KR20010096393A

KR20010096393A - 자유라디칼 소거용 감꼭지 추출물-함유 조성물 및 감꼭지추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR20010096393A
Application number: KR1020000020558A
Authority: KR
Inventors: 최희진
Original assignee: 최희진
Priority date: 2000-04-19
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2001-11-07

Abstract

본 발명은 피부의 노화를 촉진하는 자유라디칼을 소거하기 위한 조성물에 관한 것으로, 본 조성물은 자유라디칼 소거를 위한 유효성분으로 감꼭지 추출물을 함유하며, 감꼭지 추출물은 식품이나 화장료 조성물에 매우 안전하게 적용되어 조성물에 매우 효과적인 자유라디칼 소거효과를 부여한다.

Description

자유라디칼 소거용 감꼭지 추출물-함유 조성물 및 감꼭지 추출물의 제조방법{Persimmon calyx extract-containing composition for scavenging free radical and preparation of persimmon calyx extract}

본 발명은 감나무과 식물인 감(Diospyros kaki L. f.)의 꽃받침(감꼭지) 추출물의 자유라디칼 소거효과 및 항산화 효과 조성물에 관한 것이다.

피부의 노화를 억제하기 위하여 극복하여야 할 3대 과제는 자외선에 의한 손상, 자유라디칼에 의한 손상 및 피부 건조이다. 자유라디칼(free radical)에 의한 손상은 인체내에서 광범위하게 발생하여 노화 원인 중 하나의 이론으로 인식되고 있다 [참조: Age(1984) 7, 111-131, Harman].

자유라디칼은 하나 이상의 짝을 이루지 못한 전자를 가지고 있는 원자 또는 분자로서 다른 분자로부터 전자를 뺏어 안정화하려는 특성을 지니고 있다. 자유라디칼의 수명은 수천분의 일초 정도로 매우 짧다. 이런 이유로 자유라디칼은 매우 불안정하며 공격적인 성질을 나타낸다. 피부의 노화에 관여하는 라디칼로는 히드록실 라디칼(hydroxy radical), 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical), 활성산소(singlet oxygen) 등이 있다. 또한 쉽게 히드록실 라디칼로 분해되는 과산화수소도 피부의 노화에 관여한다.

히드록실 라디칼은 강력한 산화력을 가지고 있으며, 반응 시간도 10^-11초로 매우 짧다. 히드록실 라디칼은 생체의 모든 물질과 반응할 수 있으며, 지질(lipid)을 공격하여 지질과산화물(lipid peroxide)을 생성시키며, 단백질간의 비정상적인 교차결합을 생성시키며, 유전자(DNA)를 공격한다. 히드록실 라디칼은 노화의 주된 요인중의 하나이다.

슈퍼옥사이드 라디칼은 요소와 세포막(cell membrane)을 공격하며, 특히 세포막의 주요성분중의 하나인 불포화 지방산(unsaturated fatty acid)을 공격하여 분해시켜 세포막의 성질을 변화시킨다. 세포막의 성질변화는 세포막을 통한 물질들의 전달체계의 변화로 이어져 노화를 촉진시킨다. 또한 불포화 지방산의 분해물은 황색물질인 리포푸신(lipofucin)이 되는데 이는 피부를 칙칙한 황갈색으로 보이게 하며, 좀 더 늙어 보이게 한다. 슈퍼옥사이드 라디칼의 지방산 공격은 연속적으로 진행된다.

활성산소는 히드록실 라디칼과 같이 매우 공격적인 라디칼로서 피부세포의 모든 성분들을 변화시킨다.

과산화수소는 라디칼에 비해 산화력은 약하지만 매우 강력한 반응성을 지니고 있다. 과산화수소는 확산력이 강하여 세포막을 쉽게 투과하며, 철(Fe) 성분과 접촉하면 쉽게 히드록실 라디칼로 변한다. 과산화수소는 세포핵의 DNA를 공격하며,단백질과 반응하여 변성시키거나, 정상적인 기능을 발휘하지 못하도록 한다.

인체에는 자유라디칼에 의한 손상을 방지하기 위한 방어 시스템을 갖추고 있다. 비타민 E, 비타민 C, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase: SOD), 카탈라제(catalase) 및 여러종류의 산화효소(oxydase) 등이 자유라디칼을 소거시킨다.

