KR20000022488A

KR20000022488A - 치료 디엔에이 생성방법

Info

Publication number: KR20000022488A
Application number: KR1019980710929A
Authority: KR
Inventors: 조엘 크루제; 베아트리체 카메롱
Original assignee: 자끄 사비나; 로오느-푸우랜크 로레르 소시에테 아노님
Priority date: 1996-07-04
Filing date: 1997-06-24
Publication date: 2000-04-25
Also published as: JP2000514293A; US20020187527A1; FR2750704A1; NO986177D0; ZA975959B; BR9710173A; CZ438298A3; EP0914418A1; AU3447597A; IL127620A0; AU722909B2; NO986177L; US6410273B1; FR2750704B1; SK181498A3; CA2258792A1; WO1998001540A1

Abstract

본 발명은 DNA, 특히 플라스미드 DNA의 제조를 기재한다. 좀더 상세하게는 본 발명은 유전자 치료에 사용될 세균 플라스미드 DNA의 플라스미드, 미니써클 수퍼코일, 느슨한 또는 선형 형태로의 생성에 관한 것이다.

Description

치료 디엔에이 생성방법

유전자 치료는 유전 정보를 병에걸린 세포 또는 기관에 도입함으로써 결함 또는 비정상을 정정함에 있다. 이러한 정보는 시험관내에서 기관으로부터 추출된 세포로 도입된 다음 생체 또는 표적 조직으로 직접 재주입될 수 있다. 음으로 하전된 고 분자량 분자인 DNA는 인지질 세포막을 통하여 자발적으로 통과하는 데에 곤란을 겪는다. 따라서, 다양한 벡터: 한편으로 바이러스 벡터, 한편으로는 천연 또는 합성 화학 및/또는 생화학 벡터가 유전자 전달을 허용하기 위해서 사용된다. 바이러스 벡터(레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스 등)가 특히 막 통과에 매우 효과적이지만, 다수의 위험, 예를 들면, 병원성, 재조합, 복제, 면역성 등이 존재한다. 화학적 및/또는 생화학적 벡터는 이러한 위험을 피할 수 있게 한다 (검토를 위해 Behr, 1993, Cotten and Wagner, 1993 참조). 이들은 예를 들면, 침전물을 DNA로 형성시킴으로써 작용한 다음 침전물이 세포에 의해서 "식작용화"될 수 있는 양이온 (칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란 등)이다. 이들은 또한 DNA가 혼입되고 원형질 막과 융합할 수 있는 리포솜일 수 있다. 합성 유전자 전달 벡터는 일반적으로 양이온성 지질 또는 DNA를 복합하고 이것으로 양성 표면 전하를 운반하는 입자를 형성하는 양이온성 지질 또는 중합체이다. 이러한 입자는 세포막의 음전하와 상호작용한 다음 이를 크로싱할 수 있다. 이러한 벡터의 예로서, 디옥타데실아미도글리실스퍼민 (DOGS, Transfectam^TM) 또는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA, Lipofectin^TM)를 언급할 수 있다. 키메릭 단백질이 또한 개발되었다: 이들은 DNA를 응축하고, 막 수용체에 결합하는 리간드에 연결되고 엔도시토시스에 의해서 세포에 착물을 발생시키는 다가양이온성 부분으로 이루어져 있다. 따라서, 전달된 유전자의 생체내 생이용능을 개선하기 위해서 조직 또는 특정 세포군을 "표적화"하는 것이 이온적으로 가능하다.

유전자 치료에 널리 사용되는 플라스미드는 일반적으로 (i) 복제 오리진, (ii) 마커 유전자, 예를 들면, 항생제에 내성이 있는 유전자 (카나마이신, 앰피실린 등) 및 (iii) 발현에 필수적인 서열을 갖는 하나 이상의 트랜스진 (인핸서, 프로모터, 폴리아데닐화 서열 등)을 운반한다. 이러한 유형의 플라스미드는 예를 들면, 흑색종 치료와 같은 임상 시도의 상황(Nabel et a., 1992)에서 또는 실험 연구의 상황에서 유전자 치료에 널리 사용된다.

그러나, 유전자 치료시 플라스미드 DNA의 사용은 다수의 문제를 유발한다.

특히, 이것은 약물학적 순도의 대량의 DNA를 생성할 가능성을 수반한다. 사실상, 이러한 유전차 치료 기술에서, 약물은 DNA 자체로 이루어지고, 적합한 양으로 인간에게 치료용으로 적합한 성질을 갖는 DNA를 제조할 수 있음이 본질적이다. 이와 관련하여, 생성 및/또는 정제의 다양한 방법이 선행 기술에 기재되어 왔고, 플라스미드 DNA의 질이 개선될 수 있게 한다 (PCT/FR95/01468; FR96 03519).

또한, 항생제에 내성이 있거나 복제의 작용성 오리진의 유전자를 운반하는 DNA의 사용은 특히 생체내 산포에 연관된 약간의 약점을 지닐 수 있다. 다양한 접근이 또한 이러한 약점을 제한하기 위해서 개발되었다 (PCT/FR96/00274, FR95 10825).

지금까지 사용된 플라스미드 DNA의 다른 약점은 이의 기원에 있다. 이들은 사실상, 본질적으로 인간에게 면역원성인 모티프를 잠재적으로 지니는 원핵 유기체(세균)에서 생성되는 분자 또는 하등 원핵 유기체 (효모)이다. DNA의 면역학적 성질은 여전히 상대적으로 알려져 있지 않다. 쥐에서의 세균 DNA는 i) 가능한 면역작용을 하지만 포유동물 이본쇄 DNA와 반응하지 않는 이본쇄 및 일본쇄 세균 DNA를 인식하는 항체의 합성을 유발하고, ii) 마크로파지 및 시토카인 생성의 자극을 유발한다 [참조문헌: D. Pisetsky "The Immunologic Properties of DNA", J. Immunol. 156 (1996) 1]. 따라서, DNA 거대분자는 면역원성인 것으로 언급된다. 또한, 거대분자는 또한 면역원성이지 않으면서 면역 시스템의 자극을 유발할 수 있다 (예를 들면, 세포-매개 면역 반응으로 인도되는 외부 생체). 세균 DNA가 면역 반응을 유발한다는 것을 제안하는 첫번째 증거가 Pisetsky 등에 의해서 기재되었다 (1991 J. Immunol. 147 p.1759). 이들은 3 종의 세균의 DNA가 쥐 림포사이트를 자극할 수 있고, 3 종의 동물로부터 추출된 DNA는 이러한 자극을 유발하지 않는다. 이어서, 야마모토 등(1992 Microbiol. Immunol. 36 p. 983)은 6 종의 세균 DNA가 BALB/c 쥐의 췌장 세포에서 "천연 킬러" NK 활성의 증가 및 인터페론 생성의 유도를 유발한다. 그러나, 10 종의 척추동물로부터 추출된 DNA는 이러한 반응을 유발하지 않는다. 또한, Krieg 등은 1995년 (Nature vol. 374 p.546)에 이. 콜라이드의 게놈 DNA 단편이 시험관내에서 쥐의 B 세포의 증식 및 IgM 이뮤노글로불린의 분비를 유도하고, 반면에 생체내에서 CpG 메틸라제로 처리된 이러한 동일한 세균 DNA는 이러한 반응을 유도하지 않는다고 보고하였다. Krieg 등은 또한 비메틸화 DNA의 존재하에, 인터페론-γ가 생성되고, IL-6의 생성을 B 세포에 의해서 조정시킴으로써 B 세포의 분화를 공자극하는 인자로서 작용함을 예시한다 (Krieg et al., 1996 J. Immunol. 156 p.558). 또한 비메틸화 CpG 모티프를 갖고 5' 말단에서 2 개의 퓨린에 의해서 및 3' 말단에서 2 개의 피리미딘에 의해서 플랭킹된 올리고뉴클레오티드가 NK 세포 (IFN-γ), B 세포 (IL-6 및 IL-12) 및 CD4⁺T 림포사이트 (IL-6 및 IFN-γ)에 의해서 생체내에서 인터루킨 IL-6 및 IL-12 및 인터페론-γ의 조정된 분비를 유발한다 (Krieg et al. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 p.2879).

