KR20020030642A

KR20020030642A - 디벤조사이클로옥탄계 리그난 화합물의 뇌신경세포사멸억제제 및 뇌졸중 및 뇌허혈 예방과 치료제로서의용도 및 이를 함유하는 약학적 제제

Info

Publication number: KR20020030642A
Application number: KR1020000061676A
Authority: KR
Inventors: 김영중; 성상현; 이미경; 김소라; 구경아; 정원주
Original assignee: 주식회사엘컴바이오테크놀러지
Priority date: 2000-10-19
Filing date: 2000-10-19
Publication date: 2002-04-25
Also published as: DE60139409D1; WO2002032417A1; JP3996505B2; EP1326596A4; JP2004511514A; US20030050335A1; ATE437636T1; KR100380634B1; EP1326596B1; EP1326596A1; AU2002214336A1; CN1394137A; US6653344B2; CN1171585C

Abstract

본 발명은 다음 일반구조식 ( I )의 화합물의 뇌신경세포 사멸억제 및 뇌졸중 및 뇌허혈의 예방과 치료제로서 용도 및 이들 화합물들을 유효성분으로 함유하고, 여기에 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하고 통상의 약학적 제제의 제조방법으로 약학적 제제로 제제화시켜서 제조된 뇌신경세포 사멸억제제 및 뇌졸중 및 뇌허혈 예방과 치료효과를 가지는 약학적 제제를 제공하는 것이다.

( I )

상기식에서 R₁은 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 저급알킬기이며, R₂, R₃, R₄및 R₅는 각각 수소원자, 하이드록실기, 탄소수 1 내지 4의 저급알킬기 또는 탄소수 1 내지 4의 저급알콕시기이거나, 또는 R₂와 R₃및 R₄와 R₅는 각각 함께 결합하여 -OCH₂O-기를 형성할 수 있다.

Description

디벤조사이클로옥탄계 리그난 화합물의 뇌신경세포 사멸억제제 및 뇌졸중 및 뇌허혈 예방과 치료제로서의 용도 및 이를 함유하는 약학적 제제 {Pharmaceutical prepareations containing a dibenzocyclooctane lignan derivative for prevention and treatment of ischemic stroke by blocking neuronal cell death}

본 발명은 다음의 일반구조식 ( I )로 표시되는 디벤조사이클로옥탄계 리그난 화합물의 뇌신경세포 사멸억제 및 뇌허혈 및 뇌졸중치료제로서의 용도 및 이 일반구조식 ( I )의 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제에 관한 것이다.

(I)

상기의 일반구조식 ( I )의 화합물중 R₁이 수소원자이고, R₂, R₃, R₄및 R₅가 각각 메톡시기인 화합물이 데옥시쉬잔드린(Deoxyshizandrin : 화합물 1)이며, R₁이 수소원자이고, R₂및 R₃가 함께 결합하여 -OCH₂O-기이고 R₄및 R₅가 각각 메톡시기인 화합물이 고미신 N(Gomisin N : 화합물 2)이며, R₁이 수소원자이고, R₂및 R₃, 그리고 R₄및 R₅가 각각 함께 결합하여 -OCH₂O-기인 화합물인 화합물이 우웨이지수 C (Wuweizisu C : 화합물 3)이다.

상기의 성분들은 오미자에 함유되어 있는 기지의 물질들이다.

현대사회의 인구분포는 고령화 추세로 급변하고 있다. 이에 따라 노화와 관련된 질병, 예를들면 뇌졸중이나 치매와 같은 퇴행성 뇌신경계 질환의 발병률도 높아지고 있다. 뇌신경계 질환은 그 사망률이 매년 증가하는 질환으로 우리나라의 사망원인을 분석하여 볼 때 암에 이어 2위를 차지하고 있으며, 세계적으로도 사망원인의 2-3위를 차지하는 심각한 질환이다. 그러나 이를 치료할 수 있는 뚜렷한 의약품이나 치료방법이 아직까지도 제시되어 있지 않은 실정으로 그 사회적, 경제적인 손실은 더욱 심화되고 있다.

퇴행성 뇌신경계 질환은 노화에 의한 뇌신경세포의 구조적 퇴화, 순환기 장애 등 다른 성인병에 기인한 2차적 증상, 또는 교통사고, 산업재해, 일산화탄소 중독 등 다양한 물리적, 기계적 요인에 의하여 뇌가 손상을 입으면 일어날 수 있다 ( Rothman SM, Thurston JH and hauhart RE (1987) Delayed neurotoxicity of excitatory amino acids in vitro. Neuroscience 22: 1884-1891; and Weiloch, T. (1985) Hypoglycemia-induced neuronal damage prevented by an NMDA antagonists. Science 230: 681-683).

