KR20000076670A - 성장 호르몬 조절 성장 마커 - Google Patents

Abstract

인간성장 호르몬에 의해 발현이 조절되는 신규의 유전자, 그것을 구성하는 DNA, 및 이것이 코딩하는 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

서열표의 서열번호 1 에 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA 및 이것이 코딩하는 서열표의 서열번호 2 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이들의 상동체.

Description

성장 호르몬 조절 성장 마커{GROWTH HORMONE-REGULATED GROWTH MARKER}

본 발명은 인간성장 호르몬에 의해 그 발현이 조절되는 유전자, 그 유전자를 구성하는 DNA, 및 그 DNA 가 코딩하는 단백질, 또한 이들을 이용한 진단약에 관한 것이다.

인간성장 호르몬 (hGH) 은 그 성장촉진 효과 때문에 성장 호르몬 (GH) 분비 부전증 소아 및 터너 증후군 소아, 만성 간질환 소아 등의 치료약［Neely E.K., and Resenfeld R.G., Ann. Rev. Med. 45 : 407-420 (1994)］으로서 세계적으로 널리 이용되고 있다. GH 는 다양한 생리작용을 나타내며, 성장, 대사, 분화 등에 관한 다수의 유전자 조직의 특이한 발현을 조절하고 있다. 또, 세포증식 및 유전자 발현에 대한 일부의 GH 효과는 성에 의존하거나, 또 하직체의 GH 분비 패턴으로 조절되고 있다. GH 등의 성장 인자는 세포막에 있는 각각의 수용체로의 결합을 거쳐 세포 내의 시그널 트랜스덕션 경로의 STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) 를 인산화하여 그 각 정보를 핵으로 전달한다. 그러나, 핵유전자에 대한 GH 의 작용은 아직 해명되고 있지 않다［Garry B.Udy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:7239-7244 (1977)］.

최근, GH 분비 부전증 및 분비 과잉증의 환자에게 심기능의 장해가 보인 것으로부터 심장의 기능 및 구조에 대한 GH/인슐린 유사 성장인자-1 (IGF-1) 의 작용이 연구의 대상이 되어 왔다. 특히, 심기능의 발달 조절에 GH 또는 IGF-1 이 관여하고 있는 것이 시사되고 있다［Gaetano Lombardi et al., Journal of Pediatric Endocrinology ＆ Metabolism, 10 : 553-560 (1997)］. 이 심기능의 장해는 GH 및 IGF-1 의 수준을 정상화함으로써 부분적으로 회복하는 것도 확인되고 있다.

한편, 염색체 21q22.3 으로부터 글루타민산을 풍부하게 포함하는 단백질을 코딩하는 새로운 유전자가 클론되고, 이 유전자의 발현은 성인의 심장 및 골격근에 한정되어 일어나는 것이 확인되고 있다［Paolo Scartezzini et al., Hum. Genet., 99 : 387-392 (1997)］.

이와 같은 배경으로부터 본 발명은 인간성장 호르몬에 의해 발현이 조절되는 신규 유전자, 그것을 구성하는 DNA, 및 이것이 코딩하는 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 집토끼의 연골세포를 이용한 연구에서 일종의 유전자의 발현이, 성장 호르몬 (GH) 등의 성장 인자에 의해 조절되어 어린 연골세포보다도 나이 먹은 연골세포에서 강하게 발현되는 것, 또 그 강한 발현이 성장 호르몬 처리에 의해 어린 연골세포 수준으로 복귀하는 것, 나아가 동 유전자가 종양세포 등의 이상세포에서 강하게 발현되는 것을 발견하여 그 유전자를 단리, 동정하여 검토하고 그 유전자가 인간, 집토끼와 같은 종을 초월하여 공통의 아미노산 서열을 보유하는 신규 유전자인 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

즉 본 발명은 서열표의 서열번호 1 에 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA 를 제공한다.

또한 본 발명은 서열표의 서열번호 2 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질도 제공한다.

또한, 본 발명은 서열표의 서열번호 2 에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며 그 발현이 인간의 정상세포에 비해 인간의 종양세포에 있어서 강화되는 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질도 제공한다. 여기서, 인간의 종양세포의 예는 특히 전골수구 백혈병세포, 만성 골수성 백혈병세포, 결장직장선 암세포, 폐암세포 및/또는 흑색종세포이다.

또한 본 발명은 상기의 각 단백질로서 그 발현이 가령(aging)에 의해 높아지며, 또한 성장 호르몬 처리에 의해 어린 세포의 수준으로 복귀하는 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질도 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 단백질중의 하나를 코딩하는 염기 서열을 갖는 각각의 DNA 도 제공한다. 그와 같은 염기 서열은 코돈의 축중(縮重)에 관한 주지의 지식을 이용하여 임의로 구성하는 것이 가능하다.

또한 본 발명은 상기의 DNA 중의 하나의 발현이 가능한 플라스미드도 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 각 DNA 중의 하나의 특이하게 하이브리다이즈(hybridize)하는 올리고뉴클레오티드도 제공한다. 그 올리고뉴클레오티드는 이들을 프라이머, 프로브 또는 마커로서 사용하는 것을 특징으로 하는 진단약을 제공하는 것에 이용할 수 있다.

그리고 본 발명은 상기의 각 단백질에 대한 폴리클로널 또는 모노클로널 항체도 제공한다. 그 항체는 이에 따른 면역측정법(immunoassay) 등에 기초한 진단약을 제공하는 것에 사용할 수 있다.

본 발명자들은 mRNA 디퍼렌셜 (differential)디스플레이 및 PCR 선택 cDNA 서브트랙션법을 이용하고, 성장 호르몬에 의해 제어되는 유전자의 예비적 검출을 실시하여 집토끼 연골세포 중에 성장 호르몬에 의해 발현이 제어되는 유전자가 있는 것을 확인하였다. 즉, mRNA 디퍼렌셜ㆍ디스플레이법을 이용하여 일종의 전기영동밴드 (N11) 가 어린 집토끼의 연골세포를 100 ng/㎖ 의 rhGH 로 1 일 처리함으로써 촉진되고 있는 것을 발견하였다. 이 밴드를 잘라내어 상법에 의해 그 DNA 를 추출하여 클로닝하여 서열결정하였다. 이 DNA 단편은 길이가 505 염기임이 판명되었고, 그리고 정의된 유전자가 모두 의미있는 상동성(相同性)은 없었다. 그러나, 인간 및 마우스의 EST (Expressed Sequence Tag) 중에는 상동한 것이 있었다. 이 밴드로부터 DNA 를 상동한 클러스터(cluster) HCD20 으로서 분류하여 문제의 집토끼 유전자를 「HCD20(11)」 로 명명하였다.

추가되는 실험에 의해 mRNA 디퍼렌셜ㆍ디스플레이법에 있어서 이용하고, HCD20(11) 의 발견의 계기가 된 이 집토끼가 HCD20(11) 의 발현 양식에 있어서 약간의 이상이 있었음이 판명되었다. 즉, 다른 어린 집토끼 연골세포에 있어서는 모두 성장 호르몬 처리에 의한 HCD20(11) 유전자의 발현 변화는 특별히 검출할 수 없었다. 그러나, 놀랍게도 HCD20(11) 유전자의 발현은 나이먹은 오래된 세포에 있어서 매우 높아있고, 그리고 GH 처리가 그 발현을 어린 집토끼 연골세포에 특유한 낮은 수준까지 복귀시키는 것이 발견되었다. HCD20(11) 의 전장 DNA 서열을 집토끼 연골세포로부터 추출한 mRNA 로 구축한 cDNA 라이브러리를 이용하여 결정하였다.

전술한 바와 같이, 이 유전자에 대응하는 505 염기인 DNA 단편의 염기 서열이 전술한 인간의 EST 와 고도한 상동성을 나타낸 것으로부터 이 유전자에 대응하는 인간의 유연(類緣)유전자 (hGHRGM : human growth hormone regulated growth marker) 를 탐색하기 위해 이 집토끼의 HCD20(11) 특이한 DNA 단편을 프로브로서 이용하였다. 그 DNA 단편은 서열표의 서열번호 3 으로 나타내는 염기 서열을 갖는다. hGHRGM 유전자의 여러 영역을 포함한 9 개의 독립된 파지 클론을 회수하였다. 그들 DNA 를 정제하고 pUC18 벡터에 재클로닝한 후 서열결정하였다. 전장 765 염기로 이루어지는 염기서열이 조립되었다. 그 서열을 서열표의 서열번호 1 에 나타낸다. 또 여기서 추정된 단백질인 93 개의 아미노산잔기로 이루어지는 유추된 아미노산서열을 서열표의 서열번호 2 에 나타낸다.

이 단백질은 핵에 존재하는 것으로 예측된다. 본 발명자의 측정에 의하면 대응하는 집토끼의 상동체의 아미노산 서열과의 사이에 아무런 차이도 없었던 것으로부터 종을 초월한 매우 높은 보존성을 나타냄이 판명되었다. 이것은 이 단백질이 생명활동에 있어서 기본적인 역할을 담당하고 있는 것임을 시사하고 있다.

hGHRGM 단백질의 아미노산 서열을 BLASTP 서치를 이용하여 공지의 폴리펩티드 서열과 비교하였다. 인간 SH3 도메인 결합성 글루타민산 풍부한 단백질 ( SH3BGRL)［Egeo A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 247(2) : 302-306 (1998)］ 및 인간 SH3 결합성 글루타민산 풍부한 단백질 (CH3BGR)［Paolo Scatezzini, et al., Hum. Genet., 99 : 387-392 (1997)］가 hGHRGM 단백질과 가장 높은 상동성을 나타내었다. MOTIF 서치는 3 개의 모티프(motif)의 존재를 분명히 하였다.

