칭하기도 함), 포스포에놀피루베이트 카복실라제(이하, "PEPC"로서 칭하기도 함), 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오즈포스페이트 이소머라제, 프럭토즈 비스포스페이트 알도라제, 포스포프럭토키나제, 글루코즈 포스페이트 이소머라제 등을 언급할 수 있다. 이들 효소 중에서, CS, PEPC 및 GDH 중의 1종, 2종 또는 3종이 바람직하다. 또한, 3종의 효소, 즉 CS, PEPC 및 GDH 모두의 활성이 L-글루탐산 축적 미생물에서 증강되는 것이 바람직하다. 특히, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)의 CS가 바람직한데, 이는 이것이 α-케토글루타르산, L-글루탐산 및 NADH에 의한 저해를 겪지 않기 때문이다.
CS, PEPC 또는 GDH의 활성을 증강시키기 위해서는, 예를 들어, CS, PEPC 또는 GDH를 암호화하는 유전자를 적당한 플라스미드 상에서 클로닝시키고, 이로써 수득된 플라스미드로 숙주 미생물을 형질전환시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 균주 세포에서 CS, PEPC 또는 GDH를 암호화하는 유전자(이하, 각각 "gltA유전자", "ppc유전자" 및 "gdhA유전자"로 약칭됨)의 복사 수가 증가하여, CS, PEPC 또는 GDH의 활성이 증가한다.
클로닝된gltA,ppc및gdhA유전자를 전술된 출발 모 균주 내로 단독으로도입하거나 임의의 2종 또는 3종의 유전자와 조합하여 도입한다. 2종 또는 3종의 유전자를 도입하는 경우에는, 2종 또는 3종의 유전자를 1종의 플라스미드 상에 클로닝시켜 숙주 내로 도입하거나, 함께 존재할 수 있는 2종 또는 3종의 플라스미드 상에서 개별적으로 클로닝시켜 숙주 내로 도입할 수 있다.
동일한 종류이긴 하지만 상이한 미생물로부터 유도된 효소를 암호화하는 2종 이상의 유전자를 동일한 숙주 내로 도입할 수 있다.
상기한 플라스미드는 이들이, 예를 들어, 엔테로박터 속 등에 속하는 미생물 세포에서 자가 복제할 수 있는 한은 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 예를 들면, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pACYC177, pACYC184 등을 언급할 수 있다. 이들 이외에도, 파아지 DNA의 벡터를 사용할 수도 있다.
형질전환은, 예를 들면, 문헌[참조: D.M. Morrison, Methods in Enzymology, 68, 326(1979)]의 방법; DNA에 대한 수용균 세포의 투과성을, 상기 세포를 염화칼슘으로 처리함으로써 증가시키는 방법[참조: Mandel M. and Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)]; 전기천공[참조: Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992] 등에 의해 수행될 수 있다.
CS, PEPC 또는 GDH의 활성은 또한,gltA유전자,ppc유전자 또는gdhA유전자의 다중 복사체가 숙주가 될 전술된 출발 모 균주의 염색체 DNA 상에 존재하도록 함으로써 증대시킬 수 있다.gltA유전자,ppc유전자 또는gdhA유전자의 다중복사체를 엔테로박터 속 등에 속하는 미생물의 염색체 DNA 상에 도입하기 위해서는, 염색체 DNA 상에 존재하는 다중 복사체의 특정의 서열, 예를 들면, 전이 인자의 말단에 존재하는 역방향 반복 서열 및 반복 DNA를 사용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 유전자의 다중 복사체는,gltA유전자,ppc유전자 또는gdhA유전자를 함유하는 트랜스포손의 전이를 활용함으로써 염색체 DNA 상으로 도입할 수 있다. 그 결과, 형질전환된 균주 세포 내에서의gltA유전자,ppc유전자 또는gdhA유전자의 복사 수가 증가하게 되며, 이로써 CS, PEPC 또는 GDH의 활성이 증대된다.
복사 수를 증가시켜야 하는gltA유전자,ppc유전자 또는gdhA유전자의 공급원으로 사용된 유기체로서, CS, PEPC 또는 GDH의 활성을 갖는 한은 어떠한 유기체도 사용할 수 있다. 특히, 원핵생물인 세균, 예를 들면, 엔테로박터 속, 클렙시엘라 속, 에르위니아 속, 판토에아 속, 세라티아 속, 에스케리키아 속, 코리네박테리움 속, 브레비박테리움 속 또는 바실루스 속에 속하는 세균이 바람직하다. 구체적인 예로서, 에스케리키아 콜라이, 브레비박테리움 락토페르멘툼 등을 언급할 수 있다.gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자는 상기한 미생물의 염색체 DNA로부터 수득할 수 있다.
gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자는, 전술된 미생물의 염색체 DNA로부터 이의 영양요구성을 보충해주는 DNA 단편을 분리시키기 위해 CS, PEPC 또는 GDH의 활성이 결손된 돌연변이주를 사용함으로써 수득할 수 있다. 또한, 이들 에스케리키아 및 코리네박테리움 세균 유전자의 뉴클레오티드 서열이 이미 밝혀졌기 때문에[참조: Biochemistry, 22, pp.5243-5249, (1983); J. Biochem., 95, pp.909-916, (1984); Gene, 27, pp.193-199, (1984); Microbiology, 140, pp.1817-1828, (1994); Mol. Gen. Genet., 218, pp.330-339, (1989); Molecular Microbiology, 6, pp.317-326, (1992)], 이들은 주형으로서 각각의 뉴클레오티드 서열과 염색체 DNA를 기준으로 하여 합성된 프라이머를 활용한 PCR에 의해 수득될 수도 있다.
CS, PEPC 또는 GDH의 활성은 또한gltA유전자,ppc유전자 또는gdhA유전자의 전술된 증폭 이외에도, 이들 유전자의 발현을 증진시킴으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 발현은gltA유전자,ppc유전자 또는gdhA유전자에 대한 프라이머를 보다 강력한 또 다른 프로모터로 대체시킴으로써 증진시킬 수 있다. 예를 들면,lac프로모터,trp프로모터,trc프로모터,tac프로모터, 람다 파아지의 PR프로모터 및 PL프로모터 등이 강력한 프로모터로서 공지되어 있다. 이의 프로모터를 대체시킨gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자를 플라스미드 상에서 클로닝시키고 이를 숙주 미생물 내로 도입하거나, 반복 DNA, 역방향 반복 서열, 트랜스포손 등을 사용함으로써 숙주 미생물의 염색체 DNA 상으로 도입한다.
