KR20010089498A

KR20010089498A - 표고버섯 균사체 추출물을 함유하는 ｌａｋ 활성스크리닝물질 및 이를 사용한 ｌａｋ 활성스크리닝법

Info

Publication number: KR20010089498A
Application number: KR1020017006475A
Authority: KR
Inventors: 아사노겐지; 마쯔다유끼꼬; 다지마유따까
Original assignee: 나가오까히또시; 고바야시 가즈마사; 고바야시 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1998-11-27
Filing date: 1999-11-26
Publication date: 2001-10-06
Also published as: CA2352614C; WO2000033069A1; HK1042745A1; JP4308350B2; CA2352614A1; JP2000162204A; HK1041518B; CN1332847A; GB2360090A; HK1041518A1; CN1314963C; GB2360090B; TWI222515B; GB0112999D0

Abstract

저렴한 가격에 입수할 수 있는 항종양 및/또는 항암활성을 갖는 면역요법제를 스크리닝하기 위한 물질.

이하의 공정을 포함하는 피검체에 적합한 LAK 활성증강작용을 갖는 물질을 시험관 내에서 결정하는 스크리닝 방법:

(a) 피검체의 말초혈을 채취하여 이들 림프구 분획을 조제하는 것;

(b) 상기 림프구 분획에 본 발명의 스크리닝 물질을 첨가한 LAK 유도 샘플과 스크리닝 물질을 첨가하지 않은 대조 샘플을 조제하는 것;

(c) 상기 유도 샘플과 상기 대조 샘플에 대하여 LAK 활성을 측정하여 이들 결과를 서로 비교함으로써 당해 피검체에 대한 스크리닝 물질의 시험관 내에서의 LAK 활성증강작용을 결정하는 것.

Description

표고버섯 균사체 추출물을 함유하는 ＬＡＫ 활성스크리닝 물질 및 이를 사용한 ＬＡＫ 활성스크리닝법 {SUBSTANCE CONTAINING SHIITAKE MUSHROOM HYPHA EXTRACT FOR SCREENING LAK ACTIVITY AND METHOD FOR SCREENING LAK ACTIVITY BY USING THE SAME}

종양면역학에서의 기본적 개념으로 종양세포가 종양항원을 가짐이 알려져 있다. 종양세포가 갖는 종양항원으로는 정상세포에는 발현되지 않고 종양세포에만 존재하는 종양특이항원 (TSA : Tumor Specific Antigen), 또는 정상세포에도 극히 미량 존재하나 세포의 암화(癌化)에 수반하여 그 발현이 증강되는 종양관련 항원 (TAA : Tumor Associated Antigen) 이 존재한다. 이와 같은 종양항원은 정상세포의 암화에 수반하여 생기는 유전자 변이에 따라 새롭게 발현되거나 또는 당해 변이에 수반하여 발현 조절이 변화함으로써 발현된다. 이상(異常)항원성을 갖는 종양세포의 치료법으로는 면역요법이 가장 일반적이며, 그 예로 피검체를 종양항원으로 면역하거나, 피검체의 면역기능을 증강하는 약제가 사용된다. 일반적으로 종양세포를 파괴하는 활성은 면역계세포중에서도 NK (natural killer) 세포에서 높고, 또한 NK 세포의 활성도 면역요법에 의하여 증강됨이 알려져 있다. NK 세포는 정상개체중에 존재하는 비(非) T 비 B 세포장해성 림프계 세포로서, 종양세포, 바이러스 감염세포 등에 대하여 MHC 항원에 구속되지 않고 MHC 클래스 1 분자를 발현하지 않거나 또는 발현이 저하된 세포에 대한 장해활성을 나타냄이 알려져 있다. 그러나 현재는 NK 세포로도 살상할 수 없는 종양세포의 존재도 밝혀졌다.

미국 국립 암연구소 (NCI: National Cancer Institute) 의 S. Rosenberg 는 말초림프구를 인터루킨 2 (IL-2) 와 함께 배양하면 자가암을 포함하는 넓은 범위의 표적 암세포에 대하여 세포장해성을 나타내는 세포를 유도할 수 있고, 이 세포에 의하면 NK 세포로는 살상불가능한 암세포도 살상할 수 있음을 발견하였다 (일본 공개특허공보 소62-116518 호 참조). 이 킬러세포는 림포카인 활성화 킬러세포 (LAK 세포, Lymphokine Activated Killer Cell) 라 명명되었다. LAK 세포는 세포학상으로는 균일한 집단이 아니라, NK 세포계와 킬러 T 세포계의 세포집단인 것으로 알려져 있다. 최근에는 피검체 유래의 말초림프구를 세포배양계중에서 IL-2 를 사용하여 활성화한 후, 항종양활성을 나타내는 LAK 세포를 다시 피검체 체내로 이입하는, 양자(養子)면역 방법이 시도되고 있다 (LAK 요법). 이와 같은LAK 세포의 반복투여에 의한 양자면역에 의하여 말기암의 축소 또는 증식억제예가 보고되어 있다. 그러나 LAK 요법의 효과에는 개체차가 있어, 거의 효과가 없는 경우도 있다. 또, 피검체에서 다량의 백혈구를 분리하는 것이 피검체에 육체적 부담을 주는 것, 그리고 분리한 백혈구 세포를 대량 배양할 필요가 있어 경제적 부담이 크다는 것등, 여러가지 문제점이 있다. 또한 IL-2 를 직접 투여함으로써 LAK 요법을 실시하는 경우, 고농도의 IL-2 투여에 의한 심각한 부작용이 발생한다.

