KR20020028896A - 돼지 서코바이러스의 재조합 폭스바이러스 백신 - Google Patents

돼지 서코바이러스의 재조합 폭스바이러스 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 서코바이러스 2에서 유래한 외래 DNA를 함유한 아비폭스 바이러스와 같은 재조합 폭스바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 숙주 동물에서 면역반응을 유발하는 재조합 폭스바이러스를 함유한 면역학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 면역학적 조성물을 돼지 서코바이러스 2 감염에 민감하거나 감염 치료가 필요한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 돼지 서코바이러스 2에 의해 유발되는 질병을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

돼지 서코바이러스의 재조합 폭스바이러스 백신 {PORCINE CIRCOVIRUS RECOMBINANT POXVIRUS VACCINE}
이유기 후의 전신성 소모성 증후군(PMWS)은 어린 돼지의 질병으로 최근 인정되고 있다. PMWS는 점진적인 체중의 감소 및 빈호흡, 호흡곤란 및 황달과 같은 기타 증상을 임상적인 특징으로 한다. 병인학적으로는 림프구성 및 육아종성 침윤, 림프절 병증, 및 드물게는 림프구성 및 육아종성 간염 및 신장염이 관찰되었다(Clark, 1997; Harding, 1997).
이 질병은 북미뿐 아니라 다른 유럽 국가에서도 보고된 적이 있다. 이 질병의 치료 및 예방은 현재로서는 가능하지 않다.
PMWS의 병인학적 약제로서 돼지 서코바이러스에 대한 몇 가지 분명한 점이 있다(Elliset al., 1998). PMWS에 걸린 돼지에서 서코바이러스가 회수되었고, 돼지 서코바이러스에 대한 항체가 그 병에 걸린 돼지에서 검출되었다.
서코바이러스는 동물과 식물 종의 범주에서 발견되는 단쇄의 환형 DNA 바이러스이다. 돼지 서코바이러스는 원래 무한증식성 돼지의 신장 세포주로부터 오염물로 분리되었다. 이 세포 배양 분리물은 PK-15로 지정되었다(Meehanet al., 1997). 최근, PMWS에 걸린 돼지로부터 얻은 돼지 서코바이러스를 PK-15와 비교하였다. 이러한 바이러스는 뉴클레오타이드 및 단백질 서열 수준에서 PK-15와 실질적으로 다르고, PCV2로 지정되었다(Meehanet al., Hamelet al., 1998).
13개의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 PCV2 게놈에서 동정되었다(프랑스 특허 출원 제98 03707호의 COL1 내지 COL13). 이들 ORF 중 4개는 PK-15의 게놈내의 유사한 ORF과 실질적인 상동성을 가진다. ORF1(Meehanet al., 1998; 프랑스 특허 출원 제98 03707호에서 COL4에 해당)은 nt 398-1342(GenBank 수탁번호 AF055392)를 포함하며, 37.7 kD의 예상 분자량을 가진 단백질을 코딩할 가능성이 있다. ORF2(Meehanet al., 1998; 프랑스 특허 출원 제98 03707호에서 COL13에 해당)는 1-314에 연결된 nt 1381-1768(GenBank 수탁번호 AF055392)을 포함하며, 27.8 kD의 예상 분자량을 가진 단백질을 코딩할 가능성이 있다. ORF3(Meehanet al., 1998; 프랑스 특허 출원 제98 03707호에서 COL7에 해당)은 nt 1018-704(GenBank 수탁번호 AF055392)를 포함하며, 11.9 kD의 예상 분자량을 가진 단백질을 코딩할 가능성이 있다. ORF4(Meehanet al., 1998; 프랑스 특허 출원 제98 03707호에서 COL10에 해당)는 nt 912-733(GenBank 수탁번호 AF055392)을 포함하며, 6.5 kD의 예상 분자량을 가진 단백질을 코딩할 가능성이 있다.
PCV2의 ORF1은 PK15 분리물의 ORF1(Meehanet al., 1998)과 높은 상동성(86% 동일)이 있다. PK-15의 ORF1 단백질은 부분적으로 밝혀졌다(Meehanet al., 1997; Mankertzet al., 1998a). 이것은 바이러스 복제를 위한 필수성분으로 알려져 있고, 아마도 바이러스성 DNA 복제에도 관여할 것이다.
각 ORF2들간의 단백질 서열의 상동성은 ORF1 들의 상동성보다 낮지만(66% 동일), ORF2 각각은 조류의 서코바이러스인 닭 빈혈 바이러스(CAV)의 주된 구조 단백질의 N-말단 부위에서 발견되는 것과 유사한 잘 보존된 염기성 N-말단 영역을 공유하고 있다(Meehanet al., 1998). 최근, Mankertzet al.(1998b)은 PK-15 분리물의 ORF2(Mankertzet al., 1998b에서 ORF1로 설정)가 캡사이드 단백질을 코딩한다고 제안한 바 있다.
PK-15 분리물과 PCV2의 ORF3들 및 ORF4들 사이에서는 더욱 큰 차이가 발견되었다. 각각의 경우에, PK-15 분리물의 게놈에 존재하는 해당 ORF과 비교하면 PCV2의 ORF4 및 ORF3의 C-말단 부위가 결실되어 있었다. 가장 높은 단백질 서열 상동성은 ORF3 및 ORF4의 N-말단 부위에서 관찰되었다(Meehanet al., 1998).
PCV2의 게놈의 전사 분석값은 아직 공개되지 않았다. PK-15 분리물에서 얻은 최근의 자료에서는 ORF2 전사체가 스플라이싱되어 있다는 것이 밝혀졌다(Mankertzet al., 1998b).
백시니아 바이러스는 1980년대에 천연두를 세계적으로 박멸하는 것을 최고점으로 하여 천연두를 성공적으로 면역하는 데 사용되고 있다. 천연두의 박멸 외에, 폭스바이러스의 새로운 역할은 외래 유전자의 발현을 유전자적으로 조작된 벡터로서 주요한 역할이 대두되고 있다(Panicadi and Paoletti, 1982; Paolettiet al., 1984). 이질 항원을 코딩하는 유전자를 백시니아에서 발현시키면, 종종 해당 병원체에 의한 접종에 대해 방어 면역이 이루어진다(Tartagliaet al., 1990). MVA로 명명된 고도로 약독화된 백신 균주도 폭스바이러스계 백신을 위한 벡터로 사용되고 있다. MVA의 용도는 미국 특허 제5,185,146호에 기재되어 있다.
2가지의 추가적인 백신 벡터 시스템은 천연 숙주-제한된 폭스바이러스, 아비폭스 바이러스의 사용을 포함한다. 파울폭스바이러스(FPV; Tayloret al., 1988a,b) 및 카나리폭스바이러스(CPV; Tayloret al., 1991 & 1992)는 모두 외래 유전자 산물을 발현시키도록 조작되었다. 파울폭스 바이러스(FPV)는 Poxvirus 과의 Avipox 속의 원형(prototypic) 바이러스이다. 이 바이러스는 약독화된 생백신을 사용하여 1920년대 이후 잘 방제되고 있는 가금류의 경제적으로 중요한 질병을 일으킨다. 아비폭스 바이러스의 복제는 조류 종에 한정되는 것으로(Matthews, 1982) 인간을 포함하는 비조류 종에서 생산성 감염을 일으키는 아비폭스바이러스에 관한 보고는 없다. 이러한 숙주 제한은 다른 종으로 바이러스가 전파되는 것에 대한 고유하고 안정한 장벽으로 제공되어 아비폭스 바이러스 계통의 백신 벡터를 수의학 및 인간에게 적용하는 데 매력적인 제안이 되고 있다.
FPV는 가금류의 병원체에서 유래한 항원을 발현시키는 벡터로서 유용하게 사용되어 왔다. 독성의 조류 인플루엔자 바이러스의 적혈구 응집소 단백질은 FPV 재조합체에서 발현시켰다(Tayloret al., 1988c). 닭 및 칠면조에 재조합체를 접종한 후, 동질 또는 이질의 독성 인플루엔자 바이러스 접종 중 하나에 대해 방어적인 면역반응이 유도되었다. 뉴캐슬병 바이러스의 표면 당단백질을 발현시키는 FPV 재조합체도 개발되었다(Tayloret al., 1990; Edbaueret al., 1990).
다른 약독화된 폭스바이러스 벡터는 바이러스의 야생형 균주의 유전자 변형에 의해 제조되었다. 백시니아의 코펜하겐 균주(Copenhagen strain) 유래의 특정 독소 및 숙주 범주의 유전자의 결실에 의해 유도된 NYVAC 벡터(Tartagliaet al., 1992)는 발현된 외래 항원에 대한 방어적 면역 반응을 일으키는 재조합 벡터로 유용하다는 것이 검증되었다.
