EP0914418A1 - Procede de production d'adn therapeutique - Google Patents

Procede de production d'adn therapeutique

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Publication number
EP0914418A1
EP0914418A1 EP97930569A EP97930569A EP0914418A1 EP 0914418 A1 EP0914418 A1 EP 0914418A1 EP 97930569 A EP97930569 A EP 97930569A EP 97930569 A EP97930569 A EP 97930569A EP 0914418 A1 EP0914418 A1 EP 0914418A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
plasmid
methylated
dinucleotide
cytosine residues
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP97930569A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jo[L Crouzet
Béatrice Cameron
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
Publication of EP0914418A1 publication Critical patent/EP0914418A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to the preparation of DNA, in particular plasmid DNA. It relates more particularly to the production of bacterial plasmid DNA which can be used in gene therapy, in the form of plasmid, of supercoiled, relaxed or linear minicircle, and whose immunogenic properties are reduced or even eliminated.
  • the invention also relates to microorganisms which can be used for the production of DNA, as well as pharmaceutical compositions.
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly by introducing genetic information into the affected cell or organ. This information can be introduced either in vitro into a cell extracted from the organ and then reinjected into the body, or in vivo, directly into the targeted tissue. Being a molecule of high molecular weight and negative charge, DNA has difficulties in spontaneously crossing phospholipid cell membranes. Different vectors are therefore used to allow gene transfer: viral vectors on the one hand, chemical and / or biochemical vectors, natural or synthetic, on the other hand.
  • Viral vectors are very effective, in particular for the passage of membranes, but present a certain number of risks such as pathogenicity, recombination, replication, immunogenicity, ... Chemical and / or biochemical vectors make it possible to avoid these risks (for reviews, see Behr, 1993, Cotten and Wagner, 1993). These are for example cations (calcium phosphate, DEAE-dextran, ...) which act by forming precipitates with DNA, which can be "phagocytosed” by cells. They can also be liposomes in which the DNA is incorporated and which fuse with the plasma membrane.
  • Synthetic gene transfer vectors are generally lipids or cationic polymers which complex DNA and form with it a particle carrying positive charges on the surface. These particles are capable of interacting with the negative charges of the cell membrane, then of crossing it. Examples of such vectors that may be mentioned are dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS, TransfectamTM) 0 or N- chloride [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium (DOTMA, LipofectinTM). Chimeric proteins have also been developed: they consist of a polycationic part which condenses DNA, linked to a ligand which binds to a membrane receptor and drives the complex into cells by endocytosis. It is thus theoretically possible to "target" a tissue or certain cell populations, in order to improve the bioavailability in vivo of the transferred gene.
  • the plasmids currently used in gene therapy generally carry (i) an origin of replication, (ii) a marker gene such as an antibiotic resistance gene (kanamycin, ampicillin, etc.) and (iii) one or more transgenes with sequences necessary for their expression (enhancer (s), promoter (s), polyadenylation sequences ).
  • This type of plasmid is for example currently used in gene therapy at the level of clinical trials such as the treatment of melanomas, Nabel et al. 1992, or at the level of experimental studies.
  • DNA carrying genes for resistance to antibiotics or to functional replication origins can also have certain drawbacks, linked in particular to their dissemination in the body.
  • the DNA macromolecule is therefore called immunogenic.
  • a macromolecule can also lead to stimulation of the immune system without being immunogenic (for example a foreign body leading to a cell-mediated immune response).
  • the first evidence suggesting that bacterial DNA leads to an immune response has been described by Pisetsky et al. (1991 J. Immunol. 147 pl759). They have shown that the DNA of three bacterial species can stimulate the proliferation of mouse lymphocytes while the DNA extracted from three animal species does not lead to this stimulation. Then, Yamamoto et al. (1992 Microbiol. Immunol.
  • interferon g acts as a costimulating factor for the differentiation of B cells by modulating the production of IL-6 by B cells (Krieg et al. 1996 J. Immunol. 156 p558).
  • an oligonucleotide having an unmethylated CpG motif and framed in 5 'by 2 purines and in 3' by 2 pyrimidines leads in vivo to a coordinated secretion of the interleukins IL-6 and IL-12, and of interferons g by the cells.
  • NK IFN-g
  • B cells IL-6 and IL-12
  • CD4 + T cells IL-6 and IFN-g
  • the plasmid DNA used to date in gene therapy is essentially produced in prokaryotic cells, and therefore has a methylation profile comparable to that of bacterial genomic DNA. It has also been demonstrated that the plasmid DNA which has been injected into the muscle or into the liver, and then extracted, retains the procaroyte methylation profile (Wolf et al. 1992 Hum. Mol. Genet.1 p363; Malone et al 1995 J. Biol. Chem. 269 ⁇ 29903). As a result, the bacterial plasmid DNA used has a significant potential for stimulating the immune system.
  • the present invention provides a solution to these problems.
  • the Applicant has in fact been interested in the immunogenic properties of bacterial DNA.
  • the Applicants have now developed a process for producing pharmaceutical grade plasmid DNA, potentially devoid of undesirable immunogenic effects.
  • the Applicant has also shown that the methylation of certain DNA residues makes it possible to reduce the immunogenic potential of plasmid DNAs, without affecting their capacity to transfect cells and to express therein a nucleic acid of interest.
  • One aspect of the invention is to prepare DNA, in particular plasmid DNA, of therapeutic quality.
  • the present invention relates to the use in gene therapy of methylated plasmid DNA on the cytosines of the 5'-CG-3 'dinucleotides.
  • a third aspect of the invention relates to pharmaceutical compositions comprising methyl plasmid DNAs.
  • the invention further relates to a method for in vivo methylation of DNA by expression of a methylase.
  • the invention in other aspects relates to expression cassettes, host microorganisms usable for methylation, the preparation of therapeutic compositions, and methods of gene transfer.
  • a first object of the invention therefore relates to a process for the production of DNA usable in gene therapy, characterized in that said DNA is produced in a cell containing a cassette for expression of a DNA methyltransferase making it possible to methylate the cytosine residues of the dinucleotides 5'-CG-3 '.
  • the present invention therefore relates to the production of DNA, in particular plasmid DNA, methylated on the cytosine residues of the 5'-CG-3 'dinucleotides.
  • Plasma DNA methylation in vitro is documented in the literature (Adams et al. 1992 FEBS Letters 309 p97; Doerflerl994 FEBS Letters 344 p251; Komura et al. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p73).
  • this methylation method cannot be envisaged for the industrial production of plasmids which would be used in gene therapy.
  • a process for the production of plasmid DNA must indeed make it possible to reproducibly produce large and homogeneous quantities of plasmids and to purify this DNA by methods acceptable for pharmaceutical use. It is quite clear that DNA methylated in vitro may be more or less released from batch to batch (Doerflerl994 FEBS Letters 344 p251) and that the quantities produced are limited.
  • the present invention now shows that it is possible to methylate a plasmid of interest directly during production, by coexpressing in the host cell the gene coding for a methylase.
  • the present invention also shows that, according to this method, large and homogeneous quantities of methylated plasmid can be produced and the methylated plasmid DNA can be purified according to methods already described.
  • the Applicant has also demonstrated, advantageously, that the plasmid DNA thus methylated retains the capacity to transfect target cells and, if necessary, to replicate therein. In a particularly remarkable manner, the applicant has further demonstrated that the plasmid DNA thus methylated can, in vivo, express nucleic acids of interest.
  • the present invention therefore describes for the first time a process allowing the production of methylated plasmid DNA, homogeneous and compatible with industrial use, and demonstrates the possibility of using this type of plasmid for the expression of genes in vitro, ex vivo or in vivo, in particular in gene therapy applications.
  • the method according to the invention can be implemented in different types of cellular hosts. These include any non-human cell, essentially lacking a methylation system for the cytosines of the 5'-CG-3 'dinucleotides.
  • the absence of methylation may be the result of the absence of appropriate enzymatic activity, due either to insufficient expression of a corresponding gene, or to the absence of said gene.
  • They are preferably simple prokaryotic or eukaryotic cells.
  • the cell host is a bacterium.
  • bacteria there may be mentioned more preferably E, CQli. fi. ___ ⁇ ll_, Streptomvces. Pseudomonas (putida. E aeruginosa ) . RhizQbiui melitoti, Agrohacterium tumefaciens. Staphvlococcus _w___, StreptOTTiyceS pristinaespiralts. Enterococcus faecium or Clostridium. Enterobacteria such as Salmonella typhimurium can also be used. Klebsiella ⁇ eur ⁇ oniae, Enterobacter aerogenes.
  • the cell host used is a non-pathogenic organism and makes it possible to produce large and homogeneous quantities of plasmid DNA.
  • E. coli is used as a particularly preferred example.
  • the method of the invention allows the production of DNA of therapeutic quality.
  • the DNA can be any DNA molecule, single-stranded or double-stranded, linear or circular, replicative or not, integrative or not, in the form of plasmid, supercoiled, loose or linear mini-circle.
  • the DNA will also be referred to as plasmid DNA or TG plasmid (for plasmid usable in gene therapy).
  • the TG plasmids generally used in gene therapy essentially carry (i) an origin of replication, (ii) one or more nucleic acids of interest (therapeutic gene) with sequences necessary for their expression
  • This plasmid can be a derivative of pBR322 (Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95), a derivative of pUC (Viera and Messing, Gene 19 (1982) 259), or other plasmids derived from the same group of incompatibility, that is to say of ColEl or pMBl for example. These plasmids can also be chosen from other incompatibility groups which replicate in Escherichia coli.
  • Plasmids may be plasmids derived from plasmids belonging to the incompatibility groups A, B, FI, Fil, Fin, IVF, Hl, Hll, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z or 9 for example.
  • Other plasmids can also be used, among which plasmids which do not replicate in E. coli but in other hosts such as & s liS. Streptomvces. P. putida. P. aeruginosa. Rhizobium meliloti. Agrobacterium tu efaciens. Staphvlococcus aureus.
  • the origins of replication from plasmids replicating in E. coli are used.
  • the origin of replication can be a conditional origin, that is to say the activity of which depends on the presence of factors in trans. The use of this type of origin of replication prevents replication of the plasmid DNA after administration, for example in humans (FR95 10825).
