TWI835805B - 生物感測器裝置及方法 - Google Patents

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娜塔莉 奧莉維亞 維多利亞 普蘭克
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Abstract

本發明提供一種感測器裝置，其包含與基板以電連通之包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物，其中該感測器裝置經組態以偵測該基板之電特徵之變化。本發明亦提供感測器裝置組件，其包含與基板以電連通之包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物。本發明亦提供用於製造及使用該感測器裝置及感測器裝置組件之方法。本發明亦提供使用該感測器以偵測分析物之方法。

Description

生物感測器裝置及方法
本發明係關於用於偵測分析物之感測器及方法。
針對健康及環境監測以及食品安全及水品質，對諸如揮發性有機化合物(VOC)及可溶性有機化學物質之分析物之即時偵測為一項關鍵的挑戰，且強烈需要研發負擔得起且快速的分析物感測器。
方便、靈敏且特定的分析物感測器將具有不同應用，其包括監測與食品品質/安全相關之分析物(調味劑、熟化劑、污染物及腐敗劑)、生物安全性(害蟲及疾病)、環境監測(有害污染物)、醫療診斷(例如，呼吸診斷)及安全性(違禁化合物及爆炸物)。
昆蟲嗅覺受體(OR)可區分廣泛範圍的天然及合成化學物質，包括VOC。昆蟲OR充當雜聚配位體閘控之陽離子通道(圖1)，且由稱為Orco之專性輔受體及氣味劑特異性調整受體(OrX)構成。
昆蟲OR在結構及功能上與充當G蛋白偶合受體(GPCR)之哺乳動物及秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans) OR極其不同。
許多作者已描述了使用非洲爪蟾(Xenopus )卵母細胞2 、昆蟲細胞株3-5 及人類HEK293細胞6 基於細胞分析昆蟲OR功能1 。然而，其應用大部分受限於鑑別昆蟲OR之化合物特異性，其中一些針對昆蟲害蟲行為控制用以鑑別活化及抑制性化合物7 。
許多出版之專利文獻描述了昆蟲OR細胞分析8-13 。其均覆蓋分析用於昆蟲害蟲控制之新穎活化及抑制性化合物之途徑。就基於細胞之感測器而言，兩個公開案14-15 描述表現昆蟲OR之細胞株在基於細胞之感測器型式中之用途。一個公開案證實經昆蟲OR轉染以使用雙電極電壓鉗方法14 偵測氣味劑之非洲爪蟾卵母細胞之用途，而另一個公開案15 描述在玻璃微流晶片上生長之表現費洛蒙(pheromone)受體之細胞株及藉由鈣成像使用螢光顯微鏡偵測之費洛蒙結合。
市售攜帶型揮發性感測技術受限於電子/化學電子鼻，就靈敏度及特異性而言，其效能實質上在昆蟲嗅覺系統之下。此外，就申請人所知，不存在基於上文所論述之基於昆蟲OR之系統的商業產品。諸如離子遷移譜儀及質譜儀之其他技術提供相對於電子鼻經改良之靈敏度及特異性，但購買極其昂貴，需要大量的使用者培訓且移動性不強。
因此，本發明之目標為提供一種改良之感測器裝置，其利用至少一種昆蟲受體及/或至少向公眾提供適用的選擇。
本發明提供一種感測器裝置，其包含偶合至感測器之顯示表面/基板的包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物。就申請人所知，此係首次將純化之昆蟲氣味受體複合物(OrX/Orco)以功能方式固定於感測器顯示表面/基板上。
發明人已出人意料地顯示，相對於先前使用之基於昆蟲OR之系統，新穎感測器之靈敏度得到非常顯著地增加。
感測器裝置 在第一態樣中，本發明提供一種感測器裝置，其包含與基板以電連通之包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物，其中感測器裝置經組態以偵測基板之電特徵之變化。
在一個實施例中，電特徵之變化為由昆蟲氣味受體複合物中之OrX與分析物之間的相互作用引起。
在另一實施例中，相互作用為分析物與昆蟲氣味受體複合物中之OrX之結合。
在另一實施例中，分析物與OrX互補。
在另一實施例中，分析物與OrX之間的相互作用為特異性的。
對分析物之偵測 因此，在一個實施例中，感測器能夠藉由偵測基板之電特徵之變化而偵測分析物與OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲氣味受體複合物中之昆蟲OrX之結合之分析物的存在。
較佳地，偵測對於分析物為特異性的。
電連通 在一個實施例中，電連通意謂昆蟲氣味受體複合物可影響基板之電特徵。
在另一實施例中，分析物與昆蟲氣味受體複合物中之OrX之間的相互作用導致昆蟲氣味受體複合物中之構形變化。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物中之構形變化導致基板之電特徵之變化。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物形成對分析物之存在或其他方面敏感之離子通道。
昆蟲氣味受體複合物與基板之偶合 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至基板。
昆蟲氣味受體複合物之呈現 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物以能夠回應與分析物之相互作用而發生構形變化之形式存在。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於膜模擬物中。
膜模擬物可選自脂質體、兩親性聚合物(amphipole)、清潔劑微胞、奈米囊泡、脂質雙層及奈米盤。
膜模擬物可包含兩親性分子，諸如脂質分子。較佳地，兩親性分子包含磷脂分子。
較佳地，膜模擬物為人造的。
昆蟲氣味受體複合物亦可存在於界面活性劑中，該界面活性劑可為離子或非離子。
偵測之靈敏度 在一個實施例中，感測器可偵測濃度小於1 × 10-3 M、較佳地小於1 × 10-3 M、更佳地小於1 × 10-4 M、更佳地小於1 × 10-5 M、更佳地小於1 × 10-6 M、更佳地小於1 × 10-7 M、更佳地小於1 × 10-8 M、更佳地小於1 × 10-9 M、更佳地小於1 × 10-10 M、更佳地小於1 × 10-11 M、更佳地小於1 × 10-12 M、更佳地小於1 × 10-13 M、更佳地小於1 × 10-14 M、更佳地小於1 × 10-15 M、更佳地小於1 × 10-16 M、更佳地小於1 × 10-17 M、更佳地小於1 × 10-18 M、更佳地小於1 × 10-19 M、更佳地小於1 × 10-20 M之分析物之存在。
基板 在一個實施例中，基板係選自以下中之至少一者或由以下中之至少一者構成：電極、半導體材料、碳奈米管(CNT)、石墨烯、氧化物、摻雜矽、導電聚合物、共振器組件、稜鏡上之惰性金屬表面。
在一個實施例中，共振器組件為以下各者或由以下各者構成：壓電材料、至少一種壓電晶體、石英晶體。在一較佳實施例中，共振器組件為石英晶體共振器。
電特徵 在一個實施例中，電特徵係選自以下中之至少一者：傳導性、電阻、複電阻、阻抗、電化學阻抗、電化學電位、表面電漿子共振、電流及藉由交流電場誘導之振盪之共振頻率。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含量測基板之電特徵之變化的偵測器組件。
電化學阻抗頻譜 (EIS) 感測器裝置 在感測器裝置之一個實施例中，基板為電化電池之工作電極。
在一個實施例中，除工作電極以外，電化電池進一步包含相對電極。
在另一實施例中，電化電池進一步包含參考電極。
在另一實施例中，電化電池進一步包含恆電位器。
在另一實施例中，電特徵為電化學阻抗。
因此，在一個實施例中，感測器裝置包含與電化電池之工作電極以電連通的包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物，其中感測器裝置經組態以偵測工作電極之電化學阻抗之變化。
EIS 感測器裝置之工作電極 在一個實施例中，工作電極由金構成或用金塗佈。
EIS 感測器裝置中之昆蟲氣味受體複合物之呈現 昆蟲氣味受體複合物可存在於如上文所描述之膜模擬物中。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質體中。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於人造脂質體中。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質雙層中。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於人造脂質雙層中。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於奈米盤中。
昆蟲氣味受體複合物與 EIS 感測器裝置中之電極之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至工作電極。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由鍵聯分子偶合至工作電極。
在另一實施例中，鍵聯分子足夠短以允許在昆蟲氣味受體複合物與電極之間的電連通。
在一個實施例中，鍵聯分子足夠短以防止電極與昆蟲氣味受體複合物之分離。
在另一實施例中，鍵聯分子選自16-巰基十六烷酸(16-MHDA)、6-巰基十六烷酸(6-MHDA)及6-巰基己酸(MHA)。
在一較佳實施例中，鍵聯分子為6-巰基己酸(MHA)。
在另一實施例中，鍵聯劑為自組裝單(SAM)層之一部分。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由包括鍵聯分子之SAM層偶合至電極。
在一較佳實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由包括6-巰基己酸(MHA)鍵聯分子之SAM層偶合至電極。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在EDC/NHS上之酯類與昆蟲氣味受體複合物中之蛋白質上之胺類之間的相互作用偶合至工作電極。此等胺同時存在於OrX及Orco上。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在EDC/NHS上之酯類與膜模擬物中之脂質(POPC、POPE、POPS)上之胺類之間的相互作用偶合至工作電極。
在 EIS 感測器中偵測分析物 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲氣味受體複合物之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲氣味受體複合物結合之分析物之存在。
較佳地，偵測對於分析物為特異性的。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OrX之結合改變了工作電極之電化學阻抗。
在一較佳實施例中，在分析物與昆蟲OrX結合時，工作電極之電化學阻抗降低。
在一較佳實施例中，在藉由感測器偵測或與昆蟲OrX結合之分析物的量變化時，工作電極之電化學阻抗降低。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。在另一實施例中，偵測器組件偵測或量測工作電極之電化學阻抗之變化。
基於半導體之感測器裝置 在感測器裝置之一個實施例中，基板為半導體材料。可使用任何適合之半導體材料。
在感測器裝置之一個實施例中，半導體材料為以下中之至少一者或由以下中之至少一者構成：石墨烯、氧化物、摻雜矽、導電聚合物及碳奈米管(CNT)。
碳奈米管 - 場效電晶體 (CNT-FET) 感測器裝置 在一個實施例中，基板由碳奈米管(CNT)構成。碳奈米管(CNT)可為單壁、雙壁或多壁或其組合。在一較佳實施例中，碳奈米管(CNT)為單壁。
在另一實施例中，基板形成碳奈米管-場效電晶體(CNT-FET)設備之通道。
在一個實施例中，CNT-FET設備包含源電極及汲電極。
在另一實施例中，在源電極與汲電極之間發現或形成通道。
在另一實施例中，通道與源電極及汲電極電連通。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種感測器裝置，其包含昆蟲氣味受體複合物，該複合物與碳奈米管-場效電晶體(CNT-FET)設備之通道中之至少一個碳奈米管電連通。
在另一實施例中，碳奈米管-場效電晶體(CNT-FET)設備亦包含閘電極。
CNT-FET 感測器裝置中之昆蟲氣味受體複合物之呈現 昆蟲氣味受體複合物可存在於如上文所描述之膜模擬物中。
在一較佳實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於奈米盤中。
昆蟲氣味受體複合物與碳奈米管 (CNT) 之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至通道中之碳奈米管。
在另一實施例中，偶合使昆蟲氣味受體複合物與碳奈米管電連通。
昆蟲氣味受體複合物功能化 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經功能化以便於偶合至CNT。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物用his標記功能化。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物包含his標記。
在一個實施例中，OrX蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於OrX蛋白之N端。
在另一實施例中，Orco蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於Orco蛋白之N端。
在另一實施例中，OrX及Orco蛋白二者包含上述之his標記。
CNT 功能化 在一個實施例中，CNT經功能化以便於偶合至昆蟲氣味受體複合物。
在另一實施例中，CNT經鎳(Ni)-氮基三乙酸(NTA)功能化。
偶合 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由his標記親和力結合偶合至CNT。
因此，在一個實施例中，his標記之昆蟲氣味劑複合物與Ni-NTA功能化CNT結合。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與昆蟲氣味受體複合物中之蛋白質上之胺類之間的相互作用偶合至CNT。此等胺同時存在於OrX及Orco上。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與膜模擬物中之脂質(POPC、POPE、POPS)上之胺類之間的相互作用偶合至CNT。
在 CNT-FET 感測器中偵測分析物 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。
較佳地，對分析物之偵測為特異性的。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OrX之結合改變CNT-FET設備中之源極增益電流。
在一較佳實施例中，在分析物與昆蟲OrX結合時，源極增益電流降低。
在一較佳實施例中，在藉由感測器偵測或與昆蟲OrX結合之分析物的量增加時，源極增益電流降低得更多。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。在另一實施例中，偵測器組件偵測或量測源極-汲極電流之變化。
石墨烯 - 場效電晶體 (GFET) 感測器裝置 在一個實施例中，基板由一片石墨烯(G)構成。石墨烯可為單層、雙層或多層或其組合。在一較佳實施例中，石墨烯為單層。
在另一實施例中，基板形成石墨烯-場效電晶體(GFET)設備之通道。
在一個實施例中，GFET設備包含源電極及汲電極。
在另一實施例中，在源電極與汲電極之間發現或形成通道。
在另一實施例中，通道與源電極及汲電極電連通。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種感測器裝置，其包含與石墨烯-場效電晶體(GFET)設備之通道中之石墨烯電連通的昆蟲氣味受體複合物。
在另一實施例中，石墨烯-場效電晶體(GFET)設備亦包含閘電極。
GFET 感測器裝置中之昆蟲氣味受體複合物之呈現 昆蟲氣味受體複合物可存在於如上文所描述之膜模擬物中。
在一較佳實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質體中。
昆蟲氣味受體複合物與石墨烯之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至通道中之石墨烯。
在另一實施例中，偶合使昆蟲氣味受體複合物與石墨烯電連通。
昆蟲氣味受體複合物功能化 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經功能化以便於偶合至石墨烯。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物用his標記功能化。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物包含his標記。
在一個實施例中，OrX蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於OrX蛋白之N端。
在另一實施例中，Orco蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於Orco蛋白之N端。
在另一實施例中，OrX及Orco蛋白二者包含上述之his標記。
石墨烯功能化 在一個實施例中，石墨烯經功能化以便於偶合至昆蟲氣味受體複合物。
在另一實施例中，石墨烯經1-芘丁酸N-羥基丁二醯亞胺酯(PBASE)功能化。
偶合 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由his標記親和力結合偶合至石墨烯。
因此，在一個實施例中，his標記之昆蟲氣味劑複合物與PBASE功能化石墨烯結合。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與昆蟲氣味受體複合物中之蛋白質上之胺類之間的相互作用偶合至石墨烯。此等胺同時存在於OrX及Orco上。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與膜模擬物中之脂質(POPC、POPE、POPS)上之胺類之間的相互作用偶合至石墨烯。
在 GFET 感測器中偵測分析物 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。
較佳地，對分析物之偵測為特異性的。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OrX之結合改變了GFET設備中之源極增益電流。
在一較佳實施例中，在分析物與昆蟲OrX結合時，源極增益電流降低。
在一較佳實施例中，在藉由感測器偵測或與昆蟲OrX結合之分析物的量增加時，源極增益電流降低得更多。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。在另一實施例中，偵測器組件偵測或量測源極-汲極電流之變化。
石英晶體微天平(QCM)感測器裝置 在感測器裝置之一個實施例中，基板為石英晶體微天平中之共振器組件。
在一個實施例中，共振器組件為以下各者或由以下各者構成：壓電材料、至少一種壓電晶體及至少一種石英晶體。在一較佳實施例中，共振器組件為石英晶體共振器。
在一個實施例中，石英晶體用金塗佈。
電特徵 在一個實施例中，電特徵為藉由施加至共振器組件之交流電場誘導之振盪的共振頻率。
QCM 感測器裝置之電極 在一個實施例中，共振器組件具有附接至其相對側中之兩者之電極。
