KR19990055111A - N-아세틸 글루코사민 전이효소ⅲ의 활성도 측정방법 및 그 측정용 킷트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간염이 간암으로 이행되는 기작에 관여하는 것으로 추정되는 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 생쥐 단일클론항체를 이용하여 효소 면역학적 방법을 확립하고 이를 킷트화하여 혈액내의 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ의 수준을 측정하여 간질환(간염, 간경변 및 간암 등)을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

Ｎ-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ의 활성도 측정방법 및 그 측정용 킷트

본 발명은 효소면역 측정법에 의한 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ (N-acetylglucosaminyltransferaseⅢ)측정방법 및 측정용 킷트(kit)에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 간질환조직에서 특이적으로 발현되는 인간 N-아세틸글루코사민전이효소 Ⅲ(N-acetylglucosaminyltransferase Ⅲ; GnT Ⅲ)에 대한 단일클론항체를 이용하여 혈액과 조직중의 N-아세틸글루코사민전이효소Ⅲ를 측정하는 효소 면역학적 방법과 그 킷트제조에 관한 것이다.

당전이효소 중의 하나인 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ는 골지체의 벽에 결합되어 있는 효소로서 글루코사민잔기를 N-결합형당쇄의 트리만노실 중심(trimanosyl core)에 부가하여 이분지(bisecting)글루코사민 잔기의 형성을 촉매하는 당전이효소이다. 이분화 글루코사민 잔기는 여러 당단백질에서 복잡한 당쇄의 형태를 유도하는 전구체이다. 이들 구조는 발생과 분화과정에 따라 변화하는 것으로 알려져 있으며, 이것은 세포 표면의 당쇄가 세포간 상호작용에 특정한 역할을 수행하고 있다는 것을 의미한다. 특히, 악성 종양으로 전이되는 세포에도 복잡한 N 결합형 당쇄구조의 변화가 수반된다.

종양세포에서 보이는 당쇄의 변화는 트리만노실 중심(trimannosyl core) 부분에서 분지상(分枝像)이 증가하고 폴리락토스아미노글리칸 사슬(polylactosaminoglycan chain)의 형성이 증가하며, 시알릴레이션(sialylation)이 증가한다. 이는 특정한 글리실코트란스페라제(glycosyltransferase)의 반응에 의해 조절된다. N-아세틸 글루코사민 전이효소 Ⅲ의 활성은 닭의 난관에서 처음 발견되었으며, 쥐의 신장, 뇌, 태아간에는 그 활성도가 높으나 정상 성체쥐의 간에서는 그 활성도가 매우 낮으나 간암화되는 동안 그 발현이 증가한다고 보고되고 있다. 암화중인 쥐 간의 hepatic nodules, Novikoff ascites tumor cells, human B lymphocytes, HL-60 cell 등에서 높은 활성을 보임이 보고되었다. 또한, 간암, 간경변등 간질환 환자의 조직과 혈액안에서 정상인과 구별되는 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ의 활성이 80-100배 정도로 과잉 발현된다고 한다. 이와같이 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ는 간질환(예를 들어 간염, 간경변, 간암)의 경우 정상 상태에 비해 과잉 발현되므로 혈액중 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 분석하면 간질환 진단은 물론 간기능 상태를 알 수 있다.