CS, PEPC 또는 GDH의 활성은 또한, 염색체 상의gltA유전자,ppc유전자 또는gdhA유전자의 프로모터를 보다 강력한 또 다른 프로모터로 대체하거나[참조: WO 87/03006 및 일본 특허공개공보 제61-268183호], 또는 각 유전자의 암호화 서열의 상류에 강력한 프로모터를 삽입함으로써[참조: Gene, 29, pp.231-241 (1984)] 증가시킬 수 있다. 구체적으로는, 보다 강력한 프로모터로 대체시킨gltA유전자,ppc유전자 또는gdhA유전자 또는 이의 일부를 함유하는 DNA와 염색체 상의 상응하는 유전자 간에 상동 재조합을 수행할 수 있다.
L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분지되어 L-글루탐산 이외의 화합물을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소의 예로는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(이하, "αKGDH"로 칭하기도 함), 이소시트레이트 리아제, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제, 글루타메이트 데카복실라제, 1-피롤린 데하이드로게나제 등이 있다. 이들 효소 중에서 αKGDH가 바람직하다.
엔테로박터 속 등에 속하는 미생물 내의 전술된 효소의 활성을 저하 또는 제거시키기 위해서는, 이러한 효소의 세포내 활성을 저하 또는 제거시키는 돌연변이를, 통상의 돌연변이 유발 처리 방법이나 유전공학 방법에 의해 전술된 효소의 유전자 내로 도입할 수 있다.
돌연변이 유발 처리 방법의 예에는, 예를 들면, X선이나 자외선 조사를 이용하는 방법, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 돌연변이 유발제로 처리하는 방법 등이 포함된다. 돌연변이가 도입되는 유전자의 부위는 효소 단백질을 암호화하는 암호화 영역 또는 발현을 조절하기 위한 영역, 예를 들면, 프로모터 내일 수 있다.
유전공학 방법의 예에는, 예를 들면, 유전자 재조합, 형질도입, 세포 융합 등을 이용하는 방법이 포함된다. 예를 들면, 약물 내성 유전자를 클로닝된 표적 유전자 내로 삽입하여 이의 기능을 상실한 유전자(결실형 유전자)를 제조한다. 이어서, 이러한 결실형 유전자를 숙주 유기체의 세포 내로 도입하고, 염색체 상의 표적 유전자를, 상동 재조합을 이용하여 전술된 결실형 유전자로 대체시킨다(유전자 파괴).
표적 효소의 세포내 활성 저하 또는 결손과 이러한 활성 저하도는 후보 균주로부터 수득된 세포 추출물 또는 이의 정제된 분획의 효소 활성을 측정한 다음, 이를 야생형 균주의 것과 비교함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면, αKGDH 활성은 문헌[참조: Reed L.J. and Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, pp.55-61 (1969)]의 방법에 의해 측정할 수 있다.
표적 효소에 따라서, 돌연변이주의 표현형에 근거하여 표적 돌연변이주를 선별할 수 있다. 예를 들면, αKGDH 활성이 제거되거나 저하된 돌연변이주는, 호기성 배양 조건하에서 유일한 탄소원으로서 아세트산 또는 L-글루탐산을 함유하는 최소 배지 또는 글루코즈를 함유하는 최소 배지에서 증식할 수 없거나 현저하게 저하된 증식 속도를 나타낸다. 그러나, 글루코즈를 함유하는 최소 배지에 석신산 또는 리신, 메티오닌 및 디아미노피멜산을 가함으로써 심지어 동일한 조건하에서도 정상적인 증식이 가능해진다. 이들 현상을 지표로 활용하여, αKGDH 활성이 저하되거나 결손된 돌연변이주를 선별할 수 있다.
상동 재조합을 이용함으로써 브레비박테리움 락토페르멘툼의 αKGDH 유전자-결손주를 제조하는 방법이 WO 95/34672에 상세히 기재되어 있다. 유사한 방법이 다른 미생물에도 적용될 수 있다.
또한, 유전자 클로닝, 및 DNA의 분해 및 연결, 형질전환 등의 기술이 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)] 등에 상세히 기재되어 있다.
상기한 바와 같이 수득된, αKGDH 활성이 결손되거나 αKGDH 활성이 저하된 돌연변이주의 구체적인 예로서는, 엔테로박터 아글로메란스 AJ13356을 언급할 수 있다. 엔테로박터 아글로메란스 AJ13356은 1998년 2월 19일자로 다음 기탁 기관[통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소: National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry(현명칭, 산업기술 총합 연구소 생명공학공업기술 연구소: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)]에 기탁되었으며, 수탁번호 FERM P-16645를 부여받았다. 이어서, 이를 1999년 1월 11일자로 부다페스트 조약 규칙하에 국제 기탁으로 전환시켰으며, 수탁번호 FERM BP-6615를 부여받았다. 엔테로박터 아글로메란스 AJ13356은 αKGDH-E1 아단위 유전자(sucA)의 파괴 결과로서 αKGDH 활성이 결손되어 있다.
본 발명에서 사용되는 미생물의 한 예인 엔테로박터 아글로메란스를 사카라이드를 함유하는 배지에서 배양하는 경우, 점액질이 세포외적으로 분비되어, 종종 조작 효율이 낮아진다. 따라서, 이러한 점액질 분비 특성을 갖는 엔테로박터 아글로메란스를 사용한 경우에는, 야생형 균주와 비교해서 점액질을 덜 분비하는 돌연변이주를 사용하는 것이 바람직하다. 돌연변이 유발 처리 방법의 예에는, 예를 들면, X선이나 자외선 조사를 이용하는 방법, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘등의 돌연변이 유발제로 처리하는 방법 등이 포함된다. 점액질 분비가 감소된 돌연변이주는, 사카라이드를 함유하는 배지, 예를 들면, 5g/L의 글루코즈를 함유하는 LB 배지 플레이트에 돌연변이 유발된 세균성 세포를 접종하고, 상기 플레이트를 약 45°로 기울이면서 이들을 배양한 다음, 점액질이 흘러내리지 않는 콜로니를 선별함으로써 선별할 수 있다.