구체적으로는 IL-2 를 이용한 LAK 양자면역요법을 실시하는 경우, 전신권태, 오한, 발열, 저알부민, 빈혈, 호산구 증가 등의 증상이 부작용으로서 발생하며, 이들 부작용은 IL-2 를 단독으로 이용한 경우보다도 강한 것으로 알려져 있다. 더욱 주목해야 할 것은, 중대한 몇가지 부작용의 발현에 대해 LAK 세포가 정상세포에 대한 상해활성을 가지고 있을 가능성이 원인으로서 생각되어지고 있다. 이러한 LAK 세포에 의한 조혈간세포장해에 의해 빈혈이나 혈소판 감소가 발생하는 것 외에도, 림프구, 대식세포나 혈관내피세포에 대한 시험관 내 상해도 발생함도 보고되어 있다. 또, IL-2 는 경구투여에 의한 흡수가 나빠, 현재는 직접투여에 있어서는 주사투여가 주류를 이루고 있다.

따라서, 효과가 분명하지 않은 상태에서 부작용을 발생할 가능성이 있는 LAK 요법을 실시하는 것이 아니라, 직접투여에 의해 LAK 활성을 증강시킬 수 있는지 여부에 대해 미리 시험관 내에서 스크리닝할 것이 요구되어지고 있다. 그러나, IL-2 를 이용하여 시험관 내에서 실시하는 스크리닝에는 비용이 지나치게 많이 든다는 결점이 있다.

종래부터 세균류 또는 식품 등이 항암작용을 갖는 것으로 알려져 있다. 이들 항암작용을 갖는 세균류 또는 식품 등은 부작용이 적어 안전하므로, 이들 세균류 또는 식품 등으로부터의 항암작용 물질의 탐색이 시도되어 왔다. 지금까지 세균류에 의하여 암을 제압하려는 많은 시도가 이루어져 왔고, 예를 들면 세라티아균과 용련균의 배양여과액을 이용한 콜리 (Coley's) 톡신 (1964), BCG 에 의한 백혈병치료 (Mathe, G., Adv. Cancer Res., 14, 1, 1971) 및 모르모트에 있어서의 암종혹의 퇴축 (Zbar, B. 등, J. Natl. Cancer Inst., 48, 831, 1971) 및 효모벽다당체의 투여에 의한 사르코마 180 등의 이식암에 대한 유효성 등이 보고되어 있다.

특히, 다당체에 관해서는 효모 글루칸, 효모 만난, 기타 균체의 다당체, 지의류 및 담자균류의 다당체에서의 항암효과에 관하여 많은 연구가 이루어져 왔다. 이들 중에서 항암 면역증강약으로서 현재 시판되고 있는 것으로는, 담자균류의 말굽버섯과의 가와라타케 (코리올루스 베르시컬러 (Coriolus versicolor)) 배양균사체 유래의 크레스틴 (구레하카가쿠, 산쿄세야쿠 : 숙주의 면역기능 부활제) 및 표고버섯 다당체의 렌티난 및 스에히로타케 (스키조필룸 콤무네 (Schizophyllum commune)) 다당체 등이 있다.

또한 표고버섯 (렌티누스 에도데스 (Lentinus edodes)) 은 일본 및 중국을 대표하는 식용버섯으로 일본에서는 약 300 년 전부터 인공재배가 이루어져 왔는데, 그 약리효과 및 약효성분이 최근 해명되어가고 있어, 예를 들면 랫트·마우스에 있어서의 대장 및 간장 등의 이식종양세포의 증식억제효과 (Sugano, N. 등, Cancer Letter, 27:1, 1985 ; 스즈키 외, 일본대장항문병회지, 43:178, 1990) 및 마이토젠효과 (Tabata, T. 등, Immunopharmacology, 24;57, 1992 ; Hibino 등, Immunopharmacology, 28:77, 1994) 등이 보고되어 있다.