在一個實施例中，電極由金構成或用金塗佈。
QCM 感測器裝置中之昆蟲氣味受體複合物之呈現 昆蟲氣味受體複合物可存在於如上文所描述之膜模擬物中。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質體中。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於人造脂質體中。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質雙層中。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於人造脂質雙層中。
在一較佳實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質體中。
昆蟲氣味受體複合物與 QCM 感測器裝置中之共振器組件之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至共振器組件。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由鍵聯分子偶合至共振器組件。
在另一實施例中，鍵聯分子足夠短以允許在昆蟲氣味受體複合物與共振器組件之間的電連通。
在一個實施例中，鍵聯分子足夠短以防止共振器組件與昆蟲氣味受體複合物之分離。
在另一實施例中，鍵聯分子選自16-巰基十六烷酸(16-MHDA)、6-巰基十六烷酸(6-MHDA)及6-巰基己酸(MHA)。
在一較佳實施例中，鍵聯分子為6-巰基己酸(MHA)。 在另一實施例中，鍵聯劑為自組裝單層(SAM)之一部分。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由包括鍵聯分子之SAM層偶合至共振器組件。
在一較佳實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由包括6-巰基己酸(MHA)鍵聯分子之SAM層偶合至共振器組件。
用 QCM 感測器偵測分析物 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲氣味受體複合物中之昆蟲OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。
較佳地，偵測對於分析物為特異性的。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OrX之結合改變了藉由施加至共振器組件之交流電場誘導之共振頻率。
在一個實施例中，在分析物與昆蟲OrX結合時，共振頻率增加。
在另一實施例中，在分析物與昆蟲OrX結合時，共振頻率降低。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。在另一實施例中，偵測器組件偵測或量測藉由施加至共振器組件之交流電場誘導之共振器組件中的共振頻率之變化。
在一個實施例中，偵測器組件為頻率分析器。
雙層感測器裝置 在感測器裝置之一個實施例中，感測器包含膜模擬物，該膜模擬物包含兩親性分子、OrX蛋白及Orco蛋白； 第一基板，該第一基板包含安置於膜之第一側之第一電極；及 第二基板，該第二基板包含安置於膜之第二側之第二電極。
電特徵 在一個實施例中，電特徵為電化學電位。在另一個實施例中，電特徵為電流之流動。
雙層感測器裝置之電極 在一個實施例中，基板為工作電極。在一個實施例中，感測器進一步包含相對電極。
在另一實施例中，感測器進一步包含參考電極。
在另一實施例中，電化電池進一步包含恆電位器。
在一個實施例中，一或多個電極由銀構成或用銀塗佈。較佳地，至少部分電極覆蓋於氯化銀層中。
雙層感測器裝置中之昆蟲氣味受體複合物之呈現 昆蟲氣味受體複合物較佳地安置於如上文所描述之膜模擬物中。
較佳地，膜模擬物包含兩親性分子，諸如脂質分子。較佳地，兩親性分子包含磷脂分子。
在另一實施例中，OrX及Orco為親離子型膜蛋白。OrX及Orco蛋白一起形成複合物。在一些實施例中，複合物在分析物之存在下形成。
用雙層感測器偵測分析物 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物形成對分析物之存在或其他方面敏感之離子通道。
較佳地，偵測對於分析物為特異性的。
在另一實施例中，分析物之結合激活昆蟲氣味受體複合物，致使離子流通過膜。
較佳地，第一電極與膜之第一側電接觸且第二電極與膜之第二側電接觸。
在另一實施例中，感測器包含經組態以量測電特徵(例如在第一與第二電極之間的電流之流動)之控制系統。
表面電漿子共振(SPR)感測器裝置 在感測器裝置之一個實施例中，基板為玻璃稜鏡上之惰性金屬表面。較佳地，金屬表面為銀或金之金屬層。更佳地，金屬層具有近似50 nm之厚度。
電特徵 在一個實施例中，電特徵為表面電漿子共振。
SPR 感測器裝置中之昆蟲氣味受體複合物之呈現 昆蟲氣味受體複合物可存在於如上文所描述之膜模擬物中。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質體(例如人造脂質體或奈米盤)中。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質雙層(例如人造脂質雙層)中。
在一較佳實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質體中。
昆蟲氣味受體複合物與 SPR 感測器裝置中之金屬層之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至金屬表面。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由N端半胱胺酸殘基直接偶合至金屬表面。
用SPR 感測器偵測分析物 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲氣味受體複合物中之昆蟲OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。
較佳地，偵測對於分析物為特異性的。
在另一實施例中，SPR感測器包含： (a)金屬表面，其與能夠結合分析物之昆蟲氣味受體複合物結合， (b)光源激發光束，其用於在金屬表面定向， (c)至少一個偵測器，其能夠偵測自金屬表面內部反射之光束之光。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OrX之結合導致感測器之折射率之變化。較佳地，此變化藉由量測表面電漿子共振角或共振波長之變化來偵測。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。
在另一實施例中，偵測器組件偵測或量測激發光束(在固定共振角處)之共振波長之時變或在固定波長處之共振角之時移。
使用本發明之感測器裝置偵測分析物結合之方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測分析物之方法，該方法包含以下步驟： a) 使分析物與本發明之感測器中之昆蟲OrX結合， b)         偵測基板之電特徵之變化， 其中基板之電特徵之變化指示對分析物之偵測。
使用本發明之感測器裝置偵測環境中分析物之存在的方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測環境中分析物之存在之方法，該方法包含以下步驟： a) 使本發明之感測器暴露於含有分析物之環境， b)         使分析物與感測器中之昆蟲OrX結合， c) 偵測基板之電特徵之變化， 其中基板之電特徵之變化指示環境中分析物之存在。
使用本發明之 EIS 感測器裝置偵測分析物結合之方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測分析物之方法，該方法包含以下步驟： a) 使分析物與本發明之電化電池中之昆蟲OrX結合， b)         量測工作電極中之電化學阻抗之變化， 其中電化學阻抗之變化指示對分析物之偵測。
使用本發明之 EIS 感測器裝置偵測環境中分析物之存在的方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測環境中分析物之存在之方法，該方法包含以下步驟： a) 使本發明之感測器暴露於含有分析物之環境， b)         使分析物與本發明之電化電池中之昆蟲OrX結合， c) 量測工作電極之電化學阻抗之變化， 其中電化學阻抗之變化指示環境中分析物之存在。
使用本發明之 CNT-FET 感測器裝置偵測分析物結合之方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測分析物之方法，該方法包含以下步驟： a) 使分析物與本發明之感測器中之昆蟲OrX結合， b)         量測CNT-FET設備中之源極增益電流之變化， 其中源極增益電流之變化指示對分析物之偵測。
使用本發明之 CNT-FET 感測器裝置偵測環境中分析物之存在的方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測環境中分析物之存在之方法，該方法包含以下步驟： a) 使本發明之感測器暴露於含有分析物之環境， b)         使分析物與感測器中之昆蟲OrX結合， c) 量測CNT-FET設備中之源極增益電流之變化， 其中源極增益電流之變化指示環境中分析物之存在。
使用本發明之石墨烯 -FET(GFET) 感測器裝置偵測分析物結合之方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測分析物之方法，該方法包含以下步驟： a) 使分析物與本發明之感測器中之昆蟲OrX結合， b)         量測GFET設備中之源極增益電流之變化， 其中源極增益電流之變化指示對分析物之偵測。
使用本發明之石墨烯 -FET(GFET) 感測器裝置偵測環境中分析物之存在的方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測環境中分析物之存在之方法，該方法包含以下步驟： a) 使本發明之感測器暴露於含有分析物之環境， b)         使分析物與感測器中之昆蟲OrX結合， c) 量測GFET設備中之源極增益電流之變化， 其中源極增益電流之變化指示環境中分析物之存在。
使用本發明之 QCM 感測器裝置偵測分析物結合之方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測分析物之方法，該方法包含以下步驟： a) 使分析物與本發明之感測器中之昆蟲OrX結合， b)         量測由施加至QCM設備中之共振器組件之交流電場誘導的共振器組件中之共振頻率的變化， 其中共振頻率之變化指示對分析物之偵測。
使用本發明之 QCM 感測器裝置偵測環境中分析物之存在的方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測環境中分析物之存在之方法，該方法包含以下步驟： a) 使本發明之感測器暴露於含有分析物之環境， b)         使分析物與感測器中之昆蟲OrX結合， c) 量測由施加至QCM設備中之共振器組件之交流電場誘導的共振器組件之共振頻率的變化， 其中共振頻率之變化指示環境中分析物之存在。
使用本發明之 SPR 感測器裝置偵測分析物結合之方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測分析物之方法，該方法包含以下步驟： a) 使分析物與本發明之感測器中之昆蟲OrX結合， b)         量測表面電漿子共振角或共振波長之變化， 其中表面電漿子共振角或共振波長之變化指示對分析物之偵測。
使用本發明之 SPR 感測器裝置偵測環境中分析物之存在的方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測環境中分析物之存在之方法，該方法包含以下步驟： a)使本發明之感測器暴露於含有分析物之環境， b)使分析物與感測器中之昆蟲OrX結合， c)量測表面電漿子共振角或共振波長之變化， 其中表面電漿子共振角或共振波長之變化指示環境中分析物之存在。
使用本發明之雙層感測器裝置偵測分析物結合之方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測分析物之方法，該方法包含以下步驟： a) 使分析物與本發明之感測器中之昆蟲OrX結合， b)         獲得通過第一及第二電極之電量測值， 其中電量測值之變化指示對分析物之偵測。
使用本發明之雙層感測器裝置偵測環境中分析物之存在的方法 在另一態樣中，本發明提供一種偵測環境中分析物之存在之方法，該方法包含以下步驟： a) 使本發明之感測器暴露於含有分析物之環境， b)         使分析物與本發明之感測器中之昆蟲OrX結合， c) 獲得通過第一及第二電極之電量測值， 其中電量測值之變化指示環境中分析物之存在。
製造本發明之感測器裝置之方法 在另一態樣中，本發明提供一種製造感測器裝置之方法，該方法包括在感測器裝置之包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物與基板之間建立電連通的步驟，其中感測器裝置經組態以偵測基板之電特徵之變化。
在一個實施例中，方法包括使昆蟲氣味受體複合物與基板偶合之步驟。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經偶合至基板，之後將昆蟲氣味受體複合物偶合之基板組裝於感測器裝置中。
較佳地，感測器之組件、偶合及功能性為如本文所描述。
製造本發明之 EIS 感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為如本文所描述之電化電池之工作電極。
因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲氣味受體複合物與電化電池之工作電極之間建立電連通的步驟，其中電化電池經組態以偵測工作電極之電化學阻抗之變化，由此形成感測器裝置。
在一個實施例中，方法包括使昆蟲氣味受體複合物與工作電極偶合之步驟。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經偶合至工作電極，之後將昆蟲氣味受體複合物偶合之工作電極組裝於感測器裝置中。
較佳地，感測器之組件、偶合及功能性為如本文所描述。
昆蟲氣味受體複合物與電極之偶合。 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由鍵聯劑偶合至電極。
在一個實施例中，鍵聯分子足夠短以允許在昆蟲氣味受體複合物與電極之間的電連通。
在另一實施例中，鍵聯分子足夠短以防止電極與昆蟲氣味受體複合物之分離。
在另一實施例中，鍵聯分子選自16-巰基十六烷酸(16-MHDA)、6-巰基十六烷酸(6-MHDA)及6-巰基己酸(MHA)。
在一較佳實施例中，鍵聯分子為6-巰基己酸(MHA)。
在另一實施例中，鍵聯劑為自組裝單(SAM)層之一部分。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由包括鍵聯分子之SAM層偶合至電極。
在一較佳實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由包括6-巰基己酸(MHA)鍵聯分子之SAM層偶合至電極。
在另一實施例中，鍵聯劑或MHA之羧基之活化在昆蟲氣味受體複合物之偶合之前執行。
較佳地，在將昆蟲氣味受體複合物偶合至電極之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之溶液執行鍵聯劑或MHA之羧基之活化。
製造本發明之 CNT-FET 感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為如本文所描述之CNT-FET設備之通道。
因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲氣味受體複合物與CNT-FET設備之通道之間建立電連通的步驟，其中CNT-FET設備經組態以偵測CNT-FET設備之源極增益電流之變化，由此形成感測器裝置。
在一個實施例中，方法包括使昆蟲氣味受體複合物與通道偶合之步驟。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經偶合至通道，之後將昆蟲氣味受體複合物偶合之通道組裝於感測器裝置中。
較佳地，感測器之組件、偶合及功能性為如本文所描述。
昆蟲氣味受體複合物與碳奈米管 (CNT) 之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至通道中之碳奈米管。
昆蟲氣味受體複合物功能化 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經功能化以便於偶合至CNT。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物用his標記功能化。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物包含his標記。
在一個實施例中，OrX蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於OrX蛋白之N端。
在另一實施例中，Orco蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於Orco蛋白之N端。
在另一實施例中，OrX及Orco蛋白二者包含上述之his標記。
CNT 功能化 在一個實施例中，CNT經功能化以便於偶合至昆蟲氣味受體複合物。
在另一實施例中，CNT經鎳(Ni)-氮基三乙酸(NTA)功能化。
偶合 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由his標記親和力結合偶合至CNT。
因此，在一個實施例中，his標記之昆蟲氣味受體複合物與Ni-NTA功能化之CNT結合。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與昆蟲氣味受體複合物中之蛋白質上之胺類之間的相互作用偶合至CNT。此等胺同時存在於OrX及Orco上。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與膜模擬物中之脂質(POPC、POPE、POPS)上之胺類之間的相互作用偶合至CNT。
製造本發明之 GFET 感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為如本文所描述之GFET設備之通道。
因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲氣味受體複合物與GFET設備之通道之間建立電連通的步驟，其中GFET設備經組態以偵測GFET設備之源極增益電流之變化，由此形成感測器裝置。
在一個實施例中，方法包括使昆蟲氣味受體複合物與通道偶合之步驟。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經偶合至通道，之後將昆蟲氣味受體複合物偶合之通道組裝於感測器裝置中。
較佳地，感測器之組件、偶合及功能性為如本文所描述。
昆蟲氣味受體複合物與石墨烯之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至通道中之石墨烯。
昆蟲氣味受體複合物功能化 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經功能化以便於偶合至石墨烯。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物用his標記功能化。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物包含his標記。
