KR20010074721A - 암 치료에 유용한 무수물 변형 칸타리딘 유사체 - Google Patents

Abstract

특정 형태의 암 치료에 유용한 무수물 변형 칸다리딘 유사체, 상기 유사체의 항-암 활성 및/또는 암세포를 암치료로 감작시키는 능력 검색 방법. 변형 칸다리딘 유사체는 하기 식의 구조를 갖는다:

[식중 R₁및 R₂및 R₄는 H, 아릴 또는 알킬이고; X 는 O, N 또는 S 이며; Y 는 O, S, NH, NR 이며; R 은 알킬 또는 아릴이고; A 및 B 는 H 또는 CH₃이며; W 및 Z 은 CHOH 또는 C-O 이다. 상기 화합물은 단백질 포스파타제를 저해한다.

Description

암 치료에 유용한 무수물 변형 칸타리딘 유사체{ANHYDRIDE MODIFIED CANTHARIDIN ANALOGUES USEFUL IN THE TREATMENT OF CANCER}

단백질 탈인산화효소 저해제 및 세포 주기 체크포인트의 상실

단백질 칼인산화효소의 조절은 세포 성장, 암화, 종양 억제, 유전자 전사, 아폽토시스, 신경전달과 같은, 세포의 신호 전달, 근육 수축, 글리코겐 합성, 및 T-세포 활성화를 포함하는, 많은 세포 과정의 조절에 필수적이다. 상기 과정의 다수에서 단백질 탈인산화효소의 역할은 종종 세포 주기의 변화를 통해 매개된다. 세포 주기 진행은 게놈의 보전을 확실히 하기위해 팽팽하게 조절된다. 세포 분열 도중에서 세포 주기의 각 단계는 다음으로 들어가기 전에 완료되야 하며, 이는 일련의 체크포인트를 통해 달성된다. 세포 주기는 DNA 합성 단계 (S-phase) 를 뒤따르는, 첫번째 갭 (G₁), 두번째 갭 (G₂) 에 이어 G₁단계인 두 딸세포를 생성하는 유사분열 (M) 의 네 단계로 나눌 수 있다. 세포 주기에는 하나는 G₁후기에, 및 다른 하나는 G₂및 M 경계면에 있는 두가지 주요 조절점이 있다. 상기 조절점을 거친 통과는 공통적인 단백질 인산화효소인, cdk1 가 조절한다. cdk1 의 인산화효소 활성은 인산화 및 조절 소단위인, 시클린 B 와의 연합에 의존한다. 서로 다른 시클린 의존 인산화효소 (cdk) 와 서로 다른 시클린간의 주기적인 연합이 세포 주기의 서로 다른 단계를 유도함이 보고된 바 있다; 즉 cdk4-시클린 D1 은 세포를 G₁중기로 유도하고, cdk2-시클린 E 는 세포를 G₁후기로 유도하며, cdk2-시클린 A 는 S-단계로 들어가는 것을 조절하고 cdc2-시클린 B 는 세포를 G₂/M 전이로 유도한다 (O'Connor, 1996, 1997).

화학치료 또는 방사선 치료로 유도된 DNA 손상에 따라 상기 체크포인트는 G₁S 및/또는 G₂단계로의 세포주기 진행을 중지시켜야 한다. 세포는 세포주기 중단을 겪으면서 S 단계 또는 유사분열에 들어가기 전에 손상된 DNA 를 수리할 수 있다. 세포주기가 중지되는 단계는 사용한 DNA 손상 약물의 타입 및 손상이 일어난 세포주기상의 시점에 의존한다 (O'Connor, 1997). 세포 주기는 복잡한 인산화 네트워크에 의해 조절되고 제어된다 (Stein 이외, 1998). 보다 자세하게는, cdk/시클린 복합체의 활성화에는 보존된 트레오닌 기의 인산화가 필요하며, 상기 인산화는 CAK 인산화효소에 의해, 억제적 인산화의 제거는 탈인산화효소 cdc25 에 의해 촉매된다. Cdc25 는 그것의 인산화된 형태일 때에만 활성을 띈다. 따라서, 단백질 탈인산화효소 2A (PP2A) 는 CAK 활성을 억제하고 cdc25 를 탈인산화시켜 cdk/시클린 복합체의 활성화를 억제할 수 있다. G₁/S 체크포인트는 종양 억제 단백질 레티노블라스토마 (pRb) 의 인산화 및 불활성화를 통해 그 효과를 나타내는 cdk/시클린 D/E 복합체에 의해 주로 조절된다. pRb 의 인산화는 상기 단백질과 S-단계 전사 인자인 E2F 의 상호작용을 억제한다. E2F 는 티미딜레이트 합성효소를 포함하는 DNA 합성 및 S-단계에 들어가는데 필요한 단백질의 전사를 조절한다. 따라서, 인산화에 의한 pRb 의 불활성화로 S-단계로 들어가는 것 및 나오는 것이 허용된다. 그러나 단백질 탈인산화효소 1 (PP1) 은 pRb 를 탈인산화시킬 수 있고 세포 주기를 저해한다 (Durfee 이외, 1993). 따라서, PP1 및 PP2A 는 모두 세포 주기의 음성 조절인자이다. PP1 및 PP2A 의 저해는 상기 체크포인트를 상실시키고 세포가 조급하게 세포주기를 거치도록 한다.

단백질을 탈인산화시키는, 세린/트레오닌 탈인산화효소는, 그들의 기질 특이성 및 환경적 요구에 근거한 네가지 주요 아분류로 구성되는 독특한 분류의 효소군을 형성한다. 세린/트레오닌 탈인산화효소 중, 단백질 탈인산화효소 1 및 2A (각각, PP1 및 PP2A) 는 두 효소의 소단위간 서열 동일성을 공유하며 (23-292 기에 대해 50%, 전체에 대해 43%), 모든 진핵 세포에 존재하고 둘이 함께 전체 세포의 탈인산화 중 90% 를 일으킨다. 따라서 PPI 및 PP2A 둘의 구조 및 이에 따른 결합 기능과의 연관성에 대한 지식은 상기 효소들의 생화학적 역할을 이해하는데 중대한고리를 제공할 것이다. 의약 화학자의 목표는 상기 단백질 탈인산화효소의 강력하고 선택적인 억제제를 개발하는 것이다.

자연산 독소인, 오카다산, 칼리큐린 A, 마이크로시스틴-LR 및 타우토마이신은 모두 단백질 탈인산화효소 1 (PP1) 및 2A (PP2A) 의 강력한 억제제인 화합물의 구조적으로 다양한 그룹을 대표한다. 오카다산은 PPI (IC₅₀60nM) 보다 PP2A (IC₅₀1nM) 에 대해 더 특이적인 반면, 칼리큐린은 PPA (IC₅₀2nM) 보다 PPI (IC₅₀0.5-0nM) 에 대해 약간 더 특이적이다. 모든 상기의 탈인산화효소 저해제들은 세포주기 체크포인트, 특히 세포주기의 G₂체트포인트를 상실시키고 세포의 유사분열을 유도한다고 공지되어 있다 (Yamashita 이외, 1990). G₂체트포인트의 상실은 세포가 유사분열에 들어가기 전에 DNA 손상 또는 게놈의 이상형성을 검출하는 능력을 갖지 못했음을 의미한다. 따라서, 결핍된 G₂체크포인트를 갖는 세포는 불안정하고, DNA 손상, G₂저지 개시, 또는 DNA 복구를 검출할 수 없다. 상기 세포는 기형 방추체를 사용하여 체세포 분열 단계의 세포 사이클에 미성숙하게 진입한다. 제거는 오카다산에 의한 세포 사이클 중 G₂체크 포인트가 cdc2/H1 키나제인, 주요 체세포분열 유도체의 활성화를 매개로 하고, 미성숙 체세포분열 상태에 있게 된다 (Yamashita 등, 1990). 어떤 세포 형태에서는 오카다산이 종양 프로모터로서 공지되어 있음에도 불구하고, 암유전자-형질변환 세포의 표현형을 정상 세포의 표현형으로 되돌리고, 섬유아세포의 신생물 형질변환을 억제하는 것이 관찰되어 왔다(Schonthal, 1991).

