KR102612950B1 - 센서 장치 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기판과 전기적으로 연통되는 곤충 취기물질 수용체(OrX)를 포함하는 센서 장치에 관한 것으로서, 상기 센서 장치는 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성된다. 본 발명은 또한 기판과 전기적으로 연통하는 곤충 취기물질 수용체(OrX)를 포함하는 센서 장치 구성요소를 제공한다. 본 발명은 또한 센서 장치 및 센서 장치 구성요소의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 분석물을 검출하기 위해 센서를 사용하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 분석물을 검출하기 위한 센서 및 방법에 관한 것이다.
휘발성 유기 화합물(VOC) 및 가용성 유기 화학 물질과 같은 분석물의 실시간 검출은 식품 안전성 및 수질뿐만 아니라 건강 및 환경 모니터링에 있어 중요한 과제이며, 저렴하고 신속한 분석물 센서를 개발할 강력한 동인이 있다.
편리하고 민감하며 특정한 분석물 센서는 식품 품질/안전성(맛, 숙성, 오염 및 부패), 생물학적 안전(해충 및 질병), 환경 모니터링(위험한 오염 물질), 의학 진단(예: 호흡 진단) 및 보안(불법 화합물 및 폭발물)과 관련된 분석물 모니터링을 비롯하여 다양한 용도를 갖는다.
곤충 후각 수용체(OR)는 VOC를 포함한 광범위한 천연 및 합성 화학 물질을 구별할 수 있다. 곤충 OR은 이종 리간드 의존성 양이온 채널(도 1)로 기능하며, Orco로 알려진 필수 공동 수용체 및 취기물질-특이적 조절 수용체(OrX)로 구성된다.
곤충 OR은 구조적으로나 기능적으로 G 단백질-결합 수용체(GPCR)로서 기능하는 포유류 및 카에노하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) OR과 매우 다르다.
많은 저자들이 제노푸스(Xenopus) 난모세포2, 곤충 세포주3 및 인간 HEK293 세포4를 사용하여 곤충 OR 기능1에 대한 세포 기반 검정을 설명했다. 그러나, 이들의 용도는 주로 해충 OR의 화합물 특이성을 확인하는 것으로 제한되었으며, 일부는 해충 거동 방제5를 위한 활성화 및 저해 화합물을 확인하는데 사용된다.
공개된 다수의 특허 문서는 곤충 OR 세포 검정6-11을 기술하고 있다. 이들 모두는 해충 방제를 위한 신규 활성화 및 저해 화합물 분석을 위한 접근법을 다룬다. 세포 기반 센서의 관점에서, 두 개의 간행물12, 13은 세포 기반 센서 포맷에서 곤충 OR을 발현하는 세포주의 사용을 기술한다. 한 간행물은 두 전극 전압 클램프 방법12을 사용하여 취기물질을 검출하기 위해 곤충 OR로 형질감염된 제노푸스 난모세포의 사용을 보여주는 반면, 다른 간행물13은 페로몬 수용체(유리 미세유체 칩에서 성장됨) 및 페로몬 결합(형광 현미경을 이용한 칼슘 이미징에 의해 검출됨)을 발현하는 세포주를 기술한다.
위에서 설명한 모든 곤충 OR 기반 시스템/센서에는 곤충 OrX와 관련 Orco가 포함된다.
상업적으로 이용가능한 휴대용 휘발물질 감지 기술은 감도 및 특이성 측면에서 곤충 후각 시스템보다 성능이 훨씬 떨어지는 전자/화학 전자-코(e-nose)로 국한된다. 또한, 본 발명자들의 지식 한도 내에서는, 위에서 설명한 곤충 OR 기반 시스템을 기반으로 한 상용 제품이 없다. 이온 이동도 분광계 및 질량 분광계와 같은 다른 기술은 전자-코보다 향상된 감도 및 특이성을 제공하지만, 구매 비용이 매우 높고 광범위한 사용자 교육이 필요하며 이동이 쉽지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 적어도 하나의 곤충 수용체를 이용하고/하거나 적어도 대중에게 유용한 선택을 제공하는 개선된 센서 장치를 제공하는 것이다.
본 발명은 센서의 디스플레이 표면/기판에 결합된 곤충 OrX를 포함하는 센서 장치를 제공한다. 본 발명자들의 지식 한도 내에서는, 정제된 곤충 OrX가 센서 디스플레이 표면/기판에 기능적으로 고정된 것은 이번이 처음이다.
본 발명자들은 놀랍게도 신규 센서가 이전에 사용된 곤충 OR 기반 시스템에 비해 감도에서 매우 상당한 증가를 제공한다는 것을 보여주었다. 더욱 놀랍게도, 본 발명자들은 신규 센서가 Orco 없이도 기능적이라는 것을 보여주었다.
센서 장치
제 1 양태에서, 본 발명은 기판과 전기적으로 연통되는 곤충 취기물질 수용체(OrX)를 포함하는 센서 장치를 제공하며, 센서 장치는 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성된다.
한 실시양태에서, 전기적 특징의 변화는 OrX와 분석물 사이의 상호작용에 기인한다.
추가의 실시양태에서, 상호작용은 분석물이 OrX에 결합하는 것이다.
추가의 실시양태에서, 분석물은 OrX에 상보적이다.
추가의 실시양태에서, 분석물과 OrX 사이의 상호작용은 특이적이다.
분석물의 검출
따라서, 한 실시양태에서, 센서는 기판의 전기적 특징의 변화를 검출함으로써 분석물의 OrX에 대한 결합을 검출할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 결합하는 분석물의 존재를 환경에서 검출할 수 있다.
바람직하게는, 검출은 분석물에 대해 특이적이다.
전기적 연통
한 실시양태에서, 전기적 연통은 수용체가 기판의 전기적 특징에 영향을 줄 수 있음을 의미한다.
추가의 실시양태에서, 분석물과 OrX 사이의 상호작용은 OrX에서의 구조 변화를 초래한다.
추가의 실시양태에서, OrX에서의 구조 변화는 기판의 전기적 특징의 변화를 야기한다.
OrX의 기판으로의 연결
추가의 실시양태에서, OrX는 기판에 연결된다.
OrX의
프리젠테이션
추가의 실시양태에서, OrX는 분석물과의 상호작용에 반응하여 구조 변화를 겪을 수 있는 형태로 존재한다.
추가의 실시양태에서, OrX는 막 모방체에 존재한다.
막 모방체는 리포좀, 양극자(amphipole), 세제 미셀(micelle), 나노소포체(nanovesicle), 지질 이중층 및 나노디스크로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 막 모방체는 인공적인 것이다.
OrX는 또한 이온성 또는 비이온성일 수 있는 계면활성제에도 존재할 수 있다.
검출 감도
한 실시양태에서, 센서는 1×10-3M 미만, 바람직하게는 1×10-3M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-4M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-5M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-6M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-7M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-8M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-9M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-10M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-11M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-12M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-13M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-14M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-15M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-16M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-17M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-18M 미만의 농도에서 분석물의 존재를 검출할 수 있다.
센서 장치에서의 Orco의 결여
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 취기물질 공동 수용체(Orco)를 포함하지 않는다.
기판
한 실시양태에서, 기판은 전극, 반도체 물질, 탄소 나노튜브(CNT), 그래핀, 산화물, 도핑된 규소, 전도성 중합체, 공진기 구성요소중 적어도 하나로부터 선택되거나 이들중 적어도 하나로 구성된다.
한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 압전 물질, 적어도 하나의 압전 결정, 수정이거나 이들로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 수정 공진자이다.
전기적 특징
한 실시양태에서, 전기적 특징은 도전율, 저항, 복합 저항, 임피던스, 전기 화학적 임피던스, 전류의 흐름, 및 교번 전기장에 의해 유도된 진동의 공진 주파수 중 적어도 하나로부터 선택된다.
검출기 구성요소
다른 실시양태에서, 센서는 기판의 전기적 특징의 변화를 측정하는 검출기 구성요소를 포함한다.
전기 화학적 임피던스 분광법(EIS) 센서 장치
센서 장치의 한 실시양태에서, 기판은 전기 화학 전지의 작동 전극이다.
한 실시양태에서, 전기 화학 전지는 작동 전극 이외에 대전극을 더 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 전기 화학 전지는 기준 전극을 더 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 전기 화학 전지는 포텐시오스탯(potentiostat)을 더 포함한다.
다른 실시양태에서, 전기적 특징은 전기 화학적 임피던스이다.
따라서, 한 실시양태에서, 센서 장치는 전기 화학 전지의 작동 전극과 전기적으로 연통되는 OrX를 포함하며, 센서 장치는 작동 전극의 전기 화학적 임피던스의 변화를 검출하도록 구성된다.
EIS 센서 장치의 작동 전극
한 실시양태에서, 작동 전극은 금으로 구성되거나 금으로 코팅된다.
EIS 센서 장치에서의 OrX의 프리젠테이션
OrX는 상기 기술된 바와 같이 막 모방체에 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, OrX는 리포좀에 존재한다.
추가의 실시양태에서, OrX는 인공 리포좀에 존재한다.
추가의 실시양태에서, OrX는 지질 이중층에 존재한다.
추가의 실시양태에서, OrX는 인공 지질 이중층에 존재한다.
추가의 실시양태에서, OrX는 나노디스크에 존재한다.
곤충 OrX와 EIS 센서 장치의 전극의 연결
한 실시양태에서, 곤충 OrX는 작동 전극에 연결된다.
추가의 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커 분자를 통해 작동 전극에 연결된다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 OrX와 전극 사이의 전기적 연통을 허용하기에 충분히 짧다.
한 실시양태에서, 링커 분자는 수용체로부터의 전극의 단리를 방지하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 16-머캅토헥사데칸산(16-MHDA), 6-머캅토헥사데칸산(6-MHDA) 및 6-머캅토헥산산(MHA)으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 링커 분자는 6-머캅토헥산산(MHA)이다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 SAM(Self-Assembled Mono) 층의 일부이다.
따라서, 한 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커 분자로 구성된 SAM 층을 통해 전극에 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 곤충 OrX는 6-머캅토헥산산(MHA) 링커 분자로 구성된 SAM 층을 통해 전극에 연결된다.
EIS 센서에서의 분석물의 검출
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 대한 분석물의 결합을 검출할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 결합하는 분석물의 존재를 환경에서 검출할 수 있다.
바람직하게는, 검출은 분석물에 대해 특이적이다.
추가의 실시양태에서, 곤충 OrX로의 분석물의 결합은 작동 전극의 전기 화학적 임피던스를 변화시킨다.
바람직한 실시양태에서, 작동 전극의 전기 화학적 임피던스는 분석물이 곤충 OrX에 결합할 때 감소한다.
바람직한 실시양태에서, 센서에 의해 검출되는 분석물의 양 또는 곤충 OrX에 대한 결합이 변화함에 따라, 작동 전극의 전기 화학적 임피던스는 감소한다.
검출기 구성요소
다른 실시양태에서, 센서는 검출기 구성요소를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 검출기 구성요소는 작동 전극의 전기 화학적 임피던스의 변화를 검출하거나 측정한다.
반도체 기반 센서 장치
센서 장치의 한 실시양태에서, 기판은 반도체 물질이다. 임의의 적합한 반도체 물질이 사용될 수 있다.
센서 장치의 한 실시양태에서, 반도체 물질은 그래핀, 산화물, 도핑된 규소, 전도성 중합체 및 탄소 나노튜브(CNT)중 적어도 하나이거나 이들중 적어도 하나로 구성된다.
탄소 나노튜브-전계 효과 트랜지스터(CNT-FET) 센서 장치
한 실시양태에서, 기판은 탄소 나노튜브(CNT)로 구성된다. 탄소 나노튜브(CNT)는 단일 벽, 이중 벽 또는 다중 벽, 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 탄소 나노튜브(CNT)는 단일 벽이다.
추가의 실시양태에서, 기판은 탄소 나노튜브-전계 효과 트랜지스터(CNT-FET) 장치의 채널을 형성한다.
한 실시양태에서, CNT-FET 장치는 소스 전극 및 드레인 전극을 포함한다.
다른 실시양태에서, 채널은 소스 전극과 드레인 전극 사이에서 발견되거나 형성된다.
다른 실시양태에서, 채널은 소스 전극 및 드레인 전극과 전기적으로 연통된다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 탄소 나노튜브-전계 효과 트랜지스터(CNT-FET) 장치의 채널에서 적어도 하나의 탄소 나노튜브와 전기적으로 연통되는 곤충 취기물질 수용체(OrX)를 포함하는 센서 장치를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 탄소 나노튜브-전계 효과 트랜지스터(CNT-FET) 장치는 또한 게이트 전극을 포함한다.
CNT-FET 센서 장치에서의 OrX의 프리젠테이션
OrX는 상기 기술된 바와 같이 막 모방체에 존재할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, OrX는 나노디스크에 존재한다.
탄소 나노튜브(CNT)로의 OrX의 연결
한 실시양태에서, OrX는 채널에서 탄소 나노튜브에 연결된다.
다른 실시양태에서, 연결은 OrX를 탄소 나노튜브와 전기적으로 연통시킨다.
곤충 OrX 작용화
한 실시양태에 있어서, 곤충 OrX는 CNT로의 연결을 용이하게 하기 위해 작용화된다.
한 실시양태에서, 곤충 OrX는 his-태그로 작용화된다.
따라서, 한 실시양태에서, OrX는 his-태그를 포함한다.
바람직하게는, his-태그는 OrX 단백질의 N-말단에 있다
CNT 작용화
한 실시양태에서, CNT는 곤충 OrX로의 연결을 용이하게 하기 위해 작용화된다.
추가의 실시양태에서, CNT는 니켈(Ni)-니트릴로트리아세트산(NTA)으로 작용화된다.
연결
추가의 실시양태에서, OrX는 his-태그 친화성 결합을 통해 CNT에 연결된다.
따라서, 한 실시양태에서, his-태그된 OrX는 Ni-NTA 작용화된 CNT에 결합한다.
CNT-FET 센서에서의 분석물 검출
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 대한 분석물의 결합을 검출할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 결합하는 분석물의 존재를 환경에서 검출할 수 있다.
바람직하게는, 분석물의 검출은 특이적이다.
추가 실시양태에서, 곤충 OrX에 대한 분석물의 결합은 CNT-FET 장치에서 소스-게인 전류를 변경시킨다.
바람직한 실시양태에서, 소스-게인 전류는 곤충 OrX에 분석물이 결합할 때 감소한다.
바람직한 실시양태에서, 센서에 의해 검출된 분석물의 양 또는 곤충 OrX에 대한 결합이 증가함에 따라 소스-게인 전류는 더 감소한다.
검출기 구성요소
다른 실시양태에서, 센서는 검출기 구성요소를 포함한다. 다른 실시양태에서, 검출기 구성요소는 소스-드레인 전류의 변화를 검출하거나 측정한다.
수정 미세저울(QCM) 센서 장치
센서 장치의 한 실시양태에서, 기판은 수정 미세저울의 공진기 구성요소가다.
한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 압전 물질, 적어도 하나의 압전 결정 및 적어도 하나의 수정이거나 이들로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 수정 공진자이다.
한 실시양태에서, 수정은 금으로 코팅된다.
전기적 특징
한 실시양태에서, 전기적 특징은 공진기 구성요소에 인가되는 교번 전기장에 의해 유도되는 진동의 공진 주파수이다.
QCM 센서 장치의 전극
한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 그 대향면중 2개에 부착된 전극에 있다.
한 실시양태에서, 전극은 금으로 구성되거나 금으로 코팅된다.
QCM 센서 장치에서의 OrX의 프리젠테이션
OrX는 상기 기술된 바와 같이 막 모방체에 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, OrX는 리포좀에 존재한다.
추가의 실시양태에서, OrX는 인공 리포좀에 존재한다.
추가의 실시양태에서, OrX는 지질 이중층에 존재한다.
추가의 실시양태에서, OrX는 인공 지질 이중층에 존재한다.
바람직한 실시양태에서, OrX는 리포좀에 존재한다.
곤충 OrX와 QCM 센서 장치의 공진기 구성요소의 연결
한 실시양태에서, 곤충 OrX는 공진기 구성요소에 결합된다.
추가의 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커 분자를 통해 공진기 구성요소에 연결된다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 OrX와 공진기 구성요소 사이의 전기적 연통을 허용하기에 충분히 짧다.
한 실시양태에서, 링커 분자는 수용체로부터의 공진기 구성요소의 단리를 방지하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 16-머캅토헥사데칸산(16-MHDA), 6-머캅 토헥사데칸산(6-MHDA) 및 6-머캅토헥산산(MHA)으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 링커 분자는 6-머캅토헥산산(MHA)이다.
추가의 실시양태에서, 링커는 SAM의 일부이다.
따라서, 한 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커 분자로 구성된 SAM 층을 통해 공진기 구성요소에 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 곤충 OrX는 6-머캅토헥산산(MHA) 링커 분자로 구성된 SAM 층을 통해 공진기 구성요소에 연결된다.
QCM 센서를 사용한 분석물 검출
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 대한 분석물의 결합을 검출할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 결합하는 분석물의 존재를 환경에서 검출할 수 있다.
바람직하게는, 검출은 분석물에 대해 특이적이다.
추가 실시양태에서, 곤충 OrX에 대한 분석물의 결합은 공진기 구성요소에 인가되는 교번 전기장에 의해 유도되는 공진 주파수를 변경시킨다.
한 실시양태에서, 공진 주파수는 곤충 OrX에 분석물이 결합할 때 증가한다.
추가의 실시양태에서, 공진 주파수는 곤충 OrX에 분석물이 결합할 때 감소한다.
검출기 구성요소
다른 실시양태에서, 센서는 검출기 구성요소를 포함한다. 다른 실시양태에서, 검출기 구성요소는 공진기 구성요소에 인가되는 교번 전기장에 의해 유도되는 공진기 구성요소의 공진 주파수의 변화를 검출하거나 측정한다.
한 실시양태에서, 검출기 구성요소는 주파수 분석기이다.
본 발명의 센서 장치를 사용하여 분석물 결합을 검출하는 방법
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 a) 본 발명의 센서에서 곤충 OrX에 분석물을 결합시키는 단계, b) 기판의 전기적 특징에서의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 분석물을 검출하는 방법을 제공하고, 이 때 상기 기판의 전기적 특징의 변화는 분석물의 검출을 나타낸다.
본 발명의 센서 장치를 사용하여 환경에서의 분석물의 존재를 검출하는 방법
또 다른 형태에 있어서, 본 발명은 a) 본 발명의 센서를 분석물을 함유하는 환경에 노출시키는 단계, b) 센서 내의 곤충 OrX에 분석물을 결합시키는 단계, c) 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 환경에서 분석물의 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 이 때 기판의 전기적 특징의 변화는 환경에서의 분석물의 존재를 나타낸다.
본 발명의 EIS 센서 장치를 사용하여 분석물 결합을 검출하는 방법
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 a) 본 발명의 전기 화학 전지에서 곤충 OrX에 분석물을 결합시키는 단계, b) 작동 전극에서의 전기 화학적 임피던스의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 분석물을 검출하는 방법을 제공하고, 이 때 전기 화학적 임피던스의 변화는 분석물의 검출을 나타낸다.
본 발명의 EIS 센서 장치를 이용하여 환경에서의 분석물의 존재를 검출하는방법
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 a) 본 발명의 센서를 분석물을 함유하는 환경에 노출시키는 단계, b) 본 발명의 전기 화학 전지에서 곤충 OrX에 분석물을 결합시키는 단계, c) 작동 전극의 전기 화학적 임피던스의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 환경에서 분석물의 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 이 때 전기 화학적 임피던스의 변화는 환경에서의 분석물의 존재를 나타낸다.
본 발명의 CNT-FET 센서 장치를 사용하여 분석물 결합을 검출하는 방법
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 a) 본 발명의 센서에서 곤충 OrX에 분석물을 결합시키는 단계, b) CNT-FET 장치에서 소스-게인 전류의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 분석물을 검출하는 방법을 제공하고, 이 때 소스-게인 전류의 변화는 분석물의 검출을 나타낸다.
본 발명의 CNT-FET 센서 장치를 사용하여 환경에서의 분석물의 존재를 검출하는 방법
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 a) 본 발명의 센서를 분석물을 함유하는 환경에 노출시키는 단계, b) 센서 내의 곤충 OrX에 분석물을 결합시키는 단계, c) CNT-FET 장치에서 소스-게인 전류의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 환경에서 분석물의 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 이 때 소스-게인 전류의 변화는 환경에서 분석물의 존재를 나타낸다.
본 발명의 QCM 센서 장치를 사용하여 분석물 결합을 검출하는 방법
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 a) 본 발명의 센서에서 곤충 OrX에 분석물을 결합시키는 단계, b) QCM 장치에서 공진기 구성요소에 인가되는 교번 전기장에 의해 유도되는 공진기 구성요소의 공진 주파수의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 분석물을 검출하는 방법을 제공하고, 이 때 상기 공진 주파수의 변화는 상기 분석물의 검출을 나타낸다.
본 발명의 QCM 센서 장치를 사용하여 환경에서 분석물의 존재를 검출하는 방법
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 d) 본 발명의 센서를 분석물을 함유하는 환경에 노출시키는 단계, e) 센서에서 곤충 OrX에 분석물을 결합시키는 단계, f) QCM 장치에서 공진기 구성요소에 인가되는 교번 전기장에 의해 유도되는 공진기 구성요소의 공진 주파수의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 환경에서 분석물의 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 이 때 공진 주파수의 변화는 환경에서 분석물의 존재를 나타낸다.
