KR20020026427A - 기체상 이온 분광계용 탐침 - Google Patents

기체상 이온 분광계용 탐침 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표면, 및 표면 상에 하이드로겔을 가지는 기재를 포함하고, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침(probe) 및 탐침의 제조 방법을 제공하는데, 상기 하이드로겔 물질은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함한다. 또한, 본 발명은 표면, 및 표면 상에 직경이 거의 균일한 다수의 입자들을 포함하고, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침 및 탐침의 제조 방법을 제공하는데, 상기 입자들은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 탐침; 및 탐침 표면에 빛을 향하게 하여 분석물질을 탈착시키는 에너지 공급원, 및 탐침 표면과 연통하며 탈착된 분석물질을 검출하는 검출기를 포함하는 기체상 이온 분광계를 포함하는 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 탐침 표면으로부터 분석물질을 탈착시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 분석물질과 결합 작용기 사이의 결합을 가능하게 하는 조건 하에 분석물질 함유 샘플에 결합 작용기를 노출시키는 단계; 및 기체상 이온 분광계에 의해 탐침으로부터 분석물질을 탈착시키는 단계를 포함한다.

Description

기체상 이온 분광계용 탐침{PROBES FOR A GAS PHASE ION SPECTROMETER}
[관련 출원의 참고]
본 출원은 1999. 4. 29. 출원된 가출원 U.S.S.N 60/131,652에 기한 우선권을 주장하는데, 상기 가출원의 명세서 기재 내용 전부를 본 명세서에 참고로 인용한다.
[연구·개발에 있어서의 공동 후원하에 이루어진 발명에 대한 권리에 관한 선언]
적용없음
전통적으로, 질량 분석에 의한 생물학적 샘플의 분석은 레이저와 같은 이온화 공급원을 사용하는, 물질의 소규모 샘플의 이온화 및 탈착을 포함한다. 물질는 이온화 공급원에 의해 기체상 또는 증기상으로 탈착되고, 그 과정에서 개별 분자의 일부가 이온화된다. 이어서, 이온화된 분자는 질량 분석기에 의해 분산될 수 있고, 검출기에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 고속(time-of-flight) 질량 분석기에 있어서, 양(+)으로 하전되고, 이온화된 분자들은 짧고 높은 전압장(voltage field)을 통해 가속되고, 고속 진공 체임버로 날아가게(표류하게) 되는데, 상기 체임버의말단에서 상기 분자들은 감수성 검출기 표면을 강타한다. 고속은 이온화된 분자의 질량 작용이기 때문에, 이온화와 충돌 사이에 경과된 시간은 특정 질량을 가지는 분자의 존부를 동정하는데 사용될 수 있다.
탈착 질량 분석은 약간의 시간이 걸린다. 그러나, 거대 완전(intact) 생체고분자(예: 단백질 및 핵산)의 분자량을 측정하는 것은 어려운데, 이는 상기 생체고분자가 탈착시 단편화(파괴)되기 때문이다. 이러한 문제는 화학 매트릭스를 사용함으로써 해소된다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)에 있어서, 분석물질 용액은 매트릭스 용액(예컨대, 산성이고 자외선 흡수성인 거대 분자량의 매트릭스 용액 과량)과 혼합한다. 상기 혼합물이 불활성 탐침 표면 상에 침착된 후 결정화되고, 결정 내의 분석물질이 포착된다. 상기 매트릭스는 레이저 에너지를 흡수하고, 그것을 분석물질에 명확하게 분배함으로써 탈착 및 이온화를 야기하도록 선택된다. 미국 특허 제5,118,937호(Hillenkamp 등) 및 미국 특허 제5,045,694호(Beavis & Chait)를 참조하라.
최근, MALDI보다 유의성있게 향상된 표면 증강 레이저 탈착/이온화(SELDI)가 개발되었다. SELDI에 있어서, 탐침 표면은 탈착 공정에 있어서의 활성에 관여한다. SELDI의 한 버전은, 중요 분석물질을 선택적으로 포착하는 표면 화학작용이 있는 탐침을 사용하는 것이다. 예를 들어, 탐침의 표면 화학작용은 분석물질의 공유 또는 비공유 부동화의 산소 의존성, 탄소 의존성, 황 의존성 및/또는 질소 의존성 수단에 기초한 결합 작용기를 포함한다. 탐침의 표면 화학작용은 결합된 분석물질이 보류되도록 하며, 비결합 물질이 씻겨 나가도록 한다. 연이어, 탐침 표면에 결합된분석물질은 탈착시키고 질량 분석법을 사용하여 분석할 수 있다. 이 방법은 샘플을 탈착시키고 샘플 제조의 임의의 중간 단계(예: 샘플 표지 및 정제)없이 직접 분석할 수 있다. 따라서, SELDI는 분석 물질의 직접 검출용 단일 통합 작동 시스템을 제공한다. SELDI 및 그 개량 버전은 미국 특허 제5,719,060호(Hutchens & Yip) 및 WO98/59361(Hutchens & Yip)에 기재되어 있다.
전술한 탈착 방법은 분리학 및 분석 생화학 분야에서 무한정 응용된다. 예를 들어, 세포 표면 또는 가용성 수용체를 탐침 표면에 부착시켜 리간드를 스크리닝할 수 있다. 이어서, 탈착 및 이온화에 의해 결합된 리간드를 분석할 수 있다. 또한, 핵산 분자들을 탐침 표면에 부착시켜 복합체 용액으로부터 생체분자들을 포획할 수 있다. 이어서, 탈착 및 이온화에 의해 핵산에 결합된 생체분자들을 단리하고 분석할 수 있다. 또한, 탐침 표면에 부착된 항체는 특정 항원을 포획하고 동정하는데 사용될 수 있다. 이어서, 탈착 및 이온화에 의해 항체에 특이적으로 결합된 항원을 단리하고 분석할 수 있다.
전술한 탐침이 분리학 및 분석 생화학 분야에 위대한 도구를 제공하지만, 증가된 수용능력 및 감수성을 제공하는 표면 화학작용을 가지는 탐침을 개발하는 것이 바람직하다. 분석에 유용한 샘플의 양이 매우 작거나 제한된 경우, 증가된 검출 감수성이 있는 탈착 시스템을 보유하는 것이 바람직하다. 또한, 탐침 상의 결합된 분석물질의 일관된 질량 분해능 및 강도를 제공할 수 있는 탐침을 개발하는 것이 바람직하다.
[발명의 개요]
본 발명은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질을 결합시키는 결합 작용기를 가지는 하이드로겔 물질을 포함하는 기체상 이온 분광계용 탐침을 처음으로 제공한다. 하이드로겔 물질은 가교된 수불용성 및 수팽윤성 중합체이고, 그 중량의 10배 이상, 바람직하게는 100배 이상의 액체를 흡수할 수 있다. 분석물질을 포함하는 액체 용액의 침출시에 팽윤됨으로써, 하이드로겔 물질은 결합 작용기 이 존재하는 3차원 비계(scaffolding)을 제공한다. 이는 증가된 검출 감수성을 야기시킬 수 있도록 유의성있는 보다 고도의 분석물질 수용능력을 가지는 탐침 표면을 산출한다. 또한, 하이드로겔 물질의 친수성 성질은 생체분자(예: 단백질)의 비특이성 결합을 감소시킨다. 또한, 하이드로겔 물질의 다공성 성질은 비결합 샘플 성분이 세척 단계 중 용이하게 씻겨 나가도록 한다.
또한, 본 발명은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질을 결합시키는 결합 작용기를 가지는 균일 입자를 포함하는 기체상 이온 분광계용 탐침을 처음으로 제공한다. 입자의 크기 또는 직경은 균일하기 때문에, 기재 표면 상에 입자의 균일 배치를 제공한다. 상기 탐침은 탐침으로부터 탈착된 분석물질의 일관된 질량 분해능 및 강도를 제공한다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명은 표면, 및 표면 상의 하이드로겔 물질을 가지는 기재를 포함하고, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침을 제공하는데, 여기서 상기 하이드로겔은 가교되어 있으며, 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 기재는 대상(帶狀; strip) 또는 평판 형태이다.
다른 구체예에 있어서, 기재는 전기 전도성이 있다.
다른 구체예에 있어서, 기재는 하이드로겔 물질을 부착하도록 상태 조절한다.
다른 구체예에 있어서, 기재의 표면은 금속 코팅, 산화물 코팅, 졸 겔, 유리 코팅 또는 커플링제로 상태 조절한다.
다른 구체예에 있어서, 기재의 표면은 거칠거나, 다공성이거나 또는 미세다공성이다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 원 위치에서 기재의 표면 상에 중합시킨다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 예비 작용화된(pre-functionalized) 단량체를 사용하여 원 위치에서 기재의 표면 상에 중합시킨다.
다른 구체예에 있어서, 탐침은 유리 코팅으로 피복하고, 하이드로겔 물질은 유리 코팅 상에 단량체 함유 용액을 침착시킴으로써 원 위치에서 유리 코팅 상에 중합시키는데, 상기 단량체는 예비 작용성이 있어 결합 작용기를 제공한다.
다른 구체예에 있어서, 코팅 및 결합된 하이드로겔 물질의 두께는 약 1 마이크로미터 이상이다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질의 두께는 약 1 마이크로미터 이상이다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 불연속 패턴 형태이다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 불연속 및 이산 반점 형태이다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 연속성이 있으며, 1종 이상의 결합 작용기의 1차원 또는 2차원 그래디언트(gradient)를 가진다.
다른 구체예에 있어서, 상이한 결합 작용기를 포함하는 다수의 상이한 하이드로겔 물질은 기재의 표면 상에 있다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 단독 중합체, 공중합체 또는 혼합형 중합체이다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 치환된 아크릴아미드 단량체, 치환된 아크릴레이트 단량체 또는 이들의 유도체로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는, 염 촉진성(salt-promoted) 상호작용, 친수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 배위 상호작용, 공유 상호작용, 효소 부위 상호작용, 가역 공유 상호작용, 비가역 공유 상호작용, 당단백질 상호작용, 생체특이성 상호작용 또는 이들의 조합에 의해 분석물질을 유인한다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질의 결합 작용기는 카르복실기, 설포네이트기, 포스페이트기, 암모늄기, 친수성기, 소수성기, 반응성기, 금속 킬레이트기, 티오에테르기, 비오틴기, 보로네이트기, 염료기, 콜레스테롤기 및 이들의 유도체로 이루어진 기로부터 선택된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 카르복실기이고, 하이드로겔 물질은 (메트)아크릴산, 2-카르복시에틸 아크릴레이트, N-아크릴로일-아미노헥사노산, N-카르복시메틸아크릴아미드, 2-아크릴아미도글리콜산 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 설포네이트기이고, 하이드로겔 물질은 아크릴아미도메틸-프로판 설폰산 단량체들 및 이들의 유도체로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 포스페이트기이고, 하이드로겔 물질은 N-포스포에틸 아크릴아미드 단량체들 또는 이들의 유도체로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 암모늄기이고, 하이드로겔 물질은 트리메틸아미노에틸 메타크릴레이트, 디에틸아미노에틸 메타크릴레이트, 디에틸아미노에틸 아크릴아미드, 디에틸아미노에틸 메타크릴아미드, 디에틸아미노프로필 메타크릴아미드, 아미노프로필 아크릴아미드, 3-(메타크릴로일아미노)프로필트리메틸암모늄 클로라이드, 2-아미노에틸 메타크릴레이트, N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드, 2-(t-부틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-디메틸아미노)에틸 (메트)아크릴레이트, N-(2-(N,N-디메틸아미노))에틸 (메트)아크릴아미드, N-(3-(N,N-디메틸아미노))프로필 메타크릴아미드, 2-(메트)아크릴로일옥시에틸트리메틸암모늄 클로라이드, 3-메타크릴로일옥시-2-히드록시프로필트리메틸암모늄 클로라이드, (2-아크릴로일옥시에틸)(4-벤조일벤질)디메틸암모늄 브로마이드, 2-비닐피리딘, 4-비닐피리딘, 비닐이미다졸 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 친수성기이고, 하이드로겔 물질은 N-(메트)아크릴로일트리스(히드록시메틸)메틸아민, 히드록시에틸 아크릴아미드, 히드록시프로필 메타크릴아미드, N-아크릴아미도-1-데옥시소르비톨, 히드록시에틸(메트)아크릴레이트, 히드록시프로필아크릴레이트, 히드록시페닐메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 아크릴아미드, 글리세롤 모노(메트)아크릴레이트, 2-히드록시프로필 아크릴레이트, 4-히드록시부틸 메타크릴레이트, 2-메타크릴옥시에틸 글루코시드, 폴리(에틸렌글리콜)모노메틸 에테르 모노메타크릴레이트, 비닐 4-히드록시부틸 에테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 소수성기이고, 하이드로겔 물질은 N,N-디메틸 아크릴아미드, N,N-디에틸 (메트)아크릴아미드, N-메틸 메타크릴아미드, N-에틸 메타크릴아미드, N-프로필 아크릴아미드, N-부틸 아크릴아미드, N-옥틸 (메트)아크릴아미드, N-도데실 메타크릴아미드, N-옥타데실 아크릴아미드, 프로필 (메트)아크릴레이트, 데실 (메트)아크릴레이트, 스테아릴 (메트)아크릴레이트, 옥틸-트리페닐메틸아크릴아미드, 부틸-트리페닐메틸아크릴아미드, 옥타데드실-트리페닐메틸아크릴아미드, 페닐-트리페닐메틸아크릴아미드, 벤질-트리페닐메틸아크릴아미드 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 금속 킬레이트기이고, 하이드로겔 물질은 N-(3-N,N-비스카르복시메틸아미노)프로필 메타크릴아미드, 5-메타크릴아미도-2-(N,N-비스카르복시메틸아미노)펜타노산, N-(아크릴아미도에틸)에틸렌디아민 N,N',N'-트리아세트산 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 반응성기이고, 하이드로겔 물질은 글리시딜 아크릴레이트, 아크릴로일 클로라이드, 글리시딜(메트)아크릴레이트, (메트)아크릴로일 클로라이드, N-아크릴옥시숙신이미드, 비닐 아즈락톤, 아크릴아미도프로필 피리딜 디설리드, N-(아크릴아미도프로필)말레이미드, 비스-에폭시란 화합물로 활성화된 아크릴아미도데옥시 소르비톨, 알릴클로로포르메이트, (메트)아크릴산 무수물, 아크롤레인, 알릴숙신산 무수물, 시트라콘산 무수물, 알릴 글리시딜 에테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 티오에테르기이고, 하이드로겔 물질은 2-히드록시-3-머캅토피리딜프로필 (메트)아크릴레이트, 2-(2-(3-(메트)아크릴옥시에톡시)에탄설포닐)에틸설파닐 에탄올 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 친황성 단량체들로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 비오틴기이고, 하이드로겔 물질은 N-비오티닐-3-(메트)아크릴아미도프로필아민 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 비오틴 단량체들로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 보로네이트기이고, 하이드로겔 물질은 N-(m-디히드록시보릴)페닐 (메트)아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 보로네이트 단량체들로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 염료기이고, 하이드로겔 물질은 N-(N'-염료 커플링된 아미노프로필) (메트)아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 염료 단량체들로부터 유도된다.
다른 구체예에 있어서, 결합 작용기는 콜레스테롤기이고, 하이드로겔 물질은 N-콜레스테릴-3-(메트) 아크릴아미도프로필아민 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 콜레스테롤 단량체들로부터 유도된다.
다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 표면, 및 표면 상에 직경이 거의 균일한 다수의 입자들을 가지는 기재를 포함하고, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침을 제공하는데, 상기 입자들은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 다수의 입자들의 평균 직경은 약 1000 ㎛ 이하이고, 임의로 약 0.01 ㎛ 내지 약 1000 ㎛이다.
다른 구체예에 있어서, 입자들의 직경 편차 계수는 약 5% 이하이다.
다른 구체예에 있어서, 기재의 표면은 입자들에 부착되도록 상태 조절한다.
다른 구체예에 있어서, 입자들의 결합 작용기는 카르복실기, 설포네이트기, 포스페이트기, 암모늄기, 친수성기, 소수성기, 반응성기, 금속 킬레이트기, 티오에테르기, 비오틴기, 보로네이트기, 염료기, 콜레스테롤기 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 유입구(inlet) 시스템 및 유입구 시스템에 삽입된, 전술한 임의의 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침을 포함하는 분석물질 검출용 시스템을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 기체상 이온 분광계는 질량 분광계이다.
