JP2000232886A

JP2000232886A - 成長ホルモン依存性遺伝子

Info

Publication number: JP2000232886A
Application number: JP11037617A
Authority: JP
Inventors: Junichi Koga; 淳一古賀; Keiko Kono; 恵子河野; Fiodooru N Zorotaryofu; フィオドールエヌゾロタリョフ
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1999-02-16
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 2000-08-29
Also published as: KR20000076670A; CA2296764A1; EP1029914A3; CN1266098A; EP1029914A2; AU1485200A

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト成長ホルモンにより発現が調節される新
規な遺伝子、それを構成するＤＮＡ、及びこれがコード
するタンパク質を提供することを目的とする。【解決手段】配列表の配列番号１に示す塩基配列を有
するＤＮＡ及びこれがコードする配列表の配列番号２に
示すアミノ酸配列を有するタンパク質、並びにこれらの
類縁体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト成長ホルモン
によりその発現が調節される遺伝子、該遺伝子を構成す
るＤＮＡ，及び該ＤＮＡがコードするタンパク質、並び
にこれらを用いた診断薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト成長ホルモン(hＧＨ)は、その成長
促進効果のために、成長ホルモン（ＧＨ）分泌不全症小
児やターナー症候群小児、慢性腎疾患の小児など治療薬
［Neely E.K.,and Rosenfeld R.G.,Ann.Rev.Med. 45:40
7-420 (1994)］として世界的に繁用されている。ＧＨは
多様な生理作用を示し、成長、代謝、分化等に関する多
数の遺伝子の組織特異的な発現を調節している。また、
細胞増殖や遺伝子発現に対するＧＨ効果のあるものは、
性に依存しており、又は、下垂体のＧＨ分泌パターンに
調節されている。ＧＨ等の成長因子は、細胞膜にある受
容体への結合を経て、細胞内のシグナルトランスダクシ
ョン経路のＳＴＡＴ（Signal Transducerand Activator
of Transcription）をリン酸化し、その情報を核に伝
達する。しかしながら、核遺伝子に対するＧＨの作用
は、未だ解明されていない[Garry B.Udy, et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94: 7239-7244 (199
7)]。

【０００３】近年、ＧＨ分泌不全症や分泌過剰症の患者
に心機能の障害が認められたことから、心臓の機能及び
構造へのＧＨ／ＩＧＦ−１の作用が研究の対象となって
きた。特に、心機能の発達調節にＧＨ又はＩＧＦ−１が
関与していることが示唆されている［Gaetano Lombardi
et al., Journal of Pediatric Endocrinology & Meta
bolism, 10: 553-560 (1997)］。この心機能の障害は、
ＧＨやＩＧＦ−１のレベルを正常化することにより、部
分的に回復することも確認されている。

【０００４】一方、染色体21q22.3からグルタミン酸を
豊富に含むタンパク質をコードする新しい遺伝子がクロ
ーンされ、この遺伝子の発現は成人の心臓や骨格筋に限
定して起こることが確認されている［Paolo Scartezzin
i et al., Hum. Genet., 99:387-392 (1997) ］。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このような背景のも
と、本発明は、ヒト成長ホルモンにより発現が調節され
る新規な遺伝子、それを構成するＤＮＡ、及びこれがコ
ードするタンパク質を提供することを目的とする。

【０００６】本発明者等は、家兎の軟骨細胞を用いた研
究で、ある遺伝子の発現が、成長ホルモン（ＧＨ）等の
成長因子によって調節され、若い軟骨細胞よりも齢を経
た軟骨細胞で強く発現されること、またその強い発現が
成長ホルモン処理によって若い軟骨細胞レベルに復帰す
ること、更には、同遺伝子が腫瘍細胞等の異常細胞で強
く発現されることを見出し、該遺伝子を単離、同定して
検討し、該遺伝子がヒト、家兎など種を越えて共通のア
ミノ酸配列を保持する新規な遺伝子であることを発見
し、本発明を完成させた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、配列
表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡを提供す
る。

【０００８】更に本発明は、配列表の配列番号２に示す
アミノ酸配列を有するタンパク質をも提供する。

【０００９】更に、本発明は、配列表の配列番号２に示
すアミノ酸配列において、１若しくはそれ以上のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、その発現がヒトの正常細胞に比してヒトの腫瘍細胞
において高められる性質を有することを特徴とするタン
パク質をも提供する。ここに、ヒトの腫瘍細胞の例は、
特に、前骨髄球白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、結
腸直腸腺癌細胞、肺癌細胞及び／又は黒色腫細胞であ
る。

【００１０】更に本発明は、上記の各タンパク質であっ
て、その発現が、加齢により高まり、且つ、成長ホルモ
ン処理により若い細胞のレベルへと復帰する性質を有す
ることを特徴とするタンパク質も提供する。

【００１１】更に本発明は、上記の各タンパク質をコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡをも提供する。そのよう
な塩基配列は、コドンの縮重に関する周知の知識を利用
して、任意に構成することが可能である。

【００１２】更に本発明は、上記の各ＤＮＡを発現可能
なプラスミドをも提供する。

【００１３】更に本発明は、上記の各ＤＮＡに特異的に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをも提供する。
該オリゴヌクレオチドは、これらをプライマー、プロー
ブ又はマーカーとして使用することを特徴とする診断薬
を提供するのに用いることができる。

【００１４】加えて本発明は、上記の各タンパク質に対
するポリクローナル又はモノクローナル抗体をも提供す
る。該抗体は、これによるイムノアッセイ等に基づく診
断薬を提供するのに用いることができる。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明者等は、ｍＲＮＡディファ
レンシャル（differential）・ディスプレー及びＰＣＲ
選択ｃＤＮＡサブトラクション法を用いて、成長ホルモ
ンによって制御される複数遺伝子の予備的検出を行い、
家兎軟骨細胞中に、成長ホルモンによって発現が制御さ
れる遺伝子があることを確認した。すなわち、ｍＲＮＡ
ディファレンシャル・ディスプレー法を用いて、ある電
気泳動バンド（N 11）が、若い家兎の軟骨細胞を100 ng
/mlのｒｈＧＨで１日処理することにより促進されてい
ることを見出した。このバンドを切り出し、常法により
そのＤＮＡを抽出し、クローニングして配列決定した。
このＤＮＡ断片は、長さが505塩基であることが判明
し、そして、定義された遺伝子の何れとも意味ある相同
性はかった。しかしながら、ヒト及びマウスのＥＳＴ
（Expressed Sequence Tag）のうちには相同なものがあ
った。このバンドからのＤＮＡを、相同なクラスターHC
D20として分類し、問題の家兎遺伝子を「HCD20(11)」と
命名した。

【００１６】更なる実験により、ｍＲＮＡディファレン
シャルディスプレー法において用い、HCD20(11)の発見
の契機となったこの家兎が、HCD20(11)の発現様式にお
いて幾分異常であったことが判明した。すなわち、他の
若い家兎軟骨細胞においては、何れも、成長ホルモン処
理によるHCD20(11)遺伝子の発現変化は特に検出できな
かった。しかし、驚くべきことに、HCD20(11)遺伝子の
発現は、歳を経た古い細胞において非常に高まってお
り、そしてＧＨ処理がその発現を、若い家兎軟骨細胞に
特有な低いレベルまで復帰させることが見出された。HC
D20(11)の全長ＤＮＡ配列を、家兎軟骨細胞から抽出し
たｍＲＮＡで構築したｃＤＮＡライブラリーを用いて決
定した。

【００１７】前述のように、この遺伝子に対応する505
塩基のＤＮＡ断片の塩基配列がヒトのＥＳＴと高度な相
同性を示したことから、この遺伝子に対応するヒトの類
縁遺伝子（hGHRGM：human growth hormone regulated g
rowth marker）を探索するために、この家兎のHCD20(1
1)特異的ＤＮＡ断片をプローブとして用いた。該ＤＮＡ
断片は、配列表の配列番号３で示す塩基配列を有する。
hGHRGM遺伝子の種々の領域を含んだ９つの独立のファー
ジクローンを回収した。それらのＤＮＡを精製し、pUC1
8ベクターに再クローニングし、そして配列決定した。
全長765塩基よりなる配列が組立てられた。該配列を配
列表の配列番号１に示す。またこれから推定されたタン
パク質の93個のアミノ酸よりなる配列を配列表の配列番
号２に示す。