또한, 오카다산은 p53 nul 인 HL60 세포에서 빈블라스틴의 세포파괴 및 고사 세포 형성을 선별적으로 증진시키는 것이 관찰되어 왔다 (Kawamura, 1996). 흥미롭게도, 칼리큘린은, 단독 처리로서 주어진 경우, 독성이지 않은 투여량에서의 섬유아세포 중 조사 킬링 (killing) 을 증진시킨다 (Nakamura 및 Antoku, 1994). 데이터는 또한 아카다산이 세포 사이클의 G₁/S 체크포인트를 폐지할 수 있다는 것을 보여준다. 상기 내용에서, 오카다산은 S-단계 체크포인트를 간과하고 G₂-단계의 진행을 촉진시켜서 미성숙 체세포분열을 유도하는 것으로 나타났다 (Gosh 등, 1996). 또한, 오카다산은 pRb 의 인산화 상태 중 변형을 통하여 S-단계에 진입하는 정지 세포의 분획을 현저히 증가시키는 것이 나타났다 (Lazzereschi 등, 1997). 다른 연구는 pRb 상태의 과인산화가 세포로 하여금 pRb 및 S-단계로 미성숙하게하는 것이 단백질 포스페이트 억제를 통하여 인산화 상태로 유지될 수 있다는 것을 보였다 (Herwig 및 Strauss, 1997). 관능성 pRb 가 결여된 세포는 5-플루오로우라실 및 메토트렉세이트 처리에 뒤따르는 세포파괴 및 고사를 증가시킨다 (Herwig 및 Strauss, 1997). 세포 죽음은 dTMP 와 같은 필수 S-단계 구성성분이 결여된 (TS 억제를 통해), 미성숙하게 S-단계으로 강제 진입하는 (G₁체크포인트 제거) 세포에서 실질적으로 증진된다.

오카다산, 칸타리딘 (Honaken) 및 티리스페릴 23-아세테이트의 예외를 갖는, 화합물의 오카다산 군은 (Matszawa 등) (PP2A 선별적인) 불량한 선별성을 나타낸다. 또한, 세포내 PP1 및 PP2A 의 농도는 상기 억제제의 높은 농도가 임의의 생체외 선별성의 효과 손실을 초래하는 생체내 반응을 생성하도록 요구되는 정도이다 (Wang).

칸타리딘 (exo,exo-2,3-디메틸-7-옥소비시클로[2.2.1]헵탄-2,3-디카르복실산 무수물) 은 중국산 가뢰의 주요 구성성분이다: 밀라브리스 팔레라타 (Mylabris phalerata) 또는 엠. 시코리이 (M. cichorii) (Yang; Cavill 등). 상기 갑충은 지난 2000 년 동안 천연 요법으로서 중국인들에게 사용되어 왔다. 1900 년대 서양 의학이 칸타리딘을 맹독성인 것으로 판단하였음에도 불구하고 (Goldfarb 등), 가축 먹이로의 폭넓은 사용 및 그의 의도된 최음약량 ("칸타리스" 의 활성 성분)은 여전히 수많은 인간 및 가축 중독을 일으키고 있다 (Schmitz).

상기 실험에 대한 Li 및 Casida. 및 이전의 연구 (McCluskey 등) (더욱 최근으로는 pombo-Villar, Sodeoka) 는 칸타리딘 유사체에 의한 PP2A 억제에 중요한 특정 특성 서술에 조력해왔다 (도1). 그러나, PP1 에 대한 해당하는 도면은 그다지 정확하지 않고, 데이터의 대부분은 공지된 결정 구조와의 가능한 상호작용을 참고하고 있으며, 어떤 경우에 있어서는 PP1 에 대한 억제치가 보고되지 않았다.

종양 억제 유전자 p53 의 진화

인간 암에 있어서 가장 보편적으로 돌연변이화된 유전자는 종양 억제 유전자 p53 이고, 이는 50% 이상의 종양에서 비정상적으로 발현된다. 돌연변이 p53 과의 암 세포를 선별 표적하는 화학치료제 개발은 두 가지 주요 이유에 대하여 확실히 바람직하다. 첫째, 비정상 p53 상태인 세포는 통상적인 화학치료법에 고유로 내성이 있고, 콜론 칼시노마 및 비소세포폐암 (non small cell lung cancer) 과 같은 보다 통상적이고, 보다 공격적인 종양을 생성한다. 둘째, 단지 돌연변이 p53 표현형을 갖는 세포만 표적으로 하는 화학치료법 제도는, p53 에 익숙한 정상적인 건강한 세포가 아닌 단지 암 세포만을 없앨 것이므로 잠재적으로 보다 적은 부작용을 만들 것이다.

본 발명의 개시

상기 논의와 관련하여, 본 발명자들은 무수물의 에테르 O 원자를 N 또는 S 로 대체하는 것이 (R = 알킬 또는 아릴인 경우 N-H 및 N-R 로서), 칸타리딘 유사체의 상기 부위의 H-결합 필요조건을 규명하도록 한다는 것을 생각하였다. 이들의 실험에서 이전의 연구들은 7-옥사 위치의 변형에 대하여 한정된 인내성을 보였다. 상기 헤테로 원자를 변형시키는 능력은 상기 간단한 골격에 기재한 선별 억제제의 개발에 중요하다.

현재로서는, 생체내에서 효과적으로 특이적인 억제제이도록 하는 절대적인 특이성 또는 충분히 높은 선별성을 갖는 억제제가 없다.

놀랍게도, 본 발명의 주제인, 무수물 변형 칸타리딘 유사체가, 강력하고, 선별적이고, 산화적으로 안정한 하나 이상의 특성, 및 단백질 포스파타제 1 및 2A 를 가질 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 측면에 있어서, 단백질 포스파타아제 1 및 2A 의 세포 투과성 억제제가 제공되고, 그 억제제는 무수물 변형 칸타리딘 유사체이다.

본 발명의 첫 번째 측면의 특정 구현예에 있어서, 하기 화학식의 화합물이제공된다:

[식 중, R₁및 R₂는 H, 아릴 또는 알킬이고; X 는 O, N 또는 S 이고; Y 는 O, S, SR, NH, NR, CH₂OH, CH₂OR 이고; R 은 알킬 또는 아릴이고; A 및 B 는 H 또는 CH₃이고; W 및 Z 는 CHOH 또는 C=O 이고, R₁및 R₂는 고리화되어, 하기 고리를 형성할 수 있음:

(식 중, R₃및 R₄는 H, 아릴 또는 알킬임)].

아릴기는 적절하게는, 예컨대 페닐 또는 나프틸일 수 있고, 탄소수 6 내지 10 개의 탄소 스페이서를 통해 부착될 수 있다. 알킬기는 적절하게는 C₁-C₁₀일 수 있다.

본 발명의 두 번째 측면에 있어서, 무수물 변형 칸타리딘 유사체의 제조 방법이 제공된다. 그 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

적절한 용매 내에 디엔을 용해시키고, 생성된 용액에 엔을 첨가함.

