KR20120041816A

KR20120041816A - 신규한 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물

Info

Publication number: KR20120041816A
Application number: KR1020100083258A
Authority: KR
Inventors: 권병목; 한동초; 한영민; 신대섭; 이유진
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-08-27
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2012-05-03
Also published as: KR101690665B1

Abstract

본 발명은 신규한 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 활성산소 및 세포사멸을 유도하여 암세포주의 성장을 억제하는 항암활성을 가진 신규한 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물{Novel 2-hydroxy curcuminoid derivatives, a method for preparing the same and pharmaceutical compositions for anticancer property comprising the same}

활성산소는 세포 내부의 작은 기관인 미토콘드리아에서 주로 생긴다. 이는 체내에서 쓰이는 보통 산소보다 불안정해서 반응성이 증가된 여러 종류의 산소를 통칭한다. 보통 산소는 안정된 분자상태이고 활성산소는 여기에 전자들이 더 붙은 상태이다.

몸에서 활성산소가 생기는 것은 필연적 현상이다. 단 이것이 체내에 과잉 생성될 때 치명적인 독으로 작용하지만 적당량은 생명 유지에 반드시 필요하다. 이와 같이 활성 산소는 몸속에서 양날의 칼과 같은 존재이다.

현대인의 질환 중 90%가 활성산소와 관련이 있다고 알려져 있다. 산소가 우리 몸 곳곳으로 전달되듯 활성산소도 우리 몸 어느 기관에서든지 생길 수 있다. 활성산소는 세포를 손상시키고 재생을 막기 때문에 특히 심혈관질환?치매?관절염?백내장 등 퇴행성 질환과 관련이 깊다. 그래서 활성산소는 만병의 근원이자 노화를 촉진시키는 주범이다.

몸속에 세균이나 바이러스가 침입해오면 백혈구가 공격을 시작하는데 이때 활성산소를 만들어 공격한다. 활성산소는 침입한 세균이나 이물질을 녹이는데 필수적인 방어기제로 작용하고, 다른 세포들에게 이러한 상황을 알려서 우리 몸이 방어체제로 변하게 된다. 항암제가 투입될 때 활성산소가 많이 생성시켜서 암세포를 공격하게 하는데 이처럼 활성산소는 면역 기능에 반드시 필요하다. 그런데 이런 활성산소가 지나치게 많아지면 정상 조직까지 공격하여 각종 질환이 발생하게 되는 것이다.

신체를 구성하고 있는 세포들의 분열 증식과 분화는 생명 현상의 유지에 기본이다. 정상적인 기능을 이루기 위한 세포의 증식 및 성장은 정교한 세포 내 신호전달 체계에 의해서 조절되며, 이 일련의 과정은 세포가 외부로부터 받은 신호를 여러 단백질들(PLC, PKC, Shc, Grb2, Raf, MAPK, MEK등)과 분자 매개체들(GTP, cAMP 등)을 통해 핵 내의 세포 시계로 전달시킴으로써 이루어진다. 이러한 일련의 과정 중에서 어느 한 부분에 이상이 발생하게 되면 자체적인 조절 기작에 의해서 균형을 유지하기도 하지만, 많은 경우에는 질병으로 발전하게 된다.