본 발명에서는, L-글루탐산 생산능의 부여 또는 증강 과정과, 상기한 점액질 분비가 덜하도록 돌연변이시키는 것과 같은 기타 바람직한 특성을 부여하는 과정은 임의 순서로 수행할 수 있다.
L-글루탐산을 침전시키는 pH 조건으로 조정시킨 액체 배지에서 L-글루탐산 축적 미생물을 배양함으로써, 상기 배지 내에서의 침전을 수반하면서 L-글루탐산을 생성 및 축적시킬 수 있다.
본원에 언급된 "미생물에 의해 생산된 L-글루탐산을 침전시키는 조건"은 L-글루탐산 축적 미생물이 L-글루탐산을 생성 및 축적시킬 때 L-글루탐산을 침전시키는 조건을 의미한다. 이러한 조건의 pH가 해당 미생물의 L-글루탐산 생산능에 따라서 변동할 수 있지만, 이러한 미생물이 엔테로박터 세균인 경우에는 통상 3 내지 5이다.
제1 pH에서의 배양 및 제2 pH에서의 배양에서 사용되는 배지로서는, 탄소원, 질소원, 무기 염 및 유기 미량 영양소, 예를 들면, 아미노산 및 비타민을 필요로 따라 함유하는 통상의 영양 배지를 사용할 수 있는데, 이는 예정된 조건을 충족시키도록 pH를 조정해야 한다. 합성 배지 또는 천연 배지를 사용할 수 있다. 상기배지에서 사용되는 탄소원과 질소원은 이들이 배양될 균주에 의해 사용될 수 있는 한은 어떠한 것일 수도 있다.
탄소원으로서는, 사카라이드, 예를 들면, 글루코즈, 글리세롤, 프럭토즈, 슈크로즈, 말토즈, 만노즈, 갈락토즈, 전분 가수분해물 및 당밀을 사용한다. 또한, 아세트산 및 시트르산 등의 유기산을 단독으로 사용하거나 또 다른 탄소원과 병용할 수 있다.
질소원으로서는, 암모니아, 암모늄 염, 예를 들면, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 및 아세트산암모늄, 질산염 등을 사용한다.
유기 미량 영양소로서는, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 이들 물질을 함유하는 것, 예를 들면, 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물 및 대두 단백질 분해 산물을 사용한다. 대사화 또는 생육에 아미노산 등을 요구하는 영양요구성 돌연변이주를 사용하는 경우에는, 요구되는 영양소가 보충되어야만 한다.
무기 염으로서, 인산 염, 마그네슘 염, 칼슘 염, 철 염, 망간 염 등을 사용한다.
배양 방법에 관해서는, 20 내지 42℃에서의 호기성 배양이 통상 수행되는데, 단 pH는 예정된 값으로 조절하여야 한다.
배양을 완료한 후, 배양물에 침전된 L-글루탐산을 원심분리, 여과 등에 의해 수집할 수 있다. 배지 중에 용해된 L-글루탐산은 공지된 방법으로 수집할 수도 있다. 예를 들면, L-글루탐산은 배양액을 농축시켜 결정화시킴으로써 분리시키거나 또는 이온 교환 크로마토그래피 등에 의해 분리시킬 수 있다. 배지 중에 용해된L-글루탐산을 결정화한 다음, 배양액에 침전된 L-글루탐산을 상기와 같이 결정화된 L-글루탐산과 함께 수집하는 것도 가능하다.
포화 농도를 초과하는 L-글루탐산이 침전되는 양태에서는, 배지 중에 용해된 L-글루탐산의 농도를 일정한 수준으로 유지시킨다. 따라서, 미생물에 대한 고농도의 L-글루탐산의 영향이 저하될 수 있다. 따라서, 추가로 개선된 L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물을 육종하는 것이 가능해진다. 또한, L-글루탐산은 결정으로서 침전되기 때문에, L-글루탐산의 축적에 의한 배양액의 산성화가 억제되므로, 배양물의 pH를 유지하는데 사용된 알칼리의 양을 상당히 감소시킬 수 있다.
실시예
이하, 본 발명은 다음 실시예를 참조로 하여 보다 구체적으로 설명될 것이다. 본 실시예에서는, 달리 언급되지 않는 한 아미노산은 L-아미노산이다.
참조 실시예 1
<1> 산성 환경하에서 L-글루탐산 내성을 갖는 미생물의 스크리닝
산성 환경하에서 L-글루탐산 내성을 갖는 미생물의 스크리닝을 다음과 같이 수행한다. 토양, 과실, 식물체, 하천수 등을 포함한 자연계로부터 수득된 약 500점 샘플 각 1g을 5ml의 멸균수에 현탁시키고, 이의 200㎕를, HCl을 이용하여 pH 4로 조정시킨 고체 배지 20ml 상에 피복시킨다. 상기 배지의 조성은 다음과 같다: 3g/L의 글루코즈, 1g/L의 황산암모늄, 0.2g/L의 황산마그네슘 헵타하이드레이트,0.5g/L의 황산이수소칼륨, 0.2g/L의 염화나트륨, 0.1g/L의 염화칼슘 디하이드레이트, 0.01g/L의 황산제1철 헵타하이드레이트, 0.01g/L의 황산망간 테트라하이드레이트, 0.72mg/L의 황산아연 디하이드레이트, 0.64mg/L의 황산구리 펜타하이드레이트, 0.72mg/L의 염화코발트 헥사하이드레이트, 0.4mg/L의 붕산, 1.2mg/L의 몰리브덴산나트륨 디하이드레이트, 50㎍/L의 바이오틴, 50㎍/L의 판토텐산칼슘, 50㎍/L의 폴산, 50㎍/L의 이노시톨, 50㎍/L의 니아신, 50㎍/L의 p-아미노벤조산, 50㎍/L의 피리독신 하이드로클로라이드, 50㎍/L의 리보플라빈, 50㎍/L의 티아민 하이드로클로라이드, 50mg/L의 사이클로헥시미드 및 20g/L의 한천.