在一個實施例中，OrX蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於OrX蛋白之N端。
在另一實施例中，Orco蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於Orco蛋白之N端。
在另一實施例中，OrX及Orco蛋白二者包含上述之his標記。
石墨烯功能化 在一個實施例中，石墨烯經功能化以便於偶合至昆蟲氣味受體複合物。
在另一實施例中，石墨烯經1-芘丁酸N-羥基丁二醯亞胺酯(PBASE)功能化。
偶合 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由his標記親和力結合偶合至石墨烯。
因此，在一個實施例中，his標記之昆蟲氣味劑複合物與PBASE功能化石墨烯結合。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與昆蟲氣味受體複合物中之蛋白質上之胺類之間的相互作用偶合至石墨烯。此等胺同時存在於OrX及Orco上。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與膜模擬物中之脂質(POPC、POPE、POPS)上之胺類之間的相互作用偶合至石墨烯。
製造本發明之 QCM 感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為石英晶體微天平之石英晶體共振器。
因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲氣味受體複合物與石英晶體微天平之共振器組件之間建立電連通的步驟，其中石英晶體微天平經組態以偵測由施加至QCM設備中之共振器組件之交流電場誘導的共振器組件之共振頻率的變化，由此形成感測器裝置。
在一個實施例中，方法包括使昆蟲氣味受體複合物與共振器組件偶合之步驟。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經偶合至共振器組件，之後將昆蟲氣味受體複合物偶合之工作共振器組件組裝於感測器裝置中。
較佳地，共振器組件為石英晶體共振器。
較佳地，感測器之組件、偶合及功能性為如本文所描述。
昆蟲氣味受體複合物與共振器組件之偶合 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由鍵聯劑偶合至共振器組件。
在一個實施例中，鍵聯分子足夠短以允許在昆蟲氣味受體複合物與共振器組件之間的電連通。
在另一實施例中，鍵聯分子足夠短以防止共振器組件與受體分離。
在另一實施例中，鍵聯分子選自16-巰基十六烷酸(16-MHDA)、6-巰基十六烷酸(6-MHDA)及6-巰基己酸(MHA)。
在一較佳實施例中，鍵聯分子為6-巰基己酸(MHA)。
在另一實施例中，鍵聯劑為自組裝單層(SAM)之一部分。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由包括鍵聯分子之SAM層偶合至共振器組件。
在一較佳實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由包括6-巰基己酸(MHA)鍵聯分子之SAM層偶合至共振器組件。
在另一實施例中，鍵聯劑或MHA之羧基之活化在昆蟲氣味受體複合物之偶合之前執行。
較佳地，在將昆蟲氣味受體複合物偶合至共振器組件之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之溶液執行鍵聯劑或MHA之羧基之活化。
申請人之發明成功地將具聞嗅能力之昆蟲氣味受體與便利之感測器型式組合。
除便利性得到提高以外，相對於基於使用昆蟲OR之先前分析系統，本發明之感測器裝置出人意料地使偵測靈敏度得到非常顯著的提高。
昆蟲氣味受體複合物 昆蟲氣味受體(OR)為形成配位體閘控之非選擇性陽離子通道之新穎的七種跨膜蛋白家族的成員。如在圖1中所展現，認為高度保守之昆蟲氣味劑輔受體(Orco)在活體內形成活性通道，具有由配位體結合子單元(OrX)組所賦予的氣味劑特異性。
較佳地，偵測對於分析物為特異性的。
活體內，昆蟲OrX蛋白之N端為細胞質的，而C端在細胞外。此拓樸結構與哺乳動物G蛋白偶合受體(GPCR)之拓樸結構相對。另外，不同於哺乳動物GPCR，昆蟲OR充當配位體閘控之非選擇性陽離子通道，且信號大部分獨立於G蛋白16-17 。
Hopf等人201518 進一步論述昆蟲OR之預測結構及其與哺乳動物GPCR之非相關性。
昆蟲 OrX 亦可描述為OrX多肽之昆蟲OrX蛋白為熟習此項技術者所熟知。用於本發明之適合之OrX序列包括來自以下之彼等：黑腹果蠅(Drosophila melanogaster ) OR基因家族(19 )，其可偵測廣泛範圍之VOC (20-22 )；瘧蚊(Anopheles gambiae ) OR基因家族(23 )，其可偵測廣泛範圍之VOC (24-25 )；以及來自其他昆蟲物種之OR基因家族，針對已知OR家族之最新清單，參見Montagne 2015 (1 )之表I。在一個實施例中，昆蟲OrX蛋白包含揭示於此類參考文獻1,19 及23 中之序列或其變異體或功能片段。
昆蟲氣味劑輔受體 (Orco) 亦可描述為Orco多肽之昆蟲氣味劑輔受體(Orco)蛋白(亦稱為Or83b26 )為熟習此項技術者所熟知。用於本發明之適合之Orco序列包括來自以下之彼等：黑腹果蠅Orco基因家族(19 )、瘧蚊(Anopheles gambiae ) Orco基因家族(23,27 )以及自其他昆蟲物種之Orco基因家族，針對已知Orco家族之最新清單，參見Montagne 2015(1 )之表I。在一個實施例中，昆蟲Orco蛋白包含揭示於此類參考文獻1,19 及23,27 中之序列或其變異體或功能片段。
OrX 蛋白之性質 在一個實施例中，受體複合物中之OrX為重組表現之蛋白質。
在一較佳實施例中，OrX已在重組表現之後純化。
在一個實施例中，OrX不直接自昆蟲嗅覺細胞純化。
在另一實施例中，在感測器裝置中，OrX不存在於昆蟲嗅覺細胞中。
Orco 蛋白之性質 在一個實施例中，受體複合物中之Orco為重組表現之蛋白質。
在一較佳實施例中，Orco已在重組表現之後純化。
在一個實施例中，Orco不直接自昆蟲嗅覺細胞純化。
在另一實施例中，在感測器裝置中，Orco不存在於昆蟲嗅覺細胞中。
用於本發明之感測器裝置之基板 用於本發明之感測器裝置之基板可為其中可量測電特徵之變化的任何基板。較佳地，電特徵之變化係由OrX與分析物之間的相互作用引起的。
基板亦可提供可偶合至昆蟲氣味受體複合物之表面。
適合之基板包括以下中之至少一者或由以下中之至少一者構成：電極、半導體材料、碳奈米管(CNT)、石墨烯、氧化物、摻雜矽、導電聚合物、共振器組件、稜鏡上之惰性金屬表面。
在一個實施例中，共振器組件為以下各者或由以下各者構成：壓電材料、至少一種壓電晶體及石英晶體。在一較佳實施例中，共振器組件為石英晶體共振器。
在本發明之感測器裝置中量測之電特徵 在一個實施例中，電特徵係選自以下中之至少一者：傳導性、電阻、複電阻、阻抗、電化學阻抗、電化學電位、表面電漿子共振、電流及藉由交流電場誘導之振盪之共振頻率。
EIS 裝置 在一個實施例中，本發明之感測器裝置經組態以偵測化學電池之工作電極中之電化學阻抗的變化。因此，在此實施例中之感測器裝置經組態用於電化學阻抗頻譜(EIS)。
電化學阻抗頻譜 (EIS) 電化學阻抗頻譜為熟習此項技術者所熟知，且已長期用於研究電化學系統。對於阻抗量測，施加較小的正弦AC電壓探針(通常2-10 mV)，且測定電流反應。同相電流反應測定阻抗之實(電阻)分量，而異相電流反應測定虛(電容)分量。AC探針電壓應足夠小，使得系統反應為線性的，允許進行簡單之等效電路分析。阻抗方法非常有效，原因在於其能夠表徵廣泛不同的時間常數之物理化學過程，在高頻率下取樣電子轉移且在低頻率下取樣質量轉移。
阻抗結果通常與電阻器及電容器之等效電路擬合，該等效電路諸如經常用以解釋簡單電化學系統之Randles電路。Randles電路[Rs+CPE/(Rct+W)]包含與恆定相位元件(CPE)串聯且與電荷轉移電阻(Rct)及瓦爾堡(Warburg)擴散元件(W)並聯之溶液電阻(Rs)。
若分析物影響此等等效電路參數中之一或多者且此等參數不受干擾物種影響，則阻抗方法可用於分析物偵測。
可用以量測有效之擴散係數的瓦爾堡阻抗幾乎不適用於分析性應用。最常適用於分析物偵測之等效電路元件為Rct及CPE。經量測之電容通常起因於若干元件之串聯組合，諸如分析物與金(Au)電極上之感測層結合。
電化學阻抗頻譜 (EIS) 裝置 EIS裝置通常包含具有以下之電化電池： ●  工作電極(WE) ●  相對電極(CE) ●  參考電極(RE) ●  恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)
視應用而定，儀器與電化電池之連接可(或必須)以不同方式設置。
在恆電位模式中，恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)將精確地控制相對電極(CE)針對工作電極(WE)之電位，使得工作電極(WE)與參考電極(RE)之間的電位差明確界定，且對應於使用者所指定的值。在恆電流模式中，WE與CE之間的電流受控制。連續監測RE與WE之間的電位差及在CE與WE之間流動之電流。藉由使用PGSTAT，在藉由使用負反饋機制量測期間之任何時候，使用者所指定之值(亦即施加電位或電流)受到精確控制。
相對電極(CE)為用以關閉電化電池中之電流電路之電極。其通常由惰性材料(例如Pt、Au、石墨、玻璃碳)製成且通常不參與電化學反應。由於電流在WE與CE之間流動，因此CE (電子源/電子匯點)之總表面積必須高於WE之面積，使得其將不為所研究的電化學過程之動力學之限制因素。
參考電極(RE)為具有穩定及熟知電極電位之電極，且用作電化電池中之參考點用於電位控制及量測。參考電極電位之高穩定性通常係藉由採用具有恆定(緩衝或飽和)濃度之氧化還原反應之各參與者的氧化還原系統達成。此外，通過參考電極之電流保持接近零(理想地，零)，其係藉由使用CE以關閉電池中之電流電路以及靜電計上之極高輸入阻抗(＞ 100 GOhm)達成。
工作電極(WE)為電化學系統中發生相關反應之電極。常見之工作電極可由惰性材料(諸如Au、Ag、Pt、玻璃碳(GC)以及Hg滴及膜)製成。
EIS裝置亦可包括量測工作電極之電性質變化的組件。舉例而言，此組件可為頻率分析器。頻率分析器可與恆電位器/恆電流儀連接。
CNT-FET 裝置 在一個實施例中，本發明之感測器裝置經組態以偵測CNT-FET設備之源極增益電流(source-gain current)之變化。
碳奈米管場效電晶體 (CNT-FET) 碳奈米管場效電晶體(CNT-FET)為如下場效電晶體：其利用單個碳奈米管或碳奈米管之陣列作為通道材料，來替代傳統金屬氧化物半導體場效電晶體(MOS-FET)結構中之塊體矽。
CNT-FET 裝置 CNT-FET裝置通常包含： a) 源電極(SE) b)         汲電極(DE) c) 閘電極(GE)，及 d)         至少一個由碳奈米管(CNT)構成之通道
閘電極用以控制通過源電極及汲電極之電流。當閘電極開啟時，電流流動能夠經由通道調節而通過源電極及汲電極。
電極通常由至少一種金屬構成。較佳之金屬包括(但不限於)：鉑、金、鉻、銅、鋁、鎳、鈀及鈦。
在一較佳實施例中，通道由碳奈米管構成。
CNT-FET裝置亦可包括量測源極-汲極電流之變化之組件。
GFET 裝置 在一個實施例中，本發明之感測器裝置經組態以偵測GFET設備之源極增益電流之變化。
石墨烯場效電晶體 (GFET) 石墨烯場效電晶體(GFET)為如下場效電晶體：其利用石墨烯作為通道材料，來替代傳統金屬氧化物半導體場效電晶體(MOS-FET)結構中之塊體矽。
GFET 裝置 GFET裝置通常包含： e) 源電極(SE) f) 汲電極(DE) g) 閘電極(GE)，及 h)         至少一個由石墨烯構成之通道。
閘電極用以控制通過源電極及汲電極之電流。當閘電極開啟時，電流流動能夠經由通道調節而通過源電極及汲電極。
電極通常由至少一種金屬構成。較佳之金屬包括(但不限於)：鉑、金、鉻、銅、鋁、鎳、鈀及鈦。
在一較佳實施例中，通道由碳奈米管構成。
GFET裝置亦可包括量測源極-汲極電流之變化之組件。
QCM 裝置 在一個實施例中，本發明之感測器裝置經組態以偵測石英晶體微天平(QCM)中之共振器組件之共振振盪頻率的變化。
在一個實施例中，共振器組件為以下各者或由以下各者構成：壓電材料、至少一種壓電晶體及至少一種石英晶體。在一較佳實施例中，共振器組件為石英晶體共振器。
在一個實施例中，石英晶體用金塗佈。
石英晶體微天平 (QCM) 石英晶體微天平(QCM)技術為熟習此項技術者所熟知，且藉由量測石英晶體共振器之頻率變化來量測每單位面積之質量變化。因在聲學共振器之表面處之氧化物生長/衰退或膜沈積所致，共振藉由添加或移除的小質量而受干擾。可在真空下、氣相及液體環境中使用QCM。在判定分子(尤其蛋白質)與經識別位點功能化之表面之親和力時，其高度有效。QCM亦已用以研究生物分子之間的相互作用。頻率量測易於具有高精度，因此，其易於量測降至低於1 μg/cm2 之含量之質量密度。除量測頻率以外，經常量測耗散因子(等效於共振頻寬)以幫助分析。耗散因子為共振之倒數品質因子，Q-1 = w/fr ；其量化系統之減振且與樣品之黏彈特性有關。
石英為經歷壓電效應之晶體家族之一個成員。施加電壓與機械變形之間的關係為熟知的；此允許藉由電學手段探測聲共振。向石英晶體施加交流電將誘導振盪。在適當切割晶體之電極之間具有交流電時，產生駐波剪力波。作為頻率與頻寬之比率的Q因子可高達106。此類窄共振產生高度穩定之振盪器且在判定共振頻率時得到高精確性。對於感測，QCM利用此容易性及精確度。常見設備允許解析度在晶體上降至1 Hz，其中基本共振頻率在4-6 MHz範圍內。
石英晶體之振盪頻率部分地視晶體之厚度而定。在正常操作期間，所有其他影響變數保持恆定；因此，厚度之變化直接與頻率之變化相關。在物質沈積於晶體之表面上時，厚度增加；因此振盪頻率自初始值下降。在一些簡化假設下，使用Sauerbrey方程，此頻率變化可定量且精確地與質量變化相關。
石英晶體微天平 (QCM) 裝置 QCM之典型設置含有水冷卻管、保留單元、經由微點饋通通道(microdot feed-through)之頻率感測設備、振盪源以及量測及記錄裝置。
QCM由共振器組件(通常較薄的壓電板)組成，其中電極蒸發於兩側上。因壓電效應所致，電極兩端之AC電壓誘導剪切變形且反之亦然。電機械偶合提供一種藉由電學手段偵測聲共振之簡單方式。否則，其重要性較小。
雙層裝置 用於雙層裝置之典型設置將諸如脂質雙層及蛋白質之生物組分與電子組合以提供回應於來自分析物或相關分析物家族之刺激的輸出信號。
雙層裝置包含安裝於電路中之昆蟲氣味受體複合物，該複合物形成藉由分析物閘控(激活/失活)之離子通道，其中分析物與OrX之結合產生使用電路量測之經由離子通道的電流。
SPR 裝置 SPR裝置之典型設置包含： (a)感測器，其提供能夠結合分析物之金屬感測器表面： (b)光源激發光束，其用於在感測器表面定向： (c)至少一個偵測器，其能夠偵測自感測器表面內部反射之光束之光。
SPR裝置包含偶合至金屬表面之昆蟲氣味受體複合物，其中分析物與昆蟲OrX之結合導致感測器之折射率之變化。較佳地，此變化可藉由量測表面電漿子共振角或共振波長中之變化來偵測。
本發明之感測器裝置 在第一態樣中，本發明提供一種感測器裝置，其包含與基板以電連通之包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物，其中感測器裝置經組態以偵測基板之電特徵之變化。
感測器組件 在另一態樣中，本發明提供用於感測器裝置之組件，該組件包含與如本文所定義之基板以電連通之包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物。此組件適用於添加至根據本發明之感測器裝置中。
在一個態樣中，本發明提供一種感測器裝置組件，其包含與基板以電連通之包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物。
在一個態樣中，本發明提供一種包含本發明之感測器裝置組件之感測器裝置，其中感測器裝置經組態以偵測基板之電特徵之變化。
在另一態樣中，本發明提供一種製造感測器裝置組件之方法，該方法包括在包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物與基板之間建立電連通之步驟。
在另一態樣中，本發明提供一種組裝感測器裝置之方法，該方法包含將本發明之感測器裝置組件添加至感測器裝置中，其中經組裝之感測器裝置經組態以偵測基板之電特徵之變化。
在感測器裝置組件及感測器裝置之某些實施例中，昆蟲氣味受體複合物、電連通、基板、組態及偵測如本文所描述。
電化學阻抗頻譜 (EIS) 設備 在一個實施例中，感測器裝置包含電化電池。
在一個實施例中，電化電池包含至少兩個電極。
在另一實施例中，電化電池至少包含： a) 工作電極(WE)，及 b)         相對電極(CE)
在一較佳實施例中，電化電池亦包含參考電極(RE)。
在另一實施例中，電化電池包含恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)。
在一較佳實施例中，電化電池包含以下所有： a) 工作電極(WE)， b)         相對電極(CE)， c) 參考電極(RE)，及 d)         恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)。
相對電極 在一個實施例中，相對電極由選自以下之材料構成或用選自以下之材料塗佈：鉑(Pt)、金(Au)、石墨或玻璃碳(GC)。
較佳地，相對電極由鉑(Pt)構成。
較佳地，相對電極為鉑(Pt)線。
參考電極 較佳地，參考電極為銀/氯化銀(Ag/AgCl)參考電極。
工作電極 在一個實施例中，電化學阻抗頻譜(EIS)設備包含至少一個工作電極。
電極可由任何適合之材料構成或用任何適合之材料塗佈。電極可由選自以下之材料構成或用選自以下之材料塗佈：金(Au)、銀(Ag)、鉑(Pt)、碳奈米管(CNT)及玻璃碳(GC)。
在一較佳實施例中，電極由金構成或用金塗佈。
恆電位器 / 恆電流儀 (PGSTAT) 較佳地，恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)以恆電位模式使用。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。偵測器組件偵測或量測基板之電特徵之變化。
在一個實施例中，偵測器組件為頻率分析器。在另一實施例中，頻率分析器與恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)連接。
昆蟲 OrX 蛋白之製備 用於重組表現及純化昆蟲OrX及Orco蛋白之方法為熟習此項技術者所熟知28 。
昆蟲 OrX 之 製備之呈現 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物以能夠回應與分析物之相互作用而發生構形變化之形式存在。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於膜模擬物中。
膜模擬物如其名指示模擬天然膜，且可以活體內發現之相同或類似之構形負載受體。
膜模擬物可選自脂質體、兩親性聚合物、清潔劑微胞、奈米囊泡、脂質雙層及奈米盤。
較佳地，膜模擬物為人造的。
在一個實施例中，膜模擬物為脂質體。
在一個實施例中，膜模擬物為人造脂質體。
在另一實施例中，膜模擬物為脂質雙層。
在另一實施例中，膜模擬物為人造脂質雙層。
用於復原脂質體中之昆蟲受體蛋白(OrX及Orco)之方法為此項技術者所熟知28 。
包含昆蟲氣味受體複合物之脂質雙層在工作電極上之形成 在不希望受理論所束縛之情況下，申請人假定在一些實施例中，當將脂質體中之昆蟲氣味受體複合物施加至工作電極時，脂質體改變結構以在電極上形成脂質雙層。申請人假定昆蟲氣味受體複合物以與活體內細胞膜中所發現之構形類似或相同的構形嵌入於脂質雙層中，使得OrX受體之配位體/分析物結合域進入至配位體 / 分析物 。
