KR20010094630A

KR20010094630A - 돌김으로부터 분리한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류 및그 제조방법

Info

Publication number: KR20010094630A
Application number: KR1020000017027A
Authority: KR
Inventors: 양한철; 조홍연; 홍범식; 신동훈; 전우진
Original assignee: 양한철
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2001-11-01
Also published as: KR100358903B1

Abstract

본 발명은 돌김으로부터 분리·정제한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류 및 그 제조방법에 관한 것으로, 돌김의 열수추출물을 에탄올로 침전분획하고 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 수행하여 대식세포 활성화능을 갖는 다당류를 분리·정제함으로써 암환자나 면역저하 환자용 기능성 식품 또는 약물에 유용하게 사용될 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

돌김으로부터 분리한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류 및 그 제조방법{Polysaccharide having an activator of macrophage from underwater stone moss and process for production thereof}

본 발명은 돌김으로부터 분리·정제한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 면역증강물질뿐만 아니라 항암 보조제로서 이용할 수 있는 돌김으로부터 분리한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류 및 그 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로, 대식세포 활성화능을 갖는 다당류는 세균, 진균 및 바이러스에 의해 생체가 감염된 경우, 유발되는 생체 방어 기전에서 중요한 역할을 하는 대식세포를 활성화시키는 능력을 갖는 것이다. 이때, 상기 대식세포는 세포성 면역(cellular immunity)으로 분류되어 대식세포 활성화에 따라 PMN, NK cell과 보체 등의 면역세포와 반응하여 면역계의 근간을 이루는 것이다[Playfair, J.H.L. : Immunology at a Glance 5th ed. Blackwell Scientific Publications. London, (1992)].

상기 대식세포의 주요역할은 첫째, 항원을 가공하여 림프구에 제공하는 항원 제시 세포(APC)로서의 역할, 둘째, 세포매개성 면역반응에서 T cell의 생성물인 임파구과 반응하여 강력한 기능세포로서의 역할, 셋째, 섬유아세포, 표피세포 등의 성장과 기능에 영향을 미치는 수용성 싸이토카인의 분비 등을 들 수 있다. 이러한 기능은 대식세포 활성화능을 갖는 물질에 의해서 그 작용이 증폭될 수 있다[Janeway, C.A. Jr and Travers, P. : Immunobiology. Blackwell Scientific Publications. London, (1994)].

대식세포는 여러 자극물질에 노출되거나 외부 자극 등에 의해 활성화되면 활성도에 따라 염증 대식세포(inflammatory macrophage)와 활성화된 대식세포(activated macrophage)로 나눌 수 있다. 염증 대식세포는 염증유발 물질에 노출되었을 경우를 말하며 이때는 식세포 작용, 표면 부착능, 프로스타글란딘분비증가, 콜라겐 분해효소 등 여러 효소의 단백질 합성능 증가의 기능적 변화를 나타내고, 세포의 크기와 여러 가지 세포분비물이 증가하게 된다. 인터페론 감마(Interferon-γ), 튜머 네크로시스 인자(Tumor necrosis factor) 등의 싸이토카인류와 그램 음성균의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide) 등에 의해 활성화된 대식세포는 항암 작용, 항미생물 작용 그리고 조직상해 기능 등을 가지게 되는데 특히 암세포에 대한 세포 독성 작용의 기전에 있어서 활성화된 대식세포에 의해 분비된 싸이토카인(TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12), 과산화수소(H₂O₂), 아질산(NO), 세포독성 단백분해 효소 등이 암세포에 대한 세포독성을 나타내는 물질로서 알려져 있다[Hibbs, J.B., Taintor, R.R., Vavrin, I. and Rachlin, E.M. : Nitric oxide : A cytotoxic activated macrophage effector molecule.Biochem. Biophys. Res. commun.157, 87 (1988)].