【００１８】このこの蛋白質は、核に局在すると予測さ
れる。本発明者の測定によれば対応する家兎の類縁体の
アミノ酸配列との間に何らの差違もなかったことから、
種を超えた非常に高い保存性を示すことが判明した。こ
のことは、このタンパク質が生命活動において基本的な
役割を担うものであることを示唆している。

【００１９】hGHRGMタンパク質のアミノ酸配列を、BLAS
TPサーチを用いて既知のポリペプチド配列と比較した。
ヒトSH3ドメイン結合性グルタミン酸・リッチ・ライク
・タンパク質（Scr homology 3H domain binding gluta
mic acid-rich-like protein: SH3BGRL）［Egeo A. et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 247(2): 302-3
06 (1998)］及びヒトSH3結合性グルタミン酸・リッチ・
タンパク質（SH3 domain binding glutamic-rich prote
in）［Paolo Scatezzini, et al., Hum. Genet., 99: 3
87-392 (1997)］が、hGHRGMタンパク質と最も高い相同
性を示した。MOTFIFサーチは、３つのモチーフの存在を
明らかにした。

【００２０】SH3BGR及びSH3BGRLにあるプロリン豊富な
ペプチドのアミノ酸配列が、シグナルトランスダクショ
ン経路に関連するタンパク質−タンパク質相互作用に重
要な役割を果たすことが知られている［Cohen, G.B., e
t al., Cell, 214: 237-248 (1995). Powson, T. and
Scott, J.D., Science, 278: 2075-2080 (1997)］。特
異的なプロリン・リッチな共通配列が、SH３、WW、EVH1
のドメインに結合する［Cicchetti, P. et al., Scienc
e, 257: 803-806 (1995). Macias, M.J. et al., Natu
re, 382: 646-649 (1996). Niebuhr, K. et al., EMBO
J., 16: 5433-5444 (1997)］。このことから、本発明
の物質も、プロリンリッチな配列を有して、ＧＨやIGF-
Iの生理作用をもたらすシグナルトランスダクションに
関与していると推定される。

【００２１】本発明のＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ
は、ＧＨ処理により軟骨細胞で発現したが、腫瘍等の異
常細胞では強く発現することが認められた。また、老化
した細胞では、そのｍＲＮＡ発現は若い細胞に比して著
しく高いが、老化細胞をＧＨで処理することによって、
若い細胞のレベルにまで復帰した。最近、成人のＧＨ分
泌不全症の患者へのＧＨ薬剤投与による治療が注目され
てきている。本発明のＤＮＡ及びこれがコードするタン
パク質、それに対する抗体、及びプローブ等は、それら
の治療における診断薬として利用することができる。

【００２２】また小児のＧＨ分泌不全症の治療において
も、本発明のタンパク質の発現の程度の測定は、ＧＨに
よる治療のモニタリングに有用なはずである。また本発
明のＤＮＡ及びこれがコードするタンパク質、それに対
する抗体、及びプローブ等は、従って、この場合にも、
診断薬として有用である。

【００２３】本発明は、配列表の配列番号１で示された
塩基配列を有するＤＮＡのみならず、これらの塩基配列
において１個若しくはそれ以上の塩基が欠失、置換又は
付加された、同様の性質を有する遺伝子を構成するＤＮ
Ａをも包含する。１個若しくはそれ以上の塩基とは、通
常は例えば、数個（例えば３、４個）ないし10個であ
る。本発明はまた、配列表の配列番号２で示されたアミ
ノ酸配列を有するタンパク質のみならず、該タンパク質
のアミノ酸配列において１個若しくはそれ以上のアミノ
酸が欠失、置換又は付加された、同様の性質を有するタ
ンパク質をも包含する。１個若しくはそれ以上のアミノ
酸とは、通常は例えば、数個（例えば３、４個）ないし
10個である。更に本発明は、そのようなタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列をも包含する。そのような塩基配列
は、コドンの縮重に関する周知の知識を利用して、種々
のものを容易に作成することが可能である。

【００２４】組換えＤＮＡ技術により、種々の変異体の
作製が可能である。最初に、種々の化学的及び／又は酵
素的方法を用いてＤＮＡのクローン断片に変異を生じさ
せることができ、得られた変異型のＤＮＡにつきＤＮＡ
配列分析を行い、利点を持つ特定の変異体を選び出す。
この方法で種々の変異体を、その表現型に関係なく、シ
ステマティックに作製することができる。一般に用いら
れる変異型クローンＤＮＡ作製方法は以下の通りであ
る。

【００２５】１．オリゴヌクレオチドを用いて直接にＤ
ＮＡ配列に置換、欠損、挿入、付加を起こさせることが
できる。この方法によれば、ＤＮＡの小さな領域に多く
の変異を起こさせることが可能である。２．より長いオリゴヌクレオチドを用いて所望の遺伝子
の合成が可能である。３．部位特異的変異導入法（Region-specific Mutagene
sis）を用いて、大きなＤＮＡ領域（１〜３ｋｂ）に所
望の変異体を作製可能である。４．ＤＮＡのリンカースキャニング変異導入法（Linker
-scanning Mutagenesis)は相対的に小さなＤＮＡ領域(4
-10 bp)にクラスター点変異を導入するのに適した方法
である。５．ＰＣＲも、直接的な変異体作製法として利用でき
る。［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al., John Wil
ey & Sons, Inc., Current Protocols., Vol.1,Chapter
8: Mutagenesis of cloned DNA, pages 8.0.1-8.5.1
0］

【００２６】これらの方法で得られた種々の変異型を含
む所望の遺伝子を発現可能なプラスミドやベクターの作
製方法も当業者に周知である。すなわち、制限酵素とリ
ガーゼとの組合わせを用いて、所望の遺伝子含んだＤＮ
Ａを発現ベクターＤＮＡに挿入することにより、所望の
遺伝子を含んだ組換えプラスミドを容易に構築すること
ができる。得られた組換えプラスミドを種々の細胞に導
入することにより細胞をトランスフェクションし形質転
換細胞を作製することができる。細胞としては、大腸菌
などの原核生物から、酵母や昆虫、植物や動物細胞も利
用することができる。［参考文献： Vectors essential data. Gacesa P. an
d Ramji D.P. 166 pages. BIOS Scientific Publishers
Limited 1994., John Wiley & Sons in association w
ith BIOS Scientific Publishers Ltd. Expression vec
tors, pages 9-12.］

【００２７】宿主細胞への組換えプラスミドの導入は、
塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法により行
うことができる。塩化カルシウム法は効率的なトランス
ホーメイションを与え、特別な装置を必要としない。よ
り高い効率を求めるならば、エレクトロポレーション法
が用いられるべきである。［参考文献： Current protocols in molecular biolo
gy. 3 vols. Edited byAusubel F.M. et al., John Wil
ey & Sons, Inc., Current Protocols.Vol.1, unit 1.
8: Introduction of plasmid DNA into cells, pages
1.8.1-1.8.10.］

【００２８】動物細胞系で通常行われるトランスフェク
ションには、一過性のものと安定で永久的なものとの２
通りが知られている。一過性のトランスフェクションで
は、形質転換細胞を１〜４日間培養してトランスフェク
トした遺伝子の転写、複製を起こさせた後、細胞を回収
してＤＮＡ分析を行なう。代わりに、多くの研究では、
トランスフェクト遺伝子を染色体遺伝子に組み込む安定
型の形質転換細胞系を作製している。トランスフェクシ
ョン法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレ
ーション法、リポソーム触媒法などが用いられる。［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al., John Wil
ey & Son,Inc., Current Protocols. Vol.1, chapter
9: Introduction of DNA into mammalian cells, pages
9.0.1-9.17.3.］

【００２９】本発明の遺伝子について、それがコードす
るタンパク質（ポリペプチド）及びその断片や類似体に
対するポリクローナルやモノクローナル抗体の作成も当
該分野において周知の技術を用いて容易に行なうことが
できる。作製された抗体は研究試薬や本遺伝子の関連す
る疾患の診断薬として利用可能である。また、得られた
抗体は抗体カラムの作製、免疫沈殿法、更にはウェスタ
ンブロッティングによる抗原の同定その他に広く利用で
きる。