在不希望受理論所束縛之情況下，申請人假定在其他實施例中，脂質體在與工作電極結合時作為脂質體保留。此例示於圖2中。
昆蟲氣味受體複合物與基板之偶合 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至基板。
用於將蛋白質與基板偶合之諸多方法為熟習此項技術者所已知。此類方法包括使用共價化學偶合、光化學交聯、表面塗佈/改質、金表面化學反應、蛋白質親和標記、生物素-抗生蛋白鏈菌素聯接、抗體固定及經工程改造之表面結合肽序列。
用於本發明裝置之OrX及Orco蛋白亦可包括胺基、組胺酸標記或用以將昆蟲氣味受體複合物與基板偶合之一些其他功能化。在具有胺基之蛋白質的情況下，使用者可使用胺基來置換與基板偶合之離去基，以便使蛋白質與基板結合。偶合無需藉由親核試劑-離去基反應實現，因為偶合可藉由共價鍵(例如醯胺鍵)、離子鍵、藉由氫鍵合或藉由金屬配位而發生。作為配位之一個實例，OrX或Orco蛋白可藉由組胺酸標記與鎳之間的配位偶合至基板。OrX或Orco蛋白亦可藉由半胱胺酸殘基偶合至基板。在一些實施例中，待天然附著之OrX或Orco蛋白包括半胱胺酸殘基。此可為天然存在的或此類殘基可有意地併入天然或重組蛋白中。其他資訊可見於WO2012050646。
在一些實施例中，基板之表面包含使基板與跨膜蛋白鍵聯之官能基。在一個非限制性實例中，材料之表面可經羧化重氮鹽功能化，該等羧化重氮鹽自發地與諸如碳奈米管之基板形成共價鍵。認為胺及醯胺官能基適用作酚系/芳族官能基。
EIS 之鍵聯劑 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由鍵聯劑偶合至電極。
在一個實施例中，鍵聯分子足夠短以允許在昆蟲氣味受體複合物與電極之間的電連通。
在另一實施例中，鍵聯分子足夠短以防止電極與受體分離。
在另一實施例中，鍵聯分子選自16-巰基十六烷酸(16-MHDA)、6-巰基十六烷酸(6-MHDA)及6-巰基己酸(MHA)。
在一較佳實施例中，鍵聯劑為6-巰基己酸(MHA)。
在另一實施例中，鍵聯劑為自組裝單(SAM)層之一部分。
因此，在一個實施例中，SAM層由6-巰基己酸(MHA)構成。
在另一實施例中，MHA之羧基之活化在昆蟲氣味受體複合物之偶合之前執行。
較佳地，在將昆蟲氣味受體複合物偶合至電極之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之溶液執行MHA之羧基之活化。
對分析物之偵測 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。
較佳地，對分析物之偵測為特異性的。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OrX之結合改變工作電極中之電化學阻抗。
碳奈米管場效電晶體 (CNT-FET) 設備 較佳地，碳奈米管場效電晶體(CNT-FET)設備包含至少兩個末端。在另一實施例中，CNT-FET設備至少包含源電極及汲電極。
在一個實施例中，CNT-FET設備包含： a) 源電極 b)         汲電極 c) 閘電極 d)         至少一個由碳奈米管(CNT)構成之通道
較佳地，閘電極為銀/氯化銀(Ag/AgCl)線。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。偵測器組件偵測或量測源極-汲極電流之變化。
可使用手動操作或在電腦控制下操作之習知電子儀錶來量測電特徵之變化。舉例而言，電腦化實驗室設置可能包括National Instrument PCI-6722 DAQ板以施加偏壓電壓及各個值之閘電壓。接著Keithley 6485微微電流計(Picoammeter)可用以量測電流，提供全I-Vg曲線。在希望量測位於單個基板上之許多裝置的情況下，可使用開關矩陣(Keithley 7001)或其他多工器。
Agilent 4156C參數分析器亦可用於所有電量測。參數分析器具有極佳之靈敏度且可精確地量測毫微微安量表上之電流。
昆蟲氣味受體複合物之呈現 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物以能夠回應與分析物之相互作用而發生構形變化之形式存在。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於膜模擬物中。
如名稱所提出，膜模擬物模擬天然膜，且可以與活體內發現之構形相同或類似之構形負載受體。
膜模擬物可選自脂質體、兩親性聚合物、清潔劑微胞、奈米囊泡、脂質雙層及奈米盤。
較佳地，膜模擬物為人造的。
在一較佳實施例中，膜模擬物為奈米盤。
在本發明之CNT-FET 裝置中 昆蟲氣味受體複合物與通道之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至通道中之碳奈米管。
昆蟲氣味受體複合物功能化 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經功能化以便於偶合至CNT。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物用his標記功能化。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物包含his標記。
在一個實施例中，OrX蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於OrX蛋白之N端。
在另一實施例中，Orco蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於Orco蛋白之N端。
在另一實施例中，OrX及Orco蛋白二者包含上述之his標記。
CNT 功能化 在一個實施例中，CNT經功能化以便於昆蟲氣味受體複合物之偶合。
在另一實施例中，CNT經鎳(Ni)-氮基三乙酸(NTA)功能化。
偶合 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由his標記親和力結合偶合至CNT。
因此，在一個實施例中，his標記之昆蟲氣味受體複合物與Ni-NTA功能化之CNT結合。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與昆蟲氣味受體複合物中之蛋白質上之胺類之間的相互作用偶合至CNT。此等胺同時存在於OrX及Orco上。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與膜模擬物中之脂質(POPC、POPE、POPS)上之胺類之間的相互作用偶合至CNT。
對分析物之偵測 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。
較佳地，對分析物之偵測為特異性的。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OR之結合改變本發明之CNT-FET設備之通道中的電源增益電流。
石墨烯場效電晶體 (GFET) 設備 較佳地，石墨烯場效電晶體(GFET)設備包含至少兩個末端。在另一實施例中，GFET設備至少包含源電極及汲電極。
在一個實施例中，GFET設備包含： e) 源電極 f) 汲電極 g) 閘電極 h)         至少一個由石墨烯構成之通道
較佳地，閘電極為銀/氯化銀(Ag/AgCl)線。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。偵測器組件偵測或量測源極-汲極電流之變化。
可使用手動操作或在電腦控制下操作之習知電子儀錶來量測電特徵之變化。舉例而言，電腦化實驗室設置可能包括National Instrument PCI-6722 DAQ板以施加偏壓電壓及各個值之閘電壓。接著Keithley 6485微微電流計可用以量測電流，提供全I-Vg曲線。在希望量測位於單個基板上之許多裝置的情況下，可使用開關矩陣(Keithley 7001)或其他多工器。
Agilent 4156C參數分析器亦可用於所有電量測。參數分析器具有極佳之靈敏度且可精確地量測毫微微安量表上之電流。
昆蟲氣味受體複合物之呈現 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物以能夠回應與分析物之相互作用而發生構形變化之形式存在。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於膜模擬物中。
如名稱所提出，膜模擬物模擬天然膜，且可以與活體內發現之構形相同或類似之構形負載受體。
膜模擬物可選自脂質體、兩親性聚合物、清潔劑微胞、奈米囊泡、脂質雙層及奈米盤。
較佳地，膜模擬物為人造的。
在一較佳實施例中，膜模擬物為脂質體。
在本發明之 GFET 裝置中昆蟲氣味受體複合物與通道之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至通道中之石墨烯。
昆蟲氣味受體複合物功能化 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經功能化以便於偶合至石墨烯。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物用his標記功能化。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物包含his標記。
在一個實施例中，OrX蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於OrX蛋白之N端。
在另一實施例中，Orco蛋白包含his標記。
較佳地，his標記處於Orco蛋白之N端。
在另一實施例中，OrX及Orco蛋白二者包含上述之his標記。
石墨烯功能化 在一個實施例中，石墨烯經功能化以便於昆蟲氣味受體複合物之偶合。
在另一實施例中，石墨烯經1-芘丁酸N-羥基丁二醯亞胺酯(PBASE)功能化。
偶合 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由his標記親和力結合偶合至石墨烯。
因此，在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與昆蟲氣味受體複合物中之蛋白質上之胺類之間的相互作用偶合至石墨烯。此等胺同時存在於OrX及Orco上。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物藉由在PBASE上之酯類與膜模擬物中之脂質(POPC、POPE、POPS)上之胺類之間的相互作用偶合至石墨烯。
對分析物之偵測 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。
較佳地，對分析物之偵測為特異性的。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OR之結合改變本發明之GFET設備之通道中的電源增益電流。
石英晶體微天平 (QCM) 設備 較佳地，石英晶體微天平(QCM)設備包含： a) 共振器組件 b)         振盪源組件 c) 頻率感測組件
共振器組件 在一個實施例中，共振器組件為以下各者或由以下各者構成：壓電材料、至少一種壓電晶體及至少一種石英晶體。在一較佳實施例中，共振器組件為石英晶體共振器。
在一個實施例中，石英晶體用金塗佈。
在一個實施例中，共振器組件具有附接至其相對側中之兩者之電極。
在一個實施例中，電極由金構成或用金塗佈。
在一較佳實施例中，共振器組件與至少一個昆蟲氣味受體複合物電連通。
振盪源組件 在一個實施例中，振盪源組件經組態以向共振器組件施加交流電場。
在一個實施例中，交流電場經由附接至共振器組件之相對側的電極施加。
頻率感測組件 在一個實施例中，頻率感測組件經組態以量測共振器組件之振盪頻率。在一個實施例中，頻率感測組件經組態以量測共振器組件之振盪頻率之變化。
昆蟲氣味受體複合物之呈現 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物以能夠回應與分析物之相互作用而發生構形變化之形式存在。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於膜模擬物中。
如名稱所提出，膜模擬物模擬天然膜，且可與活體內發現之構形相同或類似之構形負載受體。
膜模擬物可選自脂質體、兩親性聚合物、清潔劑微胞、奈米囊泡、脂質雙層及奈米盤。
較佳地，膜模擬物為人造的。
在一較佳實施例中，膜模擬物為脂質體。
在另一實施例中，膜模擬物為脂質雙層。
在另一實施例中，膜模擬物為人造脂質雙層。
用於復原脂質體中之昆蟲受體之方法為此項技術者所熟知28 。
包含昆蟲氣味受體複合物之脂質雙層在共振器組件上之形成 在不希望受理論所束縛之情況下，申請人假定在一些實施例中，當將脂質體中之昆蟲氣味受體複合物施加至工作電極時，脂質體改變結構以在共振器組件上形成脂質雙層。申請人假定昆蟲氣味受體複合物以與活體內細胞膜中所發現之構形類似或相同之構形嵌入於脂質雙層中，使得受體之配位體/分析物結合域進入至配位體/分析物。
在不希望受理論所束縛之情況下，申請人假定在其他實施例中，脂質體在與工作電極結合時作為脂質體保留。此例示於圖2中。
用於 QCM 之鍵聯劑 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由鍵聯劑偶合至共振器組件。
在一個實施例中，鍵聯分子足夠短以允許在昆蟲氣味受體複合物與共振器組件之間的電連通。
在另一實施例中，鍵聯分子足夠短以防止共振器組件與昆蟲氣味受體複合物之分離。
在另一實施例中，鍵聯分子選自16-巰基十六烷酸(16-MHDA)、6-巰基十六烷酸(6-MHDA)及6-巰基己酸(MHA)。
在一較佳實施例中，鍵聯劑為6-巰基己酸(MHA)。
在另一實施例中，鍵聯劑為自組裝單層(SAM)之一部分。
因此，在一個實施例中，SAM層由6-巰基己酸(MHA)構成。
在另一實施例中，MHA之羧基之活化在昆蟲氣味受體複合物之偶合之前執行。
較佳地，在使昆蟲OrX與電極偶合之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之溶液執行MHA之羧基之活化。
對分析物之偵測 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲氣味受體複合物中之昆蟲OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。
較佳地，對分析物之偵測為特異性的。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OrX之結合改變藉由施加至共振器組件之交流電場誘導之共振器組件的共振頻率。
雙層裝置 在感測器裝置之一個實施例中，感測器包含膜模擬物，該膜模擬物包含兩親性分子、OrX蛋白及Orco蛋白； 第一基板，該第一基板包含安置於膜之第一側之第一電極；及 第二基板，該第二基板包含安置於膜之第二側之第二電極。
電特徵 在一個實施例中，電特徵為電化學電位。在另一個實施例中，電特徵為電流之流動。
雙層感測器裝置之電極 在一個實施例中，基板為工作電極。在一個實施例中，感測器進一步包含相對電極。
在另一實施例中，感測器進一步包含參考電極。
在另一實施例中，電化電池進一步包含恆電位器。
在一個實施例中，一或多個電極由銀構成或用銀塗佈。
雙層感測器裝置中之昆蟲氣味受體複合物之呈現 昆蟲氣味受體複合物較佳地安置於如上文所描述之膜模擬物中。
在另一實施例中，人造膜之第一側接觸包含第一介質之第一體積。
在另一實施例中，人造膜之第二側接觸包含第二介質之第二體積。第二介質可與第一介質相同或不同。
較佳地，第一介質及/或第二介質為流體介質，較佳地為液體介質。
第一介質及/或第二介質可為親水性介質，較佳地為水性介質。
或者，第一介質及/或第二介質可為疏水性介質。在此替代性組態中，膜雙層之兩親性分子之疏水性基團與介質接觸。
在另一實施例中，第一介質及/或第二介質包含溶液中之離子，較佳地為水溶液中之離子；較佳地為金屬離子；較佳地為第一族或第二族金屬離子。質子(H+ )及K+ 、Na+ 、Ca2+ 離子為較佳的。若二者皆存在，第一介質及第二介質中之離子可相同或不同。
在另一實施例中，第一體積及/或第二體積包含聚合物網路，該聚合物網路可或可不與雙層直接接觸。較佳地，聚合物網路包含水凝膠或由水凝膠組成。
在另一實施例中，第一體積包含直徑至少100 nm、較佳地直徑至少200 nm之第一介質之小液滴，及/或第二體積包含直徑至少100 nm、較佳地直徑至少200 nm之第二介質之小液滴。
在另一實施例中，第一體積及/或第二體積包含分別包圍第一介質或第二介質之兩親性分子層。第一介質及/或第二介質不必經全部包圍。
在另一實施例中，兩親性分子層可覆蓋第一及/或第二體積之全部或部分。兩親性分子層通常為單層。
在較佳實施例中，人造雙層可因此為分別包圍第一及第二體積之兩親性分子層接觸時所形成的小液滴介面雙層。在其他實施例中，其可為平面雙層。
較佳地，膜包含兩親性分子，諸如脂質分子。較佳地，兩親性分子包含磷脂分子。較佳之脂質分子包括DPhPC (1,2-二苯甲醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、POPS (1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-二氧磷基-L-絲胺酸)、POPC (1-軟脂醯基-2-油醯基-甘油-3-磷酸膽鹼)、POPE (1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、膽固醇、聚乙二醇(PEG)脂質、POPG (1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-二氧磷基-(1'-rac-甘油))及其鹽。
在另一實施例中，膜及(當存在時)第一體積及(當存在時)第二體積安置於疏水性介質中，較佳地其中疏水性介質包含油。
在另一實施例中，OrX及Orco為親離子型膜蛋白。OrX及Orco蛋白一起形成複合物。在一些實施例中，複合物在分析物之存在下形成。
用雙層感測器偵測分析物 在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物形成對分析物之存在或其他方面敏感之離子通道。
較佳地，偵測對於分析物為特異性的。
在另一實施例中，分析物之結合激活昆蟲氣味受體複合物，致使離子流通過膜。
較佳地，第一電極與膜之第一側電接觸且第二電極與膜之第二側電接觸。
在另一實施例中，感測器包含經組態以量測電特徵(例如在第一與第二電極之間的電流之流動)之控制系統。
在另一實施例中，感測器進一步包含輸出系統，其中指示系統經組態以指示已經偵測之分析物。分析物之偵測可藉由此項技術中已知之任何系統來指示，諸如警報、電信號、圖形使用者介面等等。指示系統亦可指示分析物之存在或不存在、分析物之濃度等。
感測方法 在另一實施例中，提供一種使用如本文所揭示之感測器偵測分析物之方法，其中感測器包含： a) 膜，其包含兩親性分子、Orx蛋白及Orco蛋白； b)         第一基板，其包含安置於膜之第一側之第一電極；及 c) 第二基板，其包含安置於膜之第二側之第二電極； 其中該方法包含： a) 使分析物與膜接觸；及 b)         獲得通過第一及第二電極之電量測值。
分析物與昆蟲氣味受體複合物之接觸致使離子流通過藉由昆蟲氣味受體複合物形成之離子通道。在不受理論束縛之情況下，認為當分析物與OrX相互作用時，此通道對離子之滲透性改變。在第一與第二電極之間的離子流通過離子通道允許電流在電極之間流動。
較佳地，方法包含偵測在第一與第二電極之間流動之電流。電流水準指示離子通道之狀態且可指示結合或結合之分析物之種類。較佳地，電流之變化指示分析物之結合。
電流之變化可經量測為隨時間之變化。此類量測可涉及一系列離散量測或連續量測。進行複數個量測或連續量測能夠偵測更複雜之信號，該信號可經分解以指示例如是否存在多個分析物。