다른 구체예에 있어서, 질량 분광계는 레이저 탈착 질량 분광계이다.
다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침의 제조 방법을 제공하는데, 상기 방법은 표면을 가지는 기재를제공하는 단계; 및 기재의 표면 상에 하이드로겔 물질 또는 다수의 입자들을 배치시키는 단계(여기서, 하이드로겔 물질 또는 다수의 입자들은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함함)를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 기재의 표면은 거칠게 함으로써 상태 조절한다.
다른 구체예에 있어서, 기재의 표면은 레이저 에칭, 화학 에칭 또는 스퍼터 에칭에 의해 상태 조절한다.
다른 구체예에 있어서, 기재의 표면은 금속 코팅, 산화물 코팅, 졸 겔, 유리 코팅 또는 커플링제를 혼입시킴으로써, 상태 조절한다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 원 위치에서 기재의 표면 상에 단량체를 중합시킴으로써 생산한다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 결합 작용기를 제공하도록 예비 작용화된 단량제를 사용함으로써 생산한다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 방사선 조사(irradiation)에 의해 가교시킨다.
다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질은 원 위치에서 기재의 표면 상에의 방사선 조사에 의해 단량체를 가교시킴으로써 생산한다.
다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 (a) 전술한 임의의 탐침을 제공하는 단계; (b) 분석물질과 결합 작용기 사이의 결합을 허용하는 조건 하에 분석물질 함유 샘플에 하이드로겔 물질 또는 입자들의 결합 작용기를 노출시키는 단계; (c) 이온화 공급원로부터의 에너지로 탐침 표면을 강타하는 단계; (d) 기체상 이온 분광계에 의해 탐침으로부터 결합된 분석물질을 탈착시키는 단계; 및 (e) 탈착된 분석물질을 검출하는 단계를 포함하는 분석물질 검출 방법을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 기체상 이온 분광계는 질량 분광계이다.
다른 구체예에 있어서, 질량 분광계는 레이저 탈착 질량 분광계이다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 하이드로겔 물질 또는 다수의 입자들의 결합 작용기와 분석물질 사이의 결합의 최저 한계(threshold)를 선택적으로 조절하는 세척 단계를 추가로 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 분석물질이 하이드로겔 물질의 결합 작용기에 결합되는 동안 분석물질을 화학적으로 또는 효소적으로 상태 조절하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 구체예에서, 분석물질은 아민 함유 조합형 라이브러리, 아미노산, 염료, 약물, 독소, 비오틴, DNA, RNA, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 리신, 아세틸글루코사민, 프로시온 레드(procion red), 글루타티온 및 아데노신모노포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구체예에 있어서, 분석물질은 폴리뉴클레오티드, 아비딘, 스트렙타비딘, 다당류, 렉틴, 단백질류, 펩스타틴, 단백질 A, 아글루티닌, 헤파린, 단백질 G 및 콘카나발린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구체예에 있어서, 분석물질은 상이한 생체고분자의 복합체를 포함한다.
본 발명은 기체상 이온 분광 분석, 특히 질량 분석을 사용하는 분석 생화학 분야 및 분리학 분야에 관한 것이다.
도 1은 대상 형태로 다수의 흡착성 반점(예: 하이드로겔 물질 및/또는 균일입자들)을 함유하는 탐침을 도시한 것이다.
도 2는 양이온기를 포함하는 탐침 표면 상에 결합된 송아지 혈청 내의 고분자량의 분석물질에서의 분해능을 도시한 것이다.
도 3은 음이온기를 포함하는 탐침 표면 상에 결합된 송아지 혈청 내의 고분자량의 분석물질에서의 분해능을 도시한 것이다.
도 4는 금속 킬레이트기를 포함하는 탐침 표면 상에 결합된 송아지 혈청 내의 고분자량의 분석물질에서의 분해능을 도시한 것이다.
[구체예의 상세한 설명]
Ⅰ. 정의
달리 정의된 바 없다면, 본 명세서에 사용된 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 당업계에서 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가진다. 하기 참고문헌은 당업자에게 본 발명에서 사용된 다수의 용어에 대한 일반적인 정의를 제공한다: Singleton 등의 Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(제2판, 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker 등, 1998); The Glossary of Genetics, 제5판, R. Rieger 등(편집), Springer Verlag(1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991). 본 명세서에 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 달리 언급되지 않는 한 하기 정의된 바대로의 의미를 가진다.
"탐침(probe)"은 기체상 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있고, 검출용 분석물질을 제공하는 표면을 가지는 기재를 포함하는 장치이다. 탐침은 단일 기재 또는 다수의 기재를 포함할 수 있다. 또한, Protein Chip, Protein Chip배열 또는 칩과 같은 용어들은 특정 유형의 탐침을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다.
"기재(substrate)"는 하이드로겔 물질 또는 다수의 균일 입자들을 지지할 수 있는 물질을 의미한다.
"입자"는 구형, 타원형 및 기타 형태를 포함하고, 달리 언급되지 않는 한 그러한 용어들과 호환적으로 사용된다.
"표면"은 본체 또는 기재의 외부 또는 상부 경계를 의미한다.
"미세다공성"은 직경 약 1000 Å이하의 매우 미세한 공극을 가지는 것을 의미한다.
"대상(帶狀; strip)"은 거의 평평하거나 평면형인 물질의 길고 좁은 부분을 의미한다.
"평판(plate)"는 거의 평평하거나 평면형이고, 임의의 적당한 형태(예: 직사각형, 정사각형, 장타원형, 원형 등)일 수 있는 물질의 얇은 부분을 의미한다.
"거의 평평한"이란 다수의 표면이 거의 평행이고, 소수의 표면보다 명백히 큰 기재를 의미한다(예: 대상 또는 평판).
"거의 균일한" 입자들은 약 5% 이하의 직경 편차 계수를 가지는 다수의 입자들을 의미한다. 공지된 임의의 수단(예: 투과 현미경법)에 의해 다수의 입자들의 직경을 측정한 후, 직경 편차의 계수를 계산할 수 있다. 편차의 계수는 평균으로 나눈 표준 편차의 비율에 100을 곱하여 백분율로 나타낸 것을 의미한다.
"전기 전도성이 있는"이란 전기 또는 전자를 투과할 수 있는 물질을 의미한다.
기재와 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들 사이의 물리적 관계에 적용되는 바와 같은 "배치된(placed)"이란 용어는 기재 표면 상에의 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들의 배치(positioning), 코팅, 피복(covering) 또는 층화(layering)을 의미한다.
"기체상 이온 분광계"는 샘플이 기체상으로 이온화될 때 형성된 이온의 질량 대 전하 비율로 해석될 수 있는 매개변수를 측정하는 장치를 의미한다. 일반적으로 중요한 이온은 단일 전하를 운반하고, 종종 질량 대 전하 비율은 단지 질량으로서 언급된다.
"질량 분광계"는 유입구 시스템, 이온화 공급원, 이온 광학 집결기, 질량 분석기 및 검출기를 포함하는 기체상 이온 분광계를 의미한다.
"레이저 탈착 질량 분광계"는 분석물질을 탈착시키는 이온화 공급원으로서 레이저를 사용하는 질량 분광계를 의미한다.
"하이드로겔 물질"은 가교되어 있으며, 그 중량의 10 배 이상, 바람직하게는 100 배 이상인 액체를 흡수할 수 있는 수불용성 및 수팽윤성 중합체를 의미한다.
"결합 작용기"는 분석물질을 결합시키는 하이드로겔 물질의 작용기(들)을 의미한다. 결합 작용기는 카르복실기, 설포네이트기, 포스페이트기, 암모늄기, 친수성기, 소수성기, 반응성기, 금속 킬레이트기, 티오에테르기, 비오틴기, 보로네이트기, 염료기, 콜레스테롤기, 이들의 유도체 또는 이들의 배합물을 포함하나 이들에한정되는 것은 아니다. 결합 작용기는 개별 구조적 특성(예: 항원과 항체의 상호작용, 기질 유사체와 효소의 상호작용, 단백질과 핵산의 상호작용 및 수용체와 호르몬의 상호작용)에 기초하여 분석물질을 결합시키는 기타 흡착제를 추가로 포함한다.
"분석물질(analyte)"는 양호하게 보류되고 검출되는 샘플의 성분을 의미한다. 상기 용어는 샘플 내의 단일 성분 또는 일련의 성분을 의미할 수 있다.
본 발명에 적용되는 바와 같이 "상태 조절되는(conditioned)"이란 기재 표면 상에의 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들의 부착성을 촉진시키도록 기재 표면의 적합화(adaptation) 또는 개질과 관련이 있다.
"졸 겔"은 도포될 경우 젤라틴성이나, 경화될 경우 3차원 중 어느 한쪽의 전단 응력에 일반적으로 저항하는 고체가 되는 물질을 의미한다.
"커플링제"는 기재와 반응하여 계면에서의 보다 강한 결합을 형성하거나 촉진하도록 고안된 임의의 화학 물질을 의미한다.
"유도체"는 다른 화합물로 제조된 화합물을 의미한다. 예를 들어, 유도체는 단일 화학 공정(예: 화합물의 하나 이상의 치환기를 다른 치환기로 치환하는 것)에 의해 다른 화합물로부터 수득된 화합물을 의미한다.
"치환된"은 원자 또는 원자단을 다른 원자 또는 원자단으로 치환하는 것을 의미한다.
"카르복실기"는 카르복실산 또는 카르복실산 염을 가지는 임의의 화학물질 부분을 의미한다.
"암모늄기"는 치환된 아민 또는 치환된 아민의 염을 가지는 임의의 화학물질 부분을 의미한다.
"설포네이트기"는 설폰산 또는 설폰산의 염을 가지는 임의의 화학물질의 부분을 의미한다.
"포스페이트기"는 인산 또는 인산의 염을 가지는 임의의 화학물질의 부분을 의미한다.
"단독 중합체"는 단일 유형의 단량체로부터 유도된 중합체를 의미한다.
"공중합체"는 2종 이상의 상이한 중합체의 동시 중합에 의해 생산된 중합체를 의미한다.
"혼합형(blended) 중합체"는 상이한 유형의 중합체 혼합물을 의미한다.
"가교제"는 공유 결합에 의해 다양한 위치에서 소정의 중합체의 인접 분자 사슬 사이의 화학 결합을 형성시킬 수 있는 화합물을 의미한다.
"흡착하다"란 용리액(선택성 최저 제한 상태 조절제)로 세척하기 이전 또는 이후에 흡착제(예: 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들)의 결합 작용기와 분석물질 사이의 검출가능한 결합을 의미한다.
"분해하다", "분해능" 또는 "분석물질의 분해능"이란 샘플 중 1종 이상의 분석물질의 검출을 의미한다. 분해능은 분리 및 연속 시차 검출에 의한 샘플 내의 다수의 분석물질의 검출을 포함한다. 분해능은 혼합물 내의 모든 다른 분석물질로부터 분석물질의 완전 분리를 필요로 하지 않는다. 오히려, 2종 이상의 분석물질 간의 구별을 가능하게 하는 임의의 분리로 충분하다.
"검출하다"란 검출 대상인 목적물의 존재, 부존재 또는 양을 동정하는 것을 의미한다.
"복합체"는 2종 이상의 분석물질의 결합에 의해 형성된 분석물질들을 의미한다.
"생물학적 샘플"은 세포, 조직 또는 기관의 여액 또는 균질화액 (homogenate), 또는 체액 샘플(예: 혈액, 뇨 또는 뇌척수액)을 포함하나 이에 한정되지 않는, 바이러스, 세포, 조직, 기관 또는 생물체로부터 유도된 샘플을 의미한다.
"유기 생체분자"는 생물학적 기원의 유기 분자(예: 스테로이드류, 아미노산류, 뉴클레오티드, 당류, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 복합 탄수화물류 또는 지방류)를 의미한다.
"소규모 유기 분자"는 약제에 일반적으로 사용되는 유기 분자의 크기에 필적하는 크기의 유기 분자를 의미한다. 상기 용어는 유기 생체고분자(예: 단백질, 핵산 등)을 배제한다. 바람직한 소규모 유기 분자의 크기는 약 5000 Da 이하, 약 2000 Da 이하 또는 약 1000 Da이하의 범위에 걸쳐 있다.
"생체고분자"는 생물학적 기원의 중합체 또는 올리고머(예: 폴리펩티드 또는 올리고펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 다당류 또는 올리고당류, 폴리글리세리드 또는 올리고글리세리드)를 의미한다.
"에너지 흡수성 분자" 또는 "EAM"은 질량 분광계 내의 이온화 공급원으로부터 에너지를 흡수함으로써 탐침 표면으로부터 분석물질의 탈착을 가능하게 하는 분자를 의미한다. 종종, MALDI에 사용되는 에너지 흡수성 분자는 "매트릭스"라고 일컫는다. 종종, 시남산 유도체, 시나핀산("SPA"), 시아노히드록시 시남산("CHCA") 및 디히드록시벤조산은 생체유기 분자의 레이저 흡착에 있어서의 에너지 흡수성 분자로 사용된다. 기타 적당한 에너지 흡수성 분자는 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 에너지 흡수성 분자의 추가 탈착에 관하여는 미국 특허 제5,719,060호 (Hutchens & Yip)를 참조하라.
Ⅱ. 탐침
본 발명의 탐침은 질량 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침에 적합하다. 본 발명의 일 실시양태에 있어서, 탐침은 기재 및 기재 표면 상에 배치된 하이드로겔 물질을 포함한다. 하이드로겔은 별개의 화학적 또는 생물학적 부분(결합 작용기)가 부착된 3차원 비계를 제공한다. 분석 중, 상기 화학적 또는 생물학적 부분은 예컨대 특이성 화학적 또는 생물학적 상호작용을 통해 분석물질(예: 펩티드, 단백질, 저분자량의 리간드, 효소 또는 저해제)을 포획한다. 다른 SELDI 표면 제조 방법은 단위 면적당 활성 작용기 또는 결합 작용기를 상당히 제한하는, 화학적 또는 생물학적 방법의 2차원 제공에 달려 있다. 이와는 대조적으로, 하이드로겔은 상기 화학적 또는 생물학적 부분이 제공되는 3차원 비계를 제공하여, 단위 면적당 작용기(또는 결합 작용기)의 수를 증가시킨다. 이는 유의성있는 고도의 수용능력을 가지는 탐침 표면을 산출하고, 증가된 검출 감수성을 야기시킨다. 또한, 하이드로겔 골격의 친수성 성질은 하이드로겔 중합체 골격에 대한 생체분자(예: 단백질)의 비특이성 결합을 감소시킨다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 하이드로겔 물질은 분석물질이 물에 의해 둘러싸이도록 하고, 하이드로겔 중합체 골격과 연관된 비특이성 결합을 최소화하거나 제거한다. 또한, 하이드로겔 물질의 다공성 성질은 비결합 샘플 성분이 세척 단계 중 용이하게 씻겨 나가도록 한다. 일 구체예에 있어서, 기재 표면 상에 단량체 용액을 직접 침착시킨 후 중합시킴으로써, 탐침 표면 상에 하이드로겔을 산출한다. 특정 구체예에 있어서, 단량체는 결합 작용기를 제공하도록 예비 작용성이 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 탐침은 기재 및 기재 표면 상의 다수의 균일 입자들을 포함한다. 입자들은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함한다. 입자들의 균일성은 입자들의 결합 작용기에 결합된 분석물질의 일관된 질량 분해능 및 강도를 제공한다.
일반적으로, 결합 작용기는 분석물질을 유인하는 양식이 상이하며, 따라서 분석물질을 선택적으로 포획하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 결합 작용기들 간의 유인 양식은 (1) 염 촉진 상호작용(예: 소수성 상호작용, 친황성 상호작용 및 부동화 염료 상호작용); (2) 친수성 상호작용의 경우와 같은 전하 이동 상호작용 및 수소 결합 및/또는 반데르발스력 상호작용; (3) 정전기적 상호작용(예: 이온성 전하 상호작용, 특히 양이온성 또는 음이온성 전하 상호작용); (4) 금속 킬레이트기 상에 금속 이온(예: 구리, 니켈, 코발트, 아연, 철, 알루미늄, 칼슘 등)과 배위 결합을 형성하는 분석물질의 성능; (5) 가역적 공유 상호작용(예: 디설피드 교환 상호작용); (6) 비가역적 공유 상호작용[예: 산에 불안정한 에스테르기 또는 광화학적으로 불안정한 기(예: 오르토니트로 벤질)]; (7) 효소 활성 부위 결합 상호작용(예: 하이드로겔 물질에 부동화되는 트립신과 트립신 저해제 간의 상호작용); (8) 당단백질 상호작용(예: 하이드로겔 물질에 부동화되는 렉틴과 거대분자 상의 탄수화물 부분 사이의 상호작용); (9) 생체특이성 상호작용(예: 하이드로겔 물질에 부동화되는 항체와 항원 사이의 상호작용); 또는 (10) 전술한 상호작용 양식 중 2 이상의 조합을 포함한다. 상기 상호작용과 관련한 분석물질의 실시예에 관하여는 예컨대 WO98/59361을 참조하라.