본 발명의 센서 장치의 제조 방법
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 곤충 OrX와 센서 장치의 기판 사이에서 전기적 연통을 확립하는 단계를 포함하는 센서 장치 제조 방법을 제공하고, 이 때 센서 장치는 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 곤충 OrX를 기판에 연결시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, OrX 연결 기판이 센서 장치 내에 조립되기 전에, OrX가 기판에 연결된다.
바람직하게는, 센서의 구성요소, 연결 및 기능성은 본원에 기술된 바와 같다.
본 발명의 EIS 센서 장치의 제조 방법
실시양태에서, 기판은 본원에 기재된 전기 화학 전지의 작동 전극이다.
따라서, 한 실시양태에서, 방법은 곤충 OrX와 전기 화학 전지의 작동 전극 사이에서 전기적 연통을 설정하는 단계를 포함하고, 이 때 전기 화학 전지는 작동 전극의 전기 화학적 임피던스의 변화를 검출하여 센서 장치를 형성하도록 구성된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 곤충 OrX를 작동 전극에 연결시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, OrX 연결된 작동 전극이 센서 장치에 조립되기 전에, OrX가 작동 전극에 연결된다.
바람직하게는, 센서의 구성요소, 연결 및 기능성은 본원에 기술된 바와 같다.
곤충 OrX와 전극의 연결
추가의 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커를 통해 전극에 연결된다.
한 실시양태에서, 링커 분자는 OrX와 전극 사이의 전기적 연통을 허용하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 수용체로부터의 전극의 단리를 방지하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 16-머캅토헥사데칸산(16-MHDA), 6-머캅토헥사데칸산(6-MHDA) 및 6-머캅토헥산산(MHA)으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 링커 분자는 6-머캅토헥산산(MHA)이다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 SAM 층의 일부이다.
따라서, 한 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커 분자로 구성된 SAM 층을 통해 전극에 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 곤충 OrX는 6-머캅토헥산산(MHA) 링커 분자로 구성된 SAM 층을 통해 전극에 연결된다.
추가의 실시양태에서, 링커 또는 MHA의 카복실기의 활성화는 곤충 OrX의 연결 전에 수행된다.
바람직하게는, 링커 또는 MHA의 카복실기의 활성화는 곤충 OrX를 전극에 연결시키기 전에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)의 용액을 사용하여 수행된다.
센서 장치에서의 Orco의 결여
바람직한 실시양태에서, 센서는 곤충 취기물질 공동 수용체(Orco)를 포함하지 않는다.
본 발명의 CNT-FET 센서 장치의 제조 방법
실시양태에서, 기판은 본원에 기술된 바와 같은 CNT-FET 장치의 채널이다.
따라서, 한 실시양태에서, 방법은 곤충 OrX와 CNT-FET 장치의 채널 사이에서 전기적 연통을 확립하는 단계를 포함하고, 이 때 CNT-FET 장치는 CNT-FET 장치의 소스-게인 전류의 변화를 검출하여 센서장치를 형성하도록 구성된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 곤충 OrX를 채널에 연결시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, OrX 연결 채널이 센서 장치에서 조립되기 전에, OrX가 채널에 연결된다.
바람직하게는, 센서의 구성요소, 연결 및 기능성은 본원에 기술된 바와 같다.
탄소 나노튜브(CNT)로의 OrX의 연결
한 실시양태에서, OrX는 채널 내의 탄소 나노튜브에 연결된다.
곤충 OrX 작용화
한 실시양태에 있어서, 곤충 OrX는 CNT로의 연결을 용이하게 하기 위해 작용화된다.
한 실시양태에서, 곤충 OrX는 his-태그로 작용화된다.
따라서, 한 실시양태에서, OrX는 his-태그를 포함한다.
바람직하게는, his-태그는 OrX 단백질의 N-말단에 있다.
CNT 작용화
한 실시양태에서, CNT는 곤충 OrX로의 연결을 용이하게 하기 위해 작용화된다.
추가의 실시양태에서, CNT는 니켈(Ni)-니트릴로트리아세트산(NTA)으로 작용화된다.
연결
추가의 실시양태에서, OrX는 his-태그 친화성 결합을 통해 CNT에 연결된다.
따라서, 한 실시양태에서, his-태그가 붙은 OrX는 Ni-NTA 작용화된 CNT에 결합한다.
센서 장치에서의 Orco의 결여
바람직한 실시양태에서, 센서는 곤충 취기물질 공동 수용체(Orco)를 포함하지 않는다.
본 발명의 QCM 센서 장치의 제조 방법
실시양태에서, 기판은 수정 미세저울의 수정 공진자이다.
따라서, 한 실시양태에서, 방법은 곤충 OrX와 수정 미세저울의 공진기 구성요소 사이에서 전기적 연통을 확립하는 단계를 포함하고, 이 때 수정 미세저울은 QCM 장치 내의 공진기 구성요소에 인가되는 교번 전기장에 의해 유도되는 공진기 구성요소의 공진 주파수의 변화를 검출하여 센서 장치를 형성하도록 구성된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 곤충 OrX를 공진기 구성요소에 연결하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, OrX 연결 작동 공진기 구성요소가 센서 장치 내에 조립되기 전에, OrX가 공진기 구성요소에 연결된다.
바람직하게는, 공진기 구성요소는 수정 공진자이다.
바람직하게는, 센서의 구성요소, 연결 및 기능성은 본원에 기술된 바와 같다.
곤충 OrX와 공진기 구성요소의 연결
또 다른 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커를 통해 공진기 구성요소에 연결된다.
한 실시양태에서, 링커 분자는 OrX와 공진기 구성요소 사이에서 전기적 연통을 허용하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 수용체로부터의 공진기 구성요소의 단리를 방지하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 16-머캅토헥사데칸산(16-MHDA), 6-머캅토헥사데칸산(6-MHDA) 및 6-머캅토헥산산(MHA)으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 링커 분자는 6-머캅토헥산산(MHA)이다.
추가의 실시양태에서, 링커는 SAM의 일부이다.
따라서, 한 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커 분자로 구성된 SAM 층을 통해 공진기 구성요소에 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 곤충 OrX는 6-머캅토헥산산(MHA) 링커 분자로 구성된 SAM 층을 통해 공진기 구성요소에 연결된다.
추가의 실시양태에서, 링커 또는 MHA의 카복실기의 활성화는 곤충 OrX의 연결 전에 수행된다.
바람직하게는, 링커 또는 MHA의 카복실기의 활성화는 곤충 OrX를 공진기 구성요소에 연결하기 전에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)의 용액을 이용하여 수행된다.
센서 장치에서의 Orco의 결여
바람직한 실시양태에서, 센서는 곤충 취기물질 공동 수용체(Orco)를 포함하지 않는다.
본 발명은 첨부된 비한정적인 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 리간드 의존성 비선택적 양이온 채널을 생성하기 위하여 취기물질 결합 OrX 서브유닛 및 Orco 서브유닛으로 이루어진 곤충 OR 막 복합체의 개략도를 도시한다. 주황색 원은 결합된 취기물질을 나타낸다.
도 2는 전극 세정으로 시작한 후 SAM을 형성하고 SAM 층에 리포좀을 공유결합시킴으로써 종결되는 센서 제조의 개략도를 도시한다. 전기 화학적 판독치는 3단자 전기 화학 장치(set-up)에서 수행된 EIS 측정으로부터 얻어진다. 잘라낸 부분이 있는 원은 리포좀 통합 곤충 OrX를 나타내고, 작은 삼각형은 VOC 리간드를 나타낸다.
도 3은 농도가 640pM 내지 10μM인 E2-헥세날에 대한 or35a 작용화된 전극의 임피던스 전개를 도시한다. 실험 데이터는 기호로 표시되고 등가 회로 피팅 곡선은 실선으로 표시된다.
도 4는 128pM 내지 2μM의 농도로 A) 메틸 살리실레이트에서 배양된 Or10a, B) E2-헥세날에서 배양된 Or35a, 및 C) 메틸 헥사노에이트에서 배양된 Or22a의 용량 반응 곡선을 도시한다. 음성 대조용; 각각 Or10a 메틸 헥사노에이트, Or35a VUAA1, Or22a 메틸 살리실레이트.
도 5는 CNT 침착 공정의 개략도를 도시한다: (a) PDMS(폴리디메틸실록산) 스탬핑 방법을 통해 SiO2/Si를 2-티올-피리딘으로 작용화시킨다. (b) 2-티올-피리딘 작용화된 CNT FET를 미리 만들어진 CNT DCB 현탁액에 담근다.
도 6에서, 전극은 표준 마이크로 전자 제조 후 CNT 필름 코팅 기판 위에서 제작된다: (a) UV 광으로 노출되기 전에 기판에 마스크를 가져옴; (b) AZ326 현상액에서 현상 후; (c) 열 증착에 의한 금속 침착; (d) 아세톤에서 리프트-오프(lift-off) 후.
도 7은 전극이 절연 웰로서의 포토레지스트에 의해 봉지화된(encapsulated) 후의 CNT FET 구조의 개략도를 도시한다.
도 8은 AZ1518 봉지화된 CNT FET 장치 상의 수제 PDMS의 사진 이미지를 도시한다.
도 9는 전기 측정을 위한 센서 설정을 도시한다: Ag/AgCl 전극이 게이트 전극으로서 PBS 액체에 삽입된다. CNT FET의 전극과 접촉하는 두 개의 프로브는 소스 및 드레인 전극이다.
도 10은 새(pristine) CNT FET 및 Or35a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징을 도시한다: Vds=200mV, PBS 완충액중.
도 11은 PBS 및 OR35a 나노디스크로 작용화된(1:10 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 E-2-헥세날에 대한 실시간 응답을 도시한다: (a) 실시간 전류 응답, 및 (b) 정규화된(ΔI/I0) 대 E-2-헥세날 농도(로그 배율).
도 12는 Or35a 나노디스크로 작용화된(1:10) CNT FET, 미처리(pristine) CNT FET 및 빈 나노디스크로 작용화된 CNT FET로부터의 E-2-헥세날 반응에 대한 실시간 측정을 도시한다: 모든 장치는 Vlg=0, Vds=100mV 및 t=1s를 갖는다.
도 13은 Vlg=0, Vds=100mV, t=1s에서 대조용 리간드 메틸 헥사노에이트에 대한 OR35a-나노디스크(1:10) 작용화된 CNT FET의 반응을 도시한다: (a) 전류 응답; (b) 정규화된 전류(I0는 분석물 추가를 시작하기 전의 전류이다).
도 14는 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE 젤 (A) 빈 1E3D1 나노디스크 및 Or10a, Or35a, Or71a 및 Or22a 수용체가 포함된 나노디스크; 및 (B) 미처리 CNT 및 Or22a 나노디스크 작용화된 CNT의 원자력 현미경 이미지(노란색 점들은 Or22a 관련 나노디스크이다)를 도시한다.
도 15는 다음과 같다. (A) 미처리 CNT FET 및 Or10a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징: Vds=100mV, PBS 완충액중. (B) PBS 및 OR10a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 메틸 살리실레이트(MeSal)에 대한 실시간 전류 응답. (C) PBS 및 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 메틸 살리실레이트(MeSal)에 대한 실시간 전류 응답. (D) 정규화된 (ΔI/I0) 대 OR10a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 메틸 살리실레이트 농도 및 음성 대조용 리간드 E2-헥세날(E2Hex)(로그 배율). (E) 정규화된 (ΔI/I0) 대 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 메틸 살리실레이트 농도(로그 배율).
도 16은 다음과 같다. (A) 미처리 CNT FET 및 Or22a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징: Vds=100mV, PBS 완충액중. (B) PBS 및 OR22a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 메틸 헥사노에이트(MeHex)에 대한 실시간 전류 응답. (C) PBS 및 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 메틸 헥사노에이트(MeHex)에 대한 실시간 전류 응답. (D) 정규화된 (ΔI/I0) 대 OR22a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 메틸 헥사노에이트 농도 및 음성 대조용 리간드 E2-헥세날(E2Hex)(로그 배율). (E) 정규화된 (ΔI/I0) 대 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 메틸 헥사노에이트 농도(로그 배율).
도 17은 다음과 같다. (A) 미처리 CNT FET 및 Or35a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징: Vds=100mV, PBS 완충액중. (B) PBS 및 OR35a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 E2-헥세날(E2Hex)에 대한 실시간 전류 응답. (C) PBS 및 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 E2-헥세날(E2Hex)에 대한 실시간 전류 응답. (D) 정규화된 (ΔI/I0) 대 OR35a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 E2-헥세날(E2Hex) 농도 및 음성 대조용 리간드 메틸 헥사노에이트(MeHex)(로그 배율). (E) 정규화된 (ΔI/I0) 대 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 E2-헥세날(E2Hex) 농도(로그 배율).
도 18은 다음과 같다. (A) 미처리 CNT FET 및 Or71a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징: Vds=100mV, PBS 완충액중. (B) PBS 및 OR71a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 4-에틸 구아이아콜(4EG)에 대한 실시간 전류 응답. (C) PBS 및 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 4-에틸 구아이아콜(4EG)에 대한 실시간 전류 응답. (D) 정규화된 (ΔI/I0) 대 OR71a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 또한 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 4-에틸 구아이아콜(4EG) 농도(로그 배율).
도 19는 다음과 같다. 표적 리간드 메틸 살리실레이트와 대조용 리간드 E2-헥세날에 반응하는 (A) Or10a 나노디스크로 작용화된 금 전극에 대한 용량 반응 곡선. (B) 표적 리간드 메틸 헥사노에이트 및 대조용 리간드 E2-헥세날에 반응하는 Or22a 나노디스크. (C) 표적 리간드 E2-헥세날 및 대조용 리간드 메틸 살리실레이트에 반응하는 Or35a 나노디스크. 세 가지 예 모두에서, 빈 나노디스크로 작용화된 금 전극으로 표적 및 대조용 리간드 결합 측정을 수행하였다.
도 20은 Or22a 관련 리포좀 제제의 SDS-PAGE의 항-FLAG 웨스턴 블랏을 나타낸다. 레인은 1-MW 표준, 2-His-FLAG-CFP 웨스턴 블롯 표준, 3-FC14 세제로 정제된 His-FLAG-OR22a, 4-리포좀으로 재구성된 His-FLAG-OR22a, 5-12: 하단(레인 5)부터 상단(레인 12)까지의 아큐덴즈(Accudenz) 부상 구배 분획. His-FLAG-OR22a 밴드가 리포좀으로 재구성되었음을 나타내는 상위 두 부분에만 어떻게 존재하는지 주목한다.
도 21은 각각 금 맨 표면, SAM 변형, NHS-EDC 연결 및 Or22a/리포좀 고정 금 표면의 AFM 높이 이미지(a 내지 d), 높이 이미지 상의 표시선으로 표시되는 조도 프로파일(e 내지 h) 및 3D 이미지(i 내지 l)를 도시한다.
도 22는 표적 리간드 메틸 살리실레이트 및 대조용 리간드 메틸 헥사노에이트에 반응하여 A) Or10a 리포좀으로 작용화된 금 전극; B) 표적 리간드 메틸 헥사노에이트 및 대조용 리간드 메틸 살리실레이트에 반응하여 Or22a 리포좀으로 작용화된 금 전극; 및 C) 표적 리간드 4-에틸 구아이아콜 및 대조용 리간드 E2 헥세날에 반응하여 Or71a 리포좀으로 작용화된 금 전극의 용량 반응 곡선을 도시한다. 각 예에서, 표적 리간드 및 대조용 리간드 결합 측정은 빈 리포좀으로 작용화된 금 전극으로 수행하였다.
도 23A는 SAM 및 NHS/EDC 개질, Or22a 리포좀 고정 후, 표적 리간드 메틸 헥사노에이트의 결합에 의한 소산 모니터링을 갖는 수정 미세저울(QCM-D)에서의 주파수 및 소산의 변화를 도시한다. 도 23B는 Or22a 리포좀 고정 QCM-D 센서에 있어서 메틸 헥사노에이트의 농도 증가(완충액만, 1.6, 8, 40 및 200μM)에 따른 주파수 및 소산 변화의 확대도를 도시한다. 도 23C는 SAM 및 NHS/EDC 개질, 빈 리포좀 고정 후, 표적 리간드 메틸 헥사노에이트의 결합에 의한 QCM-D 센서의 주파수 및 소산 변화를 도시한다. 도 24D는 빈 리포좀이 고정된 QCM-D 센서에 있어서 메틸 헥사노에이트의 농도 증가(완충액만, 1.6, 8, 40 및 200μM)에 따른 주파수 및 소산 변화의 확대도를 도시한다.
도 1은 리간드 의존성 비선택적 양이온 채널을 생성하기 위하여 취기물질 결합 OrX 서브유닛 및 Orco 서브유닛으로 이루어진 곤충 OR 막 복합체의 개략도를 도시한다. 주황색 원은 결합된 취기물질을 나타낸다.
도 2는 전극 세정으로 시작한 후 SAM을 형성하고 SAM 층에 리포좀을 공유결합시킴으로써 종결되는 센서 제조의 개략도를 도시한다. 전기 화학적 판독치는 3단자 전기 화학 장치(set-up)에서 수행된 EIS 측정으로부터 얻어진다. 잘라낸 부분이 있는 원은 리포좀 통합 곤충 OrX를 나타내고, 작은 삼각형은 VOC 리간드를 나타낸다.
도 3은 농도가 640pM 내지 10μM인 E2-헥세날에 대한 or35a 작용화된 전극의 임피던스 전개를 도시한다. 실험 데이터는 기호로 표시되고 등가 회로 피팅 곡선은 실선으로 표시된다.
도 4는 128pM 내지 2μM의 농도로 A) 메틸 살리실레이트에서 배양된 Or10a, B) E2-헥세날에서 배양된 Or35a, 및 C) 메틸 헥사노에이트에서 배양된 Or22a의 용량 반응 곡선을 도시한다. 음성 대조용; 각각 Or10a 메틸 헥사노에이트, Or35a VUAA1, Or22a 메틸 살리실레이트.
도 5는 CNT 침착 공정의 개략도를 도시한다: (a) PDMS(폴리디메틸실록산) 스탬핑 방법을 통해 SiO2/Si를 2-티올-피리딘으로 작용화시킨다. (b) 2-티올-피리딘 작용화된 CNT FET를 미리 만들어진 CNT DCB 현탁액에 담근다.
도 6에서, 전극은 표준 마이크로 전자 제조 후 CNT 필름 코팅 기판 위에서 제작된다: (a) UV 광으로 노출되기 전에 기판에 마스크를 가져옴; (b) AZ326 현상액에서 현상 후; (c) 열 증착에 의한 금속 침착; (d) 아세톤에서 리프트-오프(lift-off) 후.
도 7은 전극이 절연 웰로서의 포토레지스트에 의해 봉지화된(encapsulated) 후의 CNT FET 구조의 개략도를 도시한다.
도 8은 AZ1518 봉지화된 CNT FET 장치 상의 수제 PDMS의 사진 이미지를 도시한다.
도 9는 전기 측정을 위한 센서 설정을 도시한다: Ag/AgCl 전극이 게이트 전극으로서 PBS 액체에 삽입된다. CNT FET의 전극과 접촉하는 두 개의 프로브는 소스 및 드레인 전극이다.
도 10은 새(pristine) CNT FET 및 Or35a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징을 도시한다: Vds=200mV, PBS 완충액중.
도 11은 PBS 및 OR35a 나노디스크로 작용화된(1:10 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 E-2-헥세날에 대한 실시간 응답을 도시한다: (a) 실시간 전류 응답, 및 (b) 정규화된(ΔI/I0) 대 E-2-헥세날 농도(로그 배율).
도 12는 Or35a 나노디스크로 작용화된(1:10) CNT FET, 미처리(pristine) CNT FET 및 빈 나노디스크로 작용화된 CNT FET로부터의 E-2-헥세날 반응에 대한 실시간 측정을 도시한다: 모든 장치는 Vlg=0, Vds=100mV 및 t=1s를 갖는다.
도 13은 Vlg=0, Vds=100mV, t=1s에서 대조용 리간드 메틸 헥사노에이트에 대한 OR35a-나노디스크(1:10) 작용화된 CNT FET의 반응을 도시한다: (a) 전류 응답; (b) 정규화된 전류(I0는 분석물 추가를 시작하기 전의 전류이다).
도 14는 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE 젤 (A) 빈 1E3D1 나노디스크 및 Or10a, Or35a, Or71a 및 Or22a 수용체가 포함된 나노디스크; 및 (B) 미처리 CNT 및 Or22a 나노디스크 작용화된 CNT의 원자력 현미경 이미지(노란색 점들은 Or22a 관련 나노디스크이다)를 도시한다.
도 15는 다음과 같다. (A) 미처리 CNT FET 및 Or10a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징: Vds=100mV, PBS 완충액중. (B) PBS 및 OR10a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 메틸 살리실레이트(MeSal)에 대한 실시간 전류 응답. (C) PBS 및 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 메틸 살리실레이트(MeSal)에 대한 실시간 전류 응답. (D) 정규화된 (ΔI/I0) 대 OR10a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 메틸 살리실레이트 농도 및 음성 대조용 리간드 E2-헥세날(E2Hex)(로그 배율). (E) 정규화된 (ΔI/I0) 대 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 메틸 살리실레이트 농도(로그 배율).
도 16은 다음과 같다. (A) 미처리 CNT FET 및 Or22a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징: Vds=100mV, PBS 완충액중. (B) PBS 및 OR22a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 메틸 헥사노에이트(MeHex)에 대한 실시간 전류 응답. (C) PBS 및 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 메틸 헥사노에이트(MeHex)에 대한 실시간 전류 응답. (D) 정규화된 (ΔI/I0) 대 OR22a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 메틸 헥사노에이트 농도 및 음성 대조용 리간드 E2-헥세날(E2Hex)(로그 배율). (E) 정규화된 (ΔI/I0) 대 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 메틸 헥사노에이트 농도(로그 배율).