뇌조직이 손상되면 뇌신경세포의 사멸이 초래되는데, 신경세포 사멸의 기전은 크게 2가지로 대별된다. 첫째, 뇌 안에 존재하는 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트(glutamate)에 의한 것이다. 글루타메이트(Glutamate)는 정상상태에서는 신경전달물질로 작용하나 여러 가지 원인에 의하여 과다하게 분비되면 신경세포의 사멸을 초래하게 된다. 이러한 글루타메이트(glutamate)에 의한 신경독성은 급성독성과 만성독성으로 나누어진다 (Choi DW (1988) Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system. Neuron 1: 623-634). 급성독성은 세포 외에 있는 Ca²⁺이 세포 내로 과량으로 유입됨으로써 시작되며, 세포의 삼투압 유지를 위해 Na⁺, K⁺및 Cl^-등의 이온들의 유입이 뒤따라 세포는 부풀게 되고 결국은 터져 죽는 형태로 나타난다. 만성독성은 글루타메이트수용체인 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate : NMDA)와 non-NMDA 수용체가 활성화되어 Ca²⁺이 세포 내로 유입되고 이로 인하여 세포 내 칼슘의존성(calcium-dependent) 효소들이 과도하게 활성화되어 결국은 세포가 죽게 되는 형태이다 (Rothman SM, Thurston JH and hauhart RE (1987) Delayed neurotoxicity of excitatory amino acids in vitro. Neuroscience 22: 1884-1891; Strijbos PJLM, Leach MJ and Garthwaite J (1996) Vicious cycle involving Na⁺channels, glutamate release and NMDA receptors mediates delayed neurodegeneration through nitric oxide formation. J. Neurosci. 16: 5004-5013; and Coyle JT and Purrfarcken P (1993) Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders. Science 262: 689-695). 둘째, 직접적인 산화적 스트레스(oxidative stress)에 의한 손상이다. 뇌에는 불포화 지방산의 비율과 산소의 소비량이 높아 산소래디칼(oxygen radical)의 생성이 높으나 다른 기관에 비하여 상대적으로 항산화 효소의 양이 적어 산소래디칼(oxygen radical)을 포함하는 후리래디칼(free radical)에 의한 손상의 위험성이 높으며, 이는 허혈 후 재관류가 일어날 때의 손상기전으로도 알려져 있다.

이와 같이 퇴행성 뇌신경계 질환에 관련된 신경세포 사멸기전에 대한 연구가 다양한 각도에서 활발히 진행되고 있으며, 이를 기초로 하여 이를 예방, 치료할 수 있는 의약품을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이에 본 연구에서는 천연물로부터 퇴행성 뇌신경계 질환을 치료하거나 예방할 수있는 물질을 찾고자 글루타메이트(glutamate)로 신경독성을 유발시킨 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포를 이용하여 천연물의 신경세포 보호 활성을 검색하던 중 오미자의 추출물이 유의성 있는 보호 활성을 가짐을 확인하였다. 예로부터 민간에서 강장이나 간장보호 목적으로 사용되어 온 오미자는 디벤조사이클로옥탄 리그난(dibenzocyclooctane lignan)계 성분이 주를 이루며 그 활성에 대하여서도 많은 연구가 진행되어 왔다 ( Nakajima K, Taguchi H, Ikeya Y, Endo Y and Yosioka I (1983) The constituents of Schizandra chinensis Baill. XIII. Quantitative analysis of lignans in the fruits of Schizandra chinensis Baill. by high performance liquid chromatography. Yakugaku Zasshi 103: 743-749; Liu GT (1985) In: Advances in Chinese medical materials research (Chang HM et al. Eds) pp.257-268, World Scientific Publishing Co. Singapore). 오미자로부터 분리된 디벤조사이클로옥탄 리그난(dibenzocyclooctane lignan)계 성분의 중요한 활성으로 간장보호 작용 ( Hikino H, Kiso Y, Taguchi H and Ikeya Y (1984) Antihepatotoxic actions of lignoids from Schizandra chinensis Fruits. Planta Med. 50: 213-218; Kiso Y, Tohkin M, Hikino H, Ikeya Y and Taguchi H (1985) Mechanism of antihepatotoxic activity of wuweizisu C and gomisin A. Planta Med. 51: 331-334; and Yamada S, Murawaki Y and Kawasaki H (1993) Preventive effect of gomisin A, a lignan component of Schizandra fruits, on acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats. Biochem. Pharmacol. 46: 1081-1085), 그 외 항암 (Yasukawa K, Ikeya Y, Mitsuhashi, Iwasaki M, Abursda M,Nakagawa S, Takeuchi M and Takido M (1992) Gomisin A inhibits tumor promotion by 12-o-tetra-decanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin. Oncology 49: 68-71), 항염 (Wang JP, Raung SL, Hsu MF and Chen CC (1994) Inhibitory by gomisin C (a lignan from Schizandra chinensis) of the respiratory burst of rat neutrophils. Brit. J. Pharmacol. 113: 945-953), 항바이러스 작용 (Fujihashi T, Hara H, Sakata T, Mori K, Higuchi H, Tanaka A, Kaji H and Kaji A (1995) Anti-human immunodeficiency virus (HIV) activities of halogenated gomisin J derivatives, new nonnucleotide inhibitors of HIV type 1 reverse transcriptase. Antimicrob. Agents Chemother. 39:2000-2007) 등이 보고되어 있다. 그러나 신경계에 대한 생리활성은 보고된 바 없다. 이에 오미자의 대표적인 디벤조사이클로옥탄 리그난(dibenzocyclooctane lignan) 성분들의 신경보호작용 및 그 작용기전을 밝힘으로써 뇌졸중이나 노인성 치매와 같은 퇴행성 뇌신경계 질환 등을 예방하거나 치료할 수 있는 의약제의 후보물질로 제시하고자 하였다.

다음에 실험예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실험방법

1. 실험동물 : Sprague-Dawley계 흰쥐를 서울대학교 동물사육장에서 공급받아 서울대학교 약학대학 실험동물실에서 사육하였다. 사육장의 환경은 실내온도를 22 ± 5 ℃로 유지하고 조명시간을 아침 7시에서 저녁 7시로 고정하였으며, 사료는 조단백 23.2 %, 조지방 4.0 %, 조섬유 6.0 %, 조회분 10.0 %, 조칼슘 0.6 %, 조인0.4 %등이 함유된 고형사료 (서울, 삼양사)를 사용하였다.