각종 결합 작용기를 가지는 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들에 샘플을 노출시킴으로써, 샘플의 상이한 성분들을 선택적으로 유인하고 결합시킬 수 있다. 따라서, 샘플의 성분들은 기체상 이온 분광계에 의해 분리하고 분해시킬 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들에 흡수된(예컨대, 반응성기를 통해) 1차 분석물질은 2차 분석물질을 유인하고 결합시키는데 사용가능하다.
B. 기재
탐침 기재는 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들을 지지할 수 있는 임의의 적당한 물질로 제조할 수 있다. 예를 들어, 탐침 기재 물질은 절연 물질(예: 실리콘 산화물과 같은 유리 또는 세라믹), 반도성(半導性) 물질(예: 실리콘 웨이퍼), 전기 전도성 물질(예: 니켈, 놋쇠, 강철, 알루미늄, 금과 같은 금속 또는 전기 전도성 중합체), 유기 중합체, 생체고분자, 종이, 막, 금속과 중합체의 합성물, 또는 이들의 임의의 배합물을 포함할 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.
기재는 다양한 성질을 가질 수 있다. 예를 들어, 기재는 다공성이거나 비다공성(예: 고체)일 수 있다. 또한, 기재는 실질적으로 강성이거나 가요성(예: 막)일수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 기재는 비다공성이고, 실질적으로 강성이어서 구조적 안정성을 제공한다. 다른 구체예에 있어서, 기재는 미세다공성이거나 다공성이다. 또한, 기재는 전기 절연성이거나 전도성이거나 또는 반도성일 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 기재는 전기 전도성이어서 표면 전하를 감소시키고 질량 분해능을 향상시킬 수 있다. 전기 전도성인 물질(예: 탄소화 폴리에테르 케톤, 폴리아세틸렌, 폴리페닐렌, 폴리피롤, 폴리아닐린, 폴리티오펜 등) 또는 전도성 미립자 충전제(예: 카본 블랙, 금속 분말, 전도성 중합체 미립자 등)과 같은 물질을 혼입시킴으로써, 기재를 전기 전도성이 되게 할 수 있다.
기재는 탐침이 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있도록 하는 한 임의의 형태일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 기재는 거의 평면형이다, 다른 구체예에 있어서, 기재는 거의 매끄럽다. 또 다른 구체예에 있어서, 기재는 거의 평평하거나 실질적으로 강성이다. 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같이, 기재는 대상 (101) 형태일 수 있다. 또한, 기재는 평판 형태일 수 있다. 또한, 기재의 두께는 약 0.1 ㎜ 내지 약 10 ㎝ 또는 그 이상, 바람직하게는 약 0.5 ㎜ 내지 약 1 ㎝ 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 약 0.8 ㎜ 내지 약 0.5 ㎝ 또는 그 이상, 가장 바람직하게는 1 ㎜ 내지 2.5 ㎜일 수 있다. 기재 자체는 손에 담을 수 있을 정도로 충분히 큰 것이 바람직하다. 예를 들어, 기재의 가장 긴 교차 직경(예: 대각선)은 최소 1 ㎝ 이상, 바람직하게는 최소 2 ㎝ 이상, 가장 바람직하게는 최소 5 ㎝ 이상일 수 있다.
기재가 단독으로 기체상 이온 분광계에 즉시 제거가능하게 삽입될 수 없는형태인 경우, 기재는 탐침이 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있도록 하는 지지 부재를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 지지 기재를 가요성(예: 막)인 기재와 함께 사용하여, 탐침이 기체상 이온 분광계에 즉시 제거가능하게 삽입될 수 있도록 돕고, 기체상 이온 분광계의 에너지 빔에 샘플을 안정적으로 제공할 수 있다. 예를 들어, 지지 기재는 평판 또는 컨테이너(예: 시판되는 96 웰 또는 384 웰 마이크로 컨테이너)와 같이 실질적으로 강성인 물질일 수 있다. 기재와 지지 부재 간의 부동화가 필요한 경우, 기재와 지지 부재는 임의의 적당한 공지 방법(예: 부착 결합, 공유 결합, 정전기적 결합 등)에 의해 커플링시킬 수 있다. 또한, 지지 부재는 손에 담을 수 있을 만큼 큰 것이 바람직하다. 예를 들어, 지지 부재의 가장 긴 교차 직경(예: 대각선)은 최소 1 ㎝ 이상, 바람직하게는 최소 2 ㎝ 이상, 가장 바람직하게는 최소 5 ㎝ 이상일 수 있다. 이 구체예의 한가지 장점은 분석물질이 하나의 물리적 환경에서 흡수되고, 기체상 이온 분광계에 의한 분석용 지지 부재로 이동될 수 있다는 것이다.
또한, 탐침은 기체상 이온 분광계의 유입구 시스템 및 검출기로 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 탐침은 손으로 탐침을 재배치할 필요없이 연속 위치에 수평 및/또는 수직으로 탐침을 이동시키는, 수평 및/또는 수직으로 병진가능한 캐리지(carriage) 내에 탑재하는데 적합하다.
기재의 표면은 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들의 부착성을 촉진하도록 상태 조절할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 기재의 표면은 당업계에 공지된 임의의 방법(예: 레이저 에칭, 화학적 에칭, 스퍼터 에칭, 와이어 브러싱, 샌드블래스팅등)에 의해 거칠거나 미세다공성이거나 또는 다공성이 되게 상태 조절할 수 있다. 바람직하게는, 레이저 에칭에 의해 표면을 상태 조절한다. 예를 들어, 금속과 같은 기재는 레이저를 통해 에칭할 수 있다. 레이저 에칭은 평균 높이 편차가 약 10 마이크로인치 내지 약 1000 마이크로인치 또는 그 이상, 바람직하게는 약 100 마이크로인치 내지 약 500 마이크로인치 또는 그 이상, 가장 바람직하게는 약 150 마이크로인치 내지 약 400 마이크로인치 또는 그 이상인 기재 표면을 제공할 수 있다. 이론에 얽매이지 않으면서, 거칠거나 미세다공성인 기재 표면은 기재 표면 상의 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들의 물리적 포획을 촉진시킬 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 기재의 표면을 화학적으로 상태 조절하여, 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들의 부착성을 촉진시킬 수 있다. 예컨대, 공유, 비공유 또는 정전기 상호작용에 의해 부착을 수행할 수 있다. 예를 들어, 부착성 촉진 코팅(예: 금속 코팅, 산화물 코팅, 졸 겔, 또는 유리 코팅)을 혼입시킴으로써, 표면을 상태 조절할 수 있다. 또한, 커플링제(예: 실란 또는 티타늄계 제제)를 사용할 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 비전도성 코팅(예: 유리 코팅)으로 표면을 상태 조절함으로써, 비전도성인 기재 표면을 제공한다. 다른 구체예에 있어서, 탐침 표면 상의 코팅(예: 유리 코팅) 두께는 약 6 옹스트롬 내지 약 9 옹스트롬이다. 기재로 금속을 사용하는 경우, 커플링제는 지르코늄 또는 실리콘 활성 부분을 가지는 유기금속 화합물일 수 있다[예컨대, 미국 특허 제5,869,140호(Blohowiak 등) 참조].
또 다른 구체예에 있어서, 기재 표면은 거칠게함으로써 또는 화학적으로 상태 조절할 수 있다. 예를 들어, 금속 기재는 레이저 에칭에 의해 거칠게 한 후, 유리 코팅으로 피복한다.
B. 결합 작용기를 포함하는 하이드로겔 물질
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 탐침은 기재 표면 상에 하이드로겔 물질을 포함한다. 하이드로겔 물질은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 하이드로겔 물질은, 가교되어 있으며, 중합체 자체 중량의 최소 10배, 바람직하게는 최소 100배인 액체를 흡수할 수 있는 수불용성 및 수팽윤성 중합체를 의미한다. 액체의 침출시 팽윤시킴으로써, 하이드로겔 물질은 결합 작용기가 부여되는 3차원 비계를 제공하여, 증가된 검출 감수성을 야기시킬 수 있는 분석물질 결합 수용능력을 증가시킨다. 또한, 하이드로겔 물질의 친수성 성질은 하이드로겔 중합체 골격에 대한 생체분자(예: 단백질)의 비특이성 결합을 감소시킨다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 하이드로겔 물질은 분석물질이 물에 의해 둘러싸이도록 하며, 하이드로겔 중합체 골격과 연관된 비특이성 결합을 최소화하거나 제거한다. 또한, 하이드로겔 물질의 다공성 성질은 비결합 샘플 성분이 세척 단계 중 용이하게 씻겨 나가도록 한다.
하이드로겔 물질은 수많은 방식으로 기재 표면 상에 존재할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 기재 표면 상에 하이드로겔 물질을 직접 침착시킬 수 있다[예컨대, 일체식(monolithic) 유리 기재 또는 일체식 알루미늄 기재 상에 침착시킬 수 있다.]. 다른 구체예에 있어서, 상태 조절된 기재 표면 상에 하이드로겔 물질을 침착시킬 수 있다. 예를 들어, 기재 표면은 전술한 부착성 촉진 코팅(예: 유리 코팅)으로 상태 조절할 수 있고, 하이드로겔 물질은 유리 코팅 상에 침착시킬 수 있다.본 발명의 경우, 이들 모든 구체예는 기재 표면 "상에" 하이드로겔 물질을 가지는 것으로 여겨진다.
일반적으로, 기재 상의 코팅(예: 유리 코팅)과 결합된 하이드로겔 물질의 두께는 약 1 마이크로미터 이상, 약 10 마이크로미터 이상, 약 20 마이크로미터 이상, 약 50 마이크로미터 이상 또는 약 100 마이크로미터 이상이다. 특정 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질 자체의 두께는 약 1 마이크로미터 이상, 약 10 마이크로미터 이상, 약 20 마이크로미터 이상, 약 50 마이크로미터 이상 또는 약 100 마이크로미터 이상이다. 다른 구체예에 있어서, 하이드로겔 물질의 두께는 약 50 마이크로미터 내지 약 100 마이크로미터의 범위이다. 코팅 및/또는 하이드로겔 물질 두께의 선택은 실험 조건 또는 소정의 결합 수용능력에 따라 다를 수 있고, 당업자가 결정할 수 있다.
수많은 하이드로겔 물질은 본 발명에 사용하기에 적당하다. 적당한 하이드로겔 물질로는 전분 그라프트 공중합체, 가교된 카르복시메틸셀룰로오스 유도체 및 개질된 친수성 폴리아크릴레이트를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. 대표적인 하이드로겔 물질로는 가수분해된 전분-아크릴로니트릴 그라프트 공중합체, 중화된 전분-아크릴산 그라프트 공중합체, 비누화된 아크릴산 에스테르-비닐 아세테이트 공중합체, 가수분해된 아크릴로니트릴 공중합체 또는 아크릴아미드 공중합체, 개질된 가교 폴리비닐 알콜, 중화된 자가 교차 폴리아크릴산, 가교된 폴리아크릴레이트 염, 카르복실화된 셀룰로오스, 중화된 가교 이소부틸렌-말레산 무수물 공중합체, 또는 이들의 유도체를 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기하이드로겔 물질은 분석물질을 결합시키는 결합 작용기를 제공하는 한 어느 것이든 사용가능하다.
예를 들어, 하이드로겔 물질의 결합 작용기는 카르복실기, 설포네이트기, 포스페이트기, 암모늄기, 친수성기, 소수성기, 반응성기, 금속 킬레이트기, 티오에테르기, 비오틴기, 보로네이트기, 염료기, 콜레스테롤기 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
결합 작용기를 포함하는 하이드로겔 물질은 각종 단량체로부터 유도할 수 있다. 선택된 결합 작용기를 가지는 단량체의 합성은 당업계의 공지 기술 범위 내에 있다. 예컨대, 문헌[Advanced organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structures, 제4판, March(John Wiley & Sons, 뉴욕(1992))]을 참조하라. 또한, 몇몇 단량체는 예컨대 Sigma, Aldrich 또는 기타 공급처에서 시판한다. 상기 단량체는 소정의 결합 작용기를 제공하도록 예비 작용성이 있기 때문에, 결합 작용기를 포함하는 중합된 하이드로겔 물질의 사후 개질(post-modification)이 필요없다. 그러나, 경우에 따라, 중합된 하이드로겔 물질은 사후 개질되어 다른 결합 작용기(예: 생체분자를 결합시킬 수 있는 특이성 리간드)를 혼입시킬 수 있다.
하이드로겔 물질은 치환된 아크릴아미드 단량체, 치환된 아크릴레이트 단량체, 또는 이들의 유도체로부터 유도되는 것이 바람직한데, 이는 상기 단량체들을 용이하게 개질시켜 다수의 상이한 결합 작용기를 포함하는 하이드로겔 물질을 생산할 수 있기 때문이다.
구체적으로, 결합 작용기로 카르복실기를 포함하는 하이드로겔 물질은 치환된 아크릴아미드 또는 치환된 아크릴레이트 단량체[예: (메트)아크릴산, 2-카르복시에틸 아크릴레이트, N-아크릴로일-아미노헥사노산, N-카르복시메틸아크릴아미드, 2-아크릴아미도글리콜산 또는 이들의 유도체]로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 설포네이트기를 포함하는 하이들겔 물질은 예컨대 아크릴아미도메틸-프로판 설폰산 또는 그 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 포스페이트기를 포함하는 하이드로겔 물질은 예컨대 N-포스포에틸 아크릴아미드 단량체 또는 그 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 암모늄기를 포함하는 하이드로겔 물질은 예컨대 트리메틸아미노에틸 메타크릴레이트, 디에틸아미노에틸 메타크릴레이트, 디에틸아미노에틸 아크릴아미드, 디에틸아미노에틸 메타크릴아미드, 디에틸아미노프로필 메타크릴아미드, 아미노프로필 아크릴아미드, 3-(메타크릴로일아미노)프로필트리메틸암모늄 클로라이드, 2-아미노에틸 메타크릴레이트, N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드, 2-(t-부틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-디메틸아미노)에틸 (메트)아크릴레이트, N-(2-(N,N-디메틸아미노))에틸 (메트)아크릴아미드, N-(3-(N,N-디메틸아미노)프로필 메타크릴아미드, 2-(메트)아크릴로일옥시에틸트리메틸암모늄 클로라이드, 3-메타크릴로일옥시-2-히드록시프로필트리메틸암모늄 클로라이드, (2-아크릴로일옥시에틸) (4-벤조일벤질)디메틸암모늄 브로마이드, 2-비닐피리딘, 4-비닐피리딘, 비닐이미다졸 또는 이들의 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 친수성기를 포함하는 하이드로겔 물질은 예컨대, N-(메트)아크릴로일트리스(히드록시메틸)메틸아민, 히드록시에틸 아크릴아미드, 히드록시프로필 메타크릴아미드, N-아크릴아미도-1-데옥시소르비톨, 히드록시에틸(메트)아크릴레이트, 히드록시프로필아크릴레이트, 히드록시페닐메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 아크릴아미드, 글리세롤 모노(메트)아크릴레이트, 2-히드록시프로필 아크릴레이트, 4-히드록시부틸 메타크릴레이트, 2-메타크릴옥시에틸 글루코시드, 폴리(에틸렌글리콜) 모노메틸 에테르 모노메타크릴레이트, 비닐 4-히드록시부틸 에테르 또는 이들의 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 소수성기를 포함하는 하이드로겔 물질은 예컨대 N,N-디메틸 아크릴아미드, N,N-디에틸 (메트)아크릴아미드, N-메틸 메타크릴아미드, N-에틸 메타크릴아미드, N-프로필 아크릴아미드, N-부틸 아크릴아미드, N-옥틸 (메트)아크릴아미드, N-도데실 메타크릴아미드, N-옥타데실 아크릴아미드, 프로필 (메트)아크릴레이트, 데실 (메트)아크릴레이트, 스테아릴 (메트)아크릴레이트, 옥틸-트리페닐메틸아크릴아미드, 부틸-트리페닐메틸아크릴아미드, 옥타데실-트리페닐메틸아크릴아미드, 페닐-트리페닐메틸아크릴아미드, 벤질-트리페닐메틸아크릴아미드 또는 이들의 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 금속 킬레이트기를 포함하는 하이드로겔 물질은 예컨대 N-(3-N,N-비스카르복시메틸아미노)프로필 메타크릴아미드, 5-메타크릴아미노-2-(N,N-비스카르복시메틸아미노)펜타노산, N-(아크릴아미도에틸)에틸렌디아민 N,N',N'-트리아세트산 또는 이들의 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 반응성기를 포함하는 하이드로겔 물질은 예컨대 글리시딜 아크릴레이트, 아크릴로일 클로라이드, 글리시딜(메트)아크릴레이트, (메트)아크릴로일 클로라이드, N-아크릴옥시숙신이미드, 비닐 아즈락톤, 아크릴아미도프로필 피리딜 디설피드, N-(아크릴아미도프로필)말레이미드, 비스-에폭시란 화합물로 활성화된 아크릴아미도데옥시 소르비톨, 알릴클로로푸르메이트, (메트)아크릴산 무수물, 아크롤레인, 알릴숙신산 무수물, 시트라콘산 무수물, 알릴 글리시딜 에테르 또는 이들의 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 티오에테르기를 포함하는 하이드로겔 물질은 예컨대 2-히드록시-3-머캅토피리딜프로필 (메트)아크릴레이트, 2-(2,3-(메트)아크릴옥시에톡시)에탄설포닐)에틸설파닐 에탄올, 또는 이들의 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 비오틴기를 포함하는 하이드로겔 물질은 예컨대 n-비오티닐-3-(메트)아크릴아미도프로필아민 또는 그 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 염료기를 포함하는 하이드로겔 물질은 염료 단량체[예: N-(N'-염료 커플링된 아미노프로필)(메트)아크릴아미드]로부터 유도할 수 있다. 염료는 임의의 적당한 염료(예: 시바크론 블루)로부터 선택가능하다.