【００３０】本発明の遺伝子がコードするタンパク質に
対するミリグラムレベルのモノクローナル抗体の一般的
作製法は、次の通りである。すなわち、抗原タンパク質
をマウスに接種して免疫し、十分な抗体タイターを示す
マウスから脾臓を除去する。脾臓細胞を分離して脾臓Ｂ
細胞を選択し、Ｂ細胞起源の骨髄腫細胞に融合し、抗体
を分泌するハイブリドーマ細胞を構築し、ハイブリドー
マ細胞から分泌されたモノクローナル抗体を、細胞培養
液からアフィニティーカラム、イオン交換法、ゲル濾過
等を用いて精製する。また、一般的な方法で本発明物質
のポリクローナル抗体をも製造できる。すなわち、免疫
動物としてはウサギ、ウマ、マウス、モルモットなどを
用い、当業者に既知の種々のスケジュールで抗原タンパ
ク質を接種して免疫し、採血した血清から免疫グロブリ
ンＧなどを単離する。［参考文献： Current protocols in molecular biolog
y. 3 vols. Edited by Ausubel F.M. et al. John Wile
y & Sons, Inc., Current Protocols. Vol.2, chapter
11: Immunology, pages 11.0.1-11.16.13.］

【００３１】本発明者等は、ヒトの各組織におけるhGHR
GMの発現レベルをノーザンハイブリダイゼーション法に
より調べた。hGHRGMは各組織で見出されたことから、種
々の組織に普遍的に発現していると推定される。その発
現レベルを、hGHRGMに特異的なプローブを作製して正常
細胞と腫瘍細胞で比較すると、前骨髄球白血病細胞（pr
omyelocytic leukemia HL-60）、慢性骨髄性白血病細胞
（chronic myelogenous leukemia K-562）、結腸直腸腺
癌細胞（colorectal adenocarcinoma SW 480）、肺癌細
胞（lung carcinoma A549）、黒色腫（melanoma G631）
において、腫瘍細胞の方が正常細胞より高い発現を示し
た。このことは、hGHRGMが、ある種の腫瘍に対してはそ
の進行程度を見積もる診断薬として利用できることを示
している。

【００３２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明が下記の実施例に限定されることは
意図しない。

【００３３】＜プライマーの作製＞pUC18中ベクターの
挿入物のＤＮＡ配列決定のために用いた、配列表の配列
番号４に示す塩基配列よりなるM13ユニバーサル配列決
定プライマー、及び配列表の配列番号５に示す塩基配列
よりなるM13逆向配列プライマーの合成は、日清紡東京
リサーチセンターに合成を委託して行なった。

【００３４】＜ファージ平板培養細胞の調製＞ファージ
感染を高い効率で行なわせるためには、ファージ増殖に
用いる細胞は対数増殖相で収穫し且つ死細胞を実質的に
含まないことが重要である。XL1-BlueMRF'株を用いるこ
とが最も便利であることが判明した。その遺伝子型は、
△(mcrA)183 △(mcrCB-hsdsSMR-mrr)173 endA1 supE44
thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac［F'proABlacl^qZ△M15
Tn10(Tet^r)］である。この細胞株を、25μg／mlのテト
ラサイクリンを補充したCGアガープレート（1.6% Bacto
-Agar（Difco）及び 40カプセル/L Circlegrow （Bio10
1, Inc.）)で培養した。細胞を37℃でインキュベートし
て、２週間毎に新鮮なプレートに植え替え、そして4℃
で保存した。

【００３５】平板培養段階の前日に、１個のコロニーを
CGアガープレートから採取し、0.4%マルトースと25μg/
mlのテトラサイクリンを補充した３mlのCG ブロス（40
カプセル/L CircleGrow)に播き、震盪しつつ37℃にて終
夜インキュベートした。

【００３６】1.0 mlの終夜培養物を47 mlの同じ保温前
の培地の47mlに加え、激しく震盪しつつ37℃にて3時間
インキュベートした。細胞濃度を、Beckman DU 640 spe
ctrophotometerを用いて、0.1 mlの石英ガラスキュベッ
トで評価した。通常、OD₆₀₀の強度は、0.3（1.5×10⁸細
胞/ml)付近である。培養物をキャップ付き滅菌50 mlポ
リカーボネート遠心ボトル(Beckman)に移し、3,000 rpm
で10分間4℃にて、Beckman JA 20 rotorを用いてBeckma
n J2-MC 遠心機で分離した。細胞ペレットを、細胞濃度
２×10⁹ 細胞/mlの懸濁液を調製するように、冷却した
滅菌10 mM MgSO₄液中に再懸濁させた。細胞を氷上に置
き、スクリーニングのため直ちにタイトレーション及び
ファージ平板培養に用いた。

【００３７】＜ファージのタイトレーション＞25μg/ml
のテトラサイクリンを補充したCGアガーを含んだ100 mm
のペトリ皿（Falcon）をタイトレーションに用いた。ア
ガーを注いだペトリ皿を蓋を開けたまま室温にて20分放
置してアガーを固化させ、次いで30分間安全キャビネッ
ト(SCV-1303EC II B：日立製作所)内で滅菌空気を吹き
付けることによって乾燥させ、そして4℃で保存した。
使用前に、それらを冷蔵庫から取り出して恒温室にて37
℃、1時間加温した。

【００３８】ファージ液 2μlをＳＭ緩衝液 198μl(100
mM NaCl, 8 mM MgSO₄, 0.01% ゼラチン(Sigma), 50mM
Tris-HCl pH 7.5)と混合した。この希釈物を10⁴ と表示
した。この希釈液の10μlを播いたときプレート上の１
個のプラークは元のファージ原液における10⁴pfu/mlに
等しいからである。同じ仕方で、ＳＭ緩衝液により10 ⁹
までの段階的希釈液を調製した。

【００３９】10μlの各ファージ希釈液を90μlのＳＭ緩
衝液で希釈し、10 mM MgCl２中の細胞懸濁液100μlと混
合し、そしてThermo Alumi Bath ALB-120のメタルホル
ダー中で37℃、15分間インキュベートした。

【００４０】各プレーティング組成物を、溶解したアガ
ロースを含んだ上記チューブに加え、チューブを5回上
下反転させて素早く撹拌し、そして 25μg/mlのテトラ
サイクリンを補充した乾燥 CGアガーの100mmプレートに
注いだ。プレートを動かす前に、３分間かけてトップア
ガーを完全に固化させた。プレートを裏返しにして、37
℃、5時間インキュベートし、次いで室温で終夜放置し
た。プラーク数をカウントして、そしてプラーク総数に
希釈倍数を掛けることにより、ファージのタイターを計
算した。

【００４１】＜ファージのプレーティング及びプラーク
の膜への移転＞プレーティングのプロトコールは、ファ
ージのタイトレーションについて上に記載したのと基本
的に同じである。一度に12個までのプレートが処理され
た。ｃＤＮＡライブラリーは、外傷で死亡した75才のコ
ーカサス人男性の肺（Clontech）を用い、λgt10クロー
ニングベクターにより、オリゴ（dT）及びランダムプラ
イミング法を用いて構築した。

【００４２】最初のスクリーニングでは、ＳＭ緩衝液
に希釈した100μlのファージライブラリー（50,000〜50
0,000 pfu（プラーク形成単位）を含有）を、等量の10
mM MgCl₂中に懸濁させた細胞と混合し、37℃にて15分
間インキュベートした後、７mlの48℃のCGトップアガー
に加え、５回上下反転させてよく混合し、25μg／mlの
テトラサイクリンを補充したCGアガープレート（150m
m： Falcon）上に注いだ。プレートを裏返して37℃にて
５時間インキュベートし、次いで室温で終夜放置した。

【００４３】Hybond^TM-N+ （円形の132 mmの、グリッド
付きの正に帯電したナイロン膜（Amersham））をプラー
クを含んだアガープレート上に載せた。21Ｇ針によりフ
ィルターの配向を3点でマークした後、フィルターを除
去して上に向けてテーブル上に置き、少なくとも３分乾
燥させた。ＤＮＡ固定化のために、フィルターを 0.4M
NaOH液を浸した２枚のWhatman紙上に、10〜30分間置い
た。細菌の砕片やアルカリを除くために、膜を、5×SSP
E緩衝液(20×SSPE: 3.0 M NaCl, 0.2 M NaH₂PO４, 0.02
M EDTA, pH 7.4 (GibcoBRL))で徹底して２回、更に蒸留
水で１回洗浄し、ペーパタオルで吸い取り、そして室温
にて乾燥させた。