유전자 치료에서 지금까지 사용되어 온 플라스미드 DNA는 본질적으로 원핵 세포에 생성되고, 따라서, 세균 게놈 DNA의 것과 비교하여 메틸화 프로필을 나타낸다. 이것은 또한 근육 또는 간으로 주입된 다음 추출된 플라스미드 DNA가 원핵 메틸화 프로필을 보유하는 것으로 증명되었다 (Wolf et al. 1992 Hum. Mol. Genet. 1 p. 363; Melone et al. 1995 J. Biol. Chem. 269 p.29903). 결과적으로, 사용된 플라스미드 DNA는 면역 시스템의 자극을 위한 상당한 포텐셜을 지닌다.

따라서, 감소되거나 심지어 제거되는 면역학적 성질을 갖는 플라스미드 DNA를 일회용으로 지닐 수 있음이 특히 유리할 것이다. 이러한 유형이 플라스미드 DNA가 산업적 활용과 상업적인 규모에서 생성될 수 있게 하는 방법을 일회용으로 지닐 수 있음이 특히 유리할 것이다.

본 발명은 DNA, 특히 플라스미드 DNA의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 좀더 상세하게는 유전자 치료에 사용될 수 있는 세균 플라스미드 DNA를 면역성이 감소되거나 제거되는 플라스미드, 수퍼코일 또는 관련된 미니써클 또는 선형 형태로의 생성에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA 생성에 사용될 수 있는 미생물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

도 1. 플라스미드 pXL2784의 지도

도 2. 플라스미드 pXL2784의 제한효소 지도

도 3. 플라스미드 1-pXL2784, 2-메틸화된 pXL2784, 3-메틸화된 pXL2784 + 메틸화된 pAIT2 및 4-메틸화된 pAIT2의 분해 단면도로서, 효소 A-AatII, B-BstBI, C-HindIII, D-HpaII, E-EcoRI에 의해 분해되었다 (M은 1kb의 눈금 분자량 마커이다).

클로닝 및 분자생물학에 관한 일반적 기술

세슘 클로라이드-에티디움 브로마이드 구배에서의 플라스미드 DNA의 원심분리, 제한효소로의 분해, 겔 전기영동, 아가로스 겔로부터 DNA 단편의 전기용리, 이. 콜라이에서의 형질전환, 핵산의 침전 등과 같은 분자생물학의 표준 방법이 문헌(Maniatis et al., 1989, Ausubel et al., 1987)에 기술되어 있다. 핵산 서열은 이미 언급한 바 있는 프로토콜(Ausubel et. al., 1987)에 따라 쇄 종결 방법에 의해 결정하였다.

제한효소는 New England Biolabs, Bethesda Research Laboratories, BRL 또는 Amersham Ltd.에서 공급되었다.

라이게이션을 위해, DNA 단편을 0.7% 아가로스 겔 또는 0.8% 아크릴아마이드 겔 상에서 이들의 크기에 따라 분리하고, 전기영동에 의해 정제한 다음, 전기용출하여 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨 후, 50 mM Tris-HCl 완충액 pH 7.4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 mM ATP 내에서 T4 파지 DNA 리가제의 존재하에 배양한다. 올리고뉴클레오티드를, 제조자의 사양서를 사용하여 Applied Biosystems 394 DNA/RNA 합성기 자동 DNA 합성기를 가지고 포스포라미디트 화학을 사용하여 합성하는데, 후자 유도체는 시아노에틸기에 의해 β-위치에서 보호된다 (Sinha et al., 1984, Giles 1985).

LB 및 2XTY 배양 매질은 세균학 분야에서 사용된다 (Maniatis et al., 1989).

플라스미드 DNA는 또한, 알카라인 용해 기술에 따라 정제된다 (Maniatis et al., 1989).

본 발명은 이러한 문제에 대한 해결책을 제공한다. 본 출원인은 이러한 주의력을 사실상 세균 DNA의 면역원성으로 돌렸다. 본 출원인은 바람직하지 못한 면역원성 효과가 잠재적으로 결핍된 약학적 등급의 플라스미드 DNA가 생성될 수 있게하는 방법을 개발하였다. 본 출원인은 또한 DNA의 일부 잔기의 메틸화가 플라스미드 DNA의 면역원성 포텐셜이 세포를 형질감염시키고 해당 핵산을 발현시키는 능력에 영향을 미치지 않으면서 감소될 수 있게 함을 예시하였다.

본 발명의 한 양태는 DNA, 특히 치료 품질의 플라스미드 DNA를 제조하는 것이다. 다른 양태에 따라서, 본 발명은 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 상에 메틸화된 플라스미드 DNA의 유전자 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 제 3 양태는 메틸화된 플라스미드 DNA를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 메틸라제 발현에 의한 DNA의 생체내 메틸화 방법에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 발현 카세트, 메틸화에 사용될 수 있는 숙주 미생물, 치료 조성물의 제조 및 유전자 전달방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 제 1 주제는 DNA가 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기가 메틸화될 수 있게 하는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 발현 카세트를 함유하는 세포에서 생성됨을 특징으로 하는 DNA 생성방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기 상에서 메틸화되는 DNA, 특히 플라스미드 DNA의 생성에 관한 것이다.

시험관내 플라스미드 DNA의 메틸화가 문헌[참조: Adams et al., 1992 FEBS Letters 309 p. 97; Doerfler 1994 FEBS Letters 344 p. 251; Komura et al., 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p.73]에 기재되어 있다. 그러나, 이러한 양식의 메틸화는 유전자 치료에 사용될 플라스미드의 산업적 생성을 위해 정시될 수 없다. 플라스미드 DNA 생성방법은 사실상 대량의 동종 플라스미드가 재생성으로 생성되고 이러한 DNA가 약학 적용에 허용되는 방법에 의해서 정제될 수 있게 해야 한다. 시험관 내에서 메틸화된 DNA가 아마도 뱃치로부터 뱃치까지 이완되고 (Doerfler 1994 FEBS Letters 344 p. 251) 생성된 양이 제한됨이 매우 명백하다.

본 발명은 숙주 세포에 메틸라제를 암호화하는 숙주 세포를 공발현시킴으로써 생성 도중 직접 해당 플라스미드를 메틸화함이 가능함을 예시한다. 본 발명은 또한 본 방법에 따라서, 대량의 동종 메틸화된 플라스미드가 생성될 수 있고 메틸화된 플라스미드 DNA가 이미 기재되어 있는 방법에 따라서 정제될 수 있음을 예시한다. 본 출원인은 또한 유리하게도 이렇게 하여 메틸화된 플라스미드 DNA가 표적 세포를 형질감염시키고 경우에 따라 이를 복제하는 능력을 보유함을 증명하였다. 본 출원인이 이렇게 하여 메틸화된 플라스미드가 생체내에서 해당 핵산을 발현할 수 있음을 증명했다는 것이 특히 주목할만하다.

