CZ438298A3

CZ438298A3 - Způsob přípravy DNA pro použití v genové terapii

Info

Publication number: CZ438298A3
Application number: CZ984382A
Authority: CZ
Inventors: Joël Crouzet; Béatrice Cameron
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date: 1996-07-04
Filing date: 1997-06-24
Publication date: 1999-04-14
Also published as: NO986177L; SK181498A3; BR9710173A; US20020187527A1; CA2258792A1; IL127620A0; AU722909B2; US6410273B1; FR2750704B1; NO986177D0; FR2750704A1; AU3447597A; EP0914418A1; KR20000022488A; WO1998001540A1; ZA975959B; JP2000514293A

Description

Způsob přípravy DNA pro použití v genové terapii

Oblast techniky

Vynález se týká přípravy DNA, zvláště plazmidové DNA. Zejména se týká přípravy DNA bakteriálních plazmidů, které se mohou použít v genové terapii, jako je plazmid v nadšroubovicové, relaxované kruhové nebo lineární formě, přičemž imunogenní vlastnosti takové DNA jsou sníženy nebo zcela odstraněny. Vynález se také týká mikroorganismů, které se mohou použít pro přípravu DNA a dále se týká i farmaceutických přípravků.

Dosavadní stav techniky

Genová terapie spočívá v nápravě nedostatku nebo abnormality zavedením genetické informace do ovlivněné buňky nebo orgánu. Genetickou informaci lze zavést buď in vitro do buňky extrahované z orgánu a pak znovu vložené do těla, nebo in vivo přímo do cílové tkáně. Jelikož je molekula DNA negativně nabita a má vysokou molekulovou hmotnost, proniká spontánně jen s obtížemi přes fosfolipidovou buněčnou membránu. Užívají se proto různé vektory, aby usnadnily přenos genů. Jsou to jednak virové přirozené nebo syntetické chemické vektory (retroviry, vektory, ale také a/nebo biochemické adenoviry, adenovektory. Virové asociované viry a pod.) jsou velmi účinné zvláště při průchodu membránou, ale je s nimi spojena řada rizik, jako jsou patogenní vlastnosti, rekombinace, replikace, imunogenní vlastnosti atd. Chemické a/nebo biochemické vektory dovolují vyhnout se těmto rizikům (přehledy viz Behr 1993, Cotten • · · · ·· ···· a Wagner 1993). K takovým vektorům patří např. kationty (fosforečnan vápenatý, DEAE-dextran atd.), které působí tak, že vytvářejí s DNA sraženinu, která pak může být (prostřednictvím fagocytózy) pohlcena buňkou. Dále jsou to liposomy, do kterých je inkorporována DNA, a které fúzují s plazmatickou membránou. Syntetické vektory pro přenos genů jsou obvykle kationtové lipidy nebo polymery, které vytvářejí komplexy s DNA a tvoří tak částice nesoucí kladné povrchové náboje. Takové částice jsou schopny interakce s negativně nabitou buněčnou membránou a jsou schopny jí procházet. Jako příklady takových vektorů lze zmínit dioktadecylamidoglycyíspermin (DOGS, Transfectam™) nebo N-[l-2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamoniumchlorid(DOTMA, Lipofectin™) . Byly vyvinuty také chimérické proteiny, které obsahují polykationtovou část, která kondenzuje DNA, spojenou s ligandem, který se váže na membránový receptor a umožňuje vznik komplexu v buňce prostřednictvím endocytózy. Takže je alespoň teoreticky možné zacílit určitou tkáň nebo buněčnou populaci, a tak zlepšit in vivo biologickou dostupnost přenášeného genu.

Plazmidy používané v současnosti pro genovou terapii obsahují zpravidla

I) replikační počátek,

II) markerový gen jako je např. gen rezistence k antibiotikům (kanamycin, ampicilin apod.), a

III) jeden nebo několik transgenů se sekvencemi nezbytnými pro jejich expresi (enhancer (tj. zesilovač), promotor, polyadenylační signál atd.).

Takový typ plazmidu se v současnosti používá např. v genové terapii při klinických studiích léčení melanomu (Nabel et al. 1992) nebo v jiných experimentálních studiích.

• · • ·

Použití plazmidové DNA v genové terapii je však spojeno s řadou problémů.

Zvláště se to týká možnosti připravit velké množství DNA ve farmakologické čistotě. Při těchto terapeutických technikách je léčivem v podstatě sama DNA a je proto nezbytné vyrobit DNA v dostatečném množství a s takovými vlastnostmi, aby byla vhodná k léčebnému použití pro člověka. V této souvislosti byly již popsány různé způsoby přípravy a/nebo purifikace, umožňující zlepšit kvalitu plazmidové DNA (viz PCT/FR95/01468, FR96/03519).

Použití DNA, která nese geny rezistence k antibiotikům nebo funkční replikační počátky, může mít také jisté nevýhody, spojené s možností rozšíření po celém těle. Byly vyvinuty různé způsoby k omezení těchto nevýhod (viz PCT/FR96/00274, FR95/10825).

Další nevýhoda plazmidů spočívá v jejich původu. Plazmidy jsou v podstatě molekuly prokaryotických organismů (bakterií) nebo nižších eukaryotických organismů (kvasinek) , které nesou motivy, které mohou být potenciálně imunogenní pro člověka. Přitom imunologické vlastnosti DNA jsou v podstatě dosud neznámé. Je známo, že bakteriální DNA v myši

I) způsobuje syntézu protilátek, které rozpoznávají dvouřetězcovou a jednořetězcovou bakteriální DNA, která imunizaci způsobila, ale nereagují se savčí dvouřetězcovou DNA, a

II) stimuluje makrofágy a produkci cytokinů (D. Pisetsky, The Immunologic Properties of DNA, J. Immunol. 156, 1996, 1) .

Tedy molekuly DNA jsou imunogenní. Avšak makromolekula může vést ke stimulaci imunitního systému aniž by sama byla imunogenní (např. cizí těleso, které vyvolá imunitní odpověď • · • · • · « · « · · • · · · · ·

zprostředkovanou buňkami). První důkazy, že bakteriální DNA vyvolává imunitní odpověď popsali Pisetsky et al. (1991, J. Immunol. 147, 1759). Ukázali, že DNA ze třech bakteriálních druhů může stimulovat proliferaci myších lymfocytů, zatímco DNA extrahovaná ze třech živočišných druhů nevedla k takové stimulaci. Později Yamamoto et al. (1992, Microbiol. Immunol. 36, 983) pozorovali, že bakteriální DNA ze šesti druhů vedla u buněk sleziny myší BALB/C ke zvýšení aktivity NK (natural killer) buněk a k indukci tvorby interferonu. Avšak DNA izolovaná z deseti druhů obratlovců nevyvolala žádnou z těchto odpovědí. Kromě toho Krieg et al. popsali v r. 1995 (Nátuře 374, 546), že fragment genomové DNA z E. coli indukuje in vitro proliferaci myších B-buněk a sekreci imunoglobulinů IgM, zatímco tatáž bakteriální DNA ošetřená in vitro CpG metylázou neindukovala takovou odpověď. Krieg et al. také ukázali, že v přítomnosti nemetylované DNA je vytvářen interferon-γ, který působí jako faktor současně stimulující (ko-stimulující) diferenciaci B-buněk tím, že moduluje tvorbu IL-6 B-buňkami (Krieg et al., 1996, J. Immunol., 156, 558). Dále bylo zjištěno, že oligonukleotidy s nemetylovanými CpG motivy, obklopené na svém 5'-konci 2 puriny a na svém 3'-konci 2 pyrimidiny způsobují in vivo koordinovanou sekreci interleukinu 6 a interleukinu 12 a interferonu-γ u NK-buněk (IFN-γ) , B-buněk (IL-6 a IL-12) a T-lymfocytů CD4⁺ (IL-6 a IFN-γ) (Krieg et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 2879).