2. 흰쥐의 대뇌피질세포의 분리 및 배양 : 흰쥐 태자의 대뇌 부분만을 적출하여 해부현미경 밑에서 조심스럽게 meninges를 제거한 후 대뇌조직을 0.25 % trypsin으로 30분 동안 처리하여 조직을 연화시켜 개개의 세포로 유리되도록 하였다. 분리한 대뇌피질세포를 1.0 × 10⁶cells/㎖이 되도록 collagen으로 도포한 배양 용기에 이식하였다. 배양액은 DMEM 90 %, fetal bovine serum 10 %로 구성된 것에 1 mM sodium pyruvate, penicillin 100 IU/㎖ 및 streptomycin 100 μg/㎖을 첨가하여 사용하였다. 세포의 배양은 3-4일 마다 새로운 배양액으로 갈아주고 37 ℃ 배양기에서 공기 (95 %)와 CO₂(5 %)의 혼합기체를 계속 공급하면서 수행하였다 ( Kim YC, Kim SR, Markelonis GJ and Oh TH (1998) Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate-induced neurodegeneration. J. Neurosci. Res. 53: 426-432).

3. 화합물의 투여 : 뇌신경세포 보호활성의 유무를 검색하고자 하는 화합물을 DMSO (최종농도 0.1 % 이내)에 용해시킨 후 증류수로 희석한 다음 millipore membrane (0.22 μm, Millex-GV, U.S.A.)을 통과시켜 무균상태로 만든 후 농도를 달리하여 배양하고 있는 뇌신경세포에 투여하였다.

4. Glutamate에 의한 신경독성의 유도 : 흰쥐의 태자에서 직접 분리한 대뇌피질세포를 14일간 배양한 후 활성을 측정하고자 하는 시료를 농도별로 배양세포에 처리한 다음 1시간 후에 100 μM의 glutamate를 처리하여 신경세포에 독성을 유도하였다. 24시간 후 배양세포에 대하여 MTT assay로 세포의 생존률을 측정함으로써 시료의 신경세포 보호 활성을 판단하였다.

5. MTT assay : 배양 중인 대뇌피질세포의 배양액에 MTT (5 mg/㎖)를 배양액의 10 %가 되도록 가하고 계속하여 3시간 더 배양한 후 생성된 formazan을 DMSO로 녹여낸 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Mosmann T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immuno. Methods 65: 55-61).

6. 세포 내 Ca²⁺농도 측정 : 일차배양한 대뇌피질세포 내의 Ca²⁺농도는 활성을 측정하려는 화합물을 투여하고 1시간 후에 glutamate로 신경독성을 유도한 다음 Fura-2 AM을 이용하여 측정하였다 (Grynkiewicz G, Poenie M and Tsien RY (1985) A new generation of calcium indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260: 3440-3450).

7. Nitrite의 정량 : 일차배양한 대뇌피질세포로부터 배양액 중으로 유리되는 nitrite의 양은 Griess reagent를 이용하여 Dawson 등의 방법으로 측정하였다 (Dawson VL, Brahbhatt HP, Mong JA and Dawson TM (1994) Expression of inducible nitric oxide synthase causes delayed neurotoxicity in primary neuronal-glial cortical cultures. Neuropharmacology 33: 1425-1430).

8. 세포 상징액의 제조 : 일차배양한 대뇌피질세포의 배양액을 제거한 후 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4)을 가하여 세포를 수집하였다. 수집한 세포를20초동안 sonication 한 후 4 ℃에서 3,000 g로 20분간 원심분리하여 세포 상징액을 얻었다.

9. Glutathione-peroxidase (GSH-px)의 활성 측정 : 시험관에 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), 1 mM reduced glutathione (GSH), 0.2 mM NADPH, 0.5 mM H₂O₂및 1.5 units/㎖의 GSSG-reductase (GSSG-r)가 포함된 반응액 1 ㎖을 준비한 다음 세포 상징액 100 ㎕를 가하여 반응을 시키고 340 nm에서 1분간 흡광도의 감소를 측정하여 GSH-px의 활성을 측정하였다. GSH-px의 활성은 absorption coefficient (6.22 μmol^-1cm^-1)를 이용하여 μmol NADPH oxidized/mg protein/min으로 나타내었다 (Flohe L, Gunzler WA, 1984, Assays of glutathone peroxidase, Methods Enzymol 105: 114-121).

10. Total GSH (GSH + GSSG)양의 측정 : 시험관에 0.3 mM NADPH 및 5 mM DTNB가 담긴 반응액 700 ㎕를 준비한 후 세포 상징액 100 ㎕를 가하였다. 여기에 GSSG-R를 최종농도 5 units/㎖로 가하여 반응을 시키고, 412 nm에서 1분간 흡광도의 증가를 측정하였다. GSH의 양은 표준품의 GSH로 GSH standard curve를 구하여 환산하였다 (Tietze F, Enzymatic method for quantative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione, Anal Biochem 27: 502-522).

11. Malondialdehyde (MDA) 양의 측정 : 세포상징액 500 ㎕에 10 % trichloroacetic acid (TCA) 500 ㎕를 가하고 10분동안 방치하여 단백질을 침전시킨 후 microspin을 이용하여 침전된 단백질을 제거하였다. 상징액에 thiobarbitricacid를 최종농도 0.2 %로 가하여 1 ㎖의 반응액을 준비한 후 100 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 흡광도를 535 nm에서 측정한 후 1,1,3,3-tetraethoxypropane을 standard로 이용하여 MDA의 양으로 환산하였다 (Yagi KA, 1976, Simple fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma, Biochem Med 15: 212-216).

12. Calpain 저해활성 측정 : Calpain II (m-calpain)은 정제된 것을 sigma에서 구입하여 사용하였고, 기질은 0.2 % casein을 사용하였다. 시험관에 0.01 unit calpain, 0.2 % casein, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 100 mM EGTA, 10 mM DTT, 활성을 평가하고자하는 시료를 넣고 잘 섞은 후 4 mM 칼슘을 가하여 25 oC에서 30 분간 반응시켰다. 10 % TCA를 가하여 반응을 종결시킨 후 분해되지 않은 casein을 최대 4000 g에서 5분간 원심분리하여 제거하고 상징액을 취하여 278 nm에서 흡광도를 측정하여 시료의 calpain의 저해활성을 판단하였다 (Jiang S-T, Wang J-H, Chang T and Chen C-S (1997). A continuous method for measuring calpain activity. Anal. Biochem. 244: 233-238).