다수의 연구가 사실상, 고메틸화가 프로모터의 억제 또는 불활성화와 관련되어 있고 활성적으로 전사된 프로모터가 종종 저메틸화 또는 비메틸화된다는 발상을 지원한다. 따라서, 바이러스 프로모터의 경우에, 아데노바이러스 유형 2 게놈의 E2A 후기 프로모터가 HE1 형질전환된 햄스터 세포의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'에서 완전히 메틸화되고 HE2 형질전환된 햄스터 세포에서 비메틸화된다면, E2A 유전자는 HE1에서 사일런트하고 HE2에서 전사된다 (W. Doerfler 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 p.209). 다른 예가 Kohn 등 (1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 p. 2567)에 의해서 기재되었고, 이는 조혈 간세포에서 형질도입되는 LTR 레트로바이러스 벡터로부터의 발현 부재가 생체내 메틸화와 연관됨을 예시한다. 리포터 유전자가 시험관 내에서 메틸화된 플라스미드에 의해서 일시적인 형질감염에 도입되는 경우 바이러스 프로모터의 조절 하에서의 리포터 유전자의 발현 억제가 또한 증명되었다 [참조문헌: Adams et al., 1992 FEBS Letters 309 p. 97; Doerfler 1994 FEBS Letters 344 p.251; Komura et al. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p.73]. 또한, Razin 등 (loc. cit.)은 티미딘 키나제를 암호화하는 허프스 심플렉스 유형 I 유전자의 프로모터 및 메탈로티오네인을 암호화하는 쥐 유전자의 프로모터가 이들 프로모터가 디뉴클레오티드 5'-CG-3' 상에서 메틸화될 경우 쥐 L 세포 및 쥐 F9 테트라토카시노마 세포에서 일시적인 발현 동안 불활성임을 예시하였다.

따라서, 본 발명은 동종이고 산업적 활용에 상용성인 메틸화된 플라스미드 DNA를 생성함을 가능하게 하는 방법을 최초로 기재하고, 시험관내, 생체외 또는 생체내, 특히 유전자 치료 적용에서의 발현을 위해 이러한 유형의 플라스미드를 사용하는 가능성을 설명한다.

본 발명에 따른 방법은 다양한 유형의 세포 수주에서 수행될 수 있다. 세포 숙주는 특히 본질적으로 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신의 메틸화를 위한 시스템이 부족한 비-인간 세포이다. 메틸화의 부재는 상응하는 유전자의 불충분한 발현 또는 상응하는 유전자의 부재로 인한 적합한 효소 활성 부재의 결과일 수 있다. 바람직하게는 원핵 또는 단순한 진핵 세포가 사용된다.

유리하게도, 세포 숙주는 세균이다. 세균 중에서, 이. 콜라이 (E. coli), B. 서브틸리스(B. subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas) (P. 푸티다(putida), P. 애루기노사(aeruginosa), 리조븀 멜리오티(Rhizobium melioti), 아그로박테리움 튬파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토마이세스 프리스티내스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium) 또는 클로스트리듐(Clostridium)이 좀더 우선적으로 언급될 수 있다. 예를 들면, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 클레브실라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes), 어위니아 캐로토보라(Erwinia carotovora) 또는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)와 같은 장내균을 사용함이 가능하다. 우선적으로, 사용되는 세포 숙주는 비-병원성 유기체이고 대량의 동종 플라스미드 DNA가 생성되게 할 수 있다. 특히 바람직한 예로서, 이. 콜라이가 사용된다.

본 발명의 방법은 치료 품질의 DNA가 생성되게 한다.

DNA는 선형 또는 환형, 일본쇄 또는 이본쇄 DNA 분자일 수 있고, 복제되거나 통합될 수 있으며, 플라스미드, 수퍼코일 또는 이완된 미니써클 또는 선형 형태일 수 있다. 이후 문맥에서, DNA는 또한 GT 플라스미드 DNA 또는 GT 플라스미드(유전자 치료에 사용될 수 있는 플라스미드)로서 언급될 것이다.

일반적으로 유전자 치료에 사용되는 GT 플라스미드는 본질적으로 (i) 복제의 오리진, (ii) 발현에 필요한 서열(인핸서, 프로모터, 폴리아데닐화 서열 등)을 갖는 하나 이상의 해당(치료 유전자) 핵산, 및 임의로 (iii) 마커 유전자를 운반한다.

복제 오리진의 선택은 주로 생성에 사용되는 세포 숙주에 의해서 결정된다. 이것은 복제를 이. 콜라이 pol A 균주에서 허용하는 비상용성 그룹 P (예를 들면, pRK290)의 플라스미드로부터 기원하는 복제의 오리진일 수 있다. 좀더 일반적으로, 이것은 원핵 또는 하등 진핵 세포에서 복제하는 플라스미드로부터 기원한 복제의 오리진일 수 있다. 이러한 플라스미드는 pBR322의 유도체 (Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95), pUC의 유도체 (Viera and Messing, Gene 19 (1982) 259) 또는 동일한 비상용성 그룹으로부터 유도된 기타 플라스미드, 즉, 예를 들면, ColE1 또는 pMB1일 수 있다. 이러한 플라스미드가 또한 에세리히아 콜라이에서 복제되는 기타 비상용성 그룹 중에서 선택될 수 있다. 가능한 플라스미드는 예를 들면, A, B, FI, FII, FIII, FIV, H1, H11, I1, I2, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z 또는 9에 속하는 플라스미드 중에서 유도되는 것들이다. 다른 플라스미드가 또한 이. 콜라이에서 복제되지 않지만 B. 서브스틸리스, 스트렙토마이세스, P. 푸티다, P. 애루기노사, 리조븀 멜리오티, 아그로박테리움 튬파시엔스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토마이세스 프리스티내스피랄리스, 엔테로코쿠스 패슘 또는 클로스트리듐과 같은 기타 숙주에서 복제되는 플라스미드 중에서 사용될 수 있다. 우선적 선택으로서, 이. 콜라이에서 복제된 플라스미드로부터 기원하는 복제 오리진이 사용된다. 특정 변체에 있어서, 복제의 오리진은 통상적인 오리진, 즉, 활성이 트랜스로 인자의 존재에 의존하는 것일 수 있다. 이러한 유형의 복제 오리진의 사용은 예를 들면, 인간에 투여 한 후 플라스미드 DNA의 복제를 방해한다 (FR95 10825).

마커 유전자 중에서, 특히 항생제(암피실린, 카나마이신, 게네티신, 하이그로마이신 등)에 내성인 유전자 또는 세포에 세포가 더이상 소유하지 않는 기능(예를 들면, 염색체에서 결실되거나 불활성화된 유전자)을 부여하는 유전자, 이러한 기능을 성립시키는 플라스미드 상의 유전자를 언급할 수 있다.

특별한 양태에 있어서, 플라스미드 DNA는 모든 본질적으로 비-치료 영역(복제 오리진, 마커 유전자 등)을 상 생성 후 제거되게 할 수 있는 서열을 함유한다. 이러한 유형의 분자(미니써클)를 생성하기 위한 특히 유리한 접근이 출원 PCT/FR96/00274에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 플라스미드 DNA는 바람직하게는 이러한 발현에 필요한 서열을 갖는 하나 이상의 해당 핵산을 함유하는 이본쇄 DNA 분자이다. 바람직한 양태에 있어서, 복제되거나 통합되는 순환성 분자가 사용된다. 유리하게도, 플라스미드 DNA는 본질적으로 발현(미니플라스미드)에 필요한 서열을 갖는 하나 이상의 해당 핵산을 함유한다.

해당 핵산은 세포내 전사 및 경우에 따라 해독이 치료적, 백신적, 농경적 또는 수의학적 중요성을 갖는 산물을 생성하는 핵산(cDNA, gDNA, 합성 또는 반-합성 DNA 등)일 수 있다.