결합 작용기로 보로네이트기를 포함하는 하이드로겔 물질은 예컨대 N-(m-디히드록시보릴)페닐 (메트)아크릴아미드 또는 그 유도체로부터 유도할 수 있다.
결합 작용기로 콜레스테롤기를 포함하는 하이드로겔 물질은 콜레스테롤 단량체[예: N-콜레스테릴-3-(메트)아크릴아미도프로필아민]로부터 유도할 수 있다.
경우에 따라, 일부 결합 작용기는 중합 단계 후, 즉 하이드로겔 물질의 사후 개질에 의해 부착될 수 있다. 예를 들어, 티오에테르기는 하이드로겔 물질의 히드록실기를 개질시킴으로써 생산할 수 있다. 다른 예로는, 활성화된 에스테르 또는 산 클로라이드를 포함하는 하이드로겔 물질을 개질시켜 히드라지드기를 가지는 하이드로겔 물질을 생산하는 것을 들 수 있다. 또한, 다른 예로는, 결합 작용기로 예컨대 염료기, 렉틴기 또는 헤파린기를 포함하는 하이드로겔 물질을 생산하기 위해 개질된 하이드로겔 물질의 히드록실기 또는 반응성기를 들 수 있다. 또한, 콘쥬게이팅 화합물[예: 영발사(zero-length), 동형 또는 이형 이작용성 가교제]을 사용함으로써, 하이드로겔 물질에 결합 작용기를 부착시킬 수 있다. 가교제의 예는, 예컨대 숙신이미딜 에스테르, 말레이미드, 요오도아세트아미드, 카르보디이미드, 알데히드류 및 글리옥살류, 에폭시드류 및 옥시란류, 카르보닐디이미다졸, 또는 무수물류를 포함한다. 이들 콘쥬게이팅 시약은 작용기의 반응 화학작용을 상태 조절하려고 할 경우에 특히 유용할 수 있다.
상기 단량체 각각은 그 자신과 중합되어 단독 중합체를 형성하거나, 다른 중합체와 중합되어 공중합체를 형성한다. 또한, 중합체 혼합물도 사용할 수 있다. 공중합체 또는 혼합형 중합체는 혼합된 결합 작용기를 가지는 하이드로겔 물질이 요구되는 경우에 특히 유용하다. 예를 들어, 소수성기 및 카르복실기를 가지는 하이드로겔 물질이 요구되는 경우, N,N-디메틸 아크릴아미드 및 (메트)아크릴산과 같은 단량체들을 혼합하고 함께 중합할 수 있다. 대안으로, N,N-디메틸 아크릴아미드로부터 유도된 하이드로겔 단독 중합체 및 (메트)아크릴산으로부터 유도된 하이드로겔 단독 중합체는 함께 혼합할 수 있다. 공중합체 또는 혼합형 중합체를 생산하는 경우, 단량체 또는 중합체의 비율은 소정의 결합 작용기의 양을 상태 조절하도록각각 변화가능하다.
다른 첨가제를 첨가함으로써, 하이드로겔 물질의 결합 특성을 추가로 개질시킬 수 있다. 예를 들어, 중합되는 단량체는 친수성 중합체 화합물[예: 전분 또는 셀룰로오스, 전분 유도체 또는 셀룰로오스 유도체, 덱스트란, 아가로오스, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴산 (염) 또는 가교된 폴리아크릴산 (염), 사슬 전이제(예: 차아인산 (염)), 계면활성제 및 발포제(예: 탄산염) 등]을 혼입할 수 있다.
공지된 임의의 적당한 중합 방법을 사용하여, 상기 단량체 및 첨가제를 혼합하고 중합할 수 있다. 예를 들어, 벌크(bulk) 중합 또는 침전 중합을 사용할 수 있다. 그러나, 수용액 형태로 단량체를 제조하고, 생성물의 품질 및 중합 상태 조절의 용이성의 관점에서 수용액이 용액 중합 또는 역상(reversed-phase) 현탁액 중합되게 하는 것이 바람직하다. 상기 중합 방법은, 예컨대 미국 특허 제4,625,001호 (Tsubakimoto 등), 미국 특허 제4,769,427호 (Nowakoowsky 등), 미국 특허 제4,873,299호(Nowakoowsky 등), 미국 특허 제4,093,776호(Aoki 등), 미국 특허 제4,367,323호(Kitamura 등), 미국 특허 제4,446,261호(Yamasaki 등), 미국 특허 제4,552,938호(Mikita 등), 미국 특허 제4,654,393(Mikita 등), 미국 특허 제4,683,274호(Nakamura 등), 미국 특허 제4,690,996호(Shih 등), 미국 특허 제4,721,647호(Nakanishi 등), 미국 특허 제4,738,867호(Itoh 등), 미국 특허 제4,748,076호(Satome), 미국 특허 제4,985,514호(Kimura 등), 미국 특허 제5,124,416호(Haruna 등) 및 미국 특허 제5,250,640호(Irie 등)에 기재되어 있다.
일반적으로, 단량체의 양은 최종 단량체 혼합물 용액(예컨대, 물, 단량체 및기타 첨가제를 포함)의 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 40 중량%, 바람직하게는 약 3 중량% 내지 약 25 중량%, 가장 바람직하게는 약 5 중량% 내지 약 10 중량%의 범위일 수 있다. 본 명세서에 기술되는 적당한 비율의 단량체와 가교제는 수불용성 및 수팽윤성인 가교된 하이드로겔 물질을 생성시킬 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술되는 비율의 단량체와 가교제는, 분석물질이 신속하게 투과하여 결합 작용기에 결합하도록 하는 개방형 다공성 3차원 중합체 네트워크를 생성시킬 수 있다. 또한, 비결합 샘플 성분은 하이드로겔 물질의 다공성 3차원 중합체 네트워크를 통해 용이하게 씻겨 나갈 수 있다.
단량체와 첨가제의 혼합물의 경우, 상기 단량체에 가교제를 첨가할 수 있다. 필요한 경우, 가교제는 2 이상의 부재의 배합물의 형태로 사용가능하다. 가교제로서 2 이상의 중합성 불포화기를 가지는 화합물을 사용하는 것이 바람직하다. 가교제는 중합체의 인접 분자쇄를 커플링시키고, 따라서 결합 작용기가 부여되는 3차원 비계를 가지는 하이드로겔 물질을 산출한다. 일반적으로, 가교제의 양은 단량체 중량의 약 3% 내지 약 10%의 범위일 수 있다. 최적의 가교제 양은 겔을 생성시키기 위해 사용되는 단량체의 양에 따라 변화한다. 예를 들어, 약 40 중량%의 단량체로부터 생산된 하이드로겔 물질의 경우, 약 3 중량% 이상의 가교제를 사용할 수 있다. 약 5 중량% 내지 약 25 중량%의 단량체로부터 생산된 하이드로겔 물질의 경우, 약 2 중량% 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 3 중량%의 가교제를 사용할 수 있다.
가교제의 전형적인 예로는, N,N'-메틸렌비스(메트)아크릴아미드, (폴리)에틸렌 글리콜 디(메트)아크릴레이트, (폴리)프로필렌 글리콜 디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올-프로판 트리(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판 디(메트)아크릴레이트, 글리세롤 트리(메트)아크릴레이트, 글리세롤 (메트)아크릴레이트, 에틸렌 산화물로 개질된 트리메틸올 프로판 트리(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨 테트라(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨 헥사(메트)아크릴레이트, 트리알릴 시아누레이트, 트리알릴 이소시아누레이트, 트리알릴 포스페이트, 트리알릴 아민, 폴리 (메트)알릴옥시 알칸, (폴리)에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 글리세롤 디글리시딜 에테르, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 이민, 에틸렌 카르보네이트 및 글리시딜(메트)아크릴레이트를 들 수 있다.
단량체, 가교제 및 기타 첨가제를 포함하는 단량체 혼합물 용액에 중합 개시제를 첨가함으로써, 중합을 개시할 수 있다. 개시제의 농도(초기 중합체 용액의 용적당 중량 백분율로 표현함)는 약 0.1 % 내지 약 2 %, 바람직하게는 약 0.2 % 내지 약 0.8 %이다. 예를 들어, 상기 개시제는 자유 라디칼을 생성시킬 수 있다. 적당한 중합 개시제는 열 개시제 및 광 개시제 둘다를 포함한다. 적당한 열 개시제는, 예컨대 과황산암모늄/테트라메틸에틸렌 디아민(TEMED), 2,2'-아조비스(2-아미디노 프로판) 염산, 과황산칼륨/디메틸아미노프로피오니트릴, 2,2'-아조비스(이소부티로니트릴), 4,4'-아조비스-(4-시아노발레르산) 및 벤조일퍼옥시드를 포함한다. 바람직한 열 개시제는, 예컨대 과황산암모늄/테트라메틸에틸렌 디아민 및 2,2'-아조비스(이소부티로니트릴)이다. 광 개시제는, 예컨대 이소프로필티오크산톤, 2-(2'-히드록시-5'-메틸페닐)벤조트리아졸, 2,2'-디히드록시-4-메톡시벤조페논 및 리보플라빈을포함한다. 광 개시제를 사용하는 경우, 중합 공정을 가속화하기 위해 가속제(예: 과황산칼륨 및/또는 TEMED)를 사용할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 단량체 용액을 원 위치에서 기재 표면 상에 중합함으로써, 하이드로겔 물질을 생산한다. 원 위치에서의 중합 방법은 몇가지 장점을 제공한다. 첫째, 기재 표면 상에 배치되는 단량체 용액의 양을 상태 조절하여 하이드로겔 물질의 양을 용이하게 상태 조절함으로써, 유용한 결합 작용기의 양을 상태 조절할 수 있다. 예를 들어, 기재 표면 상에 침착되는 단량체 용액의 양은 피펫팅, 잉크 젯, 실크 스크린, 전자 분무, 스핀 코팅 또는 화학 증착과 같은 방법을 사용하여 상태 조절할 수 있다. 둘째, 기재 표면으로부터의 하이드로겔 물질의 높이도 상태 조절함으로써, 기재 표면으로부터 비교적 균일한 높이를 제공할 수 있다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 하이드로겔 물질 높이에 있어서의 균일성은 보다 정학한 샘플의 고속 분석을 제공할 수 있는데, 이는 모든 탐침 표면 상에 결합된 분석물질이 기체상 이온 분광계의 이온화 공급원으로부터 등거리에 있기 때문이다.
원 위치에서의 단량체 중합의 경우, 중합의 광개시가 바람직하다. 예를 들어, 단량체, 가교제 및 광 개시제는 수중에서 혼합된 후, 탈가스된다. 그 후, 신선하게 혼합된 과황산암모늄 또는 기타 가속제를 첨가한다. 기재 상에 단량체 용액을 침착시킨 후, 방사선 조사(예: UV 노출)에 의해 혼합물 용액을 원 위치에서 기재 표면 상에 중합한다. 연이어, 임의의 공지 방법(예: 공기 건조, 증기 건조, 적외선 건조, 진공 건조 등)에 의해 단량체 혼합물 용액을 건조시킬 수 있다. 경우에 따라, 저장을 위해 특정 하이드로겔 물질을 처리할 수 있다. 예를 들어, 카르복실기함유 하이드로겔 물질을 포함하는 탐침은, 짝 이온으로서 나트륨을 가지는 염의 형태로 저장할 수 있다.
C. 결합 작용기를 포함하는 균일 입자들
본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 탐침은 기재, 및 기재 표면 상에 배치되고 직경이 균일한 다수의 입자들을 포함한다. 상기 입자들은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함한다. 입자의 평균 직경 또는 크기는 약 0.01 ㎛ 내지 약 1000 ㎛, 바람직하게는 약 0.1 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 보다 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛의 범위일 수 있다. 일관된 질량 분해능 및 강도를 제공하기 위해서, 입자들의 크기 또는 직경은 균일한 것이 바람직하다. 예를 들어, 입자들의 직경 편차의 계수는, 약 5% 이하, 바람직하게는 약 3% 이하, 보다 바람직하게는 약 1% 이하일 수 있다.
입자들은, 결합 작용기를 제공할 수 있는 임의의 적당한 물질로 제조할 수 있다. 상기 물질은, 예컨대 가교된 폴리스티렌 중합체, 다당류, 아가로오스, 덱스트란, 메타크릴레이트, 작용성이 있는 이산화실리콘을 포함한다. 상기 균일한 입자들 중 일부는 라텍스 비드를 칭하며, 예컨대 Bangs Laboratories, Inc.(인디아나주 피셔 소재) 또는 3M(미네소타주 미네아폴리스 소재)에서 시판된다.
일 구체예에 있어서, 입자들은 전술한 바와 같은 결합 작용기를 포함하는 하이드로겔 물질(예: 치환된 아크릴아미드 또는 치환된 아크릴레이트로부터 유도된 중합체 또는 공중합체)로 제조할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 비하이드로겔 입자들은 결합 작용기를 포함하는 하이드로겔 물질로 피복할 수 있다.
입자들의 결합 작용기는, 예컨대 카르복실기, 설포네이트기, 포스페이트기, 암모늄기, 친수성기, 소수성기, 반응성기, 금속 킬레이트기, 티오에테르기, 비오틴기, 보로네이트기, 염료기, 콜레스테롤기 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 소정의 결합 작용기를 가지는 입자들의 합성은 문헌[Advanced organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structures, 제4판, March(John Wiley & Sons, 뉴욕(1992))]을 참조하라. 또한, 상기 균일 입자들 중 일부는 작용성 형태로 시판된다.