Plazmidová DNA používaná dnes v genové terapii je zásadně produkovaná prokaryotickými buňkami, a tudíž vykazuje takový metylační profil, který je srovnatelný s bakteriální genomovou DNA. Navíc bylo ukázáno, že plazmidová DNA, která byla injikována do svalu nebo jater a pak izolována, podržela • · · · si svůj prokaryotický metylační profil (Wolf et al., 1992, Hum. Mol. Genet.,1, 29903, Malone et al., 1995, J. Biol. Chem. 269, 29903). Lze tedy shrnout, že používaná DNA bakteriálních plazmidů má značný potenciál pro stimulaci imunitního systému.

Bylo by tedy zvláště výhodné mít k dispozici plazmidovou DNA, která by měla takové vlastnosti, že její imunogeničnost by byla redukována nebo dokonce zcela odstraněna. Bylo by také zvláště výhodné mít k dispozici způsob, který by umožňoval připravovat takovou plazmidovou DNA v měřítku, které je vhodné pro průmyslové využití.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje řešení těchto otázek. Přihlašovatel se zabýval imunogenními vlastnostmi bakteriální DNA a vynalezl způsob přípravy plazmidové DNA ve farmaceutické čistotě, potenciálně bez nežádoucích imunogenních vlastností. Přihlašovatel také ukázal, že metylace určitých zbytků DNA umožňuje redukovat imunogenní potenciál plazmidových DNA aniž by se ovlivnila jejich kapacita tranfekovat buňky a exprimovat v nich požadovanou nukleovou kyselinu.

Jedním aspektem předkládaného vynálezu je příprava DNA, zejména plazmidových DNA, v terapeutické kvalitě. Další aspekt předkládaného vynálezu se týká použití plazmidové DNA s metylovanými cytosiny v dinukleotidech 5'-CG-3' pro genovou terapii. Třetí aspekt předkládaného vynálezu se týká farmaceutického přípravku obsahujícího metylované plazmidové DNA. Předkládaný vynález se také týká způsobu metylace DNA in vivo tím, že se exprimuje metyláza. Další aspekty • *

předkládaného vynálezu se týkají expresních kazet a hostitelských mikroorganismů, které se mohou použit pro metylaci, přípravy terapeutických přípravků a způsobů přenosu genů.

První předmět vynálezu se proto týká způsobu přípravy DNA, která se může použít v genové terapii a která se připravuje v buňkách obsahujících kazetu pro expresi DNA metyltransferázy, která umožňuje metylaci cytosinových zbytků v dinukleotidech 5'-CG-3'.

Předkládaný vynález se proto týká přípravy DNA, zvláště plazmidové DNA, která je metylována na cytosinových zbytcích v dinukleotidech 5'-CG-3'.

Metylace plazmidové DNA in vitro je doložena v literatuře (Adams et al. 1992, FEBS Lett. 309, 97, Doerfler 1994, FEBS Lett. 344, 251, Komura et al. 1995, Biochim. Biophys. Acta 1260, 73). Ale s tímto typem metylace nelze počítat pro průmyslovou přípravu plazmidové DNA, která by byla vhodná pro použití v genové terapii. Takový způsob přípravy plazmidové DNA musí umožňovat reprodukovatelnou přípravu velkého množství homogenní DNA, a tato DNA se pak musí čistit způsoby přijatelnými pro farmaceutické použití. Je zcela jasné, že DNA metylovaná in vitro se více či méně liší várka od várky (Doerfler 1994, FEBS Lett. 344, 251), a že takto připravované množství je velmi omezené.

Předkládaný vynález nyní ukazuje, že je možné metylovat požadovaný plazmid přímo v průběhu přípravy, a sice tím, že se v hostitelské buňce koexprimuje (současně exprimuje) gen kódující metylázu. Předkládaný vynález také ukazuje, že takto lze připravit velké a homogenní množství plazmidu, a že metylovaná plazmidová DNA může být purifikována způsoby již známými. Přihlašovatel také ukázal, že takto metylovaná DNA .·«« »·«· »··« • a · ·· · · · * · « · · 9 9 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 9999 99 99 si výhodně ponechává kapacitu transfekovat cílové buňky a případně tam, kde je to vhodné, se v nich. replikovat. Zvláště je třeba zdůraznit, že přihlašovatel dále ukázal, že plazmidová DNA takto metylovaná může in vivo exprimovat požadovanou nukleovou kyselinu.

Mnohé studie podporují myšlenku, že hypermetylace má nějaký vztah k inhibici nebo inaktivaci promotorů, a že tedy aktivně transkribované promotory jsou často nedostatečně metylované (hypometylované) nebo vůbec nejsou metylované. Tak např. v případě virových promotorů, jestliže pozdní promotor E2A adenoviru s genomem typu 2 je v transformovaných křeččích buňkách HE1 plně metylován v dinukleotidech 5'-CG-3' a v transformovaných křeččích buňkách HE2 je nemetylovaný, pak tento gen E2A jev buňkách HEl umlčený, zatímco v buňkách HE2 je transkribován (W. Doerfler 1995, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197, 209). Další příklad popsali Kohn et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91, 2567), kteří ukázali, že nepřítomnost exprese z LTR retrovirového vektoru transdukovaného v hematopoetických kmenových buňkách je spojena s metylací in vivo. Byla také popsána inhibice exprese reportérového genu řízeného virovým promotorem, když byl tento gen vnesen přechodnou transfekcí prostřednictvím plazmidu metylovaného in vitro (Adams et al. 1992, FEBS Lett. 309, 97, Doerfler 1994, FEBS Lett. 344, 251, Komura et al. Biochim. Biophys. Acta 1260, 73) . Kromě toho Razin et al. (loc. cit.) ukázali, že promotor genu kódujícího thymidinkinázu viru herpes simplex typu I a myší gen kódující metalothionein jsou inaktivní během přechodné exprese v myších L-buňkách a buňkách myšího teratokarcinomu F9, pokud jsou jejich promotory metylovány na dinukleotidech 5'-CG-3'.

*,·'···· *·· ···· ·· ·*

Předkládaný vynález tedy popisuje poprvé způsob, který umožňuje připravovat metylovanou plazmidovou DNA, která je homogenní a kompatibilní s průmyslovým použitím, a ukazuje možnost použít takový typ plazmidů pro expresi genů in vitro, ex vivo nebo in vivo, a zvláště pak pro použití v genové terapii.

Způsob podle předkládaného vynálezu se může provádět v různých typech hostitelských buněk. To znamená zvláště v jakýchkoliv buňkách kromě lidských, které zcela postrádají systém pro metylaci cytosinu v dinukleotidech 5'-CG-3'. Nepřítomnost metylace může být důsledkem nepřítomnosti vhodného enzymu, nebo nedostatečnou expresí odpovídajícího genu, nebo je důsledkem nepřítomnosti takového genu. Výhodně se mohou použít prokaryotické nebo jednotlivé eukaryotické buňky.