도 17은 다음과 같다. (A) 미처리 CNT FET 및 Or35a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징: Vds=100mV, PBS 완충액중. (B) PBS 및 OR35a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 E2-헥세날(E2Hex)에 대한 실시간 전류 응답. (C) PBS 및 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 E2-헥세날(E2Hex)에 대한 실시간 전류 응답. (D) 정규화된 (ΔI/I0) 대 OR35a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 E2-헥세날(E2Hex) 농도 및 음성 대조용 리간드 메틸 헥사노에이트(MeHex)(로그 배율). (E) 정규화된 (ΔI/I0) 대 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 E2-헥세날(E2Hex) 농도(로그 배율).
도 18은 다음과 같다. (A) 미처리 CNT FET 및 Or71a 나노디스크 고정 후 동일한 장치의 전달 특징: Vds=100mV, PBS 완충액중. (B) PBS 및 OR71a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 4-에틸 구아이아콜(4EG)에 대한 실시간 전류 응답. (C) PBS 및 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 표적 리간드 4-에틸 구아이아콜(4EG)에 대한 실시간 전류 응답. (D) 정규화된 (ΔI/I0) 대 OR71a 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 또한 빈 나노디스크로 공유 작용화된(1:100 희석) CNT FET로부터의 4-에틸 구아이아콜(4EG) 농도(로그 배율).
도 19는 다음과 같다. 표적 리간드 메틸 살리실레이트와 대조용 리간드 E2-헥세날에 반응하는 (A) Or10a 나노디스크로 작용화된 금 전극에 대한 용량 반응 곡선. (B) 표적 리간드 메틸 헥사노에이트 및 대조용 리간드 E2-헥세날에 반응하는 Or22a 나노디스크. (C) 표적 리간드 E2-헥세날 및 대조용 리간드 메틸 살리실레이트에 반응하는 Or35a 나노디스크. 세 가지 예 모두에서, 빈 나노디스크로 작용화된 금 전극으로 표적 및 대조용 리간드 결합 측정을 수행하였다.
도 20은 Or22a 관련 리포좀 제제의 SDS-PAGE의 항-FLAG 웨스턴 블랏을 나타낸다. 레인은 1-MW 표준, 2-His-FLAG-CFP 웨스턴 블롯 표준, 3-FC14 세제로 정제된 His-FLAG-OR22a, 4-리포좀으로 재구성된 His-FLAG-OR22a, 5-12: 하단(레인 5)부터 상단(레인 12)까지의 아큐덴즈(Accudenz) 부상 구배 분획. His-FLAG-OR22a 밴드가 리포좀으로 재구성되었음을 나타내는 상위 두 부분에만 어떻게 존재하는지 주목한다.
도 21은 각각 금 맨 표면, SAM 변형, NHS-EDC 연결 및 Or22a/리포좀 고정 금 표면의 AFM 높이 이미지(a 내지 d), 높이 이미지 상의 표시선으로 표시되는 조도 프로파일(e 내지 h) 및 3D 이미지(i 내지 l)를 도시한다.
도 22는 표적 리간드 메틸 살리실레이트 및 대조용 리간드 메틸 헥사노에이트에 반응하여 A) Or10a 리포좀으로 작용화된 금 전극; B) 표적 리간드 메틸 헥사노에이트 및 대조용 리간드 메틸 살리실레이트에 반응하여 Or22a 리포좀으로 작용화된 금 전극; 및 C) 표적 리간드 4-에틸 구아이아콜 및 대조용 리간드 E2 헥세날에 반응하여 Or71a 리포좀으로 작용화된 금 전극의 용량 반응 곡선을 도시한다. 각 예에서, 표적 리간드 및 대조용 리간드 결합 측정은 빈 리포좀으로 작용화된 금 전극으로 수행하였다.
도 23A는 SAM 및 NHS/EDC 개질, Or22a 리포좀 고정 후, 표적 리간드 메틸 헥사노에이트의 결합에 의한 소산 모니터링을 갖는 수정 미세저울(QCM-D)에서의 주파수 및 소산의 변화를 도시한다. 도 23B는 Or22a 리포좀 고정 QCM-D 센서에 있어서 메틸 헥사노에이트의 농도 증가(완충액만, 1.6, 8, 40 및 200μM)에 따른 주파수 및 소산 변화의 확대도를 도시한다. 도 23C는 SAM 및 NHS/EDC 개질, 빈 리포좀 고정 후, 표적 리간드 메틸 헥사노에이트의 결합에 의한 QCM-D 센서의 주파수 및 소산 변화를 도시한다. 도 24D는 빈 리포좀이 고정된 QCM-D 센서에 있어서 메틸 헥사노에이트의 농도 증가(완충액만, 1.6, 8, 40 및 200μM)에 따른 주파수 및 소산 변화의 확대도를 도시한다.
본 발명자들의 발명은 곤충 취기물질 수용체(OrX)의 최초 냄새 감지 능력을 편리한 센서 형식과 성공적으로 조합한다.
개선된 편리성 이외에, 본 발명의 센서 장치는 놀랍게도 곤충 OR의 사용에 기초한 이전의 검정 시스템에 비해 검출 감도를 매우 크게 향상시킨다.
또한, 본 발명의 센서는 놀랍게도 취기물질 공동 수용체(Orco)의 부재하에 기능할 수 있는 반면, 곤충 OR의 사용에 기초한 이전의 모든 검정 시스템은 OrX 및 Orco를 둘 다 포함함에 의존한다.
곤충 취기물질 수용체 복합체
곤충 취기물질 수용체(OR)는 리간드 의존성 비선택적 양이온 채널을 형성하는 7개의 막통과 단백질의 새로운 계열의 구성원이다. 고도로 보존된 곤충 취기물질 공동 수용체(Orco)는 도 1에 도시되는 것처럼 리간드-결합 서브유닛(OrX)의 패널에 의해 부여되는 취기물질 특이성을 가지면서 과 생체 내에서 활성 채널을 형성한다고 생각된다.
생체 내에서, 곤충 OrX 단백질의 N 말단은 세포질에 있는 반면, C 말단은 세포 밖에 있다. 이 배치는 포유 동물의 G 단백질 연결 수용체(GPCR)와 반대이다. 또한, 포유 동물의 GPCR과 달리 곤충 OR은 리간드 의존성 비선택적 양이온 채널로서 기능하며, G 단백질과는 독립적으로 신호한다15.
호프(Hopf) 등(2015)16은 곤충 OR의 예측되는 구조 및 포유 동물의 GPCR과 관련없음에 대해서도 추가로 논의한다.
OrX 폴리펩티드로도 기술될 수 있는 곤충 OrX 단백질은 당 업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 OrX 서열은 넓은 범위의 VOC(44-46)를 검출할 수 있는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) OR 유전자군(43), 다양한 범위의 VOC(48, 49)를 검출할 수 있는 아노펠레스 감비아에(Anopheles gambiae) OR 유전자군(47); 뿐만 아니라 다른 곤충 종의 OR 유전자군으로부터의 서열을 포함하고, 알려진 OR 군의 최근 목록은 몬탠(Montagne 2015)(1)의 표 1을 참조한다. 한 실시양태에서, 곤충 OrX 단백질은 상기 참고 문헌 1, 43 및 47에 기재된 서열, 또는 그의 변이체 또는 기능적 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, OrX는 재조합 발현된 단백질이다.
바람직한 실시양태에서, OrX는 재조합 발현 후 정제되었다.
한 실시양태에서, OrX는 곤충 후각 세포로부터 직접 정제되지 않는다.
추가의 실시양태에서, OrX는 센서 장치 내의 곤충 후각 세포에 존재하지 않는다.
본 발명의 센서 장치에 사용하기 위한 기판
본 발명의 센서 장치에 사용하기 위한 기판은 전기적 특징의 변화가 측정될 수 있는 임의의 기판일 수 있다. 바람직하게는, 전기적 특징의 변화는 OrX와 분석물 사이의 상호작용의 결과이다.
또한 기판은 OrX가 연결될 수 있는 표면을 제공한다.
적합한 기판은 전극, 반도체 물질, 탄소 나노튜브(CNT), 그래핀, 산화물, 도핑된 규소, 전도성 중합체, 공진기 구성요소중 적어도 하나를 포함하거나 이들중 적어도 하나로 구성된다.
한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 압전 물질, 적어도 하나의 압전 결정 및 수정이거나 이들로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 수정 공진자이다.
본 발명의 센서 장치에서 측정할 전기적 특징
한 실시양태에서, 전기적 특징은 도전율, 저항, 복합 저항, 임피던스, 전기 화학적 임피던스, 전류의 흐름, 및 교번 전기장에 의해 유도되는 진동의 공진 주파수 중 적어도 하나로부터 선택된다.
EIS 장치
한 실시양태에서, 본 발명의 센서 장치는 화학 전지의 작동 전극에서 전기 화학적 임피던스의 변화를 검출하도록 구성된다. 따라서, 이 실시양태의 센서 장치는 전기 화학적 임피던스 분광법(EIS) 용으로 구성된다.
전기 화학적 임피던스 분광법(EIS)
전기 화학적 임피던스 분광법은 당 업자에게 잘 알려져 있으며, 오랫동안 전기 화학 시스템을 연구하는데 사용되어 왔다. 임피던스 측정을 위해 작은 정현파 AC 전압 프로브(일반적으로 2-10mV)가 적용되고 전류 응답이 결정된다. 동상(in-phase) 전류 응답은 임피던스의 실제(저항성) 성분을 결정하고, 이상(out-of-phase) 전류 응답은 허수(용량성) 성분을 결정한다. AC 프로브 전압은 시스템 응답이 선형이어서 간단한 등가 회로 분석이 가능하도록 하기에 충분히 작아야 한다. 임피던스 방법은 매우 다른 시간 상수의 물리화학적 과정을 특징화하여, 고주파수에서의 전자 전달 및 저주파수에서의 물질 전달을 샘플링할 수 있다는 점에서 매우 강력하다.
임피던스 결과는 일반적으로 간단한 전기 화학 시스템을 해석하는데 흔히 사용되는 랜들(Randles) 회로와 같은 저항 및 커패시터의 등가 회로에 적합하다. 랜들 회로의 도식적 표현[Rs+CPE/(Rct+W)]은 정위상 요소(constant phase element; CPE)와 직렬로, 또한 전하 이동 저항(Rct) 및 워버그(Warburg) 확산 요소(W)와 병렬로 용액 저항(Rs)을 포함하는 도 3에 도시된다.
분석물이 이러한 등가 회로 매개변수 중 하나 이상에 영향을 미치고 이러한 매개변수가 간섭 종에 의해 영향을 받지 않으면, 분석물 검출에 임피던스 방법을 사용할 수 있다.
효과적인 확산 계수를 측정하는데 사용할 수 있는 Warburg 임피던스는 거의 분석 용도에 유용하지 않다. 분석물 검출에 가장 유용한 등가 회로 요소는 Rct 및 CPE이다. 측정된 커패시턴스는 일반적으로 금(Au) 전극의 감지 층에 결합하는 분석물과 같은 여러 원소의 일련의 조합에서 발생한다.
전기 화학적 임피던스 분광법(EIS) 장치
EIS 장치는 전형적으로 작동 전극(WE), 대전극(CE), 기준 전극(RE), 포텐시오스탯/갈바노스탯(galvanostat)(PGSTAT)을 갖는 전기 화학 전지를 포함한다.
용도에 따라, 전기 화학 전지에 대한 계측기의 연결은 상이한 방법으로 설정될 수 있다(또는 설정되어야 한다).
정전위 모드에서, PGSTAT는 작동 전극(WE)과 기준 전극(RE) 사이의 전위차가 잘 정의되고 사용자가 지정한 값에 상응하도록 대전극(CE)의 전위를 작동 전극(WE)에 대해 정확하게 제어한다. 정전류 모드에서는, WE와 CE 사이의 전류 흐름이 제어된다. RE와 WE 사이의 전위차와 CE와 WE 사이에 흐르는 전류는 지속적으로 모니터링된다. PGSTAT를 사용함으로써, 네거티브 피드백 메카니즘을 사용하여 측정 중에 언제든지 사용자에 의해 지정되는 값(즉, 인가되는 전위 또는 전류)을 정확하게 제어한다.
대전극(CE)은 전기 화학 전지의 전류 회로를 닫는데 사용되는 전극이다. 일반적으로 불활성 물질(예: Pt, Au, 흑연, 유리질 탄소)로 만들어지며 일반적으로 전기 화학 반응에 관여하지 않는다. 전류가 WE와 CE 사이에서 흐르기 때문에, 조사중인 전기 화학적 과정의 동역학에서 제한 요소가 되지 않도록 CE의 전체 표면적(전자의 소스/싱크)은 WE의 면적보다 높아야 한다.
기준 전극(RE)은 안정되고 잘 알려진 전극 전위를 갖는 전극이며, 전위 제어 및 측정을 위해 전기 화학 전지에서 기준점으로 사용된다. 기준 전극 전위의 높은 안정성은 일반적으로 산화 환원 반응의 각 참가 물질을 일정한(완충 또는 포화된) 농도로 갖는 산화 환원 시스템을 사용함으로써 달성된다. 또한 기준 전극을 통과하는 전류 흐름은 0에 가깝게 유지되는데(이상적으로는, 0), 이는 전위계에서 매우 높은 입력 임피던스(> 100GOhm)와 함께 전지의 전류 회로를 닫도록 CE를 사용함으로써 달성된다.
작동 전극(WE)은 관심 반응이 일어나고 있는 전기 화학 시스템의 전극이다. 일반적인 작동 전극은 Au, Ag, Pt, 유리질 탄소(GC), Hg 드롭(drop) 및 필름과 같은 불활성 물질로 만들 수 있다.
EIS 장치는 또한 작동 전극의 전기적 특징의 변화를 측정하는 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 구성요소는 주파수 분석기일 수 있다. 주파수 분석기는 포텐시오스탯/갈바노스탯에 연결될 수 있다.
CNT-FET 장치
한 실시양태에서, 본 발명의 센서 장치는 CNT-FET 장치의 소스-게인 전류의 변화를 검출하도록 구성된다.
탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터(CNT-FET)
탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터(CNT-FET)는 기존의 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터(MOS-FET) 구조에서의 벌크 실리콘 대신 단일 탄소 나노튜브 또는 탄소 나노튜브 어레이를 채널 물질로서 사용하는 전계 효과 트랜지스터이다.
CNT-FET 장치
CNT-FET 장치는 일반적으로 다음을 포함한다:
a) 소스 전극(SE)
b) 드레인 전극(DE)
c) 게이트 전극(GE), 및
d) 탄소 나노튜브(CNT)로 구성된 적어도 하나의 채널.
게이트 전극은 소스 전극과 드레인 전극을 가로지르는 전류를 제어하는데 사용된다. 게이트 전극이 켜지면 전류 흐름은 채널을 통해 소스 전극과 드레인 전극을 가로질러 변조될 수 있다.
전극은 전형적으로 적어도 하나의 금속으로 구성된다. 바람직한 금속은 백금, 금, 크롬, 구리, 알루미늄, 티클(tickle), 팔라듐 및 티탄을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 채널은 탄소 나노튜브로 구성된다.
CNT-FET 장치는 또한 소스-드레인 전류의 변화를 측정하는 구성요소를 포함할 수 있다.
QCM 장치
한 실시양태에서, 본 발명의 센서 장치는 수정 미세저울(QCM)에서 공진기 구성요소의 공진 발진 주파수의 변화를 검출하도록 구성된다.
한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 압전 물질, 적어도 하나의 압전 결정 및 적어도 하나의 수정이거나 이들로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 수정 공진자이다.
한 실시양태에서, 수정은 금으로 코팅된다.
수정 미세저울(QCM)
수정 미세저울(QCM) 기술은 당 업자에게 잘 알려져 있으며, 수정 공진자의 주파수 변화를 측정함으로써 단위 면적당 질량 변화를 측정한다. 공진은 음향 공진기의 표면에서 산화물 성장/붕괴 또는 막 증착으로 인한 작은 질량의 추가 또는 제거에 의해 교란된다. QCM은 진공 상태, 기체 상태 및 액체 환경에서 사용할 수 있다. 인식 부위로 작용화된 표면에 대한 분자(특히, 단백질)의 친화력을 결정하는데 매우 효과적이다. QCM은 또한 생체 분자간의 상호작용을 조사하는데 사용되어 왔다. 주파수 측정은 높은 정밀도로 쉽게 이루어지므로 1μg/cm2 미만까지 질량 밀도를 측정하기 쉽다. 주파수를 측정하는 것 외에도, 분석을 돕기 위해 소산 인자(공진 대역폭과 동일)가 종종 측정된다. 소산 인자는 공진의 역 품질 계수, Q-1=w/fr인데; 이는 시스템의 감쇠를 정량화하고, 샘플의 점탄성 특성과 관련이 있다.
석영은 압전 효과를 경험하는 결정 계열중 하나이다. 인가된 전압과 기계적 변형 사이의 관계는 잘 알려져 있으며; 이것은 전기적 수단에 의한 음향 공진을 탐지할 수 있게 한다. 수정에 교류 전류를 가하면 진동이 유도된다. 적절히 절단된 결정의 전극 사이에 교류 전류를 가하면, 정상 전단파가 생성된다. 주파수와 대역폭의 비인 Q 인자는 106만큼 높을 수 있다. 이러한 좁은 공진은 매우 안정적인 발진기 및 공진 주파수 결정의 높은 정확성을 제공한다. QCM은 이러한 용이함과 정밀도를 감지에 활용한다. 일반 장비는 4 내지 6MHz 범위의 기본 공진 주파수를 갖는 결정에서 1Hz까지 분해능을 허용한다.
수정 진동의 진동 주파수는 부분적으로 결정의 두께에 의존한다. 정상 작동 중에 다른 모든 영향 변수는 일정하게 유지되며; 따라서, 두께의 변화는 주파수의 변화와 직접적으로 관련이 있다. 결정 표면에 물질이 침착되면 두께가 증가하고; 결과적으로 발진 주파수는 초기 값에서 감소한다. 몇 가지 가정을 간소화하면 소이어브리(Sauerbrey) 방정식을 사용하여 이 주파수 변화를 정량화하고 질량 변화와 정확하게 상관시킬 수 있다.
수정 미세저울(QCM) 장치
QCM의 일반적인 설비는 수냉 튜브, 유지 장치, 마이크로도트 피드-스루(microdot feed-through)를 통한 주파수 감지 장비, 진동 소스 및 측정 및 기록 장치를 포함한다.
QCM은 전극이 양면으로 증착된 공진기 구성요소(일반적으로는, 얇은 압전 판)로 구성된다. 피에조 효과로 인해, 전극을 가로지르는 AC 전압은 전단 변형을 유발하고 그 반대도 마찬가지이다. 전기 기계적 연결은 전기적 수단에 의한 음향 공진을 검출하는 간단한 방법을 제공한다. 그렇지 않으면 이는 그다지 중요하지 않다.
본 발명의 센서 장치
제 1 양태에서, 본 발명은 기판과 전기적으로 연통되는 곤충 취기물질 수용체(OrX)를 포함하는 센서 장치를 제공하고, 이 때 센서 장치는 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성된다.
센서 구성요소
한 양태에서, 본 발명은 본원에 정의되는 기판과 전기적으로 연통되는 OrX를 포함하는 센서 장치 구성요소를 제공한다. 이 구성요소는 본 발명에 따른 센서 장치에 부가하는데 유용하다.
한 양태에서, 본 발명은 기판과 전기적으로 연통되는 곤충 취기물질 수용체(OrX)를 포함하는 센서 장치 구성요소를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 센서 장치 구성요소를 포함하는 센서 장치를 제공하고, 이 때 상기 센서 장치는 상기 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 곤충 OrX와 기판 사이의 전기적 소통을 확립하는 단계를 포함하는, 센서 장치 구성요소를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 센서 장치 구성요소를 센서 장치에 부가하는 단계를 포함하는, 센서 장치의 조립 방법을 제공하고, 이 때 조립된 센서 장치는 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성된다.
센서 장치 구성요소 및 센서 장치의 특정 실시양태에서, 곤충 취기물질 수용체(OrX), 전기적 연통, 기판, 구성 및 검출은 본원에서 설명된 바와 같다.
전기 화학적 임피던스 분광법(EIS) 장치
한 실시양태에서, 센서 장치는 전기 화학 전지를 포함한다.
한 실시양태에서, 전기 화학 전지는 적어도 2개의 전극을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 전기 화학 전지는 적어도 a) 작동 전극(WE), 및 b) 대전극(CE)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 전기 화학 전지는 또한 기준 전극(RE)을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 전기 화학 전지는 포텐시오스탯/갈바노스탯(PGSTAT)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 전기 화학 전지는 a) 작동 전극(WE), b) 대전극(CE), c) 기준 전극(RE), 및 d) 포텐시오스탯/갈바노스탯(PGSTAT)을 포함한다.
대전극
한 실시양태에서, 대전극은 백금(Pt), 금(Au), 흑연 또는 유리질 탄소(GC)로부터 선택되는 물질로 구성되거나 이러한 물질로 코팅된다.
바람직하게는, 대전극은 백금(Pt)으로 이루어진다.
바람직하게는, 대전극은 백금(Pt) 와이어이다.
기준 전극
바람직하게는, 기준 전극은 은/염화은(Ag/AgCl) 기준 전극이다.
작동 전극
한 실시양태에서, 전기 화학적 임피던스 분광법(EIS) 장치는 적어도 하나의 작동 전극을 포함한다.
