KR102674770B1 - 베타글루칸 가수분해물을 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역 기능을 증진하는데 이용 가능한 베타글루칸 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 면역 기능 증진용 식품 조성물은 베타글루칸 가수분해물을 포함함으로써 세포 내 사이토카인의 생산, 분비를 자극하여 우수한 면역 기능 증진 효과를 나타낼 수 있으며, 면역 기능을 증진, 강화하는 건강기능식품으로 제조될 수 있다.
Description
본 발명은 면역 기능을 증진하는데 이용 가능한 베타글루칸 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 경제발전으로 많은 사람들이 풍요로운 생활을 누리고 있는 반면, 식생활의 서구화와 활동량의 감소로 인해 체중증가 및 동맥경화, 고혈압, 당뇨병 등의 여러 성인병에 위험에 노출되고 있다. 이러한 성인병 질환 관련 환자 수가 급격히 증가하고 있을 뿐 아니라 질병에 걸리는 연령도 점차 낮아지고 있어 더욱 심각한 문제로 인식되고 있다.
또한, 인간의 삶의 질을 높이기 위해 만들어졌던 여러 화학물질들은 오히려 면역력을 떨어뜨리고, 예기치 못한 질병들을 초래하고 있다. 이에 따라, 전통적으로 우리 몸에 유익하다고 알려진 식재료 또는 약재료에 대해 새로운 방법으로 접근하여 신물질을 발견하거나, 또는 그 약리효과를 밝혀 이용하려는 시도가 증가하고 있다. 그 예로, 한국등록특허 제10-1484021호에는 울금, 자색고구마 및 뽕잎으로 구성된 복합물 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역저하증 보호용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1028155호에는 흑마늘과 개똥쑥을 이용한 면역증강용 음료의 제조방법이 개시되어 있다.
여기서 면역(immunity)이란, 피부, 소화관, 호흡기 등을 통해 침입한 외부물질(유해물질)로부터 신체를 보호하는 방어체계로서, 외부 자극물질을 제거하는 대식 작용을 통하거나, 상처에 발생한 심각한 염증을 줄이는 작용을 통해 인체 내 항상성을 유지하는 활동이다. 면역계는 크게 물리적 장벽, 내재면역, 적응면역의 3차 방어선을 지니고 있다. 상피조직, 리소자임(lysozyme), 프로테아제(protease), 정상균총(normal flora) 등에 의한 1차 방어선에서 제대로 병원균을 방어하지 못하면, 대식세포(macrophage), 자연살해세포(natural killer cell), 수지상세포(dendritic cell)에 의한 2차 방어선인 내재면역이 활성화되어 병원균을 저지하게 된다. 내재면역에 의해 제거되지 못한 병원체는 3차 면역방어선인 적응면역을 활성화시킴으로써, T 세포와 B 세포에 의한 면역글로불린의 생성과 사이토카인(cytokine)의 분비를 통해, 표적세포(target cell)를 파괴한다. 대식세포(macrophage)는 면역반응세포 중 하나로서 혈액, 비장, 간, 조직 및 림프절 등에 널리 분포되어 있으며, 미생물을 제거하는 식균작용뿐 아니라 표적세포를 제거하는 역할을 한다. 대식세포는 면역조절물질에 의해 자극 및 활성화되어 IFN-γ, TNF-α, 일산화질소(nitric oxide, NO) 등을 분비함으로써 미생물 및 표적세포를 제거할 수 있다.
이러한 면역 기능을 향상시키는 천연재료를 이용할 경우에는 세균성 감염이나 바이러스 감염 또는 암세포에 의한 질환의 치료, 예방 또는 개선이 가능하다. 특히, 이러한 천연재료는 화학 치료제의 사용에 의한 부작용 문제로부터 자유로울 수 있다는 장점이 있다.