  • marker genes mention may be made of a resistance gene, in particular to an antibiotic (ampicillin, kamamycin, geneticin, hygromycin, etc.), or any gene conferring on the cell a function which it no longer possesses (for example a gene which has deleted on the chromosome or made inactive), the gene on the plasmid restoring this function.
  • an antibiotic ampicillin, kamamycin, geneticin, hygromycin, etc.
  • any gene conferring on the cell a function which it no longer possesses for example a gene which has deleted on the chromosome or made inactive
  • the plasmid DNA comprises sequences making it possible to eliminate, after the production phase, all the essentially non-therapeutic regions (origin of replication, marker gene, ete).
  • all the essentially non-therapeutic regions oil of replication, marker gene, ete.
  • the plasmid DNA according to the invention is preferably a double-stranded DNA molecule comprising one or more nucleic acids of interest with sequences necessary for their expression. According to a preferred mode, it is a circular, replicative or integrative molecule.
  • the plasmid DNA essentially contains one or more nucleic acids of interest with sequences necessary for their expression (miniplasmid).
  • the nucleic acid of interest can be any nucleic acid (cDNA, gDNA,
  • Synthetic or semi-synthetic DNA, ete whose transcription and possibly translation in a cell generate products having a therapeutic, vaccine, agronomic or veterinary interest.
  • nucleic acids having therapeutic properties there may be mentioned more particularly the genes coding for enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, ete (FR 9203120), growth factors, neurotransmitters or their synthetic precursors or enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ete; apolipoproteins: ApoAI, ApoAIV, ApoE, ete (FR 93 05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 9111947), tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, ete (FR 93 04745) , genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VIII, IX, summer, suicide genes: Thymidine kinase, cytosine deaminase, summer, suicide genes
  • the therapeutic gene can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences can, for example, be transcribed, in the target cell, into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the nucleic acid of interest can also be a vaccinating gene, that is to say a gene coding for an antigenic peptide, capable of generating in humans or animals an immune response, with a view to carrying out vaccines. They may in particular be antigenic peptides specific for the epstein barr virus, for the virus HIV, hepatitis B virus (EP 185 573), pseudo-rabies virus, or even specific for tumors (EP 259212).
  • the nucleic acid of therapeutic, vaccine, agronomic or veterinary interest also contains a promoter region for functional transcription in the target cell or organism (ie mammals, in particular humans), as well that a region located in 3 ', and which specifies a transcriptional end signal and a polyadenylation site.
  • the promoter region it may be a promoter region naturally responsible for the expression of the gene considered when it is capable of functioning in the cell or the organism concerned. They can also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the target cell.
  • promoters any promoter or derived sequence stimulating or repressing the transcription of a gene in a specific way or not, inducible or not, strong or weak. They may in particular be ubiquitous promoters (promoter of the HPRT, PGK genes, a-actin, tubulin, ete), promoters of intermediate filaments (promoter of the GFAP genes, desmin, vimentin, neurofilaments, keratin, ete), promoters of therapeutic genes (for example the promoter of the MDR, CFTR, Factor VIII, ApoAI, ete genes), of tissue-specific promoters (promoter of the pyruvate kinase gene, villin, intestinal fatty acid binding protein, muscle a-actin smooth, ete) or promoters responding to a stimulus (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, ete).
  • ubiquitous promoters promoter of the HPRT, PGK genes, a-actin, tub
  • promoter sequences originating from the genome of a virus such as for example the promoters of the El A and MLP genes of adenovirus, the CMV early promoter, or even the RSV LTR promoter or MMTV, etc.
  • these promoter regions can be modified by adding activation or regulatory sequences, or allowing tissue-specific or majority expression.
  • the gene of interest can also include a signal sequence directing the product synthesized in the secretory pathways of the target cell. This signal sequence can be the natural signal sequence of the synthesized product, but it can also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the methyl plasmid DNAs of the invention can be used for the treatment or prevention of numerous pathologies, including genetic diseases (dystrophy, cystic fibrosis, etc.), neurodegenerative diseases (alzheimer, parkinson , ALS, ete), cancers, pathologies linked to coagulation disorders or dyslipoproteinemias, pathologies linked to viral infections (hepatitis, AIDS, summer), or in the agronomic and veterinary fields, etc. They are particularly advantageous for the treatment of pathologies in which lasting expression without immunological reaction is desired, in particular in the field of genetic, neurodegenerative and cardiovascular diseases.
  • the method according to the invention uses a host cell containing an expression cassette for a DNA methyltransferase making it possible to methylate the cytosine residues of the dinucleotide 5'-CG-3 '.
  • DNA methyltransferase dam which methylates adenosine residues within the 5'-GATC-3 'sequences
  • DNA methyltransferase dem which methylates the second cytidine residue.
  • 5'-CCA / TGG-3 'sequences Other DNA methylases have been studied in bacteria, which methylate a residue contained in a recognition site of an enzyme of restriction.
  • the enzyme M. Hpall methylated the second cytosine residue in the sequence 5'-CCGG-3 '.
  • the present invention uses an expression cassette for a DNA methyltransferase making it possible to methylate the cytosine residues on the 5'-CG-3 'dinucleotides. Therefore, within the meaning of the present invention, methyl DNA more particularly means methyl DNA on the cytosine residues of dinucleotides 5 '-CG-3'.
  • the DNA methyltransferase used preferentially methylates the cytosine residues of the 5'-CG-3 'dinucleotides, that is to say almost does not affect the adenine residues, nor the cytosine residues which are present in a context different from 5 '-CG-3' dinucleotides.
  • methyl plasmid DNA is understood to mean plasmid DNA of which at least 50% of the cytosine residues of the 5 '-CG-3' dinucleotides are methyl. More preferably, at least 80%, advantageously 90% of said residues are methylated.
  • Plasmid DNA methylation can be checked in several ways. In particular, it can be controlled by digesting the plasmid preparations with restriction enzymes, the cleavage of which is not possible if the cytosine residue of the dinucleotide 5'-CG-3 ', contained in the cleavage site, is methylated. Mention may be made, for example, of the restriction enzymes Hpall. AatlI. BstBI.
  • Methylation can also be determined by chromatography.
  • the amount of unmethylated plasmid present in the preparation of methylated plasmid was quantified as follows: to the undigested unmethylated plasmid are added 1% or 5% of unmethylated plasmid and fully digested with Hpall. These samples, as well as the methylated plasmid digested with Hpall. are analyzed by anion exchange liquid chromatography and detection at 260 nm, which makes it possible to separate and quantify the undigested DNA from the digested DNA. It is found that the methylated plasmid contains less than 5% of unmethylated plasmid DNA, in other words that more than 95% of the plasmid DNA is methylated.
  • the method of the invention is characterized in that the DNA methyltransferase preferably methylates the cytosine residues of the 5'-CG-3 'dinucleotide.
  • more than 50% of the cytosine residues of the 5'-CG-3 'dinucleotide of the plasmid DNA are methylated. Even more preferably, more than 80%, particularly more than 90% of the cytosine residues of the 5 '-CG-3' dinucleotide of the plasmid DNA are methylated.
  • the DNA methyltransferase is chosen from methylase M.SssI, mouse methylase and human methylase.
  • methylase M.SssI is used.
  • the DNA methyltransferase expression cassette generally comprises a nucleic acid encoding a DNA methyltransferase making it possible to methylate the cytosine residues of the 5 '-CG-3' dinucleotide under the control of a promoter.
  • the promoter used for this purpose can be any promoter functional in the chosen host cell. In this regard, it may be a promoter as defined above.
  • prokaryotic cellular hosts there may be mentioned more particularly the promoter of the lactose operon (Plac), of the tryptophan operon (Ptrp), the hybrid Plac / Ptryp promoters, the PL or PR promoter of bacteriophage lambda, the promoter of the tetA gene (in Vectors 1988 pl79 Rodriguez and Denhardt editors), etc.
  • lac lactose operon
  • Ptrp tryptophan operon
  • hybrid Plac / Ptryp promoters the PL or PR promoter of bacteriophage lambda
  • the promoter of the tetA gene in Vectors 1988 pl79 Rodriguez and Denhardt editors
  • a promoter different from that responsible for the expression of the nucleic acid of interest in the plasmid DNA is used. It is very particularly advantageous to use an inducible promoter, making it possible to control the expression of the methylase.
  • the inducible promoter can for example be the promoter of bacteriophage T7 or the Plac promoter.
  • the expression cassette also contains end of transcription signals (transcriptional terminators), such as ribosomal terminators.
  • transcriptional terminators such as ribosomal terminators.
  • the DNA methyltransferase expression cassette can be carried by a replicative vector, or can be integrated into the genome of the host cell.
  • a vector compatible with the plasmid TG is advantageously used, that is to say capable of co-residing in the same cell.
  • Two different plasmids can replicate in the same cell if the control of replication of each plasmid is different.
  • compatible plasmids belong to two incompatibility groups.
  • there are approximately 30 groups of incompatibility of plasmids replicating in enterobacteria (Maas et al. 1988 Microbiol. Rev. 52 p375).
  • the replicative vector used has a different number of copies in the host cell than the plasmid TG.
  • the vector carrying the gene coding for methylase, the expression of which may be inducible has a low copy number (derived for example from pACYC184 or RK2), while the plasmid TG has a high copy number (derived from ColEl). It is also possible to clone in the plasmid TG a sequence making it possible to form with an appropriate oligonucleotide a triple helix sequence so that the plasmid TG can be separated from the other plasmid by affinity purification.
  • the DNA methyltransferase expression cassette can also be integrated into the genome of the host cell. Integration can be achieved by homologous recombination, insofar as the expression cassette is surrounded by adjacent fragments of a gene, nonessential, of the host genome and cloned on a plasmid which cannot replicate in the host considered.
  • This plasmid can be i) a derivative of ColEl in a strain of E. poli ts (Gutterson et al. 1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 p4894); ii) a thermosensitive derivative of pSC101 in any strain of E- £ ⁇ li (S. Kushner et al. 1989 J. Bacteriol.