D. 기재 상에의 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들의 배치
하이드로겔 물질은 기재 상에 불연속적으로 또는 연속적으로 존재할 수 있다. 불연속적으로 존재하는 경우, 1, 10, 100, 1000, 10,000 또는 그 이상의 하이드로겔 물질 반점이 단일 기재 상에 존재할 수 있다. 실험적 고안 및 의도에 따라 반점의 크기는 다양하다. 그러나, 그것은 충돌 이온화 공급원의 직경(예: 레이저 반점 직경)보다 클 필요는 없다. 예를 들어, 반점의 직경은 약 0.5 ㎜ 내지 약 5 ㎜, 바람직하게는 약 1 ㎜ 내지 약 2 ㎜일 수 있다. 반점은 동일하거나 상이한 하이드로겔 물질과 계속 존속할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 다수의 상이한 용리액에 대한 평가가 가능하도록 또는 결합된 분석물질이 장래의 사용을 위해 보존될 수 있도록, 기재 상의 여러 위치에 동일한 하이드로겔 물질을 제공하는 것은 잇점이 있다. 상이한 결합 특성을 가지는 다수의 상이한 하이드로겔 물질을 기재에 제공하는 경우, 단일 샘플로부터 보다 광범위한 상이한 분석물질을 결합시키고 검출하는 것이 가능하다. 단일 샘플의 평가를 위해 기재 상의 다수의 상이한 하이드로겔 물질을 사용하는 것은 상이한 크로마토그래피 칼럼으로 다중 크로마토그래피 실험을 각각 동시에 수행하는 것과 본질적으로 동등하지만, 본 발명의 방법은 단지 단일 시스템을 필요로 하는 잇점이 있다.
기재가 다수의 하이드로겔 물질을 포함하는 경우, 예정된 주소형 위치에 하이드로겔 물질을 제공하는 것이 특히 유용하다[예컨대, 도 1에 도시된 하이드로겔 물질 (102) 참조]. 주소형 위치는 임의의 패턴으로 배열할 수 있지만, 규칙적인 패턴[예: 직선형 배열, 직교형 배열 또는 규칙적인 곡선형(예컨대, 원형) 배열]으로 배열하는 것이 바람직하다. 예정된 주소형 위치에 하이드로겔 물질을 제공하여, 일련의 용리액으로 하이드로겔 물질 각각의 위치를 세척함으로써, 하이드로겔 물질의 결합 특성을 상태 조절할 수 있다. 또한, 병진가능한 캐리지 내에 탐침을 탑재하는 경우, 예정된 주소형 위치에서 하이드로겔 물질에 결합된 분석물질은 인접 위치로 이동하여 기체상 이온 분광계에 의한 분석물질의 검출을 촉진시킨다.
대안으로, 하이드로겔 물질은 기재 상에 연속적으로 존재할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 기재 표면 전체에 한가지 유형의 하이드로겔 물질을 배치시킬 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 1차원 그래디언트 또는 2차원 그래디언트로 기재 상에 상이한 결합 작용기를 포함하는 다수의 하이드로겔 물질을 배치시킬 수 있다. 예를 들어, 대상(帶狀)의 한쪽 말단에 약한 소수성 하이드로겔 물질을 제공하고, 반대쪽 말단에 강한 소수성 하이드로겔 물질을 제공할 수 있다. 혹은, 평판의 한쪽 구석에 약한 소수성 및 음이온성 하이드로겔 물질을 제공하고, 대각선 반대쪽 구석에 강한 친수성 및 음이온성 하이드로겔 물질을 제공할 수 있다. 상기 그래디언트는 임의의 공지된 방법에 의해 달성가능하다. 예를 들어, 그래디언트 차원 이상의 반응 완결이 가능하도록 제어형 분무를 수행하거나 시간형(time-wise) 방식으로 표면을 가로질러 물질을 흘려 보냄으로써, 상기 그래디언트를 달성할 수 있다. 또한, 광화학 반응기를 방사선 조사와 결합시켜 단계식 그래디언트를 창출할 수 있다. 이 방법을 직각으로 반복함으로써, 상이한 결합 작용기를 가지는 유사하거나 상이한 하이드로겔 물질의 직교형 그래디언트를 제공할 수 있다.
또한, 하이드로겔 물질의 배치에 관한 상기 내용은 기재 상에의 균일 입자들의 배치에도 적용되지만, 언급을 생략하기로 한다.
Ⅲ. 분석물질의 선택 및 검출
샘플로부터 분석물질을 선택적으로 흡착시키고, 보류된 분석물질을 기체상 이온 분광계에 의해 검출하는데 전술한 시스템을 사용할 수 있다. 다수의 상이한 선택 조건 하에 분석물질을 선택적으로 흡착시킬 수 있다. 예를 들어, 상이한 결합 작용기를 가지는 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들은 상이한 분석물질을 선택적으로 포획한다. 또한, 용리액은 하이드로겔 물질, 균일 입자들 또는 분석물질의 결합 특성을 상태 조절할 수 있고, 따라서 동일한 하이드로겔 물질, 균일 입자들 또는 분석물질에 대한 상이한 선택 조건을 제공한다. 각각의 선택 조건은 흡착되지 않은 분석물질로부터 흡착된 분석물질을 분리시키는 1차원 분리를 제공한다. 기체상 이온 분광계는 질량에 따라 흡착된 분석물질을 각각 다른 분석물질과 분리시키는 2차원 분리를 제공한다. 이러한 다차원 분리는 분석물질의 분해능 및 특성화를 제공하고, 이 방법을 리텐테이트 크로마토그래피(retentate chromatography)라 칭한다.
리텐테이트 크로마토그래피는 몇가지 방식에 있어서 종래의 크로마토그래피와 구별된다. 첫째, 리텐테이트 크로마토그래피의 경우, 흡착제(예: 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들) 상에 보류된 분석물질을 검출한다. 종래의 크로마토그래피 방법의 경우, 검출 전에 흡착제로부터 분석물질을 용리시킨다. 종래의 크로마토그래피에 있어서, 흡착제로부터 용리되지 않은 분석물질을 검출하는 전형적이거나 편리한 수단은 없다. 따라서, 리텐테이트 크로마토그래피는 보류된 분석물질의 화학적 또는 구조적 특징에 대한 직접적인 정보를 제공한다. 둘째, 탈착 분광계에 의한 검출과 흡착 크로마토그래피의 커플링은 펨토(10-15) 몰 범위에서 특별한 감수성 및 특별히 우수한 분해능을 제공한다. 세째, 부분적으로, 리텐테이트 크로마토그래피는 분석물질의 직접 검출이 가능하기 때문에 광범위하게 상이한 선택 조건으로 보류된 분석물질을 신속하게 분석할 수 있는 성능을 제공하고, 따라서, 샘플 내의 분석물질의 신속한 다차원 특성화를 제공한다. 네째, 예정된 주소형 위치의 배열 내의 기재에 흡착제(예: 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들)를 부착시킬 수 있다. 이는 상이한 용리 조건 하에서 배열 상의 상이한 흡착제 부위(즉, "친화성 부위" 또는 "반점")에 노출된 분석물질의 병행 처리를 가능하게 한다.
A. 선택 조건에의 분석물질의 노출
1. 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들에의 분석물질의 접촉
분석물질과 하이드로겔 물질 간의 결합을 가능하게 하는 임의의 적당한 방법을 사용하여 기재 상에 하이드로겔 물질을 배치하기 이전 또는 이후에 하이드로겔 물질에 샘플을 접촉시킬 수 있다. 샘플과 하이드로겔 물질을 단순히 혼합하거나 결합시킬 수 있다. 샘플에 기재를 중탕하거나 침지시킴으로써, 또는 샘플에 기재를 침액시킴으로써, 또는 기재 상에 샘플을 분무함으로써, 또는 기재 위의 샘플을 세척함으로써 하이드로겔 물질에 샘플을 접촉시킬 수 있다. 또한, 샘플을 가용화하거나 또는 용리액과 샘플을 혼합하고 전술한 공지의 방법 및 기타 공지의 방법(예: 중탕, 침지, 침액, 분무, 세척 또는 피펫팅)을 사용하여 하이드로겔 물질에 용리액 및 샘플의 용액을 접촉시킴으로써, 하이드로겔 물질에 샘플을 접촉시킬 수 있다. 일반적으로, 약 1 ㎕ 내지 약 500 ㎕ 중 약간의 원자몰 내지 100 피코몰의 분석물질을 함유하는 샘플의 용적은 하이드로겔 물질에 결합하기에 충분하다.
분석물질을 하이드로겔 물질에 결합하도록 하기에 충분한 기간 내에 하이드로겔 물질에 샘플을 접촉시켜야 한다. 일반적으로, 약 30 초 내지 약 12 시간 내에 하이드로겔 물질과 샘플을 접촉시킨다. 약 30 초 내지 약 15 분 내에 하이드로겔 물질에 샘플을 접촉시키는 것이 바람직하다.
샘플이 하이드로겔 물질에 접촉하는 온도는 특정 샘플과 선택된 하이드로겔 물질의 함수이다. 일반적으로, 상온 및 상압 조건 하에 하이드로겔 물질에 샘플을 접촉시킨다, 그러나, 일부 샘플의 경우, 변경된 온도(일반적으로 4 ℃ 내지 37 ℃) 및 압력 조건이 적당하고, 이는 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 하이드로겔 물질에의 분석물질의 접촉에 관한 상기 내용은 균일 입자들에의 분석물질의 접촉에도 적용되지만, 언급을 생략하기로 한다.
2. 용리액으로 하이드로겔 물질 또는 균일 입자들의 세척
하이드로겔 물질에의 분석물질의 결합을 일으켜 분석물질과 샘플을 접촉시킨후, 용리액으로 하이드로겔 물질을 세척한다. 일반적으로, 다차원 분석을 제공하기 위해서, 각각의 하이드로겔 위치를 다수의 상이한 용리액으로 세척함으로써, 특정 하이드로겔 물질 상에 보류된 분석물질 집단(population)을 상태 조절할 수 있다. 하이드로겔 물질의 결합 특성과 용리액의 용리 특성의 조합은 세척 후 하이드로겔 물질에 의해 보류된 분석물질을 상태 조절하는 선택 조건을 제공한다. 따라서, 세척 단계는 하이드로겔 물질로터 샘플 성분을 선택적으로이동시킨다.
용리액은 하이드로겔 물질의 결합 특성을 상태 조절할 수 있다. 용리액은 예컨대 전하, pH, 이온 강도(예: 용리액 중 염의 양에 기인), 물 구조(예: 우레아 및 카오트로픽 염 용액의 봉입에 기인), 특이성 경쟁적 결합제, 표면 장력(예: 세정제 또는 계면활성제의 봉입에 기인), 유전 상수(예: 우레아, 프로판올, 아세토니트릴, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 세정제의 봉입에 기인) 및 이들의 조합의 관점에서 하이드로겔 물질의 선택성을 상태 조절할 수 있다. 일반적으로 흡착제의 결합 특성을 상태 조절할 수 있는 용리액의 다른 예에 관하여는 예컨대 WO98/59361을 참조하라.
결합된 분석물질로 하이드로겔 물질을 세척하는 것은, 예컨대 중탕, 침지, 침액, 헹구기, 분무 또는 용리액으로 기재를 세척하는 것에 의해 달성할 수 있다. 용리액을 하이드로겔 물질의 작은 반점에 도입하는 경우, 미시유체 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
용리액이 하이드로겔 물질에 접촉하는 온도는 특정 샘플과 선택된 하이드로겔 물질의 함수이다. 일반적으로, 0 ℃ 내지 100 ℃, 바람직하게는 4 ℃ 내지 37 ℃의 온도에서 하이드로겔 물질에 용리액을 접촉시킨다. 그러나, 일부 용리액의 경우, 변경된 온도가 적당하고, 이는 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
분석물질이 단지 한 위치에서 하이드로겔 물질에 결합하고, 세척 단계에서 다수의 상이한 용리액이 사용되는 경우, 각각의 용리액의 존재 하의 하이드로겔 물질의 선택성에 관한 정보는 개별적으로 수득할 수 있다. 제1 용리액으로 세척하고, 보류된 분석물질을 탈착 및 검출하는 단계; 이어서 제2 용리액으로 세척하고, 보류된 분석물질을 탈착 및 검출하는 단계를 반복하는 패턴에 의해 용리액으로 각각 세척한 후, 한 위치에서 하이드로겔 물질에 결합된 분석물질을 측정할 수 있다. 세척 후 탈착 및 검출 공정은, 동일한 하이드로겔 물질을 사용하여 다수의 상이한 용리액에 대해 연속적으로 반복할 수 있다. 이러한 방법으로, 단일 위치에서 보류된 분석물질과 하이드로겔 물질은 다수의 용리액으로 재시험하여 각각의 개별 세척 후 보류된 분석물질에 관한 정보의 수집을 제공한다.
또한, 하이드로겔 물질이 모두 동일하든 상이하든 불문하고, 다수의 예정된 주소형 위치에 하이드로겔 물질을 제공하는 경우, 전술한 방법은 유용하다. 그러나, 다수의 위치에서 동일하거나 상이한 하이드로겔 물질에 분석물질을 결합시키는 경우, 대안으로 병행 처리를 비롯한 보다 체계적이고 효율적인 방법을 사용하여 세척 공정을 수행할 수 있다. 다시 말해서, 용리액으로 모든 하이드로겔 물질을 세척한 후, 하이드로겔 물질의 각 위치에 대해 보류된 분석물질을 탈착시키고 검출하였다. 경우에 따라, 모든 하이드로겔 물질 위치의 세척 공정 후, 다수의 상이한 용리액에 대해 각 하이드로겔 물질 위치에서의 탈착 및 검출 공정을 반복하였다. 이러한 방법으로, 샘플 내의 분석물질의 특징을 효율적으로 측정하는데 전체 배열을 이용할 수 있다.
또한, 하이드로겔 물질의 세척에 관한 상기 논의 내용은 균일 입자들의 세척에도 적용되지만, 언급을 생략하기로 한다.
B. 분석물질의 탈착 및 검출
본 발명의 탐침 상에 결합된 분석물질은 기체상 이온 분광계를 사용하여 분석할 수 있다. 이는 예컨대 질량 분광계, 이온 이동 분광계 또는 총 이온 전류 측정 장치를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 탐침과 함께 질량 분광계를 사용한다. 본 발명의 탐침에 결합된 고체 샘플을 질량 분광계의 유입구 시스템에 도입시킨다. 이어서, 이온화 공급원에 의해 샘플을 이온화시킨다. 전형적인 이온화 공급원은 예컨대 레이저, 빠른 원자 충격 또는 플라즈마를 포함한다. 생성된 이온이 이온 광학 집결기에 의해 수집되고, 이어서 질량 분석기는 통과하는 이온을 분산시키고 분석한다. 질량 분석기를 빠져 나가는 이온은 검출기에 의해 검출한다. 이어서, 검출기는 검출된 이온에 대한 정보를 질량 대 전하 비율로 해석한다. 일반적으로, 분석물질의 검출은 신호 강도의 검출을 포함한다. 이는 탐침에 결합된 분석물질의 양을 차례로 반영한다. 질량 분석에 관한 추가 정보의 경우, 예컨대 문헌[Principles of Instrumental Analysis, 제3판, Skoog, Saunders College 발행, 필라델피아, 1985] 및 문헌[Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 제4판, Vol. 15(John Wiley & Sons, 뉴욕 1995), pp.1071-1094]를 참조하라.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 탐침과 함께 레이저 탈착 고속 질량분광계를 사용한다. 레이저 탈착 질량 분광계에 있어서, 탐침 상의 샘플을 유입구 시스템에 도입시킨다. 샘플을 탈착시키고, 이온화 공급원으로부터의 레이저에 의해 기체상으로 이온화시킨다. 이온 광학 집결기에 의해 생성된 이온을 수집한 후, 고속 질량 분석기에서 짧고 높은 전압장을 통해 이온을 가속시키고, 높은 진공 체임버로 표류시킨다. 높은 진공 체임버의 맨 끝에서, 가속된 이온은 상이한 시간에 감수성 검출기 표면을 강타한다. 고속은 이온 질량의 함수이기 때문에, 특정 질량의 분자의 존부를 동정하는데 이온화와 충돌 사이에 경과된 시간을 사용할 수 있다. 당업자가 이해하듯이, 레이저 탈착 고속 질량 분광계의 임의의 상기 성분은, 탈착, 가속, 검출, 시간 측정 등 각종 수단을 이용하는 질량 분광계의 집결기 내의 본 명세서에 기술된 다른 성분과 배합될 수 있다.
또한, 이온 이동 분광계는 샘플을 분석하는데 사용할 수 있다. 이온 이동 분광계의 원리는 이온의 상이한 이동에 기초한다. 구체적으로, 샘플의 이온은 예컨대 질량, 전하 또는 형태의 차이로 인하여 상이한 속도로 전기장의 영향 하에 튜브를 통해 이동한다. 이온(일반적으로, 전류의 형태로)은 검출기에 기록된 후, 샘플을 동정하는데 사용할 수 있다. 이온 이동 분광계의 한가지 장점은 대기압에서 작동할 수 있다는 것이다.