다른 조작된 폭스바이러스 벡터로는 카나리폭스 바이러스로부터 유래된 ALVAC가 있다. ALVAC는 비조류 숙주에서 생산적인 복제를 하지 않고 안전성 프로필을 향상시킨다고 고려된다(Tayloret al., 1991 &1992). ALVAC 및 NYVAC는 BSL-1 벡터이다.
서브유닛 PCV2 백신의 개발을 위한 하나의 방안은 생 바이러스 벡터를 관련 PCV2 ORF를 발현시키는 데 사용하는 것이다. 재조합 폭스바이러스는 본 명세서에서 인용되고 있는 미국 특허 제4,769,330; 4,722,848; 4,603,112; 5,110,587; 5,174,993; 5,494,807; 및 5,505,941호에서 기재된 백시니아 바이러스 및 아비폭스 바이러스와 같은 폭스바이러스의 합성 재조합체를 제조하는 방법과 유사한 종래의 2단계 방법으로 제작될 수 있다. PCV2 재조합 폭스바이러스 및 이로부터 이루어진 조성물 및 산물, 특히 ALVAC 계통의 PCV2 재조합체 및 이로부터의 조성물 및 산물,특히 PCV2의 ORF1 및/또는 2를 함유하는 재조합체 및 이로부터 이루어진 조성물 및 산물은 현재의 기술에 대비해 매우 바람직한 이점이 있을 것이다.
본 발명은 재조합 벡터와 같은 벡터, 폭스바이러스(예를 들면 변형된 폭스바이러스)와 같은 재조합 바이러스 벡터 및 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 본 발명은 카나리폭스(canarypox) 바이러스, 예를 들면 ALVAC와 같은 재조합 아비폭스 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 돼지 서코바이러스 2(PCV2)의 유전자 산물, 예를 들면 항원, ORF, 및/또는 관심 에피토프를 발현하는 폭스바이러스와 같은 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PCV2 유전자 산물 및/또는 PCV2에 관한 면역반응 또는 대항하는 면역반응을 유도하는 폭스바이러스와 같은 벡터 및 바람직하게 항 PCV2 감염 면역학적 조성물, 면역원 조성물, 또는 백신 조성물 및/또는 항 PCV 감염의 방어 면역을 제공하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 벡터, 조성물, 및 이의 중간체를 제조하는 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 재조합 또는 폭스바이러스에 관한 용도 및 방법에 의해 이루어진 산물, 예를 들면 발현에 의해 이루어진 항체에 관한 것이다.
본 출원은 1999년 6월 10일자 미국 특허 출원 제60/138,478호 및 2000년 5월 31일자 미국 특허 출원을 우선권으로 주장하는 것이다. 1998년에 출원한 국제 특허 출원 공보 WO-A-99 18214호, 1997년 10월 3일, 1998년 1월 22일, 및 1998년 3월20일자 프랑스 특허 출원 제 97/12382, 98/00873, 및 98/03707호 및 WO99/29717호를 참조하였다. 상기의 각기 미국, PCT, 및 프랑스 출원서, 상기 미국, PCT, 및 프랑스 출원의 명세서 및 심사단계에서 인용된 문헌("출원서에서 인용된 문헌") 및 출원서에서 인용된 문헌에 인용되거나 참조된 문헌을 참조문헌으로 인용되고, 상기 미국, PCT, 및 프랑스 출원 각각에 기재된 기술 및 상기 미국, PCT, 및 프랑스 출원 각기의 명세서 및 심사 중에 인용된 문헌에 기재된 기술은 본 발명을 실시하는 데 사용될 수도 있다.
몇몇 공보는 본 명세서에서 인용되고 있다. 이들 문헌에 대한 완전한 문헌 정보는 명세서 상세한 설명 말미에서 특허청구의 범위 전에 기재되어 있다. 이들 문헌은 본 발명의 기술분야에 속하는 것으로, 본 출원에 인용되고 참조된 각각의 문헌("본 명세서에서 인용된 문헌") 및 본 명세서에서 인용된 문헌에 다시 인용되거나 참조된 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용된다.
본 발명은 다음의 첨부 도면을 참조하여 보다 잘 이해할 수 있을 것이다.
도 1(SEQ ID NO:1)은 C6 오픈 리딩 프레임을 함유한 ALVAC DNA의 3.7 kbp 단편의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 도면이다.
도 2는 pJP102 도너 플라스미드의 지도를 나타내는 도면이다.
도 3(SEQ ID NO:8)은KpnI(위치 653)으로부터SacI(위치 3166) 제한 자리까지의 pJP102 도너 플라스미드로부터 얻은 2.5 kbp 단편의 뉴클레오타이드 서열을나타내는 도면이다.
도 4는 pJP105 도너 플라스미드의 지도를 나타내는 도면이다.
도 5는 pJP107 도너 플라스미드의 지도를 나타내는 도면이다.
도 6(SEQ ID NO:11)은KpnI(위치 653)으로부터SacI(위치 4255) 제한 자리까지의 pJP107 도너 플라스미드로부터 얻은 3.6 kbp 단편의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 도면이다.
따라서, 본 발명의 목적은 PCV2에 의한 감염의 치료 및 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공하고자 하는 것이다. 또한, PMWS를 치료하거나 예방하기 위한 수단을 제공하고자 한다.
본 발명의 한 특징은 항원 조성물, 면역학적 조성물, 면역원 조성물 및 백신 조성물 및 이 조성물로 접종된 숙주 동물에서 항원 반응, 면역원성 반응 및 면역학적 반응을 일으키기 위한 치료제 조성물에 관한 것이다. 조성물은 담체 또는 희석제 및 재조합 폭스바이러스와 같은 재조합 바이러스를 포함하는 것이 바람직하다. 재조합 바이러스 또는 폭스바이러스는 PCV2로부터 ORF, 항원, 면역원, 또는 관심 에피토프를 코딩하는 외인성 핵산 분자 또는 항PCV2 면역학적 반응 또는 PCV2에 의해 유발되는 PMWS와 같은 증상을 일으키는 단백질을 포함하고 발현한다. 예를 들면 재조합 바이러스는 변형된 재조합 바이러스 또는 폭스바이러스, 예를 들면 그 내부에서 바이러스-코딩 유전자 기능체, 예를 들면 비필수적인 바이러스-코딩 유전자 기능체를 불활성화하여 그 재조합 바이러스가 약화된 독성 및 개선된 안전성을 가지도록 한 바이러스 또는 폭스바이러스이다. 본 발명은 또한 조성물에 사용된 바이러스 및 이 조성물 및 바이러스의 제조 방법 및 용도를 추가로 제공한다.
본 발명의 조성물에 사용된 바이러스는 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스 또는 아비폭스 바이러스, 예를 들면 파울폭스바이러스 또는 카나리폭스 바이러스가 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 ALVAC이다. 변형된 재조합 바이러스는 예를 들면 바이러스 게놈의 비필수 부위 내에 항원성 단백질, 예를 들면 PCV2 ORF1 및/또는 2와 같은 PCV2 ORF로부터 유래된 항원성 단백질을 코딩하는 이질 DNA 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 특징에서, 본 발명은 재조합 바이러스가 약화된 독성 및 개선된 안전성을 가지도록 불활성화된 비필수적인 바이러스-코딩 유전자 기능체를 가지는 변형된 재조합 바이러스를 함유하는 면역원 조성물에 관한 것이다. 이 변형된 재조합 바이러스는 예를 들면 바이러스 게놈의 비필수 부위 내에 항원 단백질(예를 들면 PCV2 ORF 특히 ORF1 및/또는 2에서 유래됨)을 코딩하는 이질 DNA 서열을 포함한다. 이때 조성물을 숙주에 투여하는 경우, 이 조성물은 항원 특이적 면역 반응을 유발할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 특징은 바이러스가 약화된 독성을 가지도록 불활성화된 비필수적인 바이러스-코딩 유전자 기능체를 가지는 변형된 재조합 바이러스에 관한 것이다. 이때, 변형된 재조합 바이러스는 이질의 공급원, 예를 들면 바이러스 게놈의 비필수적인 부위에 이질의 공급원으로부터 유래된 DNA를 추가로 포함한다. DNA는 PCV2 ORF1, ORF2, ORF3, 또는 ORF4(Meehanet al., 1998)의 일부 또는 전부와 같은 PCV2 유전자 또는 이로부터 유래된 관심의 에피토프를 코딩할 수 있다. 유전자 기능체는 독성 인자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 결실시키거나 또는 천연적인 숙주-제한적 바이러스를 이용함으로써 불활성화할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 바이러스는 폭스바이러스, 예를 들면 백시니아 바이러스 또는 파울폭스바이러스 또는 카나리폭스 바이러스와 같은 아비폭스 바이러스가 바람직하다.