  • a suicide vector such as M13mp10 in the strains of E. CQ_ ⁇ sjp + (Blum et al. 1989 J. Bacteriol. 171 p538) or also iv) a plasmid comprising only the origin g of R6K in any strain of E-coli lacking the J2Î £ gene (Filutowicz et al. 1994 Prog. In Nucleic Acid Res. And Mol. Biol. 48 p239).
  • the expression cassette can be introduced into the host cell before, after or at the same time as the plasmid DNA.
  • As an integrative cassette it is generally introduced before, and the cells containing said cassette are selected and used for the production of plasmid DNA.
  • a particular aspect of the invention is to express the gene coding for the methylase M. SssI in bacterial cells (in particular E. coli) containing a plasmid TG. As indicated in the examples, said plasmid is then methylated on the cytosines of dinucleotides 5'-CG-3 '. More specifically, the plasmid TG is transformed into a strain of E-coli mcrA mcrB D (mcrC-mrr) already containing a plasmid carrying the gene coding for the methylase M-SssI and compatible with the plasmid TG. During the growth of the bacterium, the two co-residing plasmids replicate and are methylated (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol. 173 p5793).
  • the plasmid DNA or the expression cassette can be introduced into the host cell by any technique known to those skilled in the art (transformation, transfection, conjugation, electroporation, pulsing, precipitation, etc.).
  • the transformation can in particular be carried out by the Ca ⁇ 2 transformation technique (Dagert and Ehrlich, Gene 6 (1979) 23), or that perfected by Hanahan et al. (J. Mol. 166 (1983) 557) or any technique derived therefrom (Maniatis et al., 1989), as well as by electrotransformation (Wirth et al., Mol.Gen.Genet. 216 (1989) 175) or by TSB (Transformation and Storage Buffer; Chung et al. 1988 Nucleic Acids Res.
  • the methyl plasmid DNA according to the invention can then be purified by any technique known to a person skilled in the art (precipitation, chromatography, centrifugation, dialysis, etc.).
  • the TG plasmid must also be separated from said vector. Different techniques can be used, based on the differences in size or mass of the two plasmids, or on the digestion of the vector at restriction sites present only in the vector and not in the plasmid TG.
  • a particularly advantageous purification method is based on the affinity between a specific sequence present on the plasmid TG and an immobilized oligonucleotide. This triple-helix purification has been described in detail in applications FR96 03519 and FR94 15162, which are incorporated herein by reference.
  • a particularly advantageous result of the invention is that the plasmid DNA methylated under the conditions of the invention leads to the expression of the gene under the control of the promoter as good as that obtained with the same unmethylated plasmid DNA.
  • This methylated plasmid DNA should not cause the immune stimulation associated with bacterial DNA and therefore has a definite advantage for being used in non-viral gene therapy.
  • the methylated plasmid DNAs according to the invention can be used in any vaccination or gene and cell therapy application, for the transfer of a gene to a given organism, tissue or cell.
  • they can be used for direct administration in vivo, or for the modification of cells in vitro or ⁇ x vivo, with a view to their implantation in a patient.
  • the molecules according to the invention can be used as such (in the form of naked DNA), or in combination with different chemical and / or biochemical, synthetic or natural vectors. These may include cations
  • Synthetic gene transfer vectors are generally cationic lipids or polymers which complex DNA and form with it a particle carrying positive charges on the surface. These particles are capable of interacting with the negative charges of the cell membrane, then of crossing it. Examples of such vectors include DOGS (TransfectamTM) or DOTMA (Lipofectin M).
  • Chimeric proteins have also been developed: they consist of a polycationic part which condenses DNA, linked to a ligand which binds to a membrane receptor and drives the complex into cells by endocytosis.
  • the DNA molecules according to the invention can also be used for the transfer of genes into cells by physical transfection techniques such as bombardment, electroporation, etc.
  • the molecules of the invention can optionally be linearized, for example by enzymatic cleavage.
  • another object of the present invention relates to any pharmaceutical composition
  • This DNA can be naked or associated with a chemical and / or biochemical transfection vector.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the DNA molecule is used in an injectable form or in application. It can be mixed with any pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection at the site to be treated.
  • nucleic acid may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes. They may in particular be Tris or PBS buffers diluted in glucose or sodium chloride.
  • a direct injection of the nucleic acid into the affected region of the patient is advantageous because it allows the therapeutic effect to be concentrated in the affected tissues.
  • the doses of nucleic acid used can be adapted according to different parameters, and in particular depending on the gene, the vector, the mode of administration used, the pathology concerned or even the duration of the treatment sought.
  • the DNA fragments are separated according to their size on 0.7% agarose or 8% acrylamide gels, purified by electrophoresis then electroelution, phenol extracts, ethanol precipitates and then incubated. in a tampon 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, in the presence of phage T4 DNA ligase (Biolabs).
  • oligonucleotides are synthesized using the chemistry of phosphoramidites protected in b by a cyanoethyl group (Sinha ej al confuse1984, Giles 1985) with the automatic DNA synthesizer Applied Biosystems 394 DNA / RNA Synthesizer using the manufacturer's recommendations.
  • LB and 2XTY culture media are used for the bacteriological part (Maniatis ⁇ l al., 1989).
  • the plasmid DNAs are also purified according to the alkaline lysis technique (Maniatis ⁇ î âl-. 1989).
  • cassettes of eukaryotic expression carried by replicative plasmids in the bacterium E- £ ⁇ li are known to those skilled in the art. These cassettes can express reporter genes such as the gene coding for the E. coli b-galactosidase, or the chloramphenicol acetyltransferase of the transposon Tn9, or luciferase, or genes of interest in gene therapy. These cassettes contain a promoter which can be viral or eukaryotic. these expression systems can be specific tissue and / or inducible or else have a ubiquity of expression.
  • the cassette used in this example comprises the gene ___, coding for the luciferase of Photinus pyralis and the promoter pCMV, promoter / enhancer intermediate of human cytomegalovirus.
  • the Ju £ gene has 4.78% of 5 '-CG-3' dinucleotides, and the viral promoter pCMV 5%. These percentages are therefore high compared to the low frequency of 0.8% of 5 '-CG-3' on mammalian sequences.
  • a methylase such as methylase M. SssI or CpG methylases endogenous to mammals
  • the promoter pCMV and the gene ln ⁇ can therefore be highly methylated.
  • This expression cassette was cloned into the replicative plasmid in E-coli pXL2784, the map of which is presented in FIG. 1.
  • the plasmid is 6390 bp in size and contains 5.8% of 5'-CG-3 ⁇ dinucleotides ⁇
  • the plasmid pXL2784 was constructed from the vector pXL2675 (2.513 kb), a minimal replicon of ColEl derived from pBluescript (ORI) and having as a selection marker the gene for the transposon Tn ⁇ coding for resistance to kanamycin.
  • Plasmid pXL2784 has the ££ T locus (382 bp) from ColEl; the csi locus contains a specific site sequence of XerC / XerD recombinases and leads to the resolution of plasmid dimers (Summers et al. 1988 EMBO J. 7 p851).
  • the transgene cloned on this plasmid pXL2784 is an expression cassette (3.3 kb) of the read gene coding for Photinus pyralis luciferase (from pomegal basic Promega) under the control of the enhancer / promoter pCMV human cytomegalovirus (from pcDN A3 of In Vitrogen).
  • This example describes the structure of an M. SssI methylase expression cassette from Spiroplasma sp. MQ1. It is understood that the same principle can be applied to the construction of an expression cassette for any other enzyme according to the invention.
  • the expression cassette used comprises the gene coding for methylase M. SssI from Spiroplasma sp. MQ1 which is expressed under the control of the promoter plac.
  • IPTG isopropylthio-b-D-galactoside
  • This cassette is present in the plasmid pAIT2, which replicates pACYC184 and further carries the transposon gene Tn9Q3 coding for resistance to lividomycin, allowing the selection of transformed host cells.
  • Example 3 Production of plasmid DNA pXL2784 methylated to the cytosine residues of the 5'-CG-3 'dinucleotides.
  • Plasmid pXL2784 is methylated on the cytosines of all 5'-CG-3 'dinucleotides with methylase M. ⁇ ssl from Spiroplasma sp. MQl.
  • the methylation mode according to the invention uses this enzyme and the plasmid is methylated during production in the bacteria.
  • the transformants are selected on LB medium containing kanamycin 50 mg 1 and lividomycin 100 mg l in order to select pXL2784 which carries the Tn transposon gene coding for resistance to kanamycin and pAIT2 carries the Tn903 transposon gene coding for resistance to lividomycin.
  • pXL2784 is cultured in LB medium kanamycin 50 mg / l + lividomycin 100 mg / 1 + 2.5 mM IPTG at 37 ° C. for 15 hours, the extracted plasmid DNA is methylated.
  • the methylation is verified by digesting the plasmid preparations with the restriction enzymes Hpall. AatH. BstBI. The integrity and the presence of the two plasmids are verified by digesting these preparations with the restriction enzymes HindIII and EcoRI. see figure 2.
  • Hpall restriction enzymes. AatH. BstBI are three enzymes whose cleavage is not possible if the cytosine residue of the dinucleotide 5'-CG-3 ', contained in the cleavage site, is methylated.
  • methyl plasmid DNA according to the invention retains its capacity to transfect cells, to replicate therein, and to express a gene of interest therein.
  • the methylated plasmid ⁇ XL2784 is obtained in the form of a mixture with the plasmid pAIT2 which ensured its methylation after bacterial co-transformation.
  • a fractionation by affinity chromatography was carried out to purify the plasmid of interest and the technique used is described in application No. FR 94tl5162.
  • a dialysis step against 0.15M NaCl can be carried out to remove the buffer which constitutes the elution phase from the column.
  • the plasmid pXL2784 When the plasmid pXL2784 is used as a reference, it is purified according to the same protocol as that described above. In this example, vectorization of the DNA is ensured by a cationic lipid, RPR120535A, belonging to a series described in patent application No. FR 95 13490. It is understood that any other chemical or biochemical transfer vector can be used.
  • the transfection solutions are prepared from a volume-to-volume mixture of DNA at 30 ⁇ g / l and aqueous solution of cationic lipid RPR 120535 at 90 ⁇ M; the cationic lipid / DNA ratio is therefore 3 nanomoles cationic lipid / ⁇ g DNA.