상기 샘플로 도말된 배지를 28℃, 37℃ 또는 50℃에서 2 내지 4일 동안 항온 배양하고, 378개 균주 형성 콜로니를 수득하였다.
후속적으로, 상기한 바와 같이 수득된 각각의 균주를 포화 농도의 L-글루탐산을 함유하는 액체 배지(HCl를 이용하여 pH 4로 조정됨) 3ml를 함유하는, 길이가 16.5cm이고 직경이 14mm인 시험용 튜브에 접종하고, 28℃, 37℃ 또는 50℃에서 24시간 내지 3일 동안 진탕시키면서 배양한다. 이어서, 생육한 균주를 선별한다. 전술된 배지의 조성은 다음과 같다: 40g/L의 글루코즈, 20g/L의 황산암모늄, 0.5g/L의 황산마그네슘 헵타하이드레이트, 2g/L의 황산이수소칼륨, 0.5g/L의 염화나트륨, 0.25g/L의 염화칼슘 디하이드레이트, 0.02g/L의 황산제1철 헵타하이드레이트, 0.02g/L의 황산망간 테트라하이드레이트, 0.72mg/L의 황산아연 디하이드레이트, 0.64mg/L의 황산구리 펜타하이드레이트, 0.72mg/L의 염화코발트 헥사하이드레이트, 0.4mg/L의 붕산, 1.2mg/L의 몰리브덴산나트륨 디하이드레이트 및 2g/L의 효모 추출물.
따라서, 산성 환경하에서 L-글루탐산 내성을 나타내는 미생물 78개 균주를 성공적으로 수득하였다.
<2> 산성 환경하에서 L-글루탐산 내성을 갖는 미생물로부터 생육 속도가 우수한 균주의 선별
상기한 바와 같이 수득된, 산성 환경하에서 L-글루탐산 내성을 갖는 각종 미생물을, 20g/L의 글루탐산과 2g/L의 글루코즈를 M9 배지[참조: Sambrook, J., Fritsh, E.F. and Maniatis, T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989]에 가함으로써 수득된 배지(HCl를 이용하여 pH 4.0으로 조정됨) 3ml를 함유하는, 길이가 16.5cm이고 직경이 14mm인 시험용 튜브 내로 각각 접종하고, 시간에 따른 배지의 혼탁도를 측정하여 바람직한 생육 속도를 나타내는 균주를 선별하였다. 그 결과, 바람직한 생육을 나타내는 균주로서, AJ13355 균주를 일본 시즈오카켄 이와타시의 토양으로부터 수득하였다. 이러한 균주는 상기한 이의 세균학적 특성을 근거로 하여 엔테로박터 아글로메란스로 판정되었다.
<3> 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주로부터 점액질을 덜 분비하는 균주의 획득
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주는 이것을 사카라이드를 함유하는 배지에서 배양하는 경우에 세포외적으로 점액질을 분비하기 때문에, 조작 효율이 좋지 못하다. 따라서, 자외선 조사 방법에 의해, 점액질을 덜 분비하는 균주를 수득하였다[참조: Miller, J.H. et al., "A Short Course in Bacterial Genetics: Laboratory Manual", p.150, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.].
60W 자외선 램프로부터 60cm 떨어진 위치에서 2분 동안 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주에게 자외선을 조사하고, LB 배지에서 밤새 배양하여 돌연변이를 고정시킨다. 이와 같이 돌연변이 유발된 균주를 희석시키고, 5g/L의 글루코즈와 20g/L의 한천을 함유하는 LB 배지에 접종하여 플레이트당 약 100개의 콜로니가 출현되도록 하고, 상기 플레이트를 45°로 기울이면서 30℃에서 밤새 배양한 다음, 점액질이 흘러내리지 않는 20개 콜로니를 선별하였다.
5g/L의 글루코즈와 20g/L의 한천을 함유하는 LB 배지에서 5회 계대배양한 후에도 복귀 돌연변이체가 전혀 출현되지 않았다는 조건과, LB 배지, 5g/L의 글루코즈를 함유하는 LB 배지 및 M9 배지[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989]에 20g/L의 L-글루탐산과 2g/L의 글루코즈가 보충되고, HCl를 사용하여 pH 4.5로 조정된 배지에서 모 균주와 등가의 생육이 관찰되어야 한다는 조건을 충족시키는 균주로서, 상기 선별된 균주들로부터 SC17 균주를 선별하였다.
<4> 엔테로박터 아글로메란스 SC17 균주로부터 글루탐산 생산 세균의 작제
(1) 엔테로박터 아글로메란스 SC17 균주로부터의 αKGDH 결손주의 제조
αKGDH가 결손되어 있고, 증강된 L-글루탐산 생합성 시스템을 갖는 균주를 엔테로박터 아글로메란스 SC17 균주로부터 제조하였다.
(i) 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주의 αKGDH 유전자(이하, "sucAB"로 칭함)의 클로닝
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주의 염색체 DNA로부터 에스케리키아 콜라이의 αKGDH-E1 아단위 유전자(이하, "sucA"로 칭함)-결손주의 아세트산-비동화 특성을 보충한 DNA 단편을 선별함으로써, 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주의sucAB유전자를 클로닝하였다.
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주의 염색체 DNA는 에스케리키아 콜라이로부터 염색체 DNA를 추출하는데 통상적으로 이용된 방법에 의해 분리시켰다[참조: Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifukan, 1992]. 벡터로서 사용된 pTWV228(앰피실린에 대한 내성)은 다음 제조회사[Takara Shuzo Co., Ltd.]의 시판품이다.
EcoT221로 분해시킨 AJ13355 균주의 염색체 DNA와PstI로 분해시킨 pTWV228을 T4 리가제를 사용하여 연결하고, 이를 사용하여sucA-결손 에스케리키아 콜라이 JRG465 균주를 형질전환시켰다[참조: Herbert, J. et al., Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)]. 상기 수득된 형질전환체 균주로부터, 아세테이트 최소 배지에서 생육하는 균주를 선별하고, 이로부터 플라스미드를 추출하여 이를 pTWVEK101로명명하였다. pTWVEK101을 보유하는 에스케리키아 콜라이 JRG465 균주는 아세트산-비동화 특성 이외에도 석신산 또는 L-리신과 L-메티오닌에 대한 영양요구성을 회복하였다. 이는 pTWVEK101가 엔테로박터 아글로메란스의sucA유전자를 함유하였다는 것을 제시해준다.