치료적 성질을 갖는 핵산 중에서, 좀더 상세하게는 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인, 즉, 인터루킨, 인터페론, TNF 등을 암호화하는 유전자 (FR 92 03120), 생장 인자, 신경 전달 물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자, 즉, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, vFGF, NT3, NT5 등; 아포리포프로테인, 즉, ApoAI, ApoAIV, ApoE 등 (FR 93 05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 (FR 91 11947), 종양-억제 유전자, 즉, p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등 (FR 93 04745), 혈액응고에 수반되는 인자, 즉, 인자 VII, VIII, IX 등을 암호화하는 유전자, 자살 유전자, 즉, 티미딘 키나제, 시토신 디아미나제 등을 위한 유전자; 또는 이와 달리 모두 또는 일부의 천연 또는 인공 이뮤노글로불린 (Fab, ScFv 등), 리간드 RNA (WO 91/19813) 등이 언급될 수 있다. 치료 유전자는 또한 표적 세포에서의 발현이 세포 mRNA의 발현 또는 전사가 조절될 수 있게 하는 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있다. 이러한 서열은 예를 들면, 특허 EP 140 308에 기재된 기술에 따라서 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사되고, 이렇게 하여 단백질로 해독을 블로킹할 수 있다.

해당 핵산은 또한 백신화 유전자, 즉, 백신을 생성할 목적으로 인간 또는 동물에서 면역 반응을 생성할 수 있는 항원 펩티드를 암호화하는 유전자일 수 있다. 이러한 항원 펩티드는 특히 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, HIV 바이러스, 헤파티티스 B 바이러스 (EP 185 573) 또는 슈도라비스 바이러스, 또는 종양-특이 펩티드 (EP 259 212)에 특이적인 것일 수 있다.

일반적으로, 플라스미드에서, 치료, 백신, 농경 또는 수의학적으로 중요한 핵산은 또한 표적 세포 또는 유기체 (즉, 포유동물, 특히 인간)에 작용성인 전사 프로모터 영역 및 전사 종결 시그널과 폴리아데닐화 부위를 열거하는 3' 말단에 배치된 영역을 함유한다. 프로모터 영역에 관하여, 이것은 프로모터 영역이 해당 세포 또는 유기체를 작용화할 수 있는 경우 해당 유전자의 발현을 자연적으로 책임지는 프로모터 영역일 수 있다. 상이한 기원(기타 단백질 또는 합성 영역의 발현을 책임지는)의 영역이 추가의 가능하다. 특히, 프로모터 영역은 진핵 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 표적 세포의 게놈으로부터 기원한 프로모터 서열일 수 있다. 진핵 프로모터 중에서, 유전자의 전사를 명백히 또는 유도적으로, 강하게 또는 약하게 자극하거나 억제하는 프로모터 또는 유도된 서열을 사용함이 가능하다. 가능한 프로모터는 특히 편재성 프로모터 (HPRT, PGK, α-액틴, 튜불린 등, 유전자 프로모터), 중간체 필라멘트의 프로모터 (GFAP, 데스민, 비멘틴, 뉴로필라멘트, 케라틴 등, 유전자 프로모터), 치료 유전자의 프로모터 (예를 들면, MDR, CFTR, 인자 VIII, ApoAI 등, 유전자 프로모터), 조직-특이 프로모터 (피루베이트 키나제, 빌린, 내장 지방산 결합 단백질, 평활근 α-액틴 등, 유전자 프로모터) 또는 자극에 반응하는 프로모터(스테로이드 호르몬 수용체, 망막 산 수용체 등)일 수 있다. 유사하게도, 프로모터 서열은 바이러스의 게놈으로부터 기원하는 것, 예를 들면, 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터 또는 RSV 또는 MMTV LTR 프로모터 등일 수 있다. 또한, 이러한 프로모터 영역은 활성화 또는 조절 서열 또는 조직-특이적 또는 -우세 발현을 허용하는 서열을 첨가함으로써 변형시킬 수 있다.

또한, 해당 유전자는 또한 합성된 산물을 표적 세포의 분비 경로로 인도하는 시그널 서열을 함유할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 합성된 산물의 자연 시그널 서열일 수 있지만, 이것은 또한 기타 작용성 시그널 서열 또는 인공 시스널 서열일 수 있다.

해당 핵산에 따라서, 본 발명의 메틸화 플라스미드 DNA를 유전적 장애 (영양실조, 담낭 섬유증 등), 신경변성 질병 (알츠하이머, 파킨슨, ALS 등), 암, 혈액응고 장애 또는 리포프로테인 장해에 연관된 병, 및 바이러스 감염 (간염, AIDS 등)에 연관된 병 등을 포함하는 다수의 병의 치료 또는 예방 또는 농업 및 수의학 분야 등에 사용될 수 있다. 이들은 특히 면역 반응 없이 지속하는 발현이 바람직한 병, 특히 유전적, 신경변성 및 심장혈관 장애 및 질병 분야의 치료에 특히 유리하다.

상기에 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기가 메틸화될 수 있게 하는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 발현 카세트를 함유하는 숙주 세포를 사용한다.

DNA 합성 후, 일부 퓨린 및 피리미딘이 화학적으로, 예를 들면, 메틸화에 의해서 변형된다. 따라서, 5-메틸시토신 또는 N⁶-메틸아데닌이 일부 DNA 조성물에서 침전된다. 이러한 변형이 메틸 그룹을 S-아데노실-L-메티오닌으로부터 서열내 특정 위치에 존재할 수 있는 아데닌 또는 시토신 잔기로 전달하는 DNA 메틸트랜스퍼라제, 유지 또는 de novo 효소에 의해서 일어난다. 예를 들면, 이. 콜라이에서, 두 DNA 메틸트랜스퍼라제, 서열 5'-GATC-3' 내 아데노신 잔기를 메틸화하는 dam DNA 메틸트랜스퍼라제와 서열 5'-CCA/TGG-3'의 제 2 사이티딘 잔기를 메틸화하는 dcm DNA 메틸트랜스퍼라제가 익히 공지되어 있다. 제한 효소 인식 부위에 함유된 잔기를 메틸화하는 기타 DNA 메틸라제가 세균에서 연구되었다. 예를 들면, 효소 M. Hpa II는 서열 5'-CCGG-3'내 제 2 시토신 잔기를 메틸화한다.

대부분의 단순한 진핵생물 및 무척추동물은 상대적으로 적은 5-메틸시토신과 N6-메틸아데닌을 함유한다. 그러나, 척추동물에서 염기의 메틸화는 좀더 광범위하고, 이 경우에 5-메틸시토신이 가장 보통의 메틸화 염기이다. 사실상, 척추동물 DNA의 메틸 그룹의 95 % 이상이 비범한 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 C 잔기에서 일어난다 (GC의 퍼센티지가 평균 40 %이고 비바이어스 배열이 4%의 5'-CG-3' 빈도를 유발하지만, 포유동물 서열내 5'-CG-3'의 빈도는 0.8 %로 매우 낮다. 집합성 디뉴클레오티드의 50 % 이상이 메틸화될 수 있다. 다양한 증거는 디뉴클레오티드 5'-CG-3'를 함유하는 일부 서열의 메틸화도가 포유동물에서 특정 유전자의 발현, X 염색체, 옹코진 (1993 in DNA methylation: Molecular Biology and Biological Significance, Eds Jost and Saluz) 및 또한 유전성 장애 (Bates et al. 1994 BioEssays 16 p. 277)의 불활성화 조절시 결정 인자일 것임을 제안한다.