종래의 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 활성도 측정방법을 형광 표지 기질을 사용하여 액체크로마토 그래피(HPLC)로 확인하거나 섬광계수기(liquid scintilation counter)를 이용하여 분석하였다. 이와 같은 방법들은 측정 시간이 많이 걸릴 뿐 아니라 고가의 기기가 필요하며 반응 및 처리 과정도 복잡하여 비전문가는 분석이 불가능하였다. 특히, 기질로 사용되어 지는 형광물질이 접합된 피리딜 아미네이티드 이분화 당쇄(fluorenscence-labelled pyridylaminated biatennary sugar chain)는 합성방법이 매우 까다롭고 합성에 필요한 재료가 매우 비싸 분석상 어려움이 있었다. 본 발명은 종래의 상기 문제점에 착안하여 일반인도 간편하게 당전이효소로 간기능을 진단하고 간질환을 예방하거나, 치료에 직접 사용할 수 있는 효과적이고 간편한 진단체계를 제공함을 그 목적으로 한다. 특정물질을 정성적 또는 정량적으로 분석하는 방법에는 여러 가지 방법이 있을 수 있으나, 이들 방법 중 미립자 응집반응법(particle agglutination assays), 방사 면역 분석법(radioimmunoassays, RIA), 효소 면역 분석법(enzyme immunoassays, EIA)와 형광면역분석법(fluoroimmunoassays, FIA)등이 가장 널리 이용되고 있다. 최초에는 특히 방사 면역 분석법의 단점인 방사 표지물에서 유래되는 짧은 반감기와 폐기물 처리 문제 등을 해결하기 위해 방사물질을 사용하지 않는 면역 측정법이 개발되고 있다. 이중 가장 보편적으로 사용되는 방법은 효소를 표지로 사용하는 효소면역 측정법과 형광물질을 표지로 사용하는 형광면역 측정법이다. 효소 면역 측정법에 흔히 사용되는 효소는 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)나 서양고추 냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP), 포도당 산화효소(glucose oxidase)등 안정성이 큰 효소들이며 높은 turn-over rate의 발색 기질를 선택하여 이용되고 있다. 이 방법은 방사 면역 분석법과 근사한 감도와 특이성을 갖고 있으며 방사 면역 분석법의 단점을 해결할 수 있으므로 광범위하게 이용되고 있다. 그러나, N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 항체는 현재까지 제조되지 않고 있는 실정이어서 면역측정법을 이용할 수 없었으나 본 발명자들에 의하여 개발된 대한민국 특허출원 제 97-64030호에 의해 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론항체가 생산가능하게 되어 본 발명을 통하여서는 효소 면역 측정법을 제공하기에 이르렀다. 따라서, 본 발명은 기존의 형광 표지 기질를 이용한 액체크로마토 그래피(HPLC)이나 섬광계수기(liquid scintilation counter)를 이용하여 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 활성도를 측정하는 방법보다 가격이 저렴하고 분석이 간단하며 다량의 시료를 한번에 측정할 수 있는 효소면역 측정킷트를 제공함을 또다른 목적으로 한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 간염이 간암으로 이행되는 기작에 관여하는 것으로 추정되는 당전이 효소유전자중 하나인 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 혈액과 조직중에서 측정할 수 있는 면역학적 측정법을 확립하고, 이를 이용하여 간편하게 혈액과 조직중의 N-아세틸글루코사민전이효소Ⅲ를 측정할 수 있는 킷트를 제조하였다.

본 발명자들은 간염이 간암으로 이행되는 기작에 관여하는 것으로 추정되는 당전이 효소유전자중 하나인 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 대장균에서 대량으로 생산하여(대한민국 특허출원 제 97-48855호) 마우스를 면역화시킴으로써 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론항체를 생산(대한민국 특허출원 제 97-64030호)한 바 있다. 본 발명은 상기 발명을 이용하여 혈액과 조직중 N-아세틸글루코사민전이효소 Ⅲ의 양을 측정하는 면역학적 측정법을 확립하는 단계; 확립된 면역학적 방법을 이용하여 간편하게 혈액과 조직중의 N-아세틸글루코사민전이효소Ⅲ를 측정할 수 있는 킷트를 제조하는 단계로 구성된다. 본 발명은 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 암세포나 혈청내의 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ농도를 결정하여 암이나 간질환을 진단하는 데 이용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

도 1은 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체의 역가를 나타낸 곡선이다. ■는 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체중 하나인 GT273G의 반응성을, □는 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체중 하나인 GT125M의 반응성을 나타낸다. 이때 역가는 GT273G의 경우 1:100000, GT125M의 경우 1:10000이었다.

도 2는 효소와 단일클론 항체를 접합시킨 효소 접합항체의 활성도를 나타낸 곡선이다. □는 280nm에서의 흡광도를 나타내며 단백질의 양을 표시한다. ■는 403nm에서의 흡광도를 나타내며 효소의 활성도를 표시한다.

도 3은 항N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 단일클론 항체와 효소접합체의 역가 곡선이다.

도 4는 간접 효소면역법에 의한 효소접합항체(GT 273G-호스레디쉬 퍼옥사이드 접합체)의 적정사용 농도를 조사한 도표이다.

도 5는 본 발명에서 확립된 효소면역방법을 이용하여 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 분석하였을 때 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ의 검정곡선표이다.