(A-C) + (D-B)

Calpain inhibition (%) = ----------------- X 100

A-B

A: OD with Ca²⁺

B: OD without Ca²⁺

C: OD of Sample with Ca²⁺

D: OD of Sample without Ca²⁺

13. 통계처리 : 통계적 유의성 검토는 각 실험군의 수를 3으로 하였으며 (n=3) 대조치로부터의 변동을 "ANOVA test"로 하였다. P값이 5 % 미만일 때는 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

14. 결과 및 고찰 :

오미자의 중요한 디벤조사이클로옥탄 리그난(dibenzocyclooctane lignan)계 성분인 데옥시쉬잔드린(deoxyschizandrin), 고미신 N(gomisin N) 및 우웨이지수 C(wuweizisu C)의 뇌신경세포 보호 활성을 글루타메이트(glutamate)로 신경독성을 유발시킨 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포를 검색계로 이용하여 알아보았다. 그 결과는 다음의 표 1에 나타내었다.(Table 1). 즉, 흰쥐의 대뇌피질세포를 14일 동안 배양한 후 화합물을 각각 농도별로 투여하고 1시간 후에 다시 100 μM 글루타메이트로 신경세포 독성을 유발하였으며, 24시간동안 더 배양한 후 신경세포 보호 활성을 측정하였다. 화합물의 뇌신경세포 보호 활성은 세포 내 존재하는 석시네이트 데하이드로지네이스(succinate dehydrogenase)의 활성을 측정하는 MTT assay로 판단하였다. 세포가 독성을 입으면 세포 내 미토콘드리아가 손상을 입게 되며, 미토콘드리아 내에 존재하는 succinate dehydrogenase의 활성 또한 감소되어 생성되는 포르마잔(formazan)의 양이 감소하게 되므로 이를 이용하여 생존률을 측정할 수 있다. 이와 같은 검색계를 이용하여 상기 리그난(lignans)의 뇌신경세포 보호 활성을 측정한 결과 일반구조식 ( I )의 화합물은 유의성있는 뇌신경세포 보호 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 즉, deoxyschizandrin, gomisin N 및 wuweizisu C은 각각 1 μM의 농도로 투여하였을 때 가장 뛰어난 뇌신경세포 보호활성을 나타내어 정상상태 때의 각각 46.2 %, 51.3 % 및 63.9 %의 수준까지 뇌신경세포를 유지시켰다.

이에 글루타메이트(glutamate)로 유발시킨 독성에 대하여 보호 활성을 나타낸 데옥시쉬잔드린(deoxyschizandrin), 고미신 N(gomisin N) 및 우웨지수 C(wuweizisu C)의 작용기전을 알아보고자 투여시기 및 투여기간을 달리하여 글루타메이트로 유발시킨 신경독성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 즉, 흰쥐의 대뇌피질세포에 글루타메이트(glutamate)로 투여하기 1시간 전부터 글루타메이트로 작용시키기 직전까지만 화합물을 투여하는 것을 pre-treatment라 하였으며, 배양액을 DMEM으로 교환하고 24시간 더 배양한 다음 뇌신경세포 보호 활성을 측정하였다. 그 결과를 다음의 표 2에 나타내었다. (Table 2). 또한, 흰쥐의 대뇌피질세포에 글루타메이트(glutamete)를 15분 동안 처리한 후 배양액을 DMEM으로 갈아주면서 이들을 다시 투여하고 24시간 더 배양한 다음 뇌신경세포 보호활성을 측정하는 것을 post-treatment라 하였다. 그 결과도 표 2에 나타내었다. (Table 2). Wuweizisu C는 pretreatment하였을 때에는 유의성있는 뇌신경세포 보호 활성을 나타내었으나, post-treatment 하였을 때에는 그 보호 활성이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, deoxyschizandrin은 pre-treatment 하였을 때보다는 post-treatment 하였을 때 더 뛰어난 보호활성을 나타내었다. 한편, gomisin N은 pre-treatment와 post- treatment 하였을 때 모두 그 활성이 유지되었다. 따라서 이러한 결과로부터 deoxyschizandrin, gomisin N 및 wuweizisu C는 각기 서로 다른 기전으로 glutamate에 의한 신경독성에 대하여 보호활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 즉, wuweizisu C는 glutamate에 의해 독성이 유발되는 초기단계에 작용하여 보호 활성을 가지는 것으로 추정되었으며, deoxyschizandrin은 glutamate의 수용체의 과발현 후 매개되는 일련의 반응에 대하여 보호 활성을 나타내는 것으로 추정할 수 있었다. 한편, gomisin N은 wuweizisu C와 deoxyshizandrin의 뇌신경세포 보호작용기전을 모두 가지는 것으로 일단은 추정할 수 있었다.

