CA2258792A1 - Procede de production d'adn therapeutique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne la préparation d'ADN, notamment plasmidique. Elle concerne plus particulièrement la production d'ADN plasmidique bactérien qui soit utilisable en thérapie génique, sous la forme de plasmide, de minicercle surenroulé, relâché ou linéaire.

Description

CA 022~8792 1998-12- l~

- WO 98/01540 . - PCT/FR97tO1116 PROCEDE DE PRODUCTION D'ADN THF.l~APF.UTIQUF.

La présente invention concerne Ll ~,-ep~alion d'ADN, not~mment pl~mi~lique. Elle concerne plus particulierement la production d'ADN pl~cmiflique bactérien qui soit utilisable en thérapie génique, sous la forme de pl~mirl~, de5 minicercle ~we~ ,ulé, relaché ou linéaire, et dont les propriétés immlmogènes sont réduites voire supprimées. L'invention concerne également des microorg~ni~mes utilisables pour la production d' ADN, ainsi que des compositions pharmaceutiques.

La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie en introduisant une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette 10 information peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe et ensuite réinjectée dans l'organisme, soit in !~Q, directement dans le tissu visé.
S'~gi~ant d'une molécule de haut poids moléculaire et de charge négative, l'ADN a des difficultés pour traverser spontanément les membranes cellulaires phospholipidiques. Différents vecteurs sont donc utilisés afin de permettre le 15 transfert de gène: les vecteurs viraux d'une part, les vecteurs chimiques et/ou biochimiques, naturels ou synthétiques, d'autre part. Les vecteurs viraux (rétrovirus, adénovirus, virus adéno-associés,...) sont très efficaces, not~mment pour le passage des membranes, mais présentent un certain nombre de risques tels que la pathogénicité, la recombinaison, la réplicaticn, l'immunogénicité, ... Les vecteurs 20 chimiques et/ou biochimiques permettent d'eviter ces risques (pour revues, voir Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Ce sont par exemple des cations (phosphate de calcium, DEAE-dextran,...) qui agissent en formant des précipités avec l'ADN, lesquels peuvent être "phagocytés" par les cellules. Il peut également s'agir deliposomes dans lesquels l'ADN est incorporé et qui fusionnent avec la membrane 25 plasmique. Les vecteurs synthétiques de Lra,1~eLl de gènes sont généralement des lipides ou des polymères cationiques qui complexent l'ADN et forment avec lui une particule portant des charges positives en surface. Ces particules sont capablesd'interagir avec les charges négatives de la membrane cellulaire, puis de franchir celle-ci. On peut citer comme exemples de tels vecteurs le 30 dioctadécylamidoglycyls~e~ e (DOGS, Tr~msfectamTM) ou le chlorure de N-[1-CA 022~8792 1998-12-1~

(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA, LipofectinTM). Des protéines chimères ont aussi été développées: elles sont con.ctitl1ées d'une partie polycationique qui condense l'ADN, liée à un ligand qui se fixe sur un récepteurmembranaire et entraîne le complexe dans les cellules par endocytose. Il est ainsi 5 théoriquement possible de "cibler" un tissu ou ce"a~es populations cellulaires, afin d'améliorer la biodisponibilité in vivo du gène transféré.

Les pl~mi-les utilisés ~ctuellem~nt en thérapie génique portent generalement (i) une origine de réplication, (ii) un gène marqueur tel qu'un gène de résistance à un antibiotique (kanamycine, ampicilline...) et (iii) un ou plusieurs transgènes avec des 10 séquences nécessaires à leur expression (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de polyadénylation...). Ce type de plasmides est par exemple utilisé actuellement en thérapie génique au niveau d'essais cliniques tels que le traitement de mélanomes, Nabel et al., 1992, ou au niveau d'études expérimentales.

L'utilisation d'ADN plasmidique en therapie genique pose toutefois un 15 certain nombre de problemes.

En particulier, cela implique la possibilité de produire des quantités importantes d'ADN de pureté pharmacologique. En effet, dans ces techniques de thérapie génique, le médicament est constitué par l'ADN même et il est essentiel de pouvoir fa~riquer, dans des quantités adaptées, des ADN ayant des propriétés 20 appl upriées à un usage thérapeutique chez l'homme. A cet egard, differentes methodes de production et/ou purification ont ete decrites dans l'art anterieur,permettant d'ameliorer la qualite de l'ADN plasmidique (PCT/FR95/01468; FR96 03519).

Par ailleurs, I'utilisation d'ADN porteur de genes de resistance a des 25 antibiotiques ou d'origines de replication fonctionnelles peut egalement présenter certains inconvénients, liés notamment à leur f~i~min~tion dans l'organisme.
Differentes approches ont egalement ete developpees pour limiter ces inconvenients (PCT/FR96/00274, FR95 10825).

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Un autre inconvenient des ADN pl~m~ ques utilises jusqu'a present reside dans leur origine. Il s'agit en effet de molecules produites e~ntiellement dans des or~ni~mes procaryotes (bacteries) ou eucaryotes inferieurs (levures), qui pos~Pnt potentiellement des motifs immunogenes chez l'homme. Les propriétés 5 immunologiques de l'ADN sont encore assez peu connues. L'ADN bactérien chez lasouris conduit i) à la ~ylllhese d'anticorps I~ n~;s~ l'ADN bactérien double brin et simple brin ayant permis l'imml-ni~ation mais ne ré~gi.~s~nt pas avec l'ADN
double brin m~mmifère, ii) à la stimulation de la production de macrophages et cytokines (D. Pisetsky "the Immunologic .Properties od DNA" J. Immunol. 156 (1996) 1). La macromolécule ADN est aniisi dite immunogène. Par ailleurs, une macromolécule peut aussi conduire à une stimulation du système immunitaire sans être immunogène (par exemple corps étranger conduisant à une réponse immunitaireà médiation cellulaire). Les premières évidences suggérant que l'ADN bactérien conduit à une réponse immunitaire ont été décrites par Pisetsky et coll. (1991 J.
Immunol. 147 pl759). Ils ont montré que l'A~DN de trois espèces bactériennes peut stimuler la prolifération de lymphocytes de souris alors que l'ADN extrait de trois espèces animales ne conduit pas à cette stimulation. Puis, Yamamoto et coll. (1992 Microbiol. Immunol. 36 p983) ont observ~é que l'ADN bactérien de six espèces conduit dans les cellules de rate de souris BALB/c à une augment~tion de l'activité
20 NK "natural killer" et à l'induction de la procluction d'interférons. Mais l'ADN extrait de dix espèces vertébrées ne conduit à auclme de ces réponses. En outre, Krieg et coll. ont décrit en 1995 (Nature vol374 p546) qu'un fragment d'ADN genomique de E.coli induit in vitro la prolifération de cellules B murines et la secrétion d'immunoglobulines IgM, alors que ce même ADN bactérien, traite in vitro avec une 25 CpG méthylase, n'induit pas une telle réponse. Krieg et coll. ont aussi indique qu'en présence d'ADN non méthylé, l'interféron g est prc)duit, et agit comme facteur costimulant de la difféle~lliation des cellules; B en modulant la production d'IL-6 par les cellules B (Krieg et coll. 1996 J. Immunol. 156 p558). De plus un oligonucleotide possédant un motif CpG non méthylé et encadré en 5' par 2 purines et en 3' par 230 pyrimidines conduit in vivo à une secrétion coordonnée des interleukines IL-6 et IL-12, et dlinterférons g par les cellules NK(IF]~I-g), les cellules B (IL-6 et IL-12) et les CA 022~8792 1998-12-1~

- WO 98/01540 . - PCT/FR97101116 lymphocytes T CD4+( IL-6 et IFN-g) (Krieg et coll. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93 p2879).