따라서, 상대적으로 안전성에 대한 문제 발생이 적은 천연재료 중에서 면역 기능 향상 효과를 발휘할 수 있는 물질을 선택하여, 높은 면역 활성 효과를 나타내며 부작용이 적은 면역 기능 증진 성분을 함유하는 식품 조성물의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 베타글루칸 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 베타글루칸에 가수분해효소를 접촉하여 가수분해하는 단계를 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 베타글루칸 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
베타글루칸(β-glucan)은 D-글루코스(glucose) 단량체가 베타글리코사이드 결합(β-glycosidic bond) (베타-1,3, 베타-1,4 및 베타-1,6 결합)에 의해 연결된 중합체 형태의 다당류로, 베타-1,3 및 베타-1,6 결합을 갖는 베타글루칸이 베타-1,3 및 베타-1,4 결합을 갖는 베타글루칸에 비해 생물학적 활성이 더 우수한 것으로 알려져 있으나 베타글루칸은 큰 분자량으로 생체이용률이 높지 않다는 단점이 있다.
이러한 베타글루칸은 버섯, 효모 등 미생물의 세포벽이나 세포외 다당류에서 분리, 생산되는 미생물 유래 베타글루칸과 보리, 귀리, 갈조류 등 식물의 식이섬유에서 추출, 생산되는 식물성 베타글루칸으로 나눌 수 있다. 본 발명에서는 당 업계에 알려진 베타글루칸을 제한 없이 사용할 수 있으며, 일례로 베타-1,3 결합을 갖는 베타글루칸을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 베타글루칸은 커들란(curdlan)인 것일 수 있다.
상기 커들란은 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 종양균(Agrobacterium)에서 생산된 다당류를 분리 및 정제한 것으로, 젤리, 면류, 케이크, 식육가공품 등 다양한 식품 제조에 사용되는 식품첨가물로 알려져 있으며, 구하기 쉽고 단순하게 베타-1,3 결합의 구조로만 이루어져 있다는 이점이 있다.
이러한 베타글루칸은 글루코스 분자 간에 형성된 베타글리코사이드 결합을 절단하는 가수분해효소를 통해 단당류인 글루코스나 올리고당, 거대 당류, 다당류의 형태로 분해된다. 여기서, 올리고당(oligo-saccharide)이란 2 ~ 9개의 글루코스를 포함하는 당 고분자를 의미하며, 거대 당류(megalo-saccharide)는 올리고당보다 많은 10 ~ 100 개의 글루코스를 포함하는 당 고분자 (약 1.6 ~ 16 kDa)이며, 다당류(polysaccharide)는 분자량에 따라 저분자량 다당류 (약 16 kDa 초과)와 고분자량 다당류 (약 100 kDa 초과)로 구분할 수 있다. 저분자화된 베타글루칸은 세포 흡수가 용이하여 가수분해되지 않은 베타글루칸에 비해 생체이용률이 향상될 수 있다.
본 발명에서, 베타글루칸 가수분해물은 베타글루칸이 베타글루칸 가수분해효소 또는 β-글루카나아제(β-glucanase)로 가수분해되어 저분자화된 것일 수 있다. 이때, β-글루카나아제는 베타-1,3 결합, 베타-1,4 결합 또는 베타-1,6 결합에 각각 작용하거나, 또는 2종 이상의 결합에 작용하는 것일 수 있다. 상기 베타글루칸 가수분해물은 베타글루칸의 베타-1,3 결합이 분해되어 생성된 불용성 성분인 것이 바람직하다. 여기서, 불용성 성분이란, 물에 용해되지 않아 원심분리를 통해 펠렛 형태로 수득되는 물질을 의미하며, 본 발명에서의 불용성 성분은 물에 용해되는 올리고당을 제외한 거대 당류 및 다당류가 해당된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 베타글루칸 가수분해물은 베타글루칸이 β-1,3-글루카나아제(Glucanase), 펙티나아제(Pectinase), 글루코아밀라아제(Glucoamylase), α-아밀라아제(Amylase), 폴리갈락투로나아제(Polygalacturonase), β-글루카나아제(Glucanase), 마나나아제(Mannanase) 및 자일라나아제(xylanase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소에 의해 분해된 것일 수 있다.