세포의 성장에 관여하는 유전자들 중에서 암세포에서 특이적으로 활성화 되어 있거나 불활성화 되어 있는 유전자들을 표적으로 항암제가 개발되었고 많은 다국적 제약 기업이 이러한 표적을 대상으로 항암제를 개발하고 있다. 그러나 암 세포는 살아남기 위한 노력으로 특이 표적을 조절하는 물질에 대한 내성을 유발하는 능력을 가지고 있어서 이들 약물의 효능을 무력화 한다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 대두되고 있는 항암제 개발 전략 중에서 주목을 받는 분야가 암 세포의 특이적 생화학적 기능을 표적으로 하는 것이다 (Frantz, S. Drug approval triggers debate on future direction for cancer treatments. Nature Rev. Drug Discov. 5, 91, 2006). 대표적인 예가 암 세포의 빠른 대사 과정과 이로 인한 암 세포에서의 높은 농도의 활성 산소이다. 앞에서 언급하였듯이 적은 양의 활성 산소는 세포의 성장 및 분화 등에 필요하지만 과도한 양의 활성 산소는 세포내의 핵산, 지질 등에 산화를 유도하여 세포를 죽음으로 몰고 간다. 그러므로 활성 산소의 항상성 유지는 세포의 성장과 생존에 매우 중요하다. 이러한 활성산소의 세포내 항상성 유지를 위하여 다양한 항산화 물질들이 존재 한다 (superoxide dismutases, glutathione peroxidase, peroxiredoxins, glutaredoxin, thioredoxin, catalase 등).

많은 연구자들에 의하여 암 세포는 정상세포보다 많은 양의 활성 산소를 가지고 있음이 증명 되었다 (Szatrowski, T. P. & Nathan, C. F. Production of large amounts of hydrogen peroxide by human tumor cells. Cancer Res. 51, 794, 1991). 외부에서 활성산소의 양을 증대 시킬 수 있는 물질을 암세포에 투여 한다면 암 세포의 활성산소의 양이 증대되어 암세포의 심각한 영향을 줄 수 있을 것이다. 그러므로 암 세포의 활성 산소 양을 증대 시키는 약물은 선택적으로 암세포의 사멸을 유도 할 수 있을 것이다 (Nature Review Drug Discovery 8, 579, 2009).

세포주기는 일상적으로 우리가 사용하고 있는 시계가 초침, 분침, 시침으로 구분되듯이 4개의 독특한 단계로 나뉘어 진다. 즉, Gap1(G1기), DNA 합성단계(S기, Synthetic phase), Gap2(G2기), 분열기(M기, Mitosis phase) 등이 바로 그것이다. 또한, 세포가 높은 밀도로 존재하거나, 낮은 농도의 성장 인자의 환경에서 장기간 방치되면, 세포는 휴면기라고 불리는 성장 멈춤(Go기) 상태로 접어든다. 이러한 일련의 핵 내 반응을 세포주기라 한다.

시계 내에는 전기적 또는 물리적 힘에 의해서 시계추가 진동하고 이에 따라서 초침, 분침, 시침이 순차적으로 움직임으로써 우리에게 정확한 시각을 알려 주게 된다. 이를 위해서는 시계추에 일정한 힘이 가해져야 하며 이를 조절하는 각종 부속품들이 시계를 구성하고 있다. 이와 마찬가지로 세포주기에도 체크포인트(checkpoint)라고 불리는 복잡한 네트워크가 있어서 세포시계가 정확히 G1-S-G2-M기의 순서로 진행되도록 유도해 준다. 체크포인트에서 세포주기의 다음 단계로 넘어가기 위한 조건이 충족되었는지를 확인한 후, 모든 조건이 만족되면 S기 또는 M기가 진행된다. 이런 체크포인트 조절 메커니즘의 결핍은 유전물질의 불안정성을 증가시켜 조절 불가능한 세포 성장을 가져오며, 때로는 암과 같은 무절제한 세포성장을 일으키기도 한다.