L'ADN p~ mi~iique utilisé jusqu'à ce jour en thérapie geni~ue est e~ ntiellement produit dans des cellules procaryotes, et pl~senle donc un profil de 5 methylation comparable a celui de l'ADN genomique b~cterien Il a en outre ete demontre que l'ADN pl~mi~ique qui a été injecté dans le muscle ou dans le foie, puis extrait, conserve le profil de méthylation procaroyte (Wolf et coll. 1992 Hum.
Mol. Genet.1 p363; Malone et coll. 1995 J. Biol. Chem. 269 p29903). De ce fait, l'ADN pl~mi~ ue bacterien utilisé presente un potentiel de stimulation du système 10 i~n~ ir~ important.

Il serait donc particulièrement avantageux de pouvoir disposer d'ADN
plasmidique ayant des propriétés immunologiques réduites, voire supprimées. Il serait également particulièrement avantageux de pouvoir disposer d'un procédé
permettant de produire, à une Echelle compatible avec une utilisation industrielle, 15 des ADN pl~mi~iques de ce type.

La présente invention apporte une solution à ces problèmes. La demanderesse s'est en effet intéressée aux propriétés immunogènes de l'ADN bactérien. La c~.om~n~i~reSse a m~inten~nt mis au point un procédé permettant de produire des ADN plasmidiques de qualité pharm~ceusique, potentiellement dépourvus d'effets 20 immunogènes indésirables. La (l~m~n-le~esse a également montré que la méthylation de certains résidus de d'ADN permettait de réduire le potentiel immunogène des ADN pl~mi~iiques, sans affecter leur capacité de transfecter des cellules et d'yexprimer un acide nucléique d'intérêt.

Un aspect de l'invention est de pré~el des ADN, not~mmPnt plasmidiques, 25 de qualité th~l~pe~ltique. Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation en thérapie génique d'ADN plasmidique méthylé sur les cytosines des dinucléotides 5'-CG-3'. Un troisième aspect de l'invention est relatif à des compositions pharmaceutiques comprenant des ADN pl~mit~ ues mEthyles.
L'invention concerne encore un procédé de méthylation in vivo d'ADN par eA~r~ssion d'une méthylase. L'invention dans d'autres aspects, est relative à des ettes d'expression, des microorganismes hotes utilisables pour la méthylation, la ~pa~alion de compositions thérapeutiques, et des méthodes de ~-an~rell de gènes.
Un premier objet de l'invention concerne donc un procédé de production 5 d'ADN utilisahlç en thérapie génique caract~risé en ce que ledit ADN est produit dans une cellule c-nt~n~nt une cassette d'expression d'une ADN m~ yl~ rel~c permettant de méthyler les résidus cytosine des ~in-lcléotide 5'-CG-3'.

La présente invention concerne donc la production d'ADN, not~mmPnt pl~emi~lique, méthylé sur les résidus cytosine des dinucléotides 5'-CG-3'.

La méthylation d'ADN plasmidique in vitro est documentée dans la iLIeldlU~e (Adams et coll. 1992 FEBS Letters 309 p97; Doerflerl994 FEBS Letters 344 p251; Komura et coll. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p73). Cependant, ce mode de méthylation n'est pas envisageable pour la production industrielle de pl~cmiclç qui serait utilisé en thérapie génique. Un procédé de production d'ADN15 plasmidique doit en effet permettre de produire de façon reproductible des quantités de plasmides importantes et homogènes et de purifier cet ADN par des méthodes acceptables pour un usage pharmaceutique. Il est bien clair qu'un ADN méthylé invitro peut-être plus ou moins relâché de lot à lot (Doerflerl994 FEBS Letters 344 p251) et que les quantités produites sont limitees.

La présente invention montre m~int~n~nt qu'il est possible de méthyler un pl~mide d'intérêt directemçnt au cours de ]a production, en coexprimant dans la cellule hote le gène codant pour une méthylase. La présente invention montre également que, selon ce procédé, des qu;mtités importantes et homogènes de pl~mide méthylé peuvent être produites et l'ADN plasmidique méthylé peut être purifié selon des procédés déjà décrits. La demanderesse a egalement ~em~-ntre, de maniere avantageuse, que l'ADN pl~mi(iique ainsi méthylé conserve la c~p~cite detransfecter des cellules cibles et, le cas échEant, de s'y repliquer. De manièreparticulièrement remarquable, la ~eman~lçresse a encore démontré que l'ADN
plslcmi~lique ainsi méthylé peut, in vivo, exprimer des acides nucléiques d'intérêt.

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- WO 98/OlS40 - PCT/FR97/01116 De nombreuses études re,~or~enl en effet l'idée que l'hyperméthylation est corrélée avec l'inhibition ou l'inactivation des promoteurs et que des promoteurs activement transcrits sont sollv~lll hypo-ou non méthylés. Ainsi, s'~gi~c~nt de promoteurs viraux, si le promoteur tardif E2A du génome de l'adénovirus de type 2 5 est entièrement méthylé sur les dinucléotides 5'-CG-3', dans les cellules transformées de h~ xlt~r HE1, et non méthylé dans les cellules ~ar~ llées de h~m~er HE2; le gène E2A est silencieux dans HE1 et transcrit dans HE2 (W.
Doerfler 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 p209). Un autre exemple est décrit par Kohn et coll. (1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 p2567) qui montrent10 que l'~hsent~e d'expression à partir du vecteur rétroviral LTR lldnsd~ dans des cellules souches hématopoiétiques est associée à la méthylation in vivo. L'inhibition de l'expression d'un gène rapporteur, sous le contrôle d'un promoteur viral, lorsque ce gène est introduit en transfection transitoire par un plasmide méthylé in vitro a egalement été démontrée (Adams et coll. 1992 FEBS Letters 309 p97; Doerfler 1994 FEBS Letters 344 p251; Komura et coll. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p73). Par ailleurs, Razin et coll. (precitee) ont montré que le promoteur du gène codant pour la thymidine kinase de l'herpès simplex de type I et celui du gène codant pour la métallothionéine de souris sont inactifs lors d'expression transitoire dans 1es cellules de souris L et les cellules murines teratocarcinomes F9 si ces promoteurs 20 sont méthylés sur les dinucléotides 5'-CG-3'.