이러한 베타글루칸 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 세포에서 TNF-α, IL-6와 같은 사이토카인의 분비를 증가시키는 것으로, 베타글루칸 가수분해물에 의한 면역 기능 활성 및 강화 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 사이토카인 생산 또는 분비를 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 베타글루칸 중 커들란을 β-1,3-글루카나아제로 가수분해한 경우에는 가수분해되지 않은 커들란에 비해 TNF-α 및 IL-6 생산량이 향상됨을 확인하였다. 또한, β-1,3-글루카나아제의 종류에 따라 베타글루칸 가수분해물 내 포함된 다당류의 분자량 크기가 상이하며, 이러한 분자량 크기 차이로 인해 사이토카인 TNF-α 및 IL-6 생산량에 대해서도 차이가 나타남을 확인하였다. 특히 베타글루칸 가수분해물이 거대 당류에 비해 고분자량 및 저분자량 다당류를 더 많이 포함하는 경우 면역 활성을 더 효과적으로 활성화시키는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 베타글루칸은 β-1,3-글루카나아제 활성이 알려지지 않은 31종의 종래 가수분해효소 중에서 β-1,3-글루카나아제 활성을 나타내는 11종의 상업용 효소를 발굴하였으며, 특히 아스퍼질러스 니제르(Aspergillus niger)에서 유래된 펙티나아제(Pectinase), 글루코아밀라아제(Glucoamylase), 폴리갈락투로나아제(Polygalacturonase) 및 α-아밀라아제(Amylase)와, 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)에서 유래된 β-글루카나아제(Glucanase) 및 자일라나아제(Xylanase)가 우수한 β-1,3-결합 가수분해 활성을 가지는 것을 확인하였다.
이러한 식품 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품첨가물을 포함할 수 있다. 상기 식품첨가물은 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당 업계에 알려진 식품첨가물을 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서는 식품 조성물의 성질을 크게 변화시키지 않고 식품 조성물의 면역 활성 효과를 보조하는 것이라면, 제한 없이 사용할 수 있다. 식품첨가물의 일예로는 다양한 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 들 수 있다.
상기 식품 조성물은 면역 기능 강화용으로 기능화된 건강기능식품으로 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이란, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
또한, 상기 식품 조성물은 각종 식품의 첨가물로 이용할 수 있다. 이러한 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 식품의 종류에 제한 없이 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 베타글루칸에 가수분해효소를 접촉하여 가수분해하는 단계를 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 베타글루칸은 전술한 베타글루칸의 설명과 동일하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 베타글루칸은 커들란인 것일 수 있다.
상기 가수분해효소는 베타글루칸 내 글루코스 분자 간의 결합을 절단하는 효소로서 절단 위치에 따라 β-1,3-글루카나아제, β-1,4-글루카나아제 및 β-1,6-글루카나아제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이와 유사한 활성을 가지는 효소라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 가수분해효소는 β-1,3-글루카나아제(Glucanase), 펙티나아제(Pectinase), 글루코아밀라아제(Glucoamylase), α-아밀라아제(Amylase), 폴리갈락투로나아제(Polygalacturonase), β-글루카나아제(Glucanase), 마나나아제(Mannanase) 및 자일라나아제(Xylanase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
이러한 베타글루칸에 가수분해효소를 접촉하여 가수분해하는 단계는 베타글루칸을 효율적으로 가수분해하기 위하여 베타글루칸 및 β-글루카나아제의 사용량, 반응 조건을 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 단계는 가수분해효소 100 ~ 2,000 mU를 포함하는 혼합물에 0.01 ~ 10%(w/v) 농도의 베타글루칸을 접촉하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 각 효소의 활성도(activity)를 고려하여 베타글루칸의 농도가 0.01 내지 10%(w/v), 0.01 내지 5%(w/v), 0.05 내지 10%(w/v), 0.05 내지 5%(w/v), 0.1 내지 10%(w/v), 또는 0.1 내지 5%(w/v)일 수 있다. 베타글루칸의 농도가 상기 범위에 미치지 못할 경우에는 기질이 부족하여 가수분해물의 수율이 적으며, 상기 범위를 벗어날 경우에는 상대적으로 효소 농도가 부족하여 가수분해 효율이 저하될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 단계는 35 내지 55℃, pH 4.0 내지 7.0의 조건에서 30분 내지 96시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 효소의 활성도를 고려하여 온도가 35 내지 55℃, 35 내지 50℃, 35 내지 45℃, 40 내지 55℃, 또는 40 내지 50℃일 수 있고, pH가 4.0 내지 7.0, 4.0 내지 6.0, 4.0 내지 5.0, 5.0 내지 7.0, 5.0 내지 6.0, 또는 6.0 내지 7.0일 수 있다.