【００４４】＜プローブの標識化と精製＞Multiprime D
NA ラベリングシステム(Amersham)をプローブの標識化
に用いた。約25ngの家兎HCD20(11)特異的ＤＮＡ断片
（配列表の配列番号３）を含んだ１μlのプローブ溶液
を容れた４つのサンプルの各々を、25μlの水と混合
し、98℃のThermo Alumi Bath ALB-120中で５分間加熱
し、そして氷上で冷やした。試料を18,000×g（TOMY MR
X-150 高速マイクロ冷凍遠心機で15,000 rpm)にて１秒
間遠心して、チューブの内容物を下降させた。各反応物
を、次のようにキャップ付きMicroAmp Reaction Tube内
に入れて氷上にセットした。すなわち、変性ＤＮＡプロ
ーブの全量、10μlの標識化緩衝液、５μlのプライマー
/BSA 溶液、６μlの［α-³²P］dCTP（〜110 TBq/mmol,
370 MBq/ml)(Amersham)、及び２μlのKlenow酵素であ
る。ピペットで上下することにより調合物を穏やかに混
合し、GeneAmpPCRシステム2400中で37℃にて30分間イン
キュベートし、組み込まれなかったヌクレオチドを除去
してハイブリダイゼーションを行うまで、20℃にて3〜4
時間維持した。

【００４５】QIAquick Nucleotide Removal Kit(QIAGE
N)を、標識されたプローブの精製に用いた。各標識化混
合物を、500 μlの緩衝液ＰＮを含む1.5 mlのチューブ
内で混合した。QIAquick スピンカラムを、備え付けの
２ mlの収集チューブ内に入れた。ＤＮＡを結合させる
ために、試料をQIAquick スピンカラムに適用し、そし
て6000 rpm（TOMY MC-150 高速マイクロ遠心機）で1分
間遠心した。QIAquickカラムを清浄な２mlの収集チュー
ブ内におき、素通りした放射活性液を、後でＤＮＡへの
標識取り込みを計算するために、保存した。QIAquick
カラムの洗浄のために、500μlのＰＥ緩衝液を加え、60
00 rpmで１分間遠心した。通過した液を捨て、更なる50
0μlのＰＥ緩衝液で再度洗浄を行なった。通過した液を
捨て、QIAquick カラムを同じチューブに戻しした。こ
のチューブは空になっていなければならない。なぜなら
ば、緩衝液ＰＥからの残存エタノールは、この更なる遠
心の前に通過液が捨てられていない限り完全には除去さ
れないからである。カラムを更に１分間13,000 rpmで遠
心した。QIAquick カラムを清浄な1.5 mlのマイクロ遠
心チューブ内に入れた。ＤＮＡを溶出させるために、10
0μlの緩衝液ＥＢ(10mM Tris-HCl, pH 8.5)をカラムの
中心に加え、１分間放置し、次いで13,000 rpmで１分間
遠心した。

【００４６】溶出した標識ＤＮＡの各々を、キャップ付
きMicroAmp Reaction Tubeに移し、GeneAmp PCR System
2400中において99.9 ℃で５分間で加熱し、そして４℃
に冷却した。変性させたプローブを 450μlのハイブリ
ダイゼーション緩衝液を含んだ1.5 mlのチューブに加
え、β(γ)Survey Meter TGS-133 (Aloka)を用いて標識
組み込み効率を評価して、組み込まれなかったヌクレオ
チドの放射活性と比較した。

【００４７】＜プラークのハイブリダイゼーション＞ハ
イブリダイゼーションとフィルター洗浄は、陽性プラー
クを切り出すためのフィルターの正確な位置決定のため
に有利であるよう、低温で行った。100 mlのハイブリダ
イゼーション緩衝液を次の様に調製した。すなわち、50
mlの、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼ試験済脱イオン
化ホルムアミド（Nacalai Tesque)、25 mlの20×SSPE緩
衝液（3 M NaCl、0.2M NaH₂PO₄、20 mM EDTA、pH 7.4）
（GibcoBRL)、5 mlの10% SDS、18 mlの水である。各々2
00μlの10 mg/mlのHerring Sperm DNA 溶液 (GibcoBRL)
及び0.8 mlの水を含んだ1.5 mlの２本のチューブを、Th
ermo Alumi Bath ALB-120中で98 ℃にて５分間加熱し、
氷上で冷却し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液と
合わせた。SDSは温度低下と共に沈澱する傾向があるた
め、ハイブリダイゼーション緩衝液は、使用直前に約40
℃に暖めた（冬季）。

【００４８】80 mlのハイブリダイゼーション緩衝液
を、150 mmの丸いプラスティック容器に注ぎ、そして12
個のフィルターを、各々の膜の表側の面が隣の膜の表側
の面と、そして裏面が隣の膜の裏面と接するように、１
つずつ注意して浸漬した。蓋を閉じ、Thomastat Shaker
T-22S中で、32℃、40 rpm の条件で少なくとも３時間
の前ハイブリダイゼーションを行った。

【００４９】ハイブリダイゼーション緩衝液を前ハイブ
リダイゼーションしたフィルターから別の150 ml の丸
いプラスチック容器内へ注ぎ出し、ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液の残り及び４種の標識プローブと混合し、フ
ィルターを前述のようにして浸漬した。容器の蓋を閉じ
て、Thomastat Shaker T-22S中で、32℃、40 rpm で終
夜ハイブリダイゼーションを実施した。

【００５０】別の蓋付きプラスチック容器に入れたフィ
ルターを、Thomastat Shaker T-22S中で40 rpm にて、
次の各洗浄液で洗浄した。 1) 2×SSPE緩衝液, 0.1% SDS： 32℃、10 分 2) 2×SSPE緩衝液, 0.1% SDS： 50℃、1.5 時間 3) 2×SSPE緩衝液, 0.1% SDS： 50℃、1.5 時間

【００５１】残存の洗浄緩衝液をフィルターから吸い取
り、そして少なくとも1.5時間室温で乾燥させた。12枚
のフィルターを、２つの 35.6×43.2 cm Fuji EC-Aカセ
ットに配列し、Hyperfilm-MP X-ray film (Amersham)を
３〜４日間露光させた。

【００５２】＜ファージの回収＞Ｘ線フィルムを現像
し、照明にBright Light Boxを用いて、位置決めマーク
に従って陽性プラークの位置を決定した。Ｘ線フィルム
上の各陽性シグナルをその中心に一致させて、各々５×
５mmの栓状にトップアガロースを21Ｇの針で切り出し
て、各0.3mlのＳＭ緩衝液を含む蓋付きの４ mlのサンプ
ルバイアルに入れた。ファージを４℃にて１日の間溶出
した。

【００５３】＜ファージの第２スクリーニング＞ファー
ジの２回目スクリーニングは、１回目について上記した
のと基本的に同様である。予備的調節の後は、もはや平
板培養のためにファージ溶出液をタイトレーションする
必要はなかた。に150 mmのペトリ皿当り、0.0001μlの
ファージ溶出液に対応するファージ量が多くの場合適当
であることが判明した。個々のプラークを、0.2 mlのＳ
Ｍ緩衝液で、４℃にて１日の間溶出し、14μlのDMSO
（ジメチルスルホキシド）を添加して、ファージＤＮＡ
の増殖及び精製まで−70℃で保存した。

【００５４】＜ファージＤＮＡの調製＞ファージ平板培
養段階の前日の朝に、１個のコロニーをCGアガープレー
トから採取して、0.4% マルトース及び25μg/mlのテト
アサイクリンを補充した３mlのCGブロス（40カプセル/L
CircleGrow)に播き、震盪しつつ37℃にてインキュベー
トした。同日の夕刻に、50μlの培養物を、47 mlの予め
加温した同じ増殖培地に加え、激しく攪拌しつつ37℃に
て終夜インキュベートした。翌日の朝、滅菌した50 ml
の蓋付きポリカーボネート遠心壜 (Beckman)に培養物を
移し、Beckman JA20 rotorを用いてBeckman J2-MC 遠心
機により、3,000 rpmで10分間 4℃にて遠心した。得ら
れた細胞ペレットを、4.5 mlの冷却した無菌の10mM MgS
O₄に再懸濁させ、次いで氷上においた。

【００５５】25μg/mlのテトラサイクリンを補充した1.
2% CGアガロース GP-36を含んだ150mmペトリ皿 (Falco
n)を、ファージの増殖に用いた。アガーを注いだペトリ
皿は、固化した後は乾燥させなかった。それらは冷凍庫
に保存し、そして使用前に37℃の恒温室中で１時間加温
した。

【００５６】約５×10⁶ pfuを含むファージ溶出液の50
μlを、450μlのＳＭ緩衝液及び500μlの細胞懸濁液と
よく混合し、37℃にて15分間インキュベートし、６mlの
溶融アガロースと混合し、そしてペトリ皿の上に広げ
た。３分後、ペトリ皿を裏返し、37℃にて約８時間イン
キュベートした。