  • the DNA / lipofectant solutions are distributed at 4.8% (VV) final in the wells where the cells have been washed with medium devoid of proteins (serum) and returned to growth during the transfection time in a serum-free medium.
  • Î.IO ⁇ cells [NIH3T3 (mouse fibroblasts) and Hela (human uterine carcinoma)] in exponential growth phase over 2 cm2 (500 ⁇ l of medium without serum / well) are treated with 25 ⁇ l of transfection solution ce which corresponds to the contribution of 0.375 ⁇ g of DNA / 1.10 5 cells. After a 2 hour incubation at 37 ° C under 5% CO2 in a humid atmosphere, the growth medium is supplemented with final 8% fetal calf serum (V / V).
  • the cells are washed with PBS and lysed with a buffer containing 1% Triton X-100 and 2 mM DTT.
  • Plasmid PXL2784 PXL2784CH3 PXL2784 PXL2784CH3 purified by 2.0.1010 +/- 2.2.101 ° +/- 3.1.10 8 +/- 1.7. 10 8 +/- chromatography 4% 10% 15% 11% affinity and dialysis 2.3.1010 +/- 3.1.10 10 +/- 3.8.10 8 +/- 2.4. 10 8 +/- 21% 10% 14% 7%

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Abstract

La présente invention concerne la préparation d'ADN, notamment plasmidique. Elle concerne plus particulièrement la production d'ADN plasmidique bactérien qui soit utilisable en thérapie génique, sous la forme de plasmide, de minicercle surenroulé, relâché ou linéaire.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION D'ADN THERAPEUTIQUE
La présente invention concerne la préparation d'ADN, notamment plasmidique. Elle concerne plus particulièrement la production d'ADN plasmidique bactérien qui soit utilisable en thérapie génique, sous la forme de plasmide, de minicercle surenroulé, relâché ou linéaire, et dont les propriétés immunogènes sont réduites voire supprimées. L'invention concerne également des microorganismes utilisables pour la production d'ADN, ainsi que des compositions pharmaceutiques.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie en introduisant une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe et ensuite réinjectée dans l'organisme, soit in vivo, directement dans le tissu visé. S'agissant d'une molécule de haut poids moléculaire et de charge négative, l'ADN a des difficultés pour traverser spontanément les membranes cellulaires phospholipidiques. Différents vecteurs sont donc utilisés afin de permettre le transfert de gène : les vecteurs viraux d'une part, les vecteurs chimiques et/ou biochimiques, naturels ou synthétiques, d'autre part. Les vecteurs viraux (rétrovirus, adénovirus, virus adéno-associés,...) sont très efficaces, notamment pour le passage des membranes, mais présentent un certain nombre de risques tels que la pathogénicité, la recombinaison, la réplication, l'immunogénicité, ... Les vecteurs chimiques et/ou biochimiques permettent d'éviter ces risques (pour revues, voir Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Ce sont par exemple des cations (phosphate de calcium, DEAE-dextran,...) qui agissent en formant des précipités avec l'ADN, lesquels peuvent être "phagocytés" par les cellules. Il peut également s'agir de liposomes dans lesquels l'ADN est incorporé et qui fusionnent avec la membrane plasmique. Les vecteurs synthétiques de transfert de gènes sont généralement des lipides ou des polymères cationiques qui complexent l'ADN et forment avec lui une particule portant des charges positives en surface. Ces particules sont capables d'interagir avec les charges négatives de la membrane cellulaire, puis de franchir celle-ci. On peut citer comme exemples de tels vecteurs le dioctadécylamidoglycylspermine (DOGS, TransfectamTM) 0u le chlorure de N-[l- (2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA, LipofectinTM). Des protéines chimères ont aussi été développées : elles sont constituées d'une partie polycationique qui condense l'ADN, liée à un ligand qui se fixe sur un récepteur membranaire et entraîne le complexe dans les cellules par endocytose. Il est ainsi théoriquement possible de "cibler" un tissu ou certaines populations cellulaires, afin d'améliorer la biodisponibilité iû vivo du gène transféré.
Les plasmides utilisés actuellement en thérapie génique portent généralement (i) une origine de réplication, (ii) un gène marqueur tel qu'un gène de résistance à un antibiotique (kanamycine, ampicilline...) et (iii) un ou plusieurs transgènes avec des séquences nécessaires à leur expression (enhanceur(s) , promoteur(s), séquences de polyadénylation...). Ce type de plasmides est par exemple utilisé actuellement en thérapie génique au niveau d'essais cliniques tels que le traitement de mélanomes, Nabel et al.. 1992, ou au niveau d'études expérimentales.
L'utilisation d'ADN plasmidique en thérapie génique pose toutefois un certain nombre de problèmes.
En particulier, cela implique la possibilité de produire des quantités importantes d'ADN de pureté pharmacologique. En effet, dans ces techniques de thérapie génique, le médicament est constitué par l'ADN même et il est essentiel de pouvoir fabriquer, dans des quantités adaptées, des ADN ayant des propriétés appropriées à un usage thérapeutique chez l'homme. A cet égard, différentes méthodes de production et/ou purification ont ete décrites dans l'art antérieur, permettant d'améliorer la qualité de l'ADN plasmidique (PCT/FR95/01468; FR96 03519).
Par ailleurs, l'utilisation d'ADN porteur de gènes de résistance a des antibiotiques ou d'origines de réplication fonctionnelles peut également présenter certains inconvénients, liés notamment à leur dissémination dans l'organisme.
Différentes approches ont également ete développées pour limiter ces inconvénients
(PCT/FR96/00274, FR95 10825). Un autre inconvénient des ADN plasmidiques utilises jusqu'à présent reside dans leur origine. Il s'agit en effet de molécules produites essentiellement dans des organismes procaryotes (bactéries) ou eucaryotes inférieurs (levures), qui possèdent potentiellement des motifs immunogenes chez l'homme. Les propriétés imm nologiques de l'ADN sont encore assez peu connues. L'ADN bactérien chez la souris conduit i) à la synthèse d'anticorps reconnaissant l'ADN bactérien double brin et simple brin ayant permis l'immunisation mais ne réagissant pas avec l'ADN double brin mammifère, ii) à la stimulation de la production de macrophages et cytokines (D. Pisetsky "the Immunologie Properties od DNA" J. Immunol. 156 (1996) 1). La macromolécule ADN est anisi dite immunogène. Par ailleurs, une macromolécule peut aussi conduire à une stimulation du système immunitaire sans être immunogène (par exemple corps étranger conduisant à une réponse immunitaire à médiation cellulaire). Les premières évidences suggérant que l'ADN bactérien conduit à une réponse immunitaire ont été décrites par Pisetsky et coll. (1991 J. Immunol. 147 pl759). Ils ont montré que l'ADN de trois espèces bactériennes peut stimuler la prolifération de lymphocytes de souris alors que l'ADN extrait de trois espèces animales ne conduit pas à cette stimulation. Puis, Yamamoto et coll. (1992 Microbiol. Immunol. 36 p983) ont observé que l'ADN bactérien de six espèces conduit dans les cellules de rate de souris BALB/c à une augmentation de l'activité NK "natural killer" et à l'induction de la production d'interférons. Mais l'ADN extrait de dix espèces vertébrées ne conduit à aucune de ces réponses. En outre, Krieg et coll. ont décrit en 1995 (Nature vol374 p546) qu'un fragment d'ADN genomique de E.coli induit in vitro la prolifération de cellules B murines et la sécrétion d'im unoglobulines IgM, alors que ce même ADN bactérien, traite in vitro avec une CpG méthylase, n'induit pas une telle réponse. Krieg et coll. ont aussi indique qu'en présence d'ADN non méthylé, l'interféron g est produit, et agit comme facteur costimulant de la différentiation des cellules B en modulant la production d'IL-6 par les cellules B (Krieg et coll. 1996 J. Immunol. 156 p558). De plus un oligonucleotide possédant un motif CpG non méthylé et encadré en 5' par 2 purines et en 3' par 2 pyrimidines conduit in vivo à une sécrétion coordonnée des interleukines IL-6 et IL- 12, et d'interférons g par les cellules NK(IFN-g), les cellules B (IL-6 et IL-12) et les lymphocytes T CD4+( IL-6 et IFN-g) (Krieg et coll. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 p2879).
L'ADN plasmidique utilisé jusqu'à ce jour en thérapie génique est essentiellement produit dans des cellules procaryotes, et présente donc un profil de méthylation comparable a celui de l'ADN genomique bactérien. Il a en outre ete démontre que l'ADN plasmidique qui a été injecté dans le muscle ou dans le foie, puis extrait, conserve le profil de méthylation procaroyte (Wolf et coll. 1992 Hum. Mol. Genet.1 p363; Malone et coll. 1995 J. Biol. Chem. 269 ρ29903). De ce fait, l'ADN plasmidique bactérien utilisé présente un potentiel de stimulation du système immunitaire important.
Il serait donc particulièrement avantageux de pouvoir disposer d'ADN plasmidique ayant des propriétés immunologiques réduites, voire supprimées. Il serait également particulièrement avantageux de pouvoir disposer d'un procédé permettant de produire, à une Échelle compatible avec une utilisation industrielle, des ADN plasmidiques de ce type.
La présente invention apporte une solution à ces problèmes. La demanderesse s'est en effet intéressée aux propriétés immunogènes de l'ADN bactérien. La demanderesse a maintenant mis au point un procédé permettant de produire des ADN plasmidiques de qualité pharmaceutique, potentiellement dépourvus d'effets immunogènes indésirables. La demanderesse a également montré que la méthylation de certains résidus de d'ADN permettait de réduire le potentiel immunogène des ADN plasmidiques, sans affecter leur capacité de transfecter des cellules et d'y exprimer un acide nucléique d'intérêt.
Un aspect de l'invention est de préparer des ADN, notamment plasmidiques, de qualité thérapeutique. Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation en thérapie génique d'ADN plasmidique méthylé sur les cytosines des dinucléotides 5'-CG-3'. Un troisième aspect de l'invention est relatif à des compositions pharmaceutiques comprenant des ADN plasmidiques mÈthyles. L'invention concerne encore tin procédé de méthylation in vivo d'ADN par expression d'une méthylase. L'invention dans d'autres aspects, est relative à des cassettes d'expression, des microorganismes hôtes utilisables pour la méthylation, la préparation de compositions thérapeutiques, et des méthodes de transfert de gènes.