SH3BGR 및 SH3BGRL 에 있는 프롤린이 풍부한 펩티드의 아미노산 서열이 시그널 트랜스덕션 경로에 관련하는 단백질-단백질 상호 작용에 중요한 역할을 담당하는 것이 알려져 있다［Cohen, G.B., et al., Cell, 214 : 237-248 (1995). Powson, T. and Scott, J.D., Science, 278 : 2075-2080 (1997)］. 특이한 프롤린 풍부한 공통 서열이 SH3, WW 및 EVH1 의 도메인에 결합한다［Cicchetti, P. et al., Science, 257 : 803-806 (1995). Macias, M.J. et al., Nature, 382 : 646-649 (1996). Niebuhr, K. et al., EMBO J., 16 : 5433-5444 (1997)］. 이로부터 본 발명의 화합물도 프롤린 풍부한 서열을 갖고, GH 및 IGF-1 의 생리작용을 초래하는 시그널 트랜스덕션에 관여하고 있는 것으로 추정된다.

본 발명의 DNA 의 전사(轉寫)산물인 mRNA 는 GH 처리에 의해 연골세포에서 발현하였지만, 종양 등의 이상세포에서는 강하게 발현하는 것이 확인되었다. 또 노화한 세포에서는 그 mRNA 발현은 어린 세포에 비해 현저하게 높지만, 노화세포를 GH 로 처리함으로써 어린 세포의 수준으로까지 복귀되었다. 최근, 성인의 GH 분비 부전증의 환자의 GH 약제 투여에 의한 치료가 주목되고 있다. 본 발명의 DNA 및 이것이 코딩하는 단백질, 그것에 대한 항체, 및 프로브 등은 그들 치료에 있어서 진단약으로서 이용할 수 있다.

또 소아의 GH 분비 부전증의 치료에 있어서도 본 발명 단백질의 발현 정도의 측정은 GH 에 의한 치료의 모니터링에 유효하다. 또 본 발명의 DNA 및 이것이 코딩하는 단백질, 그것에 대한 항체, 및 프로브 등은, 따라서 이 경우에도 진단약으로서 유용하다.

본 발명은 서열표의 서열번호 1 로 나타난 염기 서열을 갖는 DNA 뿐 아니라 이들 염기 서열에 있어서 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 동일한 성질을 갖는 유전자를 구성하는 DNA 도 포함한다. "하나 이상의 염기"란 통상은 예를 들면 복수개 (예를 들면 3 또는 4 개) 내지 10 개이다. 본 발명은 또 서열표의 서열번호 2 로 나타난 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐 아니라 그 단백질의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 동일한 성질을 갖는 단백질도 포함한다. "하나 이상의 아미노산이란 통상은 예를 들면 복수개 (예를 들면 3 또는 4 개) 내지 10 개이다. 또한 본 발명은 그와 같은 단백질을 코딩하는 DNA 서열도 포함한다. 그와 같은 염기 서열은 당업자가 코돈의 축합에 관한 주지의 지식을 이용하여 여러 가지의 것을 용이하게 작성하는 것이 가능하다.

재조합 DNA 기술에 의해 여러 변이체의 제작이 가능하다. 최초로, 여러 화학적 및/또는 효소적 방법을 이용하여 DNA 의 클론 단편에 변이를 발생시킬 수 있으며, 얻어진 변이형의 DNA 에 대해 DNA 서열 분석을 실시하여 이점을 갖는 특정한 변이체를 선출한다. 이 방법에서 여러 변이체를 그 표현형에 관계 없이 시스티메틱(systematic)하게 제작할 수 있다. 일반적으로 이용되는 변이형 클론의 DNA 제작방법은 이하와 같다.

1. 올리고뉴클레오티드를 이용하여 직접 DNA 서열로 치환, 결실, 삽입, 부가를 일으킬 수 있다. 이 방법에 의하면 DNA 가 작은 영역에 많은 변이를 일으키는 것이 가능하다.

2. 보다 긴 올리고뉴클레오티드를 이용하여 원하는 유전자의 합성이 가능하다.

3. 부위 특이적 변이 도입법 (Region-specific Mutagenesis) 을 이용하여 큰 DNA 영역 (1∼3 kb) 에 원하는 변이체를 제작할 수 있다.

4. DNA 의 링커 스캐닝 변이 도입법 (Linker-scanning Mutagenesis) 는 상대적으로 작은 DNA 영역 (4-10 bp) 에 클러스터 점 변이를 도입하기에 적합한 방법이다.

5. PCR 도 직접적인 변이체 제작법으로서 이용할 수 있다.

［참고 문헌 : Current Protocols in Molecular Biology. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al., John Wiley ＆ Sons, Inc., Current Protocols., Vol.1, Chapter 8 : Mutagenesis of cloned DNA, pages 8.0.1-8.5.10.］

이들 방법으로 얻어진 여러 변이형을 포함하는 원하는 유전자의 발현이 가능한 플라스미드 및 벡터의 제작방법도 당업자에게 주지의 사실이다. 즉, 제한 효소와 리가아제(ligase)와의 조합을 이용하여 원하는 유전자를 포함한 DNA 를 발현 벡터 DNA 로 삽입함으로써 원하는 유전자를 포함한 재조합 플라스미드를 용이하게 구축할 수 있다. 얻어진 재조합 플라스미드를 다른 세포에 도입함으로써 세포를 트랜스펙션(transfection)하여 형질전환 세포를 제작할 수 있다. 세포로서는 대장균 등의 원핵생물로부터 효모 및 곤충, 식물 및 동물세포도 이용할 수 있다.

［참고 문헌 : Vectors Essential Data. Gacesa P. and Ramji D.P. 166 pages. BIOS Scientific Publishers Limited 1994., John Wiley ＆ Sons in association with BIOS Scientific Publishers Ltd. Expression vectors, pages 9-12.］

숙주세포로의 재조합 플라스미드의 도입은 염화칼슘법 및 일렉트로포레이션법에 의해 실시할 수 있다. 염화칼슘법은 효율적인 트랜스포메이션을 부여하고 특별한 장치를 필요로 하지 않는다. 보다 높은 효율을 구하려면 일렉트로포레이션(electroporation)법이 사용되어야 한다.

［참고 문헌 : Current Protocols in Molecular Biology. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al., John Wiley ＆ Sons, Inc., Current Protocols., Vol.1, unit 1.8 : Introduction of Plasmid DNA into Cells, pages 1.8.1-1.8.10.］

동물세포계에서 통상 실시되는 트랜스팩션에는 일과성인 것과 안정적이며 영구적인 것 2 종류가 알려져 있다. 일과성의 트랜스팩션에서는 형질전환 세포를 1 ∼ 4 일간 배양하여 트랜스팩트(transfect)한 유전자의 전사, 복제를 일으킨 후, 세포를 회수하여 DNA 분석을 실시한다. 대신에, 많은 연구에서는 트랜스팩트 유전자를 염색체 유전자에 결합하는 안정형의 형질전환 세포주를 제작하고 있다. 트랜스팩션법으로서는 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 리포좀(liposome)융합법 등이 이용된다.

［참고 문헌 : Current protocols in molecular biology. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al., John Wiley ＆ Sons, Inc., Current Protocols., Vol.1, Chapter 9 : Introduction of DNA into mammalian cells, pages 9.0.1-9.17.3.］

본 발명의 유전자에 대해 그것이 코딩하는 단백질 (폴리펩티드) 및 그 단편이나 유사체에 대한 폴리클로널 및 모노클로널 항체의 작성도 당해 분야에 있어서 주지의 기술을 이용하여 용이하게 실시할 수 있다. 제작된 항체는 연구시약 및 본 유전자가 관련되는 질환의 진단약으로서 이용이 가능하다. 또, 얻어진 항체는 항체 칼럼(column)의 제작, 면역침전법, 나아가 웨스턴블로팅(Western blotting)에 의한 항체의 동정(同定) 기타 널리 이용할 수 있다.

본 발명의 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 밀리그램 수준의 모노클로널 항체의 일반적인 제작법은 다음과 같다. 즉, 항원 단백질을 마우스에 접종하여 면역시키고, 충분한 항체 타이터(titer)를 나타내는 마우스로부터 비장(脾臟)을 제거한다. 비장세포를 분리하여 비장 B 세포를 선택하고, B 세포 기원인 골수종세포에 융합시키고, 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma) 세포를 구축하고, 하이브리도마 세포로부터 분비된 모노클로널 항체를 세포 배양액으로부터 어피니티(affinity) 칼럼, 이온 교환법, 겔 여과 등을 이용하여 정제한다. 또, 일반적인 방법으로 본 발명 물질의 폴리클로널 항체도 제조할 수 있다. 즉, 면역동물로서는 토끼, 말, 마우스, 기나아돼지등을 이용하고, 당업자에게 이미 공지인 여러 스케쥴로 항원 단백질을 접종하여 면역시키고, 채혈한 혈청으로부터 면역 글로블린 G 등을 단리시킨다.

［참고 문헌 : Current protocols in molecular biology. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al., John Wiley ＆ Sons, Inc., Current Protocols., Vol.2, Chapter 11 : Immunology, pages 11.0.1-11.16.13.］

본 발명자들은 인간의 각 조직에 있어서의 hGHRGM 의 발현 수준을 노던 하이브리다이제이션(Northern hybridization)법으로 조사하였다. hGHRGM 은 각 조직에서 발견된 것으로부터 여러 조직에 보편적으로 발현하고 있는 것으로 추정된다. 그 발현 수준을 hGHRGM 에 특이한 프로브를 제작하여 정상세포와 종양세포를 비교하면 전골수구 백혈병세포 (HL-60), 만성 골수성 백혈병세포 (K-562), 결장직장선 암세포 (SW 480), 폐암세포 (A549), 흑색종 (G631) 에 있어서 종양세포 쪽이 정상세포보다 높은 발현을 나타내었다. 이것은 hGHRGM 이 일정한 종류의 종양에 대해서는 그 진행정도를 평가하는 진단약으로서 이용할 수 있는 것을 나타내고 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 의도하지 않는다.