바람직하게, 폭스바이러스 또는 바이러스 게놈에서 결실된 오픈 리딩 프레임 은 J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L - K1L, 및 I14L과 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다(이들 용어는 Goebelet al., 1990에 보고된 것임). 이점에서, 오픈 리딩 프레임은 티미딘 키나제 유전자, 출혈 부위, A형 봉입체 부위, 적혈구 응집 유전자, 숙주 범위 유전자 부위 또는 대형 서브유닛, 리보뉴클레오타이드 환원효소; 또는 이들의 조합을 포함한다.
백시니아 바이러스의 적합한 변형된 코펜하겐 균주는 NYVAC(Tartagliaet al., 1992) 또는 J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L-K1l 및 I4L 또는 티미딘 키나제 유전자, 출혈 부위, A형 봉입체 부위, 적혈구 응집소 유전자, 숙주 범위 부위 및 대형 서브 유닛, 리보뉴클레오타이드 환원 효소가 결실된 백시니아 바이러스로 확인되었다(본 발명의 실시에 유용한 NYVAC 및 NYVAC에서 부가적으로 결실되거나 불활성화된 벡터에 관해서 미국 특허 제5,364,773, 5,494,807 및 5,762,938호 참조).
바람직하게, 폭스바이러스 벡터는 ALVAC 또는 예를 들면 병아리 태아의 섬유아세포(Rentschler 백신 균주)를 200회 이상 연속 통과시켜 약독화된 카나리폭스 바이러스로서, 이로부터 얻은 마스터 시드를 아가 하에서 플라크 클론을 5회의 추가 통과를 통해 증폭시킨 4연속 플라크 정제를 실시하였다(ALVAC 및 TROVAC(본 발명의 실시에 유용한 약독화된 파울폭스 바이러스)에 대해 미국 특허 제 5,756,103 및 5,766,599호 참조; 향상된 발현을 가지는 벡터, 결실된 기능체를 가지는 벡터및 돼지 숙주에 대해 유용한 벡터(예를 들면 돼지 숙주에 유용한 벡터는 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스, 카나리폭스 바이러스 및 스윈폭스 바이러스를 포함하는 폭스바이러스를 포함할 수 있다)와 같이 본 발명을 실시하는 데 유용할 수 있는 벡터 및 "면역원 조성물", "면역학적 조성물", "백신" 및 "관심 에피토프"와 같은 용어 및 교시, 투여량, 투여 경로, 아주반트, 및 재조합 바이러스의 용도 및 이의 발현 산물에 대해 미국 특허 제6,004,777, 5,990,091, 5,770,212, 6,033,904, 5,869,312, 5,382,425, 및 WO 95/30018 참조)
본 발명의 또 다른 특징은 또한 재조합 폭스바이러스의 발현 산물 및 치료, 예방, 진단 또는 테스트를 위한 그의 항원 조성물, 면역학적 조성물, 또는 백신 조성물의 용도 및 DNA 프로브 및 PCR 프라이머를 제작하는 데 유용한 재조합 폭스바이러스로부터 유래된 DNA에 관한 것이다.
이하의 상세한 설명에서 이들 및 기타 실시예가 기재되어서 이들로부터 본 발명을 보다 분명하게 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 한 특징은 폭스바이러스 게놈의 비필수 부위에 PCV2로부터 유래된 DNA 서열을 포함하는 재조합 폭스바이러스와 같은 재조합 바이러스에 관한 것이다. 이 폭스바이러스는 파울폭스 바이러스, 특히 약독화된 파울폭스 바이러스, 또는 ALVAC와 같은 카나리폭스바이러스, 특히 약독화된 카나리폭스 바이러스와 같은 아비폭스 바이러스가 바람직하다.
본 발명에 따르면, 재조합 폭스바이러스는 외래의 PCV2 유전자의 유전자 산물을 발현시킨다. PCV2의 특정 ORF를 폭스바이러스 벡터에 삽입하고 얻어진 재조합 폭스바이러스를 사용하여 동물에 감염시켰다. PCV2 유전자 산물을 동물에서 발현시킨 결과 그 동물은 PCV2에 대해 면역반응을 일으켰다. 따라서 본 발명의 재조합 폭스바이러스를 면역학적 조성물 또는 백신에 사용하면 이것으로 한정되지는 않지만 방어적인 면역반응을 일으키는 수단을 제공하게 된다.
재조합 폭스바이러스-PCV2 또는 그의 발현 산물, 면역학적 조성물, 항원 조성물, 또는 백신 조성물 또는 치료제 조성물과 같은 본 발명의 조성물 또는 치료제조성물의 투여 방법은 비경구 경로(피부하, 근육내, 또는 피하)를 통한 것일 수 있다. 이러한 투여로 전신 면역 반응 및 체액성 또는 세포-매개된 반응이 일어난다.
더욱 일반적으로, 본 발명의 폭스바이러스-PCV2 재조합체, 항원, 면역학 또는 백신 폭스바이러스-PCV2 조성물 또는 치료제 조성물을 제약 기술 분야 및 수의학 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 표준 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 조성물의 함량은 의학 기술 분야 또는 수의학 기술분야의 당업자들이 특정 대상의 연령, 성별, 체중, 종족 및 상태와 같은 인자 및 투여 경로를 고려하여 결정할 수 있다. 이 조성물은 단독으로 투여하거나 또는 예를 들면 "다른" 면역학적, 항원 또는 백신 조성물 또는 치료제 조성물과 함께 투여하거나 후속하여 투여하여 다중 또는 "칵테일" 또는 조합 조성물 및 그의 채용되는 방법을 제공할 수 있다. 또한 투여 성분 및 방식(후속 또는 공동-투여) 및 투여량도 특정 대상의 연령, 성별, 체중, 종족, 및 상태 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 결정할 수 있다. 이점에 대해, 본 명세서에서 인용되는 광견병 조성물, 조합 조성물 및 이의 용도에 관한 미국 특허 제 5,843,456호를 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형의 예로는 구강, 비강, 항문, 질, 위내 등과 같은 구멍용의 현탁액, 시럽, 또는 보형제와 같은 액상 제제 및 비경구, 피하, 피부내, 근육내, 또는 정맥내 투여(예를 들면 주사 투여)용의 멸균 현탁 또는 에멀젼 제제를 포함한다. 이러한 조성물에서, 재조합 폭스바이러스 또는 항원은 멸균수, 생리 식염수, 글루코스 등과 같은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제와 미리 혼합될 수도 있다. 조성물을 동결건조시킬 수도 있다. 조성물은 습윤제, 에멀젼화제, pH완충제, 면역보강제, 겔화제, 또는 증점제, 방부제, 향미제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 소망의 투여 경로 및 제형에 따라 함유할 수 있다. 본 명세서에 인용된 "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE" 17판, 1985와 같은 교과서를 참조하여 곤란함 없이 적합한 제형을 제조할 수 있을 것이다. 적합한 용량을 이하의 실시예에 따를 수도 있다.
조성물은 아크릴산 또는 메타크릴산의 폴리머 및 말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 코폴리머에서 선택된 적어도 하나의 면역 보강제 화합물을 포함할 수 있다.
면역 보강제 화합물은 특히 당 또는 다가알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 폴리머가 바람직하다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)의 용어로 알려져 있다(Phameuropa Vol. 8, No. 2, 1999년 6월). 당업자는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록시기를 가지고, 적어도 3개의 하이드록시기의 수소 원자는 적어도 2개의 탄소원자를 가지는 불포화된 지방족 라디칼로 치환되는 폴리하이드록시화된 화합물과 가교결합된 아크릴 폴리머를 개시한 미국 특허 제2,909,462호(본 명세서에서 인용됨)를 참조할 수도 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 것으로, 예를 들면 비닐, 알릴, 및 기타 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 것이다. 불포화된 라디칼은 자체적으로 메틸과 같은 다른 치환기를 포함할 수도 있다. Carbopol(R)(BF Goodrich, Ohio, USA)의 제품명으로 시판되는 제품이 특히 바람직하다. 이 제품은 알릴 슈크로즈 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교결합된 것이다. 이들 중, Carbopol(R)974P, 934P 및 971P를 예로 들 수가 있다.
말레산 무수물 및 알케닐 유도체의 코폴리머 중에서, 선형 또는 가교결합된 말레산 무수물과 에틸렌의 코폴리머, 예를 들면 디비닐 에테르와 가교결합된 선상 또는 가교결합된 코폴리머인 EMA(R)(Monsanto)가 바람직하다. 본 명세서에서 인용되고 있는 1960년 6월 4일자의 J. Fieldset al., Nature,186: 778-780을 참조할 수도 있다.