Un premier objet de l'invention concerne donc un procédé de production d'ADN utilisable en thérapie génique caractérisé en ce que ledit ADN est produit dans une cellule contenant une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'.
La présente invention concerne donc la production d'ADN, notamment plasmidique, méthylé sur les résidus cytosine des dinucléotides 5'-CG-3'.
La méthylation d'ADN plasmidique in vitro est documentée dans la littérature (Adams et coll. 1992 FEBS Letters 309 p97 ; Doerflerl994 FEBS Letters 344 p251 ; Komura et coll. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p73). Cependant, ce mode de méthylation n'est pas envisageable pour la production industrielle de plasmide qui serait utilisé en thérapie génique. Un procédé de production d'ADN plasmidique doit en effet permettre de produire de façon reproductible des quantités de plasmides importantes et homogènes et de purifier cet ADN par des méthodes acceptables pour un usage pharmaceutique. Il est bien clair qu'un ADN méthylé in vitro peut-être plus ou moins relâché de lot à lot (Doerflerl994 FEBS Letters 344 p251) et que les quantités produites sont limitées.
La présente invention montre maintenant qu'il est possible de méthyler un plasmide d'intérêt directement au cours de la production, en coexprimant dans la cellule hôte le gène codant pour une méthylase. La présente invention montre également que, selon ce procédé, des quantités importantes et homogènes de plasmide méthylé peuvent être produites et l'ADN plasmidique méthylé peut être purifié selon des procédés déjà décrits. La demanderesse a également démontre, de manière avantageuse, que l'ADN plasmidique ainsi méthylé conserve la capacité de transfecter des cellules cibles et, le cas échÈant, de s'y répliquer. De manière particulièrement remarquable, la demanderesse a encore démontré que l'ADN plasmidique ainsi méthylé peut, in vivo, exprimer des acides nucléiques d'intérêt. De nombreuses études renforcent en effet l'idée que l'hyperméthylation est corrélée avec l'inhibition ou l'inactivation des promoteurs et que des promoteurs activement transcrits sont souvent hypo-ou non méthylés. Ainsi, s 'agissant de promoteurs viraux, si le promoteur tardif E2A du génome de l'adénovirus de type 2 est entièrement méthylé sur les dinucléotides 5'-CG-3', dans les cellules transfoimées de hamster HE1, et non méthylé dans les cellules transformées de hamster HE2; le gène E2A est silencieux dans HE1 et transcrit dans HE2 (W. Doerfler 1995 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 p209). Un autre exemple est décrit par Kohn et coll. (1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 p2567) qui montrent que l'absence d'expression à partir du vecteur rétroviral LTR transduit dans des cellules souches hématopoiétiques est associée à la méthylation in vivo. L'inhibition de l'expression d'un gène rapporteur, sous le contrôle d'un promoteur viral, lorsque ce gène est introduit en transfection transitoire par un plasmide méthylé in vitro a également été démontrée (Adams et coll. 1992 FEBS Letters 309 p97 ; Doerfler 1994 FEBS Letters 344 p251 ; Komura et coll. 1995 Biochim. Biophys. Acta 1260 p73). Par ailleurs, Razin et coll. (précitée) ont montré que le promoteur du gène codant pour la thymidine kinase de l'herpès simplex de type I et celui du gène codant pour la métallothionéine de souris sont inactifs lors d'expression transitoire dans les cellules de souris L et les cellules murines teratocarcinomes F9 si ces promoteurs sont méthylés sur les dinucléotides 5 ' -CG- 3 ' .
La présente invention décrit donc pour la première fois un procédé permettant la production d'ADN plasmidique méthylé, homogène et compatible avec une utilisation industrielle, et démontre la possibilité d'utiliser ce type de plasmide pour l'expression de gènes in vitro, ex vivo ou in vivo, notamment dans des applications de thérapie génique.
Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre dans différents types d'hôtes cellulaires. Il s'agit notamment de toute cellule non-humaine, essentiellement dépourvue d'un système de méthylation des cytosines des dinucléotides 5'-CG-3'.
L'absence de méthylation peut être le résultat de l'absence d'activité enzymatique appropriée, due soit à une expression insuffisante d'un gène correspondant, soit à l'absence dudit gène. Il s'agit préférentiellement de cellules procaryotes ou eucaryotes simples.
Avantageusement, l'hote cellulaire est une bactérie. Parmi les bactéries, on peut citer plus préférentiellement E,CQli. fi. ___ύll_, Streptomvces. Pseudomonas ( putida. E aeruginosa). RhizQbiui melitoti, Agrohacterium tumefaciens. Staphvlococcus _w___, StreptOTTiyceS pristinaespiralts. Enterococcus faecium ou Clostridium. On peut aussi utiliser des entérobactéries telles que Salmonella typhimurium. Klebsiella ηeurηoniae, Enterobacter aerogenes. Erwinia carotovora ou Serratia marcescens. Préférentiellement, l'hote cellulaire utilisé est un organisme non pathogène et permet de produire des quantités d'ADN plasmidique importantes et homogènes. A titre d'exemple particulièrement préfère, on utilise E. coli.
Le procédé de l'invention permet la production d'ADN de qualitÈ thérapeutique.
L'ADN peut être toute molécule d'ADN, simple-brin ou double-brin, linéaire ou circulaire, replicative ou non, intégrative ou non, sous la forme de plasmide, de minicercle surenroulé, relâché ou linéaire. Dans la suite du texte, l'ADN sera également référencé ADN plasmidique ou plasmide TG (pour plasmide utilisable en thérapie génique).
Les plasmides TG généralement utilisés en thérapie génique portent essentiellement (i) une origine de réplication, (ii) un ou plusieurs acides nucléiques d'intérêt (gène thérapeutique) avec des séquences nécessaires à leur expression
(enhanceur(s), promoteur(s), séquences de polyadénylation...), et éventuellement (iii) un gène marqueur.
Le choix de l'origine de réplication est principalement déterminé par l'hote cellulaire utilisé pour la production.. Il peut s'agir d'une origine de réplication issue d'un plasmide du groupe d'incompatibilité P (exemple = pRK290) qui permet la réplication dans les souches d'E. coli pol A. Plus généralement, il peut s'agir de toute origine de réplication issue d'un plasmide se répliquant dans les cellules procaryotes ou eucaryote inférieures. Ce plasmide peut être un dérivé de pBR322 (Bolivar et al., Gène 2 (1977) 95), un dérivé de pUC (Viera et Messing, Gène 19 (1982) 259), ou d'autres plasmides dérivant du même groupe d'incompatibilité, c'est-à-dire de ColEl ou de pMBl par exemple. Ces plasmides peuvent être choisis par ailleurs dans d'autres groupes d'incompatibilité se répliquant chez Escherichia coli. Il peut s'agir de plasmides dérivés de plasmides appartenant aux groupes d'incompatibilité A, B, FI, Fil, Fin, FIV, Hl, Hll, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z ou 9 par exemple. D'autres plasmides peuvent encore être utilisés, parmi lesquels des plasmides ne se répliquant pas chez E. coli mais chez d'autres hôtes tels que & s liS. Streptomvces. P. putida. P. aeruginosa. Rhizobium meliloti. Agrobacterium tu efaciens. Staphvlococcus aureus. Streptomvces pristinaespiralis. EnterQgPCÇUS faecium ou Clostridium. A titre préférentiel, on utilise les origines de réplication issues de plasmides se répliquant chez E. coli. Selon une variante particulière, l'origine de replication peut être une origine conditionnelle, c'est-à-dire dont l'activité dépend de la présence de facteurs en trans. L'utilisation de ce type d'origine de replication évite la replication de l'ADN plasmidique après administration, par exemple chez l'homme (FR95 10825).
Parmi les gènes marqueur on peut citer un gène de résistance, notamment à un antibiotique (ampicilline, kamamycine, généticine, hygromycine, ete), ou tout gène conférant à la cellule une fonction qu'elle ne possède plus (par exemple un gène qui a été délété sur le chromosome ou rendu inactif), le gène sur le plasmide rétablissant cette fonction.
Selon un mode de réalisation particulier, l'ADN plasmidique comporte des séquences permettant d'éliminer, après la phase de production, toutes les régions essentiellement non- thérapeutiques (Origine de replication, gène marqueur, ete). Une approche particulièrement avantageuse pour générer ce type de molécule
(minicercles) a été décrite dans la demande PCT/FR96/00274.
L'ADN plasmidique selon l'invention est préférentiellement une molécule d'ADN double-brin comportant un ou plusieurs acides nucléiques d'intérêt avec des séquences nécessaires à leur expression. Selon un mode préféré, il s'agit d'une molécule circulaire, replicative ou integrative. Avantageusement, l'ADN plasmidique contient essentiellement un ou plusieurs acides nucléiques d'intérêt avec des séquences nécessaires à leur expression (miniplasmide).
L'acide nucléique d'intérêt peut être tout acide nucléique (ADNc, ADNg,
ADN synthétique ou semi-synthétique, ete) dont la transcription et éventuellement la traduction dans une cellule génèrent des produits ayant un intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire.
Parmi les acides nucléiques ayant des propriétés thérapeutiques, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, ete (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ete; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, ete (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, ete (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, ete, les gènes suicides : Thymidine kinase, cytosine désaminase, ete; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, ete), un ARN ligand (WO91/19813) etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.
L'acide nucléique d'intérêt peut aussi être un gène vaccinant, c'est-à-dire un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259212).
Généralement, dans les plasmides, l'acide nucléique d'intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire contient également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule ou l'organisme cible (i.e. les mammifères, en particulier l'homme), ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. Il peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, a-actine, tubuline, ete), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, ete), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAI, ete), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, a-actine du muscle lisse, ete) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, ete). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes El A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV ou du MMTV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire. Par ailleurs, le gène d'intérêt peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit synthétisé, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Selon l'acide nucléique d'intérêt, les ADN plasmidiques methyles de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, ete), les maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, ete), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, ete), ou dans les domaines agronomique et vétérinaire, etc. Ils sont particulièrement avantageux pour le traitement des pathologies dans lesquelles une expression durable sans reaction immunologique est souhaitée, notamment dans le domaine des maladies génétiques, neurodégénératives et cardiovasculaires.