따라서, 부작용을 나타내지 않으면서 천연물질 중에서 대식세포 활성화 물질들에 대해서 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이들은 주로 저분자보다는 고분자 분획에서 그 활성을 나타내는 것으로 밝혀지고 있다. 특히, 상기 고분자 대식세포 활성화 물질 중에는 항암효과를 나타내는 다당류들이 많이 보고되고 있는데, 다당류에 의한 대식세포 활성화와 항종양 활성의 상관 관계는 숙주 매개 면역반응이 관여하여 종양 발생에 의해 손상된 면역기능을 회복, 또는 증강시킴으로써 나타나는 현상으로 이해되고 있다[Chihara, G., Hamuro, J., Maeda, Y., Arai, Y., and Fukuok, F. , Nature, 225, 7, (1970) ; Hamuro, J., Jadding, H. and Bitter-suermann, D. , Immunology, 34, 695, (1978)].

최근 그램 양성균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 그 유도체들이 다양한 면역 조절 작용을 유도하고 대식세포를 활성화한다고 보고되고 있으며[Heumann, C., Barras, C., Severin, A., Glauser, M.P. and Tomasz, A. : Gram-positive cell walls stimulate synthesis of tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 by human monocytes.Infect. Immun. 62, 2715 (1994)], 연쇄상구균 변이종(Streptococcus mutans)의 다당 중에서 단핵구를 활성화하여 TNF, IL-1의 분비를 유도하는 주된 성분은 람노스이고 이것의 수용기도 밝혀졌다 [Benabdelmoumene, S., Dumont, S., Petit, C., Poindron, P., Wachsmann, D. and Klein, J.P. : Activation of human monocytes byStreptococcus mutansserotype polysaccharide : Immunoglobulin G Fc receptor expression and tumor necrosis factor and interleukin-1 production.Infect. Immun. 59, 3261 (1991)]. 또한 만노스를 함유한 다당류, 만뉴론산, 글루칸, 글루코만난과 같은 다당류 종류가 항암작용 및 단구와 대식세포의 싸이토카인 분비를 촉진한다고 보고되고 있다[Otterlei, M., Sundan, A., Skjak-Brak, G., Ryan, L., Smidsrod, O. and Espevik, T. : Similar mechanisms of action of defined polysaccharides and lipopolysaccharides : Characterization of binding and tumor necrosis factor alpha induction.Infect. Immun. 61, 1917 (1993)]. 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus)의 렌티난과 같은 담자균류의 항암 효과, 항체 활성과 대식세포 활성 등도 보고되어 있으며 특히 코리올루스 벌시올라(Coriolus versiolor)로부터 추출한 다당은 항암제로 시판되고 있다. 또한 도꼬마리 추출물의 면역 억제 작용, 당귀 추출물의 면역계 증강에 의한 B 임파구 증식 효과 등의 면역 증강 주성분이 단백 결합 다당이거나 다당류로 알려져 있다.

해조류는 고대로부터 해산야채로 먹어 왔지만 이 해조류를 즐겨 먹고 있는 나라는 적으며, 주식으로서의 가치 또한 거의 없다. 이는 해조류의 탄수화물 대부분이 비소화성 복합 다당류로서 산이나 알칼리에도 비교적 안정하고 특수한 세균 효소에 의하지 않고는 분해되기 어렵고 섭취했을 때의 소화율은 육상 식물의 전분 소화율의 3분의 1도 안되기 때문이다. 그러나 풍미가 우량하고 비타민, 무기물 등이 비교적 풍부할 뿐 아니라 한국, 일본, 중국 등 동양권 국가에서 생산과 소비가 날로 증가함을 고려할 때 그 영양학적 가치가 중요하다고 할 수 있다. 해조류 중 돌김은 수요가 가장 많고 또한 영양학적으로도 우수한 것으로 알려져 있다. 김은 해조류중 홍조류에 속하는데 홍조류의 다당류로는 폴피란(porphyran), 아가(agar-agar), 카라기난(carrageenan) 등이 대표적이다. 김의 성분은 비타민류가 대단히 풍부하여 A, B, D, E를 다량 함유하고 있으며 마그네슘, 인, 철분 및 요오드도 일부 함유하고 있다. 생리 기능적인 측면에서 김은 항암효과 및 미용식으로도 훌륭하며 또한 동맥경화 예방효과가 있고 다혈질, 뇌졸중, 현기증, 위궤양, 숨이 차는 사람 등에 특히 좋은 식품이며, 설사, 잇몸염증, 치질, 화상 치료에도 효과가 있다고 알려져 있다. 또한 식물성에는 소량 함유되어 있는 비타민 B₂가 많으며 비타민 E는 필수지방산의 과산화를 막고 노화의 방지에 유효하다. 김은 사코마 180(sarcoma180) 세포를 이식한 흰쥐의 고형암 성장 저지율을 측정한 결과 톳 열수 추출물이 63%, 그리고 참도박 열수 추출물이 30mg/kg의 농도에서 81%의 저지율을 나타낸다고 보고하였다[김성홍, 제주도산 식물 중 수용성 추출물의 항암효과, 제주대학교 (1990)].

