KR20000047963A

KR20000047963A - 헬리코박터 파일로리 정착 억제제

Info

Publication number: KR20000047963A
Application number: KR1019990055439A
Authority: KR
Inventors: 고다마요시까쓰; 기무라노부따께
Original assignee: 도꼬로 히데오; 겐 코오포레이션; 쇼다 오사무; 닛신 세이훈 가부시키가이샤
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-07
Publication date: 2000-07-25
Also published as: CA2292012C; EP1010434B1; AU731059B2; CA2292012A1; US6235709B1; DE69915988D1; EP1010434A3; AU6442399A; DE69915988T2; EP1010434A2; KR100460173B1

Abstract

본 발명은 위에서 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 정착을 억제하는 안전하고 효과적인 억제제 및 이 억제제를 포함하는 식품을 제공한다. 본 발명의 억제제는 뮤신, 특히 우유로부터의 뮤신 또는 계란 알부민으로부터의 뮤신을 활성 성분으로 포함하며, 헬리코박터 파일로리의 감염에 의해 야기되는 질병, 예를 들어 소화성 궤양의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

헬리코박터 파일로리 정착 억제제{INHIBITOR OF HELICOBACTER PYLORI COLONIZATION}

본 발명은 소화성 궤양의 발생과 결부된 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori, 하기에서는 에이치. 파일로리 또는 Hp로 칭함)의 정착 (colonization)의 억제제와, 이 억제제를 함유하는 식품, 특히 항 에이치. 파일로리 기능 식품에 관한 것인데, 본 억제제는 위에서 에이치. 파일로리를 제거할 수 있다.

현재 위에서 에이치. 파일로리를 박멸하는 것이 소화성 궤양을 완전히 치료하는 데 필수적이라고 생각된다. 하기하는 바와 같이 일반적으로 항생제와 위산 분비 억제제의 배합물이 에이치. 파일로리의 박멸 요법으로 제안되었다.

에이치. 파일로리는 사람 위 점막에 서식하며 그의 한 말단에는 약간의 편모가 있는 나선 로드형 그램 음성균이다. 1983년에 오스트레일리아의 Marshall, B.J.와 Warren, J.R.은 이 박테리아가 위궤양에 걸린 환자의 생체검사용 위 표본에서 종종 검출됨을 보고하였다. 그 당시 이 박테리아는 캠필로박터 파일로리 (Campylobacter pylori)로 명명되었는데, 이는 이 박테리아가 형태학적으로, 그리고 생장 특성상 캠필로박터를 닮았기 때문이었다. 나중에 이 박테리아는 그의 외막의 지방산 조성과 리보좀 16S-RNA의 서열 면에서 캠필로박터와는 다르다는 것이 밝혀졌다. 그 결과 현재 이 박테리아는 헬리코박터 파일로리로 칭해지며 새로이 확립된 헬리코박터속에 속한다.

그 후 전염병학적 연구에 기초하여 많은 보고서가 발표되었는데, 그에 따르면 이 박테리아는 위염, 위궤양, 및 십이지장궤양을 일으키며 위암 등의 질병과 결부되어 있음이 나타났다. 일단 Hp가 위 점막에 정착하면 그의 감염에 대한 면역 응답이 강하다 해도 (즉, 항체 역가가 높다 해도) 이 Hp는 위에서 박멸될 수 없으며 계속하여 서식한다. 따라서 Hp가 항생제 요법으로 위에서 완전히 제거되지 않는 한, 항생제 투여가 중지된 후 약 1개월 이내에 감염 수준이 치료 전의 수준과 동일하게 된다. 또한 위의 pH는 강산인 HCl에 의해 매우 낮게 유지되며 따라서 대부분의 항생제는 불활성화되기 쉽다. 이러한 이유로 종종 위산의 분비를 강력히 억제하는 프로톤 펌프 억제제와 항생제의 배합물이 에이치. 파일로리의 박멸에 일반적으로 사용되는 투여량보다 더 많은 양으로 사용된다. 최근에 비스무쓰 서브살리실레이트, 메트로니다졸, 및 테트라사이클린의 배합물을 사용하는 새로운 치료법이 Hp에 대하여 가장 큰 제균율을 나타내는 것으로 판명되었지만 이 배합물 중 메트로니다졸이 단독으로 사용될 경우 항생제 내성 균주가 빠르게 출현하게 되는 것으로 알려졌다. 개발도상국에서는 이 약이 설사 환자를 치료하는 데 광범위하게 사용되며 그 결과 메트로니다졸 내성 Hp에 의한 감염률이 높다.

따라서 장기간 항생제가 투여되면 부작용이 야기될 뿐만 아니라 항생제 내성 균주가 증가되는 심각한 문제가 발생한다.