도 1은 pTWVEK101 내에서의 엔테로박터 아글로메란스로부터 유도된 DNA 단편의 제한 효소 지도를 도시한 것이다. 도 1에서 사선으로 표시된 부분의 뉴클레오티드 서열에서는, 2개의 완전한 길이의 ORF로 간주되는 뉴클레오티드 서열과, ORF의 부분 서열로 간주되는 2개의 뉴클레오티드 서열이 발견되었다. 이들에 대한 상동성 조사 결과, 이의 뉴클레오티드 서열이 결정된 부분은, 석시네이트 데하이드로게나제 철-황 단백질 유전자(sdhB)의 3' 말단 부분 서열, 완전한 길이의sucA및 αKGDH-E2 아단위 유전자(sucB유전자), 및 석시닐 CoA 신테타제 β 아단위 유전자(sucC유전자)의 5' 말단 부분 서열을 함유하였다는 사실이 밝혀졌다. 이들 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 아미노산 서열을 에스케리키아 콜라이로부터 유도된 것과 비교한 결과[참조: Eur. J. Biochem., 141, pp.351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, pp.361-374 (1984); Biochemistry, 24, pp.6245-6252 (1985)]가 도 2 내지 5에 도시되어 있다. 따라서, 이들 아미노산 서열은 서로 매우 높은 상동성을 나타내었다. 또한,sdhB-sucA-sucB-sucC의 클러스터가 에스케리키아 콜라이에서와 같이 엔테로박터 아글로메란스의 염색체 상에서 구성되었다는 사실이 밝혀졌다[참조: Eur. J. Biochem., 141, pp.351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, pp.361-374 (1984); Biochemistry, 24, pp.6245-6252 (1985)].
(ii) 엔테로박터 아글로메란스 SC17 균주로부터 유도된 αKGDH-결손주의 획득
상기한 바와 같이 수득된 엔테로박터 아글로메란스의sucAB유전자를 사용함으로써 상동 재조합을 수행하여 엔테로박터 아글로메란스의 αKGDH-결손주를 수득하였다.
pTWVEK101을SphI로 분해시켜sucA를 함유하는 단편을 절단시키고, 이 단편을 클레노우 단편[공급처: Takara Shuzo Co., Ltd.]으로 평활 말단화시킨 다음, T4 DNA 리가제[공급처: Takara Shuzo Co., Ltd.]를 사용하여,EcoRI로 분해시키고 클레노우 단편으로 평활 말단화시킨 pBR322에 연결시킨다. 이로써 수득된 플라스미드를, 상기 효소를 사용함으로써sucA의 대략 중앙에 위치한 제한 효소BglII 제한 부위에서 분해시키고, 클레노우 단편으로 평활 말단화시킨 다음, T4 DNA 리가제를 사용하여 다시 연결시킨다.sucA유전자는 기능적이지 않게 되었는데, 이는 상기 과정을 통하여 새롭게 작제된 플라스미드의sucA내로 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이가 도입되었기 때문인 것으로 간주되었다.
상기한 바와 같이 작제된 플라스미드를 제한 효소ApaLI로 분해시키고, 아가로즈 겔 전기영동시켜, 프레임쉬프트 돌연변이가 도입된sucA를 함유하는 DNA 단편과 pBR322로부터 유도된 테트라사이클린 내성 유전자를 회수하였다. 이와 같이 회수된 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용함으로써 다시 연결시켜, αKGDH 유전자를 파괴시키기 위한 플라스미드를 작제하였다.
상기한 바와 같이 수득된 αKGDH 유전자를 파괴시키기 위한 플라스미드를 사용하여, 전기천공에 의해 엔테로박터 아글로메란스 SC17 균주를 형질전환시키고[참조: Miller, J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics: Handbook", p.279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992], 마커로서 테트라사이클린 내성을 이용함으로써, 염색체 상의sucA를 상동 재조합에 의해 상기 플라스미드의 돌연변이체 유형으로 대체시킨 균주를 수득하였다. 이와 같이 수득된 균주를 SC17sucA 균주로 명명하였다.
상기 SC17sucA 균주에 αKGDH 활성이 결손되었다는 것을 확인하기 위해, LB 배지에서 대수 증식기까지 배양된 균주의 세포를 사용함으로써, 효소 활성을 문헌[참조: Reed, L.J. and Mukherjee, B.B., Methods in Enzymology, 13, pp.55-61, (1969)]의 방법에 의해 측정하였다. 그 결과, 0.073의 αKGDH 활성(△ABS/분/mg 단백질)이 상기 SC17 균주로부터 검출된 반면, SC17sucA 균주로부터는 어떠한 αKGDH 활성도 검출되지 않았으므로,sucA가 의도된 바대로 제거되었다는 사실을 확인하였다.
(2) 엔테로박터 아글로메란스 SC17sucA 균주의 L-글루탐산 생합성 시스템의 증강
후속적으로, 에스케리키아 콜라이로부터 유도된 시트레이트 신타제 유전자, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자 및 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자를 상기 SC17sucA 균주 내로 도입하였다.
(i) 에스케리키아 콜라이로부터 유도된gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자를갖는 플라스미드의 제조
gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자를 갖는 플라스미드를 제조하는 과정은 도 6 및 7를 참조로 하여 설명될 것이다.