본 발명자들은, 표고버섯이 가진 LAK 활성증강효과 (항종양 및/또는 항암활성) 에 착안하여, 표고버섯 균사체 추출물을 직접 생체내에 투여했을 때의 생체 내 에서의 LAK 활성증강효과를 시험관 내에서 스크리닝하기 위한 스크리닝 물질 및 그 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

종래의 방법에서는, 실제로 생체내에 LAK 활성증강물질을 투여함으로써 또는 생체내의 림프구를 대량으로 제조하고, 이를 시험관 내에서 LAK 활성증강물질에 의해 활성화하고 이때 실제로 생체내에 활성화한 림프구를 되돌림으로써, LAK 활성증강효과가 있는지 여부를 확인하고 있었다. 이 방법에서는 치료에 비용이 지나치게 많이 든다는 결점 외에, 피검체의 육체적 부담이 과제가 된다는 결점이 존재하고 있었다. 따라서, LAK 활성증강물질이 실제로 생체내에서 효과를 갖는지 여부에 대해 시험관 내에서 간편하게 스크리닝할 수 있다면, 피검체의 육체적, 금전적 부담을 크게 줄일 수 있다.

[발명의 개시]

본 발명자들은 표고버섯의 생활환에 있어서 식용형태인 자실체의 전의 형태인 균사로부터 추출된 성분중에 자실체를 훨씬 능가하는 면역부활활성, 항종양활성 및/또는 항암활성이 있음을 발견하였다. 또한, 해당 추출물을 IL-2 의 대체물로서 시험관 내에서의 LAK 활성유도물질로서 사용함으로써, 당해 추출물을 직접 생체내에 투여했을 때의 생체 내에서의 항종양작용 및/또는 항암작용, 특히 LAK 활성증강작용을 시험관 내에서 스크리닝할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

보다 구체적으로는, 본 발명자들은, 표고버섯 균사체 추출물을 포함하는 항종양물질 또는 항암물질, 특히 LAK 활성증강물질을 직접 생체내에 투여하는 경우의 생체 내에서의 세포장해활성이 피검체로부터 제조한 림프구를 시험관 내에서 상기 LAK 활성증강물질에 의해 활성화하는 경우의 세포상해활성과 양(+)의 상관을 갖는 것을 발견하였다. 본 발명은, 다음의 공정을 포함하는 피검체에 적합한 LAK 활성증강작용을 갖는 물질을 시험관 내에서 결정하는 방법을 제공한다:

(a) 피검체의 말초혈을 채취하여 이것으로부터 림프구 분획을 제조하는 것:

(b) 상기 림프구 분획에 본 발명의 스크리닝 물질을 첨가한 LAK 유도 샘플과, 스크리닝 물질을 첨가하지 않는 대조 샘플을 제조하는 것;

(c) 상기 유도체 샘플과 상기 대조 샘플에 대해서, LAK 활성을 측정하여 이들 결과를 상호 비교함으로써 당해 피검체에 대한 스크리닝 물질의 시험관 내에서의 LAK 활성증강작용을 결정하는 것.

본 발명은, 또한 전술한 시험관 내에서의 스크리닝 방법에 사용함으로써, 생체 내에서 LAK 활성을 증강할 수 있는지 여부를 스크리닝할 수 있는, 표고버섯 균사체 추출물을 함유하는 스크리닝 물질을 제공한다. 따라서, 본 발명은 LAK 활성증강물질에 의해 생체 내에서의 LAK 활성증강효과를 기대할 수 있는지 여부에 대하여, LAK 활성증강물질의 투여 전에 시험관 내에서 판단할 수 있는, 표고버섯 균사체 추출물을 함유하는 스크리닝 물질 및 이 스크리닝 방법에 관한 것이다.본 발명의 스크리닝 물질 및 스크리닝 방법은, 인체뿐만 아니라 가축에도 사용할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「LAK 활성」이란 NK 활성을 담당하는 림프구에서는 인식할 수 없는 종양을 공격할 수 있고, 또 자기 정상세포에는 거의 영향을 미치지 않는 세포장해성 T 림프구가 나타내는 항종양활성을 의미한다. 「LAK 활성증강」이란 이러한 LAK 활성을 강화시키는 것으로, 림프구로부터 LAK 세포를 유도하거나 또는 이미 존재하는 LAK 세포의 항종양활성을 더욱 강화시키는 것 등을 의미한다.

LAK 활성을 증강함으로써 LAK 세포의 항종양활성을 높일 수 있는데, 이는 세포성 면역계의 향상을 유도한다. 따라서, 항종양활성의 향상을 기대하는 치료 이외에도, 면역계의 향상을 목적으로 하는 치료에 이용할 수 있다.

본 발명은 종양면역학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항종양 및/또는 항암활성을 갖는 면역요법제를 스크리닝하기 위한 물질 및 그 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 시험관 내에 있어서 생체 내에서의 LAK 세포 (Lymphokine Activated Killer Cell: 림포카인 활성화 킬러세포) 의 활성증강효과를 얻을 수 있는지 여부를 판단하기 위한 스크리닝 물질 및 그 방법에 관한 것이다.