핵 외부로부터의 신호 전달과 영양 상태가 양호하면 G1기의 세포 크기가 커지고, 세포주기로 진입하게끔 해준다. 세포주기 작동은 효모에서는 START, 포유세포에서는 제한점(restriction point)이라고 불리는 G1 체크포인트에서 이루어진다. 이 지점을 지난 후 특별한 제동이 없으면 세포는 자동적으로 4단계의 세포주기를 거쳐서 자신의 게놈을 복제하고 분열하게 된다. 포유세포에서의 이들 단계를 자세히 살펴보면 다음과 같다. 체크포인트가 존재하는 G1기는 새로운 세포를 만들기 위한 준비 단계로서 이 때에 성장인자와 충분한 영양이 공급되지 못하면 세포주기는 멈추게 되고, 성장 멈춤기인 Go 상태로 접어들게 된다. 그러나 충분한 영양이 공급되고 다양한 성장 인자들이 준비되면 세포주기는 S기로 진행되게 된다. 이때에 세포는 자신의 게놈을 복제하여 두개의 복제 염색체를 만들 뿐만 아니라, 두 세포로 분열되기 위해 세포질 내의 여러 인자들이 복제되어 진다. S기가 끝나면 세포는 제2의 체크포인트로 알려진 G2 단계로 진입한다. 이 G2 기간 동안의 주요 메커니즘은 DNA 복제와 완성을 조절하며 분열기로의 진입을 준비한다. 그러므로 세포의 구성에 필요한 다양한 인자들이 이때에 생산된다. 두 세포로 분열되는데 필요한 인자들이 충분히 만들어진 후에 세포의 실질적 분열이 일어나는 분열기인 M기로 진행되며, M기는 시간적으로 가장 짧고 가장 드라마틱한 단계이다. 복제된 게놈이 세포의 양극으로 분리되어 두 개의 딸세포가 만들어지는 단계이기 때문이다. 이런 일련의 과정은 한 세포가 성장하여 두 세포로 분열되기 위해서 모든 세포가 거치는 과정이므로 세포의 생명 유지에 매우 중요한 과정이다. 그러므로 세포주기의 연구와 이들을 조절하는 물질의 개발은 세포성장기작의 연구 및 세포주기이상에서 발생하는 암의 예방, 치료제 개발에 필수적이라 할 수 있다(Nature Review Cancer 2001, 1, 222-231).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 암세포에서 활성 산소를 유도하여 암 세포를 세포주기 G2/M기에서 성장을 멈추게 함으로서 비정상적 성장을 억제시키고 암 세포의 사멸을 유도하는 새로운 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

상기 식에서,

R은 수소, C₆~C₁₀ 아릴기 또는 C₆~C₁₀ 아릴 카보닐이다.

바람직하게는, 상기 화학식 1에서

R은 수소 또는 벤조일이다.

보다 바람직한 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 2 내지 화학식 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

본원에서 사용된 용어 “아릴”이란 탄소수 6 내지 10개의 모노- 또는 폴리-사이클릭 방향족 환을 의미하며, 예를 들어 페닐, 나프틸 등을 포함한다. 페닐기가 특히 바람직하다.

본 발명의 화학식 1의 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체의 제조방법을 제공한다.

R이 수소 인 화학식 1의 화합물은 하기 단계를 포함하여 하기 반응식 1에서와 같이 제조될 수 있다:

하이드록시 벤즈알데하이드를 유기 용매에 녹이고 보로옥사이드 및 트리부틸보레이트 존재하에서 아세틸아세톤과 반응시키는 단계.

[반응식 1]

상기 반응식 1에서, 유기 용매로는 디메칠포름아마이드 등을 사용할 수 있다.

R이 벤조일 인 화학식 1의 화합물은 하기 단계를 포함하여 하기 반응식 2에서와 같이 제조될 수 있다:

1) 하이드록시 벤즈알데하이드를 유기 용매에 녹이고 보로옥사이드 및 트리부틸보레이트 존재하에서 아세틸아세톤과 반응시키는 단계; 및

2) 상기 단계에서 제조된 화합물을 카보네이트 화합물 존재하에서 벤조일 클로라이드와 반응시키는 단계.