이때, 반응 시간은 가수분해물의 생성이 최대에 도달할 때까지 지속되는 것이 바람직하며, 최적의 생산 효율을 나타내기 위해 0.5 내지 96시간, 0.5 내지 84시간, 0.5 내지 72시간, 0.5 내지 60시간, 0.5 내지 48시간, 0.5 내지 36시간, 0.5 내지 24시간, 0.5 내지 12시간, 0.5 내지 10시간, 또는 0.5 내지 6시간일 수 있다.
본 발명에서는 상기 베타글루칸에 가수분해효소를 접촉하여 생성된 베타글루칸 가수분해물을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 베타글루칸 가수분해물의 회수 단계는 당 업계에 알려진 적절한 회수 방법을 이용하여 베타글루칸으로부터 가수분해된 또는 저분자화된 다당류를 수집 또는 회수하는 것일 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 커들란과 가수분해효소를 접촉한 반응액을 고속 원심분리하여 글루코스나 저분자량의 다당류를 포함하는 상층액을 제거하고, 25개 이상의 글루코스로 이루어진 불용성 다당류를 포함하는 펠렛을 수득하였다.
본 발명의 일 구체예 따르면, 상기 베타글루칸 가수분해물의 회수 단계는 불용성 다당류를 정제하는 공정을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 기능 증진용 식품 조성물은 베타글루칸 가수분해물을 포함함으로써 세포 내 사이토카인의 생산, 분비를 자극하여 우수한 면역 기능 증진 효과를 나타낼 수 있으며, 면역 기능을 증진, 강화하는 건강기능식품으로 제조될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 (A) E1, (B) E2, (C) E3 및 (D) E4에 의해 가수분해된 커들란 가수분해물의 분자량 분포를 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 (A) E1, (B) E2, (C) E3 및 (D) E4에 의해 가수분해된 커들란 가수분해물에 의한 IL-6 및 TNF-a 생성을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 31종의 상업용 효소 (L1 ~ L21 및 P1 ~ P10)로부터 β-1,3-글루카나아제 활성을 가지는 효소를 선별하기 위해 아닐린 블루 염색을 수행한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 CE1 ~ CE11으로 (A) 2시간 및 (B) 72시간 가수분해된 커들란 가수분해물에 의한 IL-6 및 TNF-a 생성을 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 (A) E1, (B) E2, (C) E3 및 (D) E4에 의해 가수분해된 커들란 가수분해물에 의한 IL-6 및 TNF-a 생성을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 31종의 상업용 효소 (L1 ~ L21 및 P1 ~ P10)로부터 β-1,3-글루카나아제 활성을 가지는 효소를 선별하기 위해 아닐린 블루 염색을 수행한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 CE1 ~ CE11으로 (A) 2시간 및 (B) 72시간 가수분해된 커들란 가수분해물에 의한 IL-6 및 TNF-a 생성을 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 베타글루칸 가수분해물의 제조
베타글루칸 가수분해물을 제조하기 위해, 베타글루칸으로는 커들란을 사용하고, 가수분해효소로는 종래 β-1,3-글루카나아제로 알려진 하기 표 1에 기재된 효소를 사용하였다.
| 번호 | 효소명 | 제조사 | 기원(source) | 효소 활성 (U/mL) |
| E1 | Endo-β-1,3-Glucanase | Megazyme | Trichoderma sp. | 3.90±0.22 |
| E2 | Endo-β-1,3(4)-Glucanase | Megazyme | Clostridium thermocellum | 4.01±0.52 |
| E3 | Endo-β-1,3-Glucanase | Megazyme | Hordeum vulgare | 13.07±1.58 |
| E4 | Exo-β-1,3-Glucanase | - | Kribbella flavida | 5.25±0.33 |
효소 E1 ~ E3은 상업적으로 판매되는 효소를 구매하여 사용하였으며, 효소 E4는 재조합 효소로서 대장균에서 발현시켜 정제한 후 사용하였다.