현재 이 박테리아 박멸용 항생제를 사용하는 치료법에 의한 부작용 및 항생제 내성 균주의 증가와 같은 문제점을 해결하기 위하여 경구 백신을 사용하는 면역학적 요법의 접근법이 제안되었다. 이러한 목적을 위하여 Hp 감염 동물 모델을 개발하는 것이 필수적이다. 그러나 Hp는 생쥐 또는 쥐 등의 작은 동물을 쉽게 감염시킬 수 없으며 감염에는 무균 동물이 요구된다. 또한 장기간 감염을 유지하는 데에는 신선한 단리물이 요구된다. 이러한 필요 조건은 새로운 예방 및 치료 방법의 개발을 목표로 하는 연구에서 장애가 되었다. 또한 경구 백신 제제는 일반적으로 이. 콜라이 (E. coli) 및 콜레라 독소로부터 유래된 가열 불안정성 독소 (heat-labile (LT) toxin)를 가지고 있는데 점막 면역성은 이러한 보조제 없이는 획득될 수 없다. 실질적으로 사용할 때의 안전성 면에서 이. 콜라이와 콜레라 독소로부터의 LT의 독성 수준이 높아 경구 백신법은 사람에세 실제 사용하는 데 있어서 미해결 문제점을 가진다. 또한 이 백신은 예방에 주로 사용되며 따라서 Hp에 이미 감염된 환자에게는 아무런 효과이 없다.

특정 항체의 사용이 Hp를 억제하려는 새로운 시도로 제안되었는데, 항체는 항원으로서 Hp 전체 세포에 대하여 면역화한 계란으로부터 얻어진다. 그러나 Hp 전체 세포에 대한 항체를 사용한 위로부터의 Hp의 완전한 제거는 기대될 수 없다. 또한 위에서 Hp를 제거하는 데 대한 실제 효과은 확인되지 않았다.

반면 특정 비피드 (bifid) 박테리아 또는 락트산 박테리아의 세포와, 이 세포로부터 추출된 다당류가 위궤양의 예방 또는 치료에 유용하고 (일본 특허 출원 공개 제4-5236호), 특정 해초에서 유래된 람노스 다당류인 람난 및 람노스 올리고당이 항궤양제로 유용하다는 것 (일본 특허 출원 공개 제6-247861호)이 개시되어 있다.

일본 특허 출원 공개 제7-138166호에는 네마시스투스 (Nemacystus)로부터 유래된 다당류인 푸코이단의 용도가 기술되어 있다. 상기 특허 출원에는 푸코이단이 항 궤양 활성을 가지며 위 점막에서의 Hp의 정착을 억제한다는 것이 기재되어 있다. 그러나 상기 특허 출원에서는 궤양 치료 효과를 보여주기 위하여 병리학적 전개 면에서 Hp에 의해 유도된 궤양과는 기본적으로 다른 아세트산 유도 궤양이 이용된다. 따라서 상기 특허 출원에서는 Hp 감염에 의해 야기되는 궤양 형성을 억제한다는 증거가 전혀 없다. 또한 상기 특허 출원에서는 푸코스 (단당류)가 정착 인자 (어드헤신 (adhesin))로 간주되며 이러한 가정에 기초하여 바이오티닐화 푸코스를 어드헤신 마커로 사용하여 생체외 실험을 수행함으로써 Hp 정착에 대한 푸코이단의 억제 효과을 살펴보는 것이 기재되어 있다. 그러나 푸코스는 현재 어드헤신이 아닌 것으로 여겨져 이 실험은 Hp 정착에 대한 푸코이단의 억제 효과을 보여주지는 못한다.

상기에 설명한 바와 같이 Hp를 제거하기 위하여 항생제를 장기간 사용하면 부작용 뿐만 아니라 항생제 내성 박테리아가 증가되며, 백신은 실용적으로 개발되지 않았다. 또한 Hp 전체 세포에 대한 계란 항체를 사용하는 시도로는 Hp를 박멸할 수 없으며, 따라서 위염, 위궤양, 및 십이지장 궤양의 예방 또는 치료에는 효과적이지 않다.

본 발명의 목적은 소화성 궤양의 발생과 결부된 Hp 정착의 효과적이고 안전한 억제제를 제공하며, 소화성 궤양의 치료 또는 예방용의 생리학적 기능 식품 및 의학 용도의 식품 등의 식품을 제공하는 것인데, 본 억제제는 항생제의 사용과 결부된 부작용 및 약품 내성 균주의 증가라는 불리한 점 없이 Hp 정착을 효과적으로 억제할 수 있다.

도 1은 정제된 위 뮤신에 대한 우레아제의 부착 패턴을 예시하는 그래프이다.

도 2는 우레아제 부착 억제율을 예시하는 그래프이다.

도 3은 생쥐에서의 Hp의 제거율을 예시하는 그래프이다.

본 발명의 특징 뿐만 아니라 다른 목적 및 잇점이 하기하는 것으로부터 명백할 것이다.

일반적으로 박테리아 감염 완료의 제1 단계는 박테리아가 숙주 세포에 부착하여 거기에서 생장하는 박테리아의 정착이다. 박테리아가 숙주 세포에 부착하기 위해서 숙주 세포의 표면상의 수용체에 어드헤신이 결합해야 한다. 박테리아 감염 부위의 특이성은 상기 어드헤신 및 수용체에 의해 결정된다. 박테리아가 숙주 세포에 부착할 때 수용체 분자가 공존한다면 경쟁적 억제가 일어나 감염이 일어나지 않는다.

Hp의 어드헤신 및 사람 위 점막상의 수용체는 Hp 감염의 억제를 위한 표적 분자로 여겨진다. 본 발명자들은 밝혀지지 않은 Hp의 어드헤신이 Hp에 의해 생산되는 우레아제임을 Hp의 부착 기전을 고려한 연구로 명백하게 밝혀내었다. 또한 본 발명자들은 계란으로부터 얻은 Hp의 우레아제에 대한 항체를 경구 투여하여 위에서 Hp의 생장을 현저하게 억제할 수 있음을 증명하였다 (일본 특허 출원 공개 제10-287585호).