그러나, 현대인들은 대기오염, 불규칙한 식생활, 자외선 노출, 스트레스, 질병 등의 유해환경에 노출되어 여러 라디칼에 의한 산화적 스트레스(oxidative stress)를 충분히 소거하기 어려운 형편이다. 이러한 산화적 스트레스에 계속 노출되면 피부의 노화, 태양광에 의한 화상 및 염증, 접촉성 피부염, 주름 등이 발생하게 된다. 따라서 자유라디칼을 소거할 수 있는 물질은 피부에 대한 산화적 스트레스를 제거하여 피부의 노화를 방지 또는 지연할 수 있다. 종래, 자유라디칼 소거제로서 알려진 물질로는 아스코르빈산(ascorbic acid), 디부틸 히드록실 톨루엔(BHT), 디엘-알파-토코페롤(dl-α-tocopherol), 베타-카로틴(β-carotene), 모린(morine) 및 갈릭산(Gallic acid) 등이 있다. 그러나 이러한 종래의 자유라디칼 소거제는 식품이나 화장료 등에 사용하기에는 안전성에 다소 문제가 있는 것이다.

이러한 이유로 보다 안전하면서 자유라디칼 소거 효과가 높은 물질 개발은 식품 및 화장품 분야에서 중요한 과제로 대두되어 많은 연구가 진행되고 있다.

따라서 본 발명은 자유라디칼을 효과적으로 소거하여 노화를 방지할 수 있으며 식품이나 화장료 등에 안전하게 적용할 수 있는 물질을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.

상기한 과제를 해결하기 위한 연구에서, 본 발명자는 감꼭지로부터 추출한 물질이 자유라디칼 소거효과가 우수하다는 놀라운 사실을 알게 되어 본 발명을 완성하게 된 것이다.

그러므로 본 발명에 의하면, 피부의 노화를 유발하는 자유라디칼을 소거하기 위한 유효성분으로 감꼭지 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 자유라디칼 소거용 조성물이 제공된다.

또한 본 발명에 의하면 상기한 감꼭지 추출물을 제조하기 위한 방법으로서, (a) 감꼭지를 감꼭지 건조 중량기준으로 1∼15배의 추출용매에 1∼15일간 침지하여 유효성분을 추출하는 공정, 및 (b) 추출액을 감압 농축하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 감꼭지 추출물의 제조방법이 제공된다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

감꼭지는 납작한 원형으로 직경이 1.5∼2.5㎝이다. 중앙부가 비교적 넓고 약간 융기하여 있으며, 과실이 떨어진 후에는 원형 흔적이 남는다. 가장자리가 비교적 얇고 4열로 갈라져 있는데 열편은 대부분 반쯤 말려 있고 잘 부스러진다. 기부에는 과일 꼭지 혹은 둥근 과일꼭지 흔적이 있다. 외표면은 황갈색 혹은 홍갈색이고, 내표면은 황갈색으로 미세한 융모가 빽빽하게 나 있다. 질은 딱딱하고 약하다.

특별히 한정하기 위한 것은 아니지만 본 발명에 따라 감꼭지 추출물을 함유하는 자유라디칼 소거 조성물의 바람직한 예로는 화장료 조성물, 식품 조성물, 등이 있다. 이러한 화장료 및 식품 조성물 중 감꼭지 추출물의 함량은 화장료 및 식품의 건조중량 기준으로 0.00001 ∼ 10중량, 바람직하게 0.005∼5중량가 적당하다.

감꼭지 추출물은 감꼭지를 추출용매에 침지하여 유효성분을 추출하고, 유효성분을 함유하는 추출액을 감압, 농축하는 것에 의해 제조할 수 있다.

추출에 사용하는 감꼭지는 동계에 성숙한 과실의 꼭지를 햇볕에 말린 다음, 깨끗한 물로 세척한 후, 건조하고 분쇄하여 얻은 분말상태의 것을 사용하는 것이 바람직하다.

감꼭지를 침지하여 유효성분을 추출하는데 사용되는 추출용매로서는 물, 메탄올과 에탄올과 같은 저급 알코올, 물과 저급알코올의 혼합물, 아세톤, 에틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 헥산, 디에틸에테르, 노말 프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올이 바람직하다. 감꼭지 대 추출용매의 비율은 중량기준으로 1:1 ∼1:15가 적당하고, 침지시간은 1∼15일 정도가 적당하다.