각 효소 활성은 커들란 0.5 mg (0.5%, w/v)과 각 효소 10 μL가 함유된 100 mM 완충액 (pH 4.5 ~ 6.5) 100 μL를 40℃에서 10분간 반응한 후 100℃에서 10 분간 열처리하여 효소를 불활성화하고, 반응액을 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후 상층액에 대해 BCA(Bicinchoninic acid assay)를 수행하여 환원당을 정량하여 효소 활성을 측정하였다.
1-1. 커들란 가수분해물
커들란 500 mg (1%, w/v)과 1,500 mU 효소 E1 (30 mU/mL)가 함유된 100 mM 구연산 나트륨/구연산 완충액 (pH 4.5) 50 mL를 40℃에서 2, 8, 24, 72시간 반응하여 커들란 가수분해물을 제조하였다. 이후, 4,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)을 동결건조하여 실험에 이용하였다.
1-2. 커들란 가수분해물
효소 E1 대신 효소 E2를 사용하고, 구연산 나트륨/구연산 완충액 (pH 4.5) 대신 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)을 사용한 것을 제외하고는, 상기 1-1과 동일한 방법으로 커들란 가수분해물을 제조하였다.
1-3. 커들란 가수분해물
효소 E1 대신 효소 E3를 사용하고, 구연산 나트륨/구연산 완충액 (pH 4.5) 대신 구연산 나트륨/구연산 완충액 (pH 5.0)을 사용한 것을 제외하고는, 상기 1-1과 동일한 방법으로 커들란 가수분해물을 제조하였다.
1-4. 커들란 가수분해물
효소 E1 대신 효소 E4를 사용하고, 구연산 나트륨/구연산 완충액 (pH 4.5) 대신 구연산 나트륨/구연산 완충액 (pH 5.5)을 사용한 것을 제외하고는, 상기 1-1과 동일한 방법으로 커들란 가수분해물을 제조하였다.
실험예 1. 분자량 분포 측정
실시예 1에서 제조된 베타글루칸 가수분해물을 이용하여 가수분해효소에 의한 베타글루칸의 가수분해 정도를 확인하기 위해, 분자량 분포를 측정하였다.
베타글루칸 가수분해물의 분자량 분포는 2 개의 연속된 Shodex 컬럼 (KS-804 및 KS-802) 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 시료는 DMSO/물 (90/10; v/v)에 용해하여 사용하였다. 컬럼은 70℃로 유지하고, 이동상 (물)은 0.8 mL/min의 유속으로 사용하였다. 베타글루칸 가수분해물의 분자량 분포는 풀루란(pullulan) 표준물질 (Shodex P-82)과 비교하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 효소 E1 ~ E4는 약 2,000 kDa의 분자량을 갖는 커들란의 β-1,3 결합을 가수분해하여 거대 당류 또는 상대적으로 짧은 글루코스 사슬을 갖는 다당류 (약 16 kDa 초과)로 분해한 것으로 확인되었다.
실험예 2. 사이토카인의 생성 측정
실시예 1에서 제조된 베타글루칸 가수분해물에 의한 세포 내 면역 활성을 평가하기 위해, 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 생성을 효소면역분석법(ELISA)으로 측정하였다.
48웰-마이크로플레이트(48well-microplate)에 마우스의 골수로부터 분화한 대식세포(BMDM)를 2x105 cell/well로 분주한 후 각 베타글루칸 가수분해물 1 mg/mL을 처리하고 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 각 세포의 배양액을 회수한 후 IL-6, TNF-α ELISA 키트를 이용하여 사이토카인의 생성을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 커들란 가수분해물 (2 ~ 72h)은 효소 처리되지 않은 커들란 (0h)에 비해 IL-6 및 TNF-α 생산이 향상되었으며, 효소 처리 시간에 의존적으로 IL-6 및 TNF-α 생산이 유의미하게 증가한 것으로 확인되었다 (*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001). 특히, 효소 E3 및 E4는 효소 E1 및 E2에 비해 높은 면역 활성을 가지는 가수분해물을 생산할 수 있는 것으로, 도 1을 참조하면 커들란 가수분해물의 분자량에 따라 면역 활성이 상이함을 예상할 수 있으며 거대 당류(megalo saccharide)보다는 다당류(polysaccharide)가 면역 활성에 더 긍정적인 영향을 미치는 것을 알 수 있다.