[반응식 2]

상기 반응식 2에서, 제1단계의 유기 용매로는 디메칠포름아마이드 등을 사용할 수 있다. 아울러, 상기 반응식 2의 제2단계 반응은 카보네이트 화합물의 존재 하에 10 시간 이상, 11 내지 13 시간 동안 수행한다. 이때, 카보네이트 화합물로는 포타슘 카보네이트 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 제조된 화합물의 구조분석을 위하여, 먼저, UV 흡광도 분석, IR (infrared) 흡광도 분석 및 고해상도 질량분석기 분석을 실시하여 상기 순수 정제된 화합물의 분자량 및 분자식을 결정한다. 구체적으로, UV 흡광도 분석은 시마주사의 UV-265 분광광도계(Shimadzu UV-265 spectrophotometer)로 측정하고, IR 흡광도는 바이오-라드사의 디지랩 디비존 FTS-80 분광광도계(Bio-Rad Digilab Division FTS-80 spectrophotometer)로 측정하고, 분자량 및 분자식은 VG70-SEQ 질량 분석계(mass spectrometry; MS)를 이용한 고해상도(High resolution) MS를 측정하여 결정한다. 또한 핵자기공명기(Varian 300 MHz, 500 MHz NMR)를 이용하여 ¹H, ¹³C-NMR 스펙트럼을 얻고, 이들 스펙트럼을 종합적으로 분석하여 최종적으로 구조를 결정할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 항암제 조성물을 제공한다.

본 발명에서 항암이란 암의 예방 및 치료 효과 모두를 포함한다.

상기 암은 결장암, 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 암, 경부 암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양 등이 있다.

본 발명에 따른 화합물은 암세포의 비정상적인 성장을 억제하는 효과가 우수하여 암 질환의 치료 및 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

일 실시예로서, 화학식 1의 화합물들을 인체 결장암 세포주 SW620에 10 microM로 처리하면 세포주기 G2+M기에 정지시켜서 세포의 성장을 억제하는 효과를 나타낸다. 구체적으로, 세포 성장 억제 효과 실험은 다음과 같이 수행할 수 있다. 먼저, 인체 결장암 세포주 SW620의 배양액에, DMSO에 녹인 상기 화합물을 처리한 후, 20시간째에 세포 DNA를 염색하고, 염색된 세포를 벡톤-디킨스 팍스 칼리버 (Becton-Dickinson FACS calibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA))를 이용하여 세포 주기를 측정하고, 벡톤-디킨스 모디핏 (Becton-Dickinson Modifit) 세포 주기 분석 프로그램을 이용하여 세포주기의 G1, S, G2+M기에 있는 세포의 양을 백분율로 계산한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 포함하는 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 화합물은 통상적으로 하루에 체중 1 kg 당 1 내지 50 mg, 바람직하게는 5 내지 50 mg의 양을 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 기타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 암세포에 특이적으로 활성산소를 유도하여 세포 사멸을 유도하는 효과와 암세포의 세포주기 G2+M기를 고정시켜 비정상적 성장을 억제시킴으로써 우수한 항암 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 화학식 2의 화합물의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 다양한 구조의 커큐미노이드 화합물들에 대하여 활성 산소 생성 효과를 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명의 화학식 2의 화합물에 대하여 시간에 따른 활성 산소 생성 효과를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 화학식 2의 화합물에 대하여는 농도에 따른 활성 산소 생성 효과를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 화학식 2의 화합물이 세포주기에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 화학식 2의 화합물의 인간 암세포주 성장 억제를 WST-1을 사용하여 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 화학식 2의 화합물에 대하여는 대장암 세포주 SW620에서 대조구(화합물 미처리) 대비 농도에 따른 암세포 증식 억제율을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 화학식 2의 화합물이 세포사멸에 미치는 영향을 조사한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 화학식 2의 화합물 제조