Comme indique ci-avant, le procède selon l'invention utilise une cellule hôte contenant une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'.
Après synthèse de l'ADN, certaines purines et pyrimidines sont modifiées chimiquement, par exemple par méthylation. Ainsi, la 5-méthylcytosine ou la N^- méthyladénine entrent dans la composition de certains ADN. Ces modifications ont lieu à l'aide d'ADN méthyltransférases, de maintien ou __a novo. qui transfèrent tin groupe méthylé de la S-adénosyl-L-méthionine à des résidus adénine ou cytosine qui peuvent être situés à des positions spécifiques dans les séquences. Par exemple, chez E- coli deux ADN méthyltransférases sont bien connues, l'ADN méthyltransférase dam, qui méthylé les résidus adénosine au sein des séquences 5'-GATC-3', et l'ADN méthyltransférase dem, qui méthylé le second résidu cytidine des séquences 5'- CCA/TGG-3'. D'autres ADN méthylases ont été étudiées chez les bactéries, qui méthylent un résidu contenu dans un site de reconnaissance d'une enzyme de restriction. Par exemple, l'enzyme M. Hpall méthylé le second résidu cytosine dans la séquence 5'-CCGG-3'.
La plupart des eucaryotes simples et des invertébrés contiennent relativement peu de 5-méthylcytosine et de N^-méthyladénine. Cependant la méthylation de bases chez les vertébrés est plus importante et dans ce cas la 5-méthylcytosine est la plus fréquente des bases méthylées. En effet plus de 95 pour cent des groupes méthylé de l'ADN des vertébrés se trouve sur les résidus C des rares dinucléotides 5' -CG-3* (la fréquence de 0,8 % de 5' -CG-3' sur les séquences mammifères est très faible bien que le pourcentage en GC soit en moyenne de 40% et qu'un arrangement non biaisé conduirait à une fréquence de 4% de 5'-CG-3'). Et, plus de 50 pour cent de l'ensemble des dinucléotides peuvent être méthylés. Différentes évidences suggèrent que le degré de méthylation de certaines séquences contenant le dinucléotide 5'-CG- 3' puisse être un facteur déterminant chez les mammifères dans la régulation de l'expression de gènes particuliers, l'inactivation du chromosome X, l'oncogénèse (1993 in DNA méthylation: Molecular Biology and Biological Significance, Eds Jost et Saluz), et encore des maladies héréditaires (Bâtes et coll. 1994 BioEssays 16 p277).
La presente invention utilise une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine sur les dinucléotides 5'-CG-3'. De ce fait, au sens de la presente invention, ADN methyle signifie plus particulièrement ADN methyle sur les résidus cytosine des dinucléotides 5' -CG-3'. Avantageusement, l'ADN méthyltransférase utilisée methyle préférentiellement les résidus cytosine des dinucléotides 5'-CG-3', c'est-a-dire n'affecte quasiment pas les résidus adenine, ni les résidus cytosine qui sont présents dans un contexte différent des dinucléotides 5' -CG-3'. Avantageusement, on entend par ADN plasmidique methyle un ADN plasmidique dont au moins 50 % des résidus cytosine des dinucléotides 5' -CG-3' sont methyles. Plus préférentiellement, au moins 80 %, avantageusement 90 % desdits résidus sont méthylés. La méthylation de l'ADN plasmidique peut être vérifiée de différentes manières. En particulier, elle peut être contrôlée en digérant les préparations plasmidiques par des enzymes de restriction dont la coupure n'est pas possible si le résidu cytosine du dinucléotide 5'-CG-3', contenu dans le site de coupure, est méthylé. On peut citer par exemple les enzymes de restrictions Hpall. AatlI. BstBI. La méthylation peut également être déterminée par chromatographie. Ainsi, la quantité de plasmide non méthylé presente dans la préparation de plasmide méthylé a ete quantifiée de la façon suivante : au plasmide non méthylé non digéré sont ajoutés 1 % ou 5 % de plasmide non méthylé et totalement digéré par Hpall. Ces échantillons, ainsi que le plasmide méthylé digéré par Hpall. sont analysés par chromatographie liquide échangeuse d'anions et détection à 260 nm, ce qui permet de séparer et quantifier l'ADN non digéré de l'ADN digéré. On constate que le plasmide méthylé contient moins de 5 % d'ADN plasmidique non méthylé, autrement dit que plus de 95% de l'ADN plasmidique est methyle.
Avantageusement, le procédé de l'invention est caractérise en ce que l'ADN méthyltransférase methyle préférentiellement les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'.
Avantageusement, dans le procédé selon l'invention, plus de 50% des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont methyles. Encore plus préférentiellement, plus de 80 %, particulièrement plus de 90 % des résidus cytosine des dinucléotide 5' -CG-3' de l'ADN plasmidique sont methyles.
Plusieurs ADN méthyltransférases mammifères permettant de méthyler les résidus cytosine sur les séquences contenant tout dinucléotide 5'-CG-3' ont été caractérisées et les gènes correspondant ont été clones, par exemple celle de la souris (Bestor et coll. 1988 J. Mol. Biol. 203 ρ971) ou celle de l'homme (Yen et coll. 1992 Nucl. Acids Res. 20 p2287). Ces enzymes ont un poids moléculaire compris entre 135 et 175 kD. Elles méthylent l'ADN hémiméthylé beaucoup plus rapidement que le non méthylé, suggérant que ce sont des méthylases de maintien (Smith 1994 Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 49 p65). L'enzyme homologue chez £. coli n'existe pas. Par contre la méthylase M. SssI de Spiroplasma méthylé exclusivement et complètement les résidus cytosine de tout dinucléotide 5' -CG-3' avec une vitesse comparable, quelque soit le substrat hémiméthylé ou non méthylé (Razin et coll. 1992 FEBS letters 313 ρ243; Baker et coll. 1993 Biochim. Biophys. Acta 196 p864). Cette enzyme a été isolée à partir de la souche Spiroplasma sp. MQ1. Son poids moléculaire est de 42 KD et le gène a été clone et surexprimé chez £. coli (Razin et coll. 1990 Nucl. Acids Res. 18 pi 145 et EP0412676A1 derwent 91045812).
Préférentiellement, l'ADN méthyltransférase est choisie parmi la méthylase M.SssI, la méthylase de souris et la méthylase humaine. Avantageusement, on utilise la méthylase M.SssI.
La cassette d'expression de l'ADN méthyltransférase comprend généralement un acide nucléique codant pour une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5' -CG-3' sous le contrôle d'un promoteur. Le promoteur utilise a cet effet peut être tout promoteur fonctionnel dans la cellule hôte choisie. A cet égard, il peut s'agir d'un promoteur tel que défini ci-avant. S'agissant d'hôtes cellulaires procaryotes, on peut citer plus particulièrement les promoteur de l'operon lactose (Plac), de l'operon tryptophane (Ptrp), les promoteurs hybrides Plac/Ptryp, le promoteur PL ou PR du bacteriophage lambda, le promoteur du gène tetA (in Vectors 1988 pl79 Rodriguez et Denhardt éditeurs), etc.
Dans un mode de réalisation préfère, on utilise un promoteur différent de celui responsable de l'expression de lacide nucléique d'intérêt dans l'ADN plasmidique. Il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un promoteur inductible, permettant de contrôler l'expression de la méthylase. Le promoteur inductible peut être par exemple le promoteur du bacteriophage T7 ou le promoteur Plac.
Avantageusement, la cassette d'expression contient également des signaux de fin de transcription (terminateurs transcriptionnels), tels que des terminateurs ribosomaux. La cassette d'expression de l'ADN méthyltransférase peut être portée par un vecteur replicatif , ou être intégrée dans le génome de la cellule hôte.
S 'agissant d'un vecteur replicatif, on utilise avantageusement un vecteur compatible avec le plasmide TG, c'est a dire capable de co-resider dans la même cellule. Deux plasmides différents peuvent se répliquer dans la même cellule si le contrôle de la réplication de chaque plasmide est différent. Ainsi des plasmides compatibles appartiennent à deux groupes d'incompatibilité. Or il existe environ 30 groupes d'incompatibilité de plasmides se répliquant chez les entérobactéries (Maas et coll. 1988 Microbiol. Rev. 52 p375). De ce fait, il existe de nombreuses possibilités pour répliquer deux plasmides dans la même cellule et plusieurs exemples sont décrits dans la littérature. On peut citer par exemple la coréplication des plasmides dérivés de ColEl avec les plasmides ayant pour réplicon R6K ou pl5A ou RSF1010 ou RK2 ; on peut encore citer la coréplication des plasmides dérivés de RK2 avec des plasmides dérivés de R6K ou RSF1010 ou pSa ou ColEl (in Vectors 1988 p287 Rodriguez et Denhardt éditeurs). Cette liste n'est pas limitative et d'autres exemples sont encore décrits dans Vectors 1988 p287 Rodriguez et Denhardt éditeurs. Avantageusement, le vecteur replicatif utilise presente un nombre de copies différent dans la cellule hôte que le plasmide TG. Ainsi, le vecteur portant le gène codant pour la méthylase, dont l'expression peut être inductible, est à faible nombre de copies (dérivé par exemple de pACYC184 ou RK2), alors que le plasmide TG est à haut nombre de copies (dérivé de ColEl). On peut aussi cloner dans le plasmide TG une séquence permettant de former avec un oligonucléotide approprié une séquence triple hélice de telle sorte que le plasmide TG peut être séparé de l'autre plasmide par une purification d'affinité.