Výhodně je hostitelskou buňkou bakterie. Výhodněji se jedná o bakterie E. coli, B. subtilis, rod Streptomyces, rod Pseudomonas (P. putida, P. aeruginosa) , Rhizobium melioti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium nebo rod Clostridium. Je také možné využít bakterie jako např. Salmonella typhímurium, Klebsiella pneumoníae, Enterobacter aerogenes, Erwinia carotovora nebo Serratia marcescens. Výhodně jsou hostitelské buňky z nepatogenního organismu a umožňují přípravu velkého a homogenního množství plazmidové DNA. Zvláště výhodným příkladem je použití E. coli.

Způsob podle předkládaného vynálezu dovoluje přípravu DNA v terapeutické kvalitě.

DNA může být lineární nebo kruhová, jednořetězcová nebo dvouřetězcová molekula, v replikativní nebo integrativní formě, nebo plazmid, v nadšroubovicové formě nebo v uvolněné • 4 • · 44 · 4 4

4 ·

4 « 4

4 4

4« 4 4 4 4 kruhové nebo lineární formě. V dalším textu zde se bude DNA také označovat jako GT plazmidová DNA nebo GT plazmid (v případě plazmidu vhodného pro genovou terapii).

GT plazmidy obecně užívané v genové terapii nezbytně obsahuj í

I) replikační počátek,

II) jednu nebo několik požadovaných nukleových kyselin (tj . terapeutických genů) se sekvencemi nezbytnými pro jejich expresi (enhancer, promotor, polyadenylační signál atd.),

III) markerový gen.

Výběr replikačního počátku závisí především na hostitelských buňkách použitých pro přípravu. Může to být replikační počátek pocházející z plazmidu s inkompatibilitou skupiny P (např. pRK290), který umožňuje replikaci v kmenech E. coli pol A. Zcela obecně to může být jakýkoliv replikační počátek pocházející z plazmidu, který se replikuje v prokaryotických nebo nižších eukaryotických buňkách. Takovým plazmidem je třeba derivát pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, 1977, 95), derivát pUC (Viera a Messing, Gene 19, 1982, 259) nebo další plazmidy odvozené ze stejné inkompatibilní skupiny, např. ColEl nebo pMBl. Ale mohou být vybrány i plazmidy z jiných inkompatibilních skupin, které se replikují v E. coli. Možnými plazmidy jsou plazmidy patřící např. do skupin inkompatibility A, B, FI, FII, Fill, Hl, Hll, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, Y, Z nebo 9. Mohou se užít také jiné plazmidy, které se nereplikují v E. coli, ale zato v jiných hostitelích jako je např. B. subtilis, Streptomyces,

P. putida, P. aeruginosa, Phizobium melioti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, pristinaespiralis, Enterococcus faecium nebo

Streptomyces

Clostridium.

Výhodné je použití replikačního počátku z plazmidů, které se replikují v E. coli. V závislosti na konkrétní variantě, replikační počátek může být tzv. podmíněného původu, tj. takový replikační počátek, jehož aktivita závisí na přítomnosti faktoru působícího v trans. Použití takového replikačního počátku zabraňuje replikaci plazmidové DNA po podání, např. člověku (FR95/10825).

Mezi markerovými geny je třeba uvést geny rezistence, zvláště pak rezistence k antibiotiku (jako je např. ampicilin, kanamycin, geneticin, hygromycin apod.), nebo to může být jakýkoliv gen udělující buňce vlastnost, kterou sama již nemá (např. gen odstraněný z chromosomu nebo inaktivovaný) a kterou gen v plazmidů obnoví.

V konkrétním provedení vynálezu plazmidová DNA obsahuje sekvence, které umožňují, aby všechny úseky, které nemají terapeutickou funkci (replikační počátek, markerový gen apod.) byly po produkční fázi odstraněny. Zvláště výhodný způsob přípravy pro přípravu molekul takového typu (tzv. minikruhová molekula) byl popsán v přihlášce vynálezu PCT/FR95/00274.

Plazmid podle předkládaného vynálezu je výhodně dvouřetězcová molekula DNA obsahující jednu nebo několik požadovaných nukleových kyselin společně se sekvencemi nezbytnými pro jejich expresi. Ve výhodném provedení vynálezu je užita replikativní nebo integrativní kruhová molekula. Výhodně plazmidová DNA obsahuje nezbytně jednu nebo několik požadovaných nukleových kyselin společně se sekvencemi nezbytnými pro jejich expresi (tzv. miniplazmid).

Požadovaná nukleová kyselina (tj . která má být přenesena) může být jakákoliv nukleová kyselina (cDNA, gDNA, syntetická nebo polosyntetická DNA apod.), jejíž transkripce,

·· 99 • 4 4 · • · · · · 4 · 4 4 • 4

44 popřípadě translace, v buňce vede ke vzniku produktů, které mají terapeutický, očkovací, zemědělský nebo veterinární význam.

K nukleovým kyselinám s terapeutickými vlastnostmi patří zejména geny kódující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, zvláště interleukiny, interferony, TNF apod. (viz FR92/03120), růstové faktory, nervové přenašeče a jejich prekurzory nebo syntetické enzymy, trofické faktory, zejména BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 apod., apolipoproeiny, zejména ApoAI, ApoAIV, ApoE apod. (viz FR93/05125), dystrofin nebo minidystrofin (FR91/11947), geny potlačující nádory jako p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev apod. (FR 93/ 04745), geny kódující faktory účastnící se koagulace, zejména faktory VII, VIII, IX apod., tzv. sebevražedné geny, zejména pro thymidinkinázu, cytosindeaminázu apod., nebo alternativně celou molekulu přirozeného nebo umělého imunoglobulinu nebo její část (Fab, ScFv apod.) nebo ligand (WO91/19813) atd. Terapeutickým genem může být antisense (s orientací proti smyslu normální transkripce) gen nebo sekvence, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje kontrolovat expresi nebo transkripci buněčné mRNA. Taková sekvence může být transkribována v cílové buňce do RNA komplementární k buněčné mRNA, která pak blokuje translaci do proteinu, což bylo popsáno v patentu EP 140308.

Požadovaná nukleová kyselina může být také vakcinační (očkovací) gen, tj. takový gen, který kóduje antigenní peptid, schopný vyvolat imunitní odpověď u člověka nebo zvířete, s ohledem na tvorbu vakcín. Takový antigenní peptid může být např. specifický pro virus Epstein-Barrové, virus HIV, virus hepatitidy B (viz EP 185573) nebo virus ·· ···· » 4 4 4 » 4 4 « •·4 4 4« «

• 4 44 pseudorabies, anebo to také mohou být peptidy nádorově specifické (EP 259212).

Obecně je v plazmidech s geny terapeuticky, vakcinačně, zemědělsky nebo veterinárně významnou nukleovou kyselinou také promotor transkripce, který je funkční v cílové buňce nebo organismu (tj . savci a zvláště člověku), a také úsek lokalizovaný na 3'-konci, který specifikuje terminační signál transkripce a polyadenylační místo.

Pokud se týká promotorového úseku, může to být promotorový úsek přirozeně zodpovídající za expresi požadovaného genu, pokud je takový promotorový úsek schopen funkce v hostitelské buňce nebo organismu. Promotorové úseky různého původu (zodpovídající za expresi jiných proteinů, nebo dokonce syntetické úseky) jsou další možností. Promotorovými úseky mohou být zvláště promotorové sekvence eukaryotických nebo virových genů. např. to mohou být promotorové sekvence pocházející z genomu cílové buňky. Z eukaryotických promotorů je možné použít jakýkoliv promotor nebo odvozenou sekvenci, který stimuluje nebo potlačuje transkripci genu specificky nebo nespecificky, indukovatelně nebo neindukovatelně, silně nebo slabě. K možným promotorům patří všeobecně rozšířené promotory (HPRT, PGF, a-actin, tubulin, apod.), promotory intermediárních vláken (promotory genů pro GFAP, desmin, vimentin, neurofilamenta, keratin apod.), promotory terapeutických genů (jako je např. promotor genu MDR, CFTR, faktoru VIII, ApoAI apod.), tkáňově specifické promotory (jako např. promotory genů pro pyruvátkinázu, villin, intestinální protein vážící mastné kyseliny, α-actin v hladkých svalech a další) anebo případně promotory, které odpovídají na určitý stimul (receptory steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové apod.).