이러한 결과는 베타글루칸 가수분해물이 면역 관련 사이토카인의 생성을 증가시켜 우수한 면역 기능 증진 및 강화 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
실시예 2. 베타글루칸 가수분해물의 제조
2-1. β-1,3-글루카나아제 활성을 가지는 효소 선별
β-1,3-글루카나아제 활성 여부에 대해 알려지지 않은 종래 가수분해효소를 대상으로 β-1,3-글루카나아제 활성을 가지는 효소를 선별하기 위해, 베타글루칸으로는 커들란을 사용하고, 가수분해효소로는 31종의 상업용 효소를 사용하여 아닐린 블루(Aniline blue) 염색을 수행하였다.
아닐린 블루는 베타-1,3-글루칸과 결합하여 푸른색을 띄는 것을 특징으로 하는 지시약으로, 이를 이용하여 베타글루칸 분해 효소를 보다 쉽고 간편하게 탐색할 수 있다.
200 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 5.8)에 커들란 10 g/L, 아닐린 블루 0.05 g/L 및 한천(agar) 20 g/L을 첨가하여 잘 혼합한 후 기포가 생기지 않게 플레이트에 붓고 굳혀서 고체배지를 제조하였다. 고체배지에 각 상업용 효소를 10 μL씩 점적하고, 50℃에서 5일간 반응하여 생성된 활성환의 유무, 크기로 β-1,3-글루카나아제 활성이 있는 효소를 선별하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 31종의 상업용 효소 (L1 ~ L21 및 P1 ~ P10) 중 활성환 크기가 큰 순서대로 11종의 상업용 효소 (하기 표 2 참조)를 선택하였고, 그 효소들을 베타글루칸 가수분해물을 제조하는데 사용하였다.
| 번호 | 효소명 | 제조사 | 구성 효소 | 기원(source) | 효소 활성 (U/mL) |
| CE1 | AMS 30046 | Novozymes | - | - | 5.83±2.54 |
| CE2 | Cytolase PCL5 | DSM | Pectinase | Aspergillus niger | 5.48±0.31 |
| CE3 | Dextrozyme DX 1.5X | Novozymes | Glucoamylase | Aspergillus niger | 6.95±3.42 |
| CE4 | Mycolase | DSM | α-Amylase | Aspergillus niger | 2.42±0.53 |
| CE5 | Pectinex Ultra Pulp | Novozymes | Polygalacturonase | - | 5.96±0.30 |
| CE6 | Pectinex Ultra SP-L | Novozymes | Polygalacturonase | Aspergillus niger | 8.33±0.85 |
| CE7 | Viscozyme L | Novozymes | β-Glucanase* | Aspergillus niger | 35.33±7.02 |
| CE8 | Ultraflo L | Novozymes | β-Glucanase* | Humicola insolens | 1.53±0.25 |
| CE9 | Econase MP1000 | Bision Biochem | Mannanase | - | 19.39±2.81 |
| CE10 | Fungamyl Ultra BG | DaeJong Enzyme | α-Amylase | Aspergillus niger | 5.32±3.78 |
| CE11 | Pentopan 500BG | Novozymes | Xylanase | Humicola insolens | 1.15±0.51 |
| * β-Glucanase는 베타글루칸의 β-결합 (β-1,3-, β-1,4-, β-1,6-결합 등)을 가수분해하는 효소이다. | |||||
각 효소 활성을 측정하기 위해, 커들란 0.5 mg (0.5%, w/v)과 각 효소 1 μL가 함유된 100 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 5.8) 100 μL를 50℃에서 10분간 반응한 후 100℃에서 10 분간 열처리하여 효소를 불활성화하고, 반응액을 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후 상층액에 대해 BCA(Bicinchoninic acid assay)를 수행하여 환원당을 정량하였다.