글루타메이트(Glutamate)의 수용체는 agonist에 따라 크게 대별되어 NMDA에 의하여 활성화되는 NMDA 수용체와 α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로피오네이트(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate) 및 카이닌산 (kainic acid : KA)에 의하여 활성화되는 non-NMDA 수용체로 나뉜다. 이에 글루타메이트(glutamate)로 유발시킨 신경독성에 대하여 유의성 있는 보호 활성을 나타낸 deoxyschizandrin, gomisin N 및 wuweizisu C들이 각기 다른 glutamate 수용체의 agonist로 유발시킨 독성에 대하여 어떻게 영향을 미치는지 살펴보았다. 즉, 일차배양한 대뇌피질세포에 이들 화합물을 각기 처리한 후 NMDA 수용체 agonist로 NMDA를 non-NMDA 수용체 agonist로 KA를 사용하여 독성을 유발시킨 후 각 화합물의 뇌신경세포 보호 활성을 측정하였다. 그 결과 wuweizisu C는 NMDA로 유발시킨 독성에 대하여, deoxyschizandrin은 KA로 유발시킨 독성에 대하여 상대적으로 선택적인 보호 활성을 나타내었다. 반면, gomisin N은 KA로 유발시킨 독성보다는 NMDA로 유발시킨 독성에 대하여 상대적으로 우수한 보호활성을 나타내었으나 그 선택성은 deoxyshizandrin이나 wuweizisu C보다 떨어짐을 확인할 수 있었다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. (Table 3).

글루타메이트(Glutamate)에 의한 신경독성은 글루타메이트(glutamate)수용체의 과도한 활성화로 인한 Ca²⁺의 유입이 매개하는 것으로 알려져 있으며, 이는 세포 내 Ca²⁺양의 증가, free radical 및 NO의 축적 등을 수반한다 (Peter et al, 1995; Krieglstein, 1997). 세포 내 Ca2+은 세포의 신호 전달과 세포 기능에 중요한 역할을 한다. 따라서 Ca²⁺의 항상성은 체계적으로 조절되며 Ca²⁺의 항상성의 파괴는 세포의 사멸을 유도하여 다양한 질병의 원인이 되고 있다. 신경세포의 Ca²⁺항상성을 깨는 주 원인중의 하나가 글루타메이트에 의한 세포 내 Ca²⁺의 증가이다. 글루타메이트 수용체가 활성화되면 Ca²⁺이 세포 내로 유입되고 세포 내 Ca²⁺의 양의 증가는 Ca2+-dependent 효소들인 나이트릭 옥사이드 신세이즈(nitiric oxide synthase : NOS), 프로테인 키네이스 C(protein kinase C), 포스포리페이스(phospholipase) 및 프로테아제(protease) 등을 활성화시킨다 (Choi, 1985; Lipton and Rosenberg, 1994). 이러한 효소들이 활성화되면 일련의 반응을 통하여 다양한 독성이 일어나게 된다.

따라서 deoxyschizandrin, gomisin N 및 wuweizisu C가 glutamate로 인한Ca²⁺의 유입에 미치는 영향을 먼저 살펴보았다. gomisin N과 wuweizisu C는 glutamate로 인하여 세포 내로 유입되는 Ca²⁺의 농도를 유의성 있게 저하시켰다. Gomisin N과 wuweizisu C는 각각 1 μM의 농도로 처리하였을 때 glutamate에 의하여 증가되는 세포 내 Ca²⁺의 양을 각각 60.3 % 및 67.9 %까지 감소시켰다. 그러나 deoxyschizandrin은 Ca²⁺의 유입에는 유의성 있는 영향을 나타내지 않았다. 그 결과를 다음의 표 4에 나타내었다 (Table 4). 이러한 결과는 wuweizisu C와 gomisin N은 세포 독성 유발 초기단계에 작용하여 보호활성을 나타낼 것이라는 것과 deoxyschizandrin은 glutamate 수용체의 과발현 후 일어나는 일련의 반응에 작용하여 그 활성을 나타낼 것이라는 상기의 추정을 뒷받침하는 결과라 할 수 있겠다.

앞서 언급하였듯이 glutamate로 인한 세포 내 Ca²⁺양의 증가는 Ca²⁺`-dependent 효소들을 활성화시킨다. Ca²⁺-dependent 효소중의 하나인 NOS의 활성화는 NO의 생성을 증가시켜 독성을 나타내며 이는 glutamate 독성기전의 하나로 알려져 있다 (Masanori et al, 1998). 또한 phospholipase A2가 활성화되면 아라키도닌산(arachidonic acid)이 생성되며 arachidonic acid의 대사과정에서 다양한 free radical이 생성된다. 따라서 oxidative stress는 glutamate의 또다른 독성기전으로 알려져 있다. 신경계에는 이러한 oxidative stress에 대한 방어를 위한 다양한 항산화 기전을 가지고 있다. 대표적인 항산화기전으로는글루타치온 퍼옥시데이스(glutathione peroxidase), 수퍼옥사이드 디스뮤테이스(superoxide dismutase), 카탈레이스(catalase)와 같은 항산화효소와 glutathione으로 대표되는 항산화물질이 있다. 이에 glutamate로 유발시킨 독성에 대하여 보호 활성을 나타낸 deoxyschizandrin, gomisin N 및 wuweizisu C에 대하여 항산화 기전 및 NO의 생성에 미치는 영항을 살펴보았다.

일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 glutamate를 처리하면 NO 생성이 증가된다. Gomisin N과 wuweizisu C는 glutamate로 인하여 과다 생성되는 NO의 양을 유의성 있게 감소시켜 1 μM의 농도로 처리하였을 때 각각 정상상태 때의 60.2 % 및 65.8 % 수준까지 감소시켰다. Deoxyschizandrin도 1 μM의 농도로 처리하였을 때 glutamate로 인하여 증가된 NO의 양을 감소시켰으나 그 효과는 정상상태 때의 40.2 % 수준으로 gomisin N 및 wuweizisu C에 비하여 떨어졌다. 그 결과를 다음의 표 5에 나타내었다. (Table 5). Gomisin N 및 wuweizisu C이 glutamate로 인한 NO의 생성을 저하시키는 효과는 gomisin N 및 wuweizisu C의 Ca²⁺의 유입 억제에 따른 NOS의 활성화를 차단시키는데 기인하는 것으로 추측할 수 있다. 그러나 deoxyschizandrin은 glutamate에 의한 Ca²⁺의 유입에는 유의성 있는 영향을 나타내지 않은 반면 NO의 생성을 저하시킨 것으로 보아 gomisin N 및 wuweizisu C와는 다른 기전으로 NO의 생성을 억제하는 것으로 추측할 수 있겠다.