在其他實施例中，方法包含視情況選用之其他步驟，包括i）判定是否存在分析物、ii）判定存在哪種分析物及/或iii)判定分析物之濃度。
在另一實施例中，方法在第一與第二電極之間施加電位。在一些實施例中，電位可為零。
在另一實施例中，方法包含偵測經由藉由Orco及OrX蛋白形成之複合物的通過膜之離子流。
在另一實施例中，方法包含使分析物與膜接觸，包含形成包含Orco蛋白、Orx蛋白及分析物之複合物。
在另一實施例中，方法包含偵測分析物與Orco及Orx蛋白質之間的相互作用。
在另一實施例中，膜之第一側接觸包含第一介質之第一體積且方法包含將分析物引入至第一體積。
在另一實施例中，感測器為如本文所定義之感測器，且其中方法包含獲得通過各第一電極及第二電極之複合電量測值，較佳地偵測在第二電極與各第一電極之間流動之複合電流。
表面電漿子共振(SPR)感測器裝置 使用表面電漿子共振（SPR）來偵測小的可溶分析物為熟知的(參見例如「Advances in Biosensors - 第5卷. 2003年」Ed. Bansi D. Malhotra & Anthony P. F. Turner, Pub. Jai Press Ltd, London)。
表面電漿子(SP)係指相干之電子振盪，其與電磁波(例如，光)一起沿在介電質(例如矽石玻璃)與金屬(例如塗銀或金)之間的介面傳播。在某些條件下(由波長、偏振及/或入射角定義)，在金屬表面之自由電子吸收入射光光子且將其轉換成表面電漿子波。當可見光子之頻率與抵抗金屬之正核之復原力振盪的表面電子之天然頻率匹配時，可建立一種稱作表面電漿子共振(SPR)之共振條件。
藉由量測光之最小反射角(或最大吸收)，表面電漿子共振條件可用於偵測分析物與偶合至金屬表面之昆蟲氣味受體複合物之結合。舉例而言，分析物與昆蟲氣味受體複合物之結合可導致在金屬表面處之擾動，其反過來可誘導SPR條件之改變。此類改變可作為基板之反射率之變化來量測，且形成一些基於SPR之量測技術之基礎，該量測技術適用於量測廣泛多種目標分子之存在。在感測器裝置之一個實施例中，基板為玻璃稜鏡上之惰性金屬表面。較佳地，金屬表面為銀或金之金屬層。更佳地，金屬層具有近似50 nm之厚度。
電特徵 在一個實施例中，電特徵為表面電漿子共振。
SPR 感測器裝置中之昆蟲氣味受體複合物之呈現 昆蟲氣味受體複合物可存在於如上文所描述之膜模擬物中。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質體(例如人造脂質體或奈米盤)中。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質雙層(例如人造脂質雙層)中。
在一較佳實施例中，昆蟲氣味受體複合物存在於脂質體中。
昆蟲氣味受體複合物與 SPR 感測器裝置中之金屬層之偶合 在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物偶合至金屬表面。
在另一實施例中，昆蟲氣味受體複合物經由N端半胱胺酸殘基直接偶合至金屬表面。
用 SPR 感測器偵測分析物 在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲氣味受體複合物中之昆蟲OrX之結合。
在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。
較佳地，偵測對於分析物為特異性的。
在另一實施例中，SPR感測器包含： (a)金屬表面，其與能夠結合分析物之昆蟲氣味受體複合物結合， (b)光源激發光束，其用於在金屬表面定向， (c)至少一個偵測器，其能夠偵測自金屬表面內部反射之光束之光。
在另一實施例中，SPR感測器視情況包括光束修正構件，由此以受控制之方式影響激發光束，由此自感測器表面發射之光水準實質上增強。
光束修正構件可操作以使激發光束相對於金屬表面在角程內移動。激發移位構件可包含光束反射鏡及用於振動反射鏡之構件。激發光束可包含線性光束、扇型光束或楔形光束。
替代地，光束修正構件可操作以便調節激發光束之波長。
在另一實施例中，分析物與昆蟲OrX之結合導致感測器之折射率之變化。較佳地，此變化藉由量測表面電漿子共振角或共振波長之變化來偵測。
偵測器組件 在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。
在另一實施例中，偵測器組件偵測或量測激發光束(在固定共振角處)之共振波長之時變或在固定波長下之共振角之時移。
偵測之靈敏度 如上文所論述，本發明之感測器出人意料地工作良好。申請人已展示，本發明之感測器裝置比涉及使用昆蟲氣味受體之任何已知分析之靈敏度高得多。
在一個實施例中，感測器可偵測濃度小於1 × 10-3 M、較佳地小於1 × 10-3 M、更佳地小於1 × 10-4 M、更佳地小於1 × 10-5 M、更佳地小於1 × 10-6 M、更佳地小於1 × 10-7 M、更佳地小於1 × 10-8 M、更佳地小於1 × 10-9 M、更佳地小於1 × 10-10 M、更佳地小於1 × 10-11 M、更佳地小於1 × 10-12 M、更佳地小於1 × 10-13 M、更佳地小於1 × 10-14 M、更佳地小於1 × 10-15 M、更佳地小於1 × 10-16 M、更佳地小於1 × 10-17 M、更佳地小於1 × 10-18 M之分析物之存在。
動態範圍 在一個實施例中，為偵測分析物，感測器具有至少2個、較佳至少3個、更佳至少4個、更佳至少5個、更佳至少6個、更佳至少7個、更佳至少8個、更佳至少9個、更佳至少10個數量級之分析物濃度之動態範圍。
本發明之感測器之其他優勢 在便利性、便攜性、穩定性、快速偵測、靈敏度及量測容易性方面，感測器或本發明提供優於先前已知之基於昆蟲OR之系統/分析之諸多電位優勢。
分析物介質 分析物可在氣態或液體介質中。
視情況選用之捕獲組件 感測器裝置可另外包含捕獲分析物且向受體呈現分析物之組件。在一些實施例中，此組件可適用於捕獲揮發性分析物用於向OrX呈現。此可涉及使用微通道以處理呈液相或氣相(29 )之目標VOC。微流體系統已經設計以向感測器表面遞送呈液相(30-31 )及氣相(31-33 )之目標分子。
多工 本發明涵蓋在昆蟲氣味受體複合物中使用多個不同OrX蛋白之多工方法。以此方式，使用者可構建對多種分析物靈敏之多工裝置。此類多工裝置可包括幾十、數百或甚至數千之如本文所描述之感測器。多工裝置亦可包括兩個或多於兩個感測器，該等感測器偶合至相同之昆蟲氣味受體複合物以便將「雙重檢查」引入至裝置中。
本發明亦涵蓋使用具有多個感測器基板之晶片，各基板在昆蟲氣味受體複合物中包含不同或相同之受體。本發明之感測器裝置組件可為此種晶片。
使用本發明之感測器裝置之方法 本發明提供使用本發明之感測器裝置以偵測分析物及/或偵測環境中分析物之存在的方法，如上文所描述。
對照及校準 使用者可比較裝置之電特徵與當裝置暴露於對照、已知分析物或兩者時所量測之對應電特徵。使用者亦可生成樣品中之一或多種分析物之存在的估計值。此可藉由比較樣品中所觀測之電特徵與該電特徵之校準曲線來實現，該校準曲線對應於自具有已知量之相關分析物之對照或標準品收集之資料點。以此方式，使用者可估計存在於已接觸裝置之樣品中之分析物的濃度。
使用者可構建裝置之一或多種電特徵之庫，該一或多種電特徵對應於暴露於一或多種已知分析物之裝置。舉例而言，使用者可構建表示當裝置暴露於各種濃度之分析物時所觀測之電特徵的結果庫。
製造本發明之感測器裝置之方法 感測器裝置
在另一態樣中，本發明提供一種製造感測器裝置之方法，該方法包括在昆蟲氣味受體複合物與感測器裝置之基板之間建立電連通的步驟，其中感測器裝置經組態以偵測基板之電特徵之變化。
在一個實施例中，方法包括使昆蟲氣味受體複合物與基板偶合之步驟。
在一個實施例中，昆蟲氣味受體複合物經偶合至基板，之後將昆蟲氣味受體複合物偶合之基板經組裝於感測器裝置中。
較佳地，感測器之組件、偶合及功能性為如本文所描述。
感測器組件 在另一態樣中，本發明提供一種用於生產感測器裝置之組件之方法，該組件包含與如本文所定義之基板電連通之昆蟲氣味受體複合物。如本文所描述，該方法包含在昆蟲氣味受體複合物與基板之間建立電連通。此組件適用於添加至根據本發明之感測器裝置中。
在另一實施例中，本發明提供一種用於產生感測器裝置之方法，該方法包含將組件添加至其他組件中，如本文所描述，以產生根據本發明之感測器裝置。
製造本發明之 EIS 感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為如本文所描述之電化電池之工作電極。
因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲氣味受體複合物與電化電池之工作電極之間建立電連通的步驟，其中電化電池經組態以偵測工作電極之電化學阻抗之變化，由此形成感測器裝置。
藉助於實例，用於製造本發明之EIS裝置之適合方法描述於實例部分中。此實例不意欲限制本發明之範疇。
製造本發明之 CNT-FET 感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為如本文所描述之CNT-FET設備之通道。
因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲氣味受體複合物與CNT-FET設備之通道之間建立電連通的步驟，其中CNT-FET設備之通道經組態以偵測CNT-FET設備之源極增益電流之變化，由此形成感測器裝置。
藉助於實例，用於製造本發明之CNT-FET裝置之適合方法描述於實例部分中。此實例不意欲限制本發明之範疇。
製造本發明之石墨烯 FET(GFET) 感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為如本文所描述之GFET設備之通道。
因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲氣味受體複合物與GFET設備之通道之間建立電連通的步驟，其中GFET設備之通道經組態以偵測GFET設備之源極增益電流之變化，由此形成感測器裝置。
藉助於實例，用於製造本發明之GFET裝置之適合方法描述於實例部分中。此實例不意欲限制本發明之範疇。
製造本發明之 QCM 感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為如本文所描述之石英晶體微天平(QCM)之共振器組件。
因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲氣味受體複合物與石英晶體微天平(QCM)之共振器組件之間建立電連通的步驟，其中QCM經組態以偵測藉由施加至共振器組件之交流電場誘導之振盪的共振頻率之變化，由此形成感測器裝置。
藉助於實例，用於製造本發明之QCM裝置之適合方法描述於實例部分中。此實例不意欲限制本發明之範疇。
製造本發明之雙層感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為如本文所描述之電化電池之工作電極。
因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲氣味受體複合物與電化電池之工作電極之間建立電連通的步驟，其中電化電池經組態以偵測工作電極與第二電極之間的電特徵變化，由此形成感測器裝置。
借助於實例，用於製造本發明之雙層裝置之適合方法描述於實例部分中。此實例不意欲限制本發明之範疇。
製造本發明之 SPR 感測器裝置之方法 在一個實施例中，基板為如本文所描述之稜鏡上之惰性金屬表面。
因此，在一個實施例中，方法包含將昆蟲氣味受體複合物偶合至金屬表面之步驟，其中該裝置經組態以偵測基板之折射率之變化，由此形成感測器裝置。
借助於實例，用於製造本發明之SPR裝置之適合方法描述於實例部分中。此實例不意欲限制本發明之範疇。
通用定義及方法 OrX 及 Orco 蛋白 / 多肽及片段 如本文所使用，術語「多肽」涵蓋具任何長度但較佳至少5個胺基酸之胺基酸鏈，包括全長蛋白質，其中胺基酸殘基藉由共價肽鍵而鍵聯。用於本發明之多肽較佳使用重組或合成技術部分地或整體地產生。
多肽之「片段」係較佳執行多肽之功能及/或提供多肽之三維結構的多肽子序列。
如本文所使用之OrX多肽之「功能片段」為OrX之子序列，其可執行結合分析物之功能，且該子序列在結合時可導致其形成昆蟲氣味受體複合物部分之構形變化，其中構形變化導致功能片段所結合之基板之電學特性之變化。在一個實施例中，構形變化為昆蟲氣味受體複合物中之離子通道之開口。
如本文所使用之Orco多肽之「功能片段」為Orco之子序列，其可執行昆蟲氣味劑輔受體之功能，且在分析物結合至昆蟲氣味受體複合物中之OrX時發生構形變化，其中構形變化導致功能片段所結合之基板之電學特性之變化。在一個實施例中，構形變化為昆蟲氣味受體複合物中之離子通道之開口。
術語「重組」係指在其天然背景中自其周圍序列移出及/或與不存在於其天然背景中之序列重組的聚核苷酸序列。
「重組」多肽序列藉由自「重組」聚核苷酸序列轉譯而產生。
變異體 OrX或Orco多肽之變異體係指不同於特異性識別序列之多肽序列，其中一或多個胺基酸殘基經刪除、取代或添加。變異體可為天然存在之對偶基因變異體或非天然存在之變異體。變異體可來自相同或其他物種，且可涵蓋同源物、旁系同源物及直系同源物。在某些實施例中，經鑑別之多肽之變異體擁有與本發明多肽或多肽之生物活性相同或類似的生物活性。
較佳地，OrX多肽變異體可執行結合分析物之功能，且該變異體在結合時可導致其形成昆蟲氣味受體複合物部分之構形變化，其中構形變化導致功能片段所結合之基板之電學特性之變化。在一個實施例中，構形變化為昆蟲氣味受體複合物中之離子通道之開口。
較佳地，OrX多肽變異體可執行昆蟲氣味劑輔受體之功能，且在分析物結合至昆蟲氣味受體複合物中之OrX時發生構形變化，其中構形變化導致功能片段所結合之基板之電學特性之變化。在一個實施例中，構形變化為昆蟲氣味受體複合物中之離子通道之開口。
變異體多肽序列較佳地展現與本發明之序列至少70%、更佳至少80%、更佳至少90%、更佳至少95%、更佳至少96%、更佳至少97%、更佳至少98%且最佳至少99%之一致性。較佳地在經鑑別之多肽之全部長度內計算一致性。
可按以下方式判定多肽序列一致性。使用bl2seq中之BLASTP (來自BLAST程式組，版本2.2.5 [Nov 2002])將本發明多肽序列與候選多肽序列相比較，該BLASTP可公開購自ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/處之全球資訊網(World Wide Web)上之NCBI網站。
亦可使用全域序列比對程式在候選聚核苷酸序列與本發明聚核苷酸序列之間的重疊之全部長度內計算多肽序列一致性。如上文所論述，EMBOSS-needle (可在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/獲得)及GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235)亦為用於計算多肽序列一致性之適合的全域序列比對程式。
一種計算多肽序列一致性%之較佳方法係基於使用Clustal X比較比對序列(Jeanmougin等人, 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-405)。
在不顯著改變所描述之多肽序列之生物活性的情況下，所描述之多肽序列之一個或若干個胺基酸之保守取代亦包括於本發明中。熟習此項技術者將知曉用於產生表型沉默胺基酸取代之方法(參見例如Bowie等人, 1990, Science 247, 1306)。
用於產生多肽之方法 用於本發明之多肽，包括變異體多肽，可使用此項技術中熟知的肽合成方法來製備，諸如使用固相技術之直接肽合成(例如Stewart等人, 1969, in Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California)，或自動化合成，例如使用Applied Biosystems 431A肽合成器(Foster City, California)。亦可在此類合成期間產生多肽之突變形式。
較佳地，多肽及變異多肽在適合之宿主細胞中重組表現，且自細胞分離，如下文所論述。用於表現多肽之聚核苷酸宜可藉由熟習此項技術者所熟知之方法合成。聚核苷酸序列可為天然存在的，或可自天然存在之序列調整，例如經由使用針對重組表現該序列之細胞使用的較佳密碼子。
用於產生構築體及載體之方法 用於本發明之基因構築體包含一或多個編碼用於本發明之OrX或Orco多肽的聚核苷酸序列，且可用於轉化例如細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物有機體。
用於生產及使用基因構築體及載體之方法在此項技術中已熟知，且通常描述於Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 Cold Spring Harbor Press, 1987；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987。
用於生產包含聚核苷酸、構築體或載體之宿主細胞之方法 包含聚核苷酸之宿主細胞適用於此項技術中熟知之方法(例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 Cold Spring Harbor Press, 1987；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987)，以重組生產用於本發明之多肽。此等方法可涉及宿主細胞在適當培養基中在適於或有助於表現本發明多肽的條件下培養。表現之重組多肽可視情況分泌於培養物中，接著可藉由此項技術中熟知之方法(例如Deutscher編, 1990, Methods in Enzymology, 第182卷, Guide to Protein Purification)自介質、宿主細胞或培養基分離。
如在此說明書中所使用，術語「包含」意謂「至少部分由...組成」。當解釋此說明書中包括術語「包含」之各語句時，亦可呈現以此術語開端之彼或彼等特徵以外的特徵。諸如「包含(comprise/comprises)」之相關術語將以相同方式解釋。
預期關於本文所揭示數目之範圍(例如1至10)亦併入關於該範圍內之所有合理數目(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9及10）以及該範圍內之任何合理數目範圍(例如2至8、1.5至5.5，及3.1至4.7)，且因此，特此明確地揭示本文中明確揭示的所有範圍之所有子範圍。此等僅為特定預期之實例，且所列舉之最低值與最高值之間數值之所有可能組合視為以類似方式明確地規定於本申請案中。
應理解，替代實施例或組態可包含本說明書中所說明、描述或提及之部件、元件或特徵中之兩者或多於兩者的任何或所有組合。
本發明亦可廣泛地說在於本申請案之說明書中個別地或共同地提及或指示之部件、元件及特徵，及任何兩個或多於兩個該等部件、元件或特徵之任何或所有組合。
對於本發明相關之熟習此項技術者，在不背離如所附申請專利範圍所定義的本發明之範疇的情況下，本身將提出本發明之構築及廣泛不同實施例及應用之許多變化。本文中之揭示內容及描述純粹為說明性且不意欲為任何限制性意義。其中本文中提及在本發明相關之此項技術中具有已知等效物之特定整數，此類已知等效物經視為併入本文中如同個別地闡述一般。
實例 1 - 具有電阻抗頻譜 (EIS) 之 本發明之感測器的例證 藉由本發明人產生之先前未公開之資料(產生在PCT/IB2017/058181中描述之本發明)已出人意料地展示OrX可單獨用於電子感測器裝置中，該電子感測器裝置能夠偵測分析物之特異性結合，相對於先前技術之基於昆蟲OR之感測器系統具有顯著改良。
本申請案之資料展示包含除OrX之外的Orco出人意料地提供相比於先前技術之基於昆蟲OR之感測器系統及藉由形成PCT/IB2017/058181之本發明的申請人先前產生之基於OrX(單獨)之電子感測器裝置二者的進一步顯著改良。