본 발명의 세 번째 측면에 있어서, 엔과 디엔을 반응시키는 단계를 포함하는, 무수물 변형 칸타리딘 유사체의 제조 방법이 제공된다.

이 방법은 또한 디엔 및 엔의 부가물의 수소첨가 및/또는, 선택적으로는 부가물의 개환을 포함할 수 있다.

통상, 무수물 변형 칸타리딘 유사체의 제조를 위한 반응 조건은 출발 물질 디엔의 방향족 성질에 의존한다. 적절한 반응 조건은 하기 예시되어 있다.

본 발명의 네 번째 측면에 있어서, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게, 본 발명의 첫 번째 측면의 유효량의 무수물 변형 칸타리딘 유사체를, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.

이 방법은 암을 치료하기 위해 하나 이상의 치료법과 결합되어 수행될 수 있다.

본 발명의 다섯 번째 측면에 있어서, 감작 방법이, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게, 본 발명의 첫 번째 측면의 유효량의 무수물 변형 칸타리딘 유사체를, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 암의 치료에 암 세포의 감작 방법을 제공한다.

본 발명의 여섯 번째 측면에 있어서, 하기를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다:

이러한 치료를 필요로 하는 환자에게, 하나 이상의 암 치료법에 환자의 암 세포를 감작하기 위해 유효량의 무수물 변형 칸타리딘 유사체를 투여하고; 하나 이상의 암 치료법을 이용함.

본 발명의 일곱 번째 측면에 있어서, 항암 활성을 위한 화합물을 선별하는방법을 제공한다.

본 발명의 여덟 번째 측면에 있어서, 본 발명의 네 번째 측면에서 사용하기 위한 화합물의 선별 방법이 제공되고, 그 방법은 함암 활성을 의한 선별을 포함하고; 암세포 주기의 G₁또는 G₂체크포인트를 폐지하는 능력을 선별하는 것을 포함한다. 또한, 이 방법은 하나 이상의 암 치료법에 암 세포를 감작시키는 상기 화합물의 능력에 대한 선별을 포함할 수 있다.

상기 언급되는 하나 이상의 암 치료는 시스플라틴, 방사선조사, 탁산 및 대사 길항 물질을 포함하는 치료로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 실시예 및 수반되는 도면에 관하여 이하 기재될 것이다.

본 발명은 특정 형태의 암 치료에 유용한 화합물; 상기 화합물의 제조 방법; 상기 화합물 자체를 이용하는 치료 방법; 다른 치료에 대한 암 세포의 감수성 또한 증가시키는, 상기 화합물을 이용한 치료 방법; 상기 화합물의 항-암 활성 검색 방법; 상기 화합물의 항-암 활성 및/또는 다른 치료에 대해 암 세포를 감작시키는 능력을 검색하는 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 상기 화합물은 단백질 탈인산화제 1 및 2A 의 특이적 저해제이다.

도 1 은 칸타리딘 유사체에 의한 PP2A 에 의한 억제를 위해 생성되는 구조 활성 데이타의 개략적인 표현이다.

도 2: 신규 칸타리딘 유사체

도 3: 칸타리딘 및 신규 칸타리딘 유사체의 세포 독성

도 4: 칸타리딘, MK-2 또는 MK-4 에 노출된지 12 시간 후의 세포 주기 분석

도 5: 6 Gy 의 방사 18 시간 후, 칸타리딘, MK-2 또는 MK-4 에 노출된지 12 시간 후의 세포 주기 분석

도 6 (a-c): 시스플라틴 및 MK-4 와 동시 배합시, 배합 지수 대 영향을 받은 분획 : HCT116 결장 세포

도 7 (a-b): 시스플라틴 및 MK-4 와 동시 배합시, 배합 지수 대 영향을 받은 분획 : HT29 결장 세포

도 8 (a-c): 탁소렌 및 MK-4 와 동시 배합시, 배합 지수 대 영향을 받은 분획 : HCT116 결장 세포

도 9 (a-c): 탁소렌 및 MK-4 와 동시 배합시, 배합 지수 대 영향을 받은 분획 : HT29 결장 세포

발명을 실시하기 위한 최량의 형태 및 기타 형태

상기한 바와 같이, 본 발명에 포함되는 무수 개질 카니바리딘 유사체의 제조를 위한 반응 조건은 일반적으로 출발 디엔의 방향성에 따라 달라진다. 이는, 출발 재료가 푸란 (하기 방법 1); 티오펜 (하기 방법 2); 및 피롤 (하기 방법 3)인 방법의 예의 기재에 의해 예시된다.

방법 1: 출발 디엔으로서 푸란

푸란 (5 당량) 용액을 푸란의 약 5배 부피의 적합한 용매에 용해시킨다 (용매는 예를 들어 에테르 (실온 반응일 경우); 또는 벤젠 또는 자일렌 (후자의 둘은 각각 80℃ 및 130℃의 반응의 경우임)일 수 있음). 상기 용액에 1 당량의 상기 엔을 첨가한다. 이어서, 반응물을 일반적으로 24시간 (실온 반응일 경우 2일) 동안 가열하거나, 또는 실온에서 교반시킨다. 냉각시 (또는 실온에서 정치시), 침전물이 형성되는데, 이를 진공 여과로 수집한다. 이어서 부가물을, 예를 들어 클로로포름 또는 에탄올로부터 재결정화한다. 푸란 + 말레산 무수물 화합물일 경우, 가열을 최소화하기 위하여 주의하여야 하는데, 이는 이들이 단지 출발 재료만을 생성하는 레토-디엘스-알데르 (reto-Diels-Alder) 반응을 야기하기 때문이다.

방법 2: 출발 디엔으로서 티오펜

티오펜 (1.016 g, 0.012 몰) 및 말레산 무수물 (0.558. 0.006 몰)을 2.5 mL의 증류 디클로로메탄 중에서 실온에서 혼합시킨다. 이어서 상기 혼합물을 고압 반응기 내에 둔다. 이를 40℃에서 71시간 동안 17 kbar의 압력으로 압착한 후, 압력을 방출시키고, 생성물을 크로마토그래피로 정제한다.

방법 3: 출발 디엔으로서 피롤

[Os(NH₃)₅OsO₂CF₃)](CF₃SO₃)₂(0.3511 g, 0.4 mmol), 및 활성화 마그네슘 (0.1511 g), 피롤 (0.45 mL, 0.6 mmol), DME (1 mL) 및 DMAc (0.3 mL)을 상기 순서대로 첨가한다. 혼합물을 1시간 동안 교반시키고, 온도를 서서히 40℃로 승온시킨 후 강하시킨다. 갈색 슬러리를 셀라이트의 얇은 패드를 통하여 여과시키고; 케이크를 소량의 DME (2 mL로 4회)로 세척한다. 여과액을 디클로로메탄 15 mL에 첨가한다. 격렬하게 교반하면 황색 침전물이 형성되는데, 이를 진공 여과로 수집하고, 이어서 에테르로 세척한다 (2.5 mL로 2회). 생성물을 질소 스트림 하에서 건조시켜 황색-황갈색 고체를 수득한다 (0.343 g, 84%). 상기 피롤 착체에 아세토니트릴 중 말레이미드 (0.05 g, 0.515 mmol) (또는 다른 "엔", 예를 들어 말레산 무수물, 디메틸 말레에이트 등)를 첨가한다. 혼합물을 실온에서 60분 동안 교반시킨 후, 용매를 진공 제거하여, 엑소 이성질체를 수득한다 (0.359 g, 64%). 이동상으로NaCl을 사용하여 이온 교환 컬럼 (세파덱스(Sephadex)-CM C-25, 2 x 10 cm)으로 조 물질을 정제한다. 포화 소듐 테트라페닐보레이트 용액을 첨가하여 착체를 침전시킨다.