본 발명은 디뉴클레오티드 5'-CG-3' 상의 시토신 잔기를 메틸화되게 할 수 있는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 발현 카세트를 사용한다. 결과적으로, 본 발명의 목적상, 메틸화된 DNA는 좀더 상세하게는 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기에서 메틸화된 DNA를 의미한다. 유리하게도, 사용된 DNA 메틸트랜스퍼라제는 우선적으로 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기를 메틸화하고, 즉, 아데닌 잔기 또는 5'-CG-3' 디뉴클레오티드로부터 상이한 상황에 존재하는 시토신 잔기에 사실상 영향을 미치지 않는다. 유리하게도, 메틸화된 플라스미드 DNA는 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기 적어도 50 %가 메틸화된 플라스미드 DNA를 의미한다. 좀더 바람직하게는, 적어도 80 % 및 유리하게는 90 %의 잔기가 메틸화된다.

플라스미드 DNA의 메틸화는 다양한 방법으로 변화될 수 있다. 특히, 이것은 플라스미드 제조물을 분할 부위에 함유된 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기가 메틸화될 경우 절단될 수 없는 제한 효소로 분해시킴으로써 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 제한 효소 HPaII, AatII, BstBI를 언급할 수 있다. 메틸화는 또한 크로마토그래피에 의해서 결정될 수 있다. 따라서, 메틸화된 플라스미드 제조물에 존재하는 비메틸화된 플라스미드 양은 하기의 방식으로 정량되었다: HpaII로 완전히 분해된 비메틸화 플라스미드 1 % 또는 5 %를 비분해 비메틸화 플라스미드에 첨가한다. HpaII로 분해된 메틸화 플라스미드와 함께 이들 샘플을 비분해된 DNA가 분리되고 분해된 DNA로부터 정량될 수 있게 하는 음이온 교환 액체 크로마토그래피 및 260 nm에서의 검출에 의해서 분석한다. 메틸화된 플라스미드가 5 % 이하의 비메틸화 플라스미드 DNA를 함유하고, 즉, 95 % 이상의 플라스미드 DNA가 메틸화되는 것으로 밝혀졌다.

유리하게도, 본 발명의 방법은 DNA 메틸트랜스퍼라제가 우선적으로 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기를 메틸화함을 특징으로 한다.

유리하게도, 본 발명에 따른 방법에서, 플라스미드 DNA의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기 50 % 이상이 메틸화된다. 또한 더욱 바람직하게, 80 % 이상, 및 좀더 상세하게 90 % 이상의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기가 메틸화된다.

디뉴클레오티드 5'-CG-3'를 함유하는 서열 상의 시토신 잔기가 메틸화될 수 있게 하는 여러 포유동물 DNA 메틸트랜스퍼라제가 특징지워졌고 상응하는 유전자가 예를 들면, 쥐 효소 (Bestor et al. 1988 J. Mol. Biol. 203 p.971) 또는 인간 효소 (Yen et al. 1992 Nucl. Acids Res. 20 p.2287)로 클로닝 되었다. 이들 효소는 136 내지 175 kD의 분자량을 갖는다. 이들은 비메틸화 DNA 보다 훨씬 더 신속하게 헤미메틸화 DNA를 메틸화하고, 이들이 유지 메틸라제임을 제안한다 (Smith 1994 Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 49 p.65). 이. 콜라이내 동종 효소는 존재하지 않는다. 반대로, 스피로플라스마(Spiroplasma) 메틸라제 M. SssI는 기질이 헤미메틸화되든지 비메틸화되든지 간에 상관없이 상당한 속도로 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기를 오로지 및 완전히 메틸화한다 (Razin et al. 1992 FEBS Letters 313 p.243; Baker et al., 1993 Biochim. Biophys. Acta 196 p. 864). 이 효소는 스피로플라즈마 균주 MQ1으로부터 분리된다. 이의 분자량은 42 kD이고 유전자는 클로닝되어 이. 콜라이에서 과발현된다 (Razin et al. 1990 Nucl. Acids. Res. 18 p. 1145 and EP0412676A1 Derwent 91045812).

바람직하게, DNA 메틸트랜스퍼라제는 메틸라제 M.SssI, 쥐 메틸라제 및 인간 메틸라제로부터 선택된다. 유리하게는, 메틸라제 M.SssI이 사용된다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 발현용 카세트는 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기를 프로모터 조절하에서 메틸화될 수 있게 하는 DNA 메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 일반적으로 포함한다. 이러한 목적을 위해 사용되는 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 기능적인 임의의 프로모터일 수 있다. 이와 관련하여, 상기 정의된 바와 같은 프로모터일 수 있다. 원핵 세포 숙주의 경우에는, 보다 특별히, 락토오즈 오페론 (Plac) 및 트립토판 오페론 (Ptrp), 하이브리드 프로모터 Plac/Ptryp, 박테리오파지 람다의 P_L또는 P_R프로모터, tetA 유전자 프로모터 (in Vectors 1988 p. 179 Rodriguez and Denhardt editors) 등일 수 있다.

바람직한 양태에 있어서, 플라스미드 DNA에서 해당 핵산 발현을 책임지는 것과 상이한 프로모터가 사용된다. 메틸라제의 발현이 조절될 수 있게 하는 유도성 프로모터를 사용하는 것이 가장 유리하다. 유도성 프로모터는, 예컨대, 박테리오파지 T7 또는 Plac 프로모터일 수 있다.

유리하게, 발현 카세트는 또한 리보솜 종결자와 같은 전사 종결 시그널 (전사 터미네이터)을 함유한다.

DNA 메틸트랜스퍼라제의 발현용 카세트는 복제형 벡터에 의해 운반될 수 있거나 또는 숙주 세포의 게놈내에 통합될 수 있다.

복제형 벡터의 경우에 있어서는, GT 플라스미드와 호환성 벡터, 달리 말하면, 동일 세포에서 공존할 수 있는 벡터를 사용하는 것이 유리하다. 두개의 다른 플라스미드는, 각 플라스미드의 복제의 조절이 상이하다면, 동일 세포에서 복제할 수 있다. 즉, 호환성 플라스미드는 두개의 비호환성 그룹에 속한다. 현재, 장내균에서 복제하는 대략 30개의 비호환성 플라스미드 그룹이 있다 (Maas et al. 1988 Microbiol. Rev. 52 p. 375). 그 결과, 동일 세포에서 두개의 플라스미드를 복제함에 있어 수많은 가능성이 있으며, 여러가지 예가 문헌상에 기술되어 있다. 예를 들면, 레플리콘으로서 R6K 또는 p15A 또는 RSF1010 또는 RK2를 갖고 있는 플라스미드와 ColE1으로부터 유도된 플라스미드의 공복제를 언급할 수 있으며; 또한 R6K 또는 RSF1010 또는 pSa 또는 ColE1으로부터 유도된 플라스미드와 RK2로부터 유도된 플라스미드의 공복제를 언급할 수 있다 (in Vectors 1988 p. 287 Rodriguez and Denhardt editors). 상기 열거는 제한적이지 않으며, 추가예가 문헌 [Vectors 1988 p. 287 Rodriguez and Denhardt editors]에 기술되어 있다. 유리하게, 사용된 복제형 벡터는 숙주 세포에서 GT 플라스미드의 것과는 다른 카피(copy) 수를 갖는다. 즉, 메틸라제(이의 발현은 유도적일 수 있다)를 암호화하는 유전자를 운반하는 벡터는 낮은 카피수의 벡터(예컨대, pACYC184 또는 RK2로부터 유도됨)인 반면에, GT 플라스미드는 높은 카피수의 플라스미드(ColE1으로부터 유도됨)이다. 또한 트리플-나선형 서열이 적합한 올리고뉴클레오티드와 함께 형성될 수 있게 하는 서열을 GT 플라스미드내로 클로닝하는 것도 가능한데, 이는 GT 플라스미드가 친화력 정제법에 의해 다른 플라스미드로부터 분리될 수 있게끔 한다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 발현용 카세트는 또한, 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수도 있다. 통합은 동종 재조합에 의해 수행될 수 있으나, 단 발현 카세트는 숙주 게놈의 비필수 유전자의 인접 단편에 의해 플랭킹되어야 하며 당해 숙주에서 복제할 수 없는 플라스미드내로 클로닝되어야 한다. 이러한 플라스미드는 i) 이. 콜라이 polA^ts균주에서 ColE1 유도체 (Gutterson et al. 1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 p. 4894); ii) 임의의 이. 콜라이 균주에서 pSC101의 온도-민감성 유도체 (S. Kushner et al. 1989 J. Bacteriol. 171 p. 4617); iii) 이. 콜라이 sup⁺균주에서 M13mp10과 같은 자살 벡터 (Blum et al. 1989 J. Bacteriol. 171 p. 538); 또는 대안적으로 iv) pir 유전자가 부족한 임의의 이. 콜라이 균주에서 R6K의 오리진 g만을 함유한 플라스미드일 수 있다 (Filutowicz et al. 1994 Prog. in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol. 48 p. 239).