이들 구조의 관점에서, 아크릴산 또는 메타크릴산 폴리머 및 EMA(R)코폴리머는 다음의 식의 기본 단위체로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 식에서,
R1및 R2는 상이하거나 동일한 것으로 H 또는 CH3를 의미하고,
x = 0 또는 1, 바람직하게 x = 1이고,
y = 1 또는 2이고, x + y =2임.
코폴리머 EMA(R)에서, x = 0이고 y = 2이다. 카보머에서는 x = y = 1이다.
이들 폴리머를 물에 용해시켜 산용액을 제조하여 백신 자체가 혼입될 면역 보강제 용액을 제공하도록 바람직하게는 생리적인 pH로 중화시켰다. 폴리머의 카르복시기는 부분적으로 COO-형태가 될 것이다.
바람직하게, 본 발명에 따르는 면역 보강제 용액, 특히 카보머는 바람직하게 염화나트륨의 존재하에서 증류수 내에서 제조하여 산성 pH의 용액을 얻었다. 이 저장 용액을 NaCl이 첨가된 물을 원하는 함량(소망의 최종 농도를 얻도록) 또는 실질적으로 그의 일부, 바람직하게 생리 식염수(NaCl 9 g/ℓ)를 한번에 또는 여러번 첨가하여 희석하고 함께 또는 이어서 바람직하게 NaOH로 중화(pH 7.3 내지 7.4)시켰다. 생리 pH의 용액은 특히 동결건조하여 저장되는 백신 액 또는 동결된 형태와 혼합하기 위한 것이다.
최종 백신 조성물에서 폴리머의 농도는 0.01% 내지 2 w/v%, 바람직하게 0.06 내지 1 w/v%, 더욱 바람직하게 0.1 내지 0.6w/v%가 될 것이다. 본 발명의 면역학적 조성물은 다른 돼지 병소로부터 유래된 적어도 하나의 면역원을 발현하는 적어도 하나의 약독화된, 불활성화된 또는 서브유닛의 생백신 또는 재조합 백신(예를 들면, 폭스바이러스의 벡터 또는 DNA 플라스미드)과 회합될 수 있다.
본 발명은 균등한 뉴클레오타이드 서열, 즉 고려된 유전자의 기능 또는 균주 특이성(타입 1 균주 및 타입 2 균주)을 변화시키기 않는 서열 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드을 코딩하고 발현시키는 벡터를 포함한다. 코드의 축퇴에 의해 달라진 서열도 물론 포함된다.
실시예에서 사용된 PCV-2서열은 Meechanet al.(Strain Imp.1010; ORF1 뉴클레오타이드 398-1342; ORF2 뉴클레오타이드 1381-314; 및 각각 1998년 9월 25일자 미국 특허 출원 제09/161,092호의 ORF4 및 ORF13 및 WO-A-99 18214의 COL4 및 COL13에 해당)에서 유래된 것이다. 다른 PCV-2 균주 및 이들의 서열은 A.L. Hamelet al., J. Virol. June 1998, vol72, 6:5262-5267 (GenBank AF027217) 및 I. Morozovet al., J. Clinical Microb. Sept. 1998 vol.36, 9:2535-2541, 및 GenBank AF086834, AF086835 및 AF086836 WO-A-9918214호에 공개된 것으로 Imp1008, Imp999, Imp1011-48285 및 Imp1011-48121이라 칭한다. 본 발명의 실시를 위해 이들 서열 또는 이들의 ORF 또는 항원 또는 관심 에피토프를 코딩하는 부위을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서 및 본 명세서에서 인용된 문헌에서 사용된 서열과 균등한 서열, 예를 들면 높은 극한 조건(예를 들면 Sambrooket al., 1998 참조)하에서 뉴클레오타이드 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함한다. 균등한 서열 중에서, 완전 서열, 예를 들면 관심 에피토프의 면역원성을 보존하는 유전자 단편을 예로 들 수도 있다.
PCV 타입 1과 2 사이의 전체 게놈의 상동성은 약 75%이다. ORF1에서는 약 86%이고, ORF2에 대해서는 약 66%이다. 반대로, 타입 2 내에서 게놈 사이의 상동성과 ORF 사이의 상동성은 일반적으로 95% 이상이다.
또한, ORF1에서 본 발명의 실시에 유용한 서열은 Imp1010 균주의 ORF1과 88% 이상, 바람직하게 90% 이상, 더욱 바람직하게 92% 또는 95% 이상의 상동성을가지는 균등한 서열이다. ORF2에서는 Imp1010 균주의 ORF2와 균등한 서열은 80% 이상, 바람직하게 85% 이상, 더욱 바람직하게 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가지는 서열이다.
Meehan 1998에 따르는 ORF1 및 ORF2는 각각 37.7 kD 및 27.8 kD의 예상 분자량을 가지는 단백질을 코딩할 가능성이 있다. ORF3 및 ORF4(Meehanet al., 1998에 따르면, WO-A-99 18214에서 각각 ORF7 및 ORF10에 해당)는 각각 11.9 kD 및 6.5 kD의 예상 분자량을 가지는 단백질을 코딩할 가능성이 있다. 이들 ORF의 서열은 GenBank AF055392에서도 구입할 수 있다. 이들은 플라스미드에 혼입될 수 있고 본 발명에 따르면 단독 또는 ORF1 및/또는 ORF2와 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명을 실시하는 데 1998년 9월 25일자 미국 특허 출원 제09/161,092호에 개시된 기타 ORF 1-3 및 5, 6, 8-9, 11-12(WO-A-99 18214호의 COL 1-3 및 5, 6, 8-9, 11-12) 또는 그의 관심 에피토프 또는 항원을 코딩하는 부위을 사용할 수도 있다. 예를 들면 단독 또는 서로 각기와의 조합 또는 ORF 1 및 2와의 조합 또는 그의 항원 또는 에피토프를 코딩하는 부위가 있다.
본 발명은 또한 예를 들면 본 명세서에서 인용된 다양한 PCV-2 균주의 ORF로부터 얻은 균등한 서열을 포괄한다. 상동성에 대해, 당업자는 균주 1010의 해당 ORF와 상기에 정의된 바와 같은 상동성을 가지는 ORF2 및/또는 ORF1을 가지는 PCV 균주에서 유래한 균등한 서열이 있다는 것을 판단할 수 있다.
Meehan에 따르는 ORF3에 대해, 균등한 서열은 Imp1010 균주의 ORF3과 예를 들면 80% 이상, 바람직하게 85% 이상, 더욱 바람직하게 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가진다. Meehan 1998에 따르는 ORF4에 대해, Imp1010 균주의 ORF4와 예를 들면 86% 이상, 바람직하게 90% 이상, 더욱 바람직하게 95% 이상의 상동성을 가진다.
예를 들면 WO-A-99 18214호에 개시된 서열과 같은 게놈 뉴클레오타이드 서열에서, MacVector(R)과 같은 표준 소프트웨어를 사용하여 ORF를 결정하는 것은 일상적인 기술이다. 또한, 균주 1010의 서열에 따라 게놈을 배열하고 균주 1010 ORF를 비교하여 당업자는 다른 균주(예를 들면 WO-A-99 18214 또는 본 명세서에서 인용된 다른 문헌에 기재된 다른 균주)의 게놈의 ORF를 용이하게 결정할 수 있다.
소프트웨어를 사용하거나 서열 배열을 만드는 것은 무리한 조작이 아니고 균등한 ORF 또는 핵산 분자에 바로 도달하도록 한다.
뉴클레오타이드 서열 상동성은 Myers 및 Miller의 "Align" 프로그램("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS4, 11-17, 1988, 본 명세서에서 참고로 인용됨)을 NCBI에서 구입하고 사용하여 결정할 수 있다. 대안 또는 부가적으로, 예를 들면 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 대해 "상동성" 또는 "동일성"이라는 용어는 두 서열간의 상동성의 정량적인 산출값을 가리킬 수 있다. 서열 상동성 %은 (N ref -N dif )*100/N ref 로 산출할 수 있다. 상기 식에서, N dif 는 배열된 경우 2개의 서열에서 동일하지 않은 잔기의 총 개수이고, N ref 는 서열 중 하나의 잔기의 총 개수이다. 따라서, DNA 서열인 AGTCAGTC는 AATCAATC 서열과 75%의 서열 유사성을 가질 것이다(N ref = 8; N dif = 2).