상기 화합물에 의해 치료될 수 있는 암의 유형은 통상의 화학요법에 본질적으로 내성을 가지는 유형의 암을 포함한다. 일반적으로, 이러한 유형의 암은, 더욱 일반적이고 더욱 공격적인 종양 형태, 예를 들어 결장암 및 비 소세포 (non small-cell) 폐암에 의해 대표되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은, 비록 다른 투여 형태가 가능하지만, 정맥내 투여가 적합하다. 약학적으로 허용가능한 희석제, 보조제, 담체 및/또는 부형제가 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있다.

이러한 적합한 약학적으로 허용가능한 물질은 당 업계의 숙련자의 지식 범위 이내의 것이며, 적합한 화합물, 재료 및 조성물을 포함한다.

본 발명의 화합물의 실제 투여 수준은, 투여되는 특정 환자, 조성물 및 형태에 있어서 원하는 응답을 성취하기에 유효한 활성 화합물의 양을 얻을 수 있도록 변화될 수 있다.

투여 수준은 통상의 실시에 따라 의사에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 투여되는 본 발명의 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료할 환자의 연령, 성, 체중, 증상, 종합 건강 및 종래의 의학적 내력, 및 의학 분야에서 잘 알려진 여러 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라진다.

본 발명의 화합물은 또한 다른 처리법에 암세포를 감작하게 할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 대표적으로 조사 및 플라티늄 항암제, 예를 들어 시스플라틴의 처리를 포함한다.

또한, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트 및 항엽산제를 포함하며, 튜불린 및 체세포분열 방추체의 형성을 방해하는 식물 알카로이드 빈블라스틴과 빈크리스틴, 및 탁산(taxane)과 항대사물질을 사용하여 감작을 하게 할 수 있다.

특히, 본 발명의 화합물은 불완전한 p53 활성으로 상기 세포를 감작한다.

본 발명에 의해 계획된 항암 활성을 스크리닝할 때, 각종 암세포주가 선택될 수 있다. 상기는 대표적으로 헤마토포이에트(haematopoietic) 및 각종 p53 상의 충실성 종양 세포주 모두이고, 하기: L1210(쥐 백혈병, p53 야생형), HL60(사람 백혈병, p53 nul), A2780(사람 난소암, p53 야생형), ADDP(시스플라틴 내성 A2780 세포, p53 돌연변이체), SW480(사람 결장암, p53 돌연변이체), WiDr(사람결장암, p53 돌연변이체), HT29(사람 결장암, p53 돌연변이체), HCT116(사람 결장암, p53 야생형) 및 143B(사람 골육종, p53 돌연변이체)를 포함한다.

항암 활성을 스크리닝하는 방법에 덧붙여, 하기 과정이 나머지 스크리닝 방법에 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어 암세포 주기의 G₁및/또는 G₂체크포인트를 제거하는 능력을 스크리닝할 때, 하기가 적절히 사용될 수 있다:

세포 주기법

세포를 70% 에탄올에서 고정하고 분석이 수행될 때까지 -20℃ 에서저장한다(1-2 주). 고정 후, 세포를 펠렛화하고 요오드화 프로피듐(40mg/ml) 및 RNase A (200mg/ml)을 함유하는 PBS에서 적어도 30분 동안 실온에서 배양한다. 표본(2 ×10⁴개)을 Becton Dickson FACScan을 사용하여 분석하고, 형광검출기2(FL2), 필터 575/30nm 밴드 패스에서 형광체를 수집한다. 세포 주기 분포를 Cell Quest 소프트웨어(Becton Dickson)을 사용하여 평가한다.

이어서 G₁또는 G₂체크포인트 중 하나의 제거를 나타내는 상기 단백질 포스파타제 억제제를 방사선 노출 또는 화학요법 약물 배양의 연합 연구로 개발할 것이다. MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]2,5-디페닐-테트라졸륨 브로미드) 분석을 사용하여 상승, 길항 또는 상가 효과가 포함되는지를 측정한다. Median Effect법을 채택하여 선택된 처리의 최적 배합 지수를 수학적으로 측정한다(Chou and Talalay, 1984). 상기 방법을 광범위하게 사용하여 시스플라틴 및 D1694(Ackland et al 1996;1998)을 포함하는 각종 약물 배합의 세포독성을 조사했다. 배합 지수값 1 미만은 상승작용을 나타내고, 1과 동일한 값은 가성성을 나타내고 1보다 큰 값은 길항작용을 나타낸다.

세포독성 분석

암세포를 종래의 화학요법 및 조사에 감작하는 능력을 스크리닝할 때, 하기 방법을 적절하게 사용한다:

서브융합 단계 중 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 옮긴다. L1210 세포를 100 ㎕ 배지에 1000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 다른 모든 세포주를2000-25000 세포/웰의 밀도로 플레이팅한다. 처리 전에 세포를 24시간 동안 두어서 지수 성장을 확보하고, 플레이팅(0 일) 후 24시간 뒤에, 100㎕의 포스파타제 억제제를 각각의 웰에 첨가하고 대조군 웰은 100㎕의 배지만을 갖는다. 약물 노출 시간은 72시간(3 일)이다. 포스파타제 억제의 효과를 1 ×10^-3M - 1 ×10^-8M 범위의 농도에 대해 3배로 시험한다. 성장 억제 효과를 MTT 분석을 사용하여 평가하고 540nm에서 흡수도를 읽는다. IC₅₀은 세포 성장이 약물 노출의 0 일 및 3 일에 광학 밀도의 차이를 기준으로 50% 억제되는 약물 농도이다. 72 시간의 기간 동안 포스파타제 억제제의 각종 농도에 대해 세포의 노출을 수반하는 세포 성장의 백분율을 측정하는 분광광도 분석을 사용하여 세포독성을 평가한다. 후속의 투여량 반응 곡선을 사용하여 IC₅₀값(세포 성장이 50% 억제되는 약물 농도)을 계산한다.

대부분의 약물 발견은 신규한 단일 제제의 개발에 집중되어 왔다. 그러나, 성공적인 조합 화학요법의 견지에서, 장래의 성공적인 항암 치료가 그들의 작용상 상승적 효과를 갖는 제제들의 발견을 토대로 할 것이라는 것이 점차적으로 명백해지고 있다. 이러한 관점에서, 방사선, 시스플라틴, 탁세인, 항대사물질 또는 식물 알칼로이드와 조합된 포스파타제 억제제의 세포독성이 조사되었다. 상기 나타낸 바와 같이, 그 자체로는 세포독성이 없는 칼리쿨린(calyculin)이 방사선 유도 세포사를 향상시킨다. 유사하게, 카페인 또는 UCN-01에 의한 G₂체크포인트의 제거는 또한 p53 변이를 갖는 세포 (CA46 및 HT-29 세포)에서 γ방사선의 세포독성을 향상시킨다 [Powell et al., 1995; Russell et al., 1995; Wang et al., 1996].방사선 조사에 의해 유도된 DNA 상해는 G₁및 G₂세포주기 모두를 정지시킨다. p53 변이 세포에서는, G₁체크포인트가 없다. 그러나, 방사선 조사 후 세포는 여전히 G₂상에서 정지될 것이고 잠재적으로 상해를 복구할 것이다. p53 변이 세포는 일반적으로 통상적인 화학요법에 더 내성이 있고 보다 공격적인 종양을 생성한다. 그러므로, p53 결핍 세포에서, G₁체크포인트에 의해 검출되지 않은 DNA 상해는 G₂체크포인트에 의해 가려내질 것이다. 상기 세포에서 상기 체크포인트 모두가 결핍되어 있다면, 세포는 복구 메카니즘을 개시할 수 없고 더욱 불안정하여 DNA 상해에 의해 세포사가 더욱 유도되기 쉬운것으로 여겨진다.