발현 카세트는 플라스미드 DNA와 동시에 또는 전·후로 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 통합형 카세트의 경우에 있어서, 일반적으로 전에 도입되며, 상기 카세트를 함유한 세포를 선별하여 플라스미드 DNA의 생성을 위해 사용한다.

본 발명의 특정 일단면은 GT 플라스미드를 함유한 세균 세포(특히, 이. 콜라이)에서 메틸라제 M.SssI를 암호화하는 유전자를 발현하는 것이다. 실시예들에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 플라스미드는 그리고나서, 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신상에 메틸화된다. 보다 특별히, GT 플라스미드는, 이미 메틸라제 M.SssI을 암호화하는 유전자를 운반하고 GT 플라스미드와 호환성 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 mcrA mcrB D (mcrC-mrr) 균주내로 형질전환된다. 세균의 증식 동안, 양 플라스미드는 공존하여 복제하고 메틸화된다 (Gotschlich et al. J. Bacteriol. 173 p.5793).

플라스미드 DNA 또는 발현 카세트는 당해분야에 기술자에게 알려진 임의의 기술에 의해 숙주 세포내로 도입될 수 있다 (형질전환, 형질도입, 일렉트로포레이션, 펄싱, 침전 등). 형질전환은, 특히, CaCl₂형질전환 기술에 의해 수행될 수 있거나 (Dagert and Ehrlich, Gene 6 (1979 (23)), 또는 하나한(Hanahan) 등에 의해 개발된 방법 (J. Mol. Biol. 166 (1983) 557) 또는 마니아티스(Maniatis) 등에 의해 유래된 임의의 기술 (Maniatis et al., 1989)에 의해 수행될 수 있으며, 또한, 전기형질전환(Wirth et al., Mol. Gen. Genet. 216 (1989) 175)에 의해 또는 TSB(형질전환 및 저장 완충액; Chung et al. 1988 Nucleic Acids Res. 16 p. 3580)를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 하기 Molecular Biology의 General Techniques를 참조한다.

본 발명에 따른 메틸화된 플라스미드 DNA는, 그리고나서, 당해분야의 기술자에게 알려진 임의의 기술에 의해 정제될 수 있다 (침전, 크로마토그래피 런닝, 원심분리, 투석 등등). 메틸트랜스퍼라제의 발현을 위한 복제형 벡터의 특정 사용의 경우에 있어서, GT 플라스미드는 또한, 상기 벡터로부터 분리되어져야 한다. 두개의 플라스미드의 크기 및 질량의 차이에 기초하거나 또는 벡터에는 존재하고 GT 플라스미드에는 존재하지 않는 제한효소 부위에서의 벡터의 분해에 기초하는 다양한 기술이 사용될 수 있다. 특히 유리한 정제법은 GT 플라스미드와 고정화된 올리고뉴클레오티드상에 존재하는 특이 서열간의 친화력에 기초하는 것이다. 이러한 트리플-나선형 정제법은 프랑스 특허 출원 FR96 03519 및 FR 94 15162에 상세히 기술되어 있으며, 이들은 본원에서 참고로 인용된다.

본 발명의 특히 유리한 결과는, 본 발명의 조건하에서 메틸화된 플라스미드 DNA가 메틸화되지 않은 동일한 플라스미드 DNA에서 얻을 수 있는 것만큼 프로모터 조절하에서 유전자의 양호한 발현을 이끈다는 것이다. 상기 메틸화된 플라스미드 DNA는 세균 DNA와 관련된 면역 자극을 일으키지 않아야 하는데, 그에 따라 비-바이러스성 유전자 치료에서의 사용을 위해 한정된 잇점을 가진다.

본 발명에 따른 메틸화된 플라스미드 DNA는 임의의 백신화 또는 유전자 및 세포 치료 적용에서, 유전자의 체내, 조직 또는 특정 세포로의 운송을 위해서 사용될 수 있다. 특히, 상기 DNA는 생체내 직접 투여를 위해서 사용되거나 또는 환자의 이식 관점에서 시험관내 또는 생체밖 세포의 변이를 위해 사용될 수도 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 분자는 원래대로(네이키드 DNA 형태로) 사용될 수 있거나, 또는 다양한 합성 또는 자연의 화학적 및/또는 생화학적 벡터와 조합하여 사용될 수 있다. 가능한 벡터는, 특히, DNA와 함께 침전물을 형성함으로써 작용하는 양이온 (칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란 등)을 포함하는데, 이러한 침전물은 세포에 의해 "식작용화"될 수 있다. 다른 가능한 벡터는 DNA 분자가 통합된 리포좀인데, 이는 플라즈마 막과 융합한다. 합성 유전자 전달 벡터는 일반적으로, DNA와 혼합하여 이와 함께 양성 표면 전하를 운반하는 입자를 형성하는 양이온성 지질 또는 중합체이다. 이러한 입자는 세포막의 음성 전하와 상호작용하고 난 뒤 세포막을 가교할 수 있다. 이러한 벡터의 예로는, DOGS (Transfectam^TM) 또는 DOTMA (Lipofectin^TM)를 언급할 수 있다. 키메릭 단백질도 또한 개발되었다: 이들은 막 수용체에 결합하는 리간드에 연결된 DNA를 응축하는 다가양이온성 부분으로 이루어졌으며 엔도시토시스에 의해 세포에서 복합체를 형성한다. 본 발명에 따른 DNA 분자는 또한, 충격, 일렉트로포레이션 등과 같은 물리적 형질감염 기술에 의해 유전자를 세포내로 도입하는데도 사용될 수 있다. 또한, 치료적 사용 이전에, 본 발명의 분자는 예컨대, 효소 절단에 의해서 임의로 선형화될 수 있다.