도 1 은 본 발명의 표고버섯 균사체 추출물을 이용한 LAK 활성증강 스크리닝의 결과를 나타낸 표 1 의 데이터를 막대그래프로 나타낸 것이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명은, 표고버섯 균사체 추출물을 포함하는 항종양제 또는 항암제, 특히 LAK 활성을 증강시키기 위한 제제를, 직접 생체내에 투여함으로써 LAK 활성의 증강효과를 기대할 수 있는지의 여부에 대하여, 제제투여전에 시험관 내에 있어서 판단할 수 있는, 표고버섯의 균사체 추출물을 함유하는 스크리닝물질 및 그 스크리닝방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 「스크리닝물질」 이란, 이를 생체에 투여한 경우의 생체 내에서의 LAK 활성의 증강효과를, 시험관 내로 조사하기 위해 사용하는 물질을 말한다. 본 발명에서 스크리닝물질로서 사용되는 「표고버섯 균사체 추출물」 이란, 표고버섯균을 고체배지상에서 배양했을 때에 얻은 균사체 혹은 균사체를 포함하는 고체배지를, 물 및 효소의 존재하에서 분쇄, 분해하여 얻은 추출물을 말한다.

표고버섯 균사체 추출물은, 바람직하게는 이하의 방법으로 얻은 것을 사용하지만, 이것에 한정되지 않는다. 즉, 바가스 (bagasse) (사탕수수를 짜고 남은 찌꺼기) 와 탈지미당을 기재로 하는 고체배지상에 표고버섯균을 접종하고, 균사체를 증식시킨 후, 균사체가 증식된 고체배지를 12 메쉬통과분이 30 중량% 이하로 되도록 해속 (解束) 한다. 이 해속된 고체배지에 물을 더하여, 추가로 카보히드라제, 또는 프로테아제, 혹은 이들의 조합으로 이루어지는 효소 (군) 를 첨가하여, 30-35℃ 의 온도로 유지함으로써, 상기 고체배지를 분쇄, 연마한다. 이 공정에서 사용하는 효소로서는, 셀룰라제, 프로테아제, 글루코시다제 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 상기 공정에서 분쇄하여 연마한 고체배지를, 바가스섬유의 적어도 70 중량% 이상이 12 메쉬통과분이 되도록 조제하고, 다음에 95℃ 까지의 온도로 가열함으로써 효소를 불활성화시켜, 동시에 멸균한다. 마지막으로 얻은 현탁상 액체를 여과함으로써 표고버섯 균사체 추출물을 얻는다.

표고버섯 균사체 추출물은 그대로 본 발명의 스크리닝물질 또는 면역치료제로서 사용하여도 되지만, 이것을 농축, 동결건조하여 분말로 보존하여, 사용시에 여러가지의 형태로 사용하는 것이 편리하다. 동결건조하여 얻은 분말은 갈색분말로, 흡습성이 있고, 특이한 맛과 냄새를 갖는다.

본 발명의 표고버섯 균사체 추출물은, 말초혈에서 얻은 림프구 분획에 대하여 직접 첨가할 수 있다. 림프구 분획에 대하여 직접 첨가하는 경우에 있어서의 본 발명의 스크리닝물질 중에 포함되는 표고버섯 균사체 추출물의 농도는, 바람직하게는 1 ng/㎖ ∼ 100 ㎎/㎖ 이고, 더욱 바람직하게는 1 ㎍/㎖ ∼ 100 ㎍/㎖ 이고, 특히 바람직하게는 10 ㎍/㎖ ∼ 50㎍/㎖ 이다. 본 발명의 표고버섯 균사체 추출물은, 배양세포에 첨가하기 전에 또는 말초혈에 대하여 직접 첨가하기 전에, 아세톤에 의한 무균처리를 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 스크리닝물질을 사용하여 스크리닝을 하는 방법으로서는, 다까끼 등의 방법에 따라 수행되지만 (임상면역, 19:245-249, 1987), IL-2 대신에, 스크리닝물질, 예컨대, 본 발명의 표고버섯 균사체 추출물을 사용하는 점에서 종래의 방법과 상이하다.

즉, 본 발명의 LAK 활성증강 스크리닝법은, 이하의 공정을 포함하는 피검체에 적합한 LAK 활성증강작용을 갖는 물질을 시험관 내로 결정하는 방법이다:

(a) 피검체의 말초혈을 채취하여, 이것으로부터 림프구분획을 조제하는 것 ;

(b) 상기 림프구 분획에 본 발명의 스크리닝물질을 첨가한 LAK 유도샘플과, 스크리닝물질을 첨가하지 않은 대조샘플을 조제하는 것 ;

(c) 상기 유도샘플과 상기 대조샘플에 대하여, LAK 활성을 측정하여 이들의 결과를 상호 비교함으로써 당해 피검체에 대한 스크리닝물질의 시험관 내에서의 LAK 활성증강작용을 결정하는 것.