í.' • 9 9 999

999 9 9 1 • 1 ·· 99 být sekvence pocházející promotory adenovirových

Podobně promotorové sekvence mohou z virového genomu, jako jsou např genů E1A a MLP, časný promotor CMV nebo případně promotor LTR RSV nebo LTR MMTV a další. Navíc tyto promotorové úseky mohou být modifikovány tím, že se přidají aktivační nebo regulační sekvence, nebo sekvence dovolující tkáňově specifickou nebo převládající expresi.

Kromě toho požadované geny mohou také obsahovat signální sekvence, které směrují syntetizovaný produkt do sekreční dráhy cílové buňky. Taková signální sekvence může být přirozená signální sekvence syntetizovaného produktu, ale může to být také jiná funkční signální sekvence, nebo umělá signální sekvence.

V závislosti na tom, jakou nukleovou kyselinu požadujeme, metylovaná plazmidová DNA podle předkládaného vynálezu se může použít pro léčení nebo prevenci mnohých nemocí, včetně genetických poruch (jako je např. dystrofie, cystická fibróza atd.), neurodegenerativních onemocnění (Alzheimerova nebo Parkinsonova nemoc, ALS apod.), rakoviny, nemocí spojených s poruchou koagulace nebo dyslipoproteinemií a nemoci spojené s virovou infekcí (hepatitida, AIDS apod.), nebo se může použít v zemědělství nebo veterinárním lékařství.

Metylovaná plazmidová DNA podle předkládaného vynálezu je zvláště výhodná pro léčení nemocí, kde je potřebná trvalá exprese bez imunologické reakce, zvláště tedy v genetice a v oboru neurodegenerativních a kardiovaskulárních poruch a nemocí.

Jak již bylo uvedeno v předchozím textu, způsob podle předkládaného vynálezu užívá hostitelskou buňku obsahující • · ·· ·· ···· • · ·· ·· kazetu pro expresi DNA metyltransferázy, která umožňuje, že se metylují cytosinové zbytky v dinukleotidech 5'-CG-3'.

Po syntéze DNA jsou některé puriny nebo pyrimidiny modifikovány chemicky, např. metylací. Tak např. některé DNA obsahují 5-metylcytosin nebo N⁵-metyladenin. Tyto modifikace se uskutečňují prostřednictvím DNA metyltransferáz, udržovacích nebo de novo enzymů, které přenášejí metylovou skupinu z S-adenosyl-L-methioninu na adeninový nebo cytosinový zbytek, které mohou být umístěny ve specifických polohách sekvence. Tak např. jsou dobře známy dvě metyltranferázy z E. coli, DNA metyltransferáza dam, která metyluje adenosinový zbytek ležící uvnitř sekvence 5'-GATC-3', a DNA metyltransferáza dcm, která metyluje druhý cytidinový zbytek v sekvenci 5'-CCA/TGG-3' . Další metylázy byly zkoumány v bakteriích, kde metylují zbytky obsažené v rozpoznávacích místech pro restrikční enzymy. Např. enzym M.Hpall metyluje druhý cytosinový zbytek v sekvenci 5'-CCGG-3'.

Většina jednoduchých eukaryotických organismů a většina bezobratlých obsahují realtivně málo metylcytosinu a N⁶-metyladeninu. Avšak metylace baží u obratlovců je mnohem častější a v takovém případě je nej častější metylovanou baží 5-metylcytosin. Více než 95 % metylových skupin v DNA obratlovců se objevuje na C zbytcích nepříliš hojného dinukleotidu 5'-CG-3' (frekvenci výskytu dinukleotidu 5'-CG-3' v savčích sekvencích je velmi nízká, je 0,8 %, ačkoliv zastoupení GC párů je mnohem vyšší, v průměru 40 %, a přitom náhodné uspořádání by vedlo ke 4% frekvenci dinukleotidu 5'-CG-3'. Přitom více než 50 % všech dinukleotidů může být metylováno. Existence řady důkazů vede k představě, že stupeň metylace některých sekvencí •4 44 ··

4 4 4 4

4*44

4 444 444

4 4

4444 44 44 metyltranferázy, v dinukleotidech metylovaná DNA, obsahujících dinukleotid 5'-CG-3' by mohl být rozhodující faktor v regulaci exprese určitých genů u savců, pro inaktivaci X chromosomu, v onkogenezi (1993, DNA Methylation: Molecular Biology and Biological Significanace, Ed. Jost a Saluz) a také pro dědičné choroby (Bates et al. 1994,

BioEssays 16, 277).

Předkládaný vynález užívá kazetu pro expresi která umožňuje, že cytosinové zbytky

5'-CG-3' jsou metylovány. Výsledkem je což ve smyslu předkládaného vynálezu specificky znamená DNA metylovanou na cytosinovýcgh zbytcích v dinukleotidech 5'-CG-3'. Výhodně použitá DNA metyltranf eráza metyluje cytosinové zbytky v dinukleotidech 5'-CG-3', takže nijak neovlivňuje adeninové zbytky nebo cytosinové zbytky ležící v jiném kontextu než v dinukleotidech 5'-CG-3'. Výhodně metylovaná DNA je plazmidová DNA, ve které je více než 50 % cytosinových zbytků ležícících v dinukleotidech 5'-CG-3' metylováno. Výhodněji je metylováno alespoň 80 % a nejvýhodněji je metylováno 90% uvedených zbytků.

Metylace plazmidové DNA může být ověřena různými způsoby. Metylace může být ověřena naštěpením izolované plazmidové DNA restrikčními enzymy, které nejsou schopny štěpit, pokud štěpné místo obsahuje cytosinový zbytek v dinukleotidech 5'-CG-3', který je metylovaný. Je třeba např. uvést enzymy Hpall, AatlI a BstBI. Metylace může být také stanovena chromatograficky. Tak např. množství nemetylovaného plazmidu v preparátu metylovaného plazmidu bylo stanovenmo následujícícm způsobem: 1% nebo 5% nemetylovaného plazmidu úplně naštěpeného Hpall bylo přidáno k nenaštěpenému nemetylovanému plazmidu. Tyto vzorky, « φ · · · · · · · · · • · « · « φ φ Φ Φ Φ φ φ φ φφ Φ Φ Φ ΦΦΦΦΦΦ ΦΦΦ ♦·· ·· φφ ΦΦΦΦ >Φ ··«· ·· ·· společně s metylovaným plazmidem naštěpeným Hpall byly analyzovány anexovou kapalinovou chromatografií s detekcí při 260 nm, což umožnilo separovat nenaštěpenou DNA od naštěpené DNA a kvantifikovat ji. Bylo zjištěno, že metylovaný plazmid obsahoval méně než 5 % nemetylované plazmidové DNA, jinými slovy, více než 95 % plazmidové DNA bylo metylováno.

Výhodný způsob podle předkládaného vynálezu se vyznačuje tím, že DNA metyltransferáza přednostně metyluje cytosinové zbytky v dinukleotidech 5'-CG-3'.