본 발명자들은 위 점막에 우레아제가 부착하는 것을 억제할 수 있는 물질을 연구하여 뮤신, 예를 들어 우유로부터 유래된 뮤신 또는 계란의 알부민으로부터 유래된 뮤신이 Hp 세포의 표면층에 국한된 어드헤신인 우레아제와 특이적으로 결합함으로써 위에 정착하는 Hp를 제거할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

한 측면에 따르면 본 발명은 활성 성분으로 포유류 소화관으로부터 유래된 뮤신 이외의 뮤신을 포함하는 헬리코박터 파일로리 정착 억제제를 제공한다. 본 억제제는 사람을 포함하는 포유류에서 헬리코박터 파일로리에 의해 야기되거나 그와 결부된 질병, 예를 들어 소화성 궤양의 예방 또는 치료에 유용하다. 본 발명에 사용되는 뮤신은 바람직하게는 우유로부터 유래된 뮤신이거나 계란의 알부민으로부터 유래된 뮤신이다.

본 발명은 또한 포유류 소화관으로부터 유래된 뮤신 이외의 뮤신 및 위산 분비 억제제를 포함하는 헬리코박터 파일로리 정착 억제 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면 본 발명은 상기 헬리코박터 파일로리 정착 억제제를 함유하는 식품을 제공한다. 본 발명에 사용되는 뮤신은 바람직하게는 우유로부터 유래된 뮤신이거나 계란의 알부민으로부터 유래된 뮤신이다. 뮤신은 바람직하게는 식품의 0.5 내지 60 중량%의 양으로 포함된다.

본 발명에 따르면 포유류 소화관으로부터 유래된 뮤신 이외의 뮤신이 헬리코박터 파일로리 정착 억제제 중에 활성 성분으로 사용된다.

일반적으로 뮤신은 동물의 점막 또는 타액선에 의해 생산되는 점액성 물질이며 여러 당단백질을 포함한다. 뮤신은 또한 포유류의 초유 및 유액에 함유되어 있으며 계란의 알부민, 난대 및 난황막에 다량 함유되어 있다.

뮤신은 10⁶내지 10⁷의 한외 고분자량을 가지는 거대 중합체이며 단백질 10 내지 20 중량%와 탄수화물 80 내지 90 중량%로 이루어진다. 뮤신의 구성 (constitutive) 성분인 뮤신형 당단백질은 D-갈락토스, 시알산, L-푸코스, N-아세틸-D-갈락토스아민 등으로 이루어진 당 쇄가 펩티드에 결합되어 있으며 세린 또는 트레오닌의 히드록실기에 N-아세틸-D-갈락토스아민이 O-글리코시딕 결합으로 결합됨으로써 당 쇄가 펩티드에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이티드 (conjugated) 단백질이다. 당 쇄의 일부는 설페이트기를 포함한다.

본 발명에 사용되는 뮤신은 포유류 소화관으로부터 유래된 뮤신 이외의 임의의 뮤신일 수 있으며 포유류 유액, 및 가금류 난의 알부민, 난대 및 난황막으로부터 제조된 뮤신을 포함한다. 바람직하게는 소의 유액 (하기에서 우유로 칭함)로부터 유래되거나 계란의 알부민으로부터 유래된 뮤신이 그의 효과 때문에 사용된다.

우유 또는 계란의 알부민을 본 발명의 억제제의 활성 성분인 뮤신의 출발 물질로 사용할 경우, 이들 물질을 값싸게 다량으로 얻을 수 있으며 그로부터의 뮤신의 단리 및 정제를 간단한 방법으로 쉽게 수행할 수 있다. 또한 효소류 등의 오염물이 덜 존재하는 고순도의 뮤신을 상기 재료로부터 제조할 수 있다. 또한 우유로부터의 뮤신의 제조에 유장을 사용할 수 있다. 유장은 치즈 등의 제조 공정 동안 부산물로 다량 생성되지만 효과적인 사용 방법 없이 버려졌었다. 따라서 뮤신은 공업적으로 다량 제조될 수 있으며 우유로부터의 뮤신을 사용하는 것은 비용 및 실용 면에서 매우 유리하다.

또한 우유 또는 계란의 알부민 중 뮤신은 안정성이 높으며 가열 또는 낮은 pH에 의해 그의 생리학적 활성이 손실되지 않아 출발 물질로부터 용이하게 회수 및 정제될 수 있어 식품 또는 약제로의 제형화, 가공, 및 보관 면에서 유리하다.

우유는 여러 생리학적 활성을 가지는 물질을 포함한다. 예를 들어 락토페린은 항박테리아, 항바이러스 및 항암 활성 등의 여러 생리학적 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 당단백질로 이루어진 마크로 분자인 뮤신의 경우 단지 항 로타바이러스 활성만이 보고되었고 기타 생리학적 기능은 보고되지 않았다.

계란 단백질 (리소자임, 오보억제제, 아비딘, 오보트랜스페린 등)은 여러 생리학적 기능을 갖는 것으로 오랫동안 알려졌었다. 최근에 계란의 단백질을 프로테아제로 절단하여 얻은 단백질이 항고혈압 활성, 식균 작용 활성 등을 나타내는 것으로 보고되었다. 또한 오보뮤신 (계란의 알부민으로부터 유래된 뮤신)이 항로타바이러스 활성을 나타내며 오보뮤신, 난대, 및 난황막에 존재하는 황산화 당단백질이 마크로파지를 활성화하여 종양 괴사 인자 및 시토카인의 방출을 촉진하여 포유류 종양만을 사멸시킨다는 것이 보고되었다.