〈프라이머의 제작〉

pUC18 중의 벡터의 삽입물인 DNA 서열결정을 위해 이용한 서열표의 서열번호 4 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 M13 유니버셜 서열결정 프라이머, 및 서열표의 서열번호 5 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 M13 반대방향 서열 프라이머의 합성은 닛싱보오 토오쿄오 리서치 센터에 합성을 위탁하여 실시하였다.

〈파지 평판배양세포의 조제〉

파지 감염을 높은 효율로 실시시키기 위해서는 파지 증식에 이용하는 세포는 대수(對數) 증식상으로 수확하고 또 사(死)세포를 실질적으로 포함하지 않는 것이 중요하다. XL1-Blue MRF’주(株)를 이용하는 것이 가장 편리함이 판명되었다. 그 유전자형은 △(mcrA)183 △(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac［F’proABlacl^qZ△M15 Tn10(Tet^r)］이다. 이 세포주를 25 ㎍/㎖ 테트라 싸이클린을 보충한 CG 아가 플레이트 (1.6 % Bacto-Agar (Difco) 및 40 캡슐/L CircleGrow (Bio101, Inc.)) 에서 배양하였다. 세포를 37 ℃ 로 배양하고 2 주간마다 신선한 플레이트로 옮겨 심은 후 37℃ 에서 밤새 배양하고, 4 ℃ 로 보존하였다.

평판배양 단계의 전날에 1 개의 콜로니를 CG 아가 플레이트로부터 채취하여 0.4 % 말토스와 25 ㎍/㎖ 테트라 싸이클린을 보충한 3 ㎖ 의 CG 브로스 (40 캡슐/L CircleGrow) 에 파종하여 진탕하면서 37 ℃ 로 밤새 배양하였다.

1.0 ㎖ 의 밤새의 배양물을 47 ㎖ 의 동일한 보온 전의 배지의 47 ㎖ 에 첨가하여 세게 진탕하면서 37 ℃ 로 3 시간 배양하였다. 세포 농도를 Beckman DU 640 분광계를 이용하여 0.1 ml 의 석영유리 큐베트(cuvette) 으로 평가하였다. 통상, OD₆₀₀의 강도는 0.3 (1.5 ×10⁸세포/ml) 부근이다. 배양물을 뚜껑이 딸린 멸균 50 ㎖ 폴리카보네이트 원심병 (Beckman) 으로 옮겨 3,000 rpm 으로 10 분간 4 ℃ 로 Beckman JA 20 rotor 를 이용하여 Beckman J2-MC 원심기로 분리하였다. 세포 펠릿을 세포 농도 2 ×10⁹세포/㎖ 의 현탁액을 조제하도록, 냉각시킨 멸균 10 mM MgSO₄액 중에 재현탁시켰다. 세포를 빙상에 두고 스크리닝을 위해 즉시 타이트레이션 및 파지 평판배양에 이용하였다.

〈파지의 타이트레이션〉

25 ㎍/㎖ 의 테트라 싸이클린을 보충한 CG 아가를 포함한 100 ㎜ 의 페트리 접시 (Falcon) 를 타이트레이션에 이용하였다. 아가를 부은 페트리 접시를 뚜껑을 연 채로 실온으로 20 분간 방치하여 아가를 고화시키고, 이어서 30 분간 안전 캐비닛 (SCV-1303EC II B : 히타치세이사쿠쇼) 내에서 멸균공기를 분사함으로써 건조시킨 후 4 ℃ 로 보존하였다. 사용 전에 그들을 냉장고에서 꺼내어 항온실에서 37 ℃ 로 1 시간 가온하였다.

파지액 2 ㎕ 을 SM 완충액 198 ㎕ (100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄, 0.01 젤라틴 (SIGMA), 50mM Tris-HCl pH 7.5) 과 혼합하였다. 이 희석액을 10⁴로 표시하였다. 이 희석액의 10 ㎕ 을 파종했을 때에 플레이트상의 1 개의 플라크는 원래의 파지 원액에 있어서의 10⁴pfu/㎖ 과 같기 때문이다. 동일한 방법으로 SM 완충액에 의해 10⁹까지의 단계적 희석액을 조제하였다.

10 ㎕ 의 각 파지 희석액을 90 ㎕ 의 SM 완충액으로 희석시키고, 10 mM MgCl₂중의 세포 현탁액 100 ㎕ 과 혼합한 후, Thermo Alumi Bath ALB-120 메탈폴더 중에서 37 ℃ 로 15 분간 배양하였다.

CG 톱 아가 (0.8% Type I-B Agarose(SIGMA), 40 Capsules/L of CircleGrow) 를 마이크로웨이브 스토브에서 녹여 0.4% 이하의 최종농도로 20% 말토오스를 보충한다. 3ml 분량의 톱 아가로오스를 스크류뚜껑이 있는 16 x 125mm Tissue Culture Tube (FALCON) 에 넣고 Thermae Alumi Bath AB-120 에서 148℃ 로 사용전까지 보존한다.

각 플레이팅 조성물을 용해시킨 아가로스를 포함한 상기 튜브에 첨가하고, 튜브를 5 회 상하 반전시켜 신속히 혼합한 후, 25 ㎍/㎖ 의 테트라 싸이클린을 보충한 건조 CG 아가의 100 ㎜ 플레이트에 부었다. 플레이트를 움직이기 전에 3 분간에 걸쳐 톱 아가를 완전히 고화시켰다. 플레이트를 뒤집어 37 ℃ 로 5 분간 배양하고, 이어서 실온으로 밤새 방치하였다. 플라크 수를 센 후, 플라크 총수에 희석배수를 곱함으로써 파지의 타이터를 계산하였다.

〈파지의 플레이팅 및 플라크의 막으로의 이전〉

플레이팅의 프로토콜은 파지의 타이트레이션에 대해 상기한 것과 기본적으로 동일하다. 한번에 12 개까지의 플레이트가 처리되었다. cDNA 라이브러리는 외상으로 사망한 75 세의 코카서스인 남성의 폐 (Clontech) 를 이용하고, λgt10 클로닝 벡터에 의해 올리고 (dT) 및 랜덤 프라이밍법을 이용하여 구축하였다.

최초의 스크리닝에서는 SM 완충액에 희석시킨 100 ㎕ 의 파지 라이브러리 (50,000 ∼ 500,000 pfu (플라크 형성단위) 를 함유) 를 등량의 10 mM MgCl₂중에 현탁시킨 세포와 혼합하여 37 ℃ 로 15 분간 배양한 후, 7 ㎖ 의 48 ℃ 의 CG 톱 아가에 첨가하여 5 회 상하 반전시켜 잘 혼합한 후, 25 ㎍/㎖ 의 테트라 싸이클린을 보충한 CG 아가 플레이트 (150 ㎜ : Falcon) 상에 부었다. 플레이트를 뒤집어 37 ℃ 로 5 분간 배양하고, 이어서 실온으로 밤새 방치하였다.

Hybond^TM-N+ (원형이 132 ㎜ 인 그리드가 딸린 양으로 대전한 나이론 막 (Amersham)) 을 플라크를 포함한 아가 플레이트상에 올렸다. 21G 바늘에 의해 필터의 배향을 3 점으로 마크한 후, 필터를 제거하여 위를 향하여 테이블상에 두어 적어도 3 분간 건조시켰다. DNA 고정화를 위해 필터를 0.4 M NaOH 액을 침투시킨 2 장의 Whatman 지(紙)상에 10 ∼ 30 분간 방치하였다. 세균의 쇄편(碎片) 및 알칼리를 제거하기 위해 막을 5 ×SSPE 완충액 (20 ×SSPE : 3.0 M NaCl, 0.2 M NaH₂PO₄, 0.02M EDTA, pH 7.4 (GibcoBRL)) 으로 철저히 2 회, 나아가 증류수로 1 회 세정하고, 종이 타올로 흡수한 후 실온으로 건조시켰다.

〈프로브의 표식화와 정제〉

Multiprime DNA 라벨링(labeling) 시스템 (Amersham) 을 프로브의 표식화에 이용하였다. 약 25 ng 의 집토끼 HCD20(11) 의 특이한 DNA 단편 (서열표의 서열번호 3) 을 포함한 1 ㎕ 의 프로브 용액을 넣은 4 개의 샘플의 각각을 26 ㎕ 의 물과 혼합하고, 98 ℃ 의 Thermo Alumi Bath ALB-120 중에서 5 분간 가열한 후 빙상에서 냉각시켰다. 시료를 18,000 ×g (TOMY MRX-150 고속 마이크로 냉동원심기로 15,000 rpm) 로 1 초간 원심시켜 튜브의 내용물을 하강시켰다. 각 반응물을 다음과 같이 뚜껑이 딸린 MicroAmp Reaction Tube 내에 넣어 빙상에 세트하였다. 즉, 변성 DNA 프로브의 전량, 10 ㎕ 의 표식화 완충액, 5 ㎕ 의 프라이머/BSA 용액, 6 ㎕ 의 ［α-³²P］dCTP (∼ 110 TBq/m㏖, 370 MBq/㎖) (Amersham), 및 2 ㎕ 의 Klenow 효소이다. 피펫으로 상하시킴으로써 조합물을 온화하게 혼합하고, GeneAmp PCR 시스템 2400 중에서 37 ℃ 로 30 분간 배양하고, 결합되지 못한 뉴클레오티드를 제거하여 하이브리다이제이션을 실시하기까지 20 ℃ 로 3 ∼ 4 시간 유지하였다.

QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen) 를 표식된 프로브의 정제에 이용하였다. 각 표식화 혼합물을 500 ㎕ 의 완충액 PN 을 포함하는 1.5 ㎖ 의 튜브 내에서 혼합하였다. QIAquick 스핀 칼럼을 미리 구비한 2 ㎖ 의 수집튜브 내로 넣었다. DNA 를 결합시키기 위해 시료를 QIAquick 스핀 칼럼에 적용한 후, 6000 rpm (TOMY MC-150 고속 마이크로 원심기) 으로 1 분간 원심시켰다. QIAquick 칼럼을 청정한 2 ㎖ 의 수집 튜브 내에 두고 그대로 지나쳤던 방사활성액을 나중에 DNA 로의 표식 수확을 계산하기 위해 보존하였다. QIAquick 칼럼의 세정을 위해 500 ㎕ 의 PE 완충액을 첨가하여 6000 rpm 으로 1 분간 원심시켰다. 통과한 액을 버리고 나아가 500 ㎕ 의 PE 완충액으로 재차 세정을 실시하였다. 통과한 액을 버리고 QIAquick 칼럼을 동일한 튜브로 복귀시켰다. 이 튜브는 비어 있어야 한다. 왜냐하면, 완충액 PE 로부터의 잔존 에탄올은 이 추가 원심 전에 통과액이 버려져 있지 않는 한 완전히는 제거되지 않기 때문이다. 칼럼을 추가로 1 분간 13,000 rpm 으로 원심시켰다. QIAquick 칼럼을 청정한 1.5 ㎖ 의 마이크로 원심 튜브 내에 넣었다. DNA 를 용출시키기 위해 100 ㎕ 의 완충액 EB (10mM Tris-HCl, pH 8.5) 를 칼럼의 중심에 첨가하여 1 분간 방치하고, 이어서 13,000 rpm 으로 1 분간 원심시켰다.

용출한 표식 DNA 의 각각을 뚜껑이 딸린 MicroAmp Reaction Tube 로 옮기고, GeneAmp PCR System 2400 중에 있어서 99.9 ℃ 으로 5 분간 가열한 후 4 ℃ 로 냉각시켰다. 변성된 프로브를 450 ㎕ 의 하이브리다이제이션 완충액을 포함한 1.5 ㎖ 의 튜브에 첨가하고, β(γ)Survey Meter TGS-133 (Aloka) 을 이용하여 표식 침투효율을 평가하고, 결합되지 못한 뉴클레오티드의 방사활성과 비교하였다.

〈플라크의 하이브리다이제이션〉

하이브리다이제이션과 필터 세정은 양성 플라크를 잘라내기 위한 필터의 정확한 위치결정을 위해 유리하도록 저온으로 실시하였다. 100 ㎖ 의 하이브리다이제이션 완충액을 다음과 같이 조제하였다. 즉, 50 ㎖ 의 뉴클레아제 및 프로테아제 시험이 완료한 탈이온화 포름아미드 (Nacalai Tesque), 25 ㎖ 의 20 ×SSPE 완충액 (3 M NaCl, 0.2M NaH₂PO₄, 20 mM EDTA, pH 7.4) (GibcoBRL), 5 ㎖ 의 10 % SDS, 18 ㎖ 의 물이다. 각각 200 ㎕ 의 10 ㎎/㎖ 의 Herring Sperm DNA 용액 (GibcoBRL) 및 0.8 ㎖ 의 물을 포함한 1.5 ㎖ 의 2 개의 튜브를 Thermo Alumi Bath ALB-120 중에서 98 ℃ 로 5 분간 가열하여 빙상에서 냉각시킨 후 하이브리다이제이션 완충액과 합쳤다. SDS 는 온도저하와 함께 침전하는 경향이 있기 때문에 하이브리다이제이션 완충액은 사용 직전에 약 40 ℃ 로 따뜻하게 하였다 (동계).

80 ㎖ 의 하이브리다이제이션 완충액을 150 ㎜ 의 둥근 플라스틱 용기에 부은 후 12 개의 필터를 각각의 막의 앞측 면이 옆 막의 앞측 면과, 그리고 이면이 옆 막의 이면과 접하도록 하나씩 주의하면서 침지시켰다. 뚜껑을 닫고 Thomastat Shaker T-22S 중에서 32 ℃, 40 rpm 의 조건으로 적어도 3 시간의 전(前) 하이브리다이제이션을 실시하였다.

하이브리다이제이션 완충액을 전 하이브리다이제이션을 실시한 필터로부터 별도의 150 ㎜ 의 둥근 플라스틱 용기 내로 옮겨 부어 하이브리다이제이션 완충액의 나머지 및 4 종류의 표식 프로브와 혼합하여 필터를 전술한 바와 같이 침지시켰다. 용기의 뚜껑을 닫고 Thomastat Shaker T-22S 중에서 32 ℃, 40 rpm 으로 밤새 하이브리다이제이션을 실시하였다.

별도의 뚜껑이 딸린 다른 플라스틱 용기에 넣은 필터를 Thomastat Shaker T-22S 중에서 40 rpm 으로 다음의 각 세정액으로 세정하였다.

1) 2 ×SSPE 완충액, 0.1 % SDS : 32 ℃, 10 분

2) 2 ×SSPE 완충액, 0.1 % SDS : 50 ℃, 1.5 시간

3) 0.5 ×SSPE 완충액, 0.1 % SDS : 50 ℃, 1.5 시간

잔존의 세정 완충액을 필터로부터 흡수한 후 적어도 1.5 시간 실온으로 건조시켰다. 12 장의 필터를 2 개의 35.6 ×43.2 ㎝ Fuji EC-A 카세트에 서열하여 Hyperfilm-MP X-ray film (Amersham) 을 3 ∼ 4 일간 노광시켰다.

〈파지의 회수〉

X 선 필름을 현상하고 조명에 Bright Light Box 를 이용하여 위치결정 마크에 따라 양성 플라크의 위치를 결정하였다. X 선 필름상의 각 양성 시그널을 그 중심에 일치시키고, 각각 5 ×5 ㎜ 의 전상(栓狀)에 톱 아가로스를 21G 의 바늘로 잘라내고, 각 0.3 ㎖ 의 SM 완충액을 포함하는 뚜껑이 딸린 4 ㎖ 의 샘플 바이엘에 넣었다. 파지를 4 ℃ 로 1 일간 용출시켰다.

〈파지의 제 2 스크리닝〉

파지의 2 회째 스크리닝은 1 회째에 대해 상기한 것과 기본적으로 동일하다. 예비적 조절 후는 이제 평판배양을 위해 파지 용출액을 타이트레이션 할 필요는 없었다. 게다가 150 ㎜ 의 페트리 접시 당 0.0001 ㎕ 의 파지 용출액에 대응하는 파지량이 대부분의 경우 적당함이 판명되었다. 개개의 플라크를 0.2 ㎖ 의 SM 완충액으로 4 ℃ 로 1 일간 용출시키고, 14 ㎕ 의 DMSO (디메틸술폭시드) 를 첨가하여 파지 DNA 의 증식 및 정제까지 -70 ℃ 로 보존하였다.

〈파지 DNA 의 조제〉

파지 평판배양 단계의 전날 아침에 1 개의 콜로니를 CG 아가 플레이트로부터 채취하고, 0.4 % 말토스와 25 ㎍/㎖ 테트라 싸이클린을 보충한 3 ㎖ 의 CG 브로스 (40 캡슐/L CircleGrow) 에 파종하여 진탕하면서 37 ℃ 로 배양하였다. 같은 날 저녁에 50 ㎕ 의 배양물을 47 ㎖ 의 미리 가온한 동일한 증식배지에 첨가하여 세게 교반하면서 37 ℃ 로 밤새 배양하였다. 다음 날 아침, 멸균한 50 ㎖ 의 뚜껑이 딸린 폴리카보네이트 원심병 (Beckman) 으로 배양물을 옮겨 Beckman JA 20 rotor 를 이용하여 Beckman J2-MC 원심기에 의해 3,000 rpm 으로 10 분간 4 ℃ 로 원심시켰다. 얻어진 세포 펠릿을 4.5 ㎖ 의 냉각시킨 무균의 10 mM MgSO₄에 재현탁시킨 후 빙상에 두었다.

25 ㎍/㎖ 의 테트라 싸이클린을 보충한 1.2 % CG 아가로스 GP-36 을 포함한 150 ㎜ 페트리 접시 (Falcon) 를 파지의 증식에 이용하였다. 아가를 부은 페트리 접시는 고화한 후는 건조시키지 않았다. 그들은 냉동고에 보존하고 그리고 사용 전에 37 ℃ 의 항온실 중에서 1 시간 가온하였다.

약 5 ×10⁶pfu 를 포함하는 파지 용출액의 50 ㎕ 을 450㎕ 의 SM 완충액 및 500 ㎕ 의 세포 현탁액과 잘 혼합하여 37 ℃ 로 15 분간 배양하고, 6 ㎖ 의 용융 아가로스와 혼합한 후 페트리 접시 위에 펼쳤다. 3 분 후 페트리 접시를 뒤집어 37 ℃ 로 약 8 시간 배양하였다.

파지를 용출시키기 위해 각 플레이트를 8 ㎖ 의 SM 완충액 및 200 ㎕ 의 클로로포름으로 덮어 회전 혼합기 R-20 mini (Taitec) 에 고정시켜 150 rpm 으로 4 ℃ 로 밤새 진탕하였다.

파지 용출액을 15 ㎖ 의 원추형 원심 튜브 (Greiner) 로 옮긴 후, 플레이트를 더욱 2 ㎖ 의 SM 완충액으로 실온으로 1 시간 세정하였다. 이 2 번째 용출액을 최초의 것과 합쳐 튜브를 3500 rpm 으로 10 분간 원심시켰다 (TOMY TS-7 로터 : TOMY LC-122 저속 원심기).