디메틸 포름아마이드를 용매로 하여 보릭옥사이드(0.7g, 10mmole)와 아세틸아세톤(1g, 10mmole)을 70℃에서 30분간 교반시킨후 트리부틸보레이트(1g, 10mmole)와 살리실릭알데하이드(1.2g, 10mmole)를 추가하여 70 ℃에서 한시간 동안 교반시켰다. 그 후에 에틸아세테이트에 희석된 부틸아민(0.7g, 10mmole)을 15분간 천천히 떨어뜨리고, 80 ℃에서 3시간 동안 추가로 교반하였다. 1N 염산을 10mL 첨가한후 30분간 교반하여 반응을 종료하였다. 반응 결과물을 분리 정제한 후 테트라하이드로퓨란을 용매로 하여 소듐하이드라이드(0.3g, 12mmole), 브로모(메톡시)메탄(bromo(methoxy)methane)(1.2g, 10mmole)과 반응시켰다. 반응의 결과로 알콜 작용기는 메톡시메틸 에테르(methoxymethyl ether)로 프로텍팅 되었으며, 합성된 중간물질은 포타슘카보네이트(2g)가 첨가된 아세톤(20mL)을 용매로 아이오도메탄(3.1g, 22mmole)과 반응시켰다. 반응물질의 분리 정제 후, 프로텍팅 그룹을 떼어 내기 위하여 25ml 메탄올을 용매로 하여 10ml 1N 염산 첨가 후 70 ℃에서 3시간 동안 반응 시켰다. 활성물질을 함유하고 있는 유기 용매 층을 모아 감압 하에 농축하였다. 농축된 추출물을 메틸렌클로라이드에 용해시키고 에틸아세테이트와 헥산의 비율을 20 : 80 으로 실리카겔(Merck, Art No. 9385) 컬럼 크로마토그래피하여 활성분획을 분리 정제하여 엷은 노란색의 화학식 2의 화합물 1.7 g을 얻었다(수득율: 50 %). 화학식 2의 화합물의 물리화학적 성질을 하기 표 1에 나타내고, 수소 NMR 스펙트럼을 도 1에 나타내었다.

¹H-NMR (CDCl₃): 8.01 (2H, d, J = 15.9), 7.45 (2H, d, J = 8.1), 7.22 (2H, t, J = 7.2), 6.93 ( 4H, m), 6.79 (2H, d, J = 8.1), 1.48 (6H, s)

외형(appearance)		옅은 노란색
분자식		C₂₁H₂₀O₄
분자량		336.38
융점(℃)		110
용해성	가용성	메탄올, 에칠아세테이트, 아세톤
	불용성	물

실시예 2: 화학식 3의 화합물 제조

상기 실시예 1에서 얻은 화학식 2의 화합물(302mg, 0.9mmole)을 포타슘카보네이트(2g)가 첨가된 아세톤에 용해후 벤조일클로라이드(200mg, 1.8mmole)를 첨가하여 실온에서 2시간동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 활성물질을 함유하고 있는 유기 용매 층을 모아 감압 하에 농축하였다. 농축된 추출물을 메틸렌클로라이드에 용해시키고 에틸아세테이트와 헥산의 비율을 10 : 90 으로 실리카겔(Merck, Art No. 9385) 컬럼 크로마토그래피하여 활성분획을 분리하여 엷은 노란색의 화학식 3의 화합물 390 ㎎을 얻었다(수득율: 80 %). 화학식 3의 화합물의 물리화학적 성질을 하기 표 2에 기재하였다.

¹H-NMR (CDCl₃): 8.19 (4H, d, 7), 7.79 (2H, d, J = 15.5), 7.63 (4H, m), 7.52 (4H, t, J = 8), 7.46 (2H, m), 7.23 (4H, m), 1.30 (6H, s)

외형(appearance)		옅은 노란색
분자식		C₃₅H₂₈O₆
분자량		544.59
융점(℃)		127
용해성	가용성	메탄올, 에칠아세테이트, 아세톤
	불용성	물

실험예 1: 다양한 구조의 커큐미노이드 화합물의 활성 산소 유도 비교

하기 다양한 구조의 커큐미노이드 화합물들에 대하여 활성 산소 생성 효과를 비교하였다.

구체적인 실험 방법은 하기와 같이 수행하였다.