전극은 임의의 적절한 물질로 구성되거나 코팅될 수 있다. 전극은 금(Au),은(Ag), 백금(Pt), 탄소 나노튜브(CNT) 및 유리질 탄소(GC) 중에서 선택된 물질로 구성되거나 이들 물질로 코팅될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 전극은 금으로 구성되거나 금으로 코팅된다.
포텐시오스탯/갈바노스탯(PGSTAT)
바람직하게는, 포텐시오스탯/갈바노스탯(PGSTAT)은 정전위 모드에서 사용된다.
검출기 구성요소
다른 실시양태에서, 센서는 검출기 구성요소를 포함한다. 검출기 구성요소는 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하거나 측정한다.
한 실시양태에서, 검출기 구성요소는 주파수 분석기이다. 추가 실시양태에서, 주파수 분석기는 포텐시오스탯/갈바노스탯(PGSTAT)에 연결된다.
곤충 OrX의 준비
곤충 OrX를 재조합 발현 및 정제하는 방법은 당 업자에게 공지되어 있다14.
곤충 OrX의 프레젠테이션
추가의 실시양태에서, OrX는 분석물과의 상호작용에 반응하여 구조 변화를 겪을 수 있는 형태로 존재한다.
한 실시양태에서, 곤충 OrX는 막 모방체에 존재한다.
이름처럼 막 모방체는 천연 막을 모방함을 시사하며, 생체 내에서 발견되는 것과 동일하거나 유사한 형태로 수용체를 지지할 수 있다.
막 모방체는 리포좀, 양극자, 세제 미셀, 나노소포체, 지질 이중층 및 나노디스크로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 막 모방체는 인공적인 것이다.
한 실시양태에서, 막 모방체는 리포좀이다.
한 실시양태에서 막 모방체는 인공 리포좀이다.
추가의 실시양태에서, 막 모방체는 지질 이중층이다.
추가의 실시양태에서, 막 모방체는 인공 지질 이중층이다.
리포좀 중에서 곤충 수용체를 재구성하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다14.
작동 전극 상에서의 곤충 OrX를 포함하는 지질 이중층의 형성
이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 일부 실시양태에서 리포좀 내의 곤충 OrX가 작동 전극에 적용될 때 리포좀이 구조를 변화시켜 전극 상에 지질 이중층을 형성한다고 가정한다. 본 발명자들은 곤충 OrX가 리간드/분석물에 접근가능한 수용체의 리간드/분석물 결합 도메인과 같이 생체 내에서 세포막에서 발견되는 것과 유사한 또는 동일한 형태로 지질 이중층에 내장되어 있다고 가정한다.
이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 다른 실시양태에서 작동 전극에 결합될 때 리포좀이 리포좀으로서 잔류한다고 가정한다. 이는 도 21에 예시되어 있다.
OrX와 기판의 연결
추가의 실시양태에서, OrX는 기판에 연결된다.
단백질을 기판에 연결시키는 수많은 방법이 당 업자에게 공지되어 있다. 그러한 방법은 공유 화학적 연결, 광 화학적 가교 결합, 표면 코팅/변형, 금 표면 화학, 단백질 친화성 태그, 바이오틴-스트렙타비딘 결합, 항체 고정 및 조작된 표면-결합 펩티드 서열의 사용을 포함한다.
본 장치에 사용하기 위한 OrX 단백질은 또한 아민기, 히스티딘 태그, 또는 단백질을 기판에 연결시키는데 사용되는 몇몇 다른 작용화를 포함할 수 있다. 아민기를 갖는 단백질의 경우, 사용자는 아민기를 사용하여 기판에 연결된 이탈기를 대체하여 단백질을 기판에 결합시킬 수 있다. 연결은 공유결합(예: 아미드 결합), 이온 결합, 수소 결합 또는 금속 배위에 의해 발생할 수 있으므로, 연결이 친핵체-이탈기 반응에 의해 반드시 수행될 필요는 없다. 배위의 일례로서, OrX 단백질은 히스티딘 태그와 니켈 사이의 배위에 의해 기판에 연결될 수 있다. OrX 단백질은 또한 시스테인 잔기를 통해 기판에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부착될 OrX 단백질은 자연적으로 시스테인 잔기를 포함한다. 이것은 자연 발생적이거나, 그러한 잔류물은 천연 또는 재조합 단백질에 의도적으로 혼입될 수 있다. 추가 정보는 WO 2012/050646 호에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 기판의 표면은 기판을 막통과 단백질에 연결시키는 작용기를 포함한다. 하나의 비제한적인 예에서, 물질의 표면은 탄소 나노튜브와 같은 기판에 자발적으로 공유결합을 형성하는 카복실화 디아조늄염으로 작용화될 수 있다. 아민 및 아미드 작용기는 페놀/방향족 작용기와 마찬가지로 적합하다고 여겨진다.
EIS용 링커
추가의 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커를 통해 전극에 연결된다.
한 실시양태에서, 링커 분자는 OrX와 전극 사이의 전기적 연통을 허용하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 수용체로부터의 전극의 단리를 방지하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 16-머캅토헥사데칸산(16-MHDA), 6-머캅토헥사데칸산(6-MHDA) 및 6-머캅토헥산산(MHA)으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 링커는 6-머캅토헥산산(MHA)이다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 SAM 층의 일부이다.
따라서, 한 실시양태에서, SAM 층은 6-머캅토헥산산(MHA)으로 구성된다.
추가의 실시양태에서, MHA의 카복실기의 활성화는 곤충 OrX의 연결 전에 수행된다.
바람직하게는, 곤충 OrX를 전극에 연결하기 전에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)의 용액을 사용하여 MHA의 카복실기의 활성화를 수행한다.
분석물 검출
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 대한 분석물의 결합을 검출할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 결합하는 분석물의 존재를 환경에서 검출할 수 있다.
바람직하게는, 분석물의 검출은 특이적이다.
추가의 실시양태에서, 곤충 OR로의 분석물의 결합은 작동 전극에서의 전기 화학적 임피던스를 변화시킨다.
탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터(CNT-FET) 장치
바람직하게는, 탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터(CNT-FET) 장치는 적어도 2개의 단자를 포함한다. 다른 실시양태에서, CNT-FET 장치는 적어도 소스 전극 및 드레인 전극을 포함한다.
한 실시양태에서, CNT-FET 장치는 a) 소스 전극, b) 드레인 전극, c) 게이트 전극, d) 탄소 나노튜브(CNT)로 구성된 적어도 하나의 채널을 포함한다.
바람직하게는, 게이트 전극은 은/염화은(Ag/AgCl) 와이어이다.
검출기 구성요소
다른 실시양태에서, 센서는 검출기 구성요소를 포함한다. 검출기 구성요소는 소스-드레인 전류의 변화를 검출하거나 측정한다.
전기적 특징의 변화는 수동으로 또는 컴퓨터 제어하에 작동되는 종래의 전자 기기를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터화된 실험실 설비에는 바이어스 전압과 다양한 게이트 전압 값을 적용하는 내셔널 인스트루먼트(National Instrument) PCI-6722 DAQ 보드가 포함될 수 있다. 키슬리(Keithley) 6485 피코암미터(Picoammeter)를 사용하여 전류를 측정함으로써, 완전한 I-Vg 곡선을 제공할 수 있다. 단일 기판 상에 위치하는 많은 장치를 측정하고자 하는 경우, 스위칭 매트릭스(키슬리 7001) 또는 다른 멀티플렉서가 사용될 수 있다.
애질런트(Agilent) 4156C 매개변수 분석기를 또한 모든 전기 측정에 사용할 수 있다20. 매개변수 분석기는 우수한 감도를 가지며 펨토암페어 수준으로 전류를 정확하게 측정할 수 있다.
곤충 OrX의 프레젠테이션
추가의 실시양태에서, OrX는 분석물과의 상호작용에 반응하여 구조 변화를 겪을 수 있는 형태로 존재한다.
한 실시양태에서, 곤충 OrX는 막 모방체에 존재한다.
이름처럼 막 모방체는 천연 막을 모방함을 시사하며, 생체 내에서 발견되는 것과 동일하거나 유사한 형태로 수용체를 지지할 수 있다.
막 모방체는 리포좀, 양극자, 세제 미셀, 나노소포체, 지질 이중층 및 나노디스크로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 막 모방체는 인공적인 것이다.
바람직한 실시양태에서, 막 모방체는 나노디스크이다.
본 발명의 CNT-FET 장치의 채널로의 OrX의 연결
한 실시양태에서, OrX는 채널 내의 탄소 나노튜브에 연결된다.
곤충 OrX 작용화
한 실시양태에 있어서, 곤충 OrX는 CNT로의 연결을 용이하게 하도록 작용화된다.
한 실시양태에서, 곤충 OrX는 his-태그로 작용화된다.
따라서, 한 실시양태에서, OrX는 his-태그를 포함한다.
바람직하게는, his-태그는 OrX 단백질의 N-말단에 있다.
CNT 작용화
한 실시양태에서, CNT는 곤충 OrX로의 연결을 용이하게 하도록 작용화된다.
추가의 실시양태에서, CNT는 니켈(Ni)-니트릴로트리아세트산(NTA)으로 작용화된다.
연결
추가의 실시양태에서, OrX는 his-태그 친화성 결합을 통해 CNT에 연결된다.
따라서, 한 실시양태에서, his-태그된 OrX는 Ni-NTA 작용화된 CNT에 결합한다.
분석물 검출
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX로의 분석물의 결합을 검출할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 결합하는 분석물의 존재를 환경에서 검출할 수 있다.
바람직하게는, 분석물의 검출은 특이적이다.
추가 실시양태에서, 곤충 OR로의 분석물의 결합은 본 발명의 CNT-FET 장치의 채널에서의 전기 소스-게인 전류를 변화시킨다.
수정 미세저울(QCM) 장치
바람직하게는, 수정 미세저울(QCM) 장치는 a) 공진기 구성요소, b) 진동 소스 구성요소, c) 주파수 감지 구성요소를 포함한다.
공진기 구성요소
한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 압전 물질, 적어도 하나의 압전 결정 및 적어도 하나의 수정이거나 이들로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 수정 공진자이다.
한 실시양태에서, 수정은 금으로 코팅된다.
한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 대향하는 두 면에 부착된 전극을 갖는다.
한 실시양태에서, 전극은 금으로 구성되거나 금으로 코팅된다.
바람직한 실시양태에서, 공진기 구성요소는 적어도 하나의 곤충 OrX와 전기적으로 연통된다.
진동 소스 구성요소
한 실시양태에서, 진동 소스 구성요소는 교번 전기장을 공진기 구성요소에 인가하도록 구성된다.
한 실시양태에서, 교번 전기장은 공진기 구성요소의 대향 측면에 부착된 전극을 통해 인가된다.
주파수 감지 구성요소
한 실시양태에서, 주파수 감지 구성요소는 공진기 구성요소의 발진 주파수를 측정하도록 구성된다. 한 실시양태에서, 주파수 감지 구성요소는 공진기 구성요소의 발진 주파수의 변화를 측정하도록 구성된다.
곤충 OrX의 프레젠테이션
추가의 실시양태에서, OrX는 분석물과의 상호작용에 반응하여 구조 변화를 겪을 수 있는 형태로 존재한다.
한 실시양태에서, 곤충 OrX는 막 모방체에 존재한다.
막 모방체는 이름에서 알 수 있듯이 천연 막을 모방하고, 생체 내에서 발견되는 것과 동일하거나 유사한 형태로 수용체를 지지할 수 있다.
막 모방체는 리포좀, 양극자, 세제 미셀, 나노소포체, 지질 이중층 및 나노디스크로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 막 모방체는 인공적인 것이다.
바람직한 실시양태에서, 막 모방체는 리포좀이다.
추가의 실시양태에서, 막 모방체는 지질 이중층이다.
추가의 실시양태에서, 막 모방체는 인공 지질 이중층이다.
리포좀 내에서 곤충 수용체를 재구성하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다14.
공진기 구성요소 상에 곤충 OrX를 포함하는 지질 이중층의 형성
이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 일부 실시양태에서 리포좀 내의 곤충 OrX가 작동 전극에 적용되는 경우 리포좀이 구조를 변화시켜 공진기 구성요소 상에 지질 이중층을 형성한다고 가정한다. 본 발명자들은 곤충 OrX가 리간드/분석물에 접근가능한 수용체의 리간드/분석물 결합 도메인과 같이 생체 내에서 세포막에서 발견되는 것과 유사한 또는 동일한 형태로 지질 이중층에 내장되어 있다고 가정한다.
이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 다른 실시양태에서 작동 전극에 결합될 때 리포좀이 리포좀으로서 잔류한다고 가정한다. 이는 도 21에 예시되어 있다.
QCM용 링커
또 다른 실시양태에서, 곤충 OrX는 링커를 통해 공진기 구성요소에 연결된다.
한 실시양태에서, 링커 분자는 OrX와 공진기 구성요소 사이의 전기적 연통을 허용하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 수용체로부터의 공진기 구성요소의 단리를 방지하기에 충분히 짧다.
추가의 실시양태에서, 링커 분자는 16-머캅토헥사데칸산(16-MHDA), 6-머캅토헥사데칸산(6-MHDA) 및 6-머캅토헥산산(MHA)으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 링커는 6-머캅토헥산산(MHA)이다.
추가의 실시양태에서, 링커는 SAM의 일부이다.
따라서, 한 실시양태에서, SAM 층은 6-머캅토헥산산(MHA)으로 구성된다.
추가의 실시양태에서, MHA의 카복실기의 활성화는 곤충 OrX의 연결 전에 수행된다.
바람직하게는, 곤충 OrX를 전극에 연결하기 전에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)의 용액을 사용하여 MHA의 카복실기의 활성화를 수행한다.
분석물 검출
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX로의 분석물의 결합을 검출할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 센서는 곤충 OrX에 결합하는 분석물의 존재를 환경에서 검출할 수 있다.
바람직하게는, 분석물의 검출은 특이적이다.
추가 실시양태에서, 곤충 OrX로의 분석물의 결합은 공진기 구성요소에 인가되는 교번 전기장에 의해 유도되는 공진기 구성요소의 공진 주파수를 변경시킨다.
검출 감도
전술한 바와 같이, 본 발명의 센서는 놀랍게 잘 작동한다. 본 발명자들은 본 발명의 센서 장치가 곤충 OR의 사용을 포함하는 임의의 공지된 검정보다 상당히 더 민감하다는 것을 밝혀내었다.
한 실시양태에서, 센서는 1×10-3M 미만, 바람직하게는 1×10-3M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-4M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-5M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-6M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-7M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-8M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-9M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-10M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-11M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-12M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-13M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-14M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-15M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-16M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-17M 미만, 보다 바람직하게는 1×10-18M 미만의 농도에서 분석물의 존재를 검출할 수 있다.
동적 범위
한 실시양태에서, 센서는 분석물 농도의 차수에 있어서 2 이상, 바람직하게는 3 이상, 보다 바람직하게는 4 이상, 보다 바람직하게는 5 이상, 보다 바람직하게는 6 이상, 보다 바람직하게는 7 이상, 보다 바람직하게는 8 이상, 보다 바람직하게는 9 이상, 보다 바람직하게는 10 이상의 분석물 농도의 동적 범위를 갖는다.
센서 장치에서의 Orco의 결여
곤충 취기물질 수용체를 사용하는 이전에 알려진 모든 시스템/검정은 곤충 OrX와 취기물질 공동 수용체(Orco)의 조합을 활용한다. 이것은 동족체 리간드에 특이적으로 결합할 수 있고 리간드의 결합에 대한 반응을 도입할 수 있는 적절한 조합의 OrX/Orco와의 곤충 취기물질 수용체(OR) 복합체를 생성하기 위해 OrX 및 Orco 성분 둘 다를 요구하는 선행 기술에서의 매우 강한 편향을 나타낸다.
이전에 논의된 바와 같이, (Orco 및 OrX의) 곤충 OR 복합체는 리간드 의존성 이온 채널을 형성하며, 그것은 생체내 신호 및 종래 기술의 센서 시스템/분석에서의 신호를 변환시키는 이온 채널을 통한 이온 수송이다.
따라서, 본 발명의 추가의 매우 놀라운 특징은 본 발명의 센서가 Orco 공동 수용체의 부재하에 리간드/분석물 결합을 검출할 수 있는 능력이다.
한 실시양태에서, 센서는 10:1 미만, 바람직하게는 1:1 미만, 바람직하게는 0.1:1 미만, 바람직하게는 0.01:1 미만, 바람직하게는 0.001:1 미만, 바람직하게는 0.0001 미만:1, 바람직하게는 0.00001:1 미만의 OrX:Orco를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 센서는 곤충 취기물질 보조 수용체(Orco)를 포함하지 않는다.
본 발명의 센서의 다른 장점들
센서 또는 본 발명은 편의성, 휴대성, 안정성, 신속한 검출, 감도 및 용이 한 측정의 관점에서 이전에 공지된 곤충 OR 기반 시스템/검정에 비해 다수의 잠재적인 이점을 추가로 제공한다.
분석물 매질
분석물은 기체 또는 액체 매질에 존재할 수 있다.
임의적인 포획 구성요소
센서 장치는 분석물을 포획하고 분석물을 수용체에 제공하는 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 이 구성요소는 일부 실시양태에서 휘발성 분석물을 포획하여 OrX에 제공하기에 유용할 수 있다. 이는 액체 또는 기상에서 목표 VOC를 처리하는 마이크로채널을 포함할 수 있다(50). 미세 유체 시스템은 액체(50, 51) 및 기상(53, 52, 54)에서 센서 표면에 표적 분자를 전달하도록 디자인되었다.
멀티플렉싱
본 발명은 다수의 상이한 OrX 단백질을 사용하는 멀티플렉스 접근법을 고려한다. 이러한 방식으로, 사용자는 다수의 분석물에 민감한 멀티플렉스 장치를 구성할 수 있다. 이러한 다중화된 장치는 본원에 기술된 바와 같이 수 십, 수 백 또는 수 천개의 센서를 포함할 수 있다. 멀티플렉스 장치는 또한 장치에 더블 체크를 도입하기 위해 동일한 OrX에 결합된 2개 이상의 센서를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 각각이 상이한 또는 동일한 수용체를 포함하는 다중 센서 기판을 갖는 칩의 사용을 고려한다. 본 발명의 센서 장치 구성요소는 그러한 칩일 수 있다.
본 발명의 센서 장치를 사용하는 방법
본 발명은 전술한 바와 같이, 분석물 및/또는 환경 내의 분석물의 존재를 검출하기 위해 본 발명의 센서 장치를 사용하는 방법을 제공한다.
제어 및 보정
사용자는 장치의 전기적 특징을, 장치가 대조용 물질, 알려진 분석물 또는 둘 모두에 노출될 때 측정되는 상응하는 전기적 특징과 비교할 수 있다. 또한 사용자는 샘플에서 하나 이상의 분석물의 존재를 추정할 수 있다. 이는, 샘플에서 관찰된 전기적 특징을, 알려진 양의 관심 분석물을 갖는 대조용 물질 또는 기준물질로부터 수집된 데이터 지점에 상응하는 전기적 특징의 보정 곡선과 비교함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방식으로, 사용자는 장치가 접촉된 샘플에 존재하는 분석물의 농도를 추정할 수 있다.
사용자는 하나 이상의 알려진 분석물에 대한 장치의 노출에 상응하는 장치의 하나 이상의 전기적 특징의 라이브러리를 구성할 수 있다. 예를 들어, 사용자는 장치가 다양한 농도의 분석물에 노출될 때 관찰되는 전기적 특징을 나타내는 결과의 라이브러리를 작성할 수 있다.
본 발명의 센서 장치의 제조 방법
센서 장치
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 곤충 OrX와 센서 장치의 기판 사이의 전기적 연통을 확립하는 단계를 포함하는 센서 장치 제조 방법을 제공하고, 이 때 센서 장치는 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성된다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 곤충 OrX를 기판에 연결시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, OrX 연결된 기판이 센서 장치 내에 조립되기 전에, OrX가 기판에 연결된다.
바람직하게는, 센서의 구성요소, 연결 및 기능성은 본원에 기술된 바와 같다.
센서 구성요소
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본원에서 정의된 기판과 전기적으로 연통되는 OrX를 포함하는 센서 장치용 구성요소를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같이, OrX와 기판 사이에 전기적 연통을 확립함을 포함한다. 이 구성요소는 본 발명에 따른 센서 장치에 추가하는데 유용하다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 센서 장치를 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명에 따른 센서 장치를 제조하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 다른 구성요소에 상기 구성요소를 추가함을 포함한다.
본 발명의 EIS 센서 장치의 제조 방법
실시양태에서, 기판은 본원에 기재된 전기 화학 전지의 작동 전극이다.
따라서, 한 실시양태에서, 방법은 곤충 OrX와 전기 화학 전지의 작동 전극 사이에 전기적 연통을 확립하는 단계를 포함하고, 이 때 전기 화학 전지는 작동 전극의 전기 화학적 임피던스의 변화를 검출하여 센서 장치를 형성하도록 구성된다.
예로서, 본 발명의 EIS 장치를 제조하기 위한 적합한 방법은 실시예 부분에서 설명된다. 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본 발명의 CNT-FET 센서 장치의 제조 방법
실시양태에서, 기판은 본원에서 설명된 바와 같은 CNT-FET 장치의 채널이다.
따라서, 한 실시양태에서, 방법은 곤충 OrX와 CNT-FET 장치의 채널 사이에서 전기적 연통을 확립하는 단계를 포함하고, 이 때 CNT-FET 장치의 채널은 CNT-FET 장치의 소스-게인 전류의 변화를 검출하여 센서 장치를 형성하도록 구성된다.