본 발명자들은 전통적으로 식용되어온 국내산 해조류를 대상으로 대식세포를 활성화시키는 물질을 검색하고 검색 과정에서 높은 활성을 나타낸 홍조류인 돌김으로부터 대식세포 활성화 물질을 분리, 정제하여 생리, 화학적 특성을 연구함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 돌김으로부터 대식세포 활성화능을 갖는 다당류를 분리·정제하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 방법에 의해 제조된 대식세포 활성화능을 갖는 다당류를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 돌김을 대식세포 활성화제 및 항암 보조제로 사용하는 새로운 용도를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 돌김 열수 추출물에 에탄올을 첨가하여 침전된 물질을 음이온 교환 크로마토그래피에 주입하여, 용출 용매가 0.4M 농도의 염화나트륨(NaCl)일 때 대식세포 활성화능을 갖는 다당류를 획득하고, 이 다당류를 분자량 100만 이하 물질의 분리능을 갖는 수지에서 겔 여과 크로마토그래피하여 고분자 다당류를 얻고 생체 내 항암 활성을 확인하기 위해서 싸코마 180 고형암으로 측정·평가함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명하다.

도 1은 돌김 추출물에 에탄올을 첨가하여 침전된 물질 PS-1를 DEAE-Toyopearl 650M의 크로마토그래피한 결과이다.

도 2는 돌김 추출물에 에탄올을 첨가하여 침전된 물질에 염화나트륨으로 크로마토그래피하여 용출된 다당류 PS-1-4를 Sepharose CL-6B의 크로마토그래피한 결과이다.

도 3은 돌김에서 분리한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류 PS-1의 Sarcoma-180 고형암 모델에서 저지율을 측정한 결과이다.

본 발명은 대식세포 활성화능을 갖는 돌김 열수 추출물을 확인하는 단계; 대식세포 활성화 다당류의 분리·정제를 위한 전처리 단계; 돌김 열수 추출물로부터 대식세포 활성화 다당류를 분리·정제하는 단계; 돌김에서 분리·정제한 대식세포 활성화 다당류의 특성을 조사하는 단계; 돌김 열수 추출물로부터 분리·정제한 대식세포 활성화 다당류를 제조하는 단계로 구성된다.

상기 단계에 의해 얻어진 대식세포 활성화능을 갖는 다당류를 이용하여 면역질환자용 건강보조제나 약물등 기능성 식품을 제조할 수 있다.

본 발명의 실시예 표에서 별다른 언급이 없는 한 단위는 몰 %이다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예를 통하여 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 대식세포 활성화능을 갖는 돌김 열추 추출물의 확인

본 실시예에서는 통상의 방법으로 추출한 돌김 열수추출물이 대식세포 활성화능을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 스즈키(Suzuki) 등의 방법[Suzuki, I., Tanaka, H., Kinoshita, A., Oikawa, S., Osawa, M. andYadomae, T. : Effect of orally administered β-glucan on macrophage function in mice.Int. Soc. Immunopharmac. 12(6), 675 (1990)]을 사용하여 대식세포 활성화능을 측정하였다.