QIAGEN Lamda Mini Kit (QIAGEN) 를 파지 DNA 정제에 이용하였다. 징명화(澄明化)한 플레이트 용해물 8 ㎖ 를 새로운 15 ㎖ 의 원추형 원심 튜브로 옮겨 25 ㎕ 의 완충액 L 1 (300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.2 ㎎/㎖ BSA, 20 ㎎/㎖ 의 RNase A 및 6 ㎎/㎖ 의 DNase I) 과 혼합한 후, Thermo Alumi Bath ALB-120 (Iwaki) 중에서 37 ℃ 로 30 분간 배양하였다. 용해물을 1.6 ㎖ 의 냉각시킨 완충액 L 2 (30 % 폴리에틸렌 글리콜 PEG 6000, 3M NaCl) 과 혼합하여 빙상에서 60 분간 배양하였다. 튜브의 내용물을 16 ×76 ㎜ 의 원심 튜브 (Beckman) 로 옮긴 후, L70 초원심기 (Beckman) 의 50 Ti rotor 로 15,000 rpm, 4 ℃ 로 15 분간 원심시켰다. 상청을 제거하고 튜브를 1 분간 도치시켜 남은 액체를 잘랐다. 앞 단계에서 실시된 PEG 침전에 의해 형성된 파지 침전물을 볼 수 없었다. 투명하며 또한 튜브의 벽면에 분포하고 있었기 때문이다. 거기서, 펠릿의 완전한 재현탁을 확실하게 하기 위해 0.65 ㎖ 의 완충액 L 3 (100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM EDTA) 을 튜브 벽에 피펫으로 수회 뿌린 후 2 ㎖ 의 세이프로크 튜브로 (Eppendorf) 옮겼다. 등량의 완충액 4 (4 % 도데실 황산나트륨) 를 튜브에 첨가하여 온화하게 교반하고, Thermo Alumi Bath ALB-120 중에서 70 ℃ 로 10 분간 가열하고 이어서 빙상에서 냉각시켰다. 0.65 ㎖ 의 완충액 L 5 (3 M 아세트산칼륨, pH 5.5) 를 튜브에 붓고 바로 그러나 온화하게 교반하여 4 ℃ 로 30 분간 15,000 으로 원심시켰다 (고속 마이크로 냉동원심기 MRX-150 (TOMY)). 상청을 새로운 2 ㎜ 의 튜브로 옮겨 실온으로 10 분간, 15,000 rpm 으로 재원심시켜 모든 잔존하는 현탁물질을 제거하였다.

원심이 실시되고 있는 동안 QIAGEN-tip 20 을 폐액 트레이상의 QIArack 1 안에 넣은 후, 1 ㎖ 의 완충액 QBT (750 mM NaCl, 50 mM MOPS, pH 7.0, 15 % 에탄올, 0.15 % Triton X-100) 로 칼럼을 평형화하였다. QIAGEN-tip 이 완충액을 완전히 흘려 보내는 것에 맡겼다. 수지 베드(bed)는 어느 정도의 완충액을 유지하고 용이하게는 건조시키지 않기 때문에 QIAGEN-tip 으로부터 눈을 떼어도 된다.

상청을 즉시 QIAGEN-tip 로 적용한 후 중력에 따라 수지를 통하여 흘렸다. 칩을 1 ㎖ 의 완충액 QC (1.0 M NaCl, 50 mM MOPS, pH 7.0, 15 % 에탄올) 로 2 회 세정하였다. QIArack 1 의 상측 부분에서 청정한 1.5 ㎖ 튜브를 부착한 하측 랙을 덮은 후 DNA 를 0.75 ㎖ 의 완충액 QC (1.25 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.5, 15 % 에탄올) 로 2 회, 2 개의 다른 1.5 ㎖ 마이크로 원심 튜브 (Treff Lab.) 내로 용출시켰다.

0.7 액량의 이소프로판올로 DNA 를 침전시킨 후 15,000 rpm 으로 30 분간 실온으로 원심시켰다. 상청을 주의 깊게 제거해 버렸다. DNA 의 펠릿을 0.5 ㎖ 의 실온 하의 70 % 에탄올로 간단히 세정하고 이어서 재원심시켰다. 실온 하의 70 % 에탄올에 의한 세정을 반복하였다. 에탄올을 완전히 제거하였다. 펠릿을 5 분간 간단히 바람 건조시켜 각 튜브 내의 DNA 를 18 ㎕ 의 NaOH (pH8) 에 용해시킨 후 동일한 DNA 를 포함한 2 개의 튜브 내용물을 합쳤다.

〈파지 삽입물의 재클로닝〉

파지 삽입물의 서열을 조사하기 위해 적당한 클론으로부터 얻어진 DNA 단편을 pUC18 벡터에 재클론하였다.

36 ㎕ 의 λDNA 용액을 4.5 ㎕ 의 10 ×H 완충액 및 4.5 ㎕ 의 EcoRI (10 U/㎕) (Takara) 와 혼합하였다. 37 ℃ 로 밤새 소화를 실시하고 이어서 혼합물을 3 개의 웰로 나누고, 1 % 아가로스 GP-36 겔을 이용하여 50 V 로 50 분간 전기영동을 실시하였다. 적절한 밴드를 잘라내어 동일한 파지 클론으로부터의 DNA 를 갖는 겔 편(片)을 합쳤다.

삽입물을 「PCR 단편의 정제」 란에 기술한 바와 같이 하여 QIAEX II Gel Extraction Kit 로 정제하였다. 100 Bp 부터 4 kb 의 DNA 단편에 대해 완충액 QX1 의 3 배량을 1 배량의 겔에 첨가하였다. 30 초간 소용돌이 상태로 교반하여 QIAEX II 를 재현탁시킨 후 각 샘플에 10 ㎕ 의 수지를 첨가하였다. 혼합물을 Thermo Alumi Bath ALB-120 (Iwaki) 중에서 50 ℃ 로 12 분간 배양하였다.

샘플을 2 분마다 짧게 소용돌이 상태로 교반하였다. 튜브를 18,000 ×g (TOMY MRX-150 고속 마이크로 냉동원심기에서는 15,000 rpm) 로 1 분간 원심시켜 상청을 버렸다. 완충액 QX1 의 500 ㎕ 를 각 DNA 함유 펠릿에 첨가하여 간단히 소용돌이 상태로 교반하고, 18,000 ×g 로 1 분간 원심시킨 후 상청을 완전히 제거하였다. 완충액 PE 의 500 ㎕ 를 각 DNA 함유 펠릿에 첨가하여 간단히 소용돌이 상태로 교반하고, 18,000 ×g 로 1 분간 원심시킨 후 상청을 완전히 제거하였다. 이 세정단계를 다시 한번 반복하였다. 펠릿을 하얗게 되기까지 25 ∼ 30 분간 바람 건조시켰다. 펠릿의 지나친 건조는 회수율을 저하시키기 때문에 진공 건조처리는 피했다. 순수(純水)를 각 샘플에 첨가하여 펠릿을 교반하여 재현탁시키고, 때때로 교반하면서 혼합물을 5 분간 실온으로 배양하였다. 샘플을 18,000 ×g 로 1 분간 원심시킨 후 DNA 를 함유하는 상청을 청정한 튜브에 옮겼다. 이 단계를 샘플을 50 ℃ 로 배양하면서 반복하였다. 동일한 DNA 단편으로부터의 1 회째 및 2 회째의 DNA 추출물을 합쳤다. 정제한 DNA 단편을 벡터 DNA 와 바로 라이게이션하거나 또는 -20 ℃ 로 저장하였다.

용출한 단편의 5 ㎕ 을 15 ㎕ 의 물과 혼합하여 Ready-To-Go pUC18 EcoRI/BAP+Ligase (Pharmacie Biotech) 의 튜브에 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 3 분간, 이어서 16 ℃ 로 0.5 ∼ 3 시간, MIR-153 인큐베이터 (Sanyo) 내에서 배양하였다.

100 ㎕ 의 DH5 Competent High Cells (토요보오) 을 포함한 1 개의 튜브를 해동시키고 교반하여 세포를 균일하게 현탁시켰다. 10 ∼ 25 ㎕ 의 컴피턴트(cpmpetent)한 세포를 미리 냉각시켜둔 1.5 ㎖ 의 각 튜브에 피펫으로 첨가하였다. 라이게이션 혼합물의 1/50 을 세포에 직접 첨가하고 온화하게 교반하여 혼합하였다. 모든 세포를 일시에 사용하였다. 동결 및 해동의 싸이클 반복에 의해 형질전환 효율의 중대한 손실이 관찰되었기 때문이다. 튜브를 빙상에 30 분간 방치하였다. Thermo Alumi Bath ALB-120 중에서 세포에 정확히 45 초간 42 ℃ 의 히트 쇼크를 가해 30 초간 빙상에 두었다. 10 배량의 실온의 SOC 배지를 각 튜브에 첨가했다. 튜브를 37 ℃ 로 1 시간 방치하였다. 형질전환체의 1/10 을 1.4 % 의 Bacto-Agar (Difco), 40 캡슐/L 의 CircleGrow (Bio 101, Inc.) 및 100 ㎕/㎖ 의 앰피실린(ampicillin)을 함유하는 플레이트상에 펼쳤다. 플레이트를 37 ℃ 로 밤새 배양하였다.