시스플라틴은 DNA에 결합하여 DNA 가교결합 및 가닥 끊김을 생성하는 통상적으로 사용되는 또 다른 항암 치료이다. 시스플라틴은 고환암, 폐의 소세포 암종, 방광암, 및 자궁암의 치료에 특히 유용하다. 시스플라틴 유도 DNA 상해의 복구는 Gadd45의 p53 활성화에 의해 배위되어진 뉴클레오티드 삭제 복구에 의해 중재된다 (Smith et al., 1994). 이에 관련해서, p53 변이체인 세포는 시스플라틴 치료에 더 민감하다는 것이 제안되어 왔다 (Hawkins et al., 1996). 수 많은 연구자들이 p53 변이 세포주 및 p53 변이 종양에서 상기 제안을 혼합된 결과들과 함께 연구하였다. 시스플라틴이 p53 발달 세포(Hawkins et al., 1996)와 비교하여 (유두종 바이러스에 의해 유도된) p53이 결핍된 세포주에서 더욱 세포독성이 있다는 것이 명백한 반면, 종양 및 시스플라틴 내성 세포는 그들의 게놈내에 여러 개의 불확정한 변이를 가지고 있을 수 있기 때문에 종양 및 시스플라틴 내성 세포에서의 상기 가설을 시험하는 것은 더 어렵고 이는 상기 연구들 (Herod et al., 1996)과 혼동될 것이다. 그럼에도 불구하고, G₂제거인자 UCN-01 (7-히드록시스타우로스포린, 단백질 키나제 억제제)는 p53 기능에 대해 불완전한 MCT-7 세포에서 시스플라틴의 상당히 향상된 세포-치사 활성을 나타내었다 (Wang et al., 1996).

종양의 50%가 변이되거나 결실된 p53 유전자를 갖기 때문에, p53 변이 세포를 선별적으로 표적으로 하는 화학요법제의 개발이 바람직할 수 있다. 많은 상기 p53 결핍 세포 및 종양은 통상적인 화학요법에 대해 본래 내성이 있고 대장암 및 비-소세포 폐암과 같은 통상적인 보다 공격적인 종양 형태를 나타낸다. 티미딜레이트 합성효소 (TS) 억제제는 통상적으로 사용되는 항암제의 또 다른 분류이다. TS는 공-기질 N₅,N₁₀-메틸렌 테트라히드로폴레이트 (CH₂-THF)를 메틸 공여체로 이용하는 메틸화에 의해 dUMP를 dTMP로 전환시키는 DNA 합성 경로에 있어서 중요한 단계를 촉매한다. 상기 단계는 dTMP의 유일한 신규 공급원으로, 이는 이어서 합성 및 복구중에 DNA로 도입되기 위해 주로 dTTP로 대사된다 (Jackman & Calvert, 1995). 따라서, TS는 세포 주기의 S-상중에 주요 조절 효소이다. dTTP의 부족은 DNA 상해 및 결국에는 세포사를 나타내지만, 세포사가 발생하는 과정(들)은 명료하지 않다. 플루오로우라실, 랄티프렉시드 및 LY231514와 같은 TS 억제제들은 항암 치료에 있어서 중추적인 역할을 하고, 흔히 많은 암의 맨 처음 치료이다 (Peter & Ackland, 1996). 본 발명자들은 TS 억제제인 티미택 (Thymitaq; Zarix,Ltd.)을 칸타리딘 유사체들과 조합하여 사용한다는 것을 제안하였다. 티미택은 세포내로의 능동 수송을 필요로 하지 않고 그의 작용을 위한 세포내 활성화도 필요로 하지 않는 직접적이고 특이적인 TS 억제제이다.

하기 실시예는 상기 나타낸 바와 같은 본 발명의 범위를 한정하지 않는 것으로 해석되어야 한다.

실시예 1

화학적 성질

무수물 변성 칸타리딘 유사체를 반응식 1 및 2 에 나타낸 바와 같은 다양하게 변형된 문헌에 따른 방법으로 합성한다. 상기의 변형은 상기한 바와 같은 출발 디엔의 방향성에 따라 세 가지 방법으로 구현된다. 고압하에 17 kbar, 40 ℃ 에서 61 시간 동안 제조한 디메틸에스테르 (3) 는 반응식 3 에 나타낸 바와 같다.

[반응식 1. a. 푸란:말레산 무수물 (5:1), 디에틸에테르, 2d, RT, 96 %; b.H₂/10% Pd-C/EtOH; c. p-TosOH, MeOH, 크로마토그래피; d. H₂/10% Pd-C/아세톤; e. NaBH₄, 이어서 HCl].

[반응식 2. 시약 및 조건 : f. 푸란:말레이미드 (5:1), 디에틸에테르, 7d, 암실, 75%, 엑소 생성물; g. 푸란:말레이미드(5:1), 디에틸에테르, 밀봉 튜브, 12 h, 90 ℃, 66%, 엔도 생성물].

[반응식 3. 시약 및 조건 : h. 푸란:디메틸말레에이트 (2:1), CH₂Cl₂, 17 Kbar, 40 ℃, 61 h, 56 %].

실시예 2

댄백질 포스파타아제 1 및 2A 의 유효한 선택성의, 산화 안정성의 세포 침투성 저해제의 개발

조 천연 생성 추출물은 이소파리누린을 산출하고, 일련의 칸타리딘 유도체가 합성되었다. 본원에 있어서, 본 발명자들은 PP1 에 대해 선택성을 나타내는 첫번째 작은 분자를 나타내는 PPI 선택성인 단순 칸타리딘 유사체를 개발하였다 (IC₅₀= 50mM, 10000 mM 이상의 농도에서 PP2A 에 0 % 저해성을 갖는다). 그 결과는, 칸타리딘 골격의 일련의 단순 합성 변형 역시 PP2A 선택성 화합물의 합성을 가능하게 한다는 것을 나타낸다 (도 1 참조).

본 발명자들은 이미 PP2A 의 저해에 있어서 무수물의 용이한 개환이 결정적이라는 것을 설명하였다. 이는 c 로는 가능하지 않다 (7-O 의 선행 연구, 상기 유사체는 말레이미드 연결쇄의 상당한 가수분해 안정성을 나타낸다). 엔도탈 티오 무수물이 칸타리딘보다 세 배 강력하다는 것은 흥미로우며, S 원자는 중요한 인자이다. 따라서, 7-S 기는 자체로서 활성 부위 금속에 활성이며, 말레이미드의 N-H 는 7-O 치환체 칸타리딘이 차지하는 수소 결합 동공을 차지한다고 추측된다.

칸타리딘 및 선택성 유사체의 구조

(a) 칸타리딘의 구조를 나타낸다;

(b) PP1 선택성 유사체를 나타낸다;

(c) PP2A 선택성 유사체를 나타낸다. 패널 (c) IC₅₀의 경우 ∼25 mM.

상기의 결과 및 본 실험실의 선행 경험에 기초하여 (PP1 및 PP2A 의 칸타리딘 저해제의 합성 및 분자 모델링), 더욱 활성이고 선택성이며, 안정성의 바람직한 특성 및 세포 침투성을 보유한, 일련의 유사체를 설계하였다.