Deoxyschizandrin, gomisin N 및 Wuweizisu C은 또한 glutamate로 독성을 유발시킨 일차배양한 대뇌피질세포에 1 μM의 농도로 투여하였을 때 glutamate로 인하여 감소되는 GSH-px의 활성 및 glutathione의 양을 정상상태 때의 약 50 % 수준까지 유지시켜 항산화 효소의 활성에도 보호활성을 나타냄을 알 수 있었다. 그 결과를 다음의 표 6 및 7에 나타내었다 (Tables 6 and 7).

글루타메이트로 인하여 과다 생성된 NO와 superoxide anion는 서로 결합하여 peroxynitrite를 형성한다 (Almeida et al, 1998). 이렇게 생성된 peroxynirite는 glutamate 독성으로 인하여 생성된 free radical과 함께 신경세포에 oxidative stress를 유발하며 이는 결국 세포의 지질과산화를 유발한다. 이에 deoxyschizandrin, gomisin N 및 wuweizisu C가 glutamate에 의한 지질과산화에 미치는 영향을 살펴보았다. Wuweizisu C는 1 μM의 농도에서 glutamate로 인한 지질과산화를 67 %까지 억제시켰다. Gomisin N과 deoxyschizandrin도 glutamate로 인한 지질과산화를 유의성 있게 억제시키는 효과를 나타내었다. 그 결과를 다음의 표 8에 나타내었다. (Table 8).

이상의 실험결과에서 deoxyschizandrin, gomisin N 및 wuweizisu C는 glutamate로 유발시킨 신경독성에 유의성있는 보호 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 그 작용기전으로 wuweizisu C는 glutamate에 의한 초기 Ca²⁺의 유입을 억제함으로써 NO의 생성 및 지질과산화를 억제시켜 보호 활성을 나타내는 것을 밝힐 수 있었다. Deoxyschizandrin은 Ca²⁺의 유입을 억제시키지는 못하였으나 Ca²⁺에 의하여 매개되는 반응을 차단시킴으로써 NO의 생성을 억제하고 항산화 방어체계를 유지시켜 보호 활성을 나타내는 것으로 추정할 수 있었다. Gomisin N은 glutamate로 인한 Ca²⁺의 유입을 억제시키고 항산화 방어체계에도 작용하여 보호 활성을 나타내는 것으로 추측할 수 있었다.

글루타메이트로 유발시킨 신경독성의 기전으로 Ca²⁺-dependent 효소의 활성화가 알려져 있다. 이러한 효소 중 하나인 calpain (calcium activated protease)은 정상상태에서는 세포막 단백질의 조절 및 신경세포의 synaptic plasticity에 관여하며, 또한 cytosol내 존재하는 transcriptional factors (c-jun, c-fos etc.)의 활성을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Squier et al, 1994; Martin et al, 1995). 그러나, 비정상적으로 활성화되면 cytoskeletal 단백질들을 과도하게 분해함으로써 세포에 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다 (Johnson et al, 1991). 따라서 glutamate로 인한 신경독성을 유의성 있게 차단시킨 deoxyschizandrin, gomisin N 및 wuweizisu C이 calpain의 활성에는 어떠한 영향을 미치는가를 알아보았다. 그 결과 gomisin N은 IC₅₀가 0.112 μM로 뛰어난 calpain 저해활성을 나타내어 gomisin N의 calpain 저해효과가 glutamate로 유발시킨 뇌신경 세포사멸로부터 세포를 보호하는 또 하나의 기전임을 알 수 있었다. 그 결과를 다음의 표 9에 나타내었다. (Table 9).

이상의 실험결과로부터 본 연구에서는 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포를 이용하여 오미자의 3종 lignans 즉, wuweizisu C, deoxyschizandrin 및 gomisin N의 뇌신경세포 보호활성을 처음으로 밝혔으며 그 작용기전을 제시하였다.

표 1. Effects of deoxyschizandrin, gomisin N, and wuweizisu C on cell viability in glutamate-damaged primary cultured rat cortical cells.

Concentration Viability

(μM) (%)

Control 100.0 ± 1.4

Glutamate-treated 0.0 ± 6.4

Deoxyschizandrin 0.1 11.6 ± 5.1

1.0 46.2 ± 6.3**

5.0 45.6 ± 3.1**

Gomisin N 0.1 25.2 ± 4.4

1.0 51.3 ± 8.3**

5.0 49.2 ± 9.5**

Wuweizisu C 0.1 30.2 ± 6.3*

1.0 63.9 ± 5.9***

5.0 60.9 ± 9.6***

Rat Cortical cultures were treated with compounds for 1 hr before exposure to 100 μM glutamate and then maintained for 24 hr. Cell viability was measured by the MTT assay. Optical density (OD) of the control and glutamate-treated were 1.18 ± 0.09 and 0.75 ± 0.07, respectively. Viability was calculated as 100 x (OD of glutamate + compound-treated - OD of glutamated-treated) / (OD of control - OD of glutamate - treated). Values given represent the mean ± SD (n=3). Mean value is significantly different from the value for the glutamate-treated; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001

표 2. Effects of deoxyschizandrin, gomisin N and wuweizisu C on cell viability in glutamate-damaged primary cultured rat cortical cells in pre-treatment.