〈플라스미드 DNA 의 정제〉

각 플레이트로부터 형질전환체를 포함한 2 개의 콜로니를 멸균 투스픽 (toothpick) 을 이용하여 채취하였다. 세균을 100 ㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 2.5 ㎖ 의 CircleGrow 배지 (40 캡슐/L) 를 포함한 뚜껑이 딸린 14 ㎖ 의 폴리프로필렌 튜브 (Falcon) 로 옮겼다. 튜브를 200 rpm, 37 ℃ 로 16 ∼ 72 시간 진탕시켰다 (1 일의 배양에 의해 최고집율로 플라스미드 DNA 를 부여함).

RPM AFS Kit (Bio 101, Inc.) 를 세균 배양물로부터의 이중쇄 DNA 의 신속 단리, 정제에 이용하였다. 한번에 12 종류에서의 플라스미드 DNA 가 정제되었다. 세균을 2 ㎖ 의 Safe-Lock 튜브 (Eppendorf) 중에서 18,000 ×g 로 (TOMY MRX-150 고속 마이크로 냉동원심기로 15,000 rpm) 1 분간 원심시켰다. 상청을 버렸다. 세포를 1 ㎖ 의 수중에서 소용돌이 상태로 교반함으로써 재현탁하여 다시 원심시켰다. 상청을 버렸다. 세포가 완전히 재현탁하기까지 각 세포 펠릿을 200 ㎕ 의 Pre-Lysis 완충액 ＃1 중에서 소용돌이 상태로 교반함으로써 재현탁시켰다. 400 ㎕ 의 Alkaline Lysis Solution ＃2 를 세포 현탁액에 직접 첨가한 후 튜브를 온화하게 15 회 상하 반전시켰다. 1 분 후에 300 ㎕ 의 빙냉 Neutralizing Solution ＃3 을 첨가한 후, 균일한 백색 석출물이 형성되기까지 튜브를 3 ∼ 5 회 세게 진탕시켰다. 이 혼합물을 빙상에서 5 분간 배양하고 실온에서 5 분간 원심시킨 후 상청을 새로운 2 ㎖ 튜브로 옮겼다.

500 ㎕ 의 Glassmilk SpinBuffer ＃4 를 상청에 첨가하여 Glassmilk 에 효율 있게 결합하도록 5 분간 상하 반전시켜 18,000 ×g 로 2 초간 원심시켰다. 상청을 버렸다. Glassmilk/DNA 복합체의 각각을 500 ㎕ 세정액 (Wash Solution) ＃5 중에서 피펫 칩으로 온화하게 교반하고 이어서 피펫으로 상하시킴으로써 재현탁시킨 후, 그 키트에 부속의 RPM AFS 스핀 필터 (Spin Filter) 로 옮겼다. 필터를 10 초간 원심시키고 펠릿을 건조시키지 않고 펠릿의 수준까지 세정액의 수준을 저하시켰다. 캐치 튜브 (Catch Tube) 를 비운 후 스핀 필터를 재부착하였다. 500 ㎕ 의 세정액을 각 스핀 필터에 첨가하고 이어서 2 분간 원심시켜 필터 내용물을 「건조」 시켰다. 스핀 필터를 키트에 부속의 새로운 RPM AFS 캐치 튜브로 옮겼다. 140 ㎕ 의 용출액 ＃8 (RNase/DNase/피로겐 모두를 포함하지 않는 물) 을 각 샘플에 첨가한 후 Classmilk/DNA 복합체를 손가락으로 가볍게 두드려 슬러리 형상이 되기까지 혼합하였다. 플라스미드 DNA 를 15,000 rpm 으로 3 분간의 원심에 의해 캐치 튜브 내로 모았다. 이들 DNA 용액은 -20 ℃ 로 저장하였다.

〈DNA 삽입물의 확인〉

삽입물의 존재와 DNA 서열결정을 위한 DNA 용액의 적당량을 제한효소로 소화시킨 플라스미드 DNA 의 아가로스 전기영동에 의해 결정하였다. 2 ul 의 플라스미드 DNA 용액을 11.3 ㎕ 의 물, 1.5 ㎕ 의 10 ×희석 H Universal 완충액 (0.5 M Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 M NaCl), 0.2 ㎕ 의 EcoRI (10 U/㎕) (TAKARA 로부터 입수) 와 혼합하여 적어도 2 시간 37 ℃ 로 배양하였다.

1 % 아가로스 GP-36 (Nacalai Tesque), 0.5 ㎕/㎖ 에치듐 브로마이드 (Sigma), 및 0.5 ×TBE 완충액을 함유하는 혼합물을 마이크로 웨이브오븐으로 용융시킴으로써 분리용 겔을 조제하고, 이 용액을 Mupid-2 Mini-Gel 전기영동 시스템 (Advance) 의 형에 부은 후 실온으로 적어도 30 분간에 걸쳐서 고화시켰다.

소화시킨 플라스미드 DNA 의 각각의 전량을 1.5 ㎕ 의 10 ×시료첨가 완충액 (50 % 글리세롤, 0.01 % 브롬페놀 블루) 과 혼합하여 겔에 적용하였다. DNA 분자량 표준 마커로서 pHY 마커 (TAKARA) 를 이용하였다. 겔 전기영동은 완충액 챔버에 0.5 ×TBE 완충액을 넣은 Mupid-2 Mini-Gel Electrophoresis System 을 이용하여 100 V 로 30 분간 실시하였다.

FAS-II (토요보오) 를 이용하여 영동상을 얻었다 : 겔을 자외선 투과 조명장치 (Electronic U.V. Transilluminator) 로 조명하고, 사진을 XC-75/75CE CCD Video Camera Module (SONY) 로 촬영한 후 Video Graphic Printer UP-880 (SONY) 로 프린트아웃하였다. 적절한 길이의 삽입물을 포함한 클론으로부터의 DNA 를 최종확인을 위해 DNA 서열결정용으로 선택하였다.

〈DNA 서열결정용의 샘플 작성〉

AmpliTaq DNA 폴리머라제, FS 를 이용한 ABI PRISM^TMDye Terminator Cycie Sequencing Ready Reaction Kit 를 DNA 서열결정에 이용하였다. 18 개까지의 PCR 반응을 한번에 진행시켰다. 뚜껑이 딸린 MicroAmp 반응 튜브 (Perkin Elmer) 내에서 반응 혼합물을 다음과 같이 하여 조제하였다 : 즉, 8 ㎕ 의 Terminator Ready 반응 혼합액, 2 ㎕ 의 M13 유니버설 서열결정 프라이머는 M13 반대방향 서열 프라이머 (2 ㎛), 0.1 ∼ 0.5 ㎍ 의 플라스미드 DNA (DNA 액의 필요량은 전기영동도로부터 견적하였다), 및 물을 첨가하여 최종 액량 20 ㎕ 으로 하였다. 조합물을 피펫으로 상하시켜 충분히 혼합하였다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9600 서멀 싸이클러 (Perkin Elmer) 중에서 다음과 같이 증폭 싸이클을 이용하여 실시하였다.

［25 싸이클 반복］

10 초 : 96 ℃ (변성)

5 초 : 50 ℃ (어닐링)

4 분 : 60 ℃ (연장)

［최종 단계］ 4 ℃ (보존)

PCR 산물을 에탄올 침전으로 정제하였다. 각 반응물에 대해 2 ㎕ 의 3M 아세트산 나트륨 (pH 5.2) 및 50 ㎕ 의 99.5 % 를 첨가함으로써 1.5 ㎖ 의 마이크로 원심 튜브를 준비하였다. 반응 튜브의 20 ul 의 내용물 전부를 이 에탄올 용액을 포함하는 마이크로 원심 튜브로 옮겼다. 튜브의 용액을 소용돌이 상태로 교반한 후 빙상에 10 분간 두었다. 이어서 혼합물을 18,000 ×g (TOMY MC-150 고속 마이크로 원심기로 15,000 rpm) 으로 4 ℃ 로 20 분간 원심을 실시하였다. 에탄올 용액을 마이크로 피펫으로 주의 깊게 흡인하였다. 250 ㎕ 의 70 % 에탄올을 첨가함으로써 펠릿을 씻어내고 15,000 rpm 으로 1 분간 원심시켰다. 펠릿을 혼란시키지 않도록 주의 깊게 마이크로 피펫으로 알코올 용액을 흡인하였다. 진공 하에 10 분간 튜브를 건조시켰다. 건조시킨 침전은 바로 사용하거나 또는 -20 ℃ 로 저장하였다.

〈DNA 서열결정〉

373-18 DNA 시퀀서 (Applied Biosyatems) 를 플라스미드 DNA 의 서열결정에 이용하였다. 유리의 청정도가 신뢰할 수 있는 정확한 서열결정에 중요하기 때문에 유리 기구류를 물로 주의 깊게 세정하고 이소프로필 알코올로 닦았다. 8.3 M 우레아를 포함한 4.75 % 의 변성 PAAG 를 PCR 산물의 분리에 이용하였다. 50 ㎖ 의 원심 튜브 내에 있어서 19.94 g 의 우레아를 4.75 ㎖ 의 40 % 의 (19 : 1) Acrylamide/Bio Solution (Bio-Rad Laboratories) 및 8 ㎖ 의 5 ×TBE 완충액과 혼합한 후 증류수로 40 ㎖ 로 하였다. 시료 튜브를 세게 교반하고, 마이크로 웨이브오븐으로 수용 접시가 1 회전하는 동안 따뜻하게 하여 모든 우레아 결정이 용해되기까지 더욱 세게 교반하였다. 겔 성형장치를 준비하는 동안 A-3S Aspirator 를 구비한 데시케이터 내에서 용액을 (약 10 분간) 탈기하였다. 18 ㎕ 의 TEMED (Sigma) 및 170 ㎕ 의 10 % 과황산 암모늄 (Sigma) (-20 ℃ 로 저장) 을 첨가하여 30 초간 온화하게 혼합하여 유리 플레이트형 (420 ×250 ×0.25 ㎜) 내로 부었다. 겔을 실온에서 2 ∼ 5 시간 방치하여 고화시켰다.