La présenle invention décrit donc pour la première fois un procédé permett~nt la production d'ADN pl~mif~ique méthyle, homogène et compaLible avec une utilisation industrielle, et démontre la possibilité d'utiliser ce type de plasmide pour l'expression de gènes in vitro, ex vivo ou in vivo, not~mmçnt dans des applications 25 de thérapie génique.

Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre dans différents types d'hotes cellulaires. Il s'agit not~mm~nt de toute cellule non-humaine, essentiellement dépourvue d'un système de méthylation des cytosines des dinucleotides 5'-CG-3'.
L'absence de méthylation peut être le résultat de l'absPn~e d'activité enzymatique 30 appropliée, due soit à une expression insuffisante d'un gène correspondant, soit à

l'~hsenr.e dudit gène. Il s'agit préférentiellement de cellules procaryotes ou eucaryotes simples.

Avantageusement, l'hote cellulaire est une bacterie. Parmi les bactéries, on peut citer plus pr~r~ iellement E,ÇQ~, B. subtilis. S~ "onlyces. Pse~ m~n~
5 ~, P. ae~inosa). Rhizobium me]liloti. ~robacterium tumefaciens.
~it~?hylocof~ aureus, Sl,~Lo,.~y~;es pristin~ira1i~ F.nt~roco~ c faecium ou Clostridium. On peut aussi utiliser des entérobactéries telles que Salmonella ~ hi~lluri~ . Klebsiella pneumoniae. Enterolbacter aero~enes. En,vinia carotovora ou Serratia l,la~cescens. Pre~rentiellement, l'hote cellulaire utilisé est un org~ni~me 10 non pathogène et permet de produire des quantités d'ADN plasmidique importantes et homogènes. A titre d'exemple particulierem~. nt préfere, on utilise E. coli.

Le procédé de l'invention permet la production d'ADN de qualitE
thérapeutique.

L'ADN peut être toute molécule d'ADN, simple-brin ou double-brin, linéaire 15 ou circulaire, replicative ou non, intégrative ou non, sous la forme de plasmide, de minicercle surenroulé, relaché ou linéaire. ]Dans la suite du texte, l'ADN sera également référencé ADN plasmidique ou plasmide TG (pour plasmide utilisable en thérapie génique).

Les pl~mi-les TG généralement ultilisés en thérapie génique portent 20 e~sentiellement (i) une origine de réplication, (ii) un ou plusieurs acides nucléiques d'intérêt (gène thérapeutique) avec des séquences nécessaires à leur expl~ssion (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de polyadénylation...), et éventuellement (iii) un gène marqueur.

Le choix de l'origine de replication est principalement déterminé par l'hote 25 cellulaire utilisé pour la production.. Il peut s'agir d'une origine de réplication issue d'un pl~cmi~e du groupe d'incompatibilité P (exemple = pRK290) qui permet la réplication dans les souches d'E. coli l~ol A. P]us généralement, il peut s'agir de toute origine de réplication issue d'un plasmide se répliquant dans les cellules procaryotes ou eucaryote inferieures. Ce plasmide peut être un dérivé de pBR322 (Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95), un dérivé de pUC (Viera et Messing, Gene 19 (1982) 259), ou d'autres pl:lcmi-le,s dérivant du même groupe d'inco",palibilité, c'est-à-dire de ColE1 ou de pMB1 par exemple. Ces pl~smide,s peuvent être choisis par ailleurs dans 5 d'autres groupes d'inco~ aLibilité se répliquant chez FAs~h~richi~ coli. Il peut s'agir de p1~emi~1es dérivés de pl~smides app~lenant aux groupes d'inco~"palibilité A, B, FI, FII, FIII, FIV, H1, H11, Il, I2, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z ou 9 par exemple. D'autres pl~smi~ç.s peuvent encore être utilisés, parmi lesquels des pl~smi~ s ne se répliquant pas chez E. coli mais chez d'autres hôtes tels que ~.10 subtilis. Streptomyces. P. putida. P. aerl~inosa. Rhizobium meliloti. A,~robac~er.u"l tumefaciens. Staphylococcus aureus. St~ lo-l,yces pristinaespira1is. F:nt~rococcus faecium ou Clostridium. A titre préférentiel, on utilise les origines de rép1ication issues de pl~smidç,s se répliquant chez E. coli. Selon une variante particulière, I'origine de replication peut être une origine conditionnelle, c'est-à-dire dont15 I'activité dépend de la présence de facteurs en trans. L'utilisation de ce type d'origine de replication évite la replication de l'ADN pl~smi~ique après a~lrninistration, par exemple chez l'homme (FR95 10825).

Parmi les gènes marqueur on peut citer un gène de r~ ct~nce, notamment à
un antibiotique (ampicilline, kamamycine, généticine, hygromycine, etc), ou tout20 gène conférant à la cellule une fonction qu'elle ne possède plus (par exemple un gène qui a été délété sur le chromosome ou rendu inactif), le gène sur le plasmide rétablissant cette fonction.

Selon un mode de réalisation particulier, I'ADN plasmidique comporte des sequences permettant d'e1imin~r, après la phase de production, toutes les régions 25 essentiellement non-thérapeutiques (Origine de replication, gène marqueur, etc). Une approche particulièrement avantageuse pour générer ce type de molécule (minicercles) a été décrite dans la ~lern~nde PCT/FR96/00274.

L'ADN p1~cmi~1ique selon l'invention est préférentiellernens une molécule d'ADN double-brin comportant un ou plusieurs acides nucléiques d'intérêt avec des CA 022~8792 1998-12- l~

séquences nécÇSQqireS à leur e~cl),es~ion. Selon un mode préféré, il s'agit d'une molécule circulaire, replicative ou integrative. Avantageucçm~nt, l'ADN
pl~cmi(lique contient essentiell~ment un ou ph~sieurs acides nucléiques d'intérêt avec des séquences necç~;s~ s à leur e~p~e~ion (minipl~cmid~).

L'acide nucléique d'intérêt peut être tout acide nucléique (ADNc, ADNg, ADN synthétique ou semi-synthétique, etc) dont la transcription et év~nsuçllement la traduction dans une cellule génèrent des prl~duits ayant un intérêt thelapeulique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire.

Parmi les acides nucléiques ayant des proprietes thérapeutiques, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines: interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteur,s ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques: BDNF, C]\~TF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines: ApoAI, ApoAlV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dy~LIophil-e ou une minidy~llophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation: Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides: Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), un ARN ligand (WO91/19813) etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antiQ~nQ-, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complément~ires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.

L'acide nucléique d'intérêt peut aussi être un gène v~c-in~nS, c'est-à-dire un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus CA 022~8792 1998-12- l~

HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).