대식세포의 활성화 정도를 측정하기 위하여 먼저 5∼8주령 웅성 아이씨알 쥐(ICR Mouse)의 복강 내로부터 대식세포를 회수하였다. 회수된 대식세포는 세척하고 수를 보정하여 각 플레이트 부분(well)에 분주한 후 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂) 조건의 배양기에서 2시간 동안 배양하여 대식세포가 각 well에 단층을 형성하도록 하고 영양원인 10% 토끼 혈청 단백질(fetal bovine serum)을 함유한 RPMI-1640 배지를 각 well에 분주한 후 돌김 추출물 시료를 가하여 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하여 대식세포를 활성화시켰다. 상기의 방법에 의해 활성화된 대식세포 단층의 세포막을 용해시켜 대식세포의 라이소좀에서 인산 분해효소가 분비되면 이의 기질로서 10 mM 파라 니트로페닐 포스페이트(ρ-nitrophenyl phosphate)를 0.1 M 구연산 완충액(citrate buffer)과 같이 넣어주어 1시간 동안 산성상태(pH 5)에서 반응시키고 알칼리성인 0.2 M 붕산 완충액(pH 9.8)를 가하여 반응을 정지시킨 후 엘라이자 측정기(ELISA reader)로 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과 돌김 열수 추출액의 대식세포 활성화능은 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 223%의 활성을 나타냄으로써 높은 활성이 나타났으며, 이는 낮은 정제도에서도 높은 활성을 갖는 것으로 보조요법제로 사용 가능성이 있음을 확인하였다.

실시예 2: 대식세포 활성화 다당류의 분리·정제를 위한 전처리

돌김 열수 추출물로부터 대식세포 활성화 다당류를 분리·정제하기 위해서 전처리 공정으로 메탄올과 에톤올을 사용하여 유기용매 분획을 실시함으로써 활성과 수율을 측정하였다.

실험결과는 하기의 표 1과 같이 메탄올에서의 활성은 156%이고 수율은 11.5%이고, 에탄올의 활성은 223%, 수율은 43.3%로 돌김 열수 추출물은 에탄올을 사용한 유기용매 분획에 있어 활성과 수율이 높았다.

에탄올을 이용한 돌김 열수 추출물의 침전 분획

유기용매	상대적 활성도(%)	수율(%)
메탄올	156	11.5
에탄올	223	43.3

실시예 3: 돌김 열수 추출물로부터 대식세포 활성화 다당류의 분리·정제

돌김 열수 추출물로부터 대식세포 활성화 다당류를 분리·정제하기 위하여 상기 실시예 1과 2를 근거로 에탄올 침전을 통해서 침전된 물질을 증류수에 녹여 증류수로 평형화된 DEAE-Toyopearl 650M(Tosoh, Japan) 컬럼(4.0×33 cm)에 습윤겔 1 ㎖당 1 ㎎의 시료를 주입하고 증류수, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75, 1.0, 2.0 M 염화나트륨으로 분당 3.0 ㎖의 유속으로 각각 용출하여 가장 높은 활성을 나타내는 0.4 M 염화나트륨 용액에서 용출된 물질을 투석, 감압농축, 동결건조한 후 0.2 M 염화나트륨로 평형화된 Sepharose CL-6B(Pharmacia, USA) 컬럼(2.5×85 cm)에 습윤겔 1 ㎖당 0.1 ㎎의 시료를 주입하고 유속을 분당 0.2 ㎖로 용출하여, 도 1에 도시된 바와 같이 용출된 피크 중에서 첫 번째 피크를 분리하였다.

실험결과 음이온 교환수지 크로마토그래피를 통해서 분리된 획분들의 활성과 수율을 측정한 결과 표 2에서 나타낸 바와 같이 0.4 M 염화나트륨에서 용출된 획분에서 1 ㎎/㎖의 농도에서 252%의 활성과 25.7%의 수율을 나타내었고, 도 2와 표 3과 같이 PS-1-4a 획분이 가장 높은 활성과 수율을 나타내었다.