La cassette d'expression de l'ADN méthyltransférase peut également être intégrée dans le génome de la cellule hôte. L'intégration peut être réalisée par recombinaison homologue, dans la mesure où la cassette d'expression est encadrée par des fragments adjacents d'un gène, non essentiel, du génome de l'hôte et clonée sur un plasmide ne pouvant se répliquer dans l'hôte considéré. Ce plasmide peut être i) un dérivé de ColEl dans une souche de E. _ς_i polAts (Gutterson et coll. 1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 p4894); ii) un dérivé thermosensible de pSClOl dans une souche quelconque de E- £Ωli (S. Kushner et coll. 1989 J. Bacteriol. 171 p4617) ; iii) un vecteur suicide tel que M13mpl0 dans les souches de E. ÇQ_{ sjp+ (Blum et coll. 1989 J. Bacteriol. 171 p538) ou encore iv) un plasmide ne comportant que l'origine g de R6K dans toute souche de E- coli dépourvue du gène J2Σ (Filutowicz et coll. 1994 Prog. in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol. 48 p239).
La cassette d'expression peut être introduite dans la cellule hôte avant, âpres ou en même temps que l'ADN plasmidique. S'agissant d'une cassette integrative, elle est généralement introduite avant, et les cellules contenant ladite cassette sont sélectionnées et utilisées pour la production de l'ADN plasmidique.
Un aspect particulier de l'invention est d'exprimer le gène codant pour la méthylase M. SssI dans des cellules bactériennes (notamment E. coli) contenant un plasmide TG. Comme indique dans les exemples, ledit plasmide est alors methyle sur les cytosines des dinucléotides 5'-CG-3'. Plus spécifiquement, le plasmide TG est transformé dans une souche de E- coli mcrA mcrB D(mcrC-mrr) contenant déjà un plasmide portant le gène codant pour la méthylase M- SssI et compatible avec le plasmide TG. Au cours de la croissance de la bactérie les deux plasmides corésidant se répliquent et sont méthylés (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol. 173 p5793).
L'ADN plasmidique ou la cassette d'expression peuvent être introduits dans la cellule hôte par toute technique connue de l'homme du métier (transformation, transfection, conjugaison, electroporation, pulsing, précipitation, ete). La transformation peut notamment être effectuée par la technique de transformation au Caθ2 (Dagert et Ehrlich, Gène 6 (1979) 23), ou celle mise au point par Hanahan et al. (J.Mol.Biol. 166 (1983) 557) ou toute technique dérivée de celle-ci (Maniatis et al., 1989), ainsi que par électrotransformation (Wirth et al., Mol.Gen.Genet. 216 (1989) 175) ou par TSB (Transformation and Storage Buffer; Chung et coll. 1988 Nucleic Acids Res. 16 p3580). Voir également les techniques générales de Biologie Moléculaire ci-après. L'ADN plasmidique methyle selon l'invention peut ensuite être purifie par toute technique connue de l'homme du métier (précipitations, chromatographies, centrifugations, dialyse, ete). Dans le cas particulier de l'utilisation d'un vecteur d'expression de la méthyltransférase replicatif, le plasmide TG doit en outre être sépare dudit vecteur. Différentes techniques peuvent être utilisées, basées sur les différences de taille ou de masse des deux plasmides, ou sur la digestion du vecteur au niveau de sites de restriction présents uniquement dans le vecteur et pas dans le plasmide TG. Une méthode de purification particulièrement avantageuse repose sur la l'affinité entre une séquence spécifique presente sur le plasmide TG et un oligonucleotide immobilise. Cette purification triple-helice a ete décrite en détail dans les demandes FR96 03519 et FR94 15162, qui sont incorporées a la presente par référence.
Un résultat particulièrement avantageux de l'invention est que l'ADN plasmidique méthylé dans les conditions de l'invention conduit à l'expression du gène sous le contrôle du promoteur aussi bonne que celle obtenue avec le même ADN plasmidique non méthylé. Cet ADN plasmidique méthylé ne devrait pas entrainer la stimulation immunitaire associée aux ADN bactériens et possède donc un avantage certain pour être utilisé en thérapie génique non virale.
Les ADN plasmidiques méthylés selon l'invention peuvent être utilisés dans toute application de vaccination ou de thérapie génique et cellulaire, pour le transfert d'un gène à un organisme, un tissu ou une cellule donnée. En particulier, elles peuvent être utilisées pour une administration directe in vivo, ou pour la modification de cellules in vitro ou ≤x vivo, en vue de leur implantation à un patient.
A cet égard, les molécules selon l'invention peuvent être utilisées telles quelles (sous forme d'ADN nu), ou en association avec différents vecteurs chimiques et/ou biochimiques, synthétiques ou naturels. Il peut s'agir notamment de cations
(phosphate de calcium, DEAE-dextran,...) qui agissent en formant des précipités avec l'ADN, lesquels peuvent être "phagocytés" par les cellules. Il peut également s'agir de liposomes dans lesquels la molécule d'ADN est incorporée et qui fusionnent avec la membrane plasmique. Les vecteurs synthétiques de transfert de gènes sont généralement des lipides ou polymères cationiques qui complexent l'ADN et forment avec lui une particule portant des charges positives en surface. Ces particules sont capables d'interagir avec les charges négatives de la membrane cellulaire, puis de franchir celle-ci. On peut citer comme exemples de tels vecteurs le DOGS (TransfectamTM) ou le DOTMA (Lipofectin M). Des protéines chimères ont aussi été développées : elles sont constituées d'une partie polycationique qui condense l'ADN, liée à un ligand qui se fixe sur un récepteur membranaire et entraîne le complexe dans les cellules par endocytose. Les molécules d'ADN selon l'invention peuvent également être utilisées pour le transfert de gènes dans des cellules par des techniques physiques de transfection telles que le bombardement, l'électroporation, etc. En outre, préalablement à leur utilisation thérapeutique, les molécules de l'invention peuvent éventuellement être linéarisées par exemple par coupure enzymatique.
A cet égard, un autre objet de la présente invention concerne toute composition pharmaceutique comprenant un ADN plasmidique méthylé tel que défini ci-avant. Cet ADN peut être nu ou associé à un vecteur chimique et/ou biochimique de transfection. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, la molécule d'ADN est utilisée sous une forme injectable ou en application. Elle peut être mélangée à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Il peut s'agir notamment de tampons Tris ou PBS dilués dans du glucose ou du chlorure de sodium. Une injection directe de l'acide nucléique dans la région atteinte du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1. Carte du plasmide pXL2784
Figure 2. Carte de restriction du plasmide pXL2784
Figure 3. Profil de digestion des plasmides l-pXL2784, 2-pXL2784 méthylé, 3-pXL2784+pAIT2 méthylés et 4-pAIT2 méthylé, digérés par les enzymes A-AatH. B-BstBI. C-HindIII. D-Hpall. E-EcoRI (M est le marqueur de poids moléculaire IKB ladder).
TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure d'ethidium, les digestions par des enzymes de restriction, l 'électrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E- £ûli. la précipitation des acides nucléiques ete, sont décrites dans la littérature (Maniatis _i _[., 1989, Ausubel et ai-. 1987). Les séquences nucléotidiques ont été déterminées par la méthode de terminaison de chaînes en suivant le protocole déjà présenté (Ausubel ≤î al., 1987).
Les enzymes de restriction ont été fournies par New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersha Ltd (Amersham).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose à 0,7 % ou d'acrylamide à 8 %, purifiés par électrophorèse puis électroélution, extraits au phénol, précipités à l'éthanol puis incubés dans un tampon Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs). Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la chimie des phosphoramidites protégés en b par un groupement cyanoéthyl (Sinha ej al„ 1984, Giles 1985) avec le synthétiseur automatique d'ADN Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer en utilisant les recommandations du fabricant.
Les milieux de culture LB et 2XTY sont utilisés pour la partie bactériologique (Maniatis ≤l al., 1989).
Les ADN plasmidiques sont purifiés également suivant la technique de lyse alcaline (Maniatis ≤î âl- . 1989) .
EXEMPLES
Exemple 1. Description du plasmide TG
De nombreuses cassettes d'expression eucaryote portées par des plasmides réplicatifs chez la bactérie E- £Ωli sont connues de l'homme de l'art. Ces cassettes peuvent exprimer des gènes raporteurs comme le gène codant pour la b-galactosidase de E.coli, ou la chloramphénicol acétyltransférase du transposon Tn9, ou la luciférase, ou des gènes d'intérêt en thérapie génique. Ces cassettes comportent un promoteur qui peut être viral ou eucaryote. ces systèmes d'expression peuvent être tissu spécifique et/ou inductible ou bien avoir une ubiquité d'expression. La cassette utilisée dans cet exemple comprend le gène ___, codant pour la luciférase de Photinus pyralis et le promoteur pCMV, promoteur/enhanceur intermédiaire du cytomégalovirus humain. Le gène Ju£ possède 4,78% de dinucléotides 5' -CG-3', et le promoteur viral pCMV 5 %. Ces pourcentages sont donc élevés par rapport à la fréquence faible de 0,8 % de 5' -CG-3' sur les séquences mammifères. En présence d'une méthylase (telle que le méthylase M. SssI ou les CpG méthylases endogènes aux mammifères), le promoteur pCMV et le gène lnς peuvent être donc hautement méthylés. Cette cassette d'expression a ete clonée dans le plasmide replicatif chez E- coli pXL2784 dont la carte est présentée sur la figure 1. Le plasmide a une taille de 6390 bp et comporte 5,8 % de dinucléotides 5'-CG-3\ Le plasmide pXL2784 a été construit à partir du vecteur pXL2675 (2,513 kb), réplicon minimal de ColEl issu de pBluescript (ORI) et ayant pour marqueur de sélection le gène du transposon Tnϋ codant pour la résistance à la kanamycine. Le plasmide pXL2784 contient aussi une séquence TH (GAA)i7 pouvant se lier à un oligomère (CTT)n où n=l à 17, pour générer localement une structure triple hélice et permettre une purification par affinité. Le plasmide pXL2784 possède le locus ££T (382 bp) issu de ColEl ; le locus csi contient une séquence site spécifique des recombinases XerC/XerD et conduit à la résolution de dimères de plasmides (Summers et coll. 1988 EMBO J. 7 p851). Le transgène clone sur ce plasmide pXL2784 est une cassette d'expression (3,3 kb) du gène lue codant pour la luciférase de Photinus pyralis (provenant de pGL2 basic de Promega) sous contrôle du enhanceur/promoteur pCMV cytomégalovirus humain (provenant de pcDN A3 d ' In vitrogen) .