또한, 총 이온 전류 측정 장치도 샘플을 분석하는데 사용할 수 있다. 탐침이 오로지 단일 유형의 분석물질만 결합되게 하는 표면 화학작용을 가지는 경우, 상기 장치를 사용할 수 있다. 탐침 상에 단일 유형의 분석물질이 결합되는 경우, 이온화된 분석물질로부터 생성된 총 전류는 분석물질의 성질을 반영한다. 이어서, 분석물질로부터의 총 이온 전류를 공지 물질의 저장된 총 이온 전류와 비교할 수 있다. 따라서, 탐침 상에 결합된 분석물질의 동정을 검측할 수 있다.
분석물질의 탈착 및 검출에 의해 산출된 데이타는 프래그램 저장 가능(programmable) 디지탈 컴퓨터를 사용하여 분석할 수 있다. 일반적으로, 컴퓨터 프로그램은 코드(code)를 저장하는 판단성 매체를 함유한다. 특정 코드는 탐침 상의 각 피처(feature)의 위치, 상기 피처에서의 하이드로겔 물질(또는 균일 입자들)의 동정, 및 하이드로겔 물질(또는 균일 입자들)을 세척하는데 사용되는 용리 조건을 포함한다. 이어서, 상기 정보를 사용하여 특정 선택 특성을 한정하는 탐침 상의 일련의 피처를 동정할 수 있다. 또한. 컴퓨터는 탐침 상의 특정 주소형 위치로부터 받는 각종 분자량에서의 신호의 강도에 대한 입력 데이타로 받는 코드를 포함한다. 이 데이타는 검출된 분석물질의 수를 나타내고, 검출된 각 분석물질에 대한 신호의 강도 및 측정된 분자량을 임의로 포함한다.
또한, 컴퓨터는 데이타를 처리하는 코드를 포함한다. 본 발명은 데이타를 처리하는 다양한 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 있어서, 이것은 분석물질 인식 프로필을 산출하는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 결합 특성(예: 음이온 하이드로겔 물질 또는 소수성 하이드로겔 물질에 대한 결합)에 따라, 분자량에 의해 동정된 특정 분석물질의 보류에 대한 데이타를 분석할 수 있다. 상기 수집된 데이타는 특정 분석물질의 화학적 특성의 프로필을 제공한다. 보류 특성은 차례로 구조를 반영하는 분석물질 작용을 반영한다. 예를 들어, 금속 킬레이트기에 대한 보류는 폴리펩티드 분석물질 내의 히스티딘 잔기의 존재를 반영한다. 다양한 pH 수준에서의 용리 하에 다수의 양이온 및 음이온에 대한 보류 수준의 데이타를 사용하여, 단백질의 등전점을 유도할 수 있는 정보를 나타낸다. 이것은 단백질 내의 이온성 아미노산의 가능한 수를 차례로 반영한다. 따라서, 컴퓨터는 결합 정보를 구조 정보로 변형시키는 코드를 포함한다.
또한, 컴퓨터 프로그램은 입력으로서 프로그래머로부터 지시를 받는 코드를 포함한다. 탐침 내의 구체적이고 예정된 위치로부터 분석물질의 선택적 탈착에 대한 진보되고 논리적인 경로를 예상하고 미리 프로그램을 만들 수 있다.
컴퓨터는 데이타를 다른 프리젠테이션용 포맷으로 변형시킬 수 있다. 데이타 분석은 예컨대, 수집된 데이타로부터 피처 위치의 작용으로서 신호 강도를 측정하는 단계; "아웃라이어(outliers)"(예정된 통계 분포로부터 벗어난 데이타)를 제거하는 단계; 및 남아있는 데이타로부터 분석물질의 상대 결합 친화성을 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
생성된 데이타는 다양한 포맷으로 디스플레이할 수 있다. 일 포맷에 있어서, 신호의 강도를 분자량의 함수로서 그래프 상에 디스플레이한다. "겔 포맷(gel format)"이라고도 하는 다른 포맷에 있어서, 신호의 강도는 암흑(darkness) 강도 축에 직선형으로 디스플레이되어 겔 상의 밴드와 유사형 외관을 나타낸다. 다른 포맷에 있어서, 특정 최저 한계에 달하는 신호는 분자량을 나타내는 수평축 상에 수직 선 또는 바(bar)로서 표시된다. 따라서, 각 바는 검출된 분석물질을 나타낸다. 또한, 데이타는 결합 특성 및/또는 용리 특성에 따라 그룹을 형성한 분석물질에 대한 신호 강도의 그래프에 나타낼 수 있다.
C. 분석물질
본 발명은 분석물질의 각종 생물학적, 화학적, 또는 물리화학적 특성 및 적절한 선택 조건에 기초한 분석물질의 분해를 허용한다. 적절한 선택 조건의 사용을 통해 이용가능한 분석물질의 특성은, 예를 들어 소수성 지수(또는 분석물질 내의 소수성 잔기의 측정), 등전점(즉, 분석물질이 전하를 가지지 않는 pH), 소수성 모멘트(또는 분석물질의 양친매성 또는 분석물질 내의 전하의 분포에 있어서의 비대칭도의 측정), 인접 이중극자 모멘트(또는 분석물질 내의 전하 분포에 있어서의 비대칭 측정), 분자 구조 인자(분자의 골격과 함께 부피가 큰 측쇄의 분포와 같은 분석물질 분자의 표면 윤곽에 있어서의 편차를 설명하는), 2차 구조 구성요소(예: 나선, 평행 및 역평행 시트), 디설피드 밴드, 용매에 노출된 전자 공여기(예: His), 방향족성[또는 분석물질 내의 방향족 잔기 간의 파이-파이(pi-pi) 상호작용] 및 하전된 원자 간의 직선 거리를 포함한다.
이들은, 적당한 선택 조건의 선택에 의한 샘플로부터 소정의 분석물질을 분해하기 위해 이용할 수 있는 특성 유형의 대표적인 예이다. 샘플로부터 특정 분석물질을 분해하기 위한 기초를 형성할 수 있는 분석물질의 기타 적당한 특성은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
임의의 유형의 샘플을 분석할 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 샘플은 액체 상태이지만, 고체, 액체 또는 기체 상태로 존재할 수 있다. 당업계에 주지된 기술에 따라 액체 샘플을 제공하도록, 적당한 용매에 고체 또는 기체 상태의 샘플을 가용화하는 것이 바람직하다. 샘플은 생물학적 조성물, 비생물학적 유기 조성물 또는무기 조성물일 수 있다. 본 발명의 기술은 생물학적 샘플, 특히 생물학적 유체 및 추출물 내의 분석물질을 분해하고; 비생물학적 유기 조성물, 특히 소규모 유기 또는 무기 분자의 조성물 내의 분석물질을 분해하는데 유용하다.
분석물질은 분자, 다량체 분자 복합체, 거대분자 집결체, 세포, 세포하 소기관, 바이러스, 분자 단편, 이온 또는 원자일 수 있다. 분석물질은 샘플의 단일 성분이거나; 또는 통상 하나 이상의 특성(예: 분자량, 등전점, 이온 전하, 소수성/친수성 상호작용 등)을 가지는 구조적으로, 화학적으로, 생물학적으로 또는 기능적으로 관련된 성분류일 수 있다.
구체적으로, 분석물질의 예는 생물학적 거대분자[예컨대 펩티드, 단백질, 효소, 효소 기질, 효소 기질 유사체, 효소 저해제, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 탄수화물, 올리고당류, 다당류, 아비딘, 스트렙타비딘, 렉틴, 펩스타틴, 프로테아제 저해제, 단백질 A, 아글루티닌, 헤파린, 단백질 G, 콘카나발린]; 전술한 생물학적 거대분자의 단편[예컨대, 핵산 단편, 펩티드 단편 및 단백질 단편]; 전술한 생물학적 거대분자 복합체[예컨대, 핵산 복합체, 단백질-DNA 복합체, 유전자 전사 복합체, 유전자 해독 복합체, 막, 리포좀, 막 수용체, 수용체-리간드 복합체, 신호 경로 복합체, 효소-기질, 효소 저해제, 펩티드 복합체, 단백질 복합체, 탄수화물 복합체 및 다당류 복합체]; 소규모 생물학적 분자[예컨대, 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당류, 스테로이드류, 지방, 금속 이온, 약물, 호르몬, 아미드, 아민, 카르복실산, 비타민 및 조효소, 알콜, 알데히드, 케톤, 지방산, 포르피린, 카로테노이드, 식물 성장 상태 조절제, 포스페이트 에스테르 및 뉴클레오시드 디포스포-당류, 합성 소규모 분자(예: 약학적 또는 치료학적 유효 제제), 단량체, 펩티드 유사체, 스테로이드 유사체, 저해제, 돌연변이 유발물질, 발암성 물질, 항유사분열 약물, 항생물질, 이오노포아, 대사길항물질, 아미노산 유도체, 항균제, 수송 저해제, 표면 활성제(계면활성제), 아민 함유 조합형 라이브러리, 염료, 독소, 비오틴, 비오틴화된 화합물, DNA, RNA, 리신, 아세틸글루코사민, 프로시온 레드, 글루타티온, 아데노신 모노포스페이트, 미토콘드리아 및 엽록체 작용 저해제, 전자 공여체, 담체 및 수용체, 프로테아제용 합성 기질 및 유사체, 포스파타제용 기질 및 유사체, 에스테라제 및 리파제용 기질 및 유사체, 및 단백질 개질제]; 및 합성 중합체, 올리고머 및 공중합체[예컨대, 폴리알킬렌, 폴리아미드, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리설폰, 폴리스티렌, 폴리에테르, 펄리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리카르보네이트, 폴리비닐 할라이드, 폴리실록산, POMA, PEG, 및 이들 중 임의의 2 이상의 공중합체]를 포함한다.
하기 실시예들은 예시 목적으로 제공되는 것이지 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.
Ⅰ. 탐침의 실시예
후술하는 SAX-2 Protein Chip, WCX-1 Protein Chip및 IMAC-3 Protein Chip은 캘리포니아주 팔로 알토 소재 Ciphergen Biosystems Inc.에서 시판한다.
A. SAX-2 Protein Chip (강한 음이온 교환기, 양이온 표면)
먼저, 1999. 4. 29. 출원된 가출원 S.N. 60/131,652에 기재되어 있는 SAX-1Protein Chip은 Ciphergen Biosystems Inc.에 의해 SAX-2 Protein Chip으로 개명되었다는 것을 지적한다. 따라서, SAX-1 및 SAX-2 Protein Chip은 동일한 칩이다.
금속 기재의 표면은 레이저[예: Quantred Company, Galaxy model, ND-YAG 레이저(1.064 m의 방출선, 30-35 와트의 전력, 0.005 인치의 레이저 반점 크기, 12-14 인치의 표면 거리에 대한 레이저 공급, 초당 약 25 분의 주사 속도를 사용)]를 통한 에칭에 의해 상태 조절하였다. 이어서, 금속 기재의 에칭된 표면은 유리 코팅으로 피복하였다.
광개시제로서의 (-)-리보플라빈(0.01 중량%) 및 가속제로서의 과황산암모늄 (0.2 중량%)을 사용하여, 3-(메타크릴로일아미노)프로필 트리메틸암모늄 클로라이드(15 중량%) 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(0.4 중량%)를 광중합하였다. 거칠게 에칭되고, 유리 피복된 기재 상에 단량체 용액을 침착시키고(0.4 ㎕, 2 회), 근접 UV 노출 시스템(Hg 짧은 아크 램프, 365 nm에서 20 mW/㎠)으로 5 분 동안 방사선 조사를 행하였다. 염화나트륨 용액(1 M)으로 표면을 세척한 후, 탈이온수로 표면을 2 회 세척하였다.
B. WCX-1 Protein Chip (약한 양이온 교환기, 음이온 표면)
전술한 바와 같이 기재의 표면을 상태 조절하였다.
광개시제로서의 (-)-리보플라빈 (0.01 중량%) 및 가속제로서의 과황산암모늄 (0.2 중량%)을 사용하여, 2-아크릴아미도글리콜산(15 중량%) 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(0.4 중량%)를 광중합하였다. 거칠게 에칭되고, 유리 피복된 기재 상에단량체 용액을 침착시키고(0.4 ㎕, 2 회), 근접 UV 노출 시스템(Hg 짧은 아크 램프, 365 nm에서 20 mW/㎠)으로 5 분 동안 방사선 조사를 행하였다. 염화나트륨 용액(1 M)으로 표면을 세척한 후, 탈이온수로 표면을 2 회 세척하였다.
C. IMAC-3 Protein Chip (부동화 금속 친화성 포획, 표면 상의 니트릴로트리아세트산)
전술한 바와 같이 기재의 표면을 상태 조절하였다.
광개시제로서 (-)-리보플라빈(0.02 중량%)을 사용하여, 5-메타크릴아미도-2-(N,N-비스카르복시메타일아미노)펜타노산(7.5 중량%), 아크릴로일트리(히드록시메틸)메틸아민 (7.5 중량%) 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(0.4 중량%)를 광중합하였다. 거칠게 에칭되고, 유리 피복된 기재 상에 단량체 용액을 침착시키고(0.4 ㎕, 2 회), 근접 UV 노출 시스템(Hg 짧은 아크 램프, 365 nm에서 20 mW/㎠)으로 5 분 동안 방사선 조사를 행하였다. 염화나트륨 용액(1 M)으로 표면을 세척한 후, 탈이온수로 표면을 2 회 세척하였다.
Ⅱ. 리텐테이트 크로마토그래피용 프로토콜
A. SAX-2 Protein Chip 을 사용하는 프로토콜
SAX-2 탐침은 기재 상에 4차 암모늄 염(강한 양이온 부분)을 함유한다. 샘플 도포 전에 pH 순환 과정이 필요없다. 단지 결합 완충제 내의 반점을 평형시킴으로써 표면을 제조한다. 하기 프로토콜은 예시적인 것이고, 적당한 변경은 당업자에게 명백할 것이다.
1. 소수성 펜(예: 캘리포니아주 버링검 소재 Vector Laboratories의ImmEdge펜)을 사용하여 하이드로겔 물질의 각 반점에 대한 개요도를 작성하라.
2. 각 반점에 10 ㎕의 결합 완충제를 적재하고, 고주파 진탕기(예: 캘리포니아주 팔로 알토 소재 Tomy Tech USA의 TOMMY MT-360 마이크로튜브 믹서) 상에서 실온으로 5분 동안 항온배양하라. 완충제는 공기 건조시키지 않는 것이 바람직하다.
3. 반점으로부터 과량의 완충제를 제거하라. 반점의 표면을 건드리지 않으며 반점을 건조시키지 않는 것이 바람직하다. 단계 2 및 단계 3을 1 회 이상 반복하라.
4. 반점당 2-3 ㎕의 샘플을 적재하라. 결합 완충제 내에서 샘플을 제조할 수 있다.
5. 주(註): 결합 완충제 내에 염을 피하는 것이 바람직하다. 또한, 결합 및 세척 완충제(예: 0.1% OGP 또는 Triton X-100) 내에 비이온성 세정제를 포함하여 비특이성 결합을 감소시키는 것이 바람직하다.
6. 또한, 결합 및/또는 세척 완충제의 pH 및 이온 강도를 변화시켜 이온 결합을 상태 조절할 수 있다.
7. 플라스틱 적하(積荷) 튜브 내에 탐침을 배치하고, 탐침에 대한 습윤 조직의 플러그를 밀어 수직으로 유지하고, 캡을 닫아 습윤 체임버를 산출하라.
8. 고주파 진탕기 상의 튜브 내에서 20 분 내지 30 분 동안 탐침을 항온배양하라. 접착 테이프로 진탕기 상의 튜브를 안전하게 하라. (주: 고주파 진탕기 상의 탐침의 항온배양은 결합 효율을 향상시킬 수 있지만, 진탕기를 이용할 수 없더라도 습윤 체임버 내에서 30 분 내지 1 시간 동안 탐침을 항온배양할 수 있다.)
9. 5 ㎕의 결합 완충제로 각 반점을 5 회 세척한 후, 물(5 ㎕)로 빨리 세척(2 회)하라.
10. 반점 주위를 닦아서 건조시켜라. 각 반점이 충분히 젖은 경우, 각 반점에 0.5 ㎕의 포화 EAM 용액을 첨가하라. 각 반점에 0.5 ㎕의 포화 EAM 용액의 제2 분취량을 도포하라. 공기 건조시키라.