LAK 세포를 유도하기 위해, 피검자의 말초혈에서 림프구를 분리한다. 피검자에게서 채혈한 말초혈에 헤파린을 추가하여, 피콜-콘레이 (Ficoll-Conray) 액 (s.g.=1.077) 을 사용한 비중원심분리법으로 계면의 단핵구를 분리한다. 분리된 단핵구를 PBS (pH 7.4, Ca 및 Mg 를 포함하지 않음) 에 의해 2 ∼ 3 회 세정한 후, 1×10⁶/㎖ 로 되도록 배양액 (바람직하게는, RPMI 1640 배지 (Gibco) 에, FBS (비활성화혈청) 이나 항생물질 등을 적당히 첨가한 것) 에 현탁한다. 이것을, 자기혈청 (혈장) 을 37 ℃ 에서 15 분 처리하여 코팅한 페트리디쉬로 옮겨, 37℃ 에서 1 시간 배양한다. 비부착성세포를 회수하여 림프구 분획으로 한다.

LAK 유도샘플은, 예컨대, 이하의 방법으로 조제한다. 즉, 상술의 방법으로 얻은 림프구 분획을, 세포의 최종농도가 1×10⁵/㎖ ∼ 1×10⁶/㎖ 로 되도록 조제하여, 배양액중에 부유시켜, 1 웰 (well) 당 세포를 현탁한 배양액 100 ㎕ 을 첨가함으로써, 세포수가 1×10⁴/웰 ∼ 1×10⁵/웰이 되도록 한다. 1웰당의 세포수는, 당업자가 사용하는 이펙터(effector)세포의 활성, 표적세포의 이펙터세포에 대한 감수성 등에 의해 적당히 결정할 수 있다. 이 부유액에는, 실험계획에 따라, 스크리닝물질로서 최종농도 1 ng/㎖ ∼ 100 ㎎/㎖ 범위의 표고버섯 균사체 추출물을 추가한다.

이와 같이 하여, 피검체의 림프구를 여러가지의 농도 (농도제로를 포함함) 의 본 발명의 표고버섯 균사체 추출물의 존재하에서 배양하여 이펙터세포로 한다. 본 명세서에서는, 이펙터세포란, 3 일간 상기의 배양처리를 한 세포를 가르키고,LAK 활성증강물질과 함께 배양된 림프구 (LAK 활성증강물질이 첨가되어 처리된 림프구) 및 LAK 활성증강물질을 포함하지 않은 배양액으로만 배양된 림프구 (무첨가유도처리된 림프구) 의 양방을 포함한다.

대조샘플은, 스크리닝물질을 첨가하는 대신에 멸균된 재조합 IL-2 (rIL-2; 2000U/㎖) 을 첨가하는 것 이외에는, LAK 유도샘플을 조제하는 방법과 동일한 방법으로 조정한다.

LAK 활성의 측정은,⁵¹Cr 방출 분석법, [³H]우리딘법 등의 방법으로 실행한다. 본 발명에 있어서는, 간편성 및 객관성의 관점에서,⁵¹Cr 방출 분석을 사용하는 것이 바람직하다.⁵¹Cr 방출 분석은, LAK 활성증강물질로 처리된 림프구에서 유도된 LAK 세포에 의한 표적세포상해활성을 시험관 내에 있어서 측정하는 방법의 하나이다.⁵¹Cr 방출 분석은, 이하의 공정으로 이루어지는 이펙터세포에 의한 표적세포에 대한 세포상해활성을 측정하는 방법이다:

(i) 표적세포에⁵¹Cr 로 표식한 크롬산나트륨을 첨가함으로써 표적세포를 표식하는 것 ;

(ii) 상기 표적세포를, 스크리닝물질 또는 대조로서의 rIL-2 에 의해 자극한 이펙터세포 (예컨대, 킬러-T 세포나 LAK 세포) 와 반응시키는 것 ;

(iii) 표적세포가 이펙터세포에 의해 파괴된 경우에 세포배양 상등액중에 방출되는⁵¹Cr 의 양을 측정하는 것.

⁵¹Cr 방출 분석에 있어서 사용하는 표적세포인 계대배양세포로서는, 바람직하게는 다우디 (Daudi) 세포 또는 라지 (Raji) 세포를 사용한다. 표적세포의 배양은, 배양플라스크중에 배양한 것을 회수하고,⁵¹Cr 로 표식한 후 마이크로타이터 플레이트에 부어 실행한다. 표적세포의 배양액으로서는, 사용하는 세포가 증식하기 위해 적합한 것을 사용하고, 예컨대, RPMI 1640 등의 배양액에 혈청, 항생물질 등을 적당히 추가한 것을 사용한다.