먼저, 인간 대장암 세포 (SW 620)의 총 활성 산소의 양을 측정하기 위해 10% FBS를 포함한 RPMI 1640 배지를 이용하여 37 ℃, 5% 이산화탄소를 유지하며 배양하였고, 배양된 세포를 0.05% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 이용하여 세포를 떼어내어 96-well black plate에 5000cell/ well의 농도로 세포를 투여하였다. 24시간 인큐베이션한 세포에 시료를 처리한 후 각각의 well에 활성 산소에 민감한 형광 반응 물질인 DCF-DA(sigma-aldrich)를 10μM 농도로 10분간 처리하였다. PBS를 이용한 DCF-DA의 세척 후 Wallac 1420 VICTOR2 multilabel counter를 사용하여 형광을 측정하였다. 485nm의 excitation 파장과 535nm의 emission 파장으로 대조군과 각각의 시료가 처리된 세포의 형광 세기를 측정하였다.

상기 측정 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 통해, 2-하이드록시 그룹을 가지고 있는 화합물들이 상대적으로 많은 양의 활성 산소를 만들어 냄을 알 수 있었으며, 특히 본 발명의 화합물인 화합물 7번(화학식 3의 화합물) 화합물이 테스트된 모든 커큐미노이드 화합물들 중에서 가장 우수한 활성 산소 생성 효과를 가짐을 알 수 있었다.

한편, 상기 7번 화합물(화학식 2의 화합물)에 대하여 시간에 따른 활성 산소 생성 효과를 측정하였다.

구체적인 실험 방법으로는 인큐베이션한 세포에 시료를 처리할 때 시간별로 처리하는 것을 제외하고는 상기 방법과 동일한 방법을 사용하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 통해, 7번 화합물(화학식 2의 화합물)을 처리하는 경우 시간이 경과함에 따라 활성 산소의 생성 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

아울러, 상기 실시예 1의 화학식 2의 화합물에 대하여 농도에 따른 활성 산소 생성 효과를 측정하였다.

구체적인 실험 방법으로는 인큐베이션한 세포에 시료를 처리할 때 농도별로 처리하는 것을 제외하고는 상기 방법과 동일한 방법을 사용하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 통해, 화학식 2의 화합물을 처리하는 경우 농도가 증가함에 따라 활성 산소의 생성 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 세포주기 분석

세포주기 분석을 위하여 인체 결장암 세포주 SW620을 10% FBS를 함유한 각각의 RPMI 1640과 DMEM 배지를 이용하여 T25 플라스크(배양액 7.5㎖)에 분주한 후, 12시간 동안 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. 12시간 배양 후, 대조군(control)으로 쓰일 세포 배양액에는 DMSO를 최종 농도가 0.1%(7.5㎕)가 되도록 넣어주고, 처리군으로 쓰일 세포 배양액에는 다양한 농도로 DMSO에 녹여진 시료를 7.5 ㎕ 첨가하였다. DMSO 또는 시료를 처리한 세포주는 물질 처리 후 각기 48시간째에 분리하여 세포분석을 위해 사용하였다.

세포주기 분석을 위하여 배양된 세포는 플라스크에서 배지를 제거한 후, 트립신을 이용하여 배양 플라스크에서 분리하여 원심분리(300g, 5분)하였다. 분리된 세포는 인산염 완충액(phosphate buffer)을 이용하여 두 차례 씻어주어 배지 성분을 제거하였다. 이렇게 준비된 세포에 70% 에탄올 3㎖을 처리하여 -20℃에서 12시간 동안 방치하여 세포를 고정시켰다. 에탄올로 고정된 세포는 원심분리 (300g, 3분)한 후, 다시 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻어내어 잔여 에탄올을 제거하였다. 세포에 500㎕ PBS를 가하여 골고루 섞어 준 후, 100 ㎍/mL RNase A를 50㎕를 처리하여 37℃에서 30분간 방치한 후, 1㎎/㎖ propidium iodide(in PBS)를 10㎕를 처리하여 세포 DNA를 염색하였다. 염색된 세포는 벡톤-디킨슨 팍스 칼리버(Becton-Dickinson FACS calibur(Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA))를 이용하여 20,000개 세포의 세포 주기를 측정하였고, 벡톤-디킨슨 모디핏(Becton-Dickinson Modifit) 세포 주기 분석 프로그램을 이용하여 세포주기의 G1, S, G2+M 기에 있는 세포의 양을 백분율로 계산하였다.