11. 질량 분광계(예: SELDI단백질 생물 시스템)를 사용하여 탐침을 분석하라. (주: 저질량 영역 내에서 EAM 피크가 샘플 피크를 방해하는 경우, 먼저 EAM 을 첨가할 수 있다. 또한, 도구의 강도를 감소시켜 EAM 신호를 감소시킬 수 있다.)
상기 프로토콜용으로 추천되는 완충제는 20 mM 내지 100 mM의 나트륨 아세테이트 또는 암모늄 아세테이트, 트리스 HCl 및 비이온성 세정제(예: 0.1% Triton X-100)를 함유하는 50 mM의 트리스 염기(pH >9의 경우) 완충제이다.
B. WCX-1 Protein Chip 을 사용하는 프로토콜
WCX-1 탐침은 표면 상에 카르복실기(약한 음이온 부분)을 함유하고, 짝이온으로 나트륨을 가지는 염 형태로 저장할 수 있다. 질량 스펙트럼에서 나트륨 부가 생성물 피크를 최소화하기 위해, 샘플을 적재하기 전에 휘발성 염을 함유하는 완충제(예: 암모늄 아세테이트 완충제)로 탐침을 미리 처리하는 것을 권한다. 하기 프로토콜은 예시적인 것이고, 적당한 변경은 당업자에게 명백할 것이다.
1. 로커(rocker) 상에서 10 mM 염산 10 ㎖로 5 분 동안 세척함으로써 탐침을 미리 처리하라. 10 ㎖의 물로 3 회 헹구어라. 반점 주위를 닦아 건조시켜라.
2. 소수성 펜(예: 캘리포니아주 버링검 소재 Vector Laboratories의ImmEdge펜)을 사용하여 하이드로겔 물질의 각 반점에 대한 개요도를 작성하라.
3. 각 반점에 pH 6.5(또는 결합 완충제의 pH에서)의 100 mM 암모늄 아세테이트 10 ㎕를 적재하고, 고주파 진탕기(예: 캘리포니아주 팔로 알토 소재 Tomy Tech USA의 TOMMY MT-360 마이크로튜브 믹서) 상에서 실온으로 5분 동안 항온배양하라. 완충제는 공기 건조시키지 않는 것이 바람직하다.
4. 반점으로부터 과량의 완충제를 제거하라. 반점의 표면을 건드리지 않으며 반점을 건조시키지 않는 것이 바람직하다. 단계 3 및 단계 4를 1 회 이상 반복하라.
5. 반점당 2-3 ㎕의 샘플을 적재하라. 완충제를 미리 처리하기보다는 보다 낮은 이온 강도를 포함하는 결합 완충제 내에서 샘플을 제조할 수 있다. 예를 들어, 0.01% OGP 또는 Triton X-100을 함유하는 pH 6.5의 20 mM 암모늄 아세테이트 결합 완충제로 시작하라.
6. 주: 결합 완충제 내에 염을 피하는 것이 바람직하다. 또한, 결합 및 세척 완충제 내에 낮은 농도의 비이온성 세정제(예: 0.1% OGP 또는 Triton X-100)를 포함하여 비특이성 결합을 감소시키는 것이 바람직하다.
7. 결합 및/또는 세척 완충제의 pH 및 이온 강도를 변화시켜 이온 결합을 상태 조절할 수 있다.
8. 플라스틱 적하(積荷) 튜브 내에 탐침을 배치하고, 탐침에 대한 습윤 조직의 플러그를 밀어 수직으로 유지하고, 캡을 닫아 습윤 체임버를 산출하라.
9. 고주파 진탕기 상의 튜브 내에서 20 분 내지 30 분 동안 탐침을 항온배양하라. 접착 테이프로 진탕기 상의 튜브를 안전하게 하라. (주: 고주파 진탕기 상의 탐침의 항온배양은 결합 효율을 향상시킬 수 있다. 그러나, 진탕기를 이용할 수 없더라도, 또한 습윤 체임버 내에서 30 분 내지 1 시간 동안 탐침을 항온배양할 수 있다.)
10. 5 ㎕의 결합 완충제로 각 반점을 5 회 세척한 후, 물(5 ㎕)로 빨리 세척(2 회)하라.
11. 반점 주위를 닦아 건조시켜라. 각 반점이 충분히 젖은 경우, 각 반점에 0.5 ㎕의 포화 EAM 용액을 첨가하라. 각 반점에 0.5 ㎕의 EAM(예: 50% 수성 아세토니트릴로 포화된 시나핀산 매트릭스, 0.5% TFA) 용액의 제2 분취량을 도포하라. 공기 건조시키라.
12. 질량 분광계(예: SELDI단백질 생물 시스템)를 사용하여 탐침을 분석하라. (주: 저질량 영역 내에서 EAM 피크가 샘플 피크를 방해하는 경우, 먼저 EAM의 첨가를 시도할 수 있다. 또한, 도구의 강도를 감소시켜 EAM 신호를 감소시킬 수 있다.)
상기 프로토콜용으로 추천되는 완충제는 저농도(예: 0.01%)의 비이온성 세정제(예: 0.1% Triton X-100)을 함유하는 20 mM 내지 100 mM의 암모늄 아세테이트 및 포스페이트 완충제이다.
C. IMAC-3 Protein Chip 을 사용하는 프로토콜
IMAC-3 탐침은 표면 상에 니트릴로트리아세트산(NTA)기를 함유한다. 그것은 금속 유리(metal-free) 형태로 제조하고, 사용하기 전에 Ni 금속과 함께 적재한다.하기 프로토콜은 예시적인 것이고, 임의의 적당한 변경은 당업자에게 명백할 것이다.
1. 소수성 펜(예: 캘리포니아주 버링검 소재 Vector Laboratories의 ImmEdge펜)을 사용하여 하이드로겔 물질의 각 반점에 대한 개요도를 작성하라.
2. 각 반점에 100 mM 황산니켈 10 ㎕를 적재하고, 고주파 진탕기(예: 캘리포니아주 팔로 알토 소재 Tomy Tech USA의 TOMMY MT-360 마이크로튜브 믹서) 상에서 실온으로 5분 동안 항온배양하라. 완충제는 공기 건조시키지 않는 것이 바람직하다.
3. 약 10 초 동안 흐르는 탈이온수 하에 탐침을 헹구어 과량의 니켈을 제거하라.
4. 각 반점에 PBS 중의 0.5 M NaCl(또는 0.5 M 이상의 NaCl을 함유하는 기타 결합 완충제) 5 ㎕를 첨가하고, 진탕기 상에서 5 분 동안 항온배양하라. 완충제는 공기 건조시키지 않는 것이 바람직하다. 반점 주위를 닦아서 건조시켜라. 그리고, 반점은 건조시키지 않는 것이 바람직하다.
5. 반점당 2-3 ㎕의 샘플을 적재하라. 8 M 우레아, PBS 중의 1% CHAPS(pH 7.2)에 복합 생물학적 샘플을 가용화시키고, 실온에서 15 분 동안 와동시키고, 0.5 M NaCl/PBS로 추가 희석시켜 약 1M 우레아의 최종 농도로 할 수 있다.
6. 플라스틱 적하(積荷) 튜브 내에 탐침을 배치하고, 탐침에 대한 습윤 조직의 플러그를 밀어 수직으로 유지하고, 캡을 닫아 습윤 체임버를 산출하라.
7. 고주파 진탕기 상의 튜브 내에서 20 분 내지 30 분 동안 탐침을 항온배양하라. 접착 테이프로 진탕기 상의 튜브를 안전하게 하라. (주: 고주파 진탕기 상의 탐침의 항온배양은 결합 효율을 향상시킬 수 있다. 그러나, 진탕기를 이용할 수 없더라도, 또한 습윤 체임버 내에서 30 분 내지 1 시간 동안 탐침을 항온배양할 수 있다.)
8. 5 ㎕의 결합 완충제로 각 반점을 5 회 세척한 후, 물(5 ㎕)로 빨리 세척(2 회)하라.
9. 반점 주위를 닦아서 건조시켜라. 각 반점이 충분히 젖은 경우, 각 반점에 0.5 ㎕의 포화 EAM 용액을 첨가하라. 각 반점에 EAM의 제2 분취량을 도포하고, 공기 건조시키라.
10. 질량 분광계(예: SELDI단백질 생물 시스템)를 사용하여 탐침을 분석하라. (주: 저질량 영역 내에서 EAM 피크가 샘플 피크를 방해하는 경우, 먼저 EAM 을 첨가할 수 있다. 또한, 도구의 강도를 감소시켜 EAM 신호를 감소시킬 수 있다.)
상기 프로토콜용으로 추천되는 완충제는 20 mM 내지 100 mM의 나트륨 아세테이트 또는 암모늄 아세테이트, 트리스 HCl 및 비이온성 세정제(예: 0.1% Triton X-100)를 함유하는 50 mM의 트리스 염기(pH >9의 경우) 완충제이다.
상기 프로토콜의 경우, 염화나트륨(0.5 M 이상) 및 세정제(예: 0.1% Triton X-100)를 함유하는 결합 완충제는 특수한 이온 상호작용 및 소수성 상호작용을 각각 최소화하는데 추천된다. 우레아 및 세정제에 복합 생물학적 샘플을 가용화시킬 수 있다.
Ⅲ. 인식 프로필
하기 실시예에 있어서, ND 필터로 레이저 강도 50, 감수성 5에서 데이타를 수집하는데 SELDI단백질 생물 시스템을 사용하였다. 반점당 80 숏(shot)의 평균을 수득하였다(위치당 10 위치 시간 8 숏). 동일한 레이저 강도를 사용하여 4 숏으로 각 반점을 데웠다.
A. 상이한 pH값에서 SAX-2 Protein Chip 에 대한 송아지 혈청의 선택적 결합
송아지 혈청 샘플(뉴욕주 그랜드 아이랜드 소재 Life Technologies의 투석된 GIBCO BRL)은 하기 결합 완충제 내에서 1 대 30의 비율에 의해 희석하였다: a) 0.1 M 나트륨 아세테이트, 0.1% Triton X-100 (pH 4.5); b) 0.1 M 트리스 HCl, 0.1% Triton X-100 (pH 6.5); 및 c) 50 mM 트리스 염기, 0.1% Triton X-100 (pH 9.5). SAX-2 탐침 상에 샘플을 적재하였고, 전술한 프로토콜에 따라 탐침을 제조하였다.
도 2는 고분자량의 송아지 혈청 단백질 인식 프로필에서의 복합 질량 스펙트럼을 도시한 것이다. 하단 프로필은, pH 9.5의 완충제로 샘플을 희석시키고 세척했을 때, SAX-2 탐침 상에 보류된 소 혈청 알부민(BSA), 트랜스페린 및 IgG의 신호 강도를 도시한 것이다. 중단 및 하단 프로필은, 완충제의 pH를 낮추면, 동일한 탐침 상의 복합 단백질 혼합물의 상이한 성분의 보류가 서서히 증강되거나 감소한다는 것을 도시한 것이다. 예를 들어, 중단 프로필은, pH 6.5의 완충제로 샘플을 희석시키고 세척시켰을 때, 증강된 BSA의 신호 강도를 도시한 것이다. 이와는 대조적으로, pH 6.5의 완충제 또는 pH 4.5의 완충제로 샘플을 희석시키고 세척하였을 때, 트랜스페린 및 IgG의 신호 강도는 무시할 정도였다.
B. 상이한 pH값에서 WCX-1 Protein Chip 에 대한 송아지 혈청 단백질의 선택적 결합
송아지 혈청 샘플(뉴욕주 그랜드 아이랜드 소재 Life Technologies의 투석된 GIBCO BRL)은 하기 결합 완충제 내에서 1 대 30의 비율에 의해 희석하였다: a) 0.1 M 나트륨 아세테이트, 0.1% Triton X-100 (pH 4.5); b) 0.1 M 나트륨 아세테이트, 0.1% Triton X-100 (pH 5.5); 및 c) 0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.1% Triton X-100 (pH 8.5). WCX-1 탐침 상에 샘플을 적재하였고, 전술한 프로토콜에 따라 탐침을 제조하였다.
도 3은 고분자량의 송아지 혈청 단백질 인식 프로필에서의 복합 질량 스펙트럼을 도시한 것이다. 상단 프로필은, pH 4.5의 완충제로 샘플을 희석시키고 세척한 후, WCX-1 탐침 상에 혈청 단백질을 도시한 것이다. 예를 들어, 상단 프로필은 BSA의 강한 신호 강도 및 트랜스페린의 약한 신호 강도를 도시한 것이다. pH 5.5 또는 pH 8.5의 완충제로 샘플을 희석시키고 세척하였을 때, 혈청 단백질(BSA 및 트랜스페린 포함)의 많은 성분의 신호 강도는 감소되거나 무시할 정도였다.
C. 상이한 pH값에서 IMAC-3 Protein Chip 에 대한 송아지 혈청의 선택적 결합
송아지 혈청 샘플(뉴욕주 그랜드 아이랜드 소재 Life Technologies의 투석된 GIBCO BRL)은, 완충제[8 M 우레아, 1% CHAPS, PBS (pH 7.2)] 내에서 1 대 10의 비율에 의해 희석시키고, 실온에서 15 분 동안 와동시켰다. 이어서, 샘플은 0.5 M NaCl/PBS 내에서 1 대 3의 비율에 의해 추가로 희석시켰다. 전술한 바와 같이 제조된 IMAC-3 탐침의 각 반점에 약 2-3 ㎕의 희석된 송아지 혈청을 첨가하였다. 습윤 체임버 내에서 20-30 분 동안 항온배양 후, 6개의 반점을 5 ㎕의 완충제[0.5 M NaCl/PBS, 0.1% Triton X-100]로 5 회 세척하고, 다른 6개의 반점을 5 ㎕의 완충제[0.5 M NaCl/PBS, 0.1% Triton X-100, 100 mM 이미다졸]로 5 회 세척하였다. 샘플을 세척하고, 전술한 프로토콜에 따라 추가로 제조하였다.
도 4는 고분자량의 송아지 혈청 단백질 인식 프로필에서의 복합 질량 스펙트럼을 도시한 것이다. 하단 프로필은, 물로 세척 후, 정상상(normal phase)(예: 실리콘 산화물로 구성된 탐침 표면)에 보류된 혈청 단백질, 특히 BSA 및 트랜스페린을 도시한 것이다. 상단 프로필은 완충제로 샘플을 희석시키고 세척한 후, IMAC 3-니켈 탐침 상에 보류된 혈청 단백질(예: 트랜스페린 및 IgG)를 도시한 것이다. 상단 프로필에 도시된 바와 같이, IMAC 3-니켈 탐침은 트랜스페린을 선택적으로 보류시켰으나, BSA 결합은 정상상에 비해 감소되었다. 중단 프로필은, 이미다졸(예: 히스티딘-결합 경쟁적 친화성 리간드)를 포함하였을 때, 동일한 탐침 상의 모든 성분의 보류가 감소되었다는 것을 도시한 것이다.
본 발명은 기체상 이온 분광계를 사용하여 분석물질을 검출하는 신규 물질 및 방법을 제공한다. 구체예를 제공하였지만, 상기 구체예에 대한 상세한 설명은 예시적인 것이지 한정적인 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 전술한 구체예의 임의의 하나 이상의 특징은 임의의 방법으로 임의의 다른 구체예의 하나 이상의 특징과 조합시킬 수 있다. 또한, 본 명세서를 검토하는 경우, 본 발명의 많은 변화는 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명에 의해 결정되어서는 아니되고, 첨부된 특허청구범위 및 이와 균등 범위에 의해 결정되어야 한다.
본원에 인용된 모든 간행물 및 특허 문서는, 각 개별 간행물 및 특허 문서 모두가 본 명세서에 개별적으로 인용되는 것과 같은 정도로 본 명세서에 참고로 인용한다. 본 명세서에 상기 각종 참고문헌을 인용함으로써, 본 출원인들은 임의의 특정 참고문헌이 "선행 기술"이라고 인정하는 것은 결코 아니다.

Claims (75)

  1. 표면, 및 표면 상의 하이드로겔 물질을 가지는 기재를 포함하고, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침(probe)으로서, 상기 하이드로겔 물질은 가교되어 있으며, 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함하는 탐침.
  2. 제1항에 있어서, 기재는 대상(帶狀; strip) 또는 평판(plate) 형태인 것을 특징으로 하는 탐침.
  3. 제1항에 있어서, 기재는 전기 전도성인 것을 특징으로 하는 탐침.