에스케리키아 콜라이로부터 유도된gdhA유전자를 갖는 플라스미드 pBRGDH(일본 특허공개공보 제7-203980호)를HindIII 및SphI로 분해시키고, 양 말단을 T4 DNA 폴리머라제 처리함으로써 평활 말단화시킨 다음,gdhA유전자를 갖는 DNA 단편을 정제 및 회수하였다. 별개로, 에스케리키아 콜라이로부터 유도된gltA유전자 및ppc유전자를 갖는 플라스미드 pMWCP(WO 97/08294)를XbaI로 분해시키고, 양 말단을 T4 DNA 폴리머라제를 사용함으로써 평활 말단화시킨다. 이를,gdhA유전자를 갖는 상기 정제된 DNA 단편과 혼합하고, T4 리가제를 사용함으로써 이를 연결시켜 플라스미드 pMWCPG를 수득하였는데, 이는gdhA유전자를 추가로 함유하는 pMWCP에 상하였다(도 6).
이와 동시에, 광범위한 숙주 범위 플라스미드 RSF1010의 복제 기점을 갖는 플라스미드 pVIC40(일본 특허공개공보 제8-047397호)를NotI로 분해시키고, T4 DNA 폴리머라제로 처리한 다음,PstI로 분해시킨다. pBR322를EcoT14I로 분해시키고, T4 DNA 폴리머라제로 처리한 다음,PstI로 분해시킨다. 양 생성물을 혼합하고, T4 리가제를 사용함으로써 연결하여, RSF1010의 복제 기점과 테트라사이클린 내성 유전자를 갖는 플라스미드 RSF-Tet를 수득하였다(도 7).
후속적으로, pMWCPG를EcoRI 및PstI로 분해시키고,gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자를 갖는 DNA 단편을 정제 및 회수하였다. RSF-Tet를EcoRI 및PstI로 유사하게 분해시키고, RSF1010의 복제 기점을 갖는 DNA 단편을 정제 및 회수하였다. 양 생성물을 혼합하고, T4 리가제를 사용하여 연결시켜 플라스미드 RSFCPG를 수득하였는데, 이는gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자를 함유하는 RSF-Tet에 상응하였다(도 8). 에스케리키아 콜라이로부터 유도된gltA유전자-,ppc유전자- 또는gdhA유전자-결손주의 영양요구성 보충과 각 효소 활성 측정 결과를 근거로 하여, 상기 수득된 플라스미드 RSFCPG가gltA유전자,ppc유전자 및gdhA유전자를 발현시켰음을 확인하였다.
(ii) 브레비박테리움 락토페르멘툼으로부터 유도된gltA유전자를 갖는 플라스미드의 제조
브레비박테리움 락토페르멘툼으로부터 유도된gltA유전자를 갖는 플라스미드를 다음과 같이 작제하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰gltA유전자의 뉴클레오티드 서열[참조: Microbiology, 140, pp.1817-1828 (1994)]을 근거로 하여 제조된 프라이머 DNAs를 사용하고, 주형으로서 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA를 사용함으로써 PCR을 수행하여 약 3kb의gltA유전자 단편을 수득하였다. 이러한 단편을,SmaI로 분해시킨 플라스미드 pHSG399[구입처: Takara Shuzo Co., Ltd.] 내로 삽입하여 플라스미드 pHSGCB를 수득한다(도 9). 후속적으로, pHSGCB를HindIII로 분해하고, 이와 같이 절단된 약 3kb의gltA유전자 단편을,HindIII로 분해시킨 플라스미드 pSTV29[구입처: Takara Shuzo Co., Ltd.] 내로 삽입하여 플라스미드 pSTVCB를 수득하였다(도 9). 엔테로박터 아글로메란스AJ13355 균주에서의 효소 활성을 측정함으로써, 상기 수득된 플라스미드 pSTVCB가gltA유전자를 발현시켰음을 확인하였다.
(iii) SC17sucA 균주 내로의 RSFCPG 및 pSTVCB의 도입
엔테로박터 아글로메란스 SC17sucA 균주를 전기천공에 의해 RSFCPG로 형질감염시켜 테트라사이클린 내성을 나타내는 형질전환체 SC17sucA/RSFCPG 균주를 수득하였다. 또한, 이러한 SC17sucA/RSFCPG 균주를 전기천공에 의해 pSTVCB로 형질전환시켜 클로람페니콜 내성을 나타내는 형질전환체 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 균주를 수득하였다.
<5> 낮은 pH 환경하에서 L-글루탐산에 대한 개선된 내성을 나타내는 균주의 획득
낮은 pH 환경하에서 고농도의 L-글루탐산에 대한 개선된 내성을 나타내는 균주(이하, "낮은 pH에서 고농도 Glu-내성을 나타내는 균주"로 칭하기도 함)를 엔테로박터 아글로메란스 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 균주로부터 분리하였다.
이러한 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 균주를 LBG 배지(10g/L의 트립톤, 5g/L의 효모 추출물, 10g/L의 NaCl, 5g/L의 글루코즈)에서 30℃하에 밤새 배양하고, 식염수로 세척한 세포를 적당히 희석시킨 다음, M9-E 배지(4g/L의 글루코즈, 17g/L의 Na2HPO4·12H2O, 3g/L의 KH2PO4, 0.5g/L의 NaCl, 1g/L의 NH4Cl, 10mM의 MgSO4, 10μM의 CaCl2, 50mg/L의 L-리신, 50mg/L의 L-메티오닌, 50mg/L의 DL-디아미노피멜산,25mg/L의 테트라사이클린, 25mg/L의 클로람페니콜, 30g/L의 L-글루탐산; 수성 암모니아를 사용하여 pH 4.5로 조정됨) 플레이트 상에 도말하였다. 32℃에서 2일 동안 배양한 후에 출현된 콜로니를, 낮은 pH에서 고농도 Glu-내성을 나타내는 균주로서 수득하였다.