Généralement, dans les pl~cmi~les, l'acide nucléique d'intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire contient égAIçment une région promotrice de la 5 transcription fonctionnelle dans la cellule ou l'org~ni~me cible (i.e. les ~..AQ....;reres, en particulier l'homme), ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule ou 10 l'organisme concernés. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Not~mment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucar,votes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée 15 stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non,in~1uctihle ou non, forte ou faible. Il peut s'agir en particulier de promoteursubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes théra~euliques (par 20 exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène p,vruvate kinase, villine, protéine intçstin~le de liaison des acides gras, a-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoique, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues 25 du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes ElA et MLPd'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV ou du MMTV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou pe--n~ t une expression tissu-spécifique ou majoritaire.

CA 022~8792 1998-12- l~

- WO 98/01540 - PCTtFR97/01116 Par ailleurs, le gène d'intérêt peut également co".po~ler une séq.lence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit syntheti~é, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence 5 signal artificielle.

Selon l'acide ml~lei~le d'intérêt, les ADN pl~smi~iques methyles de l'invention peuvent être utilisés pour le tr~itemçnt ou la preven~ion de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, etc), les cancers, les 10 pathologies liées aux désordres de la coagu]ation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), ou dans les domaines agronomique et vétérinaire, etc. Ils sont particulierement avantageux pour le traitement des pathologies dans lesquelles une expression durable sans reaction immunologique est souhaitee, notamment dans le domaine des maladies génétiques, 15 neurodégénératives et cardiovasculaires.

Comme indique ci-avant, le procede selon l'invention utilise une cellule hote conten~nt une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'.

Après synthèse de l'ADN, certaines purines et pyrimi~lines sont modifiées 20 chimiquement, par exemple par methylation. Ainsi, la 5-méthylcytosine ou la N6-méthyl~(lenine entrent dans la composition de certains ADN. Ces modifications ont lieu à l'aide d'ADN méthyltransférases, de maintien ou ~ ~Q~, qui transfèrent ungroupe méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine à des résidus a~l~nin~ ou cytosine qui peuvent être situés à des positions spécifiques dans les séquences. Par exemple, chez 25 E. coli deux ADN méthyltransférases sont bien connues, l'ADN méthyltransférase dam, qui méthyle les résidus ~lenosine au seiin des séquences 5'-GATC-3', et l'ADN
m~l}lylllansférase dcm, qui méthyle le second résidu cytidine des séquences 5'-CCA/TGG-3'. D'autres ADN méthylases Ollt été étudiées chez les bactér1es, qui méthylent un résidu contenu dans un site de reconnaissance d'une enzyme de CA 022~8792 l998- l2- l~

- WO 98/OlS40 - PCT/FRg7/01116 restriction. Par exemple, l'enzyme M. ~II méthyle le second résidu cytosine dansla séquence 5'-CCGG-3'.

La plupart des eucaryotes simples et des invertébrés contiennent relativement peu de 5-méthylcytosine et de N6-méthyl~enine. Cependant la méthylation de bases5 chez les vertébrés est plus importante et dans ce cas la 5-méthylcytosine est la plus fréquente des bases méthylées. En effet plus de 95 pour cent des gl~u~es méthyle de l'ADN des v~llébr~s se trouve sur les résidus C des rares ~linlleléotides 5'-CG-3' (la fréquence de 0,8 % de 5'-CG-3' sur les séquences m~mmifères est très faible bienque le pourcentage en GC soit en moyenne de 40% et qu'un arr~ng~m~nt non biaisé
conduirait à une fréquence de 4% de 5'-CG-3'). Et, plus de 50 pour cent de l'ensemble des dinucléotides peuvent être méthylés. Différentes évidences suggèrent que le degré de méthylation de certaines séquences conLenanl le dinucléotide 5'-CG-3' puisse être un facteur déterminant chez les mammifères dans la régulation de l'expression de gènes particuliers, l'inactivation du chromosome X, l'oncogénèse15 (1993 in DNA methylation: Molecular Biology and Biological Significance, Eds Jost et Saluz), et encore des maladies héréditaires (Bates et coll. 1994 BioEssays 16p277).

La presente invention utilise une cassette d'expression d'une ADN
méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine sur les dinucléotides 20 5'-CG-3'. De ce fait, au sens de la presente invention, ADN methyle signifie plus particulierement ADN methyle sur les residus cytosine des dinucleotides 5'-CG-3'.
Avantageusement, l'ADN melhylll~nsférase utilisee methyle preferentiellement lesresidus cytosine des dinucleotides 5'-CG-3', c'est-a-dire n'affecte q~ iment pas les residus ad~nine, ni les residus cytosine qui sont presents dans un contexte dirrer~nl 25 des dinucleotides 5'-CG-3'. Avantageusement, on entend par ADN plasmidique methyle un ADN plasmidique dont au moins 50 % des residus cytosine des dinucleotides 5'-CG-3' sont methyles. Plus préfé~entiellement, au moins 80 ~c, avantageusement 90 ~o desdits résidus sont méthyles.

La méthylation de l'ADN pl~emi~ique peut être vérifiée de dirrél~.,les manières. En particulier, elle peut être contrôlée en digérant les pr~p&ations p1~mi~ ues par des enzymes de restriction dont la coupure n'est pas possible si le résidu cytosine du dinucléotide 5'-CG-3', contenu dans le site de coup~, est 5 méthylé. On peut citer par eYemrle les e~y,;-les de restrictions ~II, ~a~II, ~BI.
La methylation peut e~ n ent etre detenninee par cl~o,llatographie. Ainsi, la quantité de plasmide non méthylé p~esenLe dans la plepalalion de pl~emide méthylé a ete quantifiee de la façon suivante: au plasmide non méthylé non digéré sont ajoutés 1 % ou 5 % de plasmide non méthylé et totalement digéré par HpaII. Ces 10 échantillons, ainsi que le plasmide méthyle digéré par ~II, sont analysés parchromatographie liquide échangeuse d'anions et détection à 260 nm, ce qui permetde séparer et quantifier l'ADN non digéré de l'ADN digéré. On constate que le pl~emi~le méthylé contient moins de 5 '~o d'ADN plasmidique non méthylé, autrement dit que plus de 95% de l'ADN plasmidique est methyle.

Avantageusement, le procédé de l'invention est caracterise en ce que l'ADN
m~lhyl~ sférase methyle preferentiellement les résidus cytosine des dinucléotide5'-CG-3' .

Avantageueem~nt, dans le procédé selon l'invention, plus de 50% des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN pl~smi(lique sont methyles. Encore plus preferentiellement, plus de 80 ~o, particulierement plus de 90 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont methyles.