【００５７】ファージを溶出させるため、各プレートを
８mlのＳＭ緩衝液及び200μlのクロロホルムで覆い、ロ
ータリーシェイカー R-20 mini(Taitec)に固定して、15
0 rpmで4℃にて終夜震盪した。

【００５８】ファージ溶出液を15 mlの円錐形遠心チュ
ーブ (Greiner) に移し、そしてプレートを更なる２ml
のＳＭ緩衝液で室温にて１時間洗浄した。この２番目の
溶出液を最初のものと合わせ、チューブを3500 rpmで10
分間遠心した（TOMY TS-7 ローター：TOMY LC-122 低速
遠心機）。

【００５９】QIAGEN Lamda Mini Kit (QIAGEN)を、ファ
ージＤＮＡの精製に用いた。澄明化したプレート溶解物
の８mlを、新しい15 mlの円錐形の遠心チューブに移
し、25μlの緩衝液Ｌ１(300 mM NaCl, 100mM Tris-HCl,
pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.2 mg/ml BSA, 20 mg/mlのRNas
e A 及び 6 mg/mlのDNase I)と混合し、そしてThermo A
lumi Bath ALB-120 (Iwaki)中で、37℃にて30分間イン
キュベートした。溶解物を1.6 mlの氷冷した緩衝液Ｌ２
(30% ポリェチレングリコール PEG 6000、3M NaCl)と混
合し、氷上で60分間インキュベートした。チューブの内
容物を16×76 mmの遠心チューブ (Beckman) に移し、そ
してL70 超遠心機(Beckman)の50 Ti rotor で15,000rpm
で４℃にて15分間遠心した。上清を除去し、チューブを
１分間倒置して残りの液体を切った。先の段階で行われ
たPEG沈澱によって形成されたファージ沈澱物を見るこ
とは困難であった。透明で且つチューブの壁面に分布し
ていたためである。そこで、ペレットの完全な再懸濁を
確実にするために、0.65 mlの緩衝液Ｌ３(100 mM NaCl,
100mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM EDTA)を、チューブの
壁にピペットで数回かけ、そして２mlのセーフロックチ
ューブに(Eppendorf)移した。等量の緩衝液４(４% ドデ
シル硫酸ナトリウム)をチューブに加え、穏やかに撹拌
し、Themo Alumi Bath ALB-120中で70℃に10分間加熱
し、次いで氷上で冷却した。0.65 mlの緩衝液Ｌ５(3 M
酢酸カリウム, pH 5.5)をチューブに注ぎ、直ちにしか
し穏やかに攪拌し、４℃ にて30分間、15,000 rpmで遠
心した（高速マイクロ冷凍遠心機 MRX-150 (TOMY)）。
上清を新しい２mlのチューブに移し、室温にて10分間、
15,000 rpmで再遠心して、あらゆる残存の懸濁物質を除
去した。

【００６０】遠心が行われている間、QIAGEN-tip 20を
廃液トレー上のQIArack 1の中に入れ、そして１mlの緩
衝液QBT(750 mM NaCl, 50 mM MOPS, pH 7.0, 15% エタ
ノール、0.15% Triton X-100)でカラムを平衡化した。Q
IAGEN-tipが緩衝液を完全に流し去るのに任せた。樹脂
ベッドは幾らかの緩衝液を保持し、容易には乾燥しない
ことから、QIAGEN-tip から目を離してもよい。

【００６１】上清を即座にQIAGEN-tipに適用し、そして
重力に従って樹脂を通して流した。チップを１mlの緩
衝液ＱＣ(1.0 M NaCl, 50 mM MOPS, pH 7.0, 15% エタ
ノール)で２回洗浄した。QIArack 1の上側部分で、清浄
な1.5 mlチューブを取付けた下側ラックを覆い、そして
ＤＮＡを0.75 mlの緩衝液ＱＣ(1.25 M NaCl, 50 mM Tri
s-HCl, pH 8.5, 15% エタノール)で２回、２本の別の1.
5 ml マイクロ遠心チューブ (Treff Lab.) 内にへと溶
出した。

【００６２】0.7 液量のイソプロパノールでＤＮＡを沈
澱させ、そして15,000 rpmで30分間、室温にて遠心し
た。上清を注意深く除去して捨てた。ＤＮＡのペレット
を、0.5mlの室温下の70% エタノールで手短に洗浄し、
次いで再遠心した。室温下の70%エタノールによる洗浄
を反復した。エタノールを完全に除去した。ペレットを
５分間手短に風乾し、各チューブ内のＤＮＡを、18μl
の NaOH (pH8) に溶かし、そして同じＤＮＡを含んだ２
本のチューブの内容物を合わせた。

【００６３】＜ファージ挿入物の再クローニング＞ファ
ージ挿入物の配列を調べるために、適当なクローンから
得られたＤＮＡ断片をpUC18ベクターに再クローンし
た。

【００６４】36μlのλＤＮＡ溶液を、4.5μlの10×Ｈ
緩衝液及び4.5μlのEcoRI(10 U/μl)(Takara)と混合し
た。37℃にて終夜消化を行ない、次いで混合物を３つの
ウエルに分け、１% アガロース GP-36ゲルを用いて50 V
にて50分間電気泳動を行った。適切なバンドを切り出
し、同一のファージクローンからのＤＮＡを有するゲル
片を併せた。

【００６５】挿入物を、「ＰＣＲ断片の精製」の欄に記
述したようにして、QIAEX II Gel Extraction Kitで精
製した。100 Bpから４ kb のＤＮＡ断片について、緩衝
液QX1の３倍量を１倍量のゲルに加えた。30秒渦状間攪
拌してQIAEX II を再懸濁させ、そして各サンプルに10
μlの樹脂を加えた。混合物をThermo Alumi Bath ALB-1
20（Iwaki）中で50℃にて12分間インキュベートした。

【００６６】サンプルを２分毎に短く渦状攪拌した。チ
ューブを18,000×ｇ（TOMY MRX-150高速マイクロ冷凍遠
心機では、15,000 rpm）で１分間遠心し、上清を捨て
た。緩衝液QX1の500μlを各ＤＮＡ含有ペレットに加
え、手短に渦状攪拌し、18,000×ｇで１分間遠心し、そ
して上清を完全に除去した。緩衝液PEの500μlを各ＤＮ
Ａ含有ペレットに加え、手短に渦状攪拌し、18,000×ｇ
で１分間遠心し、そして上清を完全に除去した。この洗
浄ステップをもう一度反復した。ペレットを、白くなる
まで25〜30分間風乾した。ペレットの過乾燥は回収率を
低下させるために、真空乾燥処理は避けた。純水を各サ
ンプルに加え、ペレットを撹拌して再懸濁させ、時々攪
拌しつつ混合物を５分間、室温でインキュベートした。
サンプルを18,000×ｇにて１分間遠心し、そしてＤＮＡ
を含有する上清を清浄なチューブに移し替えた。このス
テップを、サンプルを50℃にてインキュベーションしつ
つ繰り返した。同一のＤＮＡ断片からの１回目及び２回
目のＤＮＡ抽出物を合わせた。精製したＤＮＡ断片を、
ベクターＤＮＡと直ちにライゲーションするか、又は−
20℃で貯蔵した。

【００６７】溶出してきた断片の５μlを15μlの水と混
合し、Ready-To-Go EcoRI+Ligase (Pharmacie Biotech)
のチューブに加えた。混合物を室温にて３分間、次いで
16℃にて0.5〜３時間、MIR-153インキュベーター(Sany
o)内でインキュベートした。

【００６８】100μlのDH5 Competent High cells（東洋
紡）を含んだ１本のチューブを解凍し、攪拌して細胞を
均一に懸濁させた。10〜25μlのコンピテントな細胞
を、予め冷却しておいた1.5 mlの各チューブにピペット
で加えた。ライゲーション混合物の1/50を細胞に直接添
加し、穏やかに攪拌して混合した。全ての細胞を一時に
使用した。凍結及び解凍のサイクルの反復により形質転
換効率の重大な損失が観察されたためである。チューブ
を氷上に30分間放置した。Thermo Alumi Bath ALB-120
中で、細胞に正確に45秒間42℃のヒートショックを加
え、30秒間氷上に置いた。10倍量の室温のSOC培地を各
チューブに加えた。チューブを37℃にて１時間放置し
た。形質転換体の1/10を、1.4％のBacto-Agar (Difc
o)、40 カプセル/ＬのCircleGrow (Bio 101, Inc.)及び
100μl／mlのアンピシリンを含有するプレート上に広げ
た。プレートを37℃にて終夜インキュベートした。