화학식 2의 화합물이 세포주기에 미치는 영향을 분석한 결과를 하기 표 3 및 도 5에 나타내었다.

암세포에서의 세포주기 저해활성

세포주	화합물	농도	% of Cells
			G0-G1	S	G2-M
SW620	대조군	10 μM	42	21	20
	화합식 2의 화합물
			37	14	32

상기 표 3 및 도 5로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 세포주기에 중요한 요소인 G2/M기 세포 성장을 정지시켜 세포분열을 저해하는 뛰어난 효과를 나타내었다. 이를 통해 본 발명의 화학식 2의 화합물이 암세포의 비정상적인 성장을 억제하여 암을 치료 또는 예방하는데 유용함을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 세포주에서의 항암활성

본 발명의 화학식 2의 화합물의 인간 암세포주 성장 억제를 WST-1을 사용하여 측정하였다. 각각의 인간 암 세포주를 10% 소태아혈청(FBS)이 포함된 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소를 유지하며 배양하였고, 0.05% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 이용하여 세포를 떼어내었다. 96웰 플레이트의 각 웰에 헤마토사이토미터(hematocytometer)로 계산한 4,000개의 세포를 각각 투여하였다. 5% 이산화탄소를 포함한 37 ℃ 배양기에서 10% FBS가 포함된 배지에서 배양하고, 24시간 후에 대조군(0.1 % DMSO) 또는 본 발명의 화합물을 5, 10, 15, 20, 25, 30 ㎍/㎖의 농도별로 포함(DMSO에 녹인 화합물을 배지로 희석)한 새로운 배지로 교환하였다. 약물을 48시간 동안 처리한 후에 각 웰에 WST-1(Roche사 제품) 10 ㎕씩을 첨가하고 2시간 동안 배양한 다음, ELISA 판독기(ELISA Reader, Bio-Rad사 제품)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6을 통해, 48 시간 경과 후 DLD-1, HCT116 및 SW620은 10 μM의 농도 이하에서 50% 성장 억제 효과(GI₅₀)를 나타냄으로써 결장암조직의 성장이 억제되는 것이 확인되었다. 또한, SK-MEL-28, MCF-7, MDA-MB-468 및 MDA-MB-231이 20 μM의 농도 이하에서 50% 성장 억제 효과(GI₅₀)를 나타냄으로써 피부암 및 유방암 조직의 성장이 억제되며, MiaPaCa2 및 A549가 30 μM 정도의 농도에서 50% 성장 억제 효과(GI₅₀)을 나타냄으로써 췌장암 및 폐암 조직의 성장도 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 화학식 2의 화합물에 대하여 대장암 세포주 SW620에서 대조구(화합물 미처리) 대비 농도에 따른 암세포 증식 억제율을 측정함으로써 항암 효과를 조사하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7을 통해 화학식 2의 화합물의 농도가 증가함에 따라 SW620 세포주의 증식이 더욱 억제됨을 확인할 수 있었다. 특히, 화학식 2의 화합물은 SW620에서 10 μM의 농도 이하의 50% 성장 억제 효과(GI₅₀)를 나타내었다.

실험예 4: 세포사멸에 미치는 영향 조사

본 발명의 화학식 2의 화합물이 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였다.

Poly (ADP-Ribose) polymerase[이하, PARP]은 세포 사멸의 유도를 확인 할 수 있는 마커로 외부 자극에 대해 유전자의 안정성을 유지할 수 있게 해주는 대표적인 세포 내의 수리 시스템이다. 세포 사멸이 일어나게 되면 PARP가 잘리게 되고 이러한 PARP의 절단은 세포사멸의 대표적인 신호로 여겨진다.