Výhodně při způsobu podle předkládaného vynálezu je v plazmidové DNA více než 50 % cytosinových zbytků ležícících v dinukleotidech 5'-CG-3' metylováno. Výhodněji je metylováno více než 80 % a nej výhodněji je metylováno více než 90 % cytosinových zbytků ležícících v dinukleotidech 5'-CG-3'plazmidové DNA.

Několik savčích DNA metyltransferáz, které umožňují metylaci cytosinového zbytku ležícícího v dinukleotidu 5'-CG-3', bylo již charakterizováno a odpovídající geny byly klonovány, jako např. enzym z myši (Bestor et al. 1988, J. Mol. Biol. 203, 971) nebo člověka (Yen et al. 1992, Nucl. Acids Res. 20, 2287) . Tyto enzymy mají molekulovou hmotnost mezi 135 a 175 kD. Metylují hemimetylovanou DNA mnohem rychleji než nemetylovanou DNA, což zřejmě znamená, že se jedná o udržovací metylázy (Smith 1994, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 49, 65) . Homologní enzym v E. coli neexistuje. Naproti tomu metyláza M.SssI ze Spiroplasma metyluje výlučně a úplně cytosinové zbytky v jakémkoliv dinukleotidu 5'-CG-3' srovnatelnou rychlostí, bez ohledu na to, zda je substrát hemimetylovaný nebo nemetylovaný (Razin et al. 1992 FEBS Lett.. 313, 243, Baker et al 1993, Biochim. Biophys. Acta 196, 864). Tento enzym byl ·· izolován z kmene Spiroplasma sp. MQ1. Molekulová hmotnost enzymu je 42 kD a gen byl klonován a exprimován v E. coli (Razin et al. 1990 Nucl. Acids Res. 18, 1145, EP 0412676A1 Derwent 91045812) .

Výhodně se DNA metyltransferáza vybere ze skupiny obsahující metylázu M.SssI, myší metylázu a lidskou metylázu. Výhodněji se použije metyláza M.SssI.

Kazeta pro expresi DNA metyltransferázy obecně obsahuje nukleovou kyselinu kódující DNA metyltransferázu, která umožňuje metylaci cytosinového zbytku ležícíčího v dinukleotidu 5'-CG-3^z, a která je řízena promotorem. Promotor použitý pro tento účel může být jakýkoliv promotor, který je funkční ve vybrané hostitelské buňce. Může to tedy být promotor definovaný již v předchozím textu. V případě prokaryotické hostitelské buňky je třeba uvést zvláště promotor laktózového operonu (Plac) a tryptofanového operonu (Ptrp), hybridní promotor Plac/Ptryp, promotory P_L nebo P_R bakteriofága lambda nebo promotor genu tetA (Vectors 1988, 179, Rodriguez a Denhardt, eds.) a další.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu se užije promotor, který se liší od promotoru, který je zodpovědný za expresi požadované nukleové kyseliny v plazmidové DNA. Je zvláště výhodné použít indukovatelný promotor, který umožňuje řídit expresi metylázy. Takový indukovatelný promotor může být např. promotor z bakteriofágu T7 nebo promotor Plac.

Výhodně obsahuje expresní kazeta také terminační signál transkripce (transkripční terminátor) jako je např. terminátor ribozomu.

Kazeta pro expresi DNA metyltransferázy může být nesena replikativním vektorem nebo se může integrovat do genomu hostitele.

• 4 « 4 • 4 4

4 4 • 44

4* 444«

V případě replikativního vektoru je výhodné použít vektor, který je kompatibilní s GT plazmidem, čili který je schopen koexistence ve stejné buňce. Dva odlišné plazmidy se můžou replikovat ve stejné buňce, jestliže replikace každého plazmidu je řízena odlišným způsobem. Takže v tomto smyslu kompatibilní plazmidy patří do dvou nekompatibilních skupin. Nyní je známo asi 30 nekompatibilních skupin plazmidů, které se replikují v enterobakteriích (Maas et al. 1988, Microbiol. Rev. 52, 375) . Existuje tedy mnoho možností pro replikaci dvou plazmidů v jedné a téže buňce a v literatuře bylo dosud popsáno několik příkladů. Jako příklad je možné uvést současnou replikaci (koreplikaci) plazmidů odvozených z ColEl společně s plazmidy, které mají jako replikon R6K nebo pl5A nebo RSF1010 nebo RK2, dále koreplikaci plazmidů odvozených z RK2 s plazmidy odvozenými z R6K nebo RSF10 nebo pSa nebo ColEl (Vectors 1988, Rodriguez and Denhardt, eds.). Tento výčet není omezující a další příklady jsou popsány v publikaci Vectors, 1988, Rodriguez and Denhardt. Výhodně použitý replikativní vektor se počtem kopií v hostitelské buňce odlišuje od GT plazmidů. Tedy vektor nesoucí gen kódující metylázu, jehož exprese může být indukovatelná, je vektor s nízkým počtem kopií (odvozený např. z vektorů pACYC184 nebo RK2), zatímco GT plazmid je plazmid s vysokým počtem kopií (odvozený od ColEl) . Je také možné klonovat do GT plazmidu sekvenci, která umožní vytvoření trojšroubovicové sekvence s vhodným oligonukleotidem, takže GT plazmid pak může být oddělen od druhého plazmidu afinitní purifikací.

Kazeta pro expresi DNA metyltranferázy může být také integrovaná do genomu hostitelské buňky. Integrace se může provést homologní rekombinací, za předpokladu, že .expresní kazeta je obklopena přilehlými fragmenty neesenciálního genu • · • · • · ·· • · · · · • · · · · • · · · · · · hostitelského genomu, a že je klonována do plazmidů, který se nemůže replikovat v daném hostiteli. Takový plazmid může být:

I) derivátem ColEl v kmeni E. coli polA^ts (Gutterson et al.

1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 4894),

II) teploteně senzitivní derivát pSCIOl v jakémkoliv kmeni

E. coli (Kushner et al., 1989, J. Bacteriol. 171, 4617),

III) sebevražedný vektor jako M13mpl0 v kmeni E. coli sup⁺ (Blum et al. 1989, J. Bacteriol. 171, 538) anebo

IV) plazmid obsahující počátek g z R6K v jakémkoliv kmeni

E. coli postrádajícím gen pir (Filutowicz et al. 1994,

Prog. Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 48, 239).

Expresní kazeta může být vnesena do hostitelské buňky před plazmidovou DNA, po ní, anebo současně s ní. V případě integrativní kazety, obecně je vnášena předem, a buňky obsahující uvedenou kazetu jsou pak selektovány a použity pro přípravu plazmidové DNA.

Zvláštním aspektem předkládaného vynálezu je exprese genu kódujícího metylázu M.SssI v bakteriálních buňkách (zvláště v E. coli) obsahujících GT plazmid. Jak je ukázáno v příkladech, uvedený plazmid má pak metylovány cytosiny v dinukleotidech 5'-CG-3'. Konkrétněji je GT plazmid transformován do kmene E. coli mcrA mcrB D(mcrC-mrr) již obsahujícího plazmid nesoucí gen, který kóduje metylázu M.SssI a který je kompatibilní s GT plazmidem. Během růstu bakterie oba plazmidy koexistují, replikují se a jsou metylovány (Gotschlich et al., J. Bacteriol. 173, 5793).

Plazmidová DNA nebo expresní kazeta se mohou vnést do hostitelské buňky libovolnou technikou známou odborníkovi (transformací, transfekcí, konjugací, elektroporací, pulzovou metodou, precipitací apod.). Transformace se může provést zvláště způsobem pomocí CaCl2 (Dagert a Ehrlich, Gene 6, « · • ·

• · · · · · · · · • ·· · · ♦ · · • ·· · · · ······ • · · · · • · · · ···· ·· · ·

1979, 23) nebo způsobem, který vyvinuli Hanahan et al.