2-2. 커들란 가수분해물
커들란 500 mg (1%, w/v)과 1,500 mU 효소 CE1 (30 mU/mL)가 함유된 100 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 5.8) 50 mL를 50℃에서 2, 72시간 반응시켜 커들란 가수분해물을 제조하였다. 이후, 4,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)을 동결건조하여 실험에 이용하였다.
2-3 ~ 2-12. 커들란 가수분해물
효소 CE1 대신 효소 CE2 ~ CE11를 사용한 것을 제외하고는, 상기 2-2와 동일한 방법으로 커들란 가수분해물을 제조하였다.
실험예 3. 사이토카인의 생성 측정
실시예 2에서 제조된 베타글루칸 가수분해물에 의한 세포 내 면역 활성을 평가하기 위해, 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 생성을 효소면역분석법(ELISA)으로 측정하였다. 그 측정 방법은 실험예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 2시간 및 72시간 가수분해된 커들란 가수분해물은 효소 처리되지 않은 커들란 (NT)에 비해 IL-6 및 TNF-α 생산이 향상된 것을 확인되었다. 효소 CE1 ~ CE6, CE8 ~ CE11에 의해 가수분해된 커들란 가수분해물은 IL-6 및 TNF-α 생산량이 유의미하게 증가되었으며 (*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001), 특히 효소 CE2, CE3, CE6, CE8, CE10 및 CE11은 커들란과의 반응 시간에 관계 없이 높은 면역 활성을 가지는 가수분해물을 생산할 수 있음을 알 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (9)
- 베타글루칸 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물로서;
상기 베타글루칸은 커들란인 것이며,
상기 베타글루칸 가수분해물은 베타글루칸이 아스파질러스 니게르(Aspergillus niger) 유래 펙티나아제(Pectinase), 아스파질러스 니게르 유래 글루코아밀라아제(Glucoamylase), 아스파질러스 니게르 유래 α-아밀라아제(Amylase), 아스파질러스 니게르 유래 폴리갈락투로나아제(Polygalacturonase) 및 휴미콜라 인솔렌스 유래 자일라나아제(xylanase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소에 의해 분해된 것이며,
상기 식품 조성물은 사이토카인으로서 IL-6 및 TNF-α의 생산 또는 분비를 증가시키는 것이고,
상기 가수분해물은, 가수분해효소 100 ~ 2,000 mU를 포함하는 혼합물에 0.1 ~ 5%(w/v) 농도의 베타글루칸을 40 내지 50℃ 및 pH 5.0 내지 6.0의 조건에서 2 내지 72시간 동안 접촉하여 수득되는 것인, 조성물.
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- 베타글루칸에 가수분해효소를 접촉하여 가수분해하는 단계를 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물의 제조방법으로서;
상기 베타글루칸은 커들란인 것이며,
상기 가수분해효소는 아스파질러스 니게르(Aspergillus niger) 유래 펙티나아제(Pectinase), 아스파질러스 니게르 유래 글루코아밀라아제(Glucoamylase), 아스파질러스 니게르 유래 α-아밀라아제(Amylase), 아스파질러스 니게르 유래 폴리갈락투로나아제(Polygalacturonase) 및 휴미콜라 인솔렌스 유래 자일라나아제(xylanase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이며,
상기 식품 조성물은 사이토카인으로서 IL-6 및 TNF-α의 생산 또는 분비를 증가시키는 것이고,
상기 단계는 가수분해효소 100 ~ 2,000 mU를 포함하는 혼합물에 0.1 ~ 5%(w/v) 농도의 베타글루칸을 접촉하고, 40 내지 50℃ 및 pH 5.0 내지 6.0의 조건에서 2 내지 72시간 동안 수행되는 것인, 제조방법.
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| CARBOHYDRATE POLYMER 제87권 제3호, 2362_2364쪽, 2012년 02월 14일. |
| INFLAMMATION RESEARCH 제58권 9_14쪽, 2009년 01월 08일. |
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