예로서, 본 발명의 CNT-FET 장치의 제조에 적합한 방법은 실시예 부분에서 설명된다. 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본 발명의 QCM 센서 장치의 제조 방법
실시양태에서, 기판은 본원에 기술된 바와 같은 수정 미세저울(QCM)의 공진기 구성요소이다.
따라서, 한 실시양태에서, 방법은 곤충 OrX와 QCM의 공진기 구성요소 사이에서 전기적 연통을 확립하는 단계를 포함하고, 이 때 QCM은 공진기 구성요소에 인가되는 교번 전기장에 의해 유도되는 진동의 공진 주파수의 변화를 검출하여 센서 장치를 형성하도록 구성된다.
예로서, 본 발명의 QCM 장치를 제조하기 위한 적절한 방법은 실시예 부분에 설명되어 있다. 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
일반적인 정의와 방법
OrX 단백질/폴리펩티드 및 단편
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는, 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결된, 임의의 길이, 그러나 바람직하게는 아미노산 5개 이상의 아미노산 쇄(전장 단백질 포함)를 포괄한다. 본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩티드는 바람직하게는 부분적으로 또는 전체적으로 재조합 또는 합성 기술을 사용하여 생산된다.
폴리펩티드의 "단편"은 바람직하게는 폴리펩티드의 기능을 수행하고/하거나 폴리펩티드의 3차원 구조를 제공하는 폴리펩티드의 부분 서열(subsequence)이다.
OrX 폴리펩티드의 "기능적 단편"은 분석물에 결합하고 분석물 결합시 구조 변화를 일으키는 기능을 수행할 수 있는 OrX의 부분 서열이고, 이 때 구조 변화는 기능적 단편이 결합되는 기판의 전기적 특징의 변화를 초래한다.
용어 "재조합"은 자연적인 맥락상 그를 둘러싸는 서열로부터 제거된 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 자연적인 맥락상 존재하지 않는 서열과 재조합된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
"재조합" 폴리펩티드 서열은 "재조합" 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 번역에 의해 생성된다.
변이체
OrX 폴리펩티드의 변이체는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가된, 특이적으로 확인된 서열과 상이한 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 변이체는 천연 발생 대립 유전자 변이체 또는 비-천연 발생 변이체일 수 있다. 변이체는 동일하거나 다른 종으로부터 유래한 것일 수 있으며, 동족체, 상동체(paralogue) 및 유사체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 확인된 폴리펩티드의 변이체는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 보유한다. 바람직하게는, OrX 폴리펩티드 변이체는 분석물을 결합하고 분석물 결합시 구조적으로 변하는 기능을 수행할 수 있고, 이 때 구조 변화는 기능적 단편이 결합된 기판의 전기적 특징의 변화를 초래한다.
변이체 폴리펩티드 서열은 바람직하게는 본 발명의 서열에 대해 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타낸다. 상동성은 바람직하게는 확인된 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 계산된다.
폴리펩티드 서열 상동성은 다음과 같은 방식으로 결정될 수 있다. bl2seq에서, BLASTP[블라스트 프로그램 세트(BLAST suite of programs), 버전 2.2.5, 2002년 11월]를 사용하여, 주제(subject) 폴리펩티드 서열을 후보(candidate) 폴리펩티드 서열과 비교하는데, 상기 프로그램 세트는 ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/에서 월드 와이드 웹(World Wide Web) 상의 NCBI 웹사이트로부터 공개적으로 입수가능하다.
폴리펩티드 서열 상동성은 또한 전역 서열 정렬 프로그램을 사용하여 후보 및 주제 폴리뉴클레오티드 서열간의 중첩의 전체 길이에 걸쳐 계산될 수 있다. 논의된 바와 같이 엠보스-니들(EMBOSS-needle)(http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/에서 입수가능함) 및 GAP[후앙(Huang, X.) (1994) Global Sequence Alignment, Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235]도 폴리펩티드 서열 상동성을 계산하는데 적합한 전역 서열 정렬 프로그램이다.
폴리펩티드 % 서열 상동성을 계산하기 위한 바람직한 방법은 클러스털 X(Clustal X)[쟝무진(Jeanmougin) 등, 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-405]를 사용하여 비교될 서열을 정렬하는데 기초한다.
그의 생물학적 활성을 현저하게 변화시키지 않는 기재된 폴리펩티드 서열의 하나 또는 수 개의 아미노산의 보존적 치환 또한 본 발명에 포함된다. 숙련된 기술자는 표현형적으로 조용한 아미노산 치환을 제조하는 방법을 알고 있을 것이다(예를 들어, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306 참조).
폴리펩티드를 생산하는 방법
변이체 폴리펩티드를 비롯한 본 발명에 사용된 폴리펩티드는 당 업계에 잘 공지된 펩티드 합성 방법, 예를 들어 고상 기술[예: 스튜어트(Stewart) 등, 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co] 또는 예컨대 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 431A 펩티드 합성기[캘리포니아주 포스터 시티(Foster City)]를 사용하는 자동화된 합성을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 합성 동안 폴리펩티드의 돌연변이 형태가 또한 생산될 수 있다.
바람직하게는, 폴리펩티드 및 변이체 폴리펩티드를 적합한 숙주 세포에서 재조합적으로 발현시키고 후술하는 바와 같이 세포로부터 분리한다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드는 당 업자에게 공지된 방법에 의해 편리하게 합성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생적일 수 있거나, 예를 들어 서열이 재조합 발현되는 세포에 대한 바람직한 코돈 사용을 통해 천연 발생 서열로부터 변형될 수 있다.
구조물 및 벡터의 생산 방법
본 발명에서 사용하기 위한 유전자 구조물은 본 발명에서 사용하기 위한 OrX 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 예를 들어 세균, 진균, 곤충, 포유류 또는 식물 유기체를 형질 전환하는데 유용할 수 있다.
유전자 구조물 및 벡터의 제조 및 사용 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987]; 오스벨(Ausubel) 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987]에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오티드, 구조물 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 생성시키는 방법
폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 본 발명에 사용하기 위한 폴리펩티드의 재조합 생성을 위해 당해 분야에 널리 공지된 방법(예를 들어, 샘브룩 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; 오스벨 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987)에 유용하다. 이러한 방법은 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 적합하거나 좋은 조건에서 적절한 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 이어서 배양액 중에 임의적으로 분비될 수 있는 발현된 재조합 폴리펩티드를 당 업계에 잘 공지된 방법[예를 들어, 도이처(Deutscher), Ed, 1990, Methods in Enzymology, Vol 182, Guide to Protein Purification]에 의해 매질, 숙주 세포 또는 배지로부터 분리할 수 있다.
본원에서 사용되는 "포함하는"이라는 용어는 "적어도 부분적으로 구성됨"을 의미한다. "포함하는"이라는 용어를 포함하는 본원의 각 서술을 해석할 때, 이 용어가 앞에 붙는 것 외의 특징이 또한 나타날 수 있다. "포함하다" 같은 관련 용어는 동일한 방식으로 해석되어야 한다.
본원에 개시된 수치 범위(예를 들어, 1 내지 10)에 대한 언급은 또한 그 범위 내의 모든 유리수(예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10) 및 그 범위 내의 유리수의 임의의 범위(예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5 및 3.1 내지 4.7)에 대한 언급도 혼입하고자 하며, 따라서 본원에 명시적으로 기재된 모든 범위의 모든 더 작은 범위는 이로써 명시적으로 공개된다. 이들은 단지 의도된 것의 예일 뿐이며, 열거된 가장 낮은 값과 가장 높은 값 사이의 가능한 모든 수치 조합은 유사하게 본 출원에 명시적으로 언급된 것으로 간주되어야 한다.
대안적인 실시양태 또는 구성은 본원에서 도시, 기재 또는 언급되는 둘 이상의 부품, 요소 또는 특징의 임의의 또는 모든 조합을 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
또한, 본 발명은 개별적으로 또는 전체적으로 본원의 명세서에서 언급되거나 표시된 부품, 요소 및 특징, 또는 둘 이상의 상기 부품, 요소 또는 특징의 임의의 또는 모든 조합으로 구성되는 것으로 넓게 기재된다.
본 발명이 속하는 기술 분야의 당 업자에게는, 특허청구범위에서 정의된 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서, 본 발명의 구조 및 많은 상이한 실시양태 및 응용의 많은 변화가 암시될 것이다. 본원에서의 개시 및 설명은 단지 예시적인 것이고 어떠한 의미로도 제한하려는 것은 아니다. 본 발명이 관련된 분야에서 공지된 등가물을 갖는 특정 정수가 본원에서 언급되는 경우, 그러한 공지된 등가물은 개별적으로 기재된 것처럼 본원에 혼입되는 것으로 간주된다.
실시예
이제 다음의 비제한적 실시예를 참조하여 본 발명을 설명할 것이다.
본 발명의 범위를 상술한 예로 한정하려는 의도는 아니다. 당 업자라면 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 많은 변형이 가능하다.
실시예 1 - 전기 임피던스 분광법(EIS)을 이용한 본 발명의 센서의 예시
1.0 실험 방법
1.1 물질
N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드(EDC), N-하이드록시석신이미드(NHS), 인산 완충 염수(PBS) 펠렛, 6-머캅토헥산산(MHA), 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 시그마 알드리치(시그마 알드리치)로부터 구입하였다. 모든 수용액은 증류수[밀리-큐(Milli-Q) 18.2MΩ]를 사용하여 제조하고, 마이크로사이언스 하이드라플론(Microscience Hydraflon) 필터(0.22μm)로 여과한 다음, 달리 언급하지 않는 한 10분동안 N2로 플러시하였다. 1.6mm 금(Au) 디스크 전극, 백금(Pt) 나선형 보조 전극 및 Ag/AgCl 기준 전극은 바시(BASI)에서 구입하였다.
1.2 리포좀 관련 OR 서브유닛(subunit)의 제조
포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜콜린(PC) 및 콜레스테롤(CH)을 5:3:3:1의 몰비로 함유하는 용액을 작은 유리관에서 N2 기체의 흐름 하에 증발시킨 후 진공하에 1시간동안 건조시킴으로써 제조한 인지질 용액을 사용하여, 리포좀을 제조하였다.
이러한 지질을 5분동안 볼텍싱(vortexing)에 의해 재수화 완충액(10mM HEPES pH 7.5, 300mM NaCl) 1mL에 재현탁시킨 후, 마이크로손(Microson) 초음파 세포 파괴 장치[메디소닉(Medisonic), 미국]에서 20% 동력으로 10 내지 20초동안 5회 초음파 처리하였는데, 각 초음파 처리 사이에 샘플을 1분간 얼음에 놓았다. 리포좀의 형성을 촉진하기 위해, 액체 질소에서 40℃ 수조로 관을 옮김으로써 10회의 동결/해동 단계를 수행했다.
그 후, 아베스틴 리포소패스트(Avestin LiposoFAST) 압출기 단위장치(아베스틴, 독일)를 사용하여 100nm 폴리카보네이트 막을 통해 지질 용액을 11회 통과시킴으로써 리포좀을 분립(sizing)시켰다. 글리세롤을 최종 부피의 10%로 첨가하고 10mg/mL의 분취량을 액체 질소에서 급속 동결시키고 -80℃에서 저장하였다.
정제 OR 서브유닛43을 기어츠마(Geertsma) 등(2008)34의 프로토콜과 유사한 방식으로 합성 리포좀 중으로 재구성시켰다.
사용하기 전에, 리포좀을 얼음 위에서 해동시킨 다음 실온에서 15분동안 0.2% CHAPS로 항온처리하여 탈안정화시켰다. 그런 다음 200μg의 정제된 취기물질 물질 수용체14를 1mg의 리포좀에 첨가하고 실온에서 1시간동안 10rpm으로 회전시켰다. 바이오-비즈(Bio-Beads) SM-2[바이오-라드(Bio-Rad), 미국] 25mg을 4회 추가하고 각각 4℃에서 30분, 2시간, 밤새, 또한 추가로 2시간 항온처리함으로써 과량의 세제를 제거했다. 바이오-비즈는 각 항온처리 후에 제거하였다. OR 통합 리포좀을 100,000g에서 1시간동안 원심분리하여 펠렛화하고 재수화 완충액 500μL에 재현탁시켰다. 아큐덴즈[애큐릿 케미컬 앤드 사이언티픽 코포레이션(Accurate Chemical & Scientific Corporation), 미국]를 사용하여 밀도 구배 초원심분리(DGU)에 의해 OrX의 리포좀 내로의 통합을 평가하였다. 동일한 부피의 80% 아큐덴즈 용액을 첨가함으로써 40% 아큐덴즈로 통합된 리포좀을 가져오고, 초원심분리관의 바닥에 놓고, 30% 아큐덴즈 용액과 DGU 완충액(25mM HEPES pH 7.5, 100mM NaCl, 10% 글리세롤)을 위에 넣었다. 샘플을 4℃에서 4시간동안 100,000g에서 원심분리하였다. 리포좀은 아큐덴즈 DGU 이후 낮은 밀도로 인해 구배의 맨 위로 부상한다.
1.3 전극 세정
골드 디스크(2mm) 전극을 알루미나 페이스트로 연마하여 2분간 세정하고, 순수한 에탄올로, 이어 밀리-큐 물로 각각 5분간 초음파 처리하였다. 그 다음, 티올 탈착을 위해, 3단자 전기 화학 전지에서 0.1M NaOH에서 각각 30초동안 -1.4V를 인가하였다. 전극을 다시 알루미나 페이스트로 2분간 연마하고, 순수한 에탄올, 이어 밀리-큐 물로 각각 5분간 초음파 처리했다. 5회 사이클을 위해 0.5M H2SO4에서 50mV/초의 스캔 속도로 -0.2V와 1.6V 사이에서 사이클링시킴으로써 임의의 잔류 유기 분자를 세정하였다.
1.4 자체 조립 단일층(SAM) 제조 및 활성화
세정된 전극을 6-머캅토헥산산(MHA)의 2mM 에탄올 용액에 밤새 침지시켰다. 그 후, 전극을 무수 에탄올 및 밀리-큐 물로 처리하였다.
MHA의 카복실기의 활성화는 100mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)와 50mM N-하이드록시석신이미드(NHS)의 혼합물을 함유하는 PBS(pH: 6.5) 용액 중에서 28℃에서 60분간 항온처리함으로써 수행하였다.
1.5 리포좀 항온처리
-COOH 활성화 후, 실온에서 20분동안 PBS(pH 7.4)중 리포좀 1:100 희석액 100μL 중에서 전극을 항온처리하였다. 그런 다음 이들을 과량의 PBS(pH 7.4)로 부드럽게 헹구었다.
1.6 표적 취기물질 용액 제조 및 항온처리
1% DMSO를 함유하는 PBS(pH 7.4) 중에서 표적 용액을 희석하여, 128pM, 640pM, 3.2nM, 16nM, 80nM, 400nM 및 2μM의 농도를 얻었다. 전극을 각각 5분동안 적절한 취기물질 용액에서 항온처리하고 PBS(pH 7.4)로 부드럽게 씻어내었다.
| 취기물질 수용체 | 참조 | 공지 리간드 | 대조용 물질 |
| Or10a | 43 | 메틸 살리실레이트 | 메틸 헥사노에이트 |
| Or22a | 43 | 메틸 헥사노에이트 | 메틸 살리실레이트 |
| Or35a | 43 | E2-헥세날 | VUUA1 |
1.7 전기 화학적 임피던스 분광법(EIS) 측정
이어, 기준에 대해 -0.7V를 인가하여 100kHZ 내지 0.2HZ 사이에서, 대전극(CE)으로서의 백금(Pt) 와이어, Ag/AgCl(3M KCl, +0.197V vs. SHE) 기준 전극(RE), 및 작동 전극(WE)으로서의 리포좀을 갖는 1.6mm 금 디스크 전극을 포함하는 3단자 전기 화학 전지에서 EIS 측정을 수행하였다. 표면의 전하 이동 저항은 각각의 취기물질 항온처리 후 감소하고 2μM의 취기물질을 첨가한 후에도 변하지 않았다.
2.0 결과
깨끗한 금 표면을 MHA와 함께 밤새 항온처리하여 -COOH기로 표면을 작용화시켰다. 그런 다음, 리포좀 운반 수용체(Or35a, Or22a 또는 Or10a)를, NHS-EDC 화학을 통해 MHA에 공유결합시켰다(도 2). 농도를 증가시키면서 표적(리간드) 항온처리 전후에 EIS 측정을 수행하였다. 이 연구에서 사용된 수용체와 리간드는 표 1에서 볼 수 있다.
수용체-리간드 상호작용이 전체 표면 전하를 변화시키고 그러한 변화가 EIS에서 관찰될 것으로 기대된다. 도 3은 Or35a로 작용화된 전극 상에서의 후속 리간드(E2-헥세날) 항온처리에 의해 주도된 임피던스 스펙트럼 전개를 나타낸다. 이 논문에서 연구된 모든 유형의 수용체에 있어서, 증가된 리간드 양과의 상호작용시 전극의 임피던스는 감소했다.
전극의 전하 이동 저항(Rct)은, 정위상 요소(CPE)와 직렬로, 또한 전하 이동 저항(Rct) 및 워버그 확산 요소와 병렬로 용액 저항(Rs)을 포함하는 랜들 등가 회로[Rs+CPE/(Rct+W)]에, 수득된 데이터를 핏팅시킴으로써 계산되었다. 그런 다음, 얻어진 Rct 값을 R0 ct로 정규화하였으며(ΔRct), 이 때 R0 ct는 리간드 배양 전의 전극을 나타낸다. 보정 곡선은 센서 응답을 ΔRct/R0 ct 대 log[C(리간드)]로서 정의함으로써 수득되었다(도 4).
도 4는 감지 실험을 3회 반복(Or10a 및 Or35a) 및 2회 반복(Or22a)함으로써 얻은, 상대적으로 작은 오차 막대로 강조 표시된 검출의 재현성을 도시한다. 수득된 센서는 차수 3 내지 4의 동적 범위 내에서 매우 낮은 검출 한계를 가지고 있다. 신호/배경 변동성(노이즈)이 3보다 큰35-38 것으로 고려될 때, 가장 낮은 검출가능한 취기물질의 농도는 Or10a의 경우 3.3×10-10M 메틸 살리실레이트, Or35a의 경우 3.6×10-11M E2-헥세날, 및 Or22a의 경우 2.8×10-10M 메틸 헥사노에이트인 것으로 계산되었다. 이러한 검출 한계는 취기물질 결합 단백질이 리포좀을 사용하지 않고 센서 표면에 직접 고정된 이전 연구보다 상당히 낮다. 예를 들어, 금 기판에 직접 고정된 취기물질 결합 단백질(BdorOBP2)의 경우, 센서는 퀸 페로몬(메틸-p-하이드록실 벤조에이트), 경보(alarm) 페로몬(이소아밀 아세테이트), 리날룰, 게라니올, β-이오논, 4-알릴베라트롤, 페닐아세트알데하이드, 디부틸 프탈레이트39에 대해 약 마이크로몰(10-6M)의 검출 한계를 제공하였다. 또 다른 연구에서는, Drosophila OBP LUSH의 서열을 포함하는 펩티드 용액을 다시 금 표면에 직접 고정시켰고 1-헥산올에 대해 4.9×10-5M 및 3-메틸 부탄올에 대해 5.6×10-5M의 검출 한계를 획득하였다. 최근의 연구에서는, 금 대신 탄소 나노튜브를 감지 요소로 사용하였고, 다시 OBP 단백질은 어떠한 매질도 없이 직접 고정시켰다. 저자들은 1.8×10-2M 2-헵타논과 0.52×10-10M TNT가 검출될 수 있다고 보고했다.
얻어진 센서의 감도는 각 센서36, 42, 38의 선형 범위(최저 농도 3개)의 기울기를 사용하여 계산하였으며, Or10a의 경우 0.313단위/log(conc/M)], Or35a의 경우 0.116단위/[log(conc/M)], Or22a의 경우 0.156단위/[log(conc/M)]이다.
3.0 토론
본 발명자들은 금 전극 표면에 리포좀을 결합시키기 위한 최적 길이의 링커로서 6-머캅토헥산산(MHA)을 확인하기 전에 상이한 자체 조립 단일층(SAM 층)을 초기에 시험했다. 이전에는 16-머캅토헥사데칸산(16-MHDA)을 사용하여 금 표면을 작용화시키고 금 전극 위에 리포좀을 결합시켰다. 그 실험의 결과는 높은 감도를 나타내지 않았고, 리포좀이 전극 표면으로부터 너무 멀리 떨어져 있어서 검출가능한 신호를 제공할 수 없었음을 암시하였다. 이러한 장애를 극복하기 위해 본 발명자들은 보다 짧은 6-머캅토헥산산을 대신 사용했다. 본 발명자들은 이 링커가 짧으면 금과 리포좀 사이에서 더 빠른 전자 전달을 제공할 것이므로 표면에서 발생하는 모든 사건을 보다 민감한 방식으로 모니터링할 수 있다고 가정했다. 조질 세포막에서 포유류의 취기물질 수용체를 고정시킨 두 논문의 경우, 이들은 SAM 형성을 위해 16-머캅토헥사데칸산(16-MHDA)34 또는 6-머캅토헥사데칸산(6-MHDA)14을 사용했다.
비교 데이터에 의하면, 여기에 개시된 곤충 OR-EIS 바이오센서 포맷은 곤충 취기물질 수용체와 함께 사용된 다른 센서 포맷보다 더 민감하다는 것을 보여준다.