표적세포의 표식은, 배양한 표적세포 10⁶개당 100 ∼ 150 μCi 의⁵¹Cr-크롬산나트륨을 첨가하여, 잘 교반한 후 37℃ 에서 1 ∼ 2 시간 인큐베이트함으로써 실행한다. 배양세포는 PBS 에 의해 3 회 세정한 후, 1×10⁶/㎖ 이 되도록 10% FBS 첨가 RPMI 1640 배지에 현탁한 것을 사용한다. 표식한 후, 배양시에 사용한 배양액 또는 인산완충액 (PBS) 을 사용하여 세정하고, 마지막에 10% 의 소태아혈청 (FBS) 또는 송아지혈청 (FCS) 을 포함하는 배양액중에서 최종농도 1×10⁶/㎖ 로 되도록 조제하여, 분석에 사용한다. 표적세포는, 마이크로타이터 플레이트의 각 웰중에, 세포수가 5×10⁴/㎖ 로 되도록, 50 ㎕ 씩 붓는다.

세포상해활성을 측정하기 위한 분석에 있어서는, 상술의 표적세포를 부은 각 웰에, 최대해리용에는 1N-HCl 을 100 ㎕ 를 추가로 첨가하고, 자연해리용에는 배양액만 100 ㎕ 를 추가로 첨가하고, 그리고 실험해리용에는 여러가지의 농도의 본 발명의 표고버섯 균사체 추출물 또는 대조인 2000 U/㎖ 의 rIL-2 에 의해 자극한 이펙터세포 1×10⁵/㎖ ∼ 1×10⁶/㎖ 를 함유하는 배양액 100 ㎕ 를 추가로 첨가한다. 이어서, 마이크로타이터 플레이트를 플레이트원심분리기에 의해, 800 rpm 으로 5 분간 원심처리하여 세포를 웰 저부에 모은 후, 5% CO₂배양기로 37 ℃ 에서 3.5 시간 배양한다.

⁵¹Cr 방출분석에 있어서의 표적세포상해활성은, 이하의 식에 의해 산출한다:

LAK 활성 % = [(실험해리 (cpm) - 자연해리 (cpm))/(최대해리 (cpm) - 자연해리 (cpm))] ×100

이 식에 의해 산출된 LAK 활성에 대하여, 유도샘플과 대조샘플의 값을 서로 비교함으로써, 스크리닝물질에 의한 시험관 내에서의 LAK 활성유도능을 측정할 수 있다.

상술의 최대해리, 자연해리 및 실험해리를 구하는 공정에서, 표적세포의 배양은, 5% CO₂로 37 ℃ 에서 실행하고, 배양시간은, 실험목적, 사용하는 세포의 수, 그 외의 조건에 따라, 당업자가 적당히 결정할 수 있지만, 본 발명에서는 3.5 시간 배양한다.

배양 상등액중에 방출된⁵¹Cr 에 의한 방사선량은, 신틸레이션 카운터 등을사용함으로써 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 각 공정은 이하와 같이 실시하지만, 적절한 변경 및 수식이 이루어져도 된다.

배양된 플레이트에서 각 웰의 배양 상청액을 채취하여 신틸레이션 카운터로 방사활성을 측정한다.

상술한 스크리닝방법으로 시험관 내에서의 LAK 유도 활성이 보인 표고버섯 균사체 추출물을 3600㎎/일로 7일간, 생체에 투여하여 시험관 내에서 LAK 활성을 유도하였다. 상술한 림프구 회수방법으로 채취한 림프구 분획을 사용하여 상술한 LAK 유도 샘플 때와 동일한 조건하에서 LAK 활성% 을 측정한 결과, 생체 내에서의 LAK 활성증강작용은 시험관 내에서 얻은 결과와 양(+)의 상관을 나타냄을 알 수 있었다.

본 발명을 이하의 실시예에 의하여 좀 더 상세히 설명하는데, 이들은 어디까지나 예시로서 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 본 발명의 정신에서 일탈하는 일 없이 본 발명에 대한 다양한 변경 또는 수식이 행해져도 됨은 당업자에게는 이해된다.

실시예 1 : 표고버섯 균사체 추출물의 조제

바가스 90 중량부, 미당 10 중량부로 이루어지는 고체배지에 순수(純水)를 적당히 포함시킨 후에 표고버섯균을 접종하고, 온도 및 습도를 조절한 배양실내에 방치하여 균사체를 증식시켰다. 균사체가 고체배지에 밀집된 후, 바가스 기재의 섬유소를 해속하여 12 메쉬 통과분이 24 중량% 이하가 되도록 하였다. 이 해속된 배지 1.0 kg 에 순수 3.5 ℓ 및 정제 셀룰라제 2.0 g 을 고체배지를 40 ℃ 로 유지하면서 첨가하여 배지함유 혼합물로 하였다.