이와 같이 수득된 균주에 대해, M9-E 액체 배지에서의 생육 수준을 측정하고, 5ml의 L-글루탐산 생산 시험용 배지(40g/L의 글루코즈, 20g/L의 황산암모늄, 0.5g/L의 황산마그네슘 헵타하이드레이트, 2g/L의 황산이수소칼륨, 0.5g/L의 염화나트륨, 0.25g/L의 염화칼슘 디하이드레이트, 0.02g/L의 황산제1철 헵타하이드레이트, 0.02g/L의 황산망간 테트라하이드레이트, 0.72mg/L의 황산아연 디하이드레이트, 0.64mg/L의 황산구리 펜타하이드레이트, 0.72mg/L의 염화코발트 헥사하이드레이트, 0.4mg/L의 붕산, 1.2mg/L의 몰리브덴산나트륨 디하이드레이트, 2g/L의 효모 추출물, 200mg/L의 L-리신 하이드로클로라이드, 200mg/L의 L-메티오닌, 200mg/L의 DL-α,ε-디아미노피멜산, 25mg/L의 테트라사이클린 하이드로클로라이드 및 25mg/L의 클로람페니콜)를 함유하는 50ml 용적의 대형 시험용 튜브에서 L-글루탐산 생산능을 시험하였다. 이의 모 균주인 SC17/RSFCPG+pSTVCB 균주의 것과 동일한 L-글루탐산 생산능과 가장 양호한 생육 수준을 나타낸 균주를 엔테로박터 아글로메란스 AJ13601로 명명하였다. 이러한 AJ13601 균주는 1999년 8월 18일자로 다음 기탁 기관[통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소: National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry(현명칭, 산업기술 총합 연구소 생명공학공업기술 연구소: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)]에 기탁되었으며, 수탁번호 FERM P-17516를 부여받았다. 이어서, 이를 2000년 7월 6일자로 부다페스트 조약 규칙하에 국제 기탁으로 전환시켰으며, 수탁번호 FERM BP-7207를 부여받았다.
실시예 1
엔테로박터 아글로메란스 AJ13601 균주를, 25mg/L의 테트라사이클린 하이드로클로라이드와 25mg/L의 클로람페니콜을 함유하는 LBG 한천 배지(10g/L의 트립톤, 5g/L의 효모 추출물, 10g/L의 NaCl 및 15g/L의 한천) 상에서 30℃하에 14시간 동안 배양하고, 상기 세포의 1백금이를 취한 다음, 이를 1L 용적의 발효조에서 다음 조성을 갖는 종균 배양 배지 300ml 내로 접종하여 pH 6.0에서 34℃하에 종균 배양을 수행하였다.
[종균 배양 배지의 조성]
50g/L의 슈크로즈, 0.4g/L의 황산마그네슘 헵타하이드레이트, 4.0g/L의 황산암모늄, 2.0g/L의 황산이수소일칼륨, 4.0g/L의 효모 추출물, 0.01g/L의 황산제1철 헵타하이드레이트, 0.01g/L의 황산망간 펜타하이드레이트, 0.4g/L의 L-리신 하이드로클로라이드, 0.4g/L의 DL-메티오닌, 0.4g/L의 DL-α,ε-디아미노피멜산, 25mg/L의 테트라사이클린 하이드로클로라이드 및 25mg/L의 클로람페니콜.
배양 동안에 암모니아 기체를 가함으로써 pH를 조절하였다. 마커로서 상기 종균 배양 배지에서의 사카라이드의 고갈을 관찰함으로써 종균 배양을 종결하고, 이러한 종균 배양액을, 1L 용적 발효조 내에 본배양 배지 용적의 20% 양으로 함유한 본배양 배지 300ml 내로 접종하여 본배양을 수행하였다. 본배양 배지의 조성이 다음에 제시되어 있다.
[본배양 배지의 조성]
20g/L의 글루코즈(또는 슈크로즈), 0.4g/L의 황산마그네슘 헵타하이드레이트, 5.0g/L의 황산암모늄, 6.0g/L의 황산이수소일칼륨, 1.5g/L의 염화나트륨, 0.01g/L의 황산제1철 헵타하이드레이트, 0.01g/L의 황산망간 펜타하이드레이트, 0.8g/L의 L-리신 하이드로클로라이드, 0.6g/L의 DL-메티오닌, 0.6g/L의 DL-α,ε-디아미노피멜산, 25mg/L의 테트라사이클린 하이드로클로라이드, 25mg/L의 클로람페니콜, 6.0g/L의 효모 추출물 및 0.75g/L의 염화칼슘 디하이드레이트.
배양 온도를 34℃로 조정하고, 암모니아 기체를 가함으로써 pH를 예정된 pH로 조절하였다. 배양은 이의 초기 단계시 pH 6.0에서 수행하였다. 사카라이드가 고갈된 후, 상기 본배양 배지와 동일한 조성을 갖는 용액과 글루코즈를 지속적으로 가한다(각각 1.0g/hr 및 5ml/hr). 세포의 양이 예정량에 도달된 후에는, 암모니아 기체의 첨가량을 조절하고, pH 저하를 글루탐산 생산과 연계하여 활용함으로써 pH를 4.5로 자발적으로 낮출 수 있으며, 그 후에 배양을 pH 4.5에서 지속시킨다. 배양액 중의 글루탐산 농도가 45g/L에 도달하게 되면, 글루탐산 결정 1.0g을 종결정으로서 본배양 배지에 가하여 이러한 배양액 중에서의 결정 침전을 촉진시킨다.
24시간 동안 배양한 결과, 현저한 양의 글루탐산 결정이 발효조 내에 침전되었다. 이어서, pH가 6.0으로 상승되도록 암모니아 기체를 가하여 완전한 글루탐산 결정을 발효조 내에서 용해시킨 다음, 이로써 생성된 글루탐산의 양을 측정하였다.
이로써 생성된 글루탐산 양을, pH를 배양의 초기 단계에서부터 pH 4.5로 유지시킨 것을 제외하고는 상기와 동일한 방식으로 배양을 수행한 경우의 양과 비교한 결과, 글루탐산 생산성이 pH 이동을 이용한 배양에 의해서 개선되었다는 사실을 확인하였다(표 1).
| 배양 방법 | 생성된 글루탐산의 양(g) | 글루탐산 생산성(g/hr) |
| pH 이동을 이용함 | 50.4 | 2.1 |
| 일정한 pH(4.5)를 이용함 | 30.4 | 1.3 |
실시예 2
엔테로박터 아글로메란스 AJ13601 균주를, 25mg/L의 테트라사이클린 하이드로클로라이드와 25mg/L의 클로람페니콜을 함유하는 LBG 한천 배지(10g/L의 트립톤, 5g/L의 효모 추출물, 10g/L의 NaCl 및 15g/L의 한천) 상에서 30℃하에 14시간 동안 배양하고, 상기 세포의 1백금이를 취한 다음, 이를 1L 용적의 발효조에서 다음 조성을 갖는 종균 배양 배지 300ml 내로 접종하여 pH 6.0에서 34℃하에 종균 배양을 수행하였다.