표 2는 취기물질 수용체 기반 장치에 관해 발표된 데이터를 요약한 것이다. 본 장치는 세포 기반 센서보다 100배 내지 10,000배 더 높은 감도를 제공한다.
| 센서/검정 접근법 | 수용체-분석물 | 감도 한계 | EC50 | 참조 |
| 미소유체 칩 상의 안정한 Sf21 세포주-형광 | BmOR1/Orco-봄비콜 페로몬 BmOR3/Orco-봄비칼 페로몬 |
1×10-6M 0.3×10-6M |
4.39×10-6M 2.03×10-6M |
13 |
| 미소유체 장치 상의 제노푸스 난모세포-두 전극 전압 클램핑(TEVC) | BmOR1/Orco-봄비콜 페로몬 BmOR3/Orco-봄비칼 페로몬 PxOR1/Orco-Z11-16:Ald DOr85b/Orco-2-헵타논 |
10-8 - 10-6M* 10-8 - 10-6M* 10-8 - 10-6M* 10-8 - 10-6M* |
0.25×10-6M 0.38×10-6M 2.52×10-6M 45.6×10-6M |
12 |
| 곤충 OrX-EIS 장치 | DmOr10a-메틸 살리실레이트 DmOr22a-메틸 헥사노에이트 DmOr35a-E2-헥세날 |
3.3×10-10M 2.8×10-10M 3.6×10-11M |
~10-9M ~10-8M ~10-8M |
본 연구 |
| *는 인용된 참조문헌의 그래프 상에 플롯팅된 용량 반응 데이터의 육안 평가로부터 유추된 값을 나타낸다. | ||||
표 3은 세포 검정으로부터 얻은 데이터를 요약한다. 본 곤충 OrX-EIS 센서 데이터는 HEK293 세포 및 제노푸스 난모세포에서 발현된 OrX/Orco보다 민감하다. 이러한 시스템에서 일부 페로몬 수용체(PR)는 보통의 취기물질 수용체보다 훨씬 낮은 감도를 나타내며, 이는 이들 수용체가 페로몬 표적 분자에 대해 미세하게 조정되어 있는 것으로 추측된다.
| 센서/검정 접근법 | 수용체-분석물 | 감도 한계 | EC50 | 참조 |
| 곤충 Sf9 이주형 세포 검정 | EpOR1/Orco-게라니올 | 10-14M* | 1.8×10-12M | 17 |
| 곤충 Sf9 이주형 세포 검정 | EpOR3/Orco-시트랄 | 10-15M* | 1.1×10-13M | 17 |
| 곤충 Sf9 이주형 세포 검정 | DmOr22a/Orco-에틸 부티레이트 | 10-12M* | 1.58×10-11M | 3 |
| 곤충 Sf9 이주형 세포 검정 | BmOr19/Orco-리날룰 | 10-10M* | 4.69×10-9M | 18 |
| 곤충 Sf9 이주형 세포 검정 | BmOr45/Orco-벤조산 | 10-11M* | 1.44×10-10M | 18 |
| 곤충 Sf9 이주형 세포 검정 | BmOr47/Orco-벤조산 | 10-14M* | 1.42×10-11M | 18 |
| 곤충 Sf9 이주형 세포 검정 | Am151/Orco-플로랄 혼합물 | 10-10M* | 1.54×10-9M | 4 |
| 곤충 Sf9 이주형 세포 검정 | Am152/Orco-플로랄 혼합물 | 10-10M* | 6.55×10-9M | 4 |
| HEK293 안정세포 검정 | EpOR3/Orco-게라닐 아세테이트 | 1.0×10-6M | 19 | |
| HEK293 안정세포 검정 | ApolOR1/Orco-(+ApolPBP2, (E,Z)-6,11-헥사데카디에날:페로몬) | 10-15M* | 10-13M? | 20 |
| HEK293 안정세포 검정 | HR13/Orco-PBP2(+페로몬) | 10-13M | 200fM | 21 |
| HEK293 안정세포 검정 | HR13/Orco-DMSO(+페로몬) | 10-10M | 1.2nM | 21 |
| HEK293 안정세포 검정 | BmOR-1/Orco-PBP(+페로몬) | 10-12M | 22 | |
| HEK293 안정세포 검정 | DmOr22a/Orco-메틸 헥사노에이트 | Log=-7.5* | Log=-6.38 | 23 |
| HEK293 안정세포 검정 | AgOr65/Orco-유게놀 | Log=-7* | Log=-6.54 | 23 |
| HEK293 안정세포 검정 | DmOr22a/Orco-메틸 헥사노에이트 | Log=-7* | 1.17×10-6M | 24 |
| HEK293 안정세포 검정 | AgOr48/Orco-g-도데칼락톤 | Log=-8* | Log=-7.01 | 25 |
| 제노푸스 난모세포 | ECB (Z) OR3/Orco-E11 페로몬 | 10-9M | 12.5×10-9M | 2 |
| 제노푸스 난모세포 | ACB OR3/Orco-E12 페로몬 | 1×10-9M | 7×10-9M | 2 |
| 제노푸스 난모세포 | SexiOR13/Orco-Z9,E12-14:OAc 페로몬 | 3.158×10-6M | 26 | |
| 제노푸스 난모세포 | SexiOR16/Orco-Z9-14:OH 페로몬 | 9.690×10-7M | 26 | |
| 제노푸스 난모세포 | OscaOR1/Orco-E11-14:OH 페로몬 | 10-7M* | 10-6M | 27 |
| 제노푸스 난모세포 | MsiOR1/Orco-Z11-16:Ac 페로몬 | 10-7M* | 10-6M | 28 |
| 제노푸스 난모세포 | DiOR1/Orco-EII-16:Ald 페로몬 | 10-7M* | 10-6M | 28 |
| 제노푸스 난모세포 | BmOr1/Orco-봄비콜 페로몬 | 34×10-6M | 29 | |
| 제노푸스 난모세포 | BmOr1/Orco-봄비콜 페로몬 | 5.9×10-6M | 30 | |
| 제노푸스 난모세포 | HVOR6/Orco-Z9-14:ald 페로몬 | 9.79×10-7M | 31 | |
| 제노푸스 난모세포 | HVOR13/Orco-Z11-16:ald 페로몬 | 9.79×10-7M | 31 | |
| 제노푸스 난모세포 | OnOr1/Orco-E12-14:OAc 페로몬 | 2.6×10-7M | 32 | |
| 제노푸스 난모세포 | AgOR1/Orco-4-메틸페놀 | 4.12×10-7M | 33 | |
| 제노푸스 난모세포 | AgOR2/Orco-인돌 | 1.67×10-8M | 33 | |
| 제노푸스 난모세포 | AgOR8/Orco-1-옥텐-3-올 | 1.86×10-7M | 33 | |
| 제노푸스 난모세포 | AgOr10/Orco-인돌 | 1.37×10-7M | 33 | |
| 제노푸스 난모세포 | AgOr65/Orco-유게놀 | 3.44×10-8M | 33 | |
| *는 그래프 상에 플롯팅된 용량 반응 데이터의 육안 평가로부터 유추된 값을 나타낸다. | ||||
실시예 2 - 탄소 나노튜브-전계 효과 트랜지스터(CNT-FET)를 이용한 본 발명의 센서의 예시
1. 요약
본 발명자들은 곤충 OrX 서열을 사용하여 편리하고 민감한 센서 장치를 생산하였다. 나노디스크55, 56에 내장된 드로소필라 멜라노가스터 OR35a43 곤충 OrX 수용체는 1-피렌부탄산 석신이미딜 에스터(PBASE) 및 폴리히스티딘 작용화를 통해 CNT FET상에서 작용화되었다. CNT FET는 1fM 농도에서 시작하는 실시간 전류 측정 모드에서 표적 리간드 E-2-헥세날에 대해 명확한 전자 응답을 나타낸다. 결합의 특이성은 대조용 물질, PBS 및 메틸 헥사노에이트에 대한 OR35a 작용화된 CNT FET의 반응을 시험함으로써 입증된다. 특이성을 더욱 확실하게 하기 위해 미처리 CNT FET 및 빈 나노디스크 작용화된 CNT FET의 E-2-헥세날에 대한 반응도 시험한다.
2. 실험 방법
2.1 탄소 나노튜브 트랜지스터 장치 제작
탄소 나노튜브 전계 효과 트랜지스터(CNT FET) 센서 플랫폼을 제조하기 위해 계면활성제가 없는 용액 침착 경로를 사용하여 SiO2/Si 기판(SiO2=100nm) 위에 CNT를 먼저 침착시킨다58, 59. CNT 버키 페이퍼(bucky paper)[나노인테그리스(NanoIntegris)로부터의 99.9% 이소나노튜브-S]를 1시간동안 초음파 처리를 통해 디클로로벤젠(DCB)에 분산시킨다. 도 5a에 나타낸 바와 같이 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬핑 방법58 , 59을 통해 2-티올-피리딘(시그마 알드리치)의 얇은 층으로 SiO2 기판을 작용화시킨다. 도 5b에 도시되는 바와 같이, 2-티올-피리딘 작용화된 SiO2/Si 기판을 CNT DCB 현탁액에 30분 내지 6시간동안 침지시킨다58 , 59. 침지 시간은 CNT 박막 네트워크 형태를 제어할 수 있게 해준다. 기판을 CNT 현탁액으로부터 제거하고 에탄올 중에서 세정하고 깨끗한 N2에서 건조시킨다. 결과는 전체 기판 표면을 덮는 균일한 박막 CNT 네트워크이다.
전체 기판이 CNT로 코팅되기 때문에, FET 장치의 활성 채널을 형성할 CNT의 위치를 제어하는 것이 필수적이다. 그렇게 하기 위해, 광학 리소그래피를 사용하여 제어된 위치에서 패턴화시키기 전에 CNT 필름을 포토레지스트로 코팅한다. 포토레지스트 코팅된 CNT는 보호된 CNT FET 채널 영역을 형성한다. 그런 다음, 반응성 이온 에칭(Oxford Instruments Plasmalab 80)을 이용하여 노출된 CNT를 에칭한다. 에칭 조건은 600mTorr, 200와트, 40sccm O2 유량 및 에칭 시간 3분이다. 이것은 100μm(길이)×100μm(폭)의 CNT 박막이 제어된 위치에 남게 한다. 두 번째 포토리소그래피 단계에 이어, Cr/Au(5nm/50nm) 전극의 증착 및 리프트-오프에 의해 소스 및 드레인 전극을 한정한다. 이 과정은 도 6에 개략적으로 제시된다.
마지막으로, 전극을 포토리소그래피에 의해 AZ1518 포토레지스트로 봉지화하여 전기 절연 웰로 작용시키는데, 이는 감지 실험 동안 누전 및 전극 손상을 방지한다(도 7).
전극 봉지화 후, 노출된 CNT 구역은 100μm(길이)×100μm(폭)가 되며, 이는 궁극적으로 장치의 활성 감지 영역이다20. 포토레지스트로 봉지화된 CNT FET 장치를 200℃ 핫 플레이트에서 10분간 베이킹한 후 점차적으로 실온으로 냉각시킨다. 도 8에 도시된 바와 같이, 수제 폴리디메틸실록산(PDMS)을 CNT FET 작용화 및 전기적 시험을 위해 기판에 영구적으로 부착한다.
2.2 후각 수용체 고정
2.2.1 탄소 나노튜브의 비-공유 작용화
CNT의 전자 특성을 손상시키지 않으면서 후각 수용체를 CNT 표면 상에 고정시키기 위해, 비-공유 작용화 경로가 선택된다. OrX 작용화는 his-태그 화학 반응을 통해 이루어지고, 이 때 CNT 표면은 먼저 1-피렌부탄산 석신이미딜 에스터(PBASE)(95% 순도, 시그마 알드리치)로 작용화된다. PBASE 용액은 디메틸 설폭사이드(DMSO) 용매에서 10mM 농도로 만들어지고, PBASE가 DMSO에 완전히 용해될 때까지 30초동안 1600rpm으로 교반된다. 120㎕의 PBASE 용액을 실온에서 1시간동안 PDMS 시험 웰에 첨가한다. PBASE 작용화 후, 과량의 PBASE를 씻어내기 위해 CNT FET를 순수한 DMSO 용매 중에서 3번 세정한다. 장치 기판에서 잔류 DMSO를 제거하기 위해 샘플을 인산염 완충 염수(PBS, pH=7.4)에서 3회 세척한다.
2.2.2 니트릴로트리아세트산 작용화
PBASE 작용화된 CNT FET를 11.3mM 농도의 니트릴로트리아세트산(NTA, Mw 약 191.14g/몰) 용액에 2시간동안 침지시켜 NTA로 작용화시킨다. PBS중 11.3mM의 NTA를 100mM NTA 모용액(모용액은 사용하지 않을 때 보통 4℃의 냉장고에서 보관됨)으로부터 희석시키고 NTA 용액 120㎕를 실온에서 작용화시키기 위해 PDMS 웰에 첨가한다. 과량의 NTA는 PBS로 3회 세척한 다음 탈이온수(DI 물, 18.2Ω·cm)에 적어도 1시간동안 담가두어 세정한다.
2.2.3 황산니켈의 작용화
NTA 작용화된 CNT를 11.3mM 황산니켈(NiSO4, Mw 약 154.76g/몰) 용액에서 30분동안 항온처리한다. PBS중 11.3mM NiSO4는 100mM NiSO4 모용액으로부터 희석한다(사용하지 않을 때는 모용액을 4℃ 냉장고에 보관한다). 120㎕의 NiSO4 용액을 실온에서 작용화를 위해 PDMS 웰에 첨가하였다. 과량의 NiSO4는 PBS로 3회 세척하여 제거한다.
2.2.4 후각 수용체 작용화
his-태그 친화성 결합을 통해 Ni-NTA 작용화된 CNT FET에 OR/나노디스크55, 56를 고정시킨다. 나노디스크 용액을 제조하기 위해, 벌크 OrX/나노디스크 용액을 1:10 또는 1:100 희석으로 PBS 완충액에 희석시킨다. 1:10 희석액을 제조하기 위해, 10㎕의 나노디스크 모용액을 100㎕의 PBS에 첨가한다. 1:100 희석액을 만들기 위해, 1㎕의 나노디스크 모용액을 100㎕ PBS에 첨가한다. OrX/나노디스크 모용액은 사용하지 않을 때는 -80℃의 냉동고에 보관하거나 -20℃의 냉동고에 최대 1주일동안 보관한다. 희석된 나노디스크를 PDMS 웰에 첨가하고 전체 CNT 표면을 실온에서 작용화하기 위해 30분동안 나노디스크에 담근다. 작용화 공정 후에, PBS에서 3회 세척하여 과량의 나노디스크를 세정한다.
2.3 전기적 측정
전기 측정을 수행하기 위해, 도 9에 도시된 바와 같이, 마이크로 조작기와 럭커 앤 콜스(Rucker and Kolls) 프로브 스테이션을 통해 PDMS 웰과 소스, 드레인 및 게이트 전극을 장치에 설치하였다. 전기 측정을 시작하기 전에, PBS 완충액(1% DMSO 함유) 100㎕를 시험 웰에 첨가하였다. 게이트 전극은 플라스틱으로 싸인Ag/AgCl 와이어[인 비보 메트릭(In Vivo Metric)]이며, Ag/AgCl 말단의 노출된 구역을 PBS 완충액에 완전히 삽입하여, 활성 영역을 변경할 때 발생하는 것으로 알려져 있는 임의의 전기적 결함을 피할 수 있다. 애질런트 4156C 매개변수 분석기가 모든 전기 측정에 사용된다20. 매개변수 분석기는 우수한 감도를 가지며, 펨토암페어 수준에서 전류를 정확하게 측정할 수 있다.
전송(Vlg-Ids) 측정 동안 게이트 전압(Vlg)은 -500mV에서 +1V 사이에서 변하고 소스 드레인 전압(Vds)은 고정 값(50mV, 100mV 또는 200mV)으로 설정된다. 실시간 감지 측정을 위해 Vlg를 0으로 설정하고 Vds를 고정 값(50mV, 100mV 또는 200mV, 1초의 시간 간격으로)으로 설정한다.
2.4 리간드 희석
E-2-헥세날 리간드 용액을 100mM 모용액으로부터 감지 실험에 필요한 농도 범위로 희석한다. DMSO중 100mM E-2-헥세날 모용액을 제조하기 위해, 8.4M E-2-헥세날(시그마 알드리치에서 구입) 5㎕를 취해 DMSO 415㎕와 혼합하고 사용하지 않을 때 4℃에서 냉장고에 보관한다. 용액을 시험 범위까지 더 희석시키기 위해 PBS 완충액을 사용한다. PBS(1% DMSO 함유)중 E-2-헥세날의 측정 범위는 1fM 내지 1nm(10배 증가) 또는 64pM 내지 200nM(5배 증가)이다. 실시간 측정 동안, PBS 용액(1% DMSO 함유)을 대조용으로 첨가하고 농도를 증가시키면서 분석물을 추가로 첨가한다.
3. 결과 및 토론
3.1 OR35a/나노디스크 작용화 이후 CNT FET의 전달 특징
감지 측정을 하기 전에 CNT FET 전달 특징을 측정하여 작용화 공정의 성공 여부를 결정한다. 도 10은 OR35a 나노디스크 작용화된 CNT FET(원형)와 미처리 CNT FET(사각형)를 비교한 것으로, OR35a 나노디스크 작용화 후 문턱 전압이 음의 전압 방향으로 이동한 것이 분명한다. 순방향 I-V 스캔의 문턱 전압은 0.6V(초기)에서 0.42V(OR35a 나노디스크의 경우)로 변경되었다. 이것은 CNT60의 측벽에 부착된 나노디스크에 의해 산란된 캐리어뿐만 아니라 Ni+(NiSO4)의 양전하에 의한 정전 게이팅 효과 때문인 것으로 보인다. 이것은 CNT에 연결된 압타머의 음전하가 문턱 전압에서 긍정적인 변화를 일으키는 이전 연구와 유사한 OrX/나노디스크의 성공적인 고정의 증거이다. OR로 성공적으로 작용화된 CNT FET의 경우 문턱 전압은 항상 음의 전압 방향으로 이동한다.
3.2. OR35a 나노디스크 및 리간드 결합
3.2.1. OR35a 나노디스크로 작용화된 CNT FET(1:10 희석)
CNT FET를 OR35a 나노디스크(1:10 희석)로 전술한 바와 같이 작용화시켰다. PBS 완충액을 시험 웰에 첨가한 후, E-2-헥세날을 3분마다 64pM, 320pM, 1.6nM, 8nM, 40nM 및 200nM의 순서로 첨가하면서, 장치의 소스-드레인 전류를 지속적으로 모니터링한다. 도 11a에서, 전류는 64pM E-2-헥세날에 노출된 후 즉각적인 큰 감소를 보이는 반면, PBS 완충액의 첨가로는 전류가 약간 증가한다. 전류의 이러한 감소는 OR35a와 E-2-헥세날의 결합으로 인해 CNT FET58, 60, 62에 대한 유효 게이팅이 바뀌기 때문이다. 320pM, 1.6nM, 8nM 및 40nM E2-헥세날에 노출시 더 많은 전류 감소가 관찰된다.
도 11b는 정규화된 전류 응답 전류의 E-2-헥세날 농도에 대한 의존성을 보여준다. 전류 ΔI의 변화는 도 11a의 실시간 측정을 기반으로 ΔI=I-I0에 의해 계산되며, 여기서 I는 E-2-헥세날에 노출된 후 안정화된 전류이고 I0는 64pM E-2-헥세날을 시험 웰에 첨가하기 전의 초기 전류이다. 64pM에서, ΔI/I0는 10%만큼 변화한다. 초기 측정이 64pM 농도의 E-2-헥세날을 사용하여 수행되었기 때문에, S 같은 랑뮈르(Langmuir) 흡착 곡선을 수득하기 위해서는 더 낮은 농도와 더 많은 측정이 필요하다. 여기서, ΔI/I0는 더 높은 농도의 E-2-헥세날이 장치 웰에 첨가됨에 따라 계속 증가한다.
3.3 대조용 실험
현재의 반응이 진정으로 OR35a와 E-2-헥세날의 결합에 의한 것인지를 확인하기 위해, 대조용 실험을 수행했다. 이러한 측정은 미처리 CNT FET 및 빈 나노디스크로 작용화된 CNT FET로부터의 E-2-헥세날 반응이다. 실시간 전류 측정 값은 비교를 보여주기 위해 도 12에 플롯팅된다.
3.3.3 OR35 나노디스크가 대조용 리간드에 반응하지 않음을 확인함
비특이적인 리간드, 이 경우 메틸 헥사노에이트에 대한 OR35a 나노디스크의 전기적 응답도 측정된다(도 13). 도 13에서 측정된 농도 범위는 70nM 내지 500μM이며, 이는 도 12에서의 E-2-헥세날 농도의 측정 범위보다 높다. E-2-헥세날 첨가시 명확한 계단식 반응이 관찰되고 전류가 3분 후에 안정성에 도달하는 도 11에 제시된 결과와 달리, 도 13의 메틸 헥사노에이트 리간드에 있어서의 실시간 측정은 시간에 따른 배경 드리프트 전류를 나타내지만 명확한 응답은 보이지 않는다.
4. 결론
본 연구는 OR35a의 인식 능력과 전자 장치 플랫폼을 기반으로 한 유망한 후각 바이오센서 용도를 입증했다. 나노디스크에 내장된 OR35a는 CNT가 Ni-NTA로 작용화된 후에 폴리히스티딘 태그를 통해 CNT FET에서 작용화된다. Ni-NTA는 PBASE 작용화된 CNT FET의 N-하이드록시석신이미드기에 연결된다. 이 방법을 사용함으로써, OR35a 나노디스크 작용화된 CNT FET는 실시간으로 64pM E-2-헥세날 리간드에 대한 반응을 나타내고 PBS 완충액에 대한 반응은 보이지 않는다. 미처리 CNT FET와 빈 나노디스크 작용화된 CNT FET의 결과와 비교할 때 E-2-헥세날에 대한 명확한 전류 응답은 관찰되지 않는다. OR35a의 특이적 결합은 PBS 및 대조용 리간드 메틸 헥사노에이트에 대한 OR35a 작용화된 CNT FET로부터의 반응을 시험함으로써 또한 입증되었다. OR35a 나노디스크 작용화된 CNT FET는 실시간으로 E-2-헥세날의 특이적이고 민감한 검출을 입증했다.