이와 관련하여, 본 발명의 또 다른 주제는 상기 정의된 바와 같은 메틸화된 플라스미드 DNA를 포함하는 임의의 약학 조성물과 관련된다. 이러한 DNA는 네이키드이거나, 또는 화학적 및/또는 생화학적 형질감염 벡터와 결합될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안(眼)내, 경피 등의 투여 관점에서 배합될 수 있다. 바람직하게, DNA 분자는 주사가능한 형태 또는 응용되는 형태로 사용된다. 주사가능한 배합물을 위해, 특히 치료될 부위에 직접 주사하기 위해 약학적으로 허용되는 임의의 비히클과 혼합될 수 있다. 이러한 비히클로는, 특히 등장성 무균 용액, 또는 건조 또는 동결건조된 조성물일 수 있는데, 무균수 또는 생리식염수에 덧붙여, 적절하다면, 이들은 주사가능한 용액이 보충되도록 할 수 있다. 예들은 특히, 글루코스 또는 염화나트륨내 희석된 Tris 또는 PBS 완충액을 포함한다. 치료되어야 할 환자 부위로의 핵산의 직접 주사는 유리한데, 이는 치료 효과를 관련된 조직에 집중시킬 수 있기 때문이다. 핵산의 투여량은 다양한 변수, 특히, 유전자, 벡터, 사용되는 투여 양식, 해당 병리학 또는 바람직한 치료 기간에 따라 조정될 수 있다.

본 발명은 뒤따르는 실시예에 의해 보다 완전히 기술될 것이며, 이는 예시적이며 비-제한적인 것으로 여겨져야 한다.

실시예 1. GT 플라스미드에 대한 기술

이. 콜라이 세균에서 복제형인 플라스미드에 의해 운반되는 수많은 진핵 발현 카세트가 당해분야의 기술자에게 알려져 있다. 이러한 카세트는 β-갈락토시다제를 암호화하는 이. 콜라이 유전자, 또는 트랜스포손 Tn9 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 또는 루시퍼라제, 또는 유전자 치료에서의 해당 유전자와 같은 리포터 유전자를 발현할 수 있다. 이러한 카세트는 바이러스성 또는 진핵성일 수 있는 프로모터를 함유한다. 이들 발현 시스템은 조직-특이성 및/또는 유도성일 수 있으며, 또는 대안적으로 항상 발현될 수도 있다. 본 실시예에 사용되는 카세트는 포티너스 피랄리스 (Photinus pyralis)를 암호화하는 luc 유전자와 인간 사이토메갈로바이러스 중간체 프로모터/인핸서인 pCMV 프로모터를 포함한다. luc 유전자는 4.78%의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'와 pCMV 바이러스성 프로모터 5%를 소지한다. 따라서, 이러한 퍼센트는 포유동물 서열에서 0.8%의 5'-CG-3'의 저빈도와 비교하여 높은 편이다. 이리하여, 메틸라제(포유동물에서 내생성인 메틸라제 M.SssI 또는 CpG 메틸라제와 같이)의 존재하에 pCMV 프로모터와 luc 유전자는 상당히 메틸화될 수 있다.

이 발현 카세트를 이. 콜라이에서 복제형인 플라스미드 pXL2784내로 클로닝하는데, 이의 지도는 도 1에 제공된다. 플라스미드는 6390 bp 크기이고, 5.8%의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'를 함유한다. 플라스미드 pXL2784는 벡터 pXL2675 (2.513 kb)로부터 작제되었으며, pBluescript로부터 유래하는 ColE1 최소 레플리콘과 선택 마커로서 카나마이신에 대한 내성을 제공하는 트랜스포손 Tn5 유전자를 갖는다. 플라스미드 pXL2784는 또한 올리고머 (CTT)_n(여기에서, n은 1 내지 17이다)에 결합할 수 있는 TH 서열 (GAA)₁₇을 함유함으로써 국부적으로 트리플 나선형 구조를 만들어서 친화력 정제가 가능토록 한다. 플라스미드 pXL2784는 ColE1으로부터 유래하는 cer 좌위(382 bp)를 함유하는데; 이 cer 좌위는 재조합효소 XerC/XerD를 위한 부위-특이적 서열을 함유함으로써 플라스미드 이합체의 분해를 이끈다 (Summers et al. 1988 EMBO J. 7 p. 851). 이 플라스미드 pXL284로 클로닝된 트랜스유전자는, 인간 사이토메갈로바이러스 pCMV 인핸서/프로모터(Invitrogen pcDNA3으로부터 유래됨)의 조절하의 포티너스 피랄리스 루시퍼라제(Promega pGL2 basic으로부터 유래됨)를 암호화하는 luc 유전자용 발현 카세트(3.3 kb)이다.

실시예 2. DNA 메틸트랜스퍼라제의 발현용 카세트의 작제

본 실시예는 스피로플라즈마 종 MQ1 메틸라제 M.SssI의 발현용 카세트의 구조에 대해 기술한다. 동일한 원리가 본 발명에 따른 임의의 다른 효소의 발현용 카세트의 작제에도 적용될 수 있는 것으로 이해된다.

사용된 카세트는 스피로플라즈마 종 MQ1 메틸라제 SssI을 암호화하는 유전자를 포함하는데, 이는 Plac 프로모터의 조절하에서 발현된다. 즉, IPTG (이소프로필 β-D-티오갈락토사이드)의 존재하에 메틸라제가 합성되는데 이는 활성적이다 (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol. 173 p. 5793).

이 카세트는 플라스미드 pAIT2에 존재하는데, 이는 레플리콘으로서 pACYC184를 가지며 또한, 리비도마이신에 내성을 제공하는 TN903 트랜스포손을 운반함으로써 형질전환된 숙주 세포의 선별을 가능케한다.

실시예 3. 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기에서 메틸화된 pXL2784 플라스미드 DNA의 생성

플라스미드 pXL2784는 스피로플라즈마 종 MQ1 메틸라제 M.SssI에 의해 모든 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 상에서 메틸화된다. 본 발명에 따른 메틸화 양식은 상기 효소를 활용하며, 플라스미드는 세균 내에서 생성되는 동안에 메틸화된다.

이 목적을 위해서, 유전형이 F^-1^-endA1 thi1 supE44 mcrA5 D (mrr-hsdRMS-mcrB)1-: : IS10이고 플라스미드 pAIT2를 운반하는 이. 콜라이 균주 ER 1821을 플라스미드 pXL2874로 TSB (형질전환 및 저장 완충액; Chung et al. 1988 Nucleic Acids Res. 16 p. 3580) 방법에 의해 형질전환시킨다. 카나마이신에 내성을 제공하는 트랜스포손 Tn5 유전자를 운반하는 pXL2784와 리비도마이신에 내성을 제공하는 트랜스포손 Tn903 유전자를 운반하는 pAIT2를 선별하기 위하여, 형질전환체를 50 mg/l 카나마이신 및 100 mg/l 리비도마이신을 함유한 LB 매질상에서 선별한다. ER1821, pAIT2, pXL2784 형질전환체를 37℃에서 15시간동안 50 mg/l 카나마이신 + 100 mg/l 리비도마이신 + 2.5 mM IPTG와 함께 LB 매질내에서 배양할 때, 추출된 플라스미드 DNA는 메틸화된다.

메틸화는 플라스미드 제제를 제한효소 HpaII, AatII 및 BstBI로 분해함에 의해 입증된다. 통합성 및 두개의 플라스미드의 존재는 이들 제제를 제한효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해시킴에 의해 입증되는데, 도 2를 참조하라. 제한효소 HpaII, AatII 및 BstBI은, 절단 부위 내 함유된 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기가 메틸화된다면, 자를 수 없는 세개의 효소이다. pCMV 프로모터에서, 4개의 AatII 인식 부위는 국부화되어 있고; luc 유전자에서 2개의 BstBI 인식 부위와 11개의 HpaII 인식 부위는 지도화되어 있고; 후자의 효소는 플라스미드 pXL2784를 잘라서 30개의 단편으로 만든다. 에티디움 브로마이드-염색된 아가로스 겔 사진(도 2)에서, 메틸화된 플라스미드 제제 pAIT2+pXL2784 또는 메틸화된 플라스미드 제제 pXL2784를 가지고 친화력 크로마토그래피에 의해 정제하면, 효소 HpaII, AatII 및 BstBI에서는 어떠한 분해도 일어나지 않는 반면에, 효소 HindIII 및 EcoRI으로는 분해되어 제한효소로부터 예기되는 단면도를 만든다. 효소 HpaII, AatII 및 BstBI으로 플라스미드 pXL2784의 조절된 분해는 제한효소 지도로부터 예기되는 단면도를 부여한다.