임의의 공지된 방법이 뮤신의 추출, 단리 및 정제에 사용될 수 있다. 일반적으로 소화관의 점막 또는 겔 층에 존재하는 뮤신은 균질화 또는 초음파 처리로 뮤신을 용해시키고 이어서 겔 여과 또는 에탄올 침전법으로 고분자량의 분획을 단리함으로써 회수될 수 있다. 뮤신은 구아니딘 히드로클로라이드, 우레아, 염 용액, 또는 계면활성제로 추출하거나 환원제 또는 프로테아제로 처리함으로써 용해시킬 수 있다. 몇몇 류의 뮤신은 4급 암모늄염과의 불용성 복합체를 형성시키거나 산성 조건 하에 침전시킴으로써 회수될 수 있다.

우유로부터의 뮤신의 제조에 있어서, 예를 들어 유지방 및 카제인은 유장을 얻는 통상적인 방법으로 우유로부터 제거될 수 있으며, 이어서 리포단백질을 유장으로부터 제거할 수 있고, 필요할 경우 농축 및 투석을 행할 수 있다. 이와 같이 얻어진 뮤신 포함 물질은 세파로스 (Sepharose) 컬럼 등을 사용하여 겔 여과하거나 막 등으로 처리하여 정제된 뮤신을 얻을 수 있다. 저분자량의 뮤신이 필요할 경우, 프로테아제 처리, 알칼리 가수분해 등의 처리를 더 행할 수 있다. 초유 또는 초유에 이어 생산되는 우유가 우유로 사용될 수 있다.

뮤신은 하기하는 바와 같이 계란의 알부민으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어 농축 알부민은 수집된 알부민으로부터 분리되며 아교질 부분을 한외여과법으로 얻는다. 이 부분으로부터 제조된 불용성 오보뮤신은 초음파 처리 또는 균질화 등의 방법으로 용해시키며 이것으로부터 겔 여과법, 막 처리법 또는 기타 방법으로 뮤신을 회수한다. 필요할 경우 겔 여과 등으로 더 정제할 수 있다.

본 발명에 사용되는 뮤신은 하기 예에서 증명되는 바와 같이 위 점막의 뮤신에 Hp에 의해 생산되는 우레아제가 부착하는 것을 억제할 수 있다. 우레아제는 Hp 세포의 표면상에 국한되기 때문에, 본 발명의 뮤신은 위에서 어드헤신인 우레아제에 주로 결합함으로써 우레아제를 차폐하여 위 점막의 수용체에 Hp가 부착하는 것을 억제한다. 이러한 사실은 동물 실험에서 확인되었으며, 위에서 Hp를 제거하는 것에 대한 본 발명에서 사용된 뮤신의 효과가 관찰되었다. 따라서 뮤신은 위에서의 Hp 정착의 억제제로 사용될 수 있으며 헬리코박터 파일로리에 의해 야기되거나 그와 결부된 질병, 예를 들어 소화성 궤양의 예방 또는 치료에 유용하다. 본 발명에 사용되는 뮤신은 천연형이며 매우 안전하다.

따라서 뮤신을 Hp 정착 억제제로 사용하여 약제 또는 식품으로 제형화할 수 있다. 특히 우유 또는 계란의 알부민으로부터의 뮤신은 과거에 식용되었으며 따라서 항 Hp 기능 식품, 건강 식품, 및 항 Hp 활성을 갖는 의학 용도의 식품 등의 식품으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 Hp 정착 억제제는 제약적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제형화하여 제약 조성물을 제조할 수 있다. 필요할 경우 기타 첨가제 또는 제제가 첨가될 수 있다. 예를 들어 제산제 (예를 들어, 탄산수소나트륨, 탄산마그네슘, 침전 탄산칼슘, 합성 히로탈사이트 (hyrotalsite)), 위 점막 보호용 제제 (예를 들어 합성 규산알루미늄, 수크랄페이트, 및 소듐 카퍼 클로로필린) 및 소화 효소 (예를 들어 바이오디아스타제 또는 리파제)를 제약 조성물에 첨가할 수 있다. 제약 조성물은 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 억제제의 투여는 경구 경로로 행할 수 있다. 본 발명의 억제제의 투여량은 용법, 목적 및 증상의 상태에 따라 선택된다. 일반적으로 성인의 경우 일일 0.6 내지 2.6 g, 바람직하게는 1 내지 2 g의 뮤신을 투여할 수 있다.

추가로, 뮤신을 포함하는 Hp 정착 억제제는 위산 분비 억제제와 함께 사용될 수 있다. 뮤신과 위산 분비 억제제의 배합물은 뮤신 단독보다 위에서 Hp를 제거하는 데 더 효과적이다. 본 발명에 사용되는 위산 분비 억제제의 예로는 H₂억제제, (예를 들어, 파모티딘, 니자티딘, 록사티딘, 라니티딘 또는 시메티딘) 및 프로톤 펌프 억제제 (예를 들어, 오메프라졸, 란소프라졸 또는 소듐 라베프라졸)이 있다. 위산 분비 억제제의 투여량은 바람직하게는 성인의 경우 일일 20 내지 30 mg일 수 있다.