추출후 여과하여 얻은 추출액은 직접 감압 농축하거나 또는 저온숙성처리를 선행한 후 감압 농축하여 농축액으로 제조하게 된다. 이때, 저온 숙성은 4∼15℃에서 1∼10일간 방치하여 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 감압, 농축은 냉각콘덴서와 감압펌프가 장치된 증류장치를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르는 감꼭지 추출물은 자유라디칼 소거효과 및 항산화효과가 매우 우수하며, 이러한 특성은 후술되는 실시 예로부터 보다 명백하게 될 것이다. 물론 본 발명은 후술되는 실시 예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 및 비교예

Ⅰ. 감꼭지 추출물의 제조

[실시예 Ⅰ-1]

정제수로 세척하고 건조시킨 다음 분말화 한 감꼭지 분말 1㎏을 물 5ℓ에 넣고 15∼40℃에서 3∼5일간 추출한 후 300 메쉬 여과포로 여과하고, 4∼15℃에서 7∼10일간 방치하여 저온 숙성시킨 후, 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 이 추출액을 냉각 콘덴서와 진공펌프가 장치된 증류장치에서 60℃로 가열하에 감압 농축하여 농축액을 얻고, 농축액을 건조하여 추출물 155.7g(건조중량)을 얻었다.

[실시예 Ⅰ-2]

정제수로 세척하고 건조시킨 다음 분말화 한 감꼭지 분말 1㎏을 10에탄올 수용액 5ℓ에 넣고 냉각콘덴서가 장치된 추출기에서 3일간 추출한 후 300 메쉬 여과포로 여과하고, 4∼15℃에서 7∼10일간 방치하여 저온 숙성시킨 후, 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 이 추출액을 냉각 콘덴서와 진공펌프가 장치된 증류장치에서60℃로 가열하에 감압 농축하여 농축액을 얻고, 농축액을 건조하여 추출물 169.3g(건조중량)을 얻었다.

[실시예 Ⅰ-3 ∼ Ⅰ-21]

표 1에 나타낸 추출용매를 사용한 것을 제외하고는 실시예 Ⅰ-2와 동일한 절차를 반복하였다. 얻어진 추출물의 건조중량은 표 1에 제시된다.

실시예 번호	추출용매	추출물 건조중량(g)
Ⅰ-1	물	155.7
Ⅰ-2	10에탄올 수용액	169.3
Ⅰ-3	20에탄올 수용액	178.5
Ⅰ-4	30에탄올 수용액	214.4
Ⅰ-5	40에탄올 수용액	235.8
Ⅰ-6	50에탄올 수용액	262.4
Ⅰ-7	60에탄올 수용액	299.5
Ⅰ-8	70에탄올 수용액	275.8
Ⅰ-9	80에탄올 수용액	264.9
Ⅰ-10	90에탄올 수용액	214.2
Ⅰ-11	100에탄올	134.6
Ⅰ-12	80메탄올 수용액	309.5
Ⅰ-13	100메탄올	157.1
Ⅰ-14	아세톤	68.6
Ⅰ-15	에틸아세테이트	45.7
Ⅰ-16	501,3-1부틸렌 글리콜 수용액	243.1
Ⅰ-17	헥산	21.7
Ⅰ-18	디에틸 에테르	10.3
Ⅰ-19	노말-프로판올	132.4
Ⅰ-20	이소-프로판올	130.8
Ⅰ-21	노말-부탄올	142.7

Ⅱ. 자유라디칼 소거 효과

[실시예 Ⅱ-1 내지 Ⅱ-21]

자유라디칼 소거(free radical scavenging) 작용은 60μM 1,1-디페닐-2-피크릴-2-하이드라질(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 에탄올 용액 2㎖에 실시예 Ⅰ-1 내지 Ⅰ-21의 감꼭지 추출물의 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 2㎖를 가해 실온에서 반응시킨후, 520㎚에서 흡광도를 측정하여 하기 식에 의거 자유라디칼 소거 효과(S: )를 구하였다.

실시예 Ⅰ-1 내지 Ⅰ-21의 감꼭지 추출물의 자유라디칼 소거효과는 표 2에 제시된다. 제시되는 데이터는 3회 실시 평균값이다. 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이 감꼭지 추출물은 대부분 높은 활성을 나타낸다.