(J. Mol. Biol. 166, 1983, 557), nebo jakýmkoliv dalším způsobem od předchozího odvozeným (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989), a také elektrotransformací (Wirth et al., Mol. Gen. Genet. 216, 1989, 175) nebo pomocí TSB (transformation and storage buffer, Chung et al., 1988,

Nucl. Acids Res. 16, 3580) . Viz také obecné techniky v molekulární genetice zmíněné v dalším textu.

Metylovaná plazmidová DNA podle předkládaného vynálezu může být purifikována kteroukoliv z metod známých odborníkovi (precipitací, chromatografií, centrifugací, dialýzou apod.). Ve zvláštním případě, kdy je použit replikativní vektor pro expresi metyltransferázy, musí být GT plazmid navíc oddělen od uvedeného vektoru. K tomu lze užít různé způsoby, založené na rozdílu ve velikosti nebo hmotnosti uvedených dvou plazmidů, nebo na tom, že se štěpí vektor v restrikčních místech přítomných pouze ve vektoru a nikoliv v GT plazmidů.

Zvláště výhodný způsob purifikace je založen na afinitě mezi specifickou sekvencí přítomnou v GT plazmidů a imobilizovaným oligonukleotidem. Takový způsob purifikace využívající trojšroubovicové struktury byl podrobně popsán v přihláškách FR96/03519 a FR94/15162, na které se tímto plně odvoláváme.

Zvláště výhodným výsledkem provedení předkládaného vynálezu je to, že plazmidová DNA. metylovaná způsobem podle vynálezu vede ke stejně dobré expresi genu řízené promotérem, jaké je dosahováno se stejným, ale nemetylovaným plazmidem. Taková metylovaná plazmidová DNA by neměla vést k imunitní stimulaci spojené s bakteriální DNA a představuje tudíž výhodu pro použití v nevirové genové terapii.

• · • ·

Metylovaná plazmidová DNA podle předkládaného vynálezu může být použita pro jakékoliv očkování nebo pro genovou terapii s jakýmkoliv genem, pro přenos genu do těla, tkáně nebo určité buňky. Zvláště se může použít pro přímé podávání in vivo nebo pro modifikace buněk in vitro nebo ex vivo pro jejich implantaci pacientovi. V této souvislosti, molekuly podle předkládaného vynálezu se mohou použít tak jak jsou (ve formě nahé DNA), nebo v kombinaci s různými syntetickými nebo přirozenými chemickými a/nebo biochemickými vektory. Mezi vhodné vektory patří zvláště kationty (fosforečnan vápentý, DEAE-dextran apod.), které působí tak, že vytvářejí sraženinu s DNA, kterážto sraženina může být fagocytózou pohlcena do buňky. K dalším vektorům patří liposomy, do kterých je molekula DNA vložena, a které fúzují s plazmatickou membránou. Syntetické vektory pro přenos genů jsou obvykle obecně kationtové lipidy nebo polymery, které vytvářejí komplexy s DNA, a vytvářejí tak částice, které nesou na povrchu pozitivní náboj. Tyto částice jsou schopny interakce s negativními náboji na povrchu buněčné membrány, kterou jsou pak schopny projít. Jako příklady takových vektorů lze zmínit DOGS (Tranfectam™) nebo DOTMA (Lipofectin™).

Byly připraveny také chimérické proteiny: skládají se z polykationtové části, která kondenzuje DNA, a tato část je spojena s ligandem, který se váže na membránový receptor a umožňuje vznik komplexu v buňkách prostřednictvím endocytózy. Molekuly DNA podle vynálezu se také mohou použít pro přenos genů do buněk fyzikálními metodami transfekce jako je např. bombardování mikročásticemi, elektroporace apod.

• · • · • 4 4

4 4 * 4 4

Navíc mohou být molekuly podle vynálezu před jejich terapeutickým použitím případně linearizovány, např. enzymatickým štěpením.

Další předmět předkládaného vynálezu se týká jakéhokoliv farmaceutického přípravku, který obsahuje metylovanou plazmidovou DNA, která byla definována v předchozím textu. Tato DNA může být buďto nahá nebo kombinovaná s chemickým a/nebo biochemickým vektorem pro transfekci. Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být formulovány po topické, perorální, parenterální, intranzální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární, transdermální a další podávání. Výhodně je molekula DNA v injikovatelné formě nebo ve formě, kterou lze aplikovat. Lze ji smíchat s jakýmkoliv farmaceuticky přijatelným vehikulem pro injekční podávání, zvláště pro přímé injikování do místa, které má být ošetřeno. Takovým vehikulem je zvláště např. isotonický sterilní roztok, nebo suchý, zvláště lyofilizovaný přípravek, který po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku umožní vytvoření roztoku pro injekci. K příkladům patří zvláště pufry obsahující Tris nebo PBS naředěné v roztoku glukózy nebo chloridu sodného. Přímá injekce nukleové kyseliny do zasažené oblasti je výhodná, neboť umožňuje, aby terapeutický účinek byl koncentrovaný v příslušné tkáni. Dávky nukleové kyseliny, které se použijí, se upraví v závislosti na různých faktorech, a zvláště v závislosti na použitém genu, vektoru, způsobu podávání, léčeném stavu a požadované době léčení.

Předkládaný vynález je podrobněji a úplněji popsán pomocí následujících příkladů, jejichž funkce je ilustrovat vynález a nikoliv ho omezovat.

• ·

Popis obrázků

Obr. 1. Mapa plazmidu pXL2784

Obr. 2. Restrikční mapa plazmidu pXL2784

Obr. 3. Profil štěpení plazmidů:

- pXL2784,

- metylovaný pXL2784,

- metylovaný pXL2784 + metylovaný pAIT2,

- metylovaný pAIT2, štěpený enzymy:

A-AatlI,

B-BstBI,

C-HindlII,

D-Hpall,

E-EcoRI (M je lkb žebříčkový markér molekulové hmotnosti).

Některé obecné techniky molekulární biologie a klonování

Standardní metody molekulární biologie, jako je např. centrifugace plazmidové DNA v gradientu cloridu česného a etidiumbromidu, štěpení restrikčními enzymy, gelová elektroforéza, elektroleuce fragmentů DNA z agarózového gelu, transformace E. coli, precipitace nukleových kyselin a další, jsou popsány v odborné literatuře (Maniatis et al. 1989,

Asubel et al. 1987).

Nukleotidové sekvence byly stanoveny terminační metodou podle protokolu, který publikovali Asubel et al.(1987).

* A • · • ·

Použité restrikční enzymy byly zakoupeny od firem New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) nebo Amersham Ltd. (Amersham).

Pro ligace byly fragmenty DNA separovány podle velikosti v 0,7% agarózovém gelu nebo v 8% a kryl amidovém gelu, purifikovány elektroforézou a pak elektroelucí, extrahovány fenolem, precipitovány etanolem a pak inkubovány v 50mM Tris-HCl, pH 7,4 s lOmM MgCl₂, lOmM DTT, 2mM ATP, v přítomnosti T4 DNA ligázy (Biolabs).

Oligonukleotidy byly syntetizovány fosforamiditovou technologií, přičemž fosforamiditové deriváty byly chráněny v β-poloze kyanoetylovou skupinou (Sinha et al. 1984, Giles 1985) pomocí automatického syntetizačního zařízení DNA/RNA Synthesizer Applied Biosystems 394 podle doporučení výrobce.