【００６９】＜プラスミドＤＮＡの精製＞各プレートか
ら形質転換体を含んだ２つのコロニーを、滅菌トゥース
ピック（toothpick）を用いて採取した。細菌を、100μ
g／mlのアンピシリンを含有する2.5 mlのCircleGrow培
地（40カプセル/L）を含んだ、キャップ付きの14 mlの
ポリプロピレンチューブ（Falcon)に移した。チューブ
を、200 rpmで37℃にて16〜72時間震盪した（１日の培
養により、最高集率でプラスミドＤＮＡ与える）。

【００７０】RPM AFS Kit (Bio 101, Inc.)を、細菌培
養物からの二本鎖ＤＮＡの迅速単離、精製に用いた。一
度に12種類でのプラスミドＤＮＡが精製された。細菌を
２ mlのSafe-Lock チューブ (Eppendorf)中で、18,000
×ｇにて（TOMY MRX-150 高速マイクロ冷凍遠心機で、1
5,000 rpm）1 分間遠心した。上清を傾捨した。細胞を1
mlの水中で渦状攪拌することによって再懸濁し、再び
遠心した。上清を傾捨した。細胞が完全に再懸濁するま
で、各細胞ペレットを、200μlのPre-Lysis緩衝液＃1中
で渦状攪拌することによって再懸濁させた。400μlのAl
kaline Lysis Solution＃2を細胞懸濁液に直接加え、そ
してチューブを穏やかに15回上下反転させた。１分後
に、300μlの氷冷Neutralizing Solution＃3を加え、そ
して均一な白色析出物が形成されるまでチューブを３〜
５回激しく震盪した。この混合物を氷上で5分間インキ
ュベートし、室温で５分間遠心し、そして上清を新しい
２ mlチューブに移した。

【００７１】500μlのGlassmilk SpinBuffer #4を上清
に加え、Glassmilkに効率よくＤＮＡが結合するよう５
分間上下反転させ、18,000×ｇにて２秒間遠心した。上
清を傾捨した。Glassmilk／ＤＮＡ複合体の各々を、500
μlの洗浄液（Wash Solution）#5 中にて、ピペットチ
ップで穏やかに攪拌し次いでピペットで上下することに
よって再懸濁させ、そして該キットに付属のRPM AFS ス
ピンフィルター（Spin Filter）に移した。フィルター
を10秒間遠心して、ペレットを乾燥させること無くペレ
ットのレベルまで洗浄液のレベルを低下させた。キャッ
チチューブ（Catch Tube）を空け、そしてスピンフィル
ターを再び取付けた。500μlの洗浄液を各スピンフィル
ターに加え、続いて２分間遠心してフィルター内容物を
「乾燥」させた。スピンフィルターをキットに付属の新
しい RPM AFS キャッチチューブに移した。140μlの溶
出液＃8（RNase/DNase/パイロージェンを何れも含まな
い水)を各サンプルに加え、そしてGlassmilk/DNA複合体
を、指で軽く叩いてスラリー状にまで混合した。プラス
ミドＤＮＡを、15,000 rpmにて３分間の遠心によってキ
ャッチチューブ内に集めた。これらのＤＮＡ溶液は、−
20℃で貯蔵した。

【００７２】＜ＤＮＡ挿入物の確認＞挿入物の存在とＤ
ＮＡ配列決定のためのＤＮＡ溶液の適切量とを、制限酵
素で消化したプラスミドＤＮＡのアガロース電気泳動に
より決定した。２ulのプラスミドＤＮＡ溶液を、11.3μ
lの水、1.5μlの10×希釈 H Universal緩衝液（0.5 MTr
is-HCl, pH 7.5, 100mM MgCl２, 10 mM DTT, 1 M NaC
l)、0.2μlのEcoRI（10U/μl）（TAKARAより入手)と混
合し、少なくとも２時間 37℃にてインキュベートし
た。

【００７３】１%アガロース GP-36（Nacalai Tesqu
e）、0.5 μｇ/ml エチジウムブロマイド(Sigma)、及び
0.5×ＴＢＥ緩衝液を含有する混合物をマイクロウェー
ブオーブンで溶融させることにより、分離用ゲルを調製
し、この溶液を Mupid-2 Mini-Gel電気泳動システム（A
dvance）の型に注ぎ、そして室温で少なくとも30分間か
けて固化させた

【００７４】消化したプラスミドＤＮＡの各々の全量
を、1.5μlの10×試料添加緩衝液（50% グリセロール、
0.01% ブロムフェノールブルー)と混合し、ゲルに適用
した。ＤＮＡ分子量標準マーカーとして、pHYマーカー
(TAKARA)を用いた。ゲル電気泳動は、緩衝液チャンバー
に0.5×ＴＢＥ緩衝液を入れた Mupid-2-Mini-Gel Elect
rophoresis Systemを用いて、100Vで30分間行った。

【００７５】FAS-II（東洋紡）を用いて、泳動像を得
た: ゲルを紫外線透過照明装置（Electronic U.V. Tran
silluminator）で照明し、写真をXC-75/75CE CCD Video
Camera Module（SONY）で撮り、そしてVideo Graphic
Printer UP-880（SONY）でプリントアウトした。適切な
長さの挿入物を含んだクローンからのＤＮＡを、最終確
認のため、ＤＮＡ配列決定用に選んだ。

【００７６】＜ＤＮＡ配列決定用のサンプル作成＞Ampl
iTaq ＤＮＡポリメラーゼ，FSを用いたABI PRISM^TM Dye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
を、ＤＮＡ配列決定に用いた。18個までのＰＣＲ反応を
一度に進行させた。キャップ付きMicroAmp反応チューブ
（Perkin Elmer）内で、反応混合物を次の通りにして調
製した：すなわち、８μlのTerminator Ready 反応混合
液、２μlのM13ユニバーサル配列決定プライマー又はM1
3逆方向配列プライマー（２μM）、0.1〜0.5μｇのプラ
スミドＤＮＡ（ＤＮＡ液の必要量は電気泳動図から見積
もった)、及び水を加えて最終液量20μlとした。調合物
をピペットで上下して十分に混合した。ＰＣＲ反応は、
GeneAmp PCR System 9600 サーマルサイクラー（Perkin
Elmer）中で、次の通りの増幅サイクルを用いて行っ
た：

【００７７】［25 サイクル反復］ 10秒：96℃ (変性) ５秒：50℃ (アニーリング) ４分：60℃ (延長) [最終段階] 4℃ (保存)

【００７８】ＰＣＲ産物をエタノール沈澱で精製した。
各反応物につき２μlの３M酢酸ナトリウム（pH 5.2）及
び50μlの99.5%エタノールを加えることにより、1.5 m
lのマイクロ遠心チューブを用意した。反応チューブの2
0ulの内容物全部を、このエタノール溶液を含むマイク
ロ遠心チューブに移した。チューブの溶液を渦状攪拌
し、そして氷上に10分間置いた。次いで混合物を18,000
×ｇ（TOMY MC-150 高速マイクロ遠心機で15,000 rpm)
で４℃にて20分間遠心を行った。エタノール溶液をマイ
クロピペットで注意深く吸引した。250μlの70%エタノ
ールを加えることによってペレットを濯ぎ、15、000 rp
mにて１分間遠心した。ペレットを乱さないよう注意深
く、マイクロピペットでアルコール溶液を吸引した。真
空下に10分間チューブを乾燥させた。乾燥した沈殿は、
直ちに使用するか又は−20℃にて貯蔵した。

【００７９】＜ＤＮＡ配列決定＞373-18 DNAシーケンサ
ー(Applied Biosystems)をプラスミドＤＮＡの配列決定
に用いた。ガラスの清浄度が信頼できる正確な配列決定
に極めて重要であることから、ガラス器具類を水で注意
深く洗浄し、イソプロピルアルコールで拭った。8.3 M
尿素を含んだ4.75%の変性PAAGを、ＰＣＲ産物の分離に
用いた。50 mlの遠心チューブ内において、19.94gの尿
素を、4.75 mlの40%の(19:1) Acrylamide/Bis Solution
(Bio-Rad Laboratories)及び８ mlの5×ＴＢＥ緩衝液
と混合し、そして蒸留水で40 mlとした。試料チューブ
を激しく攪拌し、マイクロウェーブオブンで受け皿が１
回転する間暖め、全ての尿素結晶が溶解するまでさらに
激しく攪拌した。ゲル成形装置を準備する間、A-3S Asp
iratorを備えたデシケータ内で溶液を（約10分間）脱気
した。18 μlのTEMED (Sigma)及び170μlの10% 過硫酸
アンモニウム (Sigma)（−20℃にて貯蔵）を加え、30秒
間穏やかに混合し、ガラスプレート型(420×250×0.25
mm)内に注いだ。ゲルを室温で2〜5時間放置して固化さ
せた。