대안 또는 부가적으로 서열에 대해 "상동성" 또는 "동일성"은 두 서열의 배열을 Wilbur and Lipman 알고리즘(Wilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726, 본 명세서에 인용됨)에 따라 결정할 수 있는 경우, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 가진 위치의 개수를 두 서열 중 더 짧은 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 개수로 나눈 값을 의미한다. 알고리즘의 예를 들면 20 뉴클레오타이드의 윈도우 크기, 4 뉴클레오타이드의 워드 길이, 및 4의 갭 페널티를 사용하고 컴퓨터 보조 분석 및 배열을 포함하는 서열 데이터의 번역은 시판되는 프로그램(예를 들면 Intelligenetics™Suite, Intelligenetics Inc. CA)을 이용하여 편리하게 실행할 수 있다. RNA 서열을 DNA 서열과 유사하거나 어느 정도의 서열 동일성 또는 상동성을 갖는다고 말하는 경우, DNA 서열에서 티미딘(T)은 RNA 서열에서 우라실(U)과 동일한 것으로 간주된다.
본 발명의 범주에서 RNA 서열은 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. DNA 서열에서 티미딘(T)은 RNA 서열에서 우라실(U)과 동일한 것으로 간주한다.
부가 또는 대안적으로, 아미노산 서열의 유사성 또는 동일성 또는 상동성은 NCBI사에서 시판하는 BlastP 프로그램(Altschulet al., Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402, 본 명세서에서 인용됨)을 이용하여 결정할 수 있다. 다음의 참고문헌(본 명세서에서 참고로 인용됨)은 2개의 단백질의 아미노산 잔기의 상대적인 상동성 또는 동일성을 비교하기 위한 알고리즘을 제공하고, 상기에 대한 부가 또는 대안으로는 이들 참고문헌 내의 교시는 상동성 또는 동일성의 백분율을 결정하는 데 사용할 수 있다: Needleman SB and Wunsch CD, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins,"J.Mol.Biol. 48:444-453(1970); Smith TF and Waterman MS, "Comparison of Bio-sequences,"Advances in Applied Mathematics2:482-489(1981); Smith TF, Waterman MS and Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence fundtional domains,"Nucleic Acids Res., 11:2205-2220(1983); Feng DF and Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees,"J. of Molec. Evol., 25:351-360(1987); Higgins DG and Sharp PM, "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcompouter,"CABIOS, 5:151-153(1989); Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ, "Cluster W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through seqhence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice,Nucleic Acid Res., 22:4673-480(1994); and Devereux J, Haeberlie P and Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX,"Nucl. Acids Res., 12:387-395(1984).
본 발명은 성숙한 돼지 뿐 아니라 어린 돼지 및 임신한 암퇘지에게도 투여할 수 있다. 후자의 경우, 특히 신생아(모계 항체)에게 수동 면역이 가능하다. 바람직하게, 암퇘지는 분만 전; 및/또는 수태기 완료(serving) 전 및/또는 임신 중에 접종한다. 바람직하게, 적어도 하나의 접종을 수태기 완료(serving) 전에 실시한 후 임신 중, 예를 들면 임신 중반 (임신 약 6-8 주) 및/또는 임신 말기(임신 약 11-13주)에 접종을 실시한다. 따라서 짝짓기 및/또는 수태기 완료 전에 접종하고 임신 중에 추가 접종하는 것이 바람직하다. 이후, 각 수태기 완료 전 및/또는 임신 동안 바람직하게, 추가 접종은 임신 중에 이루어진다. 수퇘지도 예를 들면 짝짓기 전에 접종시킬 수 있다.
백신 접종된 암컷에서 나온 새끼 돼지와 같은 돼지는 생후 첫 주 내에 접종을 실시한다. 이러한 접종은 생후 1주 및/또는 2주 및/또는 3주 및/또는 4주 및/또는 5주(예를 들면 이유기 동안)에 실시된다. 바람직하게, 이러한 새끼 돼지는 2 내지 4주 후에 추가 접종을 실시한다.
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예에 의해 더욱 설명될 것이다.
(실시예)
본 발명의 바람직한 실시예에서는 폭스바이러스 게놈의 비필수 영역에서 PCV2로부터 유래한 DNA 서열을 함유하는 재조합 폭스바이러스에 관한 것이다. 재조합 폭스바이러스는 외래의 PCV 유전자의 유전자 산물을 발현시킨다. 특히, PCV2 단백질을 코딩하는 ORF2 및 ORF1 유전자가 분리되고, 특정화되고, ALVAC(카나리폭스 벡터) 재조합체에 삽입되었다. 사용된 분자 생물학 기술은 Sambrooket al.(1989)에 기재된 것이다.
세포주 및 바이러스 균주
Imp1010-Stoon으로 지정된 PCV2 균주는 이미 개시되어 있다(Meehanet al., 1998). 이것은 캐나다산의 병에 걸린 돼지로부터 장간막의 림프구 조직에서 분리하였다. PCV2 게놈의 클로닝법은 Meehanet al.(1998)에 의해 개시되었다. 플라스미드 pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14는 플라스미드 pGem-7Z(Promega, Madison, WI)의EcoRI 자리에 삽입된EcoRI 단편으로 PCV2 게놈을 함유한다.Imp.1010 PCV2 균주의 완전 뉴클레오타이드 서열은 Meehanet al.(1998)에 의해 결정되고 GenBank 수탁번호 AF055392로 구입할 수 있다.
부모의 카나리폭스 바이러스(Rentschler 균주)는 카나리의 백신 균주이다. 백신 균주는 야생형 분리물로부터 얻어지는 것이고 닭의 태아 섬유아세포 상에서 200회 이상 연속 통과하여 약독화시켰다. 아가 하에서 마스터 바이러스 시드에 4회 연속 플라크 정제를 실시하였다. 보존 바이러스를 시험관 내 재조합 테스트에서 부모의 바이러스로 사용한 후 5회의 부가적 통과를 통해 하나의 플라크 클론을 증폭시켰다. 카나리폭스 분리물이 정제된 플라크를 ALVAC로 지정하였다. ALVAC는 부다페스트 조약에 의거하여 American Type Culture Collection에 ATCC 수탁 번호 VR-2547로 1996년 11월 14월에 기탁되었다.
폭스바이러스 재조합체의 생성은 상이한 단계를 포함한다: (1) 폭스바이러스 게놈 내의 삽입 자리 측면의 서열("아암") 및 2개의 측면 아암 사이에 위치한 다수의 클로닝 자리(MCS)을 포함하는 삽입 플라스미드의 제작(예를 들면 실시예 1 참조); (2) 외래 유전자 발현 카세트가 삽입된 MCS 내에 삽입 플라스미드로 이루어진 도너 플라스미드의 제작(예를 들면 실시예 2 내지 5 참조); (3) 폭스바이러스 게놈의 적절한 위치 내에 외래 유전자 발현 카세트의 삽입 및 재조합 바이러스의 플라크 정제를 가능하게 하는 부모의 폭스바이러스의 도너 플라스미드 및 게놈의 아암 사이의 세포 배양물내에서의 시험관 내 재조합체(예를 들면 실시예 6 참조).
PCV2 재조합 면역원은 PCV1 면역원과 회합하여 동물을 항PMWS 면역화하는 데 사용할 수도 있다. 덜 바람직한 방식에서, PCV1 면역원은 PCV2 면역원없이 사용할수도 있다.
실시예 1
C6 자리에서 카나리폭스 삽입 플라스미드의 제작
도 1(SEQ ID NO:1)은 카나리폭스 DNA의 3.7 kb 단편의 서열이다. 서열의 분석에서 C6L로 지정된 ORF이 377번 위치에서 시작되어 2254번 위치에서 종결된다는 것이 나타나 있다. 하기에는 C6 ORF를 결실시키고 이것 대신 번역 및 전사 종결 신호가 측면에 연결된 다중 클로닝 자리(MCS)를 삽입하여 제작된 C6 삽입 플라스미드가 기재되어 있다. 380 bp의 PCR 단편을 올리고뉴클레오타이드 프라이머인 C6A1(SEQ ID NO:2) 및 C6B1(SEQ ID NO:3)을 이용하여 게놈의 카나리폭스 DNA로부터 증폭시켰다. 1155 bp의 PCR 단편을 올리고뉴클레오타이드 프라이머인 C6C1(SEQ ID NO:4) 및 C6D1(SEQ ID NO:5)을 이용하여 게놈의 카나리폭스 DNA로부터 증폭시켰다. 380 bp 및 1155 bp의 단편을 주형으로 함께 첨가하고 1613 bp PCR 단편을 올리고뉴클레오타이드 프라이머인 C6A1(SEQ ID NO:2) 및 C6D1(SEQ ID NO:3)을 이용하여 증폭하여 융합시켰다. 이 단편을SacI 및KpnI로 분해하고SacI/KpnI로 분해된 pBluescript SK+(Stratagene, La Jolla, Ca, USA)로 결찰시켰다. 얻어진 플라스미드인 pC6L을 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 이것은 C6의 카나리폭스 DNA 상류의 370 bp("C6 좌측 아암"), 백시니아의 초기 종결 신호, 6개의 리딩 프레임 내의 번역 종결 코돈,SmaI,PstI,XhoI 및EcoRI 자리로 이루어진 MCS, 백시니아의 초기 종결 자리, 6개 리딩 프레임 내의 번역 종결 코돈 및 1156 bp의 하류 카나리폭스 서열("C6 우측 아암")로 이루어진다.