이들 유사체의 함성 경로를 반응식 1 내지 3 에 나타내었다. 각각의 반응식은 기본 골격의 변형을 허용하며, 일부 경우에서, 더욱 복잡한 천연 독소(들) (예를 들어 오카다산 (okadaic acid), 칼리큘린, 마이크로시스틴 등) 에 존재하는 이로운 양태의 혼입을 허용한다. 이러한 양태의 혼입은 개선된 선택성 및 효능을 제공하기 위해 설계되었다.

실시예 3

칸타리딘의 PP1 및 PP2A 유사체 시리즈의 합성 발달

(i) 딜스-엘더(Diels-Alder) 첨가 (말레산 무수물) 및 X 의 후속 조작; (ii) 딜스-엘더 첨가 (치환된 말레산 무수물), Z 의 도입 및 조작 (Z = 소수성 말단; 예를 들어 장쇄 니트릴: 참조 Calyculin A, 스피로 아세탈에서 장쇄 종결화: 참조 Tautomycin, 오까다산(Okadaic acid); 방향족 고리에서 장쇄 종결화: 참조 Adda in Microcystin-LR; (iii) 새롭게 방출된 작용기를 추가로 조작시키는 무수물의 입체특이성 고리 개방화(참조. 도 2).

상기 예에서 실험실에서 상기 유사체를 손쉽게 조립하는 합성 프로토콜을 개발하였다. 최고 활성 분자의 생물학적 평가 및 분자 모델화는 분자를 평가한다.

기본 구조에 대한 부가 변형물을 하기 예시한 바대로 수득할 수 있다.

실시예 4

일종의 칸타리딘 유사체의 특정 예는 단백질 포스파타제 1 및 2A 의 선택적 억제제로서 전망을 나타낸다.

실시예 5

7-아자비시클로[2.2.1]헵탄에 대한 입체특이성 경로

전초 질소의 도입이 유사한 유사체의 효능, 선택성 및 안정성을 향상시킨다는 것을 발견하였고, 상기 경로는 추가로 상기 유사체의 생활성을 향상시키는 것으로 개발되었다. 여기에서 언급된 합성 경로는 목표 분자를 신속하게 조립시킨다.

안정하고 특징적이며 효능이 있고 막투과성인 단백질 포스파타제 억제제의필요조건을 충족시키는 상기 제제는 이의 항암 활성으로 인해 가려진다.

실시예 6

생화학

모든 합성 화합물을 단백질 포스파타제 1 및 2A 를 억제시키는 이의 활성에 대해 시험한다. 초기 조사를 100 mM 에서 실행시킨다. 그 다음 유망한 유사체를 IC₅₀값의 평가용 3 중 분석한다.

37 ℃ 에서 50 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 5mM 카페인, 0.1 % 2-메르캅토에탄올 및 1 mg/㎖ 소 혈청 알부민에서 30 mg [³²P]-포스포릴라제를 기질로서 이용하여 측정되는 코헨(Cohen) 단백질 포스파타제 활성에 의해 기재된 대로 본래 닭 골격근으로부터 단백질 포스파타제 1 및 2A 를 부분 정제시킨다. 전체 분석 부피는 30 ㎖ 이다. 분석 조건은 20 % 데포스포릴화로 제한시켜 선형성을 확인시키고 단백질 포스파타제 활성의 억제는 칸타리딘 또는 이의 유사체를 반응 완충액내 필요한 농도로 포함함으로써 측정된다. 차가운 20 % 트리클로로아세트산의 첨가로 반응을 종결시킨다. 침전된 단백질을 액체 불꽃 계산으로 측정된 상청액에서 원심분리 및 방사성으로 펠렛화시킨다. 데이타를 대조군(경쟁 화합물의 부재) 부화에 대해 억제 % 로서 표현한다.

실시예 7

항암 활성에 대한 각종 PP1 및 PP2A 억제제의 스크리닝

(a) 단백질 포스파타제 억제의 세포 파괴

상기 기재된 필요 조건을 달성하는 PP1 및 PP2A 억제제를 각종 암세포 라인에서 시험한다. 연구용으로 선택된 세포 라인은 각종 p53 지위를 갖는 헤마토형성(haematopoietic) 및 고체 종양 세포 라인을 포함하였고 하기를 포함한다:

L1210 (쥐의 백혈병, p53 야생형),

HL60 (인간의 백혈병, p53 nul)

A270 (인간의 난소암, p53 야생형),

ADDP (항시스플래틴 A2780 세포, p53 돌연변이),

SW480 (인간의 결장암, p53 돌연변이),

WiDr (인간의 결장암, p53 돌연변이),

HT29 (인간의 결장암, P53 돌연변이),

HCT16 (인간의 결장암, p53 야생형),

143B (인간의 골육종, p53 돌연변이)

단백질 포스페이타제 억제제의 항암 차단은 MTT 시료를 사용하여 평가된다. 이 시료는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드로부터 포르마잔 결정체를 생성하기 위해 미토콘드리아성 탈히드로게나제의 능력에 의해 세포 생존능력을 결정한다. 생존가능 세포의 수/웰(well)은 포르마잔의 생성에 대한 직접적인 비인데, 포르마잔의 하기 용해도는 분광분석(540 nm)으로 측정될 수 있다. 이러한 기술은 새로운 항암제를 위한 차단에 대해 National Cancer Institute 에 의해 사용된다.

여기에서 기재된 바와 같이, 수많은 칸타리딘 유사물은 합성되어 72시간의노출후에 MTT 시료를 사용하여 9개의 암세포 라인에서 항암 활성에 대해 테스트되었다. 이들 새로운 유사물은 도2에 나타나 있고 MK-1 에서 MK-9 로 나타내었다. 이들 칸타리딘 유사물의 세포독성(IC₅₀)은 표1 에 및 도3 에 나타나 있다. 요약하여, MK-1 유사물은 테스트된 세포 라인 중 어떤 것에서 어떤 상당한 세포독성(IC₅₀> 1000 μM)도 나타내지 않는다. 시험된 모든 세포 라인에 대한 한계 세포독성은 MK-3 (IC₅₀247 내지 > 1000 μM), MK-7 (IC₅₀180 -367 μM) 및 MK-8 (IC₅₀173 - 385 μM)에 대해 관찰된다. 큰 세포독성은 MK-2 (IC₅₀157 - 248 μM) 및 MK-9 (IC₅₀107 - 233 μM) 에 대해 관찰되는데, 이들은 9개의 세포 라인에 대해서도 일치한다. 가장 큰 세포독성은 MK-4 및 MK-5 유사물에 대해서 관찰되지만, 이의 크기는 세포 라인에 의존적이다. 본 명세서에서, MK-4 및 MK-5 는 백혈병 (IC₅₀393-680 μM; 323 > 1000 μM), 난소암 (IC₅₀275-333 μM; 260-567 μM) 및 골육종 (IC₅₀450 μM; > 1000 μM) 와 비교하여 인간의 결정암 세포 라인 (IC₅₀14-88 μM; 28-247 μM) 에서 선택적으로 더욱 독성을 나타낸다.

(b) 세포 사이클 체크포인트의 제거:

세포 사이클의 G₁또는 G₂체크포인트를 제거하기 위한 단백질 포스페이타제 억제제의 능력은 유동 혈구계산을 사용하여 세포 사이클 분석으로 측정될 수 있다. 간단하게, 비동시성 세포 배양은 6Gy 조사 18시간 후 및/또는 단백질 포스페타제 억제제로 12시간 배양 후에 수확된다. 세포 라인의 p53 상태에 따라, 조사 처리는 단독으로 세포 사이클의 G₁및/또는 G₂상에서 억류를 야기할 것이다.