【００８０】50 mM EDTA（pH8.0）中の10μlの３%ブル
ーデキストラン（Sigma）と52μlのホルムアミドと混合
することによって、試料添加緩衝液を調製した。配列決
定サンプルをこの緩衝液３μlに溶かし、Thermo Alumi
Bath ALB-120 (Iwaki)中で94℃、２分間加熱し、そして
氷上に維持した。ゲルを備えたガラスプレートをもう一
度注意深く洗い、スキャンニングによりチェックし、電
気泳動チャンバーを組立てた。歯櫛（shark teeth com
b）を１mmの深さに挿入し、1×ＴＢＥ緩衝液を両方の緩
衝液チャンバーに注ぎ、そして20〜30分間、前電気泳動
を行った。ＰＭＴ電圧を900Vにセットし、運転パラメー
タを2500 V、20 mA、及び30 Wにセットした。シリンジ
を用いてウェルを１×ＴＢＥ緩衝液で注意深く洗浄し、
サンプルを奇数ウェルに添加して、５分間電気泳動を行
なった。ウェルをもう一度洗浄し、サンプルを偶数ウェ
ルに添加して、９時間電気泳動を行なった。泳動開始後
直ちにデータ収集コンピュータープログラムをスタート
させた。

【００８１】分析コンピュータープログラムは、データ
ー収集終了後に自動的に作動した。ソフトエアの誤りは
マニュアルで補正した。ヌクレオチド配列の最初の分析
は、DNASISソフトウエアを用いて行った。

【００８２】＜入れ子になった欠損体の構築＞再クロー
ンされたＤＮＡ挿入物の配列決定のために、二本鎖ＤＮ
Ａ中に単一方向のみの欠損部位を構築するためエキソヌ
クレアーゼ IIIによるＤＮＡの制御された消化を用い
た。この酵素は、二本鎖ＤＮＡにのみに作用する 3'-エ
キソヌクレーゼであり、平滑末端及び 5'-突出末端は消
化を受けるが、対して、３塩基以上の長さの 3'-突出末
端はこの酵素には抵抗性である。加えて、リン酸エステ
ル骨格中のモノチオリン酸エステル結合はエキソヌクレ
アーゼ IIIの消化に抵抗性であることから、チオヌクレ
オチドで「満たされた」後退3'-末端（すなわち、5'-
突出末端）もまた、消化に抵抗する。当該遺伝子の各Ｄ
ＮＡ領域を含んだ少なくとも２つの独立したクローン
を、両端からの欠損体を作り出すために、Double-stran
ded Nested Deletion Kit (Pharmacia Biotech)と共に
使用した。

【００８３】適切な制限酵素は、ＤＮＡ挿入物を切断し
てはならない。3'-及び5'-突出末端又は平滑末端を生ず
る適切な制限酵素のペアが利用できる場合には、２μg
の精製プラスミドＤＮＡをそれらの酵素で少なくとも３
時間消化した。消化の進行をアガロースゲル電気泳動で
モニターするのには、２μlの試料を用いた。両方の消
化が完了したとき、ＤＮＡサンプルを70℃にて10分間加
熱することにより、酵素を失活させた。

【００８４】適切な制限酵素のペアが見出せない場合
や、3'-突出末端を生じるエンドヌクレアーゼがない場
合、チオヌクレオチドによる末端保護を、方法として選
択した。そのような場合は、2μgのプラスミドＤＮＡ溶
液を、10μlの液量中で第１の制限酵素で消化した。こ
の反応液の最大３μlまでを、反応の進行をモニターす
るのに用いた。FPLCpure Klenow 断片（１単位／μl）
を 20μlの１×Klenow 緩衝液（50 mM Tris-HCl, pH7.
5; 10 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT）と混合することによっ
て、希釈したKlenow断片 (0.05 単位/μl)を調製した。
次のものを1.5 mlのマイクロ遠心チューブに加えた。す
なわち、７μlの制限酵素消化ＤＮＡ、１μlの10×Klen
ow緩衝液、１μlのdNTPαS混合液 (dATPαS、dCTPαS、
dGTPαS及びdTTPαSの各400uMを含んだ水溶液)、及び１
μlの希釈したKlenow断片である。チューブを穏やかに
攪拌し、手短に遠心し、そして37℃にて15分間インキュ
ベートした。反応物を65℃に20分間加熱し、続いて20μ
lのNaCl/グリコーゲン（250 mMのNaClと250 ng/μlのグ
リコーゲンとを含んだ水溶液）及び75μlのエタノール
加えた。混合物をドライアイス上に10分間置くか又は−
80にて少なくとも１時間冷却した。沈殿したＤＮＡを、
４℃にて10分間、15、000 rpm の遠心を行なうことによ
って収集した。上清を注意深く除去して捨てた。ペレッ
トを250μlの70%エタノールで濯ぎ、１分間遠心した。
上清を注意深く除去し、ペレットを真空下に５分間乾燥
させ、そして10μlの水に再溶解させた。ＤＮＡを、最
終反応液量20μl中で、第２の制限酵素により消化し、7
0℃に10分間加熱して酵素を失活させた。

【００８５】マイクロ遠心チューブ中に、S1ヌクレアー
ゼ/緩衝液混合液を次のように調整した。すなわち、33
μlのS1緩衝液、66μlの蒸留水及び１μlのS1ヌクレア
ーゼである。この混合物の３μlをピペットで20本のマ
イクロ遠心チューブの各々に移し、氷上に置いた。

【００８６】適切なNaCl濃度の２×ExoIII緩衝液24μl
を調製した。NaCl濃度は、２回消化されたＤＮＡの等量
で希釈されたときに75 mM又はそれ以下になるようでな
ければならない。

【００８７】1.5 mlのマイクロ遠心チューブ中で、20μ
lの２×ExoIII緩衝液を20μl (2ug)の２回消化されたＤ
ＮＡと混合し、Thermo Bath ALB-120中で30℃にて２〜
３分間平衡化した。２μlの試料を「時間＝０」のコン
トロールサンプルとして採取し、そして３μlのS1ヌク
レアーゼ/緩衝液を含んだ適当なチューブに入れてよく
混合し、氷上に置いた。

【００８８】１μlのエキソヌクレアーゼ IIIを加え、
穏やかに混合し、30℃でインキュベーションを続けた。
５分ごとに２μlのサンプルを反応物から採取して、直
ちに３μlのS1ヌクレアーゼ／緩衝液と十分に混合し
た。これらのチューブは何れも、エキソヌクレアーゼ I
II反応物から全ての経時的サンプルを採取し終わるま
で、氷上に維持した。

【００８９】全ての経時的サンプルを採取してS1ヌクレ
アーゼ／緩衝液と混合し終わった後、それらを同時に室
温にて30分間インキュベートした。

【００９０】１μlのS1ヌクレアーゼ停止溶液を各サン
プルに加え、チューブを65℃にて30分間インキュベート
した。経時的サンプルの半分を、欠損体の電気泳動分析
に用い、残りの半分を、ライゲーションによる再環状化
に用いた。これらの２つの工程は、全ての試料につき同
時に平行して行い、そして欠損体分析の結果を、形質転
換に使用すべき再環状化サンプルの選択に用いた。

【００９１】３μlの各サンプルを２μlの試料添加緩衝
液（50% グリセロール、1 mM EDTA及び0.01% ブロムフ
ェノールブルー）と混合し、0.5μg/mlのエチジウムブ
ロマイドを含む1%のアガロースゲル（Agarose GP-36、N
acalai Tesqu）による30分の電気泳動によって分析し
た。

【００９２】電気泳動が進行する間に、各経時的サンプ
ルの残りの３μlを、再ライゲーションにションに用い
た。ライゲーション液の調製は、1.5 mlのマイクロ遠心
チューブ中で次のものを混合することによって調製し
た。すなわち、40μlの10×ライゲーション緩衝液、80
μlの25% PEG、２μlのT4 DNA リガーゼ、及び218μlの
蒸留水である。このライゲーション混合液の17μlを各
経時的サンプルの残り３μlに加え、穏やかに混合し、
室温にて２時間インキュベートした。