외래 유전자와 결합된 백시니아 H6 프로모터를 포함하는 카세트(Tayloret al.(1988c), Guoet al.(1989), 및 Perkuset al.(1989))를 pC6L의SamI/EcoRI 자리 안으로 결찰시켜 pC6L로부터 플라스미드 pJP099를 유도하였다. 이 플라스미드 pJP099는 유일한EcoRV 자리 및 H6 프로모터의 3' 말단에 위치한 유일한NruI 자리 및 외래 유전자의 STOP 코돈과 C6 좌측 아암 사이에 위치한 유일한SalI 자리를 함유한다. 따라서 pJP099로부터 ∼4.5 kbEcoRV/SalI 또는NruI/SalI 단편은 플라스미드 서열(pBluescript SK+; Stratagene, La Jolla, CA, USA),EcoRV 또는NruI 자리까지 H6 프로모터의 5' 말단 및 2개의 C6 아암을 포함한다.
프라이머의 서열
프라이머 C6A1 (SEQ ID NO:2)
프라이머 C6B1 (SEQ ID NO:3)
프라이머 C6C1 (SEQ ID NO:4)
프라이머 C6D1 (SEQ ID NO:5)
실시예 2
PCV2 ORF2용 ALVAC 도너 플라스미드의 제작
PCV2를 포함하는 플라스미드 pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14를EcoRI로 분해하고 1768 bp의 단편을 분리하고 결찰하였다.
적절한 ALVAC 삽입 벡터 내에 PCV2 ORF2를 삽입하기 위해, 프라이머 JP760(SEQ ID NO:6) 및 JP773(SEQ ID NO:7)을 사용하여 1768 pb의 결찰된EcoRI 단편(상기 참조)은 PCV2 ORF2를 증폭하여 PCR J1304를 얻었다. 프라이머 JP760(SEQ ID NO:6)은EcoRV로부터 H6 프로모터의 3'말단 및 PCV2 ORF2의 5' 말단을 포함한다. 프라이머 JP773(SEQ ID NO:7)은 PCV2 ORF2의 3' 말단에 이어SalI 자리를 포함한다. PCR J1304의 산물은 이후EcoRV/SalI로 분해한 후 ∼750bp 단편을 pJP099 (실시예 1 참조) 유래의 ∼4.5 kbEcoRV/SalI 단편으로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드는 서열분석으로 확인하고 pJP102(도 2의 pJP02의 지도 및 도 3의 서열(SEQ ID NO:8) 참조)로 지정하였다. ORF2의 서열은 Gen Bank에서 수탁 번호 AF055392로 구입할 수 있는 서열과 매치된다. 도너 플라스미드인 pJP102(NotI로 선형화됨)를 시험관 내 재조합(IVR) 테스트에 사용하여 ALVAC 재조합 vCP1614(실시예 6 참조)를 제조하였다.
프라이머의 서열
JP760(SEQ ID NO:6)
JP773(SEQ ID NO:7)
실시예 3
PCV2 ORF2 및 ORF1용 ALVAC 도너 플라스미드의 제작
프라이머 JP774(SEQ ID NO:9) 및 JP775(SEQ ID NO:10)를 이용하여 플라스미드 pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI NO.14 상에서 PCV2 ORF1을 PCR에 의해 증폭시켜서 PCR J1311을 얻었다. 프라이머 JP774(SEQ ID NO:9)는NruI 유래의 H6 프라이머의 3' 말단 및 PCV2 ORF1의 5' 말단을 포함한다. 프라이머 JP775(SEQ ID NO:10)는 PCV2 ORF1의 3' 말단에 이어서SalI 자리를 포함한다. PCR J1311의 산물(∼1 Kb)을 pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 서열 분석으로 확인하고 pJP104로 지정하였다. ORF1의 서열을 GenBank에서 수탁번호 AF055392로 구입가능한 서열과 매치하였다. ∼940 pbNruI/SalI 단편을 pJP104로부터 분리하고 pJP099(실시예 1 참조)로부터 ∼4.5 kbNruI/SalI 단편으로 클로닝하여 제한 분석에 의해 확인된 플라스미드를 얻고 이것을 pJP105(도 4 참조)로 지정하였다. 도너 플라스미드인 pJP105를 사용하여 시험관 내 재조합 테스트(실시예 6에 설명되어 있음)에 사용하여 PCV2 ORF1을 발현시키는 ALVAC 재조합체를 제조할 수 있다.
pJP102(실시예 2 참조)로부터 얻은 ∼838 bpBamHI/SalI을 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편을 이용하여 평체화시키고(blunted) pJP105의 Klenow-평체 EcoRI 자리에 클로닝하였다. 클론을 제한 분석에 의해 삽입 방향을 확인하고 헤드-투-헤드 배열을 선택하였다. 플라스미드를 서열 분석에 의해 확인하고 pJP107(도 5의 pJP107의 지도 및 도 6의 서열(SEQ ID NO: 11) 참조)을 지정하였다. 도너 플라스미드 pJP107(NotI로 선형화됨)를 시험관 내 재조합 5(IVR) 테스트에 사용하여 ALVAC 재조합 vCP1615(실시예 6 참조)를 제조하였다.
프라이머의 서열
JP774(SEQ ID NO:9)
JP775(SEQ ID NO:10)
실시예 4
PCV1 ORF2용 ALVAC 도너 플라스미드의 제작
플라스미드 pGem-7Z 내에PstI 단편으로서 PCV1 게놈을 포함하는 플라스미드 pPCV1(B. Meehanet al., J. Gen. Virol, 1997, 78, 221-227)을 PCV1 ORF2를 증폭시키기 위한 주형으로 사용하였다.
적절한 ALVAC 삽입 벡터 내에 PCV2 ORF2를 삽입하기 위해, 프라이머 JP787(SEQ ID NO:12) 및 JP788(SEQ ID NO:13)을 사용하여 플라스미드 PCV1(상기 참조)로부터 PCV1 ORF1을 증폭시켜 PCR J1315을 얻었다. 플라스미드 JP787(SEQ ID NO:2)은EcoRV 유래의 H6 프로모터의 3'말단 및 ORF2에 이어서SalI 자리를 포함한다. PCR J1315의 산물은 이후EcoRV/SalI로 분해한 후 ∼750bp 단편으로서 pJP099(실시예 1 참조) 유래의 ∼4.5 kbEcoRV/SalI 단편으로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 서열 분석으로 확인하고 pJP113으로 지정하였다. ORF2의 서열은 Gen Bank에서 수탁 번호 U49186으로 구입할 수 있는 서열과 매치된다. 도너 플라스미드인 pJP113(NotI로 선형화됨)을 시험관 내 재조합(IVR) 테스트에 사용하여 ALVAC 재조합 vCP1621(실시예 7 참조)을 생산하였다.
프라이머의 서열
JP787(SEQ ID NO:12)
JP788(SEQ ID NO:13)
실시예 5
PCV1 ORF2 및 ORF1용 ALVAC 도너 플라스미드의 제작
플라스미드 pGem-7Z 내에PstI 단편으로서 PCV1 게놈을 포함한 플라스미드 pPCV1(상기 실시예 4 참조)을PstI로 분해시키고 1759 bp 단편을 분리하여 결찰시켰다.
프라이머 JP789(SEQ ID NO:14) 및 JP790(SEQ ID NO:15)을 이용하여 1759 bp의 결찰된 PstI 단편(상기 참조)으로부터 PCV1 ORF1을 PCR에 의해 증폭시켜서 PCR J1316을 얻었다. 프라이머 JP789(SEQ ID NO:14)는NruI유래의 H6 프라이머의 3' 말단 및 PCV1 ORF1의 5' 말단을 포함한다. 프라이머 JP790(SEQ ID NO:15)은 PCV1ORF1의 3' 말단에 이어서SalI 자리를 포함한다. PCR J1316의 산물(∼1 Kb)을 pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 서열 분석으로 확인하고 pJP114로 지정하였다. ORF1의 서열은 GenBank에서 수탁번호 AF49186으로 구입가능한 서열과 매치하였다. ∼970 pbNruI/SalI 단편을 pJP114로부터 분리하고 pJP099(실시예 1 참조) 유래의 ∼4.5 kbNruI/SalI 단편으로 클로닝하여 제한 분석에 의해 확인된 플라스미드를 얻고 이것을 pJP115로 지정하였다. 도너 플라스미드인 pJP115를 사용하여 시험관 내 재조합 테스트(실시예 7에 설명되어 있음)에 사용하여 PCV1 ORF1을 발현하는 ALVAC 재조합체를 제조할 수 있다.
pJP113(실시예 4 참조)로부터 얻은 ∼838 bpBamHI/SalI을 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편을 이용하여 평체화시키고 pJP115의 Klenow-평체EcoRI 자리에 클로닝하였다. 클론을 제한 분석에 의해 삽입 배향을 확인하고 헤드-투-헤드 배열을 선택하였다. 플라스미드를 서열 분석에 의해 확인하고 pJP117에 지정하였다. 도너 플라스미드 pJP111(NotI로 선형화됨)을 시험관 내 재조합(IVR) 테스트에 사용하여 ALVAC 재조합 vCP1622(실시예 7 참조)를 제조하였다.