뮤신은 생리학적 기능 식품 또는 의학 용도의 식품에 첨가제로 사용될 경우 일반적으로 약 0.5 내지 5.0 중량%, 바람직하게는 약 1 내지 3 중량%의 뮤신이 식품 중에 포함될 수 있다. 생리학적 기능 식품의 종류는 제한되지 않으며 연속적으로 섭취될 수 있는 식품, 예를 들어 감미료, 분말 수프, 및 음료수가 바람직하다. 의학 용도의 식품의 예로는 액상 식품이 바람직하다. 이러한 식품은 뮤신 부형제, 예를 들어 덱스트린, 점착제, 예를 들어 소듐 카제인, 및 필요할 경우 영양제, 예를 들어 비타민 및 미네랄, 유화제, 안정화제, 및 향신료를 첨가함으로써 제조할 수 있다. 또한 뮤신을 수프, 음료수, 또는 액상 식품 등의 식품에 첨가하여 의학 용도의 다양한 식품 형태로 제조할 수 있다. 뮤신은 건강 식품으로 사용될 경우 활성 성분으로서 식품의 약 30 내지 60 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 뮤신은 부형제, 예를 들어 락토스, 옥수수 전분, 결정질 셀룰로스, 및 PVP, 결합제, 및 필요할 경우 영양제, 예를 들어 비타민 및 미네랄과 함께 미립자, 정제, 및 과립 등의 여러 형태로 제형화될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더 예시하기 위하여 주어진 것이다. 본 발명은 실시예에 나타낸 구체적인 설명에 한정되지는 않는 것임을 알아야 한다.

실시예 1

우유로부터의 뮤신의 제조

분만 직후 생산되는 우유 (초유) 약 1,000 ml 및 분만한지 10일 후에 생산되는 우유 약 1,000 ml을 우유로서 제조하였다. 각각을 4℃에서 30분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하여 유지방을 제거하고 상청액을 회수화였다. 이어서 pH가 4.5가 될 때까지 1M 아세트산을 상청액에 적가하여 카제인을 제거하였다. 우유를 실온에서 1시간 동안 정치한 후 원심분리로 카제인을 제거하여 유장을 얻었다. 이어서 리포단백질을 제거하기 위하여 1N NaOH를 사용하여 유장의 pH를 7로 조정하고 여기에 유장 1 ml 당 1M CaCl₂0.1 ml 및 10% 덱스트란 설페이트-500 0.02 ml을 첨가하였다. 액체를 실온에서 1시간 동안 정치한 후 4℃, 10,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상청액을 얻었다. 각 상청액을 약 1/20 부피로 농축시켜 100배 양의 정제된 물에 대하여 투석시키고 사용할 때까지 -30℃ 이하에서 보관하였다.

상기 유장으로부터 뮤신 (당단백질)을 정제하기 위하여 0.15 M NaCl + 2 mM EDTA + 0.02% NaN₃를 포함하는 50 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형된 세파로스 Cl-2B 겔 컬럼에 각 샘플을 가하고 분획화하여 분획 수집기에 분획 10 ml을 취하였다. 분획을 단백질의 용출 패턴에 따라 F1, F2, F3, 및 F4의 네 분획으로 나누었다. 각 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과 F1 분획이 고농도의 당단백질을 포함하는 거대 분자임을 확인하였다. 거대 분자 중 당단백질의 함량 면에서는 초유로부터 유래된 분자와 초유 후의 우유로부터 유래된 분자 사이에 특별한 차이가 없었다. 따라서 초유 후의 우유를 그의 이용가능성 때문에 다량의 뮤신을 정제하는 데 사용하였으며 뮤신 약 100 mg (건조 중량)을 우유 1,000 ml로부터 얻었다.

실시예 2

계란의 알부민으로부터 유래된 뮤신 (오보뮤신)의 제조

화이트 레그혼 (White Leghorn) 암탉의 낳은지 1주일 이내의 미수정란 50개로부터 알부민만을 수집하고 체질하여 농축된 알부민을 분리하였다. 한외원심분리 (100,000g x 60분)로 얻은 아교질 부분을 2% KCl로 반복적으로 세척하여 불용성 오보뮤신을 제조하였다. 오보뮤신은 정제수로 세척한 후 멘셀 (Mensel) 완충제 (pH 9.5, 이온 세기=0.01)에 현탁시키고 100 W, 9 KH₂(2℃)에서 10분 동안 초음파 처리하여 용해시켰다. 상기 용해된 생성물을 세파로스 CL-2B 겔 컬럼에 가하여 상기 실시예 1 (우유로부터의 뮤신의 제조)의 F1 분획을 회수하였다. F1 분획을 SDS-PAGE로 분석하였더니 우유 유래 뮤신과 유사한 당단백질을 고농도로 포함하는 것으로 나타났다. 그의 분자량은 약 5.5 내지 8.3 x 10⁶이었다. 계란의 알부민으로부터 유래된 뮤신 약 2,000 mg (건조 중량)을 회수하여 하기 실험에 사용하였다.

실험 1. 생체외 실험

Hp에 의해 생산된 우레아제의 위 점막으로의 정착에 대한 억제 효과는 실시예 1에서 제조된 우유 유래 뮤신 및 실시예 2에서 제조된 알부민 유래 뮤신을 사용하는 경우 생체외 실험 시스템에서 조사하였다.