Viability (%)

Pre-treatment Post-treatment

Control 100.0 ± 1.5 100.0 ± 2.1

Glutamate-treated 0.0 ± 5.9 0.0 ± 4.7

Deoxyschizandrin 20.1 ± 3.1 45.9 ± 5.5**

Gomisin N 45.5 ± 9.8** 39.6 ± 6.2*

Wuweizisu C 59.6 ± 5.1*** 19.2 ± 7.8

Rat cortical cultures were treated with compounds at the concentration of 1 μM for 1 hr before exposure to 100 μM glutamate (15 min) and then maintained in DMEM for 24 hr in the absence of compound (Pre-treatment). Some cortical cultures were exposed to glutamate for 15 min, washed and maintained in DMEN for 24 hr in the presence of compund (Posttreatment). Cell viability was measured by the MTT assay. Optical density (OD) of the control and glutamate-treated were 1.18 ± 0.09 and 0.75 ± 0.07, respectively. Viability was calculated as the same as Table 1. Values given represent the mean ± SD (n=3). Mean value is significantly different from the value for the glutamate-treated; *p<0.05, **p<0.01

표 3. Effects of deoxyschizandrin, gomisin N and wuweizisu C on cell viability in NMDA- or KA-insulted primary cultured rat cortical cells.

Viability (%)

NMDA-insulted KA-insulted

Control 100.0 ± 1.4 100.0 ± 1.9

NMDA or KA-treated 0.0 ± 6.6 0.0 ± 5.6

Deoxyschizandrin 11.0 ± 3.5 38.2 ± 4.2*

Gomisin N 45.5 ± 6.8** 25.5 ± 4.5

Wuweizisu C 52.1 ± 7.1** 15.0 ± 3.9

Rat cortical cultures were treated with compounds at the concentration of 1 μM for 1 hr. The cultures were then exposed to 50 μM NMDA or 50 μM KA and were maintained for an additional 24 hr. glutamate and then maintained for 24 hr. Cell viability was measured by the MTT assay. Optical density of control, NMDA- and KA treated were 1.20 ± 0.10, 0.77 ± 0.05 and 0.85 ± 0.08, respectively. Viability was calculated as the same as Table 1. Values given represent the mean ± SD (n=3). Mean value is significantly different from the value for the NMDA- or KA-treated; *p<0.05, **p<0.01

표 4. Effects of deoxyschizandrin, gomisin N and wuweizisu C on intracellularCa²⁺([Ca²⁺]i) in glutamate-damaged primary cultured rat cortical cells.

[Ca²⁺]i Protection

(nM) (%)

Control 85.6 ± 15.9100.0

Glutamate-treated 419.0 ± 21.3 0.0

Deoxyshizandrin 350.7 ± 18.2 20.5

Gomisin N 218.0 ± 11.9*** 60.3

Wuweizisu C 192.6 ± 9.1*** 67.9

Rat cortical cultures were treated with compounds at the concentration of 1 μM for 1 hr before exposure to 100 μM glutamate and then maintained for 24 hr. Values given represent the mean ± SD (n=3). Mean value is significantly different from the value for the glutamate-treated; *** p < 0.001

표 5. Effects of deoxyschizandrin, gomisin N and wuweizisu C on nitric oxide (NO) content in glutamate-damaged primary cultured rat cortical cells.

Nitrite Protection

(nM) (%)

Control 90.2 ± 3.7100.0

Glutamate-treated 141.8 ± 5.7 0.0

Deoxyschizandrin 121.9 ± 3.1** 40.2

Gomisin N 111.4 ± 3.3*** 60.2

Wuweizisu C 107.6 ± 2.9*** 65.8

Rat cortical cultures were treated with compounds at the concentration of 1 μM for 1 hr before exposure to 100 μM glutamate and then maintained for 24 hr. Values given represent the mean ± SD (n=3). Mean value is significantly different from the value for the glutamate-treated; ***p<0.001

표 6. Effects of deoxyschizandrin, gomisin N and wuweizisu C on GSH-px activity in glutamate-injured primary cultured rat cortical cells.

GSH-px Protection

(μmol NADPH consumed/ (%)

min/mg protein)

Control 18.7 ± 2.7 100.0

Glutamate-treated 9.2 ± 3.3 0.0

Deoxyschizandrin 15.3 ± 3.0** 62.1

Gomisin N 14.6 ± 4.1** 56.8

Wuweizisu C 13.9 ± 3.9* 49.5

Rat cortical cultures were treated with compounds at the concentration of 1 μM for 1 hr before exposure to 100 μM glutamate and then maintained for 24 hr. Values given represent the mean ± SD (n=3). Mean value is significantlydifferent from the value for the glutamate-treated; *p<0.05, **p<0.01

표 7. Effects of deoxyschizandrin, gomisin N and wuweizisu C on GSH content in glutamate-injured primary cultured rat cortical cells.

GSH Protection

(μmol/mg protein) (%)

Control 6.9 ± 1.7100.0

Glutamate-treated 2.6 ± 0.7 0.0

Deoxyschizandrin 4.7 ± 1.1** 48.8

Gomisin N 4.8 ± 1.3** 51.2

Wuweizisu C 4.4 ± 0.9** 41.9

Rat cortical cultures were treated with compounds at the concentration of 1 μM for 1 hr before exposure to 100 μM glutamate and then maintained for 24hr. Values given represent the mean ± SD (n=3). Mean value is significantly different from the value for the glutamate-treated; **p<0.01

표 8. Effects of deoxyschizandrin, gomisin N and wuweizisu C on MDA content in glutamate-injured primary cultured rat cortical cells.