이어서, 배지함유 혼합물을 변속기어가 부착된 펌프에 의하여 순환시키면서, 고체배지에 기어부분에 있어서 분쇄 및 연마 작용을 200 분 정도 가하여, 바가스 섬유의 약 80 중량% 가 12 메쉬 통과분이 되도록 하였다. 배지함유 혼합물의 분쇄 및 연마는 이 혼합물의 온도를 서서히 상승시키면서 실시하였다. 그 후, 배지함유 혼합물을 다시 90 ℃ 까지 가열하여 효소를 불활성화시킴과 동시에 멸균하여 90 ℃ 에서 30 분간 방치하였다. 얻은 배지함유 혼합액을 60 메쉬 여과포 (filter cloth) 에 의하여 여과하여 표고버섯 균사체 추출물로 하고, 농축한 후 동결건조분말을 얻었다.

이렇게 하여 얻은 표고버섯 균사체 추출물은 페놀황산법에 의한 당질분석에 의하여 당질을 25.3 % (중량/중량), 로리 (Lowry) 법에 의한 단백질분석에 의하여 단백질을 19.7 % (중량/중량), 몰식자산을 규준(規準)으로 하는 폴린-데니스 (Folin-Denis) 법에 의하여 폴리페놀을 2.6 % (중량/중량) 함유하고 있었다. 표고버섯 균사체 추출물에는 그 밖에 조지방 8 %, 조회분(粗灰分) 22 %, 당질이외의 가용성 무질소물을 약 20 % 함유하고 있었다. 이 중 표고버섯 균사체 추출물 중의 구성 당 조성은 다음과 같았다. Xyl : 15.2, Ara : 8.2, Man : 8.4, Gul : 39.4, Gal :5.4, GlcN : 12.0, GluUA : 11.3

실시예 2 : LAK 활성의 측정

먼저, 피검체 A, B 및 C 에서 표고버섯 균사체 추출물 복용전의 말초혈 및 각 피검체에 표고버섯 균사체 추출물 1200㎎ 을 매일 3회, 1 주간에 걸쳐 경구 투여한 후 말초혈을 각각 채혈하였다. 이들 말초혈에서 아래와 같은 방법으로 분리된 림프구 분획을 사용하여 본 발명의 추출물이 생체 내에서 림프구를 활성화시키는 능력과 추출물을 사용하며 림프구를 시험관 내에서 활성화시키는 능력의 상관성에 대해서 스크리닝할 수 있다.

먼저, 채취된 이들 말초혈에 헤파린을 첨가하여, 피콜-콘레이 액 (s.g.=1.077) 을 이용한 비중원심분리법으로 계면의 단핵구를 분리하고, 이어서 이 분리된 단핵구를 PBS (pH 7.4, Ca 및 Mg 를 포함하지 않음) 에 의하여 2 회 세정한 후, 1×10⁶/㎖ 가 되도록 10 % FBS (비활성화 소태아 혈청) 을 배양액에 첨가한 RPMI 1640 배지 (Gibco) 에 현탁하였다. 상술한 방법으로 분리한 세포를 미리 자기혈청 (혈장) 을 사용하며 37 ℃ 에서 15 분 처리하여 코팅한 배양접시로 옮겨, 37 ℃ 에서 1 시간 배양한 후 비부착성 세포를 림프구 분획으로서 채취하였다.

10 % FBS RPMI 1640 배양액 중에 배양한 표적 세포인 계대 배양세포 (다우디 세포) 를 원심분리로 회수하고, 10⁶세포당 100 ∼ 150μCi 의⁵¹Cr-크롬산나트륨 (New England Nuclear) 을 첨가하고 5% CO₂배양기에서 37℃ 에서 1시간 배양하였다.⁵¹Cr 에 의해 표식된 배양세포를 PBS 로 3 회 세정한 후 1 ×10⁶/㎖ 가 되도록 10 % FBS 첨가한 RPMI 1640 배양액 중에 현탁시켰다.

마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 상술한 방법으로 표식된 표적세포를 50 ㎕ (5 ×10⁴/웰) 씩 붓고, 그리고 최대해리군 (양성 대조) 에는 1N-HCl 을 100 ㎕ 씩 붓고, 자연해리군 (음성 대조) 에는 10 % FBS 을 첨가한 RPMI 1640 배양액을 100㎕ 씩 붓고, 그리고 실험해리군에는 10 ㎍/㎖ 농도의 본 발명의 표고버섯 균사체 추출물 또는 대조로서의 2000U/㎖ 농도의 rIL-2 로 자극한 이펙터세포 (100 ㎕ (1 ×10⁴/웰) 씩) 를 부었다. 플레이트 원심분리기로 800rpm 에서 5 분간 원심 처리하여 세포를 웰 저부에 모은 후 5 % CO₂배양기에서 37 ℃ 에서 3.5 시간 배양하였다.