Exemple 2 : Construction d'une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase
Cet exemple décrit la structure d'une cassette d'expression de la méthylase M. SssI de Spiroplasma sp. MQ1. Il est entendu que le même principe peut être applique a la construction de cassette d'expression de toute autre enzyme selon l'invention.
La cassette d'expression utilisée comprend le gène codant la méthylase M. SssI de Spiroplasma sp. MQ1 qui est exprimé sous le contrôle du promoteur plac. Ainsi, en présence IPTG (isopropylthio-b-D-galactoside) la méthylase est synthétisée et active (Gotschlich et al. 1991 J. Bacteriol. 173 p5793).
Cette cassette est presente dans le plasmide pAIT2, qui a pour réplicon le pACYC184 et porte en outre le gène du transposon Tn9Q3 codant pour la résistance à la lividomycine, permettant la sélection des cellules hôtes transformées. Exemple 3. Production d'ADN plasmidique pXL2784 méthylé aux résidus cytosine des dinucléotides 5'-CG-3'.
Le plasmide pXL2784 est méthylé sur les cytosines de tous les dinucléotides 5'-CG-3' avec la méthylase M. ≤ssl de Spiroplasma sp. MQl. Le mode de méthylation selon l'invention utilise cette enzyme et le plasmide est méthylé au cours de la production chez la bactérie.
Pour cela, la souche de E- CΩli ER 1821 dont le génotype est !' end Al thi- 1 supE44 mcrA5 D(mrr-hsdRMS-mcrB)l-::IS10. et portant le plasmide pAIT2, est transformée par la méthode TSB (Transformation and Storage Buffer; Chung et coll. 1988 Nucleic Acids Res. 16 p3580) par le plasmide pXL2784. Les transformants sont sélectionnés sur milieu LB contenant de la kanamycine 50 mg 1 et de la lividomycine 100mg l afin de sélectionner le pXL2784 qui porte le gène du transposon Tn codant pour la résistance à la kanamycine et le pAIT2 porte le gène du transposon Tn903 codant pour la résistance à la lividomycine. Lorsqu'un transformant ER1821, pAIT2, pXL2784 est cultivé en milieu LB kanamycine 50mg/l + lividomycine 100 mg/1 + IPTG 2,5 mM à 37 °C pendant 15 heures, l'ADN plasmidique extrait est méthylé.
La méthylation est vérifiée en digérant les préparations plasmidiques par les enzymes de restrictions Hpall. AatH. BstBI. L'intégrité et la présence des deux plasmides sont vérifiées en digérant ces préparations par les enzymes de restrictions HindIII et EcoRI. voir figure 2. Les enzymes de restrictions Hpall. AatH. BstBI sont trois enzymes dont la coupure n'est pas possible si le résidu cytosine du dinucléotide 5'-CG-3', contenu dans le site de coupure, est méthylé. Sur le promoteur pCMV sont localisés quatre sites de reconnaissance de AatH ; sur le gène ___Q sont cartographiés deux sites de reconnaissance de fisîBI et onze sites de reconnaissance de Hpall ; ce dernier enzyme coupant le plasmide pXL2784 en 30 fragments. Sur la photographie du gel d'agarose coloré au bromure d'éthydium (figure 2), on constate qu'avec la préparation plasmidique pAIT2+pXL2784 méthylée ou avec la préparation plasmidique pXL2784 méthylée et purifiée par chromatographie d'affinité (voir exemple 4) aucune digestion n'a lieu avec les enzymes Hpall. AatH. BstBI alors que les digestions par les enzymes HindIII et EcoRI conduisent bien au profil attendu d'après la carte de restriction. Les digestions contrôles par les enzymes Hpall. AatH. BgtBI du plasmide pXL2784 présentent le profil escompté d'après la carte de restriction.
Ces résultats démontrent que l'ADN plasmidique extrait est méthylé, sur les résidus cytosine du dinucléotide 5'-CG-3'. Ces résultats montrent en outre que la méthylation concerne plus de 90% de ces cytosines.
Exemple 4. Utilisation de plasmides methyles pour le transfert de matériel génétique
Cet exemple démontre que l'ADN plasmidique methyle selon l'invention conserve sa capacité de transfecter des cellules, de s'y répliquer, et d'y exprimer un gène d'intérêt.
A protocole de préparation des solutions utilisées pour la transfection
Deux lots de plasmides sont utilisés pour des étude comparatives :
a) le pXL2784, b) le pXL2784 méthylé.
Le plasmide ρXL2784 méthylé est obtenu sous forme d'un mélange avec le plasmide pAIT2 qui en a assuré la méthylation après co-transformation bactérienne. Un fractionnement par chromatographie d'affinité a ete realise pour purifier le plasmide d'intérêt et la technique utilisée est décrite dans la demande N° FR 94tl5162. Une étape de dialyse contre du NaCl 0.15M peut être réalisée pour éliminer le tampon qui constitue la phase d'élution de la colonne.
Lorsque le plasmide pXL2784 est utilisé en référence il est purifié selon le même protocole que celui décrit ci-dessus. Dans cet exemple la vectorisation de l'ADN est assurée par un lipide cationique, RPR120535A, appartenant à une série décrite dans la demande de brevet N° FR 95 13490. Il est entendu que tout autre vecteur de transfert chimique ou biochimique peut être utilise.
Les solutions de transfection sont préparées à partir d'un mélange volume à volume d'ADN à 30 μg/ l et de solution aqueuse de lipide cationique RPR 120535 à 90 μM ; le ratio lipide cationique/ADN est donc de 3 nanomoles lipide cationique/μg ADN. Après homogénéisation au vortex et incubation d'au moins 15 minutes à température ambiante les solutions ADN/lipofectant sont distribuées à 4,8% (V V) final dans les puits où les cellules ont été lavées par du milieu dépourvu de protéines (sérum) et remises en croissance pendant le temps de la transfection en milieu dépourvu de sérum.
B protocole de transfection
Des échantillons de Î.IO^ cellules [NIH3T3 (fibroblastes de souris) et Hela (carcinome utérin humain)] en phase exponentielle de croissance sur 2 cm2 (500μl de milieu sans sérum/puits) sont traités par 25 μl de solution de transfection ce qui correspond à l'apport de 0,375 μg d' ADN/1.105 cellules. Après une incubation de 2theures à 37°C sous 5 % de CO2 en atmosphère humide le milieu de croissance est supplémenté par du sérum de veau foetal à 8 % final (V/V).
A 40 heures post-transfection les cellules sont lavées par du PBS et lysées par un tampon contenant du Triton X-100 à 1 % et du DTT 2mM. L'activité luciférase exprimée est dosée par l'émission de lumière [RLU = relative light unit] en présence de luciférine, coenzyme A et ATP pendant 10 secondes et rapportée au mg de protéines extraites par le tampon de lyse.
C résultat?
Les résultats obtenus selon les conditions décrites ci-dessus figurent dans le tableau suivant. Cellule Cellules NIH 3T3 Cellules Hela
Plasmide PXL2784 PXL2784CH3 PXL2784 PXL2784CH3 purifié par 2,0.1010+/- 2,2.101°+/- 3,1.108 +/- 1.7. 108 +/- chromatographie 4% 10% 15% 11% d'affinité et dialyse 2,3.1010+/- 3,1.1010+/- 3,8.108 +/- 2,4. 108 +/- 21% 10% 14% 7%
Activité enzymatique en RLU/10 secondes/mg protéine (coefficient de variation % [3 expériences de transfection par résultat]
Compte tenu des coefficients de variation obtenus pour ce type d'expériences nous pouvons conclure qu'il n'existe pas de différences significatives quant à l'expression des deux plasmides utilisés dans les mêmes conditions de transfection. De plus l'activité luciférase obtenue est du même ordre de grandeur pour les deux étapes de purification considérées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'ADN utilisable en thérapie génique caractérisé en ce que ledit ADN est produit dans une cellule contenant une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3'.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérise en ce que la cellule est une cellule procaryote.
3. Procédé selon la revendication 2 caractérise en ce que la cellule est une bactérie.
4. Procédé selon les revendications 1 a 3 caractérisé en ce que la cassette d'expression est portée par un vecteur replicatif.
5. Procédé selon les revendications 1 a 3 caractérisé en ce que la cassette d'expression est intégrée dans le génome de la cellule.
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la cassette d'expression comprend un acide nucléique codant pour une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotide 5'- CG-3' sous le contrôle d'un promoteur.
7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible.
8. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'ADN méthyltransférase méthylé préférentiellement les résidus cytosine des dinucléotide 5* -CG-3'.
9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'ADN méthyltransférase est choisie parmi la méthylase M.SssI, la mÈthylase de souris et la méthylase humaine.
10. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que plus de 50 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthylés.
11. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que plus de 80 % des résidus cytosine des dinucléotide 5' -CG-3' de l'ADN plasmidique sont mÈthyles.
12. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que plus de 90 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont mÈthyles.
13. Utilisation d'un ADN plasmidique pour la prÈparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thErapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal, caractérisée en ce que plus de 50 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthylés.
14. Utilisation d'un ADN plasmidique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thérapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal, caractérisée en ce que plus de 80 % des résidus cytosine des dinucléotide 5' -CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthylés.
15. Utilisation d'un ADN plasmidique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thérapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal, caractérisée en ce que plus de 90 % des résidus cytosine des dinucléotide 5'-CG-3' de l'ADN plasmidique sont méthylés.
16. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement thérapeutique ou diagnostic du corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes :
- la production d'ADN par culture d'une cellule comprenant ledit ADN et une cassette d'expression d'une ADN méthyltransférase permettant de méthyler les résidus cytosine des dinucléotides 5'-CG-3', - la récupération dudit ADN, et,
- le conditionnement dudit ADN avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'ADN est un ADN plasmidique comprenant un acide nucléique d'intérêt thérapeutique.
18. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que l'ADN est un minicercle comprenant un acide nucléique d'intérêt thérapeutique.
19. Composition comprenant un ADN bactérien dont au moins 50 % des résidus cytosine des dinucléotide 5' -CG-3' sont méthylés.
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