실시예	감꼭지추출물	자유라디칼 소거효과 ()
		실험농도
		5 ㎍/㎖	10 ㎍/㎖	25 ㎍/㎖	50 ㎍/㎖
Ⅱ-1	실시예 Ⅰ-1	65.3	73.1	77.3	80.2
Ⅱ-2	실시예 Ⅰ-2	76.2	80.3	83.5	87.7
Ⅱ-3	실시예 Ⅰ-3	78.1	83.7	88.3	91.0
Ⅱ-4	실시예 Ⅰ-4	81.2	86.2	91.4	94.9
Ⅱ-5	실시예 Ⅰ-5	82.1	87.8	92.9	95.2
Ⅱ-6	실시예 Ⅰ-6	85.3	90.3	93.7	95.5
Ⅱ-7	실시예 Ⅰ-7	88.0	92.1	95.0	96.0
Ⅱ-8	실시예 Ⅰ-8	88.9	93.1	94.6	95.3
Ⅱ-9	실시예 Ⅰ-9	89.3	93.3	95.7	95.8
Ⅱ-10	실시예 Ⅰ-10	82.3	89.0	94.0	95.0
Ⅱ-11	실시예 Ⅰ-11	78.3	85.2	91.0	94.7
Ⅱ-12	실시예 Ⅰ-12	90.4	94.3	95.0	95.5
Ⅱ-13	실시예 Ⅰ-13	81.5	87.5	94.2	96.1
Ⅱ-14	실시예 Ⅰ-14	55.4	65.5	77.8	84.5
Ⅱ-15	실시예 Ⅰ-15	78.5	87.0	94.4	96.0
Ⅱ-16	실시예 Ⅰ-16	91.2	95.0	96.7	96.9
Ⅱ-17	실시예 Ⅰ-17	34.3	42.7	60.3	68.1
Ⅱ-18	실시예 Ⅰ-18	32.9	40.2	60.3	67.1
Ⅱ-19	실시예 Ⅰ-19	62.5	75.4	87.0	92.4
Ⅱ-20	실시예 Ⅰ-20	67.3	78.9	87.1	93.2
Ⅱ-21	실시예 Ⅰ-21	82.3	89.1	93.5	95.3

Ⅲ. 자유라디칼 소거효과의 비교

[실시예 Ⅲ-1]

실시예 Ⅰ-2에서 얻은 감꼭지 추출물을 사용해서 자유라디칼을 50소거하기 위해 필요한 시료의 농도(SC₅₀)를 구하였다. 그 결과는 하기 표 3에 제시된다.

[비교예 Ⅲ-1 내지 Ⅲ-6]

아스코르빈산(ascorbic acid), 디부틸 히드록실 톨루엔(BHT), 디엘-알파-토코페롤(dl-α-tocopherol), 베타-카로틴(β-carotene), 모린(morine) 및 갈릭산(Gallic acid) 각각에 대해서 자유라디칼을 50소거하기 위해 필요한 시료의 농도(SC₅₀)를 구하였다. 그 결과는 하기 표 3에 제시된다.

시 험 물 질	SC₅₀(㎍/㎖)
감꼭지 추출물(실시예 Ⅰ-12)	1.83
아스코르빈산	29.74
디부틸 히드록실 톨루엔	38.05
디엘-알파-토코페롤	34.67
베타-카로틴	54.01
모린	23.61
갈릭산	1.52

표 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 감꼭지 추출물의 자유라디칼 소거효과를 기존의 소거제들과 비교한 결과 감꼭지 추출물이 조(糟)추출물임에도 불구하고 단일성분인 갈릭산에 비교될 정도의 높은 활성을 나타내었다.

Ⅳ. 감꼭지 추출물의 과산화 수소 유도 세포독성 억제 효과

감꼭지 추출물의 과산화 수소 유도 세포독성에 대한 억제효과를 마우스 유래 피부 섬유아세포(fibroblast)를 사용하여 실험하였다. 과산화 수소는 세포내에서 히드록실 라디칼을 생성하여 세포에 치명적 손상을 일으킨다. 감꼭지 추출물의 자유라디칼 소거효과를 세포 수준에서 시험하기 위하여 다음과 같이 측정하였다.