표 2 및 도 4 에 나타내어진 데이타는 칸타리딘 및 새로운 칸타리딘 아날로그 MK-2 및 MK-4 에 대한 12 시간 노출 후의 L1210, HL60, HT29 및 HCL116 세포의 세포주기응답을 나타낸다. 정리해 보면, 시험된 모든 4 개의 세포계에서 칸타리딘 및 MK-2 는 유사한 응답을 나타내고, G₂저지를 유도한다. 또한, MK-4 는 L-1210 HL60 및 HCL116 세포에서만 G₂저지를 유도한다. HT29 세포 내에서 MK-2 는 G₁세포주기 저지를 유도한다. 이러한 약제에 의해 유도된 세포주기 저지의 크기는 각각의 세포계에서 이들의 세포독성과 직접 연관된다. 모화합물(parent compound) 칸타리딘은 세포성장을 저해하기 위한 능력을 나타낸다(IC₅₀6.1-18 μM). 칸타리딘의 세포독성은 그의 아날로그보다 크게 나타났다. 흥미롭게도, 칸타리딘 또한 결장 암세포에 대해 약간의 선택성을 나타내었다.

만약 단백질 포스파타제 저해제가 G₂첵크포린트를 제거하지 않는다면, 세포는 세포주기의 G₂상(phase)에서 저지되지 않을 것이며, 세포는 세포주기를 통해 연속될 것이며, 단지 세포주기의 G₁상에 축적될 것이다. 유사하게, 만약 단백질 포스파타제 저해제가 G₁첵크포린트를 중지시키지 않는다면, 세포는 세포주기의 G₁상에서 저지되지 않을 것이며, 단지 세포주기의 G₂상에 축적될 것이다. DNA를 표식하는 프로피듐 이오다이드를 사용하는 세포주기 분석은 S-상 세포주기 저지 및 고사형(apoptotic) 세포사멸을 유도하는 특별 항암제의 효과를 분석하기 위해, 본 발명자의 실험실에서 널리 사용되고 있다. 실험은 Becton Dickinson FACScan에서 Cell Quest 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

표 3 및 도 5 에 나타내어진 데이타는 L1210, HL60, HT29 및 HCT16 세포의 세포주기응답을 나타낸다. 상기 세포는 6Gy 방사선으로 처리한 다음, 6 시간 후 칸타리딘으로 처리하였다. 세포주기 저지를 제거하는 능력은 약제를 첨가하고 12 시간 후에 분석하였다. 칸타리딘 및 MK-2 는 모두 모든 세포계에서, G₁저지가 유도된 방사선을 제거시켰다. 또한 MK-4 는 L1210, Hl60 및 HCT116 세포에서 G₁저지를 제거시켰다. HT29 세포에서, MK-4 는 G₂첵크포인트의 제거를 유도하였다. MTT 분석에 의해 결정된 것처럼, MK-4 에 대한 HT29 세포의 노출이 가장 큰 세포독성(IC₅₀14 μM) 을 유도한다는 것을 기억하는 것이 중요하다. G₂첵크포인트를 제거하는 능력이 G₁첵크포인트를 제거하는 능력보다 탁월하게 나타났는데, 이는 놀라운 것이 아니다.

(c) 배합 연구 :

상기 나열한 세포 라인을 다양한 약물 배합비로 시스플라틴 및 포스파타제 억제제에 72 시간 동안 연속적으로 노출시킨 후, 세포 파괴에 대해 분석한다. 유사하게, 이들 세포를 8 Gy 의 복사선에 노출시키고, 포스파타제 억제제로 배양한 후, 72 시간째에 세포 파괴에 대해 분석한다.

도 6∼9 에 나타낸 데이터는 HT29 및 HCT116 사람 콜론 세포에 Median Effect Method 를 사용한 배합 연구의 결과를 보여준다. 상기 방법은 배합율을 계산할 수 있는 다양한 약물 배합의 세포 파괴를 시험한다. 1 이상의 값은 적대적임을 나타내고, 1 의 값은 부가적임을 나타내는 반면, 1 이하의 값은 상승적임을 나타낸다. HT29 및 HCT116 세포 라인은 이들이 다른 p53 지위를 가지며, 칸타리딘 및 이의 유사체에 최대로 응답하는 종양 유형을 나타내기 때문에 선택되었다.

상기 데이터는 HCT116 및 HT29 세포 모두에서 시스플라틴 및 MK-4 의 동시 배합이 1:1, 10:1 및 1:10 의 약물 몰비를 사용할 때 상승적이지 않으며, 부가적임을 보여준다. 부가적인 응답은 약물이 2 개의 별도의 생화학적 경로를 통해 이들의 효과를 조정하고 있음을 나타냈다. HT29 세포에서 탁소테르와 MK-4 의 동시 배합은 또한 1:10, 1:100, 1:1000 의 약물 몰비 (탁소테르 : MK-4) 를 사용할 때 부가적이었다. 그러나, 상기 탁소테르와 MK-4 의 약물 배합은 HCT116 세포에서 상승적인 응답을 유도하였다. 상승적인 응답은 2 개의 약물이 전체 세포 파괴 응답을 향상시키며 각각의 단일 시약의 "부가적 이상" 응답을 유도하는 방식으로 상호 작용하였다. 결과적으로, MK-4 의 독성 이하 수준의 첨가는 명백히 탁소테르의 세포 파괴를 향상시켰다.

실시예 8

결과 및 토론

문헌의 방법 (Eggelte 등 ; 1973) 에 따라서 무수물 및 단순 유사체를 합성한 후, PP1 및 PP2A 생분석하여 (생화학 참조) 이들의 효소 억제 능력을 측정하였다. 몇가지 경우의 IC₅₀값과 함께, 100 mMs 에서 초기 스크린의 결과를 표 4 에 나타낸다.

무수물 변성 칸타리딘 유사체에 의한 단백질 포스파타제 1 및 2A 의 억제
화합물	PP1 의 억제(%)	PP2A 의 억제(%)	선택도PP2A/PP1
	90IC502.4 μM	97IC502.1 μM	0.875
	ND	95
	46IC5050 μM	6IC50> 10,000 μM	> 200
	13	11
	15	8
	9	11
	ND	21
	ND	15
	ND	4

표 4 에 나열한 화합물 중에서, 오직 화합물 1 및 2 만이 각각 97 % 및 95 % 에서 PP2A 의 임의의 상당한 억제를 나타낸다 (두 효소에 대해 명백한 약간의 선택도와 함께). 흥미롭게는, 화합물 1 의 무수 산소 원자의 생이소세테릭 치환은 억제의 완전 감소를 가져온다. 심지어, 고리형 무수물의 비변성이 허용되며, 결국 PP2A 의 억제는 없다.

앞서서, 본 출원인은 유사체 2 가 분석 조건하에서 디카르복실산으로의 빠른 전환을 일으킴을 입증하였다. 이로써, 본 출원인은 비활성 유사체의 안정성을 평가하였으며 (표 4), 이들이 비분해를 나타내는 분석 조건하에서 안정함을 발견하였다. 실제로, 화합물 5 는 물중에서 디엘스-알더 (Diels-Alder) 반응을 통해 합성할 수 있다 (Eggelte 등 ; 1973).

모든 경우에서, 해당 디카르복시산 유도체는 PP2A에서 낮은 억제치를 나타낸다 (표 5 및 6). 디카르복시산에 비해 무수물이 빠른 개환을 나타내지만, 활성 부위에 존재하는 기본 구조가 억제의 전체적 수준 결정에 또한 중요하다. 결국, 무수물 카보닐기 구조 (활성 부위에 오로지 하나의 구조만이 존재)가, 디카르복시산의 구조 (4 가지의 최소 에너지 형태, 결과는 미포함)보다 억제에 보다 바람직한것으로 생각한다.