도 6은 본 발명에서 확립된 효소면역방법을 이용하여 임상시료 중 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 분석하였을 때 결과를 나타낸 도표이다.

본 발명은 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하기 위하여, 우선 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 생산하는 대장균 형질전환체를 배양하여 그로부터 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 분리, 정제한다.

또, 본 발명은 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제조하기 위하여, 상기 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 이용하여 마우스를 면역화시키고 이로부터 추출된 비장세포와 마이엘로마 세포를 융합시킨 후, 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 특이성을 보이는 클론을 선별한다. 선별된 세포 클론중 소 단위형이 IgM인 하나의 마우스 융합세포주를 "GT 125M"이라 명명하고 소 단위형이 IgG_2b인 마우스 융합세포주를 "GT 273 G"라 명명하여 이들을 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 9월 24일에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0378 BP, KCTC 0379 BP).

한편, 상기 융합세포주로부터 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 대량으로 생산하기 위하여, N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 생산하는 상기 융합세포를 다시 마우스에 주사하고 복강이 부풀어 오른 생쥐에서 고농도의 융합세포를 함유하는 복수액을 취하여 본 발명의 단일클론 항체를 대량으로 얻는다. 대량으로 수득한 단일클론 항체를 분리정제하기 위하여는 소 단위형이 IgG인 복수액은 protein G-sepharose 4B 컬럼에, 소 단위형이 IgM인 클론 GT 125M에서 부터 얻은 복수액은 항-생쥐 IgM 이 결합된 아가로스(agarose)컬럼을 통과시켜 순수분리정제한다.

본 발명은 상기에서 순수 분리된 단일클론 항체의 역가를 측정하기 위하여 분리정제된 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ을 각 웰에 코팅한다. 하룻밤동안 냉장 방치 후 3% 소혈청 알부민로 차단(blocking)한다. 여기에 분리정제된 단일클론항체를 연차 희석하여 가하고 2시간 동안 실온에서 방치한 후 항-생쥐-서양고추 냉이 퍼옥시다제 (1 : 1000)를 가하고 1시간동안 실온에서 방치한다. 오르소-페닐렌 다이아민(O-phenylenediamine, OPD) 기질을 가하고 495㎚에서 흡광도를 측정하여 역가를 결정한다.

단일 클론항체와 서양고추 냉이 퍼옥시다제 효소를 접합시키기 위하여는 과요오드염산화법에 의해 순수 분리정제된 IgG에 서양고추 냉이 퍼옥시다제를 접합시킨다. 접합물을 정제하기 위하여 세퍼덱스 쥐 25(Sephadex G-25)를 사용하여 효소접합항체인 GT 273G-서양고추 냉이 퍼옥시다제 접합체를 분획한다. 용출액을 A280, A403에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 모두 높게 나온 튜브를 모아서 효소면역법에 의해 역가를 측정한다.

본 발명은 효소 면역법에 의한 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ측정법 확립을 위해 상기에서 제조된 효소접합체의 최적농도를 결정한다. 단일클론항체 GT 125M를 0.2㎍/웰의 농도로 코팅 완충액에 녹여 마이크로 타이터 플레이트에 코팅하고 소혈청알부민으로 차단한 후 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 각웰에 가하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 다시 세척하고 순차적으로 희석한 GT 273G-서양고추 냉이 퍼옥시다제 효소접합 항체를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고 오르소-페닐렌 다이아민 기질를 가하여 반응성을 조사한다.

본 발명은 상기에서 준비된 단일클론항체와 단일클론 효소 접합체를 이용하여 효소 면역법에 의한 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 측정법을 확립한다. N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 측정을 위한 효소 면역측정법을 위해 고상체로 마이크로 타이터 플레이트를 사용하였으며 GT 125M를 고상체에 결합시키고 GT 273G를 서양고추 냉이 퍼옥시다제효소에 결합시키는 샌드위치 효소면역법을 이용한다. 즉, 소 단위형이 IgM인 항체로부터 정제된 단일클론 항체 GT 125M를 마이크로 타이터 플레이트에 코팅한다. 하룻밤 방치한 후 3% 소혈청 알부민으로 차단한다. N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 각 농도별로 희석하여 각 웰에 가한다. 2시간동안 반응시킨 후 적정농도의 효소 접합 항체(서양고추 냉이 퍼옥시다제가 결합된 단일클론항체의 IgG (GT 273G))를 각 웰에 가한 후 1시간 동안 반응시킨다. 기질액을 각 웰에 가한 후 492nm에서 흡광도를 측정한다. 본 발명의 분석법을 이용하면 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 80ng/㎖ - 10 ug/ml 까지 농도에서 효소면역법을 실시할 수 있다.