概述 申請人展現使用昆蟲OrX序列之方便、靈敏的感測器裝置。兩種OrX受體(Or10a、Or22a)19 各自獨立地或與Orco嵌入於脂質體28 中，且在金電極上功能化以用於在進一步優化之實驗條件下進行EIS量測。以fM濃度開始，OrX功能化之金電極中之每一者已展示對其目標配位體(Or10a對水楊酸甲酯，Or22a對己酸甲酯)20 之清晰的電子回應。脂質體中Orco之存在對OrX反應具有相加或放大效應，從而增加OrX對於其目標配位體之最大反應水準且增加靈敏度。藉由測試各OrX脂質體及OrX/Orco脂質體功能化之電極對非回應配位體之反應來驗證結合之特異性。為進一步確保特異性，亦測試空脂質體功能化之金電極對目標配位體之反應。
1.0 實驗方法 1.1 材料 6-巰基己酸(MHA)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺) (EDC)、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)錠劑、水楊酸甲酯及己酸甲酯係獲自Sigma-Aldrich。1.6 mm直徑金(Au)圓盤電極、捲曲鉑(Pt)線電極及不漏銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極係購自BASi以用於電化學量測。
1.2 純化之 OrX 及 Orco 子單元 之製備 純化程序為詳述於Carraher等人201328 中之一者之變化形式。為his標記親和力純化來自桿狀病毒(baculovirus)感染之Sf9細胞之蛋白質，用桿狀病毒以0.1之MOI感染2 × 106 mL-1 之500 mL細胞且在27℃下培育72 h。藉由在室溫下以3800 g離心10 min來收集細胞集結粒，且接著再懸浮於40 mL具有25 U/mL核酸酶(Benzonase)之再懸浮緩衝液A (20 mM Tris/HCl pH 7.5，100 mM NaCl，1×蛋白酶抑制劑混合液(Roche Diagnostics GmbH, Germany))中，接著藉由在10,000-15,000 psi下兩次通過Emulsiflex C5乳化器（Avestin, Germany)而裂解。接著以1000 g將樣品離心5 min以移除整個細胞及核。移出上清液且在4℃下以100,000 g旋轉1 h。用1% w/v清潔劑(Fos-膽鹼14(FC14))將膜集結粒再懸浮於40 mL之緩衝液A中，且在室溫下以10 rpm旋轉1 h。接著在18℃下以100,000 g離心樣品1 h。將上清液移除且裝載至1 mL NiNTA管柱(GE Healthcare)上。在具有300 mM NaCl及20 mM咪唑之十個管柱體積之緩衝液B (20 mM Tris/HCl pH 7.5，3.6 mM FC-14)中洗滌管柱，且再用具有100 mM NaCl及50 mM咪唑之十個管柱體積之緩衝液B洗滌。用具有100 mM NaCl及500 mM咪唑之四個管柱體積之緩衝液B溶離蛋白質。在考馬斯(Coomassie)染色之SDS-PAGE凝膠及西方墨點法上評估純度。
用最終尺寸排阻層析法(SEC)步驟完成純化。將來自NiNTA純化之溶離份彙集且以20,000 g離心5 min以移除聚集體及污染物。接著將5 mL樣品注射於附接至Akta-Pure層析系統(GE Healthcare)之Superdex 200 16/60管柱(GE Healthcare)上。在具有100 mM NaCl之緩衝液B中以1 mL/min運行樣品，且使用100 kDa MWCO Vivaspin2過濾器單元(Sartorius, Goettingen Germany)收集且濃縮2 mL溶離份且儲存於-80℃下。
1.3 脂質體相關 OR 子 單元之製備 使用磷脂溶液製備脂質體，該磷脂溶液藉由以下方式產生：在小玻璃試管中在N2 氣體流下蒸發含有以下之溶液：莫耳比為5:3:3:1之磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷脂醯膽鹼(PC)及膽固醇(CH)，接著在真空下乾燥1 h。
藉由渦旋5分鐘，隨後在Microson超音波細胞破碎儀(Medisonic, USA)上以20%功率音波處理五次，持續10至20 s，在各音波處理步驟之間將樣品置放於冰上1 min，來將此等脂質再懸浮於1 mL再水合緩衝液(10 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl)中。為促進形成脂質體，藉由將來自液氮之試管轉移至40℃水浴進行10次冷凍/融化步驟。
接著藉由使用Avestin LiposoFAST擠出機單元(Avestin, Germany)使脂質溶液11次地穿過100 nm聚碳酸酯膜，來對脂質體進行尺寸化。以最終體積之10%添加甘油且將10 mg/mL之等分試樣快速冷凍於液氮中且儲存於-80℃下。
純化之OrX及Orco子單元19 以與Geertsma等人(2008)34 之方案類似的方式復原於合成脂質體中。
在其使用之前，將脂質體在冰上解凍且接著藉由在室溫下用0.2% CHAPS培育15 min而去穩定。接著將200 µg純化之氣味受體28 添加至1 mg脂質體中，且在室溫下以10 rpm旋轉1 h。藉由四次添加25 mg Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad, USA)且在4℃下分別培育30 min、2 h、隔夜及再次2 h，來移除過量清潔劑。在各培育期後移除生物珠粒。藉由以100,000 g離心1 h來粒化OrX或OrX/Orco整合脂質體，且將其再懸浮於500 µL之再水合緩衝液中。藉由密度梯度超速離心(DGU)使用Accudenz (Accurate Chemical & Scientific Corporation, USA)來評估OrX及Orco於脂質體中之整合。藉由添加相等體積之80% Accudenz溶液，將整合之脂質體引入至40% Accudenz中，置於超離心管之底部處，且用30% Accudenz溶液及DGU緩衝液(25 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 10%甘油)覆蓋。接著樣品在4℃下以100,000g離心4 h。在Accudenz DGU後，由於脂質體之密度低，因此脂質體將漂浮至梯度之頂部。
1.4 電極製備 針對各電極，用拋光氧化鋁漿料在氧化鋁拋光墊上拋光金圓盤電極(1.6 mm直徑)一分鐘。將經拋光之電極用去離子水(Milli-Q，18.2 MΩ cm)沖洗，隨後在乙醇(LR級)及去離子水中進行超音波處理直至自電極完全移除殘餘氧化鋁漿料。將-1.4 V下之記時安培分析法應用於所有經超音波處理之電極上，以使用0.1 M氫氧化鈉(NaOH)電解質溶液，在三端電化電池(Ag/AgCl (3 M NaCl，0.209 V對比SHE)參考電極、作為相對電極之捲曲鉑絲及作為工作電極之金圓盤)中，使用PalmSens3恆電位器，使存在於電極表面上之硫醇之SAM解吸附30秒。接著，再次用去離子水沖洗電極且在乙醇及去離子水中連續進行超音波處理。最後，在-0.2與1.6 V之間、在50 mV/s之掃描速率下在0.5 M硫酸(H2 SO4 )溶液中進行循環伏安法，持續10次循環，以移除任何其他雜質(三電極電池，Ag/AgCl (於3 M NaCl中，0.209 V對比SHE)參考電極、作為相對電極之捲曲鉑絲及作為工作電極之金圓盤)。
1.5 自組裝單層 (SAM) 製備及活化 藉由將1.36 µl MHA溶解於5 ml乙醇(AR級)中來製備2 mM MHA。將清洗之電極浸入於MHA溶液中且培育隔夜。次日，用乙醇及去離子水徹底地洗滌所有電極以便移除未反應酸。在2 ml PBS (pH=6.5)溶液中製備2:1 mol:mol比之EDC:NHS(100 mM EDC，50 mM NHS)。接著，在28℃下將電極覆蓋在100 μl之此溶液中一小時以活化MHA之羧酸(COOH)基團。
1.6 OrX 及 OrX/Orco 相關之脂質體固定於電極上 藉由將一種PBS錠劑浸入200 ml milli-Q水中(根據製造商說明書)且使用0.2 μm針筒過濾器過濾來製備PBS溶液。用pH計量測所製備之緩衝溶液之pH。OrX脂質體或OrX/Orco脂質體在PBS緩衝溶液(pH=7.4)中稀釋100倍，且COOH活化之電極在室溫下在緩衝溶液中培育一個小時。接著，用PBS緩衝溶液充分地洗滌電極以洗出任何未結合之脂質體。
1.7 目標氣味劑溶液製備及培育 PBS (pH=7.4)用作電解質以進行電化學量測。在電化學量測之前使PBS緩衝液脫氣約30分鐘。藉由在含有1% DMSO之PBS溶液中依次稀釋來製備濃度範圍自1 aM至1 µM之氣味劑溶液。在相關氣味劑溶液中將OR固定化之電極各自培育約30分鐘，且在EIS量測之前用PBS溫和地洗滌。
1.8 電化學阻抗頻譜 (EIS) 量測 EIS量測係在含有Ag/AgCl (3 M NaCl，0.209 V對比SHE)參考電極、作為相對電極之捲曲鉑絲及作為工作電極之金圓盤之3電極電池中，在-0.7之固定電壓下使用PalmSens恆電位器進行。脫氣之PBS用作電解質。
2.0 結果 昆蟲嗅覺受體由複合物中之OrX子單元與細胞膜中之Orco子單元構成以產生離子通道(圖1)17 。在此研究中，作者研究Orco對嵌設於脂質體中之OrX之配位體結合活性的效應。圖2中顯示藉由EIS監測之由以下組成的實驗程序：6-巰基己酸(MHA)之自組裝單層(SAM)之沈積、用N-羥基丁二醯亞胺/1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺)(NHS/EDC)偶合活化-COOH端基、OR/脂質體之共價連接及目標氣味劑分子之結合。如方案中展示，清潔之金表面與MHA培育隔夜以構建具有羧酸端基之SAM。藉由將金表面暴露於EDC/NHS溶液來進一步活化SAM之-COOH端基以形成N-羥基丁二醯亞胺酯，接著該酯可與生物分子連接。最後，電極與OrX/脂質體溶液一起培育，進而使囊泡共價附接至金表面。
作者使用原子力顯微鏡(AFM)來驗證脂質體可固定於金表面上。圖3展示可在裸露金表面至OR相關脂質體固定化表面之表面形態及粗糙度輪廓中看出變化。裸露金表面(圖3(a))展示表面粗糙度值為大約2 nm之各種尺寸之密集填充的平坦金奈米晶體。在SAM改質(圖3(b))及SAM改質金表面之NHS/EDC活化(圖3(c))之後，觀測到表面形態之可忽略的變化。當將OrX脂質體引入EDC/NHS活化之SAM改質金表面時(圖3(d))，表面形態變化明顯，進而展示固定在表面上之圓形脂質體。尺寸可變之圓形脂質體均以其天然形式見於表面上方，亦即觀測到無破裂或雙層形成，其亦指示OR較好地保留在脂質體膜中。表面粗糙度值之較大增加(＞ 30 nm)亦證實含有脂質體之OR成功地附接至NHS/EDC活化之SAM改質金表面。
在遞增濃度(1 aM至100 μM)下培育目標配位體或對照配位體之前及之後，對經OrX脂質體(Or10a或Or22a)、OrX/Orco脂質體或空脂質體功能化之金電極進行EIS量測。劑量反應曲線藉由將感測器回應定義為-(ΔR p /R o p )對比log[C (配位體)]來獲得。圖4A展示Or10a脂質體功能化之感測器在暴露於在各種濃度下含有Or10a、水楊酸甲酯之已知目標配位體中之一者的溶液時，就奈奎斯特(Nyquist)曲線圖而言之EIS回應。奈奎斯特曲線圖展示在添加遞增濃度之水楊酸甲酯之後，EIS回應降低。劑量反應曲線(圖4B)藉由繪製偏振電阻-(ΔR p /R o p )相對於log[conc(配位體)]之變化作為感測器回應而獲得。此處，R p 為在Or10a脂質體-目標相互作用之後的偏振電阻，且R o p 為在Or10a脂質體-目標相互作用之前的偏振電阻。Or10a脂質體感測器對水楊酸甲酯之回應具有0.1 pM之偵測極限(LOD)，對對照配位體己酸甲酯對照之回應可忽略。經空脂質體功能化之感測器對陽性及陰性配位體展示可忽略之回應，其表明OR為偵測氣味劑之關鍵元素。
圖5A展示Or10a/Orco脂質體功能化之感測器在暴露於各種濃度之其目標配位體(水楊酸甲酯)時的EIS回應。圖5B比較針對Or10a/Orco脂質體之水楊酸甲酯劑量反應曲線與針對Or10脂質體、Orco脂質體及空脂質體所獲得之彼等水楊酸甲酯劑量反應曲線。Or10a/Orco脂質體展示比Or10a脂質體更大之最大回應，且亦表現出更大之靈敏度，如劑量反應曲線向左移動及1 fM之偵測下限所反映。Orco脂質體及空脂質體二者展示對水楊酸甲酯之回應可忽略。
作者研究Orco對另一實例受體Or22a之效應。圖6A展示Or22a脂質體功能化之感測器在暴露於各種濃度下之其目標配位體中之一者(己酸甲酯)時的EIS回應。此外，奈奎斯特曲線圖展示在添加遞增濃度之己酸甲酯之後，EIS回應降低。劑量反應曲線(圖6B)展示Or22a脂質體感測器對己酸甲酯之回應具有1 fM之偵測極限(LOD)，且對對照配位體水楊酸甲酯之回應可忽略。經空脂質體功能化之感測器展示對陽性及陰性配位體之可忽略回應，其表明OR為偵測氣味劑之關鍵元素。
圖7A展示Or22a/Orco脂質體功能化之感測器在暴露於各種濃度下之其目標配位體(己酸甲酯)時的EIS回應。圖7B比較針對Or22a/Orco脂質體之己酸甲酯劑量反應曲線與針對Or22a脂質體、Orco脂質體及空脂質體所獲得之彼等己酸甲酯劑量反應曲線。如所預期，Or22a/Orco脂質體展示比Or22a脂質體更大之最大回應，且亦表現出更大之靈敏度，如再次藉由劑量反應曲線向左移動及0.1 fM之偵測下限來反映。Orco脂質體及空脂質體二者展示對己酸甲酯之回應可忽略。
3.0 論述 在將6-巰基己酸(MHA)鑑別為具有理想長度以將脂質體結合於金電極表面上之鍵聯劑之前，申請人最初測試了不同的自組裝單層(SAM層)。先前，16-巰基十六烷酸(16-MHDA)用以使金表面功能化且將脂質體結合於金電極上。來自該實驗之結果不顯示高靈敏度，其表明脂質體離電極表面太遠而不能得到可偵測信號。為克服該障礙，申請人使用較短之6-巰基己酸代替。申請人假定，更短之此鍵聯劑將使金與脂質體之間的電子轉移更快，因此，可以更靈敏的方式監測表面上發生之任何事件。在將哺乳動物氣味受體固定於粗細胞膜中之兩個論文的情況下，其使用16-巰基十六烷酸(16-MHDA)35 或6-巰基十六烷酸(6-MHDA)36 用於SAM形成。
比較資料顯示，此處所揭示之昆蟲OrX-Orco-EIS生物感測器型式比OrX-EIS生物感測器及已與昆蟲氣味受體一起使用之其他感測器型式更靈敏。表1概述關於基於氣味受體之裝置之公開資料。與基於細胞之感測器相比，本發明裝置提供在100-100,000倍之間的更大靈敏度。 表1：對昆蟲氣味受體感測器裝置資料之比較。 * 指示值已根據繪製於所引用參考文獻中之曲線圖上之劑量反應資料的視覺評估來估計。
表2概述獲自細胞分析之資料。與在HEK293細胞及非洲爪蟾卵母細胞中表現之OrX/Orco相比，本發明昆蟲OrX-EIS感測器及OrX/Orco-EIS資料更靈敏。注意在此等系統中，一些費洛蒙受體(PR)展現比普通氣味受體低得多的靈敏度，此為預期的，因為此等受體經細調成其費洛蒙目標分子。 表2：對昆蟲ORX/Orco細胞分析資料之綜述。 * 指示值已根據繪製於曲線圖上之劑量反應資料之視覺評估來估計。
4.0 結論 此研究已證實OrX在基於電子裝置平台之嗅覺生物感測器中Orco之存在下的識別能力之提高。在與OrX脂質體比較時，與Orco子單元嵌入於在金電極上經功能化之脂質體中的OrX展示提高之靈敏度(低於fM)及最大回應。與來自空脂質體功能化之電極之結果相比較，未觀測到對目標配位體之清晰的阻抗回應。各OrX之特異性結合亦已藉由測試對來自OrX脂質體功能化之電極之對照配位體的回應得到驗證。
實例 2- 具有電阻抗頻譜 (EIS) 之 本發明之感測器的進一步例證 概述 申請人進一步展現使用額外之昆蟲OrX序列之方便、靈敏之感測器裝置。Or35a19 自身或與Orco嵌入於脂質體28 中，且以與實例1類似之方式在金電極上功能化用於EIS量測。如先前在實例1中對受體Or10a及Or22a所見，脂質體中之Orco之存在對Or35a回應具有相加或放大效應，從而增加OrX對於其目標配位體之靈敏度。
1. 實驗方法 1.1 材料 6-巰基己酸(MHA)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺) (EDC)、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)錠劑、水楊酸甲酯及己酸甲酯係獲自Sigma-Aldrich。1.6 mm直徑金(Au)圓盤電極、捲曲鉑(Pt)線電極及不漏銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極係購自BASi以用於電化學量測。
1.2 純化之 Or35a 及 Orco 子單元 之製備 如實例1部分1.2中所描述來製備Or35a及Orco子單元。
1.3 OR 相關脂質體之製備 如實例1部分1.3中所描述在以下改變下來製備Or35a脂質體： 在使用之前，將1 mg脂質體(500 μl，2 mg/ml)在冰上解凍且接著藉由在室溫下用0.2% CHAPS培育15 min而去穩定。隨後添加50 µg純化之Or35a/Orco，且在室溫下以10 rpm旋轉1 h。藉由添加500 mg之生物珠粒SM-2 (Bio-Rad,USA)且在4℃下隔夜培育以移除過量清潔劑。在兩端刺穿試管，且藉由以5000 g離心1 min，自生物珠粒分離Or35a/Orco整合脂質體。所有Or35a/Orco整合之脂質體樣品在等分且儲存於-80℃之前藉由西方墨點分析。藉由密度梯度超速離心(DGU)使用Accudenz (Accurate Chemical & Scientific Corporation, USA)來評估Or35a/Orco於脂質體中之整合。藉由添加相等體積之80% Accudenz溶液，將Or35a/Orco整合之脂質體引入至40% Accudenz，置於超離心管之底部處，且用30% Accudenz溶液及DGU緩衝液(25 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 10%甘油)覆蓋。接著樣品在4℃下以100,000g離心4 h。脂質體由於其低密度而在Accudenz DGU之後漂浮至梯度之頂部。
2. 結果 申請人藉由執行如描述於實驗1部分2.0中之EIS量測來研究Orco對嵌設於脂質體中之Or35a之配位體結合活性的效應。
圖8A展示OR35a脂質體功能化之感測器在暴露於各種濃度下之其目標配位體中之一者（E2-己烯醛）時的EIS回應。此外，奈奎斯特曲線圖展示在添加遞增濃度之E2己烯醛之後，EIS回應降低。劑量反應曲線(圖8)展示Or35a脂質體感測器對E2己烯醛之回應具有10 fM之偵測極限(LOD)，且對對照配位體水楊酸甲酯之回應可忽略。經空脂質體功能化之感測器對陽性及對照配位體展示可忽略之回應，其表明OR為偵測氣味劑之關鍵元素。
圖9A展示OR35a/Orco脂質體功能化之感測器在暴露於各種濃度下之其目標配位體(E2-己烯醛)時的EIS回應。圖9B比較針對Or35a/Orco脂質體之E2-己烯醛劑量反應曲線與針對Or35a脂質體、Orco脂質體及空脂質體所獲得之彼等劑量反應曲線。如所預期，Or35a/Orco脂質體展示比Or22a脂質體更大之最大回應，且亦表現出更大之靈敏度，如再次藉由劑量反應曲線向左移動及0.1 fM之偵測下限來反映。Orco脂質體及空脂質體二者展示對己酸甲酯之回應可忽略。
圖10清楚地概述實例1及2中測試之基於OrX及OrX/Orco之EIS生物感測器的劑量反應曲線向左之移動。表3中概括基於OrX及OrX/Orco之EIS生物感測器之劑量反應方程、EC50 及偵測範圍。對於實例1及實例2中測試之受體，產生之感測器在Orco之存在下以較低LOD及EC50 值的形式展示感測器回應的提高。 表 3 . 基於 OrX 及 OrX/Orco 之 EIS 生物感測器之劑量反應方程、 EC50 及偵測範圍。
3. 結論 此研究已證實Or35a在基於電子裝置平台之嗅覺生物感測器中Orco之存在下的識別能力之提高。在與Or35a脂質體比較時，與Orco子單元嵌入在金電極上經功能化之脂質體中之Or35a展示提高之靈敏度(低於fM)。與來自空脂質體功能化之電極之結果相比較，未觀測到對目標配位體之清晰的阻抗回應。Or35a之特異性結合亦已藉由測試來自Or35a脂質體功能化之電極之對照配位體之回應得到驗證。