비교 데이터는 곤충의 취기물질 수용체와 함께 사용된 다른 센서 포맷보다 본원에 개시된 곤충 OrX-CNT-FET 바이오센서 포맷이 더 민감하다는 것을 보여준다.
표 4는 취기물질 수용체 기반 장치의 공개된 데이터를 요약한 것이다. 본 장치가 세포 기반 센서보다 100배 내지 10,000배 더 큰 감도를 제공한다고 추정한다.
| 센서/검정 접근법 | 수용체-분석물 | 감도 한계 | EC50 | 참조 |
| 미소유체 칩 상의 안정한 Sf21 세포주-형광 | BmOR1/Orco-봄비콜 페로몬 BmOR3/Orco-봄비칼 페로몬 |
1×10-6M 0.3×10-6M |
4.39×10-6M 2.03×10-6M |
13 |
| 미소유체 장치 상의 제노푸스 난모세포-두 전극 전압 클램핑(TEVC) | BmOR1/Orco-봄비콜 페로몬 BmOR3/Orco-봄비칼 페로몬 PxOR1/Orco-Z11-16:Ald DOr85b/Orco-2-헵타논 |
10-8 - 10-6M* 10-8 - 10-6M* 10-8 - 10-6M* 10-8 - 10-6M* |
0.25×10-6M 0.38×10-6M 2.52×10-6M 45.6×10-6M |
12 |
| 곤충 OrX-EIS 장치 | DmOr35a-E2-헥세날 | 1×10-15M | 약 0.3×10-9M | 본 연구 |
| *는 인용된 참조문헌의 그래프 상에 플롯팅된 용량 반응 데이터의 육안 평가로부터 유추된 값을 나타낸다. | ||||
표 3은 세포 검정으로부터 얻은 데이터를 요약한다. 본 곤충 OrX-CNT-FET 센서 데이터는 HEK293 세포 및 제노푸스 난모세포에서 발현된 OrX/Orco보다 더 민감하다. 이러한 시스템에서 일부 페로몬 수용체(PR)는 정상적인 취기물질 수용체보다 훨씬 낮은 감도를 나타내며, 이는 이들 수용체가 페로몬 표적 분자에 미세 조정되어 있기 때문인 것으로 추측된다.
실시예 3 - 탄소 나노튜브-전계 효과 트랜지스터(CNT-FET)를 갖는 본 발명의 센서의 추가 예시
1. 요약
본 발명자들은 곤충 OrX 서열을 사용하는 편리하고 민감한 센서 장치를 추가로 예시하였다. 4개의 드로소필라 멜라노가스터 OrX 수용체(Or10a, Or22a, OR35a 및 Or71a)43, 63는 각각 나노디스크55, 56에 내장되고, 다른 최적화된 조건 하에서 1-페닐렌부탄산 석신이미딜 에스터(PBASE) 및 아민기 반응(OrX 및 막 스캐폴드 단백질에 존재함)을 통해 CNT FET 상에 작용화되었다. OrX 작용화된 CNT FET 각각은 1fM 농도에서 시작되는 실시간 전류 측정 모드에서 그들의 표적 리간드(Or10a-메틸 살리실레이트, Or22a-메틸 헥사노에이트, Or35a-E2-헥세날 및 Or71a-4-에틸 구아이아콜)에 대해 명확한 전자 반응을 보였다. 결합의 특이성은 대조용 물질, PBS 및 비-반응 리간드에 대한 각 OrX 작용화된 CNT FET의 반응을 시험함으로써 확인된다. 특이성을 더욱 확실하게 하기 위해, 미처리 CNT FET와 빈 나노디스크 작용화된 CNT FET의 표적 리간드에 대한 반응도 시험한다.
2. 실험 방법
2.1 물질
막 스캐폴드 단백질 MSP1E3D1은 큐브 바이오테크(Cube Biotech)(#26152)에서 구입하여 물에 5mg/mL로 재현탁시켰다. 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)은 아반티 폴라 리피즈(Avanti polar lipids)(#850457)에서 구입하였고, 클로로포름중 100mg/mL의 모용액을 필요할 때까지 -20℃에서 보관했다.
2.2 탄소 나노튜브 트랜지스터 장치 제작
이 실험 세트에서는 간단한 용액 침착 경로와 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 SiO2/Si 기판(SiO2=100nm)에 랜덤 채널 CNT FET 센서 플랫폼을 제작했다. 먼저, 초음파를 사용하여 무수 1,2-디클로로벤젠(DCB)에서 SWNT 현탁액을 제조하였다. 99% 반도체 등급 SWNT 버키 페이퍼(나노 인테그리스)를 칭량하고 DCB에 분산시켜 5μg/ml 현탁액을 수득하였다. 투명한 용액이 수득될 때까지 분산액을 초음파 처리하였다. 온도는 초음파 처리 공정 전체에서 25℃로 유지되었다. 그 다음, SiO2/Si 기판을 도 5a에 도시된 바와 같이 간단한 스탬핑 방법에 의해 티올피리딘 분자로 작용화시켰다. 2-머캅토피리딘(99%, 시그마 알드리치) 10mg을 메탄올 1ml에 용해시켜 티올피리딘 용액을 제조하였다. 용액을 폴리디메틸실록산(PDMS) 표면에 2000rpm으로 1분동안 회전 코팅하였다. 회전 코팅 공정 전에, PDMS 표면을 50W 산소 플라즈마로 1분동안 세정하여 습윤성을 향상시켰다. 세정된 기판을 3분동안 PDMS 표면에 뒤집어 놓고 과량의 티올피리딘 분자를 제거하기 위해 에탄올로 세척하였다. 그 후, 기판을 CNT 현탁액으로 옮기고 10분동안 현탁액에 담갔다. 샘플을 현탁액에서 제거하고 에탄올에 10분동안 침지시켜 SWNT 네트워크에서 티올피리딘 분자를 제거하였다. 포토리소그래피 및 5nm의 크롬 및 50nm의 금의 열 증착에 의해 마커를 한정함으로써 정렬 마커를 증착시켰다. 15분동안 아세톤 침지에 이어 이소 프로필 알콜(IPA) 세척 및 N2 송풍 건조에 의해 금속 리프트 오프를 수행하였다. 결과는 전체 기판 표면을 덮는 균일한 박막 CNT 네트워크이다.
CNT 필름을 포토레지스트로 코팅하고 이어서 패턴화하고, 포토레지스트로 전극을 봉지화하는 것은 실시예 2 섹션 2.1에 설명된 바와 같다.
2.2 후각 수용체 고정
2.2.1 정제된 OR 서브유닛의 제조
정제 절차는 카라허(Carraher) 등의 문헌(2013)14에 상세하게 기재된 것의 변형이다. 바큘로바이러스에 감염된 Sf9 세포로부터의 단백질을 his-태그 친화성 정제하기 위해, 2×106mL-1의 500mL를 0.1의 MOI로 바큘로바이러스로 감염시키고 27℃에서 72시간동안 배양하였다. 실온에서 3800g에서 10분동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수집한 후, 25U/mL 벤조나제로 재현탁 완충액 A{20mM Tris/HCl pH 7.5, 100mM NaCl, 1× 프로테아제 저해제 칵테일[로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일]} 40mL에 재현탁시키고, 이어 이멀시플렉스(Emulsiflex) C5 유화기(아베스틴, 독일)에서 10,000 내지 15,000psi로 2회 통과시켜 용해시켰다. 샘플을 1000g에서 5분동안 원심분리하여, 전체 세포와 핵을 제거하였다. 상청액을 제거하고 4℃에서 1시간동안 100,000g에서 회전시켰다. 막 펠렛을 1% w/v 세제[쯔비터젠트(Zwittergent) 3-16]를 함유한 완충액 A 40mL에 재현탁시키고 실온에서 10rpm으로 1시간동안 회전시켰다. 그 후, 샘플을 18℃에서 100,000g에서 1시간동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 1mL들이 NiNTA 칼럼[지이 헬쓰케어(GE Healthcare)]에 넣고, 여기에서 쯔비터젠트 3-16 세제를 포스-콜린(Fos-Choline) 14(FC-14)로 바꾸었다. 상기 칼럼을 300mM NaCl 및 20mM 이미다졸을 함유하는 10칼럼 부피의 완충액 B(20mM Tris/HCl pH 7.5, 3.6mM FC-14) 및 100mM NaCl 및 50mM 이미다졸을 함유하는 10칼럼 부피의 완충액 B에서 세척하였다. 단백질은 100mM NaCl 및 500mM 이미다졸을 함유하는 4칼럼 부피의 완충액 B로 용리되었다. 순도는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 젤 및 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다.
최종 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 단계로 정제를 완료하였다. NiNTA 정제로부터의 용리 분획을 모아서 5분동안 20,000g에서 원심분리하여 응집체 및 오염물을 제거하였다. 그런 다음, 샘플 5mL를 액타-퓨어(Akta-Pure) 크로마토그래피 시스템(지이 헬스케어)에 부착된 수퍼덱스(Superdex) 200 16/60 칼럼(지이 헬스케어)에 주입했다. 샘플을 100mM NaCl을 함유하는 완충액 B에서 1mL/분으로 흐르게 하고, 2mL 분획을 수집하고, 100kDa MWCO 비바스핀(Vivaspin)2 필터 단위장치[사토리우스(Sartorius), 독일 괴팅겐]를 사용하여 농축하고, -80℃에서 보관하였다.
2.2.2 나노디스크 관련 OR 서브유닛의 제조
나노디스크는 베이버트(Bayburt) 등의 문헌(2010 및 2003)55, 56으로부터 변형된 프로토콜을 이용하여 제조하였다. 나노디스크는 1:0.2:150의 MSP:단백질:지질 비로 형성되었다. 필요한 양의 지질을 100mg/mL 모용액에서 제거하고 질소 기체의 일정한 흐름 하에서 건조시킨 다음, 진공 하에서 밤새 더 건조시켰다. 지질을 필요한 부피의 완충액(20mM Tris/HCl pH 7.5, 100mM NaCl, 50mM 소듐 콜레이트)에 재현탁시키고 초음파 처리하여, 20mg/mL 농도의 투명한 지질 모용액을 얻었다. 세제 완충액중 정제된 취기물질 수용체 단백질을 요구되는 비로 MSP1E3D1 및 POPC 지질과 혼합하고 얼음에서 1시간동안 항온처리하였다. 시스템에서 세제를 제거하여 재구성을 개시하기 위해, 바이오-비즈 SM2(바이오-라드 #1523920)를 1:1 무게/부피비로 샘플에 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 밤새 일정한 회전으로 항온처리하였다. 그런 다음, 바이오 비즈를 제거하고, 통합된 나노디스크를 필요할 때까지 -80℃에서 동결시켰다.
쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 결합을 확인하였다. 바이오-비즈를 첨가하기 전의 재구성 혼합물의 샘플을, 쿠마시로 염색된 SDS-PAGE 겔에 의한 바이오-비즈 항온처리 단계 후의 샘플과 비교하였으며, MSP1E3D1 및 OR 밴드가 명확하게 확인되었다. 바이오-비드에 의한 세제의 제거로 인해 OR 단백질이 나노디스크에 통합되지 않은 경우 이를 침전시켜, OR이 바이오-비드 항온처리 후 샘플에 존재하지 않게 된다.
2.2.3 탄소 나노튜브의 공유 작용화
CNT 표면에 후각 수용체 나노디스크를 고정시키기 위해 공유 작용화 경로가 선택된다. OR 작용화는 아민/에스터 반응을 통해 달성되는데, 여기에서는 CNT 표면이 먼저 1-피렌부탄산 석신이미딜 에스터(PBASE)(95% 순도, 시그마 알드리치)로 작용화된다. 이를 위해, 120㎕의 PBASE 용액을 실온에서 1시간동안 CNT 채널에 첨가한다. 1분동안 초음파 처리에 의해 메탄올에서 10mM 농도로 PBASE 용액을 만든다. PBASE 작용화 후, 과량의 PBASE를 씻어내기 위해 CNT FET를 메탄올에서 3번 세정한다. 잔류 메탄올을 제거하기 위해, 장치를 인산염 완충 염수(PBS, pH=7.4)에서 3회 세척한다.
OR-나노디스크는 막 스캐폴드 단백질(MSP) 및 OR 관련 나노디스크를 구성하는 OR 서브유닛에 존재하는 아민기에 특이적인 아민/에스터 반응을 통해 PBASE 작용화된 CNT FET 상에 고정된다. 나노디스크 용액을 제조하기 위해 벌크 OR-나노디스크 용액을 1:100으로 PBS 완충액으로 희석한다. OR-나노디스크 모용액은 사용하지 않을 때는 보통 -80℃의 냉동고에 저장된다. 희석된 나노디스크를 PDMS 웰에 첨가하고 전체 CNT 표면을 실온에서 작용화하기 위해 30분동안 나노디스크에 담근다. 작용화 공정 후에, PBS에서 3회 세척하여 과량의 나노디스크를 제거한다.
2.2.4 필름 특성
CNT 필름 형태를 특징화하기 위해 원자력 현미경법(atomic force microscopy)을 이용하였다. 나노 설프(Nano surfe)[나이오AFM(NaioAFM)]를 사용하였고 태핑 모드에서 이미지를 촬영했다. 이 필름은 나노디스크 작용화 전후에 특징화되었다.
2.2.5 전기적 측정
전기 측정은 다음의 변경 사항과 함께 실시예 2 섹션 2.3에 설명된대로 수행하였다. 게이트 전극은 Ag/AgCl 와이어(바시, MF 2052)이다. 전송(Vlg-Ids) 측정 동안 게이트 전압(Vlg)은 -500mV에서 +1V 사이에서 변동되고 소스 드레인 전압(Vds)은 100mV로 설정된다. 실시간 감지 측정을 위해 Vlg는 0으로 설정되고 Vds는 1초의 시간 간격으로 100mV로 설정된다.
리간드 용액을 100mM 모용액으로부터 감지 실험에 필요한 농도 범위로 희석한다. 리간드의 모용액을 DMSO에서 100mM 농도로 만들었고 사용하지 않을 때는 4℃에서 보관했다. 용액을 시험 범위까지 더 희석시키기 위해 PBS 완충액을 사용한다. PBS(1% DMSO 포함)에서 리간드의 측정 범위는 1fM 내지 10pM(10배 증가)이다. 실시간 측정 동안, PBS 용액(1% DMSO 함유)을 먼저 대조용으로 첨가하고 분석물을 농도를 증가시키면서 추가로 첨가한다.
2.2.6 리간드 희석
리간드 용액을 100mM 모용액에서 감지 실험에 필요한 농도 범위로 희석한다. 리간드의 모용액을 DMSO에서 100mM 농도로 만들었고 사용하지 않을 때는 4℃에서 보관했다. 용액을 시험 범위까지 더 희석시키기 위해 PBS 완충액을 사용한다. PBS(1% DMSO 포함)에서 리간드의 측정 범위는 1fM 내지 10pM(10배 증가)이다. 실시간 측정 동안, PBS 용액(1% DMSO 함유)을 먼저 대조용으로 첨가하고 분석물을 농도를 증가시키면서 추가로 첨가한다.
3.0 결과
3.1 OrX-나노디스크 공유 작용화 후 CNT FET의 전달 특징
도 14a는 OrX 연결 나노디스크 각각의 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔 분석 및 CNT로의 OrX 나노디스크의 고정(CNT 상의 흰색 반점에 주목한다)을 확인하는 미처리 및 OrX 나노디스크 작용화된 CNT의 AFM 이미지를 보여준다(도 14b). 도 15a는 OR10a 나노디스크 작용화된 CNT FET(파란색 선)와 미처리 CNT FET(검정색 선)를 비교한 것으로, OR10a 나노디스크 작용화 후 문턱 전압이 음의 전압 방향으로 이동한 것이 분명하다. 실시예 2 섹션 3.1에 기재되었듯이, 이것은 OrX-나노디스크의 성공적인 고정의 증거이다. 도 16a, 도 17a 및 도 18a에 도시된 바와 같이, 각각 Or22a, Or35a 및 Or71a로 성공적으로 작용화된 CNT FET는 문턱 전압이 항상 음의 전압 방향으로 이동된다.
3.2. OrX 연결 나노디스크 및 각각의 리간드 결합
3.2.1. OrX 나노디스크(1:100 희석)로 공유 작용화된 CNT FET
도 15b는 PBS 완충액 첨가시 OR10a 나노디스크(1:100 희석)에 의해 공유 작용화된 CNT FET로부터의 전류의 작은 증가가 있음을 보여주는 반면, 메틸 살리실레이트를 증가시키면서 첨가한 후에는 전류가 지속적으로 큰 감소를 나타낸다. 이 전류의 감소는 CNT FET로의 유효 게이팅을 변화시키는 OR10a와 메틸 살리실레이트의 결합에 기인한다58 , 60, 62. 도 15c는 메틸 살리실레이트의 양을 증가시키면서 첨가하여도 빈 나노디스크(1:100 희석)로 공유 작용화된 CNT FET로부터 전류가 증가하지 않음을 보여주여서, 메틸 살리실레이트를 결합시킴에 있어서 Or10a의 역할을 확인시켜준다. 도 15d는 메틸 살리실레이트의 농도에 대한 정규화된 전류 응답 전류의 의존성을 나타내지만, 대조용 리간드 E2-헥세날의 경우에는 반응이 관찰되지 않는다. 도 15e는 빈 나노디스크(1:100 희석)로 공유 작용화된 CNT-FET의 경우 정규화된 전류 응답에 변화가 없음을 보여준다. 도 15d 및 15e는 메틸 살리실레이트에 대해 Or10a 나노디스크가 나타내는 검출 한계가 1fM 미만임을 나타낸다.
도 16, 17 및 18은 각각 Or22a(표적 리간드 - 메틸 헥사노에이트, 대조용 리간드 - E2-헥세날), Or35a(표적 리간드 - E2-헥세날, 대조용 리간드 - 메틸 헥사노에이트) 및 Or71a(표적 리간드 - 4-에틸 구아이아콜)로 공유 작용화된 CNT FET에서의 유사한 결과를 보여주며, 각각의 OrX 나노디스크 및 각각의 표적 리간드에 대한 검출 한계는 모두 1fM 미만임을 나타낸다.
4. 결론
이 연구는 OrX의 인식 능력과 전자 장치 플랫폼을 기반으로 한 유망한 후각 바이오센서 용도를 더 입증했다. 나노디스크에 내장된 OrX는 CNT FET에서 공유 작용화되고, 실시간으로 1fM 표적 리간드에 대해 전류 응답을 나타내며 PBS 완충액에는 반응하지 않는다. 이는 실시예 2에서 기술된 CNT-FET 센서보다 5배 더 민감하고, 동적 범위는 4차수 이상 더 크다. 빈 나노디스크 작용화된 CNT FET의 결과와 비교할 때, 표적 리간드에 대한 명확한 전류 응답은 관찰되지 않는다. 각 OrX의 특이적 결합은 또한 OrX 작용화된 CNT FET로부터 PBS 및 대조용 리간드를 시험함으로써 확인되었다. OrX-나노디스크 작용화된 CNT FET는 실시간으로 표적 리간드의 특이하고 민감한 검출을 입증했다.
실시예 4 - 전기적 임피던스 분광법(EIS)을 이용한 본 발명의 센서의 추가 예시
1. 요약
본 발명자들은 곤충 OrX 서열을 사용하는 편리하고 민감한 센서 장치를 추가로 예시하였다. EIS 측정을 위해 3개의 OrX 수용체(Or10a 및 Or22a, 및 OR35a)43, 63를 나노디스크55, 56에 내장시키고 금 전극상에서 작용화시켰다. OrX 작용화 금 전극 각각은 fM 수준의 농도에서 시작하여 실시간으로 표적 리간드(Or10a ~ 메틸 살리실레이트, Or22a ~ 메틸 헥사노에이트, Or35a ~ E-2-헥세날)에 대한 명확한 전자 반응을 보였다. 결합의 특이성은 비-반응 리간드에 대한 각 OrX 나노디스크 작용화된 전극 반응을 시험함으로써 확인하였다. 특이성을 더욱 확실하게 하기 위해 빈 나노디스크 작용화된 금 전극의 표적 리간드에 대한 반응을 또한 시험했다.
2. 실험 방법
2.1 물질
6-머캅토헥산산(MHA), N-하이드록시석신이미드(NHS), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드)(EDC), 인산염 완충 염수(PBS) 정제, 메틸 살리실레이트, 메틸 헥사노에이트, 에틸 헥사노에이트, E2-헥세날 및 4-에틸구아이아콜은 시그마-알드리치에서 구입했다. 전기 화학적 측정을 위해 직경 1.6mm 금(Au) 디스크 전극, 코일 백금(Pt) 와이어 전극 및 누전없는 은/염화은(Ag/AgCl) 전극을 바시에서 구입했다.
2.2 나노디스크 연결 OR 서브유닛의 제조
2.2.1 정제된 OR 서브유닛의 제조
OR 서브유닛을 실시예 3 섹션 2.3.1에 기재된 바와 같이 제조하였다.