[종균 배양 배지의 조성]
50g/L의 슈크로즈, 0.4g/L의 황산마그네슘 헵타하이드레이트, 4.0g/L의 황산암모늄, 2.0g/L의 황산이수소일칼륨, 4.0g/L의 효모 추출물, 0.01g/L의 황산제1철 헵타하이드레이트, 0.01g/L의 황산망간 펜타하이드레이트, 0.4g/L의 L-리신 하이드로클로라이드, 0.4g/L의 DL-메티오닌, 0.4g/L의 DL-α,ε-디아미노피멜산, 25mg/L의 테트라사이클린 하이드로클로라이드 및 25mg/L의 클로람페니콜.
배양 동안에 암모니아 기체를 가함으로써 pH를 조절하였다. 마커로서 상기 종균 배양 배지에서의 사카라이드의 고갈을 관찰함으로써 종균 배양을 종결하고, 이러한 종균 배양액을, 1L 용적 발효조 내에 본배양 배지 용적의 20% 양으로 함유한 본배양 배지 300ml 내로 접종하여 본배양을 수행한다. 본배양 배지의 조성이 다음에 제시되어 있다.
[본배양 배지의 조성]
20g/L의 사탕무 당밀(또는 사탕수수 당밀), 0.4g/L의 황산마그네슘 헵타하이드레이트, 5.0g/L의 황산암모늄, 6.0g/L의 황산이수소일칼륨, 1.5g/L의 염화나트륨, 0.01g/L의 황산제1철 헵타하이드레이트, 0.01g/L의 황산망간 펜타하이드레이트, 0.8g/L의 L-리신 하이드로클로라이드, 0.6g/L의 DL-메티오닌, 0.6g/L의 DL-α,ε-디아미노피멜산, 25mg/L의 테트라사이클린 하이드로클로라이드, 25mg/L의 클로람페니콜, 6.0g/L의 효모 추출물 및 0.75g/L의 염화칼슘 디하이드레이트.
배양 온도를 34℃로 조정하고, 암모니아 기체를 가함으로써 pH를 예정된 pH로 조절하였다. 배양을 pH 6.0에서 출발하였고, 본배양 배지 중의 사카라이드와 유기산이 소모될 때까지 수행하였다. 사카라이드가 고갈된 후, 700g/L의 글루코즈 수용액을 지속적으로 가한다(5ml/hr). 글루코즈를 지속적으로 가하는 동안, 암모니아 기체의 첨가량을 조절하고, pH 저하를 글루탐산 생산과 연계하여 활용함으로써 약 2시간에 걸쳐 pH를 4.5 수준으로 낮춘 다음, pH 4.5에서 배양을 지속하였다. 배양액 중의 글루탐산 농도가 45g/L에 도달하면, 글루탐산 결정 1.0g을 종결정으로서 본배양 배지에 가하여 이러한 배양액 중에서의 결정 침전을 촉진시킨다.
50시간 동안 배양한 결과, 현저한 양의 글루탐산 결정이 발효조 내에 침전되었다. 이어서, pH가 6.0으로 상승되도록 암모니아 기체를 가하여, 완전한 글루탐산 결정을 발효조 내에서 용해시킨 다음, 이로써 생성된 글루탐산의 양을 측정한다.
이로써 생성된 글루탐산 양을, pH를 배양의 초기 단계에서부터 4.5로 유지시킨 것을 제외하고는 상기와 동일한 방식으로 배양을 수행한 경우의 양과 비교한 결과, 글루탐산 생산성이 pH 이동을 이용한 배양에 의해서 개선되었다는 사실을 확인하였다(표 2).
| 배양 방법 | pH 이동을 이용함 | 일정한 pH(4.5)를 이용함 |
| 배양액 중의 글루탐산의 양 | 51.0g | 21.6g |
| 종균 결정으로서 부가된 글루탐산의 양 | 1.0g | 1.0g |
| 배양액 중에 생성된 글루탐산의 양 | 50.0g | 20.6g |
본 발명의 방법에 따라서, 효율적으로 L-글루탐산을 생산할 수 있다. 또한, 당원으로서 광범위한 원료를 사용할 수 있다.
Claims (12)
- L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물을, 미생물의 생육에 적합한 제1 pH에서 배양하는 단계 및 미생물에 의한 L-글루탐산 생산에 적합하고 상기 제1 pH 보다는 낮은 제2 pH에서 당해 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 발효에 의한 L-글루탐산의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 제2 pH가 3 내지 5인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 pH에서의 배양을, 알칼리화 물질을 배지에 가함으로써 배지의 pH를 제1 pH로 유지시키면서 수행하는 방법.
- 제3항에 있어서, 제1 pH에서의 배양 후, 알칼리화 물질의 첨가량을 조절함으로써 배지의 pH를 저하시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 pH에서의 배양이, 세포의 양이 예정량에 도달할 때까지 지속되는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 미생물이 엔테로박터(Enterobacter) 속에 속하는 방법.
- 제6항에 있어서, 미생물이 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans)인 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 제1 pH가, 미생물의 슈크로즈-동화 능력을 저하시키지 않는 pH인 방법.
- 제8항에 있어서, 제1 pH에서의 배양이, 배지 중의 슈크로즈가 소모될 때까지 지속되는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 미생물이 특정의 pH에서 포화 농도의 L-글루탐산과 탄소원을 함유하는 액체 배지에서 탄소원을 대사시킬 수 있고, 상기 pH의 액체 배지에서 L-글루탐산의 포화 농도를 초과하는 양의 L-글루탐산을 축적시키는 능력을 갖는 방법.
- 제10항에 있어서, 특정의 pH가 5.0 이하인 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, L-글루탐산 생산에 적합한 pH가, 미생물에 의해 생산된 L-글루탐산이 배지 중에 침전되는 pH이고, 이러한 pH의 배지에서 배양하는 동안, L-글루탐산 침전을 수반하면서 L-글루탐산이 생성 및 축적되는 방법.
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