Plusieurs ADN m~hylll~sférases rn~mmifères permettant de méthyler les résidus cytosine sur les séquences conten;mt tout dinucléotide 5'-CG-3' ont été
caractérisées et les gènes correspondant ont ~té clonés, par exemple celle de la souris (Bestor et coll. 1988 J. Mol. Biol. 203 p9711 ou celle de l'homme (Yen et coll. 1992 Nucl. Acids Res. 20 p2287). Ces enzymes ont un poids moléculaire compris entre 135 et 175 kD. Elles méthylent l'ADN hémiméthylé beaucoup plus rapidement que le non méthylé, suggérant que ce sont des méthylases de maintien (Smith 1994 Progress in Nucleic Acid Research and :Molecular Biology 49 p65). L'enzyme -WO 98tO1540 - PCT/FR97/01116 homologue chez E. ÇQ~i n'existe pas. Par contre la mhhylase M. ~I de Spiropl?cm~méthyle exclusivement et complétem~nt les résidus cytosine de tout dinucléotide 5'-CG-3' avec une vitesse comparable, quelque soit le substrat helll;n~clhylé ou non méthylé (Razin et coll. 1992 FEBS letters 313 p243; Baker et coll. 1993 Biochim.S Biophys. Acta 196 p864). Cette enzyrne a été isolée à partir de la souche Spiropl~m~ sp. MQ1. Son poids moléculaire est de 42 KD et le gène a été cloné etsul~e~ é chez E. coli (Razin et coll. 1990 Nucl. Acids Res. 18 pll45 et EP0412676A1 denvent 91045812).

~l~fer~ntiellement, l'ADN m~lhylL,~nsférase est choisie parmi la methylase 10 M.SssI, la methylase de souris et la methylase humaine. Avantageusement, on utilise la methylase M.SssI.

La cassette d'expression de l'ADN m~lhyll,~nsférase comprend generalement un acide nucleique codant pour une ADN m~lhyll~dnsférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' sous le controle d'un promoteur. Le 15 promoteur utilise a cet effet peut etre tout promoteur fonctionnel dans la cellule hote choisie. A cet egard, il peut s'agir d'un promoteur tel que defini ci-avant. S'~ nt d'hotes cellulaires procaryotes, on peut citer plus particulierement les promoteur de l'operon lactose (Plac), de l'operon tryptophane (Ptrp), les promoteurs hybridesPlac/Ptryp, le promoteur PL ou PR du bactériophage lambda, le promoteur du gène tetA (~ Vectors 1988 p179 Rodriguez et Denhardt editeurs), etc.

Dans un mode de realisation prefere, on utilise un promoteur different de celui responsable de l'expression de lacide nucleique d'interet dans l'ADN
plasmidique. Il est tout particulierement avantageux d'utiliser un promoteur ind~ tihle, permettant de controler l'expression de la methylase. Le promoteur 25 inductible peut etre par exemple le promoteur du bacteriophage T7 ou le promoteur Plac.

Avantagel~cçment. la cassette d'expression contient egalement des signaux de fin de transcription (terrnin~tellrs transcriptionnels), tels que des terminateurs ribosomaux.

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La cassette d'expression de l'ADN méthylllallsrél~se peut etre portee par un vecteur replicatif, ou etre integree dans le genome de la cellule hote.

S'~gi~nt d'un vecteur replicatif, on utilise avantageu~m.ont un vecteur co...p~ihle avec le pl~mi~ TG, c'est a dire capable de co-resider dans la meme 5 cellule. Deux pl~midç~ dirrer~ peuvent se répliquer dans la même cellule si lecontrole de la réplication de chaque plasmide est différent. Ainsi des pl~mi-1çscomr~tihles appartiennent à deux groupes d'incompatibilité. Or il existe environ 30 groupes d'incompatibilité de plasmides se répiliquant chez les entérobactéries (Maas et coll. 1988 Microbiol. Rev. 52 p375). De ce fait, il existe de nombreuses 10 possibilités pour répliquer deux pl~cmi~ç~ dans la même cellule et plusieurs exemples sont décrits dans la littérature. On p~eut citer par exemple la coréplication des pl~midçs dérivés de ColE1 avec les pl:lsmie~s ayant plour réplicon R6K ou pl5A ou RSF1010 ou RK2; on peut encore citer la coréplication des pl~cmif~çs dérivés de RK2 avec des plasmides dérivés de R6K ou RSF1010 ou pSa ou ColE1(jn Vectors 1988 p287 Rodriguez et Denhardt editeurs). Cette liste n'est pas li,~ alive et d'autres exemples sont encore décrits dans Vectors 1988 p287 Rodriguez et Denhardt editeurs. Avantageusement, le vecteur replicatif utilise presente un nombre de copies dirfé~nt dans la cellule hote que le plasmide TG. Ainsi, le vecteur portant le gène codant pour la méthylase, dont l'expression peut être in(l~lctihle, est à faible 20 nombre de copies (dérivé par exemple de pACYC184 ou RK2), alors que le pl~mi-le TG est à haut nombre de copies (dérivé de ColE1). On peut aussi cloner dans le plasmide TG une séquence permettant de former avec un oligonucléotide approprié une séquence triple hélice de telle sorte que le plasmide TG peut êtreséparé de l'autre pl~.cmi~e par une purification d'affinité.

La cassette d'expression de l'ADN nnéthyltransférase peut egalement être intégrée dans le génome de la cellule hôte L'integration peut etre realisee par recombinaison homologue, dans la mesure ou la cassette d'expression est encadréepar des fragment~ adjacents d'un gène, non es,sentiel, du génome de l'hôte et clonée sur un plasmide ne pouvant se répliquer dans ].'hôte considéré. Ce pl~mi(lç peut être i) un dérivé de ColE1 dans une souche de Ei. coli polAtS (Gutterson et coll. 1983 .

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- WO g8/OlS40 . - PCT/FR97/01116 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 p4894); ii) un dérivé thermosen.cihle de pSC101 dans une souche quelconque de E. coli (S. Kushner et coll. 1989 J. Bacteriol. 171 p4617);
iii) un vecteur suicide tel que M13mplO dans les souches de E. coli ~2+ (Blum etcoll. 1989 J. Bacteriol. 171 p538) ou encore iv) un plasmide ne col~lpo~ que l'origine g de R6K dans toute souche de E. coli dépourvue du gène ~r (Filutowicz et coll. 1994 Prog. in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol. 48 p239).

La cassette d'~ s~ion peut etre introduite dans la cellule hote avant, apres ou en meme temps que l'ADN plasmidique. S'~gi.~ nt d'une casseKe integrative, elle est generalement introduite avant, et les cellules c-~nt~ n~ ladite casseKe sont selectionnees et utilisees pour la production de l'ADN plasmidique.