2.2.2 나노디스크 연결 OR 서브유닛의 제조
나노디스크를 실시예 3 섹션 2.3.2에 기재된 바와 같이 제조하였다.
2.3 전극 제조
각 전극에 대해 1분동안 연마 알루미나 슬러리를 갖는 알루미나 연마 패드상에서 금 디스크 전극(직경 1.6mm)을 연마하였다. 연마된 전극을 탈이온수(밀리-큐, 18.2MΩcm)로 헹구고, 잔류 알루미나 슬러리가 전극에서 완전히 제거될 때까지 에탄올(LR 등급) 및 탈이온수에서 초음파 처리하였다. -1.2V에서의 시간대전류법(Chronoamperometry)을 모든 초음파 처리된 전극에 적용하여, 팜센스(PalmSens)3 포텐시오스탯을 사용하는 3단자 전기 화학 전지, 즉 Ag/AgCl(3M NaCl, 0.209V vs. SHE) 기준 전극, 대전극으로서의 코일형 백금 와이어 및 작동 전극으로서의 금 디스크에서, 0.1M 수산화나트륨(NaOH) 전해질 용액을 사용하여 30초동안 전극 표면에 존재하는 티올의 SAM을 탈착시켰다. 그 후, 전극을 다시 탈이온수로 세정하고 에탄올 및 탈이온수에서 연속적으로 초음파 처리하였다. 최종적으로, 0.5M 황산(H2SO4) 용액에서 100mV/s의 스캔 속도로 -0.2V에서 1.6V 사이의 10회 사이클 동안 주기적인 전압전류법(voltammetry)을 수행하여, 임의의 다른 불순물을 제거하였다[3개 전극 전지, Ag/AgCl(3M NaCl중, 0.209V vs. SHE) 기준 전극, 대전극으로서의 코일형 백금 와이어 및 작동 전극으로서의 금 디스크].
2.4 자체 조립 단일층(SAM) 제조 및 EDC:NHS 활성화
1.36㎕의 MHA를 5ml 에탄올(AR 등급)에 용해시켜 2mM MHA를 제조하였다. 세정된 전극을 MHA 용액에 담그고 밤새 항온처리하였다. 다음날, 미반응된 산을 제거하기 위하여 모든 전극을 에탄올 및 탈이온수로 완전히 세척하였다. 2ml PBS(pH=6.5) 용액에서 2:1 몰:몰 비율의 EDC:NHS(100mM EDC, 50mM NHS)를 제조하였다. 그 후,이 용액에서 전극을 28℃에서 1시간동안 항온처리하여 MHA의 카복실(COOH)기를 활성화시켰다.
2.5 전극에서의 OR 연결 나노디스크 고정
PBS 정제 1개를 밀리-큐 물 200ml(제조사 지침서에 따라)에 담그고 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 여과함으로써 PBS 용액을 제조하였다. 제조된 완충 용액의 pH는 pH 측정기로 측정하였다. OR를 PBS 완충 용액(pH=7.4)에서 100배로 희석하고, COOH-활성화된 전극을 실온에서 1시간동안 그 완충액 중에서 항온처리하였다. 그런 다음, 전극을 PBS 완충 용액으로 광범위하게 세척하여 임의의 결합되지 않은 나노디스크를 씻어내었다.
2.5 표적 취기물질 용액 제조 및 항온처리
전기 화학적 측정(EIS 및 CV)을 수행하기 위해 PBS 용액(pH=7.4)을 전해질로서 사용하였다. PBS 완충액을 전기 화학적 측정 전에 15분동안 탈기시켰다. 리간드 용액을 100mM 모용액으로부터 감지 실험에 필요한 농도 범위로 희석시켰다. 리간드의 모용액을 DMSO에서 100mM 농도로 만들었고, 사용하지 않을 때에는 4℃에서 보관했다. 용액을 시험 범위까지 추가 희석하기 위해, PBS 완충액을 사용하였다. PBS(1% DMSO 포함)중 리간드의 측정 범위는 Or10a 나노디스크의 경우 1fM 내지 100nm(10배 증가), Or22a 나노디스크의 경우 100fM 내지 100pM(10배 증가) 및 Or35a 나노디스크의 경우 10aM 내지 1pM(10배 증가)이었다.
2.6 전기 화학적 임피던스 분광법(EIS) 측정
OR 고정된 전극을 각각 관련 취기물질 용액에서 약 30분동안 항온처리하고, EIS 측정 전에 PBS로 부드럽게 씻어내었다. 이어, 대전극(CE)으로서의 백금(Pt) 와이어, Ag/AgCl(3M KCl, +0.197V vs. SHE) 기준 전극(RE), 및 작동 전극으로서 나노디스크를 갖는 금 디스크 전극을 포함하는 3단자 전기 화학 전지에서 기준 전극에 대해 -0.7V를 인가하면서 100mHz 내지 100kHz에서 EIS 측정을 수행하였다.
3.0 결과
EIS 측정은 실시예 1의 섹션 2.0에 기재된 바와 같이 수행되고 분석되었다. 농도를 증가시키면서 표적 리간드 또는 대조용 리간드를 항온처리하기 전후에 OrX(Or10a, Or22a 또는 Or35a) 또는 빈 나노디스크로 작용화된 금 전극상에서 EIS 측정을 수행하였다. 센서 반응을 ΔRct/R0 ct 대 log[C(리간드)]로서 한정함으로써 보정 곡선을 수득하였다(도 19). 도 19a는 Or10a 나노디스크가 메틸 살리실레이트에 대해 민감하게(10fM의 LOD) 또한 선택적으로 반응하며, 예상대로 대조용 리간드 E2-헥세날에 대해서는 반응하지 않음을 보여준다. 도 19b는 Or22a 나노디스크가 메틸 헥사노에이트에 민감하게(100pM 미만의 LOD) 또한 선택적으로 반응하고, 예상대로 대조용 리간드 E2-헥세날에 반응하지 않음을 보여준다. 도 19c는 Or35a 나노디스크가 E2-헥세날에 민감하게(1fM 미만의 LOD) 또한 선택적으로 반응하며 예상대로 메틸 살리실레이트에 반응하지 않음을 보여준다. 각각의 도면에서, 빈 나노디스크는 시험된 어떠한 표적 리간드에도 반응하지 않아서, 각 OrX의 존재가 각각의 표적 리간드의 검출에 대해 핵심임을 입증한다.
4. 결론
이 연구는 OrX의 인식 능력과 전자 장치 플랫폼을 기반으로 한 유망한 후각 바이오센서 용도를 더 입증했다. 금 전극에 작용화된 나노디스크에 내장된 OrX는 fM 표적 리간드에 대한 전기 화학적 임피던스 반응을 나타내며, 4차수의 동적 범위를 나타낸다. 빈 나노디스크 작용화된 전극에서는 표적 리간드에 대한 임피던스 응답이 관찰되지 않는다. OrX 나노디스크 작용화된 전극으로부터의 리간드를 제어하는 반응을 시험함으로써 각 OrX의 특이적 결합을 또한 입증하였다. OrX 나노디스크 작용화된 전극은 표적 리간드를 특이적으로 민감하게 검출할 수 있는 큰 가능성을 보였다.
실시예 5 - 전기적 임피던스 분광법(EIS)을 이용한 본 발명의 센서의 추가 예시
개요
본 발명자들은 곤충 OrX 서열을 사용하는 편리하고 민감한 센서 장치를 추가로 예시하였다. 3개의 OrX 수용체(Or10a, Or22a, OR71a)43, 63는 리포좀55, 56에 각각 매립되고, 추가의 최적화된 실험 조건 하에서 EIS 측정을 위해 금 전극상에서 작용화되었다. OrX 작용화된 금 전극 각각은 fM 농도에서 시작하는 그의 표적 리간드(Or10a - 메틸 살리실레이트, Or22a - 메틸 헥사노에이트, Or71a - 4-에틸 구아이아콜)에 명확한 전자 반응을 보였다. 반응하지 않는 리간드에 대한 각 OrX 리포좀 작용화된 전극 반응을 시험함으로써 결합의 특이성을 입증한다. 특이성을 더욱 확실하게 하기 위해, 표적 리간드에 대한 빈 나노디스크 작용화된 금 전극의 반응을 또한 시험했다.
1. 실험 방법
2.1 물질
실시예 4 섹션 2.1에 기재된 바와 같음
2.2 리포좀 연결 OR 서브유닛의 제조
2.2.1 정제된 OR 서브유닛의 제조
OR 서브유닛을 실시예 3 섹션 2.3.1에 기재된 바와 같이 제조하였다.
2.2.2 리포좀 연결 OR 서브유닛의 제조
OR 및 OR/Orco 연결 리포좀을 실시예 1 섹션 1.2에 기재된 바와 같이 제조하였다.
2.3 전극 제조
실시예 4의 섹션 2.3에 기재된 바와 같음
2.4 자체 조립 단일층(SAM) 제조 및 EDC:NHS 활성화
실시예 4 섹션 2.4에 기재된 바와 같음
2.5 전극에서의 OR 연결 나노디스크 고정
실시예 4 섹션 2.5에 기재된 바와 같음
2.6 표적 취기물질 용액 제조 및 항온처리
실시예 4 섹션 2.6에 기재된 바와 같음
2.7 전기 화학적 임피던스 분광법(EIS) 측정
실시예 4 섹션 2.7에 기재된 바와 같음
3.0 결과
도 20은 Or22a에 대한 OR 연결 리포좀의 예시적인 제제의 SDS-PAGE 겔 분석으로부터의 웨스턴 블랏팅을 나타낸다. 레인 4는 Or22a 연결 리포좀의 최종 제제를 보여주며, 아큐덴즈 구배 초원심분리(레인 5 내지 12)가 이 제제에 적용될 때 Or22a 연결 리포좀은 구배 상단으로 부상하고 상단 2개의 구배 분획에서 발견된다(레인 11 및 12)14.
저자들은 리포좀이 금 표면에 고정될 수 있음을 확인하기 위해 원자력 현미경법(AFM)을 이용했다. 도 21은 맨 금 표면으로부터 OR 연결 리포좀 고정된 표면까지의 표면 형태 및 조도 프로파일에서 변화가 관찰됨을 보여준다. 맨 금 표면(도 21a)은 약 2nm의 표면 조도 값을 갖는 다양한 크기의 조밀하게 팩킹된 편평한 금 나노결정을 보여준다. SAM 변형(도 21b) 및 SAM 변형된 금 표면의 NHS/EDC 활성화(도 21c) 후, 표면 형태의 변화는 거의 관찰되지 않았다. OR 연결 리포좀이 EDC/NHS 활성화된 SAM 변형 금 표면(도 21d)에 도입될 때, 표면 형태의 변화가 두드러져서 표면 상에 고정된 원형 모양의 리포좀을 보여준다. 가변 크기의 둥근 리포좀이 본래의 형태로 표면 전체에 걸쳐 관찰되었는데, 즉 파열 또는 이중층 형성이 관찰되지 않았고, 이는 또한 OR이 리포좀의 막에 잘 유지되어 있음을 나타낸다. 표면 조도 값(30nm보다 큼)의 큰 증가는 또한 NHS/EDC 활성화된 SAM 변형 금 표면에 리포좀을 함유한 OR이 성공적으로 부착되었음을 입증한다.
EIS 측정은 실시예 1의 섹션 2.0에 기재된 바와 같이 수행되고 분석되었다. OrX 연결 리포좀(Or10a, Or22a 또는 Or71a)으로 작용화된 금 전극에서 또는 빈 리포좀에서 표적 리간드 또는 대조용 리간드 항온처리 전후에 농도를 증가시키면서 EIS 측정을 수행하였다. 센서 응답을 ΔRct/R0 ct 대 log[C(리간드)]로 한정함으로써 보정 곡선을 수득하였다(도 22a 내지 22c). 도 22a는 Or10a 리포좀이 메틸 살리실레이트에 대해 민감하게(1μM의 LOD) 또한 선택적으로 반응하고, 예상대로 대조용 리간드인 메틸 헥사노에이트에 반응하지 않음을 보여준다. 도 22b는 Or22a 리포좀이 메틸 헥사노에이트에 민감하게(10fM의 LOD) 또한 선택적으로 반응하고, 예상되는 바와 같이 대조용 리간드 메틸 살리실레이트에 반응하지 않음을 보여준다. 도 22c는 Or71a 리포좀이 4-에틸 구아이아콜에 민감하게(0.1fM의 LOD) 또한 선택적으로 반응하고, 대조용 리간드 메틸 살리실레이트에 반응하지 않음을 보여준다. 각각의 도면에서, 빈 나노디스크는 어떠한 표적 리간드에도 반응하지 않아서, 각각의 OrX의 존재가 각각의 표적 리간드를 검출하는데 핵심임을 입증한다.
4. 결론
이 연구는 OrX의 인식 능력과 전자 장치 플랫폼을 기반으로 한 유망한 후각 바이오센서 용도를 더 입증했다. 금 전극상에서 작용화된 리포좀에 내장된 OrX는 fM 농도의 표적 리간드에 대해 극도로 민감한 전기 화학적 임피던스 응답을 나타내며, 8차수 이상의 동적 범위를 나타낸다. 빈 나노디스크 작용화된 전극의 결과와 비교할 때, 표적 리간드에 대한 명확한 임피던스 응답이 관찰되지 않는다. 각 OrX의 특이적 결합은 또한 OrX 리포좀 작용화된 전극으로부터 대조용 리간드에 대한 반응을 시험함으로써 입증되었다. OrX 리포좀 작용화된 전극은 특이적으로 민감하게 표적 리간드를 검출할 수 있는 큰 가능성을 보였다.
실시예 6 - 수정 미세저울(QCM) 압전 변환기를 이용한 본 발명의 센서의 예시
개요
본 발명자들은 리포좀에 내장된 드로소필라 멜라노가스터 Or22a43 , 63 서열을 사용하여 편리한 압전 센서 장치를 생산했다. 소산이 모니터링되는 수정 미세저울(QCM-D)은 결정의 질량 부하에 따라 발진 주파수가 변하는 질량 민감형 압전 변환기이다. Or22a 리포좀이 결합된 QCM-D 센서의 진동 주파수 변화를 모니터링함으로써 Or22a와 표적 리간드 메틸 헥사노에이트 사이의 상호작용을 검출하였다. 시험된 표적 리간드에 대한 QCM-D 센서에 연결된 빈 리포좀의 반응을 시험함으로써 결합의 특이성을 확인하였다.
1. 실험 방법
2.1 물질
6-머캅토헥산산(MHA), N-하이드록시석신이미드(NHS), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드)(EDC), 인산염 완충 염수(PBS) 정제 및 메틸 헥사노에이트를 시그마-알드리치에서 입수하였다. 금(100nm) 센서 결정(QSX301)은 에이티에이 사이언티픽 인스트루먼츠(ATA Scientific Instruments)에서 입수했다.
2.2 OR 연결 리포좀의 제조
2.2.1 정제된 OR 서브유닛의 제조
OR 서브유닛을 실시예 3 섹션 2.2.1에 기재된 바와 같이 제조하였다.
2.2.2 OR 연결 리포좀의 제조
OR22a 리포좀을 실시예 1 섹션 1.2에 기재된 바와 같이 제조하였다.
2.3 수정 미세저울(QCM) 제조 및 데이터 수집
금(100nm) 센서 결정을 각각 에탄올과 밀리-큐 물에서 15분간 초음파 처리했다. 5:1:1 부피비의 밀리-큐 물, 암모니아(25%) 및 과산화수소(30%)를 5분동안 75℃로 가열하고, 초음파 처리된 결정을 5분동안 가열된 용액에 넣었다. 그 후, 결정을 용액으로부터 제거하고, 밀리-큐 물로 세정한 후, 질소 기체로 건조시켰다. MHA의 2mM 에탄올 용액에 밤새 노출시킨 다음, 과량의 분자 또는 느슨하게 결합된 분자를 제거하기 위해 에탄올 용액으로 세척함으로써, 깨끗한 금 결정을 티올 작용화시켰다. SAM 작용화된 결정을 Q-감지 분석기[비올린 사이언티픽(Biolin Scientific)] 챔버에 넣고 NHS/EDC, OR22a/리포좀 및 PBS 완충 용액중 다양한 농도의 메틸 헥사노에이트(1.6μM, 8μM, 40μM, 200μM 및 1mM)를 유동시켜, 주파수(Δf) 및 소산(ΔD) 값의 변화를 측정하였다.
3.0 결과
도 23A는 SAM 및 NHS/EDC 변형 후, 수정에서의 Or22a 리포좀 고정 및 표적 리간드 메틸 헥사노에이트의 결합시, 주파수 및 소산의 변화를 보여준다. 결정에 결합 이벤트가 발생하면 질량이 중가하여 진동 주파수가 감소된다64. 따라서, 센서의 질량은 SAM, NHS/EDC 및 Or22a 리포좀 고정화에 따라 증가한다. 그러나, 메틸 헥사노에이트 결합의 경우, 주파수의 증가가 관찰된다(도 23B). 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 본 발명자는 센서상의 이러한 질량 손실이 Or22a 수용체에 대한 메틸 헥사노에이트의 결합으로 인해 Or22a 리포좀 내부로부터 물과 이온이 방출됨(즉, Or22a가 기능성 이온 채널을 형성함)에 기인하는 것으로 제안한다. 이 주파수의 증가는 메틸 헥사노에이트의 농도가 1.6mM과 200mM 사이에서 증가함에 따라 발생되어, 메틸 헥사노에이트가 Or22a 수용체에 특이적으로 결합함을 나타내는데, 이는 QCM에 고정된 빈 리포좀에서는 이러한 주파수의 증가가 관찰되지 않기 때문이다(도 23C 및 23D). ppt(parts-per-trillion) 농도와 동등한 μM 수준에서의 리간드 결합의 검출은 카에노하브디티스 엘레간스 ODR-1065에서 보이는 것과 유사한다.
4. 결론
이 연구는 OrX의 인식 능력과 전자 장치 플랫폼을 기반으로 한 유망한 후각 바이오센서 용도를 더 입증했다. QCM 압전 센서에 작용화된 리포좀의 OrX는 특이 적으로 표적 리간드를 검출할 수 있다. QCM에 작용화된 빈 리포좀의 결과와 비교하면, 표적 리간드에 대한 명확한 압전 반응이 관찰되지 않았다. OrX 리포좀 작용화된 QCM은 특이적으로 그리고 민감하게 그들의 표적 리간드를 검출할 큰 가능성을 보여준다.
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Claims (16)
- 기판과 전기적으로 연통되는 정제된 곤충 취기물질 수용체 OrX 서브유닛을 포함하고, 상기 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성되는 센서 장치.
- 제 1 항에 있어서,
상기 전기적 특징의 변화가, 분석물이 상기 OrX 서브유닛에 결합함으로써 발생하는 센서 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 기판의 전기적 특징의 변화를 검출함으로써 상기 OrX 서브유닛으로의 분석물의 결합을 검출할 수 있는 센서 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 OrX 서브유닛이 분석물의 결합에 반응하여 구조 변화를 겪을 수 있는 형태로 존재하는 센서 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 OrX 서브유닛이 막 모방체(membrane mimic)에 존재하는 센서 장치. - 제 5 항에 있어서,
상기 막 모방체가 리포좀, 양극자, 세제 미셀, 나노소포체, 지질 이중층, 나노디스크 및 계면활성제로부터 선택되는 센서 장치. - 제 3 항에 있어서,
1×10-3M 미만의 농도에서 분석물의 존재를 검출할 수 있는 센서 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 기판이 전극, 반도체 물질, 탄소 나노튜브(CNT), 그래핀, 산화물, 도핑된 규소, 전도성 중합체 및 공진기 구성요소 중 하나 이상으로부터 선택되거나, 이들 중 하나 이상으로 구성되는 센서 장치. - 제 1 항에 있어서,
상기 전기적 특징이 도전율, 저항, 복합 저항, 임피던스, 전기 화학적 임피던스, 전류의 흐름, 및 교번 전기장에 의해 유도되는 진동의 공진 주파수 중 하나 이상으로부터 선택되는 센서 장치. - a) 제 1 항에 따른 센서 장치에서 OrX 서브유닛에 분석물을 결합시키는 단계; 및
b) 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하는 단계
를 포함하는, 분석물을 검출하는 방법으로서,
상기 기판의 전기적 특징의 변화가 분석물의 검출을 나타내는 방법. - a) 제 1 항에 따른 센서 장치를, 분석물을 함유하는 환경에 노출시키는 단계;
b) 상기 센서 장치에서 분석물을 OrX 서브유닛에 결합시키는 단계; 및
c) 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하는 단계
를 포함하는, 환경에서 분석물의 존재를 검출하는 방법으로서,
상기 기판의 전기적 특징의 변화가 환경에서의 분석물의 존재를 나타내는 방법. - 정제된 곤충 취기물질 수용체 OrX 서브유닛과 센서 장치의 기판 사이에서 전기적 연통을 확립하는 단계를 포함하는 센서 장치의 제조 방법으로서, 상기 센서 장치가 상기 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성되는 제조 방법.
- 기판과 전기적으로 연통되는 정제된 곤충 취기물질 수용체 OrX 서브유닛을 포함하는 센서 장치 구성요소.
- 제 13 항에 따른 센서 장치 구성요소를 포함하고, 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성되는 센서 장치.
- 정제된 곤충 취기물질 수용체 OrX 서브유닛과 기판 사이에서 전기적 연통을 확립하는 단계를 포함하는, 센서 장치 구성요소의 제조 방법.
- 제 13 항에 따른 센서 장치 구성요소를 센서 장치에 부가하는 단계를 포함하는, 센서 장치의 조립 방법으로서, 조립된 센서 장치가 기판의 전기적 특징의 변화를 검출하도록 구성되는 조립 방법.
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