비교를 위하여 네마시스투스로부터 유래된 다당류인 푸코이단 (Sigma사, 일본 특허 출원 공개 제7-138166호에 기술됨)을 Hp 정착의 억제제로 사용하였다. 이 특허 출원 공개에 기재된 생체외 실험 시스템은 Hp의 어드헤신이 푸코스라는 가정에서 구축되었으나 이 출원서에서는 푸코이단이 Hp로 감염된 생쥐에 투여될 경우 Hp 정착에 대하여 억제 효과를 갖는다는 것을 보여주지는 못하였다.

재료 및 방법

본 발명자들은 Hp의 어드헤신이 Hp에 의해 생산되는 우레아제라는 것을 이미 밝혀내었다. 이 우레아제가 위 점막의 뮤신에 우수하게 결합하기 때문에 우레아제 부착 시험에 사용하는 돼지 위 뮤신을 하기와 같이 제조하였다.

돼지 위 뮤신의 제조

약 2개월령의 건강한 돼지를 도살하고 그의 위를 회수하여 그의 내부를 0.1 M 인산염 + 0.15 M NaCl + 5 mM N-에틸 말레이미드 (NEM) + 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF) + 1 mM EDTA를 포함하는 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 위를 절개하여 위 점막을 긁어내어 상기 완충제에 현탁시켰다. 이 점막 현탁물을 얼음으로 냉각시키면서 폴리트론 호모게나이저로 균질화하고 15,000 x g에서 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 상청액을 다시 25,000 x g에서 원심분리하여 상청액을 회수하고 증류수에 대하여 투석시켜 동결건조시킴으로써 조 위 뮤신을 얻었다. 이어서 상기 동결건조된 조 위 뮤신을 6 M 구아니딘 히드로클로라이드 및 프로테아제 억제제 (5 mM NEM, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA)를 포함하는 PBS (pH 6.8)에 용해시켜 염화세슘 밀도 구배 (1.5 g/ml)에 가하고 34,000 x g에서 48시간 동안 원심분리하였다. 시아누르산 포함 분획은 니트로셀룰로스 막 블로팅 및 과요오드산 쉬프 (Schiff) 시약에 의한 건조로 검출하였다. 염색된 분획을 모아 염화세슘 밀도 구배에 가하여 원심분리하였다. 염색 양성 분획을 모아 동결건조시켰다. 이어서 동결건조한 생성물을 0.1 M 인산염 완충액 (0.1 M NaCl, pH 6.8)으로 평형시킨 세파로스 CL-4B 컬럼을 통하여 겔 여과하여 분획화를 수행하였다. PAS 염색 양성이며 단백질이 고농도로 존재하는 분획을 모아 PBS (pH 6.8)에 대하여 투석하여 정제된 돼지 위 뮤신을 얻고 이것을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 얻어진 위 뮤신은 SDS-PAGE 결과 66 kD의 당단백질인 것으로 확인되었다.

돼지 위 뮤신에 대한 우레아제 부착 시험

우레아제 부착 시험용 마이크로플레이트를 하기와 같이 만들었다.

96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 1.25% 글루타르알데히드 용액 100㎕씩을 첨가하고, 5분 동안 감작시켰다. 각 웰을 증류수로 3회 세척한 후 정제된 돼지 위 뮤신 (1.27 mg/ml) 50㎕씩을 각 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 정치하여 고정화하였다. 마이크로플레이트를 사용할 경우 각 웰에 3% BSA를 첨가하여 37℃에서 60분 동안 반응되게 함으로써 블로킹하였고 이어서 플레이트를 0.05% 트윈 (Tween) 20이 보충된 PBS로 3회 세척하였다.

마이크로플레이트에 고정된 돼지 위 뮤신에 우레아제가 부착하는 것을 관찰하기 위하여 우레아제 부착 시험을 상기에서 만들어진 마이크로플레이트를 사용하여 하기와 같이 수행하였다.

정제된 바이오티닐화 우레아제는 pH 범위가 다른 부착 매질 (0.01% 트윈 20 및 0.15 M NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액, pH는 2.0, 3.0, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 또는 6.5로 조정함)로 최종 농도가 7.0 ㎍/ml이 되도록 희석하였다. 이렇게 제조한 각 우레아제 샘플을 상기 뮤신 고정 마이크로플레이트의 웰 2개에 첨가하여 37℃에서 60분 동안 감작시켰다. 이어서 각 웰을 부착 매질로 3회 세척한 직후 10% 중성 포르말린 (pH 7.4)를 각 웰에 첨가하고 이 플레이트를 37℃에서 30분 동안 정치하여 고정화하였다. 웰에 부착된 우레아제의 양을 측정하기 위하여 스트렙토아비딘 HRP를 각 웰에 첨가하여 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 이어서 기질로 오르토-페닐렌디아민 2HCl 및 H₂O₂를 첨가하여 반응시켰다. 3 N H₂SO₄를 반응 종료에 사용하였다. 연속적으로 2배로 희석한 알려진 양의 우레아제를 러닝 (running) 플레이트에 두어 그의 보정 곡선을 사용하여 샘플 중의 우레아제의 양을 측정하였다.