프라이머의 서열
JP789(SEQ ID NO:14)
JP790(SEQ ID NO:15)
실시예 6
ALVAC-PCV2 재조합체의 제조
플라스미드 pJP102 (실시예 2 및 도 2 참조) 및 pJP107 (실시예 3 및 도 5 참조)을NotI으로 선형화하여서 이전에 기재된 인산칼슘 침전 방법(Panicali and Paoletti, 1982; Picciniet al., 1987)을 이용하여 ALVAC가 감염된 1차 CEF 세포로 트랜스펙션시켰다. 양성 플라크를 특정 PCV2 방사능 표지된 프로브에 대한 혼성화를 기준으로 선택하고 순수 군집이 얻어질 때까지 4회의 후속 플라크 정제를 실시하였다. 각각의 IVR 유래의 대표적인 플라크를 증폭시키고 얻어진 ALVAC 재조합체를 vCP1614 및 vCP1615로 지정하였다. vCP1614 바이러스는 ALVAC와 도너 플라스미드 pJP102 사이의 재조합의 결과물이고, ALVAC C6 자리내에 삽입된 PCV2 ORF2를 함유한다. vCP1615 바이러스는 ALVAC와 도너 플라스미드 pJP107 사이의 재조합의 결과물이고, ALVAC C6 자리 내에 삽입된 PCV2 ORF1을 헤드-투헤드 방향으로 함유한다.
유사한 방식으로, PCV2 ORF1만을 발현하는 재조합 ALVAC는 실시예 3에 기재된 도너 플라스미드 pJP 105를 사용하여 제조할 수 있다.
면역형광법
PCV2 단백질이 ALVAC 재조합체가 감염된 Vero 세포에서 발현되는 지를 결정하기 위해, 면역현광(IF) 분석을 실시하였다. 감염된 Vero 세포를 감염(약 10의 m.o.i.) 24시간 후에 PBS로 세척하였고, 실온에서 3분간 95%의 차가운 아세톤으로 고정하였다. PCV2 ORF1(PCV2 199 1D3GA & PCV2 210 7G5GD) 또는 ORF2(PCV2 1904C7CF, PCV2 190 2B1BC & PCV2 190 3A8BC)에 특이적인 5개의 단클론성 항체(MAb) 제제(하이브리도마 상층액)를 제1 항체로 사용하였다. 이들 특이적인 단클론성 항체를 Merial-Lyon으로부터 얻었다. 단클론성 항체를 본 명세서에서 인용된 다음의 문헌의 교시로부터 얻을 수도 있다: 본 출원서에서 참고로 인용되는 1998년의 WO-A-99 18214, 1997년 10월 3일, 1998년 1월 22일, 및 1998년 3월 20일자 프랑스 출원 제97/12382, 98/00873, 98/03707호 및 WO 99/29717호. IF 반응은 Tayloret al.(1990)에 의해 기재된 바와 같이 실시되었다.
3가지의 ORF2-특이 항체에 대한 PCV2 특이적 면역형광을 vCP1614로 감염된 세포 및 vCP1615로 감염된 세포에서 측정하였다. 2가지의 ORF1-특이 항체에 대한 PCV2 특이적 면역형광을 vCP1615 만으로 감염된 세포에서 측정하였다. 결과에서는 기대한 바와 같이, vCP1614는 ORF2만을 발현시키지만, vCP1615는 ORF1 및 ORF2모두를 발현시키는 것으로 나타났다. ALVAC 감염된 Vero 세포와 감염되지 않은 Vero 세포 모두에서 형광이 검출되지 않았다.
실시예 7
ALVAC-PCV1 재조합체의 제조
플라스미드 pJP113 (실시예 4 참조) 및 pJP117 (실시예 5 참조)을NotI으로 선형화하여서 이전에 기재된 인산칼슘 침전 방법(Panicali and Paoletti, 1982; Picciniet al., 1987)을 이용하여 ALVAC로 감염된 1차 CEF 세포로 트랜스펙션시켰다. 양성 플라크를 특정 PCV1 방사 표지된 프로브에 대한 혼성화를 기준으로 선택하고 순수 군집이 얻어질 때까지 4회의 후속 플라크 정제를 실시하였다. 각각의IVR 유래의 대표적인 플라크를 증폭시키고 얻어진 ALVAC 재조합체를 vCP1621 및 vCP1622로 지정하였다. vCP1621 바이러스는 ALVAC와 도너 플라스미드 pJP113 사이의 재조합의 결과물이고, ALVAC C6 자리내에 삽입된 PCV1 ORF2를 함유한다. vCP1622 바이러스는 ALVAC와 도너 플라스미드 pJP117 사이의 재조합의 결과물이고, ALVAC C6 자리 내에 삽입된 PCV1 ORF2 및 ORF1을 헤드-투-헤드 방향으로 함유한다.
유사한 방식으로, PCV1 ORF1만을 발현하는 재조합 ALVAC는 실시예 5에 기재된 도너 플라스미드 pJP 115를 사용하여 제조할 수 있다.
면역형광법
PCV1 단백질이 ALVAC 재조합체가 감염된 Vero 세포에서 발현되는 지를 결정하기 위해, 면역현광(IF) 분석을 실시하였다. 감염된 Vero 세포를 감염(약 10의 m.o.i.) 24시간 후에 PBS로 세척하였고, 실온에서 3분간 95%의 차가운 아세톤으로 고정하였다. 특이적인 항-PCV1 돼지 다중클론성 혈청(Allan G.et al., Vet. Mirobiol., 1999, 66:115-123)을 제1 항체로 사용하였다. IF 반응은 Tayloret al.(1990)에 의해 기재된 바와 같이 실시되었다.
PCV1 특이적 면역형광을 vCP1621로 감염된 세포 및 vCP1622로 감염된 세포에서 측정하였다. 결과에서는 기대한 바와 같이, vCP1621 및 vCP1622는 PCV1-특이적 산물을 발현시키는 것으로 나타났다. ALVAC 감염된 Vero 세포와 감염되지 않은 Vero 세포 모두에서 형광성이 측정되지 않았다.
실시예 8
CARBOPOL™974P를 가진 재조합 카나리폭스 바이러스의 제조
백신의 제조를 위해 재조합 카나리폭스 바이러스 vCP1614 및 vCP1615(실시예 6)를 카보머 용액과 혼합할 수 있다. 동일한 방식으로, 재조합 카나리폭스 바이러스 vCP1621 및 vCP1622(실시예 7)를 카보머 용액과 혼합할 수 있다. 본 발명에 따르는 돼지의 백신화에 사용된 카보머 성분은 BF Goodrich사에서 제조된 Carbopol™974P(분자량 #3,000,000)이다. 먼저, 1.5% Carbopol™974P 보존 용액은 염화나트룸 1 g/ℓ을 함유한 증류수에서 제조하였다. 보존 용액을 4 ㎎/㎖의 Carbopol™974P 용액을 제조하는 데 사용하였다. 이 보존 용액을 필요한 양의 생리수와 단일 단계 또는 여러 연속 단계로 혼합하여 각 단계에서 pH 값을 1N(그 이상의 농도)의 수산화 나트륨 용액으로 조정하여 7.3-7.4의 최종 pH값을 얻었다. 이 최종 Carbopol™974P 용액은 동결건조된 재조합 바이러스를 재조성하거나 농축된 재조합 바이러스 모액을 희석하기에 용이한 용액이다. 예를 들면 2 ㎖의 용량당 10e8 pfu를 함유하는 최종 바이러스 현탁액을 얻기 위해, 10e9 pfu/㎖ 보존 용액 0.1㎖를 상기 Carbopol™974P 4 ㎎/㎖의 사용에 용이한 용액 1.9 ㎖로 희석할 수 있다. 동일한 방식으로 Carbopol™974P 2 ㎎/㎖의 사용에 용이한 용액을 제조할 수 있다.