V bakteriologické práci byla užita média LB a 2XTY (Maniatis et al. 1989) .

Plazmidové DNA byly purifikovány také pomocí alkalické lýze (Maniatis et al. 1989).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Popis GT plazmidu

Odborníkům je známa řada kazet pro eukaryotickou expresi, které jsou neseny plazmidy replikujícími se v bakterii E. coli. Takové kazety mohou exprimovat reportérové geny jako je např. gen E. coli kódující β-galaktosidázu, nebo gen pro chloramfenikolacetyltransferázu z transpozonu Tn9, nebo gen pro luciferázu, nebo geny vhodné • · • · ·

pro genovou terapii. Tyto kazety obsahují promotor, který je virového nebo eukaryotického původu. Takové expresní systémy jsou buď tkáňově specifické, případně mohou být exprimovány všeobecně. Kazeta užitá v tomto příkladu obsahuje gen luc, kódující luciferázu z Photinus pyralis, a promotor CMV, intermediátní promotor/enhancer lidského cytomegaloviru. Gen luc obsahuje 4,78 % dinukleotidů 5'-CG-3' a virový promotor pCMV jich obsahuje 5 %. Avšak toto zastoupení je relativně vysoké vzhledem k nízké frekvenci dinukleotidů 5'-CG-3' v sekvencích savců, kde činí 0,8 %. V přítomnosti metylázy (jako je např. metyláza M.SssI nebo CpG metyláza, které jsou endogenní pro savce) , promotor pCMV a gen luc mohou být vysoce metylovány. Tato expresní kazeta byla klonována do plazmidu pXL2784, který se replikuje v E. coli a jehož mapa je uvedena na obr. 1. Tento plazmid má velikost 6390 bp a obsahuje 5,8 % dinukleotidů 5'-CG-3'. Plazmid pXL2784 byl konstruován z vektoru pXL2675 (2,513 kb), minimálního replikonu ColEl z plazmidu Bluescript (Ori) , a má jako selektovatelný markér gen kódující rezistenci ke kanamycinu z transpozonu Tn5. Plazmid pXL2784 také obsahuje TH sekvenci (GAA)n, která se může vázat k oligomeru (CTT)_n, kde n=l až 17, čímž se vytváří lokální trojšroubovicová struktura, která umožňuje afinitní purifikaci. Plazmid pXL2784 má lokus cer (382 bp) pocházející z ColEl, tento lokus cer obsahuje místně-specifickou sekvencí pro rekombinázu XerC/XerD, a vede k rozlišení plazmidových dimerů (Summers et al., 1988, EMBO

J. 7, 851). Transgen klonovaný do tohoto plazmidu pXL2784 je expresní kazeta (3,3 kb) pro gen luc kódující luciferázu z Photinus pyralis (pocházející z plazmidu Promega pGL2 basic) řízená jednotkou promotor/enhancer lidského • · cytomegaloviru pCMV (pocházející z plazmidu Invitrogen pcDNA3).

Příklad 2

Konstrukce kazety pro expresi DNA metylázy

Tento příklad popisuje strukturu kazety pro expresi metylázy M.SssI ze Spiroplasma Sp. MQ1. Je samozřejmé, že podle stejného principu by se postupovalo při konstrukci kazety pro expresi kteréhokoliv enzymu podle předkládaného vynálezu.

Expresní kazeta obsahuje gen ze Spiroplasma Sp. MQ1 kódující metylázu M.SssI, jejíž exprese je řízena promotorem Plac. Takže v přítomnosti IPTG galaktosidu) je metyláza syntetizována a je (Gotschlich et al. 1991, J. Bacteriol. 173, 5793).

Tato kazeta je přítomna v plazmidu pAIT2, který má replikon pACYC184, a navíc nese gen z transpozonu Tn903 kódující rezistenci k lividomycinu, který umožňuje selekci transformovaných hostitelských buněk.

(Isopropyl—β-D-thioaktívní

Příklad 3

Příprava DNA plazmidu pXL2784 s metylovanými cytosinovými zbytky dinukleotidů 5'-CG-3'

Metylázou M.SsI ze Spiroplasma Sp. MQ1 jsou metylovány všechny cytosinové zbytky v dinukleotidech 5'-CG-3' plazmidu pXL2784. Způsob metylace podle předkládaného vynálezu využívá tento enzym a piazmid je metylován v průběhu přípravy v bakterii.

·· 99 99 99 99 99

999 9 9 99 9 9 99 9

9 99 · 9999

9999 «9 999 999 • 99 999 9 9

9999 99 9999 99 99

Pro tento účel byl kmen E. coli ER 1821, který má genotyp F~l~endAl thil supE44 mcrA5 D(mrr-hsdRMS-mcrB)1-::IS10 a nese plazmid pAIT2, transformován TSB metodou („transformation and storage buffer, Chung etal. 1988, Nucleic Acid Research 16, 3580) plazmidem pXL2784. Transformanty byly selektovány na médiu LB obsahujícím 50 mg/1 kanamycinu a 100 mg/1 lividomycinu, aby se selektovaly pXL2784, nesoucí gen rezistence ke kanamycinu z transpozonu Tn5, a pAIT2, nesoucí gen rezistence k lividomycinu z transpozonu Tn903. Když byla transformanta ER1821 pAIT2 pXL2784 kultivována v médiu LB s 50 mg/L kanamycinu a 100 mg/1 lividomycinu a 2,5mM IPTG při 37 °C po 15 hodin, extrahovaný plazmid byl metylovaný.

Metylace byla ověřena naštěpením izolované plazmidové DNA restrikčními enzymy Hpall, AatlI a BstBI. Integrita a přítomnost obou plazmidů byla ověřena štěpením preparátů DNA restrikčními enzymy HindlII a EcoRI, jak je ukázáno na obr. 2. Restrikční enzymy Hpall, AatlI a BstBI jsou tři enzymy, které nejsou schopny štěpit, jestliže cytosinové zbytky v dinukleotidech 5'-CG~3' obsažených ve štěpném místě jsou metylované. V promotoru pCMV podle mapy existují čtyři rozpoznávací místa AatlI, v genu luc jsou dvě místa pro BstBI a jedenáct rozpoznávacích míst Hpal, přičemž tento enzym Hpal štěpí plazmid pXL2784 na 30 fragmentů. Na fotografii agarózového gelu obarveného ethidiumbromidem (obr. 3) je vidět, že v případě metylovaného plazmidového preparátu pAIT2+pXL2784 nebo v případě metylovaného plazmidů pXL2784 purifikovaného afinitní chromatografií (viz příklad 4) nedochází k žádnému štěpení enzymy Hpall, AatlI a BstBI, zatímco štěpení enzymy HindlII a EcoRI poskytuje profil, který lze očekávat podle restrikční mapy. Kontrolní štěpení plazmidu ÚXL2784 enzymy Hpall, AatlI a BstBI poskytlo také profil, který lze očekávat podle restrikční mapy.

Výsledky jasně ukazují, že extrahovaná plazmidová DNA je metylována na cytosinových zbytkách v dinukleotidech 5'-CG-3'. Výsledky navíc ukazují, že metylace ovlivňuje více než 90 % takových cytosinových zbytků.

Příklad 4

Použití metylovaných plazmidů po přenos genetického materiálu Tento příklad ukazuje, že metylovaná plazmidová DNA podle předkládaného vynálezu si uchovává svou kapacitu transfekovat buňky, replikovat se v nich a exprimovat v nich požadovaný gen.