  4. 제1항에 있어서, 기재의 표면은 하이드로겔 물질을 부착시키도록 상태 조절되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  5. 제1항에 있어서, 기재의 표면은 금속 코팅, 산화물 코팅, 졸 겔, 유리 코팅 또는 커플링제로 상태 조절되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  6. 제1항에 있어서, 기재의 표면은 거칠거나 다공성이거나 또는 미세다공성인 것을 특징으로 하는 탐침.
  7. 제1항에 있어서, 하이드로겔 물질은 기재의 표면 상에 계내 중합되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  8. 제1항에 있어서, 기재의 표면은 유리 코팅으로 피복되고; 하이드로겔 물질은 유리 코팅 상에 단량체(이는 결합 작용기를 제공하도록 예비 작용기화됨) 함유 용액을 침착시킴으로써, 유리 코팅 상에 계내 중합되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  9. 제5항에 있어서, 코팅 및 결합된 하이드로겔 물질의 두께는 약 1 마이크로미터 이상인 것을 특징으로 하는 탐침.
  10. 제1항에 있어서, 하이드로겔 물질의 두께는 약 1 마이크로미터 이상인 것을 특징으로 하는 탐침.
  11. 제1항에 있어서, 하이드로겔 물질은 불연속 패턴의 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 탐침.
  12. 제1항에 있어서, 하이드로겔 물질은 불연속, 이산 반점의 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 탐침.
  13. 제1항에 있어서, 하이드로겔 물질은 연속적이고, 하나 이상의 결합 작용기의 1차원 또는 2차원 그래디언트(gradient)를 가지는 것을 특징으로 하는 탐침.
  14. 제1항에 있어서, 상이한 결합 작용기를 포함하는 다수의 상이한 하이드로겔 물질은 기재의 표면 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 탐침.
  15. 제1항에 있어서, 하이드로겔 물질은 단독 중합체, 공중합체 또는 혼합형 중합체인 것을 특징으로 하는 탐침.
  16. 제1항에 있어서, 하이드로겔 물질은 치환된 아크릴아미드 단량체, 치환된 아크릴레이트 단량체 또는 이들의 유도체로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  17. 제1항에 있어서, 결합 작용기는 염 촉진성(salt-promoted) 상호작용, 친수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 배위 상호작용, 공유 상호작용, 효소 부위 상호작용, 가역적 공유 상호작용, 비가역적 공유 상호작용, 당단백질 상호작용, 생체특이성(biospecific) 상호작용 또는 이들의 조합에 의해 분석물질을 유인하는 것을 특징으로 하는 탐침.
  18. 제1항에 있어서, 하이드로겔 물질의 결합 작용기는 카르복실기, 설포네이트기, 포스페이트기, 암모늄기, 친수성기, 소수성기, 반응성기, 금속 킬레이트기, 티오에테르기, 비오틴기, 보로네이트기, 염료(dye)기, 콜레스테롤기 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  19. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 카르복실기이고, 하이드로겔 물질은 (메트)아크릴산, 2-카르복시에틸 아크릴레이트, N-아크릴로일-아미노헥산산, N-카르복시메틸아크릴아미드, 2-아크릴아미도글리콜산 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  20. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 설포네이트기이고, 하이드로겔 물질은 아크릴아미도메틸-프로판 설폰산 단량체 및 그 유도체로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  21. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 포스페이트기이고, 하이드로겔 물질은 N-포스포에틸 아크릴아미드 단량체 또는 그 유도체로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  22. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 암모늄기이고, 하이드로겔 물질은 트리메틸아미노에틸 메타크릴레이트, 디에틸아미노에틸 메타크릴레이트, 디에틸아미노에틸 아크릴아미드, 디에틸아미노에틸 메타크릴아미드, 디에틸아미노프로필 메타크릴아미드, 아미노프로필 아크릴아미드, 3-(메타크릴로일아미노)프로필트리메틸암모늄클로라이드, 2-아미노에틸 메타크릴레이트, N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드, 2-(t-부틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-디메틸아미노)에틸 (메트)아크릴레이트, N-(2-(N,N-디메틸아미노))에틸 (메트)아크릴아미드, N-(3-(N,N-디메틸아미노))프로필 메타크릴아미드, 2-(메트)아크릴로일옥시에틸트리메틸암모늄 클로라이드, 3-메타크릴로일옥시-2-히드록시프로필트리메틸암모늄 클로라이드, (2-아크릴로일옥시에틸)(4-벤조일벤질)디메틸암모늄 브로마이드, 2-비닐피리딘, 4-비닐피리딘, 비닐이미다졸 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  23. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 친수성기이고, 하이드로겔 물질은 N-(메트)아크릴로일트리스(히드록시메틸)메틸아민, 히드록시에틸 아크릴아미드, 히드록시프로필 메타크릴아미드, N-아크릴아미도-1-데옥시소르비톨, 히드록시에틸(메트)아크릴레이트, 히드록시프로필아크릴레이트, 히드록시페닐메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 아크릴아미드, 글리세롤 모노(메트)아크릴레이트, 2-히드록시프로필 아크릴레이트, 4-히드록시부틸 메타크릴레이트, 2-메타크릴옥시에틸 글루코시드, 폴리(에틸렌글리콜)모노메틸 에테르 모노메타크릴레이트, 비닐 4-히드록시부틸 에테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  24. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 소수성기이고, 하이드로겔 물질은 N,N-디메틸 아크릴아미드, N,N-디에틸 (메트)아크릴아미드, N-메틸 메타크릴아미드, N-에틸 메타크릴아미드, N-프로필 아크릴아미드, N-부틸 아크릴아미드, N-옥틸 (메트)아크릴아미드, N-도데실 메타크릴아미드, N-옥타데실 아크릴아미드, 프로필 (메트)아크릴레이트, 데실 (메트)아크릴레이트, 스테아릴 (메트)아크릴레이트, 옥틸-트리페닐메틸아크릴아미드, 부틸-트리페닐메틸아크릴아미드, 옥타데실-트리페닐메틸아크릴아미드, 페닐-트리페닐메틸아크릴아미드, 벤질-트리페닐메틸아크릴아미드 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  25. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 금속 킬레이트기이고, 하이드로겔 물질은 N-(3-N,N-비스카르복시메틸아미노)프로필 메타크릴아미드, 5-메타크릴아미도-2-(N,N-비스카르복시메틸아미노)펜탄산, N-(아크릴아미도에틸)에틸렌디아민 N,N',N'-트리아세트산 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  26. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 반응성기이고, 하이드로겔 물질은 글리시딜 아크릴레이트, 아크릴로일 클로라이드, 글리시딜(메트)아크릴레이트, (메트)아크릴로일 클로라이드, N-아크릴옥시숙신이미드, 비닐 아즈락톤, 아크릴아미도프로필 피리딜 디설리드, N-(아크릴아미도프로필)말레이미드, 비스-에폭시란 화합물로 활성화된 아크릴아미도데옥시 소르비톨, 알릴클로로포르메이트, (메트)아크릴산 무수물, 아크롤레인, 알릴숙신산 무수물, 시트라콘산 무수물, 알릴 글리시딜 에테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  27. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 티오에테르기이고, 하이드로겔 물질은 2-히드록시-3-머캅토피리딜프로필 (메타크릴레이트), 2-(2-(3-(메트)아크릴옥시에톡시)에탄설포닐)에틸설파닐 에탄올 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 친황성 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  28. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 비오틴기이고, 하이드로겔 물질은 N-비오티닐-3-(메트)아크릴아미도프로필아민 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 비오틴 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  29. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 보로네이트기이고, 하이드로겔 물질은 N-(m-디히드록시보릴)페닐 (메트)아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 보로네이트 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  30. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 염료기이고, 하이드로겔 물질은 N-(N'-염료 커플링된 아미노프로필) (메트)아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 염료 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  31. 제18항에 있어서, 결합 작용기는 콜레스테롤기이고, 하이드로겔 물질은 N-콜레스테릴-3-(메트)아크릴아미도프로필아민 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 콜레스테롤 단량체들로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  32. 표면, 및 표면 상에 직경이 거의 균일한 다수의 입자들을 가지는 기재를 포함하고, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침으로서, 상기 입자들은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함하는 것인 탐침.
  33. 제32항에 있어서, 다수의 입자들의 평균 직경은 약 1000 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 탐침.
  34. 제32항에 있어서, 입자들의 직경 편차 계수는 약 5% 이하인 것을 특징으로 하는 탐침.
  35. 제32항에 있어서, 기재의 표면은 입자들에 부착되도록 상태 조절되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  36. 제32항에 있어서, 입자들의 결합 작용기는 카르복실기, 설포네이트기, 포스페이트기, 암모늄기, 친수성기, 소수성기, 반응성기, 금속 킬레이트기, 티오에테르기, 비오틴기, 보로네이트기, 염료기, 콜레스테롤기 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 탐침.
  37. 유입구(inlet) 시스템을 포함하는 기체상 이온 분광계; 및
    기체상 이온 분광계의 유입구 시스템에 삽입된, 제거가능하게 삽입될 수 있고, 표면, 및 표면 상의 하이드로겔 물질을 가지는 기재를 포함하는 탐침(여기서, 상기 하이드로겔 물질은 가교되어 있으며, 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함함)
    을 포함하는 분석물질 검출 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 기체상 이온 분광계는 질량 분광계인 것을 특징으로 하는 시스템.
  39. 제38항에 있어서, 질량 분광계는 레이저 탈착 질량 분광계인 것을 특징으로 하는 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 상기 기재는 대상 또는 평판 형태인 것을 특징으로 하는 시스템.
  41. 제39항에 있어서, 기재 표면 상에 단량체들을 포함하는 용액을 침착시킴으로써 기재 표면 상에 하이드로겔 물질을 계내 중합시키며, 상기 단량체들은 결합 작용기를 제공하도록 예비 작용기화되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  42. 유입구 시스템을 포함하는 기체상 이온 분광계; 및
    기체상 이온 분광계의 유입구 시스템에 삽입된, 제거가능하게 삽입될 수 있고, 표면, 및 표면 상에 직경이 거의 균일한 다수의 입자들을 가지는 기재를 포함하는 탐침(여기서, 상기 입자들은 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함함)
    을 포함하는 분석물질 검출 시스템.
  43. 제42항에 있어서, 기체상 이온 분광계는 질량 분광계인 것을 특징으로 하는 시스템.
  44. 제43항에 있어서, 질량 분광계는 레이저 탈착 질량 분광계인 것을 특징으로 하는 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 다수의 입자들의 평균 직경은 약 1000 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 시스템.
  46. 제44항에 있어서, 입자들의 직경 편차의 계수는 약 5% 이하인 것을 특징으로하는 시스템.
  47. 표면을 가지는 기재를 제공하는 단계;
    기재의 표면을 상태 조절하는 단계; 및
    기재의 표면 상에 하이드로겔 물질을 배치시키는 단계(여기서, 하이드로겔 물질은 가교되며, 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함함)
    를 포함하는, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침의 제조 방법.
  48. 제47항에 있어서, 기재의 표면은 거칠게 함으로써 상태 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제47항에 있어서, 기재의 표면은 레이저 에칭, 화학 에칭 또는 스퍼터 에칭에 의해 상태 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제47항에 있어서, 기재의 표면은 금속 코팅, 산화물 코팅, 졸 겔, 유리 코팅 또는 커플링제를 혼입시킴으로써 상태 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제47항에 있어서, 하이드로겔 물질은 기재의 표면 상에 단량체들을 계내 중합함으로써 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 단량체들은 결합 작용기를 제공하도록 예비 작용기화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제47항에 있어서, 결합 작용기는 카르복실기, 설포네이트기, 포스페이트기, 암모늄기, 친수성기, 소수성기, 반응성기, 금속 킬레이트기, 티오에테르기, 비오틴기, 보로네이트기, 염료기, 콜레스테롤기 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제47항에 있어서, 하이드로겔 물질은 방사선 조사에 의해 가교되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제47항에 있어서, 하이드로겔 물질은 기재 표면 상에의 계내 방사선 조사에 의해 단량체들을 가교시킴으로써 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 표면을 가지는 기재를 제공하는 단계;
    기재의 표면을 상태 조절하는 단계; 및
    기재의 표면 상에 직경이 거의 균일한 다수의 입자들을 배치시키는 단계(여기서, 상기 입자들은 기체상 이온 분광계에 의해 검출가능한 분석물질과 결합하는결합 작용기를 포함함)
    를 포함하는, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침의 제조 방법.
  57. 제56항에 있어서, 기재의 표면은 거칠게 함으로써 상태 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제56항에 있어서, 기재의 표면은 레이저 에칭, 화학 에칭 또는 스퍼터 에칭에 의해 상태 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제56항에 있어서, 기재의 표면은 입자들이 기재의 표면에 공유 결합될 수 있도록 가교제에 의해 상태 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. (a) 표면, 및 표면 상의 하이드로겔 물질을 포함하고, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침으로서, 상기 하이드로겔 물질은 가교되며, 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함하는 것인 탐침을 제공하는 단계;
    (b) 하이드로겔 물질의 결합 작용기와 분석물질 사이의 결합을 가능하게 하는 조건 하에, 분석물질 함유 샘플에 하이드로겔 물질의 결합 작용기를 노출시키는 단계;
    (c) 이온화 공급원으로부터의 에너지로 탐침 표면을 강타하는 단계;
    (d) 기체상 이온 분광계에 의해 탐침으로부터 결합된 분석물질을 탈착시키는 단계; 및
    (e) 탈착된 분석물질을 검출하는 단계
    를 포함하는 분석물질 검출 방법.
  61. 제60항에 있어서, 기체상 이온 분광계는 질량 분광계인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 질량 분광계는 레이저 탈착 질량 분광계인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 하이드로겔 물질의 결합 작용기와 분석물질 사이의 결합의 최저 한계(threshold)를 선택적으로 조절하는 세척 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제62항에 있어서, 분석물질이 하이드로겔 물질의 결합 작용기에 결합되는 동안, 분석물질을 화학적으로 또는 효소적으로 상태 조절하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제62항에 있에서, 분석물질은 아민 함유 조합형 라이브러리, 아미노산, 염료, 약물, 독소, 비오틴, DNA, RNA, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 리신, 아세틸글루코사민, 프로시온 레드(procion red), 글루타티온 및 아데노신모노포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제62항에 있어서, 분석물질은 폴리뉴클레오티드, 아비딘, 스트렙타비딘, 다당류, 렉틴, 단백질류, 펩스타틴, 단백질 A, 아글루티닌, 헤파린, 단백질 G 및 콘카나발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제62항에 있어서, 분석물질은 상이한 생체고분자의 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. (a) 표면, 및 표면 상의 직경이 거의 균일한 다수의 입자들을 포함하고, 기체상 이온 분광계에 제거가능하게 삽입될 수 있는 탐침으로서, 상기 입자들은 분석물질과 결합하는 결합 작용기를 포함하는 것인 탐침을 제공하는 단계;
    (b) 상기 입자들의 결합 작용기와 분석물질 사이의 결합을 가능하게 하는 조건 하에, 분석물질 함유 샘플에 입자들의 결합 작용기를 노출시키는 단계;
    (c) 이온화 공급원으로부터의 에너지로 탐침 표면을 강타하는 단계;
    (d) 기체상 이온 분광계에 의해 탐침으로부터 결합된 분석물질을 탈착시키는 단계; 및
    (e) 탈착된 분석물질을 검출하는 단계
    를 포함하는 분석물질 검출 방법.
  69. 제68항에 있어서, 기체상 이온 분광계는 질량 분광계인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 질량 분광계는 레이저 탈착 질량 분광계인 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 입자들의 결합 작용기와 분석물질 사이의 결합의 최저 한계(threshold)를 선택적으로 조절하는 세척 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제70항에 있어서, 분석물질이 상기 입자들의 결합 작용기에 결합되는 동안, 분석물질을 화학적으로 또는 효소적으로 상태 조절하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제70항에 있에서, 분석물질은 아민 함유 조합형 라이브러리, 아미노산, 염료, 약물, 독소, 비오틴, DNA, RNA, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 리신, 아세틸글루코사민, 프로시온 레드(procion red), 글루타티온 및 아데노신모노포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제70항에 있어서, 분석물질은 폴리뉴클레오티드, 아비딘, 스트렙타비딘, 다당류, 렉틴, 단백질류, 펩스타틴, 단백질 A, 아글루티닌, 헤파린, 단백질 G 및 콘카나발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제70항에 있어서, 분석물질은 상이한 생체고분자의 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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