實例3 -具有石英晶體微天平(QCM)壓電轉換器之本發明之感測器的例證概述
申請人已使用嵌設於脂質體中之黑腹果蠅Or10a19 序列在Orco序列之不存在及存在的情況下產生方便的壓電式感測器裝置。具有耗散監測之石英晶體微天平(QCM-D)為質量敏感性壓電轉換器，其振盪頻率隨晶體上之質量負載變化。藉由用Or10a脂質體及與其偶合之Or10a/Orco脂質體監測QCM-D感測器之振盪頻率變化來偵測Or10a與目標配位體水楊酸甲酯之間的相互作用。發現Or10a/Orco脂質體比Or10a脂質體對水楊酸甲酯具有更大之回應。此結果表明脂質體中之Orco子單元之存在對OrX之回應具有相加效應，從而放大其對配位體結合之回應。結合之特異性藉由測試偶合至QCM-D感測器之Or10a脂質體及Or10a/Orco脂質體對對照配位體己酸甲酯之回應來驗證，其中存在可忽略的回應。
1. 實驗方法 1.1 材料 6-巰基己酸(MHA)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺) (EDC)、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)錠劑及水楊酸甲酯係獲自Sigma-Aldrich。金(100 nm)感測器晶體(QSX301)係獲自ATA Scientific Instruments。
1.2  OR 相關脂質體之製備 1.2.1 純化之 OR 子單元之製備 OR子單元如實例1部分1.2中所描述來製備
1.2.2   OR 相關脂質體之製備 Or22a脂質體如實例1部分1.3中所描述來製備
1.3 石英晶體微天平 (QCM) 製備及資料收集 將金(100 nm)感測器晶體各自分別在乙醇及milli-Q水中音波處理15分鐘。將5:1:1體積比率之milli-Q水、氨水(25%)及過氧化氫(30%)加熱至75℃持續5分鐘，且將音波處理之晶體置於經加熱溶液中5分鐘。接著自該溶液移出晶體且用milli-Q水沖洗，之後用氮氣乾燥。藉由將乾淨之金晶體暴露於MHA之2 mM乙醇溶液隔夜而使其經硫醇功能化，隨後用乙醇溶液洗滌以便移除過量或鬆散結合之分子。在2 ml PBS (pH=6.5)溶液中使用2:1 mol:mol比率之EDC:NHS(100 mM EDC，50 mM NHS)製備NHS/EDC。在PBS緩衝溶液(pH=7.4)中，將各OrX/脂質體儲備溶液稀釋100倍用於QCM-D量測。接著將SAM功能化之晶體置放於Q-感測分析器儀器(Biolin Scientific)腔室中，且與NHS/EDC、Or10a/脂質體或Or10a/Orco脂質體及各種濃度之己酸甲酯(1.6 µM、8 µM、20 µM、40 µM、100 µM、200 µM、500 µM及1000 µM)一起在含有1% DMSO之PBS緩衝溶液中流動以量測頻率(∆f)及耗散(∆D)值之變化。
2. 結果 圖11(A)展示在SAM及NHS/EDC改質、隨後Or10a脂質體或Or10a/Orco脂質體固定於石英晶體上且接著結合目標配位體水楊酸甲酯時，頻率之變化。當結合事件發生於晶體上時，此導致質量增加，從而降低振盪頻率53 。因此，感測器之質量隨著SAM、NHS/EDC及Or10a脂質體或Or10a/Orco固定而增加。然而，在水楊酸甲酯結合之情況下，觀測到兩種類型之脂質體之頻率增加(圖11(B))。不希望受理論所束縛，發明人提出感測器上之此質量損失係由於水楊酸甲酯與Or10a受體之結合導致水及離子自Or10a脂質體內部釋放，亦即Or10a正形成功能性離子通道。類似地，水楊酸甲酯與Or10a受體之結合導致水及離子自Or10a/Orco脂質體內部釋放，亦即Or10a/Orco正形成功能性離子通道。然而，Or10a/Orco脂質體表現出頻率之變化大得多，其指示Orco子單元正放大自Or10子單元之回應。兩種類型之脂質體之劑量反應曲線之比較展示Or10a/Orco脂質體在水楊酸甲酯濃度更大時回應更強(圖11C)。在兩種情況下，此頻率增加隨著1.6至1000 μM之間的己酸甲酯濃度的增加而發生，其指示水楊酸甲酯特異性地與Or10a受體結合，因為對於對照配位體己酸甲酯未觀測到此頻率增加(圖11C)。對以等於萬億分之幾(parts-per-trillion，ppt)濃度之μM水準結合之配位體的偵測與使用秀麗隱桿線蟲ODR-1054 所見者處於同等水準。
3. 結論 此研究已證實OrX在基於電子裝置平台之嗅覺生物感測器中之識別能力。在石英晶體微天平(QCM)壓電感測器上功能化之脂質體中之OrX可特異性偵測其目標配位體。OrX與Orco結合展示對其目標配位體之更強之回應，其指示Orco對於OrX對其配位體之回應具有相加或放大效應。回應為OrX特異性的，此係因為未觀測到對對照配位體之清晰壓電回應。OrX/Orco脂質體功能化之QCM展示在特異性且靈敏地偵測其目標配位體方面有較大前景。
實例 4- 具有石墨烯場效電晶體 (GFET) 之 感測器之例證 概述
申請人已使用嵌設於脂質體中之黑腹果蠅Or10a及Or22a序列19 在Orco序列之不存在及存在的情況下產生方便的GFET感測器裝置。實驗結果展示具有GFET平台之昆蟲OR之活體外感測。以pM濃度開始，OrX功能化之GFET中之每一者已展示對其目標配位體(Or10a對水楊酸甲酯，Or22a對己酸甲酯)20 之清晰的電子回應。脂質體中之Orco之存在對OrX回應具有相加或放大效應，從而將OrX對其目標配位體之靈敏度增加降至fM濃度。藉由測試各OrX脂質體及OrX/Orco脂質體功能化之GFET對非回應配位體之回應來驗證結合之特異性。為進一步確保特異性，亦測試經空脂質體功能化之GFET對目標配位體之回應。
1. 實驗方法 1.1 材料 用於實驗之氮氣(≤99.99%)及氧氣(99.7%)購自BOC limited New Zealand。所使用之去離子(DI)水(18.2 MΩ)獲自Sartorius(Arium® 611 VF)DI水廠。對於GFET製造，在300 nm SiO2 /p型Si基板上含有機械轉移之CVD石墨烯之晶圓購自Advanced Chemical Supplier, CA, USA；正型光阻AZ1518購自Microchem, Germany；以及1-芘丁酸N-羥基丁二醯亞胺酯(PBASE) (95%，Sigma Aldrich)用作分子鍵聯劑以將OrX及OrX/Orco脂質體繫栓至存在於GFET裝置上之石墨烯之表面。
1.2    OR 相關脂質體之製備 1.2.1 純化之 OR 子單元之製備 OR子單元如實例1部分1.2中所描述來製備
1. 1.2.2   OR 相關脂質體之製備 OR脂質體如實例1部分1.3中所描述來製備
1.3 GFET 感測器之製備 此研究中使用之GFET由美國ACS Suppliers在300 nm SiO2 塗佈之Si基板上預沈積之石墨烯膜製成。FET由具有寬度為100 µm且長度為40 µm之尺寸之通道組成。涉及在Si/SiO2 基板上製造GFET之關鍵步驟在圖12中經示意性地說明。源電極及汲電極藉由微影定義，且藉由連續沈積Cr及Au形成。接著使用AZ1518光阻囊封汲電極及源電極二者，且將具有寬度為100 µm及長度為10 µm之尺寸之通道向環境打開以用於閘控及功能化。
為製造GFET，在300 nm SiO2 /p型Si基板上含有機械轉移之CVD石墨烯之晶圓係購自Advanced Chemical Supplier, CA, USA。首先將晶圓切割成尺寸為12 mm×12 mm之正方形晶片。在丙酮及IPA中沖洗晶片以移除石墨烯表面上之污染物。接著使用Angstrom engineering-Nex Dep 200蒸發器藉由熱蒸發進行對準標記沈積。將裝置安放於旋轉台上，且負載鉻及金金屬源極。鍍覆鉻之鎢棒(Kurt J.Lesker Company)用作鉻源極。金線片(99.99%，Kurt J.Lesker Company)裝載至鎢船(Kurt J.Lesker Company)中且裝載至蒸發腔室中。腔室經抽真空至2×10-6 毫托，且連續蒸發5 nm鉻及50 nm金。腔室經冷卻且用氮氣通風。藉由將裝置浸泡於丙酮中10 min且接著在經氮氣乾燥之前在IPA中洗滌來進行剝離。使用AZ1518光阻限定通道面積，且使用反應離子蝕刻器(Oxford instruments,Plasmalab 80 Plus)在600毫托下使用200 W氧電漿蝕刻晶片之其餘部分上之石墨烯膜1 min。接著在藉由微影限定頂部接點之後，藉由連續熱蒸發5nm Cr及50 nm Au來沈積頂部接點。電極藉由AZ 1518光阻囊封。在200毫托壓力及20 SCCM氧氣流下，在50 W氧電漿下清洗囊封之石墨烯FET持續一分鐘，以移除石墨烯通道上之殘餘光阻。接著在200℃下，在加熱板上烘烤裝置持續10 min，且在功能化之前在丙酮及IPA中洗滌。
1.4 GFET 上之 OrX 及 OrX/Orco 脂質體之功能化 如圖13中所示，使用PBASE作為分子鍵聯劑，經由非共價途徑將OR脂質體功能化至石墨烯表面上。用1× PBS (pH7.4)以1:10比率稀釋OR脂質體。將清洗之GFET浸入於含1 mM PBASE溶液之甲醇中1小時。將裝置在甲醇中洗滌三次，且隨後在1× PBS中洗滌三次以分別移除在通道中之過量PBASE及殘餘甲醇。將OR脂質體用1× PBS (pH 7.4)稀釋1:10，將100µL OR稀釋液置放於石墨烯通道中，且在室溫下在封閉之皮氏培養皿中培育一個小時。在OR脂質體功能化之後，在量測之前將裝置在1× PBS中洗滌10 s。
藉由AFM使用台面AFM (Nanosurf, NaioAFM)驗證OR脂質體在石墨烯表面之附接。使用具有動態施加力之輕敲模式進行成像。在OR脂質體功能化之後的AFM影像在空氣中進行。功能化之石墨烯FET在去離子水中洗滌且排出過量之水。在成像之前，功能化之裝置在氮氣流下乾燥。Gwydion (V.2.47)及SPIP套裝軟體用於分析AFM影像。圖14展示固定於石墨烯表面上之Or10a、Or10a/Orco、Or22a、Or22a/Orco、空脂質體及Orco脂質體。此研究中使用之脂質體之平均大小估計為128 ± 43 nm。AFM影像確認脂質體之球面結構在功能化之後保留。
1.4 OR 脂質體 GFET 之電特徵 如在圖15(a)中之示意圖中所示，使用頂部液體閘極形態進行OR脂質體功能化之GFET之電感測器量測。使用PDMS井以將電解質限制於通道區。使用Agilent 4156C參數分析器及具有微操作器之Rucker及Kolls探針台對裝置進行電表徵。Ag/AgCl標準電極用作液體閘極量測之閘電極。不同石墨烯FET (圖15(b)至(g))之轉移特性在Vds =1 mV下量測，而液體閘極電壓Vlg 以20 mV之間隔自-0.5 V掃描至1 V。
1.5 OR 脂質體 GFET 感測器量測 將具有安裝於其上之PDMS井之OR脂質體固定之GFET裝置置放至探針台上，且藉由微操作器進行源極及汲極連接。向井中添加100 µl含有1%二甲亞碸(DMSO)之PBS，且將Ag/AgCl標準電極置放於緩衝液中。配位體為100 mM濃度之儲備溶液藉由將其溶解於DMSO中來製備，此係因為其在水性緩衝液中不穩定。將儲備溶液儲存在4℃下。藉由將儲備溶液稀釋於含有1% DMSO之1× PBS緩衝液中以將濃度設定為10 fM至100 pM來製備用於感測之配位體溶液。以三分鐘間隔將配位體溶液添加至PDMS井以使最終濃度為1 fM至10 pM。即時感測器量測藉由以1 s之間隔連續量測Ids 來進行。閘極電壓Vlg 在整個量測中經由Ag/AgCl參考電極保持在0 V。
2. 結果 測試OR脂質體功能化之GFET感測器之感測效能。將具有或不具有輔受體Orco之OR脂質體用於感測測試。藉由固定Or10a、Or10a/Orco、Or22a及Or22a/Orco脂質體來製造四組感測器且進行測試。
Or10a及Or10a/Orco脂質體感測器針對其陽性配位體水楊酸甲酯進行測試。Or22a及Or22a/Orco脂質體感測器針對其陽性配位體己酸甲酯進行測試。亦使用E2-己烯醛作為配位體對照來測試此等感測器。以水楊酸甲酯及己酸甲酯二者作為對照，測試空脂質體及Orco脂質體功能化之GFET感測器之回應。各實驗一式三份地進行以減小實驗及量測誤差。
圖16展示所有四個感測器在添加遞增濃度之陽性配位體的情況下之標準化即時感測回應。其展示各具有或不具有Orco之基於脂質體之感測器中之每一者產生對陽性配位體而非對照配位體具有特異性之劑量依賴性回應。空脂質體及含有Orco之脂質體皆對陽性配位體無回應，其證實選擇性結合係由於OrX之存在。圖17概述Orco之存在對於各OrX對其陽性配位體之回應的效應。Orco之存在導致靈敏度增加，藉由其劑量反應曲線向左移動及其LOD自pM降低至100 fM水準來證實。表4概述OrX及OrX/Orco組合之Ec50及偵測範圍。 表 4. 基於 OrX 及 OrX/Orco 之 GFET 生物感測器之劑量反應方程、 EC50 及偵測範圍。
3. 結論 此研究已證實Or10及Or22a二者在Orco之存在下基於GFET裝置之嗅覺生物感測器中之靈敏度的提高。與脂質體中自身之受體相比，與Orco子單元嵌設於在石墨烯上經功能化之脂質體中之Or10a及Or22a二者展示增加的靈敏度(fM)。與空脂質體及Orco脂質體功能化之石墨烯之結果相比，未觀測到對目標配位體之清晰電子回應。此證實儘管Orco不直接參與配位體結合，但其在脂質體中之存在進一步減弱OrX對其目標配位體之靈敏度。
實例 5- 具有液滴界面雙層 (DIB) 之 雙層感測器裝置之例證 概述 申請人已展示功能性離子移變嗅覺受體(OR)已經併入至蛋白脂質體中，且與人造雙層融合，其中氣味劑之可逆結合可經電量測。
1. 實驗方法 1.1 材料 磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)錠劑、水楊酸甲酯及己酸甲酯獲自Sigma-Aldrich。所有脂質來源於Avanti極化脂質。除非另外規定，否則所有其他化學品購自Merck，UK。始終使用二次蒸餾之「超純」水(Millipore，Milli-Q：18.2 MΩ cm)。
1.2 純化之 OrX 及 Orco 子單元 之製備 OrX及Orco子單元係如實例1部分1.2中所描述在以下改變下製備： 在膜集結粒再懸浮後，樣品在4℃而非18℃以100,000 g離心1 h。
1.3 OR 相關脂質體之製備 OR相關脂質體如實例1部分1.3中所描述在以下改變下來製備： 用生物珠粒執行培育步驟隔夜。
1.4 製備脂質小液滴 將DPhPC (Avanti，4ME 16:0 PC)溶解於氯仿中且等分，隨後在氮氣流下乾燥以形成薄脂質膜。接著將其置放於真空下之乾燥器中14小時。接著將等分試樣儲存在＜-20℃在氬氣下。在使用之前，添加十一烷(Merck，UK)以溶解脂質來製得10 mg/ml之溶液。將其稀釋於AR20聚矽氧油(Merck,UK)及十一烷(使最終AR20聚矽氧油十一烷比率為1:1)中以製得1 mg/ml溶液。十一烷及AR20聚矽氧油在使用之前使用0.22 µm過濾器來預過濾。
1.5 電極製備 將銀電極(直徑0.5 mm，純度＞99%，Merck)切割成適當之長度，且用精細粗砂紙製備，隨後在次氯酸鈉溶液(Fluka，UK)中培育1小時。接著將電極在插入至電生理學陣列井或固定至操作器中之前，在ddH2 O中洗滌。
1.6 電生理學陣列 使用電腦輔助設計軟體(FreeCAD，https://www.freecadweb.org/)設計由聚(甲基丙烯酸甲酯) (PMMA)製成之多井陣列，且使用減法電腦化數控(CNC)機器(Roland Modela MDX-40A)研磨。圖18展示此PMMA平台之概觀。(A)展示陣列之4腔室設計。(B)展示沈積於基底上之液滴(紅色及綠色)與初始PMMA形狀之操作器電極(藍色)之間的DIB形成之示意圖。PMMA形狀展示為完全透明以充分顯示形狀內之電極之位置。
1.7 電生理學設置 電生理記錄在法拉第籠內使用Pico2 (Tecella，USA)放大器進行。
1.8 液滴界面雙層形成 雙層形成於PMMA腔室內形成之兩個液滴之間，該PMMA腔室填充有含1 mg/ml DPhPC之十一烷及AR20聚矽氧油(1:1比率)。在此過程中之第一步為將50 nl液滴沈積在安置於井之基底之靜態銀電極上；此液滴由含有300 mM NaCl、10 mM HEPES (pH 7.4)及0.1至1 µM氣味劑之水溶液組成，該水溶液在蛋白脂質體中含有氣味受體蛋白(蛋白脂質體製劑之稀釋度為1:20)。第二液滴安裝至第二銀電極上，該第二銀電極使用YOU-3操作器(Narishige，Japan)固持於油及脂質混合物中。第二液滴具有含有50 mM NaCl及10 mM HEPES (pH 7.4)之50 nl總體積。使用0.5 µl注射器(Hamilton，USA)沈積兩個液滴。為確保在各液滴周圍形成穩定之磷脂單層，使液滴在電極上停留5 min，隨後使用YOU-3操作器輕輕地結合在一起。一旦液滴接觸，雙層在1分鐘內自發地形成(如藉由視覺評估及使用Pico2放大器用電容電壓方案量測雙層電容之增加來判定)。活性通道之插入藉由電流之變化判定，同時將電壓箝位在50 mV。此過程需要45 min。若此時看不出插入，則放棄實驗。液滴界面雙層實驗在22.0 ± 1.5℃下進行。
1.9 記錄參數 電流用具有內置數位板之Pico2或eONE-HS放大器(分別為Tecella，USA及Elements，Italy)，以20 kHz之取樣頻率在無間隙獲取模式下操作，且使用0.8或1.5 kHz低通濾波器來記錄。所有實驗使用電壓箝位方法進行。膜兩端之電壓經箝位於-200 mV至200 mV範圍內之各種電位。
1.10 手動資料分析 使用ANA (Dr Pusch，Genoa)、EDR (Elements，Italy)及WinWCP (Dr Dempster，University of Strathclyde)分析資料。單通道電流隨著觀測到之電流之幅度的梯度增加來量測。當量測不同保持電位下之電流時，基線電流可處於不同水準。為補償此點，按慣例電流之變化相對於基線給出。在保持電位低於電化學平衡值時，通道開口展示為向下偏轉。相反，當保持電位大於反轉電位時，通道開口展示為自基線向上偏轉。
2. 結果 圖19展示在含有1 mg/ml DPhPC之1:1十一烷聚矽氧油混合物中之兩個水滴之間形成的液滴界面雙層(DIB)之離子通道記錄，如使用浮置電極裝置來量測(參見圖18)。僅含有Or22a (圖19a)及Or22a/Orco (圖19b)之蛋白脂質體與DIB融合以允許受體子單元之插入。使用之溶液含有10 mM HEPES (pH 7.4，具有NaOH)、300 mM NaCl或50 mM NaCl，補充有10 µM己酸甲酯(一種已知之Or22a促效劑)。對於僅Or22a之DIB實驗(圖19a)，保持電位在+/-150 mV、+/-100 mV及+/-50 mV之間變化。在任何保持電位下未觀測到離子通道活性，其指示Or22a自身無法形成活性離子通道。對於Or22a/Orco DIB實驗(圖19b)，保持電位在+/-100 mV、+/-50 mV及+/-25 mV之間變化。在此情形下，在+/-100 mV、+/-50 mV及-25 mV下觀測離子通道活性，其指示Or22a與Orco結合時可形成活性配位體閘控離子通道。圖20展示在-100 mV之保持電位下獲得之第二個獨立Or22a/Orco DIB實驗。在此情形下，可能由於多個Or22a/Orco通道複合物之插入，可識別多個打開狀態。
圖21展示在0 mV (圖21A)及-100 mV (圖21B)之保持電位下，在含有1 mg/ml DPhPC之1:1十一烷聚矽氧油混合物中之兩個水滴之間形成的液滴界面雙層(DIB)之兩個離子通道記錄，如使用浮置電極裝置(參見圖18)量測。將含有Orco/Or71a之蛋白脂質體與DIB融合以允許受體子單元之插入。使用之溶液含有10 mM HEPES (pH 7.4，具有NaOH)、300 mM NaCl或50 mM NaCl，補充有10 µM之目標配位體4-乙基愈創木酚。兩個DIB實驗展示Or71a在Orco之存在下可形成活性配位體閘控離子通道。