본 발명은 상기에서 확립된 효소 면역학적 방법을 이용하여 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 측정용 킷트 제조한다. N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 측정을 위한 측정용 킷트는 A: 단일클론항체가 마이크로 타이터에 고착된 플레이트고상형 단일클론항체, B: 서양고추 냉이 퍼옥시다제가 결합된 단일클론항체 용액, C: 오르소-페닐렌 다이아민(OPD) 기질액, D: 세척액, E: 표준용액(N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ)으로 구성된다

본 발명의 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 사람의 혈액이나 조직내에 존재하는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질 항원과 플레이트에 코팅한 항-N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단일클론 항체를 경쟁적으로 반응시키면 환자의 세포나 혈청내의 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원농도를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 암이나 간질환의 진단에 이용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것에 불과할 뿐 본 발명의 권리가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론항체 생산

특허 출원번호 97-48855에 의거하여 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 대장균에서 대량으로 제조하고 그것을 면역원으로 하여 대한민국 특허출원 제 97-64030호 에서 얻은 하이브리도마 세포주 중 소 단위형이 IgM과 판명된 GT 125M과 소 단위형이 IgG2b인 클론(GT 273G)을 각각 마우스에 세포를 주사하여 복수액을 만든다. 즉, 대한민국 특허출원 제 97-64030호에서 얻은, 계속적으로 항체를 분비하는 하이브리도마로 부터 단일클론성 항체를 대량 생산하기 위하여 생쥐(Balb/c)에 0.5㎖ pristane을 복강내로 주사한다. 1주일 후에 각각의 하아브리도마들을 생쥐 1마리당 5×10⁶씩 주사하고, 복강이 부풀어 오른 생쥐에서 복수액을 채취한다. 이 복수액에는 하이브리도마 세포가 고농도로 자라기 때문에 이 액체를 10,000rpm에서 세포를 침전시킨 후, 상층액만을 취하고 이 상층액은 정제될 때까지 -20℃에서 보관한다.

실시예 2 : 단일클론 항체의 분리정제

소 단위형이 IgG인 복수액을 protein G-sepharose 4B 컬럼에 적하 후 인산 완충액(pH 7.2)으로 컬럼을 충분히 세척한다. 완충액을 0.1M 글라이신(pH 2.7) 완충액으로 교체하여 컬럼에 붙여있는 IgG 분자를 용출시킨다. A280에서 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 측정하여 IgG 부분만을 모아 투석한다. 투석된 IgG를 아미콘튜브(MW, 10000)를 이용하여 농축시켜 A260과 A280에서 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 결정하고 전기영동을 실시하여 순수한 IgG가 분리정제 되었음을 확인한다. 소 단위형이 IgM인 클론 GT 125M에서 부터 얻은 복수액은 항-생쥐 IgM 이 결합된 아가로스(agarose)컬럼을 통과시켜 순수분리정제된 IgM을 얻는다.

실시예 3 : 항체의 역가 측정

분리, 정제된 단일클론항체의 역가를 조사한다. 즉, 분리정제된 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ (2㎍/ml)을 각 웰에 100㎕씩 코팅한다. 하룻밤동안 냉장 방치 후 3% 소혈청 알부민로 차단(blocking)한다. 분리정제된 단일클론항체를 연차 희석한다. 연차 희석된 항체를 100㎕씩 가하고 2시간 동안 실온에서 방치한 후 항-생쥐-HRP (1 : 1000) 100㎕씩 가하고 1시간동안 실온에서 방치하였다. 오르소-페닐렌 다이아민(O-phenylenediamine, OPD) 기질을 가하고 492㎚에서 흡광도를 측정하여 역가를 결정하였다. 실험 결과는 도 1과 같다.