이러한 결과는 추출된 플라스미드 DNA가 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기상에서 메틸화되었음을 가리킨다. 이러한 결과는, 또한, 메틸화가 이들 이들 시토신의 90% 이상에 영향을 미침을 보여준다.

실시예 4. 유전 물질의 전달을 위한 메틸화된 플라스미드의 사용

본 실시예는 본 발명에 따른 메틸화된 플라스미드 DNA가 세포를 형질감염하고 그 안에서 복제하고 또한 그 안에서 해당 유전자를 발현시키는 능력을 보유하고 있음을 나타낸다.

A. 형질감염을 위해 사용되는 용액의 제조를 위한 프로토콜

두 그룹의 플라스미드가 비교 연구를 위해 사용된다:

a) pXL2784,

b) 메틸화된 pXL2784.

메틸화된 플라스미드 pXL2784를 세균 공형질전환후 메틸화된 플라스미드 pAIT2와의 혼합 형태로 수득한다. 해당 플라스미드를 정제하기 위해 친화력 크로마토그래피에 의한 분획을 수행하는데, 사용되는 기술은 프랑스 특허 출원 FR 94 15162에 기술되어 있다. 컬럼의 용출상을 구성하는 완충액을 제거하기 위해 0.15 M NaCl로 투석 절차를 수행할 수 있다.

플라스미드 pXL2784를 대조군으로 사용할 때, 상기 기술한 것 중의 하나와 같은 프로토콜에 따라 정제한다.

본 실시예에서, DNA는 양이온 지질, RPR12053A에 의해 벡터화되는데, 이는 프랑스 특허 출원 FR 95 13490에 기술된 시리즈에 속한다. 다른 화학적 또는 생화학적 전달 벡터도 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

형질감염 용액을 30 ㎍/ml 농도의 DNA와 90 μm/ml의 양이온 지질 RPR 120535 수성 용액의 동부피 혼합물로부터 제조한다; 이리하여, 양이온 지질/DNA 비율은 3 나노몰 양이온 지질/㎍ DNA이다. 와동 혼합기로의 균질화 및 실온에서의 적어도 15분간의 배양 후, DNA/리포펙턴트 용액을 4.8% (v/v) 최종 비율로 웰 내로 분배하는데, 여기에서 세포는 이미 단백질-유리(혈청-유리) 매질로 세척되었고 혈청-유리 매질내에서 형질감염 기간 동안 생장이 계속되기 위해서 교체된다.

B 형질감염 프로토콜

2 ㎠ (500 ㎕혈청-유리 매질/웰)상에서 지수적으로 생장중인 1 × 10⁵세포 샘플 [NIH3T3 (쥐 섬유아세포) 및 HeLa (인간 자궁암세포)]을 25 ㎕의 형질감염 용액으로 처리하는데, 상기 용액은 0.375 ㎍의 DNA/1 × 10⁵세포의 처방에 상응한다. 습식 대기 내 5% CO₂하, 37℃에서 2 시간 동안 배양한 후, 생장 매질을 8% 최종 (v/v) 농도로 태 송아지 혈청으로 보충한다.

형질감염하여 40시간 지난 후에 세포를 PBS를 세척한 다음 1% 트리톤-X-100과 2 mM DTT를 함유한 완충액으로 용해한다. 발현된 루시퍼라제 활성을 루시페린, 조효소 A 및 ATP가 존재하는 가운데 10초간 광 방출 [RLU=상대 광 단위]에 의해 분석하고, 용해 완충액에 의해 추출된 단백질을 mg 단위로 기록한다.

C 결과

상기 조건에 따라 수득된 결과는 하기 표에 제시된다.

세포	NIH 3T3 세포	HeLa 세포
플라스미드	pXL2784	pXL2784CH3	pXL2784	pXL2784CH3
친화력 크로마토그래피에 의한 정제	2.0×10¹⁰+/ 4%	-2.2×10¹⁰+/- 10%	3.1×10⁸+/ 15%	-1.7×10⁸+/- 11%
및 투석	2.3×10¹⁰+/ 21%	3.1×10¹⁰+/- 10%	-3.8×10⁸+/ 14%	-2.4×10⁸+/- 7%

RLU/10 초/mg 단백질의 효소 활성 (변동 계수 % [결과당 3번의 형질감염 실험]

이런 유형의 실험을 위해 수득된 변동 계수를 염두해두고, 우리는 동일 형질감염 조건하에서 사용된 두개의 플라스미드의 발현과 관련하여 중요한 차이가 없음을 결론지을 수 있다. 더욱이, 수득된 루시퍼라제 활성은 두 번의 정제 단계 모두에 대해서 같은 지수의 크기를 갖는다.

Claims

디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기가 메틸화될 수 있게 하는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 발현용 카세트를 함유하는 세포에서 DNA를 생성하는 것을 특징으로 하는, DNA 유전자 치료에 사용될 수 있는 DNA의 생성방법.
제 1 항에 있어서, 세포가 원핵 세포임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 세포가 세균임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 복제형 벡터에 의해 운반됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 세포의 게놈내로 통합됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 프로모터의 조절하에서 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기가 메틸화될 수 있게 하는 DNA 메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, DNA 메틸트랜스퍼라제가 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기를 선택적으로 메틸화시킴을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, DNA 메틸트랜스퍼라제가 메틸라제 M.SssI, 쥐 메틸라제 및 인간 메틸라제로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 플라스미드 DNA의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기의 50% 이상이 메틸화됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 플라스미드 DNA의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기의 80% 이상이 메틸화됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 플라스미드 DNA의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기의 90% 이상이 메틸화됨을 특징으로 하는 방법.
플라스미드 DNA의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기의 50% 이상이 메틸화됨을 특징으로 하는, 인간 또는 동물 신체의 치료적 또는 진단적 처치용으로 의도되는 약학 조성물의 제조를 위한 플라스미드 DNA의 사용.
플라스미드 DNA의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기의 80% 이상이 메틸화됨을 특징으로 하는, 인간 또는 동물 신체의 치료적 또는 진단적 처치용으로 의도되는 약학 조성물의 제조를 위한 플라스미드 DNA의 사용.
플라스미드 DNA의 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기의 90% 이상이 메틸화됨을 특징으로 하는, 인간 또는 동물 신체의 치료적 또는 진단적 처치용으로 의도되는 약학 조성물의 제조를 위한 플라스미드 DNA의 사용.
- 디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기가 메틸화될 수 있게 하는 DNA 메틸트랜스퍼라제 발현용 카세트와 DNA를 포함하는 세포를 배양함으로써 상기 DNA를 생성하고,

- 상기 DNA를 회수한 다음,

- 상기 DNA를 약학적으로 허용되는 비히클과 함께 패키징하는 단계들로 이루어지는, 인간 또는 동물 신체의 치료적 또는 진단적 처치용으로 의도되는 약학 조성물의 제조방법:
제 16 항에 있어서, DNA가 치료적으로 중요한 핵산을 포함한 플라스미드 DNA임을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, DNA가 치료적으로 중요한 핵산을 포함한 미니써클임을 특징으로 하는 방법.
디뉴클레오티드 5'-CG-3'의 시토신 잔기의 50% 이상이 메틸화되어 있는 세균 DNA를 포함하는 조성물.