3. 結論 此研究已進一步證實Orco之存在影響基於電子裝置平台之嗅覺生物感測器中之OrX之靈敏度。在此情形下，當兩個OrX (Or22a及Or71a)與Orco子單元單獨地插入於脂質雙層中時，兩個OrX/Orco複合物在OrX之目標配位體之存在下表現出離子通道活性。然而，在不存在Orco之情況下，此配位體閘控活性未突出表現出Orco在形成活性離子通道中之作用。此資料證實在基於脂質雙層之感測器裝置中使用OrX/Orco複合物以基於其離子通道活性回應偵測特定揮發性有機化合物之潛能。
實例 6- 具有表面電漿子共振成像之感測器之例證 概述 申請人描述一種使用嵌設於膜模擬物中之昆蟲氣味受體(OrX)子單元之方便的SPRi感測器裝置，該膜模擬物在不存在及存在Orco序列之情況下包括脂質體及奈米盤。OrX功能化之SPR感測器中之每一者展示對其目標配位體之清晰電子回應。膜模擬物中之Orco之存在具有對OrX回應之相加或放大效應，從而增加OrX對其目標配位體之靈敏度。藉由測試各OrX及OrX/Orco功能化之SPRi感測器對非回應配位體之回應來驗證結合之特異性。
1. 實驗方法 1.2 OR 相關脂質體及奈米盤之製備 1.2.1 純化之 OR 子單元之製備 OrX及Orco子單元如實例1部分1.2中所描述來製備。OrX及Orco子單元在其N端具有經工程改造之半胱胺酸殘基以使其能夠直接偶合至SPRi稜鏡之金表面。
1.2.2 OR 相關脂質體之製備 OrX及Orco脂質體如實例1部分1.3中所描述來製備。
1.2.3 OR 相關之奈米盤之製備 使用自Bayburt等人2010及200355 、 56 修改之方案製備奈米盤。以1:0.2:150之MSP:蛋白質:脂質比率形成奈米盤。自100 mg/mL之儲備液移除所需量之脂質，且在恆定氮氣流氣體下乾燥，接著進一步在真空下乾燥隔夜。將脂質再懸浮於所需體積之緩衝液(20 mM Tris/HCl pH 7.5，100 mM NaCl，50 mM膽酸鈉)中且經音波處理，產生20 mg/mL濃度之透明脂質儲備液。以所需比率將清潔劑緩衝液中之純化氣味受體蛋白與MSP1E3D1及POPC脂質混合且在冰上培育1小時。為藉由自系統移除清潔劑而引發重建，以1:1重量:體積比率將生物珠粒SM2 (Bio-Rad #1523920)添加至樣品中，且在4℃下在恆定旋轉下將混合物培育隔夜。接著移除生物珠粒且將經合併之奈米盤冷凍在-80℃下直至需要。
1.3 OrX 及 OrX/Orco SPRi 感測器之製備 脂質體或奈米盤中之OrX及OrX/Orco根據藉由Hurot等人，2019用於固定脊椎動物氣味劑結合蛋白(OBP)57 之方案作為限定點固定至SPRi稜鏡之金表面上。OrX及OrX/Orco複合物直接經由N端半胱胺酸殘基固定。固定發生在適當之密度下以確保脂質體或奈米盤在金表面上之自組裝，該固定產生脂質體或奈米盤單層。此防止脂質體或奈米盤之額外無序層之形成，該脂質體或奈米盤防止目標配位體出入直接附接至金層之OrX或OrX/Orco複合物之結合袋。獲得完全覆蓋金表面之單層以阻斷目標配位體與金表面之非特異性結合。
1.4 藉由 OrX 及 OrX/Orco SPRi 感測器對配位體結合之偵測及分析 VOC與OrX及OrX/Orco脂質體或奈米盤之結合使用適當之SPRi設備進行偵測，且如Hurot等人201957 所描述來進行分析。OrX或OrX/Orco固定之金表面暴露於不同濃度(fM至nM)之目標配位體或對照配位體。配位體結合經量測為與添加配位體之前的基線相比之反射率變化。各實驗一式三份地進行以減小實驗及量測誤差。
2. 結果 針對OrX子單元特異性之陽性配位體及OrX不應結合之對照配位體測試OrX及OrX/Orco脂質體或奈米盤功能化之SPRi感測器之感測效能。亦針對陽性配位體測試空脂質體及Orco脂質體或空奈米盤及Orco奈米盤功能化之SPRi感測器之回應。
在兩種膜顯示型式之情況下，OrX子單元自身敏感地結合至陽性配位體，產生劑量反應曲線，但對對照配位體無回應。當Orco子單元亦存在時，預期Orco之存在導致靈敏度之增加，如藉由其劑量反應曲線向左移動及其LOD降低所證實。空脂質體及含有Orco之脂質體皆對陽性配位體無回應，其證實選擇性結合係由於OrX之存在。
3. 結論 預期此研究證實OrX在基於SPRi裝置之嗅覺生物感測器中之Orco之存在下之靈敏度的提高。認為與OrX受體自身相比，與Orco子單元嵌入於在SPRi玻璃稜鏡之金表面上經功能化之脂質體或奈米盤中之OrX將展示提高之靈敏度。與分別自空脂質體或奈米盤及含有Orco之脂質體或奈米盤的結果相比，未觀測到對目標配位體之清晰電子回應。此預期證實儘管Orco不直接參與配位體結合，但其在脂質體中之存在進一步減弱OrX對其目標配位體之靈敏度。參考文獻 1. Montagne, N.; de Fouchier, A.; Newcomb, R. D.; Jacquin-Joly, E., Advances in the identification and characterization of olfactory receptors in insects.Progress in molecular biology and translational science 2015, 130 , 55-80. 2. Leary, G. P.; Allen, J. E.; Bunger, P. L.; Luginbill, J. B.; Linn, C. E., Jr.; Macallister, I. E.; Kavanaugh, M. P.; Wanner, K. W., Single mutation to a sex pheromone receptor provides adaptive specificity between closely related moth species.Proc Natl Acad Sci 2012, 109 (35), 14081-6. 3. Kiely, A.; Authier, A.; Kralicek, A. V. ; Warr, C. G.; Newcomb, R. D., Functional analysis of aDrosophila melanogaster olfactory receptor expressed in Sf9 cells.J. Neurosci. Methods 2007, 159 (2), 189-94. 4. Jordan, M. D.; Anderson, A.; Begum, D.; Carraher, C.; Authier, A.; Marshall, S. D.; Kiely, A.; Gatehouse, L. N.; Greenwood, D. R.; Christie, D. L.; Kralicek, A. V.; Trowell, S. C.; Newcomb, R. D., Odorant receptors from the light brown apple moth (Epiphyas postvittana ) recognize important volatile compounds produced by plants.Chem. Senses 2009, 34 (5), 383-94. 5. Anderson, A. R.; Wanner, K. W.; Trowell, S. C.; Warr, C. G.; Jaquin-Joly, E.; Zagatti, P.; Robertson, H.; Newcomb, R. D., Molecular basis of female-specific odorant responses inBombyx mori .Insect Biochem. Mol. Biol. 2009, 39 (3), 189-97. 6. Corcoran, J. A.; Jordan, M. D.; Carraher, C.; Newcomb, R. D., A novel method to study insect olfactory receptor function using HEK293 cells.Insect Biochem. Mol. Biol. 2014 . 7. Jones, P. L.; Pask, G. M.; Rinker, D. C.; Zwiebel, L. J., Functional agonism of insect odorant receptor ion channels.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2011, 108 (21), 8821-5. 8. 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將參考隨附非限制性圖式更好理解本發明，其中：
圖1.昆蟲OR膜複合物之示意性圖示，該昆蟲OR膜複合物包含結合OrX子單元及Orco子單元以產生配位體閘控之非選擇性陽離子通道的氣味劑。橙色圓形表示結合之氣味劑。
圖2. EIS感測器製備之示意性圖示，該EIS感測器製備開始於電極清洗，隨後為SAM形成且以脂質體共價附接於SAM層上完成。電化學讀數獲自以三端電化學設置進行之EIS量測。藍色圓形表示脂質體整合之昆蟲OrX或OrX/Orco複合物，且紅色圓形表示VOC配位體。
圖3展示AFM高度影像(a-d)、藉由高度影像上之標記直線指示之粗糙度輪廓(e-h)及分別為裸露、SAM改質、NHS-EDC偶合及Or22a/脂質體固定之金表面之3D影像(i-l)。
圖4.(A) Or10a脂質體功能化電極相對於濃度範圍為1 aM至100 μM之目標配位體水楊酸甲酯(metsal)之阻抗演進。實驗資料呈現為符號且等效電路擬合曲線呈現為實線。(B)用Or10a脂質體功能化之金電極回應於目標配位體水楊酸甲酯及對照配位體己酸甲酯之劑量反應曲線。亦用經空脂質體功能化之金電極執行目標及對照配位體結合量測。誤差條係使用四次重複使用標準差來產生的。
圖5.(A) Or10a/Orco脂質體功能化電極相對於濃度範圍為1 aM至100 μM之目標配位體水楊酸甲酯(metsal)之阻抗演進。實驗資料呈現為符號且等效電路擬合曲線呈現為實線。(B)用Or10a/Orco脂質體功能化之金電極回應於目標配位體水楊酸甲酯之劑量反應曲線。亦用經空脂質體及證實空回應之Orco脂質體功能化之金電極執行目標配位體結合量測。誤差條係使用四次重複使用標準差來產生的。
圖6.(A) Or22a脂質體功能化電極相對於濃度範圍為1 aM至100 μM之目標配位體己酸甲酯(methex)之阻抗演進。實驗資料呈現為符號且等效電路擬合曲線呈現為實線。(B)用Or22a脂質體功能化之金電極回應於目標配位體己酸甲酯及對照配位體水楊酸甲酯之劑量反應曲線。亦用經空脂質體功能化之金電極執行目標及對照配位體結合量測。誤差條係使用四次重複使用標準差來產生的。
圖7.(A) Or22a/Orco脂質體功能化電極相對於濃度範圍為1 aM至100 μM之目標配位體己酸甲酯(methex)之阻抗演進。實驗資料呈現為符號且等效電路擬合曲線呈現為實線。(B)用Or22a/Orco脂質體功能化之金電極回應於目標配位體己酸甲酯之劑量反應曲線。亦用經空脂質體及證實空回應之Orco脂質體功能化之金電極執行目標配位體結合量測。誤差條係使用四次重複使用標準差來產生的。
圖8.(A)脂質體功能化電極中之(A)Or35a相對於濃度範圍為1 aM至100 μM之目標配位體E2-己烯醛之阻抗演進。實驗資料呈現為符號且等效電路擬合曲線呈現為實線。(B)用Or35a脂質體功能化之金電極回應於目標配位體E2-己烯醛及對照配位體水楊酸甲酯之劑量反應曲線。亦用經空脂質體功能化之金電極執行目標及對照配位體結合量測。誤差條係使用四次重複使用標準差來產生的。
圖9.(A)脂質體功能化電極中之(A)Or35a/Orco相對於濃度範圍為1 aM至100 μM之目標配位體E2-己烯醛之阻抗演進。實驗資料呈現為符號且等效電路擬合曲線呈現為實線。B)用Or35a/Orco脂質體功能化之金電極回應於目標配位體E2-己烯醛之劑量反應曲線。亦用經空脂質體及證實空回應之Orco脂質體功能化之金電極執行目標配位體結合量測。誤差條係使用四次重複使用標準差來產生的。
圖10.針對(A)Or10a+/-Orco、(B)Or22a+/-Orco、及(C)Or35a+/-Orco脂質體回應於目標及對照配位體之EIS劑量反應曲線之概述。所有三個劑量反應曲線展示Orco之存在導致各OrX受體以更高靈敏度結合其目標化合物，因此將劑量反應曲線向左移動。誤差條係使用四次重複使用標準差來產生的。
圖11.(A)用SAM及NHS/EDC改質、Or10a脂質體(頂部)或Or10a/Orco脂質體(底部)固定，隨後結合目標配位體水楊酸甲酯(metsal)的帶耗散之石英晶體微天平(QCM-D)上之頻率變化。(B)展示對於Or10a脂質體(頂部)或Or10a/Orco脂質體(底部)固定之QCM-D感測器隨著水楊酸甲酯(1.6、8、20、40、100、200、500及1000 μM之1% DMSO緩衝液)之濃度增加的頻率變化的特寫視圖。(C)展示當暴露於Or10a脂質體或Or10a/Orco脂質體固定之金晶體時，對目標配位體水楊酸甲酯及對照配位體己酸甲酯(methex)之偵測的劑量反應曲線。使用兩次重複產生誤差條；標準差(SD)。
圖12：涉及在Si/SiO2 基板上之GFET製造的關鍵步驟，(a)石墨烯塗佈之Si/SiO2 基板(b)蝕刻不必要之石墨烯層(c)在/SiO2 基板上之石墨烯通道；(d)電極沈積；及(e)電極囊封。
圖13：石墨烯上之脂質體固定化之示意圖(A)使用π-π相互作用在石墨烯上對PBASE進行功能化(B)PBASE功能化之CNT與脂質體之培育(C)使用親核取代反應將脂質體與PBASE繫栓在一起。
圖14：固定於石墨烯通道上之(a)Or10a脂質體、(b)Or10a/Orco脂質體、(c)Or22a脂質體、(d)Or22a/Orco脂質體、(e)空脂質體及(f)Orco脂質體之AFM影像。
圖15：GFET裝置示意圖及轉移特性。(a)用於液體閘極量測之具有囊封之源電極及汲電極的在SiO2 /Si基板上製造之FET之裝置示意圖及電路連接。(對於CNT網絡FET選擇之Vds 為100 mV及對於GFET為1 mV)。在(b) Or10a、(c) Or10a/Orco、(d) Or22a、(e) Or22a/Orco、(f)空脂質體及(g)Orco脂質體之功能化之前(圓形)及之後(方形)之實際GFET的轉移特性曲線(對於所有量測Vds 保持在1 mV)。
圖16.(a) Or10a及(b) Or22a、(c) Or10a+Orco及(d) Or22a+Orco脂質體固定之GFET感測器隨著添加遞增濃度之目標配位體(Or10a-水楊酸甲酯(MeSal)、Or22a-己酸甲酯(MeHex))的標準化即時感測回應。
圖17.對於目標配位體(Or10a-水楊酸甲酯(MeSal)、Or22a-己酸甲酯(MeHex))及對照配位體(Or10a及Or22a-E2-己烯醛(E2Hex))與(a) Or10a、(b) Or10a+Orco、(c) Or22a及(d) Or22a+Orco脂質體之標準化劑量反應曲線。亦展示空脂質體(a、c)及僅Orco脂質體(b、d)對目標配位體之回應缺失。對於Or22a (e)及Or10a (f)二者，當Orco存在於脂質體中時，可發現其各別劑量反應曲線向左移動。
圖18.用於雙層感測器裝置之PMMA平台之概述。(A)陣列之4腔室設計。(B)沈積於基底上之液滴(紅色及綠色)與初始PMMA形狀之操作器電極(藍色)之間的液滴界面雙層(DIB)形成之示意圖。PMMA形狀展示為完全透明以充分顯示形狀內之電極之位置。
圖19.來自含有(a) Or22a或(b) Or22a/Orco及10 mM己酸甲酯(一種已知的Or22a活化劑)之液滴界面雙層(DIB)的離子通道記錄。DIB在含有1 mg/ml DPhPC之1:1十一烷聚矽氧油混合物中之兩個水滴之間形成，且使用浮置電極裝置來量測離子通道形成。保持電位如所指示變化。對於上述實驗，Na+ 之反轉電位為46 mV。資料以10 kHz取樣，且以0.8 kHz過濾。
圖20.來自含有Or22a/Orco及10 μM己酸甲酯之液滴界面雙層(DIB)的離子通道記錄。DIB在含有1 mg/ml DPhPC之1:1十一烷聚矽氧油混合物中之兩個水滴之間形成，且使用浮置電極裝置來量測離子通道形成。對於此實驗，Na+ 之反轉電位為46 mV及保持電位為-100 mV。資料以10 kHz取樣，且以0.8 kHz過濾。
圖21.(A)來自含有Or71a、Orco及10 μM 4-乙基愈創木酚(一種已知的Or71a促效劑)之液滴界面雙層(DIB)的離子通道記錄。DIB在含有1 mg/ml DPhPC之1:1十一烷聚矽氧油混合物中之兩個水滴之間形成，如使用浮置電極裝置來量測。對於此實驗，Na+ 之反轉電位為-46 mV。資料以10 kHz取樣，且以0.8 kHz過濾。(B)如(A)中所描述的第二離子通道記錄。

Claims (16)

  1. 一種感測器裝置，其包含與基板以電連通之包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物，其中該昆蟲氣味受體複合體係偶合至該基板，且其中該感測器裝置經組態以藉由偵測該基板之電特徵之變化而偵測分析物與該OrX之結合。
  2. 如請求項1之感測器裝置，其中該昆蟲氣味受體複合物係以能夠回應於該分析物之結合而發生構形變化之形式存在。
  3. 如請求項1之感測器裝置，其中該昆蟲氣味受體複合物存在於膜模擬物中。
  4. 如請求項3之感測器裝置，其中該膜模擬物係選自脂質體、兩親性聚合物(amphipole)、清潔劑微胞(micelle)、奈米囊泡(nanovesicle)、脂質雙層、奈米盤(nanodisc)及界面活性劑。
  5. 如請求項3之感測器裝置，其中該膜模擬物包含兩親性分子，諸如脂質分子，較佳地其中該兩親性分子包含磷脂分子。
  6. 如請求項1之感測器裝置，其中該感測器裝置可偵測濃度小於1×10-3M之分析物之存在，較佳地其中該感測器裝置可偵測濃度小於1×10-9M之分析物之存在。
  7. 如請求項1之感測器裝置，其中該感測器裝置可偵測濃度小於1×10-12M之分析物之存在，較佳地其中該感測器裝置可偵測濃度小於1×10-15M之分析物之存在。
  8. 如請求項1之感測器裝置，其中該基板係選自以下中之至少一者或由以下中之至少一者構成：電極、半導體材料、碳奈米管(CNTs)、石墨烯、氧化物、摻雜矽、導電聚合物及共振器(resonator)組件。
  9. 如請求項1之感測器裝置，其中該電特徵係選自以下中之至少一者：傳導性、電阻、複電阻(complex resistance)、阻抗(impedance)、電化學阻抗、電化學電位、電流，及由交流電場誘導之振盪之共振頻率。
  10. 一種偵測分析物之方法，該方法包含以下步驟：a)使該分析物與如請求項1之感測器裝置中之昆蟲OrX結合，b)偵測該基板之電特徵之變化，其中該基板之電特徵變化指示該分析物之偵測。
  11. 一種偵測環境中分析物存在之方法，該方法包含以下步驟：a)將如請求項1之感測器裝置暴露於含有該分析物之環境，b)使該分析物與該感測器裝置中之昆蟲OrX結合，c)偵測該基板之電特徵之變化，其中該基板之電特徵變化指示該環境中該分析物的存在。
  12. 一種製造如請求項1之感測器裝置之方法，該方法包括將該昆蟲氣味受體複合物偶合至該基板之步驟。
  13. 一種感測器裝置組件，其包含與基板以電連通之包含OrX及Orco之昆蟲氣味受體複合物，其中該昆蟲氣味受體複合物係偶合至該基板。
  14. 一種感測器裝置，其包含如請求項13之感測器裝置組件，其中該感測器裝置經組態以藉由偵測該基板之電特徵之變化而偵測分析物與該OrX之結合。
  15. 一種製造如請求項13之感測器裝置組件之方法，該方法包括將該昆蟲氣味受體複合物偶合至該基板之步驟。
  16. 一種組裝感測器裝置之方法，該方法包含將如請求項13之感測器裝置組件添加至該感測器裝置中，其中經組裝之該感測器裝置經組態以藉由偵測該基板之電特徵之變化而偵測分析物與該OrX之結合。
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