실시예 4 : 단일 클론항체와 서양고추 냉이 퍼옥시다제 효소접합 및 정제

과요오드염(Periodate) 산화법에 의해 순수 분리정제된 IgG에 서양고추 냉이 퍼옥시다제를 접합시킨다. 즉, 서양고추 냉이 퍼옥시다제 10㎎을 1㎖ 증류수에 녹여 0.1M 과 요오드 소듐염(sodium periodate) 500㎕를 가하여 실온에서 20분간 교반한다. 1mM 아세테이트 완충액 pH 4.4에서 변형된 효소를 4℃에서 하룻밤동안 투석하여 서양고추 냉이 퍼옥시다제를 활성화시킨다. 투석된 효소(700㎕)를 0.2M 카보네이트 완충액으로 pH 9.5로 적정하여 IgG시료와 섞어 실온에서 2시간 교반하면서 반응시켰다. 보로하이드라이드염(Sodium borohydride, 4mg/ml) 200㎕을 섞어 4℃, 2시간 교반한 후 반응이 끝난 용액을 센트리콘(centricon, MW, 30000)튜브에서 4℃, 2000rpm으로 용액이 1㎖로 농축될 때까지 원심분리하였다. 세퍼덱스 쥐 25(Sephadex G-25)를 사용하여 GT 273G-서양고추 냉이 퍼옥시다제 접합체를 분획하였다.

용출액을 A280, A403에서 흡광도를 측정하여 흡광도가 모두 높게 나온 튜브를 모아서 소혈청 알부민에 녹여 분주하여 -20℃에 보관하였다. 분리정제된 GT 273G-서양고추 냉이 퍼옥시다제 효소접합 항체를 280㎚에서 흡광도를 측정하여 단백질 양을 조사하였으며 403㎚에서 흡광도를 측정하여 서양고추 냉이 퍼옥시다제 활성도를 조사하였다. RZ 값(A403/A280)에 따라 분액을 모았다. 실험결과 도 2와 같은 결과를 얻었다.

분액을 효소면역법에 의해 GT 273G-서양고추 냉이 퍼옥시다제의 역가를 측정한다. GT 273G-서양고추 냉이 퍼옥시다제 효소접합항체의 역가를 조사하기 위해 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 용액을 2μg/㎖로 만들어 마이크로 타이터 플레이트 웰당 100㎕씩 가하여 4℃에서 하룻밤동안 코팅한 후 트윈이 포함된 인산염 완충액으로 3번 세척하고 GT 273G-서양고추 냉이 퍼옥시다제 접합체를 순차적으로 희석하여 가한 후 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 다시 인산염 완충액으로 세척하고 기질 완충액을 가하여 492nm에서의 흡광도를 측정한다. 실험결과 도 3과 같은 결과를 얻었다.

실시예 5 : 효소 면역법에 의한 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ측정법 확립을

위한 GT 273G-호스레디쉬 퍼옥사이드 효소접합체의 최적농도 조사

단일클론항체 GT 125M를 0.2㎍/웰의 농도로 코팅 완충액에 녹여 마이크로 타이터 플레이트에 가하고 4℃에서 하룻 밤 방치하여 반응시켰다. 플레이트를 인산염 완충액으로 세척한 후 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 0.2㎍/웰의 농도를 가하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 다시 세척하고 순차적으로 희석한 GT 273G-서양고추 냉이 퍼옥시다제 효소접합 항체를 100㎕/웰씩 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 인산염 완충액으로 세척하고 오르소-페닐렌 다이아민 기질를 가하여 반응성을 조사하였다.

실험결과 도 4에서 확인되는 바와같이 GT 273G-서양고추 냉이 퍼옥시다제 접합항체의 농도 1 : 1000 희석배수에서 가장 적합한 반응성을 나타내었다.

실시예 6 : 효소 면역법에 의한 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 측정법

N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 측정을 위한 효소 면역측정법을 확립하기 위하여 고상체로 마이크로 타이터 플레이트를 사용하였으며 GT 125M를 고상체에 결합시키고 GT 273G를 서양고추 냉이 퍼옥시다제효소에 결합시키는 샌드위치 효소면역법을 이용한다. 즉, 소 단위형이 IgM인 항체로부터 정제된 단일클론 항체 GT 125M(2㎍/㎖) 100㎕를 마이크로 타이터 플레이트에 코팅하였다. 하룻밤 방치한 후 3% 소혈청 알부민으로 차단한다. N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 각 농도별로 희석하여 각 웰당 100㎕씩 가한다. 2시간동안 반응시킨 후 서양고추 냉이 퍼옥시다제가 결합된 단일클론항체의 IgG (GT 273G)를 1 : 1000 희석하여 각 웰에 가한 후 1시간 동안 반응시킨다. 기질액을 각 웰에 가한 후 492nm에서 흡광도를 측정한다. 실험결과 도 5와 같은 결과를 얻었으며 본 발명의 분석법을 이용하면 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 80ng/㎖ - 10 ug/ml 까지 농도에서 효소면역법을 실시할 수 있다.