Tyr272 에서 친핵성 공격을 통한 무수물 개환의 가능성을 시험하기 위해, 페놀의 클로로포름 용액에 2를 방치한, 일련의 모델 실험을 실시하였더. 혼합물은 주기적으로¹H NMR 스펙트로스코피로 검증하고, 시간에 걸쳐 새로운 종류가 형성됨을 나타내었다 (약 10 일). 결국, 생리조건하에서의 금속 보조 또는 친핵 공격이, 활성부위 내에서 바람직한 구조로 유지된 무수물의 개환을 돕는 가능한 방식임을 나타낸다. 결국, 결과의 디산은 보다 바람직한 방식으로 재빨리 결합한다.

여기에 나타난 결과는, 칸타리딘 유도체가 무수물 개환을 거쳐 PP2A의 보다 고역가의 억제제임을 나타낸다. 개환 촉진을 방지하도록 무수물기가 개질된 유도체는 (달리 언급되지 않는한) PP2A에 대해 매우 미약한 억제제이다 (표 5 및 6).

그러나, 여기에서 가장 흥미로운 결과는 (표 4) 디메틸에테르 (3)에 의한PP1의 선택적 억제이다. 2의 간단한 디에스테르화는 PP2A에 대한 노르칸타리딘의 앞서 보고된 PP2A 선택도 (약 10 배)를 완전히 바꾸어 놓았으며, 이는 PP1 또는 PP2A의 억제를 위한 선택적인 작은 합성 분자를 초래한다. 이는 다시금, 활성부위에 디산 기를 도입하는 것이 PP2A 억제에 결정적임을 나타낸다. PP1에 대해서는,제한된 구조 활성 결과로 그러한 제한이 명백하지 않다.

3과 같은 합성 억제제는, 현재 널리 사용되는 PP1 또는 PP2A의 억제제에 대해 현저한 발전을 나타낸다.

결론적으로, 본 발명은, 무수물기의 재빠른 개환이 PP2A의 억제와 관련됨을 나타낸다. 또한, 디카르복시산 기의 변형인 PP1 선택적인 화합물을 유도한다.

이상은 본 발명의 몇몇 구현예를 나타낸다. 당업자에게 명백한 변형이 가능하며, 이는 본 발명의 범주를 벗어나지 않는다.

본 발명은, 광 응용, 특리 의학 및 수의학 분야에서 유용하다.

문헌

Claims (29)

1. 저해제가 무수물 변형 칸타리딘 유사체인, 단백질 포스파타제의 세포 침투성 저해제.
2. 제 1 항에 있어서, 포스파타제가 포스파타제 1 및/또는 포스파타제 2A 인 저해제.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 무수물 변형 칸타리딘 유사체가 산화에 안정한 저해제.
4. 하기 식의 화합물:

   [식중 R₁및 R₂는 H, 아릴 또는 알킬이고; X 는 O, N 또는 S 이며; Y 는 O, S, SR, NH, NR, CH₂OH, CH₂OR 이며; R 은 알킬 또는 아릴이고; A 및 B 는 H 또는 CH₃이며; W 및 Z 은 CHOH 또는 C=O 이고, R₁및 R₂는 고리화하여 하기와 같은 고리를 형성할 수 있다:

   (식중 R₃및 R₄는 H, 아릴 또는 알킬이다)].
5. 제 3 항에 있어서, 아릴기가 페닐 또는 나프틸이며 아릴기는 탄소수 6 내지 10 의 탄소 스페이서를 통해 부착되어 있는 화합물.
6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 알킬기가 C₁-C₁₀인 화합물.
7. 디엔을 엔과 반응시키는 단계를 포함하는, 암치료에 사용을 위한, 또는 하나 이상의 암 치료로의 암 세포의 감작을 위한 무수물 변형 칸타리딘 유사체의 제조 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 디엔 및 엔 부가물의 수소화를 더 포함하는 방법.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 디엔 및 엔 부가물의 개환을 더 포함하는 방법.
10. 적당한 용매내에 디엔을 용해시키고 생성된 용액에 엔을 가하는 단계를 포함하는 무수물 변형 칸타리딘 유사체의 제조 방법.
11. 적당한 용매내에 푸란을 용해시키고 생성된 용액에 엔을 가하며;

    침전물이 형성되기에 충분한 시간 및 온도에서 용액을 배양하며;

    침전물을 수집하고 유사체를 재결정화하는 단계를 포함하는 무수물 변형 칸타리딘 유사체의 제조 방법.
12. 적당한 용매내의 실온에서 티오펜 및 말레산 무수물을 혼합하고;

    반응이 일어나기 쉽도록 하는 압력 및 온도에서 혼합물을 압축하고;

    유사체를 정제하는 단계를 포함하는 무수물 변형 칸타리딘 유사체의 제조 방법.
13. 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께, 유효량의 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 따른 저해제 또는 제 4 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 따른 화합물을 암 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 암이 통상의 화학 요법에 대해 본질적으로 내성을 갖는 방법.
15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 암이 결장암 또는 비소세포(non small cell) 폐암인 방법.
16. 제 13 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 있어서, 저해제 또는 화합물을 정맥내 투여하는 것을 포함하는 방법.
17. 암세포의 감작방법으로서, 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 따른 유효량의 억제제 또는 제 4 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 유효량의 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 하나 이상의 암치료 방법들로의 암세포의 감작 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 하나 이상의 암치료 방법들이 방사선 조사 및 항암제를 포함하는 치료방법으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 세포가 결핍 p53 활성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 항암치료를 필요로 하는 환자에게 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항의 유효량의 무수물 변형 칸타리딘 유사체 또는 제 4 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 따른 유효량의 화합물을 투여하여 환자의 세포를 하나 이상의 암치료로 감작시키고, 그리고

    하나 이상의 암치료를 이용하는 것을 포함하는 암세포 감작 방법.
21. 항암 활성을 스크리닝하고, 그리고

    암세포 주기의 G₁또는 G₂체크 포인트를 제거(abrogate)할 수 있는 능력을 스크리닝하는 것을 포함하는, 암세포를 하나 이상의 암치료 방법으로 감작시킬 때 사용하기 위한 화합물의 스크리닝 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 암세포를 하나 이상의 암치료로 감작시킬 수 있는 화합물의 능력을 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 하나 이상의 암치료가 시스플라틴, 방사선조사, 탁산(taxanes) 및 항대사약물을 포함하는 치료로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 21 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서, 스크리닝이 다양한 p53활성을 가지고 있는 조혈세포 또는 고체 종양 세포상에서 수행되는 것을 특징으로 하는방법.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 세포가 L1210(쥐 백혈병, p53 야생형), HL60(사람 백혈병, p53 nul), A2780(사람 난소암, p53 야생형), ADDP(시스플라틴 내성 A2780세포, p53 돌연변이체), SW480(사람 결장암, p53 돌연변이체), WiDr(사람 결장암, p53 돌연변이체), HT29(사람 결장암, p53 돌연변이체), HCT116(사람 결장암, p53 돌연변이체) 및 143B(사람 골육종 p53 돌연변이체)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 하기 (a) 내지 (k) 화합물을 함유하는 군에서 선택되는 화합물:
27. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 억제제, 또는 제 3 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 화합물의 암치료 약제의 제조를 위한 용도.
28. 제 27 항에 있어서, 암이 결장암 또는 비소세포(non-small cell) 폐암인 것을 특징으로 하는 용도.
29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 약제가 정맥내로 투여되는 특징으로 하는 용도.