50 mM EDTA (pH8.0) 중의 10 ㎕ 의 3 % 블루 덱스트런 (Sigma) 과 52 ㎕ 의 포름아미드와 혼합함으로써 시료첨가 완충액을 조제하였다. 서열결정 샘플을 이 완충액 3 ㎕ 에 용해시키고 Thermo Alumi Bath ALB-120 (Iwaki) 중에서 94 ℃ 로 2 분간 가열한 후 빙상에 유지시켰다. 겔을 구비한 유리 플레이트를 다시 한번 주의 깊게 씻고 스캐닝에 의해 첵크하여 전기영동 챔버를 조립하였다. 빗살 (Shark teeth comb) 을 1 ㎜ 의 깊이로 삽입하여 1 ×TBE 완충액을 양쪽의 완충액 챔버에 부은 후 20 ∼ 30 분간 전(前)전기영동을 실시하였다. PMT 전압을 900 V 로 세트하여 운전 파라미터를 2500 V, 20 ㎃, 및 30 W 로 세트하였다. 시린지를 이용하여 웰을 1 ×TBE 완충액으로 주의 깊게 세척하고, 샘플을 홀수 웰에 첨가하여 5 분간 전기영동을 실시하였다. 웰을 다시 한번 세정하고, 샘플을 짝수 웰에 첨가하여 9 시간 전기영동을 실시하였다. 영동개시 후 바로 데이터 수집 컴퓨터 프로그램을 스타트시켰다.

분석 컴퓨터 프로그램은 데이터 수집 종료 후에 자동적으로 작동하였다. 소프트웨어의 잘못은 매뉴얼로 보정하였다. 뉴클레오티드 서열의 최초의 분석은 DNASIS 소프트웨어를 이용하여 실시하였다.

〈차례대로 포개진 결실체의 구축〉

재클론된 DNA 삽입물의 서열결정을 위해 이중쇄 DNA 중에 단일 방향만의 결실부위를 구축하기 위해 엑소뉴클레아제 III 에 의한 DNA 의 제어된 소화를 이용하였다. 이 효소는 이중쇄 DNA 에만 작용하는 3’-엑소뉴클레아제이며 평활말단 및 5’-돌출말단은 소화를 받는반면, 3 염기 이상의 길이인 3’-돌출말단은 이 효소에는 저항성이다. 그리고, 인산염 골격 중의 포스포로티오에이트 결합은 엑소뉴클레아제 III 의 소화에 저항성이 있기 때문에 티오뉴클레오티드로 「채워진」 후퇴 3’-말단 (즉, 5’-돌출말단) 도 또한 소화에 저항한다. 당해 유전자의 각 DNA 영역을 포함한 적어도 2 개의 독립한 클론을 양단으로부터의 결실체를 만들어 내기 위해 Double-stranded Nested Deletion Kit (Pharmacia Biotech) 를 사용하였다.

적절한 제한효소는 DNA 삽입물을 절단해서는 안된다. 3’- 및 5’-돌출말단 또는 평활말단을 발생시키는 적절한 제한효소의 쌍을 이용할 수 있는 경우에는, 2 ㎍ 의 정제 플라스미드 DNA 를 그들 효소로 적어도 3 시간 소화시켰다. 소화의 진행을 아가로스겔 전기영동으로 모니터하는 데에는 2 ㎍ 의 시료를 이용하였다. 양쪽의 소화가 완료했을 때 DNA 샘플을 70 ℃ 로 10 분간 가열함으로써 효소를 실활(失活)시킨다.

적절한 제한효소의 쌍을 발견할 수 없는 경우 및 3’-돌출말단을 발생시키는 엔드뉴클레아제가 없는 경우, 티오뉴클레오티드에 의한 말단보호를 방법으로서 선택하였다. 그와 같은 방법은 2 ㎍ 의 플라스미드 DNA 용액을 10 ㎕ 의 용액 중에서 제 1 제한효소로 소화시켰다. 이 반응액의 최대 3 ㎕ 까지를 반응의 진행을 모니터하는데에 이용하였다. FPLCpure Klenow 단편 (1 단위/㎕) 을 20 ㎕ 의 1 ×Klenow 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5 ; 10 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT) 과 혼합함으로써 희석시킨 Klenow 단편 (0.05 단위/㎕) 을 조제하였다. 다음 것을 1.5 ㎖ 의 마이크로 원심 튜브에 첨가하였다. 즉, 7 ㎕ 의 제한효소 소화 DNA, 1 ㎕ 의 10 ×Klenow 완충액, 1 ㎕ 의 dNTPαS 혼합액 (dATPαS, dCTPαS, dGTPαS 및 dTTPαS 의 각 400 uM 을 포함한 수용액), 및 1 ㎕ 의 희석시킨 Klenow 단편이다. 튜브를 온화하게 교반하고, 간단히 원심시킨 후 37 ℃ 로 15 분간 배양하였다. 반응물을 65 ℃ 로 20 분간 가열하고 이어서 20 ㎕ 의 NaCl/글리코겐 (250 mM 의 NaCl 과 250 ng/㎕ 의 글리코겐을 포함한 수용액) 및 75 ㎕ 의 에탄올을 첨가하였다. 혼합물을 드라이아이스상에 10 분간 방치하거나 또는 -80 ℃ 로 적어도 1 시간 냉각시켰다. 침전한 DNA 를 4 ℃ 로 10 분간, 15,000 rpm 의 원심을 실시함으로써 수집하였다. 상청을 주의 깊게 제거하여 버렸다. 펠릿을 250 ㎕ 의 70 % 에탄올로 씻어 1 분간 원심시켰다. 상청을 주의 깊게 제거하여 펠릿을 진공 하에 5 분간 건조시킨 후 10 ㎕ 의 물에 재용해시켰다. DNA 를 최종반응 용량 20 ㎕ 중에서 제 2 제한효소에 의해 소화시키고 70 ℃ 로 10 분간 가열하여 효소를 실활시켰다.

마이크로 원심 튜브 중에 S1 뉴클레아제/완충액 혼합액을 다음과 같이 조정하였다. 즉, 33 ㎕ 의 S1 완충액, 66 ㎕ 의 증류수 및 1 ㎕ 의 S1 뉴클레아제이다. 이 혼합물의 3 ㎕ 를 피펫으로 20 개의 마이크로 원심 튜브의 각각에 옮기고 빙상에 두었다.

적절한 NaCl 농도의 2 ×ExoIII 완충액 24 ㎕ 를 조제하였다. NaCl 농도는 2 회 소화된 DNA 의 등량으로 희석되었을 때에 75 mM 또는 그 이하가 되도록 하지 않으면 안된다.

1.5 ㎖ 의 마이크로 원심 튜브 중에서 20 ㎕ 의 2 ×ExoIII 완충액을 20 ㎕ (2 ug) 의 2 회 소화된 DNA 와 혼합하고, Thermo Bath ALB-120 중에서 30 ℃ 로 2 ∼ 3 분간 평형화시켰다. 2 ㎕ 의 시료를 「시간 = 0」 의 컨트롤 샘플로서 채취한 후 3 ㎕ 의 S1 뉴클레아제/완충액을 포함한 적당한 튜브에 넣어 잘 혼합하고 빙상에 두었다.

1 ㎕ 의 엑기소뉴클레아제 III 를 첨가하고 온화하게 혼합하여 30 ℃ 로 배양을 계속하였다. 5 분마다 2 ㎕ 의 샘플을 반응물로부터 채취하여 바로 3 ㎕ 의 S1 뉴클레아제/완충액과 충분히 혼합하였다. 이들 튜브는 모두 엑기소뉴클레아제 III 반응물로부터 모든 시간경과에 따른 샘플을 채취하여 끝날 때까지 빙상에 유지시켰다.

모든 시간경과에 따른 샘플을 채취하여 S1 뉴클레아제/완충액과 혼합이 끝난 후 그들을 동시에 실온으로 30 분간 배양하였다.

1 ㎕ 의 S1 뉴클레아제 정지용액을 각 샘플에 첨가하고, 튜브를 65 ℃ 로 30 분간 배양하였다. 시간경과에 따른 샘플의 반을 결실체의 전기영동 분석에 이용하고, 나머지 반을 라이게이션에 의한 재환상화(再環狀化)에 이용하였다. 이들 2 개의 공정은 모든 시료에 대해 동시에 평행하게 실시하고, 그리고 결실체 분석의 결과를 형질전환에 사용해야 할 재환상화 샘플의 선택에 이용하였다.

3 ㎕ 의 각 샘플을 2 ㎕ 의 시료 첨가 완충액 (50 % 글리세롤, 1 mM EDTA 및 0.01 % 브롬페놀 블루) 과 혼합하여 0.5 ㎕/㎖ 의 에티듐브로마이드를 포함하는 1 % 의 아가로스겔 (Agarose GP-36, Nacalai Tesqu) 에 의한 30 분의 전기영동에 의해 분석하였다.

전기영동이 진행하는 동안에 각 시간경과에 따른 샘플의 나머지 3 ㎕ 를 재라이게이션에 이용하였다. 라이게이션액의 조제는 1.5 ㎖ 의 마이크로 원심 튜브 중에서 다음의 것을 혼합함으로써 조제하였다. 즉, 40 ㎕의 10 ×라이게이션 완충액, 80 ㎕ 의 25 % PEG, 2 ㎕ 의 T4 DNA 리가아제, 및 218 ㎕ 의 증류수이다. 이 라이게이션 혼합액의 17 ㎕ 을 각 시간경과에 따른 샘플의 나머지 3 ㎕ 에 첨가하여 온화하게 혼합하고 실온으로 2 시간 배양하였다.