실시예 7 : N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 측정용 킷트 제조

N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 측정을 위한 측정용 킷트의 구성요소는 다음과 같다.

A(고상형 단일클론항체) : 단일클론항체가 결합된 마이크로 타이터 플레이트로서 소 단위형이 IgM인 항체로 부터 정제된 단일클론 항체 GT 125M(0.2㎍/㎖) 100㎕를 마이크로 타이터 플레이트에 코팅하여 24시간 방치한 후 3% 소혈청 알부민로 차단하여 제조한다.

B(효소접합 항체): 서양고추 냉이 퍼옥시다제가 결합된 단일클론항체 용액(GT 273G)

C : 오르소-페닐렌 다이아민(OPD) 기질액

D(세척액) : 트윈이 포함된 인산염 완충액

E(표준용액) : 정량적으로 혼합된 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 표준액

상기 킷트 구성성분을 이용하여 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 측정하는 방법은 다음과 같다.

제1단계 : A의 마이크로 타이터 플레이트에 시료를 웰당 100㎕씩 가한다.

제2단계 : 2시간 반응시킨 후 D의 세척액으로 3회 세척한 후 B의 서양고추 냉이 퍼옥시다제가 결합된 단일클론항체를 각 웰에 100㎕씩 가한다.

제3단계 : 1시간 후 D의 인산염 완충액으로 3회 세척한 후 C의 기질액을 각 웰에 100㎕씩 가한다.

제4단계 : 492nm에서 흡광도를 측정한다

제5단계 : 검정표에 의해 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ의 농도를 환산한다 (이때 N-아세틸 글루코사민전이효소III 80ng/㎖ - 10ug/ml 농도에서 측정가능하다.)

상기 단계별 측정 방법을 이용하여 환자 혈청 219개를 대상으로 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 측정하였을 때의 결과는 제 6도와 같다.

이상 실시예를 통하여 설명한 바와같이 본 발명은 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 활성도를 측정함에 있어서 간편한 진단 키트를 제공하여, 한꺼번에 다량의 시료를 측정하는 효과가 있으며 우리나라 성인병의 주요질환의 하나인 간염, 간경화 간암의 조기진단과 치료에 유효하게 사용할 수 있는 효과가 있어 생물의약산업상 매우 유용한 방법인 것이다.

Claims (9)

1. 당전이효소에 의한 간질환 진단 또는 간질환 치료용 단일클론항체의 용도.
2. 제1항에 있어서, 상기 당전이효소가 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ인 단일 클론 항체의 용도.
3. 에피토프가 다른 두 종류 이상의 단일클론항체을 이용하여 혈액과 조직내 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ를 측정하는 면역측정방법.
4. 제 3항에 있어서, 에피토프가 다른 고상형 단일클론항체를 제조한 후, 이를 사용하여 물질을 측정하는 면역측정방법.
5. 제 3항 있어서, 다른 에피토프를 지닌 단일클론항체에 표지물질을 사용하여 표지물질을 접합하여 물질을 측정하는 면역측정방법.
6. 제 5항에 있어서 표지물질이 효소인 면역측정방법.
7. 제 5항의 고상형 단일클론항체와 제 6항의 표지물질 접합항체가 포함된 N-아세틸 글로코사민 전이효소Ⅲ의 진단용 시약조성물.
8. 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 한 개의 킷트안에 하기 구성성분으로 이루어진 시약조성물 키트. 고상형 단일클론항체, 효소 접합항체용액, 효소기질액, 세척액, 표준용액(N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ).
9. N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론항체를 혈액 또는 조직 세포내의 N-아세틸 글루코사민 전이효소Ⅲ 농도를 결정하여 간질환 또는 암진단방법.