우레아제 부착 억제 시험

우레아제 부착 억제 시험은 본 발명의 뮤신 (우유 및 계란 알부민으로부터의 뮤신) 및 푸코이단 (비교예)를 사용하여 수행하였다. 먼저, 여러 농도의 샘플을 바이오티닐화 우레아제와 각각 혼합하고, 각 혼합물을 37℃에서 60분 동안 진탕시켜 감작시켰다. 이어서 돼지 위 뮤신이 고정된 96웰 마이크로플레이트의 각 웰로 상기 혼합물을 옮기고, 플레이트를 37℃에서 60분 동안 진탕시켜 감작시켰다. 이어서 마이크로플레이트의 각 웰을 부착 매질 (pH 3.0)로 3회 세척하고 65℃에서 10분 동안 가열 고정시켰다. 고정된 웰을 PBS-트윈 20 (0.5%, pH 6.8)로 3회 세척하고, 스트렙토-아비딘 HRP를 각 웰에 첨가하여 돼지 위 뮤신에 부착하는 바이오티닐화 우레아제를 상기 ELISA법으로 검출하였다.

결과

정제된 위 뮤신에 대한 우레아제의 부착 패턴

도 1에 예시된 바와 같이 우레아제는 돼지 위 뮤신에 특이적으로 부착하며 이 부착 패턴은 pH에 의존적이다. pH 약 3.0에서의 우레아제 부착 반응이 위 점막에서의 Hp의 정착 특성을 반영하는 것으로 여겨졌기 때문에 이 pH 범위에서 우레아제 부착을 억제할 수 있는 물질은 위에서의 Hp 정착을 억제할 수 있다.

뮤신을 사용한 우레아제 부착의 억제

도 2에 예시된 바와 같이 돼지 위 뮤신에 우레아제가 부착하는 것은 우유로부터 유래된 뮤신 및 계란 알부민으로부터 유래된 뮤신에 의해 농도 의존적으로 억제된 반면, 푸코이단은 우레아제 부착 억제능이 낮은 것으로 나타났다. 우레아제는 Hp 세포의 표면에 국한되며 따라서 본 발명의 뮤신은 Hp에 의한 감염을 억제할 수 있다 (즉, 세포의 우레아제에 결합하여 위에서 어드헤신인 우레아제를 차폐함으로써 위에서 Hp를 제거함).

실시예 2. 생체내 실험

본 실험은 실험 1의 결과를 더 확인하기 위하여 수행하였다.

방법

실험 동물은 Hp 감염에 매우 민감한 털없는 생쥐 (NS:Hr/ICR, Research Institute for Human and Animal Propagation, 접근 번호 제IRA-NHI-9701)(ATCC #72024)였다 [Clin. Diagn. Lab. Immunol. 5: 578-582, 1998]. 다수의 털없는 생쥐 각각에 1 x 10⁹CFU의 NSP 335를 경구 투여하였다. 1주일 동안 사육한 후 드링크에 용해시킨 여러 농도의 샘플을 4주 동안 생쥐에 투여하였다. 대조군에는 샘플을 전혀 포함하지 않는 드링크를 투여하였다. 각 군의 생쥐 수는 10마리였으며 드링크의 양은 생쥐 당 일일 4 내지 8 ml이었다. 샘플의 투여가 완료된 후 각 군의 생쥐를 도살하였다. 생쥐의 위를 회수하여 내용물을 제거한 후 와동 혼합기를 사용하여 PBS (pH 7.2)로 위를 8회 세척하고 호모게나이저로 균질화하여 에멀젼을 형성시켰으며, 이것을 Hp 검출에 사용하였다. Hp의 검출은 Hp 검출용 매질 (Poremedia Hp 단리 매질, Eiken Kagaku사 제품)에 에멀젼을 넣고 가스 팩 방법으로 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하여 콜로니의 수를 셈으로써 수행하였다.

결과

Hp 정착 생쥐에서 Hp 제거에 대한 우유 유래 뮤신 및 알부민 유래 뮤신의 효과

도 3에 예시된 바와 같이 우유 유래 뮤신 및 알부민 유래 뮤신은 농도에 의존적인 방식으로 위에서 Hp를 제거할 수 있다. 반면 푸코이단은 본 발명의 뮤신과는 달리 Hp 정착의 억제에 대하여 현저한 효과를 나타내지 않았다. 대조군의 생쥐는 100% (10마리/10마리)가 Hp로 감염되었다. 이러한 결과로부터 우유 유래 뮤신 및 알부민 유래 뮤신이 Hp에 의해 생산되는 우레아제에 주로 결합하여 어드헤신인 우레아제를 차폐함으로써 Hp에 의한 감염을 억제할 수 있다고 생각된다.

실험 3. 생체내 실험

본 실험은 동물에서 뮤신과 위산 분비 억제제 (H₂억제제 또는 프로톤 펌프 억제제)의 배합물에 의해 얻어지는 상승 효과를 증명하기 위하여 수행하였다. 이 실험에서 실험예 2에서 높은 제균율을 보인 우유로부터의 뮤신을 뮤신으로 사용하였다. H₂억제제 (파모티딘) 또는 프로톤 펌프 억제제 (오메프라졸)를 시도 후 1주일로부터 1주일 동안 강제로 경구 투여한 것을 제외하고 실험예 2와 동일한 방법을 사용하였으며 우유로부터의 뮤신은 시도후 1주일로부터 2주 동안 드링크 형태로 경구 투여하였다. 표 1에는 위에서의 Hp 제거 효과가 예시되어 있다.