실시예 9
돼지의 면역전종 및 재접종
9.1 생후 1일령의 새끼 돼지의 면역접종
제왕절개로 유도된 0일된 새끼 돼지의 군을 분리시켜 놓았다. 새기 돼지를 2일째에 다양한 백신 용액으로 근육내 경로에 의해 면역접종시켰다. 재조합 바이러스 모액을 멸균 식염수(NaCl 0.9%)로 희석시켜서 백신 바이러스의 현탁액을 제조하였다. 바이러스 현탁액을 위한 적합한 범위는 106내지 1010범위이고 바람직하게는 약 1010으로 결정될 수 있다. 실시예 8에 기개된 바와 같이 Carbopol™974P의 용액과 혼합하여 백신 용액을 제조할 수도 있다.
새끼 돼지는 다음 중 하나로 면역접종된다:
재조합 바이러스 vCP1614(실시예 2);
재조합 바이러스 vCP1615(실시예 3);
Carbopol과 혼합된 재조합 바이러스 vCP1614(4 ㎎/㎖ 용액); 또는
Carbopol과 혼합된 재조합 바이러스 vCP1615(4 ㎎/㎖ 용액).
바이러스 현탁액은 1회 분량당 108플라크 형성 단위(pfu)를 함유한다. 각 바이러스 현탁액은 1 ㎖의 용량으로 근육내 경로로 투여한다. 근육내 주사는 목의 근육으로 투여된다.
바이러스 현탁액의 2회 주사는 실험 2일째와 4일째에 투여된다. 접종은 PCV-2 독성 균주의 배양물로부터 얻은 바이러스 현탁액을 비구강 투여에 의해 21일째에 실시하였다. 접종 후, 3주 동안 이유후 전신성 소모성 증후군의 특징적인 새끼 돼지의 임상적 징후를 감시하였다. 다음의 징후에 대해 점수를 매겼다.
직장 온도: 접종후 2주 동안 매일 조사한 후, 3주째 직장 온도를 2회 측정.
체중: 접종 직전에 돼지의 무게를 재고 재접종 후 처음 3주동안 주마다 무게를 쟀다.
혈액 샘플을 실험 2일, 14일, 21일, 28일, 35일, 및 42일째에 채취하여 바이러스 혈중 수치를 조사하고 항 PCV-2 특이적 항체의 타이터를 조사하였다.
부검: 42일째, 모든 생존하고 있는 새끼 돼지를 인도적으로 안락사시키고 특정 PMWS의 거시적 병변을 관찰하기 위해 부검하였다. 간, 림프절, 비장, 신장, 및 흉선으로부터 조직 샘플을 준비하여 특정 해부학적 병변을 관찰하였다.
9.2 생후 5-7주령의 새끼돼지의 면역접종
항 PCV-2 특이적 모계 항체가 없는 5-7주령의 새끼 돼지를 다양한 백신 용액으로 근육내 경로에 의해 면역접종하였다. 백신 바이러스 현탁액은 멸균 생리수(NaCl 0.9%)내에 재조합 바이러스물을 희석하여 제조하였다. 백신 용액은 재조합 바이러스 현탁액을 실시예 8에 기재된 바와 같이 Carbopol™974P 용액과 혼합하여 제조할 수도 있다.
새끼 돼지는
재조합 바이러스 vCP1614(실시예 2);
재조합 바이러스 vCP1615(실시예 3);
Carbopol과 혼합된 재조합 바이러스 vCP1614(4 ㎎/㎖ 용액); 또는
Carbopol과 혼합된 재조합 바이러스 vCP1615(4 ㎎/㎖ 용액) 중 하나로 면역접종된다.
바이러스 현탁액은 1회분량당 108플라크 형성 단위체(pfu)를 함유한다. 각 바이러스 현탁액은 2 ㎖의 용량으로 근육내 경로로 투여한다. 근육내 주사는 목의 근육으로 투여되는 것이다. 바이러스 현탁액의 2회 주사는 실험 0일째와 21일째에 투여된다. 접종은 PCV-2 독성 균주의 배양물로부터 얻은 바이러스 현탁액을 비구강 투여에 의해 35일째에 실시하였다. 접종 후, 8주 동안 이유 후 전신성 소모성 증후군의 특징적인 새끼 돼지의 임상적 징후를 감시하였다. 총 관찰 기간이 3주가 아니고 8주인 것을 제외하고 임상적 관찰은 실시예 9.1에 기재된 바와 동일하다.
부검은 재접종에 의해 죽은 돼지에 대해서는 실험 기간 내에 실시하고 생존한 돼지는 실험이 종료된 시점(97일째)에 실시하였다. 조직 샘플은 실시예 9.1에 기재된 바와 동일하다.
9.3 신생아 새끼 돼지 새끼의 면역접종
3 또는 4마리의 새끼 돼지의 군을 제왕절개 0일에 격리기에 넣었다. 2일째의 새끼돼지를 vCP1614, vCP1615 또는 부모의 ALVAC 벡터로 목의 측면에 근육내 경로에 의해 백신 접종하였다. 백신 또는 플라시보의 2차 접종은 14일째에 투여하였다. 새끼 돼지는 ALVAC 재조합물에 의한 면역접종을 잘 참았고 면역 접종에 대한 부작용은 나타나지 않았다. 21일째에 새끼돼지는 각 콧구멍으로 1 ㎖의 PCV-2 바이러스 현탁물을 구비강 투여에 의해 재접종하였다. 45일째에, 부검을 실시하고 조직의 샘플을 바이러스 분리를 위해 수집하였다.
부검 결과
PMWS는 일반적으로 림프선종을 특징으로 하고 드물게는 간염 또는 신장염이 나타난다. 림프절에서의 총체적인 관찰 결과를 다음의 방식으로 점수를 매겼다: 0 = 림프절의 가시적인 확대가 전혀 없는 경우; 1 = 기관지 림프절로 제한된 약한 림프절의 확대가 있는 경우; 2 =기관지 림프절로 제한된 중간 정도의 림플절 확대; 3 = 기관지, 턱밑의 견갑골 및 서혜부의 림프절에 이르는 심한 림프절의 확대.
군 점수
vCP1614 0.5
0.0
0.0
1.0
평균 0.38
표준 편차 0.48
vCP1615 0.0
0.5
0.5
1.0
평균 0.5
표준 편차 0.41
대조군 2.0
2.5
2.5
2.5
평균 2.38
표준편차 0.25
기관지 림프선종은 뚜렷하게 총체적으로 발견되었다. 대조군과 관련된 림프절 병변이 vCO1614 및 vCP1615로 면역접종한 후 감소가 유의적으로(p ≤0.05) 관찰되었다.
본 발명의 바람직한 실시예에 설명되었지만, 당업자는 본 발명은 첨부한 특허청구의 범위에 의해 한정되는 것이고, 상기 설명에 구체적으로 기재된 바로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상 또는 범주에서 이탈됨 없이 다수의 변형이 가능하다는 것을 알 수 있을 것이다.
참고문헌
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Claims (20)

  1. 돼지 서코바이러스 2에서 유래한 DNA를 포함하는 재조합 바이러스
  2. 제1항에 있어서,
    폭스바이러스인 재조합 바이러스.
  3. 제2항에 있어서,
    아비폭스 바이러스인 재조합 바이러스.
  4. 제3항에 있어서,
    ALVAC인 재조합 바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    돼지 서코바이러스 2에서 유래한 DNA가 돼지 서코바이러스의 주요 캡사이드 단백질 또는 관심 에피토프를 코딩하고 발현하는 재조합 바이러스.
  6. 제4항에 있어서,
    돼지 서코바이러스 2에서 유래한 DNA가 돼지 서코바이러스의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2)를 포함하는 재조합 바이러스.
  7. 제4항에 있어서,
    돼지 서코바이러스 2에서 유래한 DNA가 돼지 서코바이러스의 오픈 리딩 프레임 1(ORF1)을 포함하는 재조합 바이러스.
  8. 제4항에 있어서,
    돼지 서코바이러스 2에서 유래한 DNA가 돼지 서코바이러스의 오픈 리딩 프레임 1 및 2(ORF1 및 2)를 포함하는 재조합 바이러스.
  9. 제4항에 있어서,
    vCP1614 또는 vCP1615인 재조합 바이러스.
  10. 제1항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
  11. 제5항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
  12. 제6항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
  13. 제7항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
  14. 제8항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
  15. 제9항의 재조합 바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 조성물을 숙주에 접종하여 면역 반응을 유도하는 면역학적 조성물.
  16. 제11항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
  17. 제12항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
  18. 제13항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
  19. 제14항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
  20. 제15항에 따른 면역학적 조성물을 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유발하는 방법.
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