MDA Protection

(nmol/mg protein) (%)

Control 70.2 ± 4.9100.0

Glutamate-treated 198.2 ± 15.0 0.0

Deoxyschizandrin 135.4 ± 10.7** 49.2

Gomisin N 125.6 ± 11.1*** 57.0

Wuweizisu C 110.5 ± 9.0*** 68.7

Rat cortical cultures were treated with compounds at the concentration of 1μM for 1 hr before exposure to 100 μM glutamate and then maintained for 24 hr. Values given represent the mean ± SD (n=3). Mean value is significantly different from the value for the glutamate-treated; ** p < 0.01, *** p < 0.001

표 9. Inhibitory effects of deoxyschizandrin, gomisin N and wuweizisu C on m-calpain activities.

Concentration Inhibition IC₅₀

(μM) (%)(μM)

Control100.0 ± 0.0

Reference (Ca²⁺-untreated) 0.0 ± 0.0

Gomisin N 0.01 13.5 ± 1.4

0.1 44.3 ± 3.0** 0.112 ± 0.006

1.0 83.4 ± 5.2***

Wuweizisu C 0.1 4.1 ± 2.6

1.0 10.3 ± 0.3

Deoxyschizandrin 0.1 0.0 ± 1.8

1.0 0.0 ± 3.1

Leupeptin 0.01 63.0 ± 5.9*** 0.026 ± 0.003

0.1 85.2 ± 7.4***

Control is the value for treated with Ca²⁺. Reference is the value for untreated with Ca²⁺. Calpain activities of control and reference were 0.247±0.01 and 0.07±0.00 OD, respectively. Leupeptin is well known by protease inhibitor. Each value represents the mean ±SD (n=3). Inhibition is calculated as 100 × (OD of control - OD of compound-treated) + (OD of sample - OD of reference)/(OD of control- OD of reference). Mean value is significantly different from the value for the reference; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001

따라서 일반구조식 ( I )의 화합물은 뇌신경세포 사멸억제제 및 뇌졸중과 뇌허혈치료제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 일반구조식 ( I )의 화합물은 일일 1mg 내지 200mg을 1 내지 3회 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 환자의 체중, 성별, 나이 및 질병의 정도에 따라서 그 사용량을 증감할 수 있다.

본 발명의 일반구조식 ( I )의 화합물은 뇌신경세포 사멸억제제 및 뇌졸중과 뇌허혈치료제로서 사용될 수 있고, 이 화합물은 통상으로 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 약제학적으로 통상으로 하용되는 약학적 제제, 예를들면 주사제, 액제, 시럽제, 정제, 캡슐제 등으로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있다.

다음에 제제실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

제제실시예 1

화합물 1 10mg

주사용 멸균증류수 적량

pH조절제 적량

화합물 1을 주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한후 2ml용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제 실시예 2

화합물 2 2mg

주사용 멸균증류수 적량

pH조절제 적량

화합물 2를 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH조절제로 pH약 7.2로 조절하고 전체를 2ml로 한다음 2ml용량의 앰플에 충진하여 주사제를 제조한다.

제제실시예 3

화합물 3 10mg

유당 100mg

전분 100mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제실시예 4

화합물 1 10mg

유당 100mg

전분 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

제제실시예 5

화합물 2 5mg

유당 50mg

전분 50mg

탈크 2mg

스테아린산마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제실시예 6

화합물 I 5mg

유당 100mg

전분 93mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

제제실시예 7

화합물 3 50mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml 의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.

제제실시예 8

화합물 1 100mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml

1. 일반구조식 ( I )의 화합물은 글루타메이트로 신경독성을 유발시킨 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에서 유의성있는 뇌신경세포 보호 활성을 나타내었다.

2. 일반구조식 ( I )의 화합물은 글루타메이트로 인하여 세포 내로 과다하게 유입되는 Ca²⁺의 농도를 유의성 있게 저하시켰다.

3. 일반구조식 ( I )의 화합물은 글루타메이트로 인하여 감소된 glutathione peroxidase의 활성 및 glutathione의 양을 유의성있게 증가시켰다. 또한 글루타메이트로 인한 NO의 과다한 생성을 억제시켰으며, 지질과산화 또한 억제하였다.

4. 일반구조식 ( I )의 화합물은 Ca²⁺에 의하여 활성화되는 calpain의 활성을 유의성있게 저해하였으며 IC₅₀은 각각 0.112 μM이었다

5. 이상의 실험결과로 일반구조식 ( I )의 화합물은 뇌졸중 및 노화에 의한 뇌신경세포의 구조적 퇴화, 순환기 장애 등 다른 성인병에 기인한 2차적 증상, 또는 교통사고, 산업재해, 일산화탄소 중독 등 다양한 물리적, 기계적 요인에 의한 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방과 치료를 위한 의약제제로 사용될 수 있다.

Claims

다음 일반구조식 ( I )의 화합물의 뇌신경세포 사멸억제제 및 뇌졸중 및 뇌허혈 예방과 치료제로서의 용도.

(I)

상기식에서 R₁은 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 저급알킬기이며, R₂, R₃, R₄및 R₅는 각각 수소원자, 하이드록실기, 탄소수 1 내지 4의 저급알킬기 또는 탄소수 1 내지 4의 저급알콕시기이거나, 또는 R₂와 R₃및 R₄와 R₅는 각각 함께 결합하여 -OCH₂O-기를 형성할 수 있다.
다음 일반구조식 ( I )의 화합물을 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하고 통상의 약학적 제제의 제조방법으로 약학적 제제로 제제화시켜서 제조된 뇌신경세포 사멸억제 및 뇌졸중 및 뇌허혈 예방과 치료효과를 가지는 약학적 제제.

( I )

상기식에서 R₁은 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 저급알킬기이며, R₂, R₃, R₄및 R₅는 각각 수소원자, 하이드록실기, 탄소수 1 내지 4의 저급알킬기 또는 탄소수 1 내지 4의 저급알콕시기이거나, 또는 R₂와 R₃및 R₄와 R₅는 각각 함께 결합하여 -OCH₂O-기를 형성할 수 있다.