전기영동이 완료했을 때 문제의 결실체를 어느 시간경과에 따른 샘플이 포함되어 있는지를 결정하기 위해 겔을 검사하였다. 문제의 결실체를 포함한 샘플만을 E.coli 의 형질전환에 이용하였다. 2 ㎕ 의 라이게이션 반응물을 10 ㎕ 의 DH5 Competent High Cells (토요보오) 의 형질전환에 이용하였다. 형질전환은 상기 「파지 삽입물의 재클로닝」 란의 프로토콜에 따라 실시하였다. 얻어진 형질전환체의 전부를 1.4 % 의 Bacto-Agar (Difco), 40 캡슐/L 의 CircleGrow, L (Bio 101, Inc.) 및 100 ㎍/㎖ 의 앰피실린을 포함한 플레이트상에 펼쳤다. 이들을 37 ℃ 로 밤새 배양하였다. 각 플레이트로부터의 2 개의 콜로니를 증식시키고, EcoRI 제한효소 소화한 플라스미드 DNA 의 전기영동 및 계속되는 전술한 순서에 의한 DNA 서열결정에 의해 결실의 정도를 분석하였다. DNA 서열을 DNASIS 컴퓨터 프로그램과 링크시켜 전장 삽입물을 편집하였다.

〈서열결정 데이터의 컴퓨터 해석〉

뉴클레오티드 서열의 해석은 DNASIS 컴퓨터 프로그램 및 인터넷으로 입수가 가능한 다음의 소프트웨어를 이용하여 실시하였다. 즉, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), MOTIF (Protein Sequence Motif Search), PSORT (Prediction of Protein Sorting Signals and Localization Sites in Amino Acid Sequences), SOSUI (Prediction of Transmembrane Segments), SIM (Alignment Tool for Protein Sequences), 및 GeneStream align 이다.

〈노던(Northern) 하이브리다이제이션〉

1 레인 당 여러 가지 인간세포로부터의 polyA⁺RNA 약 2 ㎍ 을 포함한 Multiple Tissue Northern (MTN) 블로트 (Clontech) 를 상기 「플라크의 하이브리다이제이션」 란에 기재한 바와 같이 하여 집토끼의 HCD20(11) 특이한 DNA 프로브와 하이브리다이즈시켰다. BIOMAX MS scientific imaging film (Kodak) 을 이용하였다. 이유는 Hyperfilm-MP 보다 거의 8 배나 감도가 높기 때문이다. Fuji EC-A 카세트를 이용하여 80 ℃ 로 증감 스크린을 구비한 Fuji EC-A 카세트를 이용하여 필름을 막으로 3 주간 노광시켰다. 필름의 현상 전, 카세트를 실온으로 적어도 1 시간 따뜻하게 하였다.

본 발명은 인간성장 호르몬에 의해 발현이 조절되는 신규 유전자, 그것을 구성하는 DNA, 및 이것이 코딩하는 단백질을 제공한다.

〈110〉 JCR PHARMACEUTICALS CO., LTD.

〈120〉 GROWTH HORMONE-REGULATED GROWTH MARKER

〈130〉 1

〈150〉 JP 037617/99

〈151〉 1999-02-16

〈160〉 4

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 765

〈212〉 DNA

〈213〉 HOMO SAPIENS

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (85)..(363)

〈400〉 1

agcacggcgg cggcgtcgtc tcccggcagt gcagctgccg ctaccgccgc cctctgcccg 60

ccggcccgtc tgtctacccc cagc atg agc ggc ctg cgc gtc tac agc 108

Met Ser Gly Leu Arg Val Tyr Ser

1 5

acg tcg gtc acc ggc tcc cgc gaa atc aag tcc cag cag agc gag gtg 156

Thr Ser Val Thr Gly Ser Arg Glu Ile Lys Ser Gln Gln Ser Glu Val

10 15 20

acc cga atc ctg gat ggg aag cgc atc caa tac cag cta gtg gac atc 204

Thr Arg Ile Leu Asp Gly Lys Arg Ile Gln Tyr Gln Leu Val Asp Ile

25 30 35 40

tcc cag gac aac gcc ctg agg gat gag atg cga gcc ttg gca ggc aac 252

Ser Gln Asp Asn Ala Leu Arg Asp Glu Met Arg Ala Leu Ala Gly Asn

45 50 55

ccc aag gcc acc cca ccc cag att gtc aac ggg gac cag tac tgt ggg 300

Pro Lys Ala Thr Pro Pro Gln Ile Val Asn Gly Asp Gln Tyr Cys Gly

60 65 70

gac tat gag ctc ttc gtg gag gct gtg gaa caa aac acg ctg cag gag 348

Asp Tyr Glu Leu Phe Val Glu Ala Val Glu Gln Asn Thr Leu Gln Glu

75 80 85

ttc ctg aag ctg gct tgagtca agcctgtcca gagttcccct gctggactcc 400

Phe Leu Lys Leu Ala

90

atcaccacac tccccccagc cttcacctgg ccatgaagga ccttttgacc aactccctgt 460

cattcctaac ctaaccttag agtccctccc ccaatgcagg ccacttctcc tccctcctct 520

ctaaatgtag tcccctctcc tccatctaaa ggcaacattc cttacccatt agtctcagaa 580

attgtcttaa gcaacagccc caaatgctgg ctgcccccag ccaagcattg gggccgccat 640

cctgcctggc actggctgat gggcacctct gttggttcca tcagccagag ctctgccaaa 700

ggccccgcag tccctctccc aggaggaccc tagaggcaat taaatgatgt cctgttccat 760

tggcg 765

〈210〉 2

〈211〉 93

〈212〉 PRT

〈213〉 HOMO SAPIENS

〈400〉 2

Met Ser Gly Leu Arg Val Tyr Ser Thr Ser Val Thr Gly Ser Arg Glu

1 5 10 15

Ile Lys Ser Gln Gln Ser Glu Val Thr Arg Ile Leu Asp Gly Lys Arg

20 25 30

Ile Gln Tyr Gln Leu Val Asp Ile Ser Gln Asp Asn Ala Leu Arg Asp

35 40 45

Glu Met Arg Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Thr Pro Pro Gln Ile

50 55 60

Val Asn Gly Asp Gln Tyr Cys Gly Asp Tyr Glu Leu Phe Val Glu Ala

65 70 75 80

Val Glu Gln Asn Thr Leu Gln Glu Phe Leu Lys Leu Ala

85 90

〈210〉 3

〈211〉 505

〈212〉 DNA

〈213〉 ORYCTOLAGUS CUNICULUS

〈400〉 3

gttttttttt ttttttcagt ggaatgggca tttaattgtc tagggtgctc ccaggcaagg 60

gactgcgggc ctttggcaga gctctggctc aggaaccaag aagaggtgtc ctggtcagtg 120

ccaggcagag aggcggcagc cccaaggccg ggctgggacg gccagcactg gggctgctgc 180

ttaagacatt tcggagacgg agcggagaag aggcttggcc tggggagagg gtccccaagg 240

ccaaaaggtt aggaatgaca gggaagttgt cacaagtccc ttcgaggcca gttgaggcct 300

gcggggagaa catgtgaccg ggtccagggg aacccatcgg gggctggact cagccagctt 360

caggaactcc tgcagcgtgt tttgctccac agcctccacg aagagctcat agtccccgca 420

gtattggtcc ccgttgacga tctggggtgg gtgccttggg gttgcccgcc aaggctcgca 480

tctcatcccg cagggcgttg tcctg 505

〈210〉 4

〈211〉 17

〈212〉 DNA

〈213〉 M13

〈400〉 4

gtaaaacgac ggccagt 17

〈210〉 5

〈211〉 17

〈212〉 DNA

〈213〉 M13

〈400〉 5

caggaaacag ctatgac 17

Claims (16)

1. 서열표의 서열번호 1 에 나타내는 염기 서열을 갖는 DNA.
2. 서열표의 서열번호 2 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
3. 제 2 항에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 결실(缺失), 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 그 발현이 인간의 정상세포에 비해 인간의 종양세포에서 강화되는 것을 특징으로 하는 단백질.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 인간의 종양세포가 전골수구 백혈병세포, 만성 골수성 백혈병세포, 결장직장선 암세포, 폐암세포 및/또는 흑색종세포인 단백질.
5. 제 2 항에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 그 발현이 가령(aging)에 의해 강화되며, 또한 성장 호르몬 처리에 의해 어린 세포의 발현 수준으로 복귀되는 것을 특징으로 하는 단백질.
6. 제 3 항에 있어서, 그 발현이 가령에 의해 강화되고, 또한 성장 호르몬 처리에 의해 어린 세포의 발현 수준으로 복귀되는 것을 특징으로 하는 단백질.
7. 제 4 항에 있어서, 그 발현이 가령에 의해 강화되고, 또한 성장 호르몬 처리에 의해 어린 세포의 발현 수준으로 복귀되는 것을 특징으로 하는 단백질.
8. 제 2 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 기재된 단백질을 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA.
9. 제 1 항에 기재된 DNA 의 발현이 가능한 플라스미드.
10. 제 8 항에 기재된 DNA 의 발현이 가능한 플라스미드.
11. 제 1 항에 기재된 DNA 에 특이하게 하이브리다이즈할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
12. 제 8 항에 기재된 DNA 에 특이하게 하이브리다이즈할 수 있는 올리고뉴클레오티드.
13. 제 1 항에 기재된 올리고뉴클레오티드를 프라이머, 프로브 또는 마커로서 사용하는 것을 특징으로 하는 진단약.
14. 제 8 항에 기재된 올리고뉴클레오티드를 프라이머, 프로브 또는 마커로서 사용하는 것을 특징으로 하는 진단약.
15. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 단백질에 대한 항체.
16. 제 15 항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 진단약.