A. Protokol pro přípravu roztoků pro transfekci

V porovnávací studii byly použity dvě skupiny plazmidů:

a) pXL2784

b) metylovaný pXL2784

Metylovaný pXL2784 byl získán ve formě směsi s pAIT2, který způsoboval jeho metylaci po kotransformaci bakterií. Byla provedena frakcionace afinitní chromatografií, aby byl požadovaný plazmid vyčištěn. Použitý způsob čištění byl popsán v přihlášce FR 94/15162. Krok, kde se provádí dialýza proti 0,15 M NaCl se provedl, aby se odstranil pufr tvořící eluční fázi v koloně.

Pokud byl plazmid pXL2784 užit jako referenční, byl purifikován stejným způsobem, jak bylo popsán výše.

V tomto příkladu bylo jako vektoru použito kationtového lipidu RPR120535A, který je popsán v přihlášce FR 95/13490.

• · · ·· ···· ·· φφ • ΦΦΦ · • · φ φ • φ φ φ φ • φ · φ φ · · · · φφ • φ

Přitom je samozřejmé, že je možné pro přenos použít jakéhokoliv jiného chemického nebo biochemického vektoru.

Transfekční roztoky byly připraveny ze směsi stejných objemů DNA v koncentraci 30 μg/ml a 90μΜ vodného roztoku kationtového lipidu RPR120535A, takže poměr kationtový lipid/DNA byl 3 nmol kationtového lipidu/1 μg DNA. Po homogenizaci vortexem a alespoň 15 minutové inkubaci při teplotě místnosti byl roztok DNA/lipofektant distribuován v poměru 4,8 % (objemových) do jamek, kde byly buňky opláchnuty médiem bez proteinu (tj. bez séra) a pak ponechány růst během období transfekce v médiu bez séra.

B. Transfekční protokol

Vzorky obsahující lxlO⁵ buněk (NIH3T3, tj . myších fibroblastů a HeLa, tj. buněk lidského karcinomu dělohy) v exponenciální fázi růstu na 2 cm² (500 μΐ média bez séra na jamku) byly ošetřeny 25 μΐ transfekčního roztoku, což odpovídalo 0,375 μg DNA na lxlO⁵ buněk. Po 2 hodinové inkubaci v 37 °C ve zvlhčované atmosféře s 5% CO2 bylo do růstového média přidáno telecí fetální sérum, takže jeho výsledná koncentrace byla 8% (objemová).

hodin po transfekcí byly buňky opláchnuty PBS a lyžovány pufrem obsahujícím 1% TritonX-100 a 2mM DTT. Aktivita exprimované luciferázy byla měřena jako emise světla (RLU - relativní jednotky světla) v přítomnosti luciferinu, koenzymu A a ATP po 10 sekund, a vyjádřená na mg proteinu extrahobvaného lyzovacím pufrem.

C. Výsledky

Výsledky získané postupy popsanými v předchozích odstavcích jsou uvedeny v následující tabulce.

• ·

Buňky	Buňky NIH 3T3	Buňk	y HeLa
Plazmid	pXL2784	PXL2784CH3	pXL2784	PXL2784CH3
Purifikované	2 x 1O¹⁰	2,2 x 1O¹⁰	3,1 x 10¹⁰	1,7 x 1O¹⁰
afinitní ohromatografii	+ /- 4%	+/- 10%	+/- 15%	+/- 11%
Purifikované	2,3 x 1O¹⁰	3,1 x 1O¹⁰	3,8 x 1O¹⁰	2, 4 x 1O¹⁰
dialýzou	+ /- 21%	+/- 10%	+/- 14%	+ /- 7%

Enzymová aktivita je vyjádřena v RLU/10 sekund/mg proteinu s variačním koeficientem v %, každý výsledek reprezentuje tři transfekční pokusy.

Uvědomíme-li si . význam koeficientů rozptylu v takovém typu pokusu, je z výsledků možno uzavřít, že není žádný významný rozdíl v expresi u dvou použitých plazmidů za stejných podmínek transfekce. Kromě toho je získaná luciferázová aktivita stejného řádu pro oba purifikační postupy.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY použití v genové terapii, tím, že uvedená DNA se expresi DNA cytosinových

Způsob přípravy DNA pro vyznačující se připravuje v buňce obsahující kazetu pro metyltranferázy, která umožňuje metylaci zbytků v dinukleotidech 5'-CG-3'.
2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že buňka je prokaryotická buňka.
3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že buňka je bakterie.
4. Způsob podle nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že expresní kazeta je nesena repliktivním vektorem.
5. Způsob podle nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že expresní kazeta je integrována v genomu buňky.
6. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že expresní kazeta obsahuje nukleovou kyselinu kódující DNA metyltransferázu, která umožňuje, aby cytosinové zbytky v dinukleotidech 5'-CG-3' byly metylovány pod kontrolou promotoru.
7. Způsob podle nároku 6 vyznačující se tím, že promotor je indukovatelný promotor.

• · ·· ♦· • · · · • · ·
8. Způsob podle náoku 1 vyznačující se tím, že DNA metyltransferáza přednostně metyluje cytosinové zbytky v dinukleotidech 5'-CG-3'.
9. Způsob podle nároku 8 vyznačující se tím, že DNA metyltransferáza je vybrána ze skupiny obsahující metylázu M.SssI, myší metylázu a lidskou metylázu.
10. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že více než 50 % cytosinových zbytků v dinukleotidech

5'-CG-3' plazmidové DNA je metylováno.
11. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že více než 80 % cytosinových zbytků v dinukleotidech

5'-CG-3' plazmidové DNA je metylováno.
12. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že více než 90 % cytosinových zbytků v dinukleotidech

5'-CG-3' plazmidové DNA je metylováno.
13. Použití plazmidové DNA pro přípravu farmaceutického přípravku zamýšleného pro terapeutické nebo diagnostické použití na lidském nebo zvířecím těle, kdy více než 50 % cytosinových zbytků v dinukleotidech 5'-CG-3' plazmidové DNA je metylováno.
14. Použití plazmidové DNA pro přípravu farmaceutického přípravku zamýšleného pro terapeutické nebo diagnostické použití na lidském nebo zvířecím těle, kdy více než 80 % cytosinových zbytků v dinukleotidech 5'-CG-3' plazmidové DNA je metylováno.

• · · · ·· ·« ·· • · « · · · • · ♦ · » • · · · · · • · · · · ·· ···« <f · ·« ·· • * · * • · · · • * · · · · · • «
15. Použití plazmidové DNA pro přípravu farmaceutického přípravku zamýšleného pro terapeutické nebo diagnostické použití na lidském nebo zvířecím těle, kdy více než 90 % cytosinových zbytků v dinukleotidech 5'-CG-3' plazmidově DNA je metylováno.
16. Způsob přípravy farmaceutického přípravku, zamýšleného pro terapeutické nebo diagnostické použití na lidském nebo zvířecím těle, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se

- připraví DNA tím, že se kultivují buňky obsahující uvedenou DNA a kazetu pro expresi DNA metyltransferázy, která umožňuje, aby cytosinové zbytky v dinukleotidech 5'-CG-3' byly metylovány, získá uvedená DNA, a

- uvedená DNA zabalí s farmaceuticky přijatelným vehikulem.
17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že DNA je plazmidová DNA obsahující nukleovou kyselinu s terapeutickým významem.
18. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že DNA je minikruhová DNA obsahující nukleovou kyselinu s terapeutickým významem.
19. Přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje bakteriální DNA, ve které je alespoň 50 % cytosinových zbytků v dinukleotidech 5'-CG-3' metylováno.