【００９３】電気泳動が完了したとき、問題の欠損体を
どの経時的サンプルが含んでいるかを決定するために、
ゲルを検査した。問題の欠損体を含んだサンプルのみ
を、E.coliの形質転換に用いた。２μlのライゲーショ
ン反応物を、10μlのDH5 Competent High Cells（東洋
紡）の形質転換に用いた。形質転換は、前記「ファージ
挿入物の再クローニング」の欄のプロトコールに従って
行なった。得られた形質転換体の全部を、1.4%のBacto-
Agar(Difco)、40カプセル/LのCircleGrow,L (Bio101, I
nc.)及び100μg/mlのアンピシリンを含んだプレート上
に広げた。これらの37℃にて終夜インキュベートした。
各プレートからの２つのコロニーを増殖させ、EcoRI制
限酵素消化したプラスミドＤＮＡの電気泳動及びそれに
続く前述の手順によるＤＮＡ配列決定によって、欠損の
程度を分析した。ＤＮＡ配列をDNASISコンピュータプロ
グラムとリンクさせ、全長挿入物を編纂（コンパイル）
した。

【００９４】＜配列決定データのコンピュータ解析＞ヌ
クレオチド配列の解析は、DNASISコンピュータープログ
ラム及びインターネットで入手可能な次のソフトウェア
を用いて実施した。すなわち、BLAST (BasicLocal Alig
nment Search Tool)、MOTIF (Protein Sequence Motif
Search)、 PSORT (Prediction of Protein Sorting Sig
nals and Localization Sites in Amino Acid Sequence
s)、SOSUI (Prediction of Transmembrane Segments)、
SIM (Alignment Tool for Protein sequences)、及びGe
neStream align である。

【００９５】＜ノーザーンハイブリダイゼーション＞１
レーン当り種々のヒト細胞からのpolyA⁺RNA 約２μgを
含んだMultiple Tissue Northern (MTN)ブロット (Clon
tech)を、前記「プラークのハイブリダイゼーション」
の欄に記載したようにして、家兎のHCD20(11)特異的Ｄ
ＮＡプローブとハイブリダイズさせた。 BIOMAX MS sc
ientific imaging film (Kodak)を利用した。理由は、H
yperfilm-MPより殆ど８倍も感度が高いからである。Fuj
i EC-Aカセットを用いて３週間-80℃で、増感スクリー
ンを備えたFuji EC-Aカセットを用いて、フィルムを膜
で３週間露光させた。フィルムの現像前、カセットを室
温で少なくとも１時間暖めた。

【００９６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Human growth hormone-regulated growth marker <130> P50-99 <160> 5 <210> 1 <211> 765 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agcacggcgg cggcgtcgtc tcccggcagt gcagctgccg ctaccgccgc cctctgcccg 60 ccggcccgtc tgtctacccc cagc atg agc ggc ctg cgc gtc tac agc acg 111 Met Ser Gly Leu Arg Val Tyr Ser Thr 1 5 tcg gtc acc ggc tcc cgc gaa atc aag tcc cag cag agc gag gtg acc 159 Ser Val Thr Gly Ser Arg Glu Ile Lys Ser Gln Gln Ser Glu Val Thr 10 15 20 25 cga atc ctg gat ggg aag cgc atc caa tac cag cta gtg gac atc tcc 207 Arg Ile Leu Asp Gly Lys Arg Ile Gln Tyr Gln Leu Val Asp Ile Ser 30 35 40 cag gac aac gcc ctg agg gat gag atg cga gcc ttg gca ggc aac ccc 255 Gln Asp Asn Ala Leu Arg Asp Glu Met Arg Ala Leu Ala Gly Asn Pro 45 50 55 aag gcc acc cca ccc cag att gtc aac ggg gac cag tac tgt ggg gac 303 Lys Ala Thr Pro Pro Gln Ile Val Asn Gly Asp Gln Tyr Cys Gly Asp 60 65 70 tat gag ctc ttc gtg gag gct gtg gaa caa aac acg ctg cag gag ttc 351 Tyr Glu Leu Phe Val Glu Ala Val Glu Gln Asn Thr Leu Gln Glu Phe 75 80 85 ctg aag ctg gct tga gtc aag cct gtc cag agt tcc cct gct gga ctc 399 Leu Lys Leu Ala 90 catcaccaca ctccccccag ccttcacctg gccatgaagg accttttgac caactccctg 459 tcattcctaa cctaacctta gagtccctcc cccaatgcag gccacttctc ctccctcctc 519 tctaaatgta gtcccctctc ctccatctaa aggcaacatt ccttacccat tagtctcaga 579 aattgtctta agcaacagcc ccaaatgctg gctgccccca gccaagcatt ggggccgcca 639 tcctgcctgg cactggctga tgggcacctc tgttggttcc atcagccaga gctctgccaa 699 aggccccgca gtccctctcc caggaggacc ctagaggcaa ttaaatgatg tcctgttcca 759 ttggcg 765 <210> 2 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Gly Leu Arg Val Tyr Ser Thr Ser Val Thr Gly Ser Arg Glu 1 5 10 15 Ile Lys Ser Gln Gln Ser Glu Val Thr Arg Ile Leu Asp Gly Lys Arg 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Leu Val Asp Ile Ser Gln Asp Asn Ala Leu Arg Asp 35 40 45 Glu Met Arg Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Thr Pro Pro Gln Ile 50 55 60 Val Asn Gly Asp Gln Tyr Cys Gly Asp Tyr Glu Leu Phe Val Glu Ala 65 70 75 80 Val Glu Gln Asn Thr Leu Gln Glu Phe Leu Lys Leu Ala 85 90 <210> 3 <211> 505 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 3 gttttttttt ttttttcagt ggaatgggca tttaattgtc tagggtgctc ccaggcaagg 60 gactgcgggc ctttggcaga gctctggctc aggaaccaag aagaggtgtc ctggtcagtg 120 ccaggcagag aggcggcagc cccaaggccg ggctgggacg gccagcactg gggctgctgc 180 ttaagacatt tcggagacgg agcggagaag aggcttggcc tggggagagg gtccccaagg 240 ccaaaaggtt aggaatgaca gggaagttgt cacaagtccc ttcgaggcca gttgaggcct 300 gcggggagaa catgtgaccg ggtccagggg aacccatcgg gggctggact cagccagctt 360 caggaactcc tgcagcgtgt tttgctccac agcctccacg aagagctcat agtccccgca 420 gtattggtcc ccgttgacga tctggggtgg gtgccttggg gttgcccgcc aaggctcgca 480 tctcatcccg cagggcgttg tcctg 505 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> M13 <400> 4 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> M13 <400> 5 caggaaacag ctatgac 17

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 33/53 33/53 Ｄ 33/577 33/577 ＢＦターム(参考） 2G045 AA34 AA35 CB02 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA12 CA04 DA03 EA04 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ42 QR40 QR48 QR55 QR62 QS33 QS34 4B064 AG01 AG26 CA19 CC24 DA14 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA31 DA75 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１に示す塩基配列を有す
るＤＮＡ。
【請求項２】配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質。
【請求項３】請求項２のアミノ酸配列において、１若し
くはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、その発現がヒトの正常細胞に
比してヒトの腫瘍細胞において高められる性質を有する
ことを特徴とする、タンパク質。
【請求項４】該ヒトの腫瘍細胞が、前骨髄球白血病細
胞、慢性骨髄性白血病細胞、結腸直腸腺癌細胞、肺癌細
胞及び／又は黒色腫細胞である、請求項３のタンパク
質。
【請求項５】請求項２のアミノ酸配列において、１若し
くはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、その発現が、加齢により高ま
り、且つ、成長ホルモン処理により若い細胞のレベルへ
とその復帰する性質を有することを特徴とする、タンパ
ク質。
【請求項６】請求項３又は４のタンパク質であって、そ
の発現が、加齢により高まり、且つ、成長ホルモン処理
により若い細胞のレベルへと復帰する性質を有すること
を特徴とする、タンパク質。
【請求項７】請求項２ないし６の何れかのタンパク質を
コードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項８】請求項１又は７のＤＮＡを発現可能なプラ
スミド。
【請求項９】請求項１又は７のＤＮＡに特異的にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】請求項８のオリゴヌクレオチドをプライ
マー、プローブ又はマーカーとして使用することを特徴
とする診断薬。
【請求項１１】請求項２ないし６の何れかのタンパク質
に対する抗体。
【請求項１２】請求項１１の抗体を使用することを特徴
とする診断薬。