Un aspect particulier de l'invention est d'exprimer le gene codant pour la methylase M. SssI dans des cellules bacteriennes (notamment E. coli) contenant un pl~mi~e TG. Comme indique dans les exemples, ledit plasmide est alors methyle sur les cytosines des dinucleotides 5'-CG-3'. Plus spécifiquement, le plasmide TG
est transformé dans une souche de _. ÇQli mcrA mcrB D(m~ ) c--nt~n~nt déjà
un pl~mi~ie portant le gène codant pour la méthylase M. SssI et compatible avec le plasmide TG. Au cours de la croissance de la bactérie les deux plasmides corésidant se répliquent et sont méthylés (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol. 173 p5793).
L'ADN pl~mi-lique ou la casseKe d'expression peuvent etre introduits dans la cellule hote par toute technique connue de l'homme du metier (transformation,transfection, conjugaison, electroporation, pulsing, precipitation, etc). La transformation peut notamment être effectuée par la technique de transformation au CaCl2 (Dagert et Ehrlich, Gene 6 (1979) 23), ou celle mise au point par H~n~h~n et al. (J.Mol.Biol. 166 (1983) 557) ou toute technique dérivée de celle-ci (Maniatis et al., 1989), ainsi que par éle(;llo~ sformation (Wirth et al., Mol.Gen.Genet. 216(1989) 175) ou par TSB (Transformation and Storage Buffer; Chung et coll. 1988 Nucleic Acids Res. 16 p3580). Voir également les techniques générales de Biologie Moléculaire ci-après.

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-WO 98/OlS40 - PCT/F1~97/01116 L'ADN pl~mi~ ue methyle selon l'invention peut ensuite etre purifie par toute technique connue de l'homme du metier (precipitations, chromatographies, centrifugations, dialyse, etc). Dans le cas particulier de l'utilisation d'un vecteur d'expression de la m~L}lyl~ sferase replicatif, le plasmide TG doit en outre etre 5 separe dudit vecteur. Differentes techniques peuvent etre ut~ eeçs, basees sur les differences de taille ou de masse des deux placmifles, OU sur la digestion du vecteur au niveau de sites de restriction presents uniquement dans le vecteur et pas dans le pl~emide TG. Une methode de purification particulierement avantageuse repose surla l'affinite entre une sequence specifique presente sur le plasmide TG et un 10 oligonucleotide immobilise. Cette purification triple-helice a ete decrite en detail dans les ~ern~n~l~s FR96 03519 et F1~94 15162, qui sont incorporees a la presente par reference.

Un résultat particulierement avantageux de l'invention est que l'ADN
pl~.emi~iique méthylé dans les conditions de l'invention conduit à l'expression du 15 gène sous le contrôle du promoteur aussi bo]me que celle obtenue avec le mêmeADN pl~emi~lique non méthylé. Cet ADN plasmidique méthylé ne devrait pas entrainer la stimulation immunitaire associée aux ADN bactériens et possède doncun avantage certain pour être utilisé en thérapie génique non virale.

Les ADN plasmidiques méthylés selon l'invention peuvent être utilisés dans 20 toute application de vaccination ou de thérapie génique et cellulaire, pour le transfert d'un gène à un org~ni~me, un tissu ou une cellule donnée. En particulier, elles peuvent être ut~ éçs pour une a~ministr<ltion directe in vivo, ou pour la modification de cellules in vitro ou ex vivo, en vue de leur implantation à un patient.
A cet égard, les molécules selon l'invention peuvent être utilisées telles quelles (sous 25 forme d'ADN nu), ou en association avec difrél~nls vecteurs chimiques et/ou biochimiques, synthétiques ou naturels. Il peut s'agir notamment de cations (phosphate de calcium, DEAE-dextran,...) qui agissent en formant des précipités avec l'ADN, lesquels peuvent être "phagocyt~s" par les cellules. Il peut également s'agir de liposomes dans lesquels la molécule cl'ADN est incorporée et qui fusionnent 30 avec la membrane plasmique. Les vecteurs s~mthétiques de transfert de gènes sont .

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généralement des lipides ou polymères cationiques qui complexent l'ADN et forment avec lui une particule portant des charges positives en surface. Ces particules sont capables d'interagir avec les charges négatives de la membrane cellulaire, puis de franchir celle-ci. On peut citer comme exemrles de tels vecteurs le DOGS
5 (TransfectamTM) ou le DOTMA (LipofectinTM). Des p~v~éil-es chimères ont aussi été développées: elles sont c~n.~ ees d'une partie polycationique qui con-l~n~e l'ADN, liée à un ligand qui ~ fixe sur un récepteur membranaire et entraîne le complexe dans les cellules par endocytose. Les molécules d'ADN selon l'inventionpeuvent également être utili~é~s pour le transfert de gènes dans des cellules par des 10 techniques physiques de transfection telles que le bombardement, l'électroporation, etc. En outre, préalablement à leur utilisation thérapeutique, les molécules de l'invention peuvent éventuellement être linéarisées par exemple par coupure enzymatique.

A cet égard, un autre objet de la présente invention concerne toute 15 composition pharmaceutique comprenant un ADN pl~cmiclique méthylé tel que défini ci-avant. Cet ADN peut être nu ou associé à un vecteur chimique et/ou biochimique de transfection. ~es compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées en vue d'admini~trations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, 2û transdermique, etc. De préférence, la molécule d'ADI~ est utilisée sous une forme injectable ou en application. Elle peut être mélangée à tout véhicule pharm~ceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophili~ee~, 25 qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Il peut s'agir not~mment de tampons Tris ou PBS dilués dans du glucose ou du chlorure de sodium. Une injection directe de l'acide nucléique dans la région aneinte du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses d'acide 30 nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de dirrelell~ paramètres, et CA 02258792 l998- l2- l5 not~mmçnt en fonction du gène, du vecteur, ldu mode d'a~mini.~ration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.

La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limit~tifs LEGENDE DES FIGURES

Fi~ure 1. Carte du pl~mitle pXL2784 ~ 2~ 2. Carte de restriction du plasmide pXL2784 Fi~ure 3. Profil de digestion des plasmides ~-pXL2784, 2-pXL2784 méthylé, 3-pXL2784+pAlT2 méthylés et 4-pAIT2 méthylé, digérés par les enzymes A-~a~II, 10 B-~BI, C-HindIII, D-HpaII, E-EcoRI (M est le marqueur de poids moléculaire lKB ladder).

TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE ET DE BIOLOGIE
MOLECULAIRE

Les méthodes classiques de biologie rnoléculaire telles que la centrifugation 15 d'ADN pl~mi-~ique en gradient de chlorure de césium-bromure d'éthidium, les digestions par des enzymes de restriction, l'l~lectrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E. coli, la ~ cipilalion des acides nucléiques etc, sont décrites dans la li~lél~e (Maniatis al., 1989, Ausubel et ~1., 1987). Les séquences nucléotidiques ont été ~Pl~..--inées 20 par la méthode de terminaison de chaînes en suivant le protocole déjà présenté
(Ausubel et al., 1987).

Les enzymes de restriction ont été fournies par New-F.ngl~n-l Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham Ltd (Amersham).

Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des 25 gels d'agarose à 0,7 % ou d'acrylamide à 8 ~o, purifiés par électrophorèse puis électroélution, extraits au phénol, précipités àl l'éthanol puis incubés dans un tampon CA 02258792 l998- l2- l5 Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgCI2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs). Les oligonucléotides sont synth~ticés en ut~ nt la chimie des phosphor~mirlit~s protégés en b par un g~upement cyanoéthyl (Sinha et ~1-, 1984, Giles 1985) avec le synthéti~ r automatique d'ADN
5 Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthe~i7er en utili.s~nt les reco.~,...~n-l~tiQns du fabricant.

Les milieux de culture LB et 2XTY sont utilisés pour la partie bactériologique (Maniatis et al., 1989).

Les ADN plasmidiques sont purifiés egalement suivant la technique de Iyse 10 alcaline (Maniatis et al., 1989).

EXEMPLES

Exemple 1. Description du plasmide TG

De nombreuses c:3~settes d'expression eucaryote portées par des pl~mi-l~s réplicatifs chez la bactérie E. coli sont connues de l'homme de l'art. Ces c~ettcs 15 peuvent exprimer des gènes raporteurs comme le gène codant pour la b-gal~cto.sidase de E.coli, ou la chlor~mph~nicol ac~lyllldnsférase du transposon Tn9, ou la luciférase, ou des gènes d'intérêt en thérapie génique. Ces ca~settes comportent un promoteur qui peut être viral ou eucary-ote. ces systèmes d'e~ ion peuvent être tissu spécifique et/ou in(iuctihle ou bien avoir une ubiquité d'e~p,~ion. La cassette 20 utilisee dans cet exemple comprend le gène 1~ codant pour la luciférase de Photinus pvralis et le promoteur pCMV, promoteur/enhanceur intermédiaire du cytomégalovirus humain. Le gène luc possède 4,78% de dinucléotides 5'-CG-3', et le promoteur viral pCMV 5 %. Ces pourcentages sont donc élevés par rapport à la fréquence faible de 0,8 % de 5'-CG-3' sur les séquences m~mmifères. En présence 25 d'une méthylase (telle que le methylase M. SssI ou les CpG méthylases endogènes aux m:lmmifères), le promoteur pCMV et le gène luc peuvent être donc hautement méthylés.

- WO98/01540 . - PCT/FR97/01116 Cette cassette d'expression a ete clonée dans le plasmide réplicatif chez _.
~Qli pXL2784 dont la carte est présentée sur la figure 1. Le plasmide a une taille de 6390 bp et comporte 5,8 ~o de dinucléotides 5'-CG-3'. Le plasmide pXL2784 a été
construit à partir du vecteur pXL2675 (2,513 kb), réplicon minim~l de ColE1 issu de pBluescript (ORI) et ayant pour marqueur dle sélection le gène du transposon Tn5codant pour la re~i~t~nce à la kana"-ycille. L~e pl~mi(ie pXL2784 contient aussi une séquence TH (GAA)17 pouvant se lier à un oligomère (CTT)n où n=1 à 17, pour générer localement une structure triple hélice et permettre une purification par~ffinité Le pl~mi-le pXL2784 possède le locus cer (382 bp) issu de ColE1; le locus cer contient une séquence site spécifique des recombinases XerC/XerD et conduit à
la résolution de dimères de pl~smi~e~ (Summers et coll. 1988 EMBO J. 7 p851). Letransgène cloné sur ce pl~cmil~e pXL2784 est une cassette d'expression (3,3 kb) du gène luc codant pour la luciférase de Photimls pvralis lprovenant de pGL2 basic de Promega) sous contrôle du enhanceur/promoteur pCMV cytomégalovirus humain (provenant de pcDNA3 d'Invitrogen).

Exemple 2 : Construction d'une c~et~e d'exp. e~;~ d'une ADN
methyltransferase Cet exemple decrit la structure d'une cassette d'expression de la méthylase M. ~I de Spiroplasma sp. MQ1. Il est entendu que le meme principe peut etre applique a la construction de cassette d'expression de toute autre enzyme selon l'invention.

La cassette d'expression utilisee comprend le gène codant la méthylase M.
~I de Spiropl~m~ sp. MQ1 qui e$ exprimé sous le contrôle du promoteur plac.
Ainsi, en présence IPI G (isopropylthio-b-D-galactoside) la méthylase est syntheti~ée et active (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol. 173 p5793).

Cette cassette est presente dans le plasmide pAlT2, qui a pour réplicon le pACYC184 et porte en outre le gène du transposon Tn~Q~ codant pour la r~si~t~n~eà la lividomycine, permettant la selection des cellules hotes transformees.

.

Exemple 3. 1'~ ;on d'ADN plasmidique pXL2784 méthylé aux residus ~l~:..e des dinucleotides 5'-CG-3'.

Le pl~mi-le pXL2784 est méthylé sur les cytosines de tous les dinucléotides 5'-CG-3' avec la méthylase M. ~I de ~irop]~m~ sp. MQ1. Le mode de 5 méthylation selon l'invention utilise cette enzyme et le pl~mic~e est méthylé au cours de la production chez la bactérie.

Pour cela, la souche de E. coli ER 1821 dont le génotype est F' l~ endA1 ~i-1 supE44 mcrA5 D(m~-hsdRMS-mcrB)l-::IS10, et portant le plasmide pAIT2, est transformée par la methode TSB (Transformation and Storage Buffer; Chung et coll.
1988 Nucleic Acids Res. 16 p3580) par le plasmide pXL2784. Les transformants sont sélectionnés sur milieu LB contenant de la kanamycine 50 mg/l et de la lividomycine 100mg/1 afin de sélectionner le pXL2784 qui porte le gène du transposon Tn5 codant pour la rçsi~t~nce à la kanamycine et le pAIT2 porte le gène du transposon Tn25~ codant pour la résistance à la lividomycine. Lorsqu'un transformant ER1821, pAIT2, pXL2784 est cultivé en milieu LB kanamycine 50mg/1 + lividomycine 100 mg/l + IPTG 2,5 mM à 37 ~C pendant 15 heures, l'ADN
plasmidique extrait est méthylé.

La méthylation est vérifiée en digérant les pl~paralions pl~smi~iques par les enzymes de restrictions HpaII, ~II, ~BI. L'intégrité et la présence des deux 20 pl~mides sont vérifiées en digérant ces p~paralions par les enzymes de restrictions ~dIII et EcoRI, voir figure 2. Les enzymes de restrictions HpaII, ~II, ~BI sont trois enzymes dont la coupure n'est pas possible si le résidu cytosine du dinucléotide 5'-CG-3', contenu dans le site de coupure, est méthylé. Sur le promoteur pCMV sont localisés quatre sites de recnnn~ nce de ~II; sur le gène ~ sont cartographiés 25 deux sites de rect)nn~i.cs~nce de BstBI et onze sites de rec-)nn~ nçe de ~II; ce dernier enzyme coupant le plasmide pXL2784 en 30 fragments. Sur la photographie du gel d'agarose coloré au bro,--ure d'éthydium (figure 2), on constate qu'avec la préparation plasmidique pAIT2+pXL2784 méthylée ou avec la plepaialion plasmidique pXL27~4 méthylée et purifiée par chromatographie d'affinité (voir exemple 4) aucune digestion n'a lieu avec les enzymes ~II, ~II, ~BI alors que les digestions par les e~.~r-nes ~i~dIII et ~QRI condl-i~nt bien au profil attendu d'après la carte de restriction. Les digestions contrôles par les enzymes ~II, ~II, ~BI du plasmide pXL2784 présentent le profil escompté d'après la carte de 5 restriction.