따라서, 본 발명의 화학식 2 화합물의 세포사멸 유도 활성을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 하였다.

100mm 세포배양접시에 SW620 세포를 10×10⁵ 개로 접종하였다. 18시간 후 화학식 2 화합물을 10uM 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 화학식 2 화합물에 의한 PARP의 절단을 분석하기 위해 처리된 세포를 RIPA buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 1mM sodium vanadate, 0.5% sodium deoxycholate, 0.05% sodium deoxy sulfate)로 용해시켰다. 세포용해액을 1080rpm으로 원심 분리하여 상층 세포액을 회수하였으며, Bradford reagent (Bio-Rad protein assay, USA)를 이용하여 회수한 세포액의 단백질 농도를 측정하였다.

또한 7.5% SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 30ug의 세포용해액을 단백질 분리한 후, PVDF 막 (Millipore, USA)으로 단백질들을 전기 이동하고 TBST (50mM Tris-HCl, pH7.6, 150mM NaCl, 0.1% tween 20)에 녹인 5% skim milk를 이용하여 blocking 하였다. PARP 항체(Cell signaling, USA), Actin 항체(Sigma, USA)로 1시간 동안 반응시키고 HRP가 conjugation된 2차 항체 (Jackson Immunolab, USA)와 1시간 동안 반응 시킨 뒤, chemiluminescence POD 시약 (Roche, Germany)을 사용하여 검출하였다.

그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 통해, 화학식 2의 화합물이 처리된 세포는 DMSO가 처리된 세포와 비교할 때, 정상적인 PARP 단백질의 양이 감소되고, 절단된 형태의 PARP 단백질의 양은 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 화학식 2의 화합물이 암세포의 사멸을 유도함을 알 수 있었다. 한편 활성산소 억제제인 GSH 또는 NAC을 동시에 처리하면 절단된 형태의 PARP 단백질을 관찰 할 수 없었다. 이를 통하여 화학식 2의 화합물에 의한 세포사멸은 활성산소와 관련이 있음을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]

상기 식에서,
R은 수소, C₆~C₁₀ 아릴기 또는 C₆~C₁₀ 아릴 카보닐이다.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서
R은 수소 또는 벤조일 인 2-하이드록시 커큐미노이드 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서, 하기 화학식 2 내지 화학식 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
[화학식 2]

[화학식 3]
하기 단계를 포함하는, R이 수소 인 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시 커큐미노이드 화합물의 제조 방법:
하이드록시 벤즈알데하이드를 유기 용매에 녹이고 보로옥사이드 및 트리부틸보레이트 존재하에서 아세틸아세톤과 반응시키는 단계.
제4항에 있어서, 상기 유기용매는 디메칠포름아마이드 임을 특징으로 하는 2-하이드록시 커큐미노이드 화합물의 제조 방법.
하기 단계를 포함하는, R이 벤조일 인 화학식 1로 표시되는 2-하이드록시 커큐미노이드 화합물의 제조 방법:
1) 하이드록시 벤즈알데하이드를 유기 용매에 녹이고 보로옥사이드 및 트리부틸보레이트 존재하에서 아세틸아세톤과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 단계에서 제조된 화합물을 카보네이트 화합물 존재하에서 벤조일 클로라이드와 반응시키는 단계.
제6항에 있어서, 상기 제1단계의 유기용매는 디메칠포름아마이드 임을 특징으로 하는 2-하이드록시 커큐미노이드 화합물의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 제2단계의 카보네이트 화합물는 포타슘 카보네이트 임을 특징으로 하는 2-하이드록시 커큐미노이드 화합물의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 기재의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 암은 결장암, 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 암, 경부 암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종 또는 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양임을 특징으로 하는 항암용 조성물.