투여군	비감염 생쥐	제균율 (%)
우유로부터의 뮤신(2.0 ㎍/ml)+파모티딘 (200㎍/ml)	6/6	100
우유로부터의 뮤신(2.0㎍/ml)+오메프라졸(15㎍/ml)	5/6	83.3
대조군	0/0	0

표 1에 예시된 바와 같이 뮤신과 위산 분비 억제제의 배합물은 투여 기간이 짧고 뮤신의 양이 실험 2에서의 양보다 적음에도 불구하고 높은 제균율을 나타내었는데, 이는 이 배합물이 뮤신 단독보다 더 효과적임을 의미한다.

실시예 1에서 제조한 우유 유래 뮤신을 하기 제제 예에서 뮤신으로 사용하였다.

제제 1(식품)

(츄잉 검)

검 베이스 25.0

탄산칼슘 2.0

소르비톨 54.0

만니톨 16.0

풍미제 1.0

뮤신 1.0

물 100.0이 되게 하는 양 (중량%)

(아이스크림)

크림 (지방 함량 40%) 32.54

우유 (지방 함량 3.7%) 33.16

무가당 탈지 연유 16.08

설탕 11.75

옥수수 시럽 4.67

안정화제 0.3

뮤신 1.5

합계 100.0 (중량%)

(분말 수프)

요리용 분말 콩 66.5

밀가루 3.5

밀 배 2.5

건조 효모 분말 2.5

양파 분말 4.8

육류 추출물 분말 15.5

소금 0.2

향신료 (흰 후추 등) 1.8

조미료 (아미노산 등) 0.2

뮤신 2.5

합계 100.0 (중량%)

(건조 수프) 10.0 g/200 ml

계란 3.6

육류 추출물 1.0

양파 추출물 1.7

당근 페이스트 2.1

콤부 추출물 0.1

유화제 0.1

소금 0.2

향신료(적색 후추) 0.2

조미료 (아미노산 등) 0.2

뮤신 0.8

합계 10.0 g

제제 2 (건강 식품)

제형예 1: 미립자 100 g 중

뮤신 45 g

락토스 (200 M) 35 g

옥수수 전분 15 g

PVP (K-30) 5 g

이들 성분은 통상의 습식 과립화법으로 미립자로 제형화하였다.

제형예 2: 과립 100 g 중

뮤신 33 g

락토스 (200 M) 44 g

옥수수 전분 18 g

PVP (K-300) 5 g

이들 성분은 통상의 압출성형 과립화법으로 과립으로 제형화하였다.

제제 3 (의학 용도의 식품)

액상 식품 (200 ml/팩)

뮤신 2.6

말토덱스트린 39.0

카제인 Na 13.0

식물유 12.0

비타민 1.0

미네랄 1.5

유화제 0.2

우유 단백질 10.3

인산나트륨 1.8

인산칼륨 1.2

풍미제 0.5

안정화제 (카라기난) 1.5

물 100.0이 되게 하는 양 (중량%)

강장제 (수프형)

뮤신 2.5

당근 (당근 페이스트) 10.0

중크림 12.0

락토스 1.8

양파 (양파 추출물) 1.5

우유 단백질 분말 0.5

우유 올리고당 1.5

콩소메 분말 0.5

밀 배 0.5

난피 칼슘 0.2

유장 칼슘 0.1

소금 0.2

유화제 0.2

물 100.0이 되게 하는 양 (중량%)

상기에서 명백하게 알 수 있듯이, 본 발명에 따르면 안전하고 효과적인 Hp 정착 억제제 및 이 억제제를 포함하는 식품이 제공된다. 따라서 Hp에 의해 야기되는 소화성 궤양 등의 질병을 부작용 발생 없이 효과적으로 억제할 수 있다. 본 발명에 사용되는 뮤신의 출발 물질로서 값싸게 다량으로 얻을 수 있는 우유 또는 계란을 사용하여 탁월한 효과를 나타내는 뮤신을 간단한 방법으로 제조할 수 있다. 또한 소화성 궤양의 치료에 사용되는 항생제와는 달리 뮤신은 약품에 내성을 갖는 박테리아를 생성하는 문제점 없이 위에서 Hp를 특이적으로 제거할 수 있다.

Claims

포유류 소화관으로부터 유래된 뮤신 이외의 뮤신을 활성 성분으로 포함하는 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 정착 (colonization) 억제제.
제1항에 있어서, 뮤신이 우유 또는 계란의 알부민으로부터 유래된 것인 억제제.
제1항에 있어서, 헬리코박터 파일로리에 의해 야기되거나 그와 결부된 질병의 예방 또는 치료에 유용한 억제제.
제3항에 있어서, 질병이 소화성 궤양인 억제제.
포유류 소화관으로부터 유래된 뮤신 이외의 뮤신 및 위산 분비 억제제를 포함하는 헬리코박터 파일로리 정착 억제 조성물.
제5항에 있어서, 뮤신이 우유 또는 계란의 알부민으로부터 유래된 것인 억제 조성물.
제5항에 있어서, 헬리코박터 파일로리에 의해 야기되거나 그와 결부된 질병의 예방 또는 치료에 유용한 억제 조성물.
제5항에 있어서, 질병이 소화성 궤양인 억제 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 헬리코박터 파일로리 정착 억제제를 포함하는 식품.
제9항에 있어서, 뮤신이 식품의 0.5 내지 60 중량%의 양으로 존재하는 것인 식품.