배양된 플레이트에서 SOKEN-PET ∑-96 으로 각 웰의 배양 상청액을 채취하여 γ-신틸레이션 카운터로 방사활성을 측정하였다.

LAK 활성은 아래 식에 따라 산출하였다.

결과를 표 1 및 도 1 에 나타낸다.

LAK 활성
	피검체 A	피검체 B	피검체 C
복용전	13 %	27 %	14 %
추출물에 의한 스크리닝(최종 농도 : 10㎍/㎖)	21 %	34%	15%
추출물 복용후	40 %	43 %	15 %

피검체 A 및 B 에서 실제로 표고버섯 균사체 추출물을 경구 투여한 결과, 생체 내에서 LAK 활성이 증강되어 있음이 확인되었다 (표 1, 실험 3 을 참조). 반면에, 본 발명의 추출물을 사용한 시험관 내에서의 스크리닝에서는 피검체 A 및 B의 말초혈에서 채취한 림프구를 본 발명의 추출물을 사용하여 자극한 경우에, 본 발명의 추출물을 피검체 A 및 B 에 직접 경구 투여한 경우에 얻은 LAK 활성의 증강효과와 양(+)의 상관을 나타내는 LAK 활성의 증강효과가 보였다 (표 1, 실험 2 를 참조). 따라서, 본 발명의 표고버섯 균사체 추출물을 경구 투여하였을 때 LAK 활성의 증강효과를 시험관 내의 스크리닝에서 예측할 수 있음이 판명되었다.

한편, 피검체 C 에서 실제로 표고버섯 균사체 함유물을 경구 투여한 결과, 생체 내에서도 LAK 활성이 증강되어 있지 않음이 확인되었다 (표 1, 실험 3 을 참조). 반면에, 본 발명의 추출물을 사용한 시험관 내에서의 스크리닝에서는 피검체 C 의 말초혈에서 채취한 림프구를 본 발명의 추출물을 사용하여 자극하여도, 본 발명의 추출물을 직접 경구 투여한 경우에 얻은 LAK 활성의 증강효과가 보이지 않았다 (표 1, 실험 2 를 참조). 따라서, 이 예에서도 본 발명의 표고버섯 균사체 추출물을 경구 투여하였을 때 생체 내에서의 LAK 활성증강효과를 시험관 내에서 스크리닝함으로써 예측할 수 있음이 판명되었다.

따라서, 본 발명의 LAK 활성증강물질을 생체에 경구 투여한 경우 생체 내에서의 LAK 활성의 증강효과를 시험관 내에서 스크리닝 결과에서 더 정확히 예측할 수 있음을 알 수 있었다. 그럼으로써, 본 발명의 표고버섯 균사체 추출물을 직접 투여하였을 때 생체 내에서의 LAK 활성증강효과를 당해 LAK 활성증강물질을 직접 투여하기 전에 시험관 내에서 간편히 판단할 수 있으며, LAK 활성증강효과를 기대할 수 있는 피검체에 대하여 LAK 활성증강물질의 효과적인 투여를 신속하게 할 수 있을 뿐아니라 LAK 활성증강효과를 기대할 수 없는 피검체에 대해서는 LAK 활성증강물질의 쓸데없는 투여를 방지할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법으로는 피검체의 혈액에서 대량의 림프구를 채취하지 않아도 LAK 활성증강물질의 생체 내에서의 치료효과를 시험관 내에서 스크리닝할 수 있어 피검체의 육체적 부담도 현저히 경감된다.

Claims

이하의 공정을 포함하는 피검체에 적합한 LAK 활성증강작용을 갖는 물질을 시험관 내에서 결정하는 방법:

(a) 피검체의 말초혈을 채취하여 이들 림프구 분획을 조제하는 것;

(b) 상기 림프구 분획에 본 발명의 스크리닝 물질을 첨가한 LAK 유도 샘플과 스크리닝 물질을 첨가하지 않은 대조 샘플을 조제하는 것;

(c) 상기 유도 샘플과 상기 대조 샘플에 대하여 LAK 활성을 측정하여 이들 결과를 서로 비교함으로써 당해 피검체에 대한 스크리닝 물질의 시험관 내에서의 LAK 활성증강작용을 결정하는 것.
제 1 항에 있어서, 스크리닝 물질이 표고버섯 균사체 추출물인 방법.
제 1 항에 기재된 시험관 내에서의 스크리닝 방법에 사용함으로써 생체 내에서 LAK 활성을 증강할 수 있는지의 여부를 스크리닝할 수 있는 표고버섯 균사체 추출물을 함유하는 스크리닝 물질.
제 2 항에 기재된 스크리닝 물질을 생체 내에 투여하는 것에 의한 피검체의 종양을 치료하는 방법.