Ces resultats demontrent que l'ADN pl~emi iique extrait est méthylé, sur les résidus cytosine du dinucléotide S'-CG-3'. Ces resultats montrent en outre que la methylation concerne plus de 90% de ces cytosines.

Exemple 4. Utilisation de plasmides methyles pour le transfert de 10 matériel génétique Cet exemple demontre que l'ADN plasmidique methyle selon l'invention conserve sa capacite de transfecter des cellules, de s'y repliquer, et d'y exprimer un gene d'interet.

A protocole de ptepa,ation des solutions utilisées pour la transfection Deux lots de pl~mi~le~e sont utilisés pour des étude comparatives:

a) le pXL2784, b) le pXL2784 méthylé.

Le pi:lemicle pXL2784 méthylé est obtenu sous forme d'un mélange avec le p!~emi~ie pAIT2 qui en a assuré la méthylation après co-transformation bactérienne.
20 Un fractionnement par chromatographie d'affinité a ete realise pour purifier le pl~emide d'intérêt et la technique utilisée est décrite dans la ~lçm~n~le N~ Fl~94t15162. Une étape de dialyse contre du NaCl 0,lSM peut être réalisée pour éliminer le tampon qui constitue la phase d'élution de la colonne.

Lorsque le plasmide pXL2784 est uti]isé en référence il est purifié selon le 25 même protocole que celui décrit ci-dessus.

Dans cet exemple la vectorisation de l'ADN est assurée par un lipide cationique, RPR120535A, app~Ienant à une série décrite dans la ~iem~n~e de brevet N~ FR 95 13490. Il est çnten~ que tout autre vecteur de transfert chimique ou biochimique peut etre utilise.

Les solutions de transfection sont préparées à partir d'un mél~n~e volume à
volume d'ADN à 30 ~g/ml et de solution aqueuse de lipide cationique RPR 120535 à90 ~1; le ratio lipide cationique/ADN est donc de 3 nanomoles lipide cationique/,ug ADN. Après homogénéisation au vortex et in~ ation d'au moins 15 minlltes à
te.lIpél~Iure ambiante les solutions ADN/lipofectant sont distribuées à 4,8~'Yo (V/V) final dans les puits où les cellules ont été lavées par du milieu dépourvu de protéines (sérum) et remises en croissance pendant le temps de la transfection en milieu dépourvu de sérum.

B protocole de transfection Des éçh~ntillons de 1.105 cellules [NIH3T3 (fibroblastes de souris) et Hela (carcinome utérin hum~in)] en phase exponentielle de croissance sur 2 cm2 (500~1de milieu sans sérum/puits) sont traités par 25 ~I de solution de transfection ce qui correspond à l'apport de 0,375 llg d'ADN/l.lOs cellules. Après une inçub~tion de2theures à 37~C sous 5 % de C02 en atmosphère humide le milieu de croissance estsupplémenté par du sérum de veau foetal à 8 ~o final (V/V).

A 40 heures post-transfection les cellules sont lavées par du PBS et Iysées par un tampon cont~n~nt du Triton X-100 à 1 ~o et du DTT 2mM. L'activité luciférase exprimée est dosée par l'émission de lumière [RLU = relative light unit] en présence de luciférine, coenzyme A et ATP pendant 10 secondes et rapportée au mg de protéines extraites par le tampon de Iyse.

C résultats Les résultats obtenus selon les conditions décrites ci-dessus figurent dans le tableau suivant.

Cellule Cellules NIH 3T3 Cellules Hela Plasmide pXL2784 pXL2784CH3 pXL2784 pXL2784CH3 purifié par 2,0.10lo+l- 2,2.101~+/ 3,1.108 +/- 1,7. 108 +/
chromatographie 4~o 10~c 15% 11~o d'affinité
et dialysé 2,3.101~+/- 3,1.101~+/ 3,8.108 +/- 2,4. 108 +J
21% 10% 14% 7%
Activité enzymatique en RLU/10 secondes/mg protéine (coefficient de variation ~o [3 expériences de transfection par résultat]

Compte tenu des coefficients de variation obtenus pour ce type d'expériences nous pouvons conclure qu'il n'existe pas de différences significatives quant à
5 l'expression des deux pl~mides utilisés dans les mêmes conditions de transfection.
De plus l'activité luciférase obtenue est du même ordre de grandeur pour les deux étapes de purification considérées.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Procédé de production d'ADN utilisable en thérapie génique caractérisé en ce que ledit ADN est produit dans une cellule contenant une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'.

2. Procédé selon la revendication 1 caracterise en ce que la cellule est une cellule procaryote.

3. Procédé selon la revendication 2 caracterise en ce que la cellule est une bacterie.

4. Procédé selon les revendications 1 a 3 caractérisé en ce que la cassette d'expression est portée par un vecteur replicatif.

5. Procédé selon les revendications 1 a 3 caractérisé en ce que la cassette d'expression est intégrée dans le génome de la cellule.

6. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la cassette d'expression comprend un acide nucléique codant pour une ADN
méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' sous le contrôle d'un promoteur.

7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible.

8. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'ADN
méthyltransférase méthyle preferentiellement les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'.

9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'ADN
méthyltransférase est choisie parmi la méthylase M.SssI, la mEthylase de souris et la méthylase humaine.

10. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que plus de 50 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthyles.

11. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que plus de 80 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont m~thyles.

12. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que plus de 90 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont m~thyles.

13. Utilisation d'un ADN plasmidique pour la pr~paration d'une composition pharmaceutique destinée au traitement th~rapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal, caractérisée en ce que plus de 50 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthyles.

14. Utilisation d'un ADN plasmidique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thérapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal, caractérisée en ce que plus de 80 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthyles.

15. Utilisation d'un ADN plasmidique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thérapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal, caractérisée en ce que plus de 90 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthyles.

16. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thérapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes:
- la production d'ADN par culture d'une cellule comprenant ledit ADN et une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler lesrésidus cytosine des dinucléotides 5'-CG-3', - la récupération dudit ADN, et, - le conditionnement dudit ADN avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'ADN est un ADN plasmidique comprenant un acide nucléique d'intérêt thérapeutique.

18. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'ADN est un minicercle comprenant un acide nucléique d'intérêt thérapeutique.

19. Composition comprenant un ADN bactérien dont au moins 50 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' sont méthyles.