DEAE-Toyopearl 650M 크로마토그래피 획분의 활성과 수율

구분	상대적 활성도(%)	수율(%)
PS-1-1(0.1몰)	223	3.3
PS-1-2(0.2몰)	224	15.1
PS-1-3(0.3몰)	215	4.1
PS-1-4(0.4몰)	227	25.7
PS-1-5(0.5몰)	163	5.0
PS-1-6(0.75몰)	213	5.5
PS-1-7(1.0몰)	154	5.8
PS-1-8(2.0몰)	165	4.9

DEAE-Toyopearl 650M 크로마토그래피로 분리된 PS-1-4 획분의 겔 크로마토그래피

구분	상대적 활성도(%)	수율(%)
PS-1-4a	271	60.6
PS-1-4b	178	19.9

실시예 4: 돌김에서 분리·정제한 대식세포 활성화 다당류의 특성

본 발명의 돌김에서 분리·정제한 대식세포 활성화 다당류의 분자량은 HPLC를 사용하여 확인하고, 싸코마 180 고형암 모델을 이용하여 대식세포 활성화 다당류의 항암 효과를 분석하였다.

실험결과 돌김에서 분리·정제한 대식세포 활성화 다당류의 분자량은 34만 정도의 고분자 물질이었고, 항암 효과는 도 3에 나타난 바와 같이 5 ㎎/㎏의 용량에서도 50% 이상의 저지효과를 나타내어, 돌김에서 분리·정제한 대식세포 활성화 다당류는 대식세포 활성화 효과 및 항암 효과가 있음을 예측할 수 있었다.

실시예 5: 돌김 열수 추출물로부터 분리·정제한 대식세포 활성화 다당류의 분석

항암 활성을 보인 돌김 열수 추출물로부터 분리·정제한 대식세포 활성화 다당류의 구성성분 분석을 실시한 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 다당류가 76.2%로 주요부분을 구성하며 11.4%가 산성당과 0.7%의 단백질로 구성되었다. 주요 구성당은 표 5와 같이 무수갈락투론산(41.3 몰%), 갈락토스(21.3 몰%), 갈락투론산(18.9 몰%), 글루코스(4.9 몰%), 아라비노스(4.5 몰%), 글루쿠론산(4.5 몰%) 순으로 구성되었다.

이상의 실험결과들로부터 돌김에서 분리·정제한 대식세포 활성화 다당류는 분자량이 34만 정도의 고분자 물질로 대식세포 활성효과와 더불어 항암효과를 나타내는 것으로 확인되었고, 주요 구성 성분은 무수갈락토스와 갈락토스인 것으로 나타났다.

정제 대식세포 활성화 다당류의 화학적 조성(%)

전당	76.2
단백질	0.7
산성당	11.4

정제 대식세포 활성화 다당류의 구성당 조성(%)

람노스	-
푸코스	-
아라비노스	4.5
자일로스	-
만노스	4.5
갈락토스	21.3
무수갈락토스	41.3
글루코스	4.9
갈락투론산	18.9
글루쿠론산	4.5

상기의 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 돌김의 열수추출물을 에탄올 침전분획하고 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 수행하여 획득한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류는 면역증강물질로서의 이용뿐만 아니라 항암 보조제로서 이용될 수 있는 효과가 있으므로 식품의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

돌김 열수 추출물에 에탄올을 첨가하여 침전 물질을 얻고, 상기 얻은 침전물질을 음이온 교환 크로마토그래피에 주입하여, 0.4M 농도의 염화나트륨(NaCl)로 용출함으로써 대식세포 활성화능을 갖는 다당류를 얻은 후, 이 다당류를 분자량 100만 이하 물질의 분리능을 갖는 수지에서 겔 여과 크로마토그래피하여 정제함을 특징으로 하는 돌김으로부터 분리·정제한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류의 제조방법.
상기 제 1항의 제조방법에 의하여 제조된 돌김으로부터 분리·정제한 대식세포 활성화능을 갖는 다당류.
상기 제 2항의 돌김으로부터 분리한 다당류를 유효성분으로 포함하는 대식세포 활성화제 및 항암 보조제용 조성물.