우선, 마우스 유래 섬유아세포(A431)를 각 웰(well)에 50,000개를 96웰 플레이트에 접종하여 디엠이엠(DMEM) 배지 200㎕에서 24시간 배양한 후, 배지중의 최종농도가 1mM이 되도록 희석시킨 과산화수소 10㎕를 가하고, 동시에 감꼭지 추출물(실시예 Ⅰ-12)의 1,3-부틸렌 글리콜(50v/v, 수용액) 용액 10㎕를 최종농도가 0, 10, 25, 50, 100㎍/㎖가 되도록 가하고, 24시간 배양한 후 웰당 MTT 용액 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide: 5㎍/㎖] 10㎕씩 첨가하고 4시간 방치 후, 배지부분을 버린다. 각 웰당 100㎕의 디메틸 설폭시드(DMSO) 용액을 가하여 20분간 교반 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 570㎚에서 흡광도를 측정한 후, 감꼭지 추출물의 과산화수소 유도 세포독성에 대한 억제효율(I: )을 다음 식에 의거 산출하였다. 산출결과는 하기 표 4에 제시된다. 제시되는 값은 3회 평균값이다.

감꼭지 추출물의 농도 (㎍/㎖)	세포독성 억제효과 ()
0	0
10	5.34
25	11.48
50	37.62
100	55.09

상기의 결과에서 알 수 있는 바와 같이 감꼭지 추출물은 과산화 수소 유도 세포독성에 대한 억제를 농도 의존적으로 나타냈다. 따라서 감꼭지 추출물은 섬유아세포내에서 생성된 히드록실 라디칼을 소거하여 세포 독성을 억제하고 있는 것으로 나타났다.

Ⅴ. 감꼭지 추출물의 세포독성

감꼭지 추출물 자체의 세포독성을 마우스 유래 피부 섬유아세포(fibroblast, A431)를 사용하여 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

우선, 마우스 유래 섬유아세포(A431)를 웰당 50,000개를 96웰 플레이트에 접종하여 DMEM 배지 200㎕에서 배양한 후, 감꼭지 추출물(실시예 Ⅰ-12)의 10㎕를 최종농도가 0, 50, 100, 250, 500㎍/㎖가 되도록 가하고 24시간 배양한다. MTT 용액을 10㎕씩 첨가하고 4시간 방치 후, DMSO 용액을 웰당 100㎕씩 첨가하고 4시간 방치 후 DMSO를 웰당 100㎕씩 가하여 20분간 교반하면서 용해시킨 다음, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 570㎚에서 흡광도를 측정한 후, 감꼭지 추출물 자체의 세포독성을 세포생존율(A, )로서 다음 식에 의거 산출하였다. 산출결과는 하기 표 4에 제시된다. 제시되는 값은 3회 평균값이다.

감꼭지 추출물의 농도 (㎍/㎖)	세포 생존율 ()
0	100
50	103.81
100	112.57
250	127.62
500	141.25

이상 설명한 바와 같이 감꼭지 추출물은 자유라디칼 소거효과가 매우 우수하므로 이를 이용하면 피부의 노화를 효과적으로 억제할 수 있게 되며, 또한 감꼭지 추출물은 식물추출물로서 매우 안전한 것이어서, 식품이나 화장료 등에 배합하면 안전하면서도 매우 유용한 노화방지 효과를 제공하여 제품의 부가가치를 크게 높일 수 있게 된다.

Claims

피부의 노화를 유발하는 자유라디칼을 소거하기 위한 유효성분으로 감꼭지 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 자유라디칼 소거용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 식품 또는 화장료 조성물이고, 감꼭지 추출물을 식품 또는 화장료 조성물의 건조중량 기준으로 0.00001 ∼ 10중량함유하는 것을 특징으로 하는 자유라디칼 소거용 조성물.
제 2 항에 있어서, 감꼭지 추출물을 식품 또는 화장료 조성물의 건조중량 기준으로 0.005 ∼ 5중량함유하는 것을 특징으로 하는 자유라디칼 소거용 조성물.
감꼭지 추출물을 제조하기 위한 방법으로서, (a) 감꼭지를 감꼭지 건조 중량기준으로 1∼15배의 추출용매에 1∼15일간 침지하여 유효성분을 추출하는 공정, 및 (b) 추출액을 감압 농축하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 감꼭지 추출물의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 추출액을 감압 농축하기 전에 저온 숙성하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 감꼭지 추출물의 제조방법.