申請人之發明第一次成功地將具聞嗅能力之昆蟲氣味受體(OrX)與便利之感測器型式組合。 除便利性得到提高以外，相對於基於使用昆蟲OR之先前分析系統，本發明之感測器裝置出人意料地使偵測靈敏性得到非常顯著的提高。 此外，本發明之感測器出人意料地能夠在不存在氣味劑輔受體(Orco)下起作用，然而基於使用昆蟲OR之所有先前分析系統均依賴於對OrX及Orco兩者的包括。
昆蟲氣味受體複合體
昆蟲氣味受體(OR)係形成配位體閘控之非選擇性陽離子通道之新穎之七種跨膜蛋白家族的構件。如在圖1中所展現，高度保守之昆蟲氣味劑輔受體(Orco)被認為在活體內形成活性通道，具有配位體結合次單元(OrX)之組賦予的氣味劑特異性。 活體內，昆蟲OrX蛋白之N端係細胞質的，而C端在細胞外。此拓樸結構與哺乳動物G蛋白偶聯受體(GPCRs)之拓樸結構相對。另外，不同於哺乳動物GPCR，昆蟲OR充當配位體閘控之非選擇性陽離子通道，且信號大部分獨立於G蛋白
15
。 Hopf等人2015
16
進一步論述昆蟲OR之預測結構及其與哺乳動物GPCR之非相關性。 昆蟲OrX蛋白，其亦可描述為OrX多肽，為熟習此項技術者所熟知。用於本發明之適合之OrX序列包括來自以下之序列：黑腹果蠅(
Drosophila melanogaster
) OR基因家族(
43
)，其可偵測廣泛範圍的VOC (
44 - 46
)；瘧蚊(
Anopheles gambiae
) OR基因家族(
47
)，其可偵測廣泛範圍的 VOC (
48 、 49
)；以及來自其他昆蟲物種之OR基因家族，針對已知OR家族之最新清單，參見Montagne 2015 (
1
)之表I。在一個實施例中，昆蟲OrX蛋白包含揭示於此類參考文獻
1 、 43
及
47
中之序列或其變型或功能片段。 在一個實施例中，OrX係重組表現之蛋白質。 在一較佳實施例中，OrX已在重組表現後純化。 在一個實施例中，OrX不直接自昆蟲嗅覺細胞純化。 在另一實施例中，在感測器裝置中，OrX不存在於昆蟲嗅覺細胞中。
用於本發明之感測器裝置之基板
用於本發明之感測器裝置之基板可為任何可量測電特徵之變化的基板。較佳地，電特徵之變化係由OrX與分析物之間的相互作用產生。 基板亦提供可與OrX偶聯之表面。 適合之基板包括以下中之至少一者或由以下中之至少一者構成：電極、半導體材料、碳奈米管(CNT)、石墨烯、氧化物、摻雜矽、導電聚合物、共振器組件。 在一個實施例中，共振器組件係以下各者或由以下各者構成：壓電材料、至少一種壓電晶體及石英晶體。在一較佳實施例中，共振器組件係石英晶體共振器。
在本發明之感測器裝置中量測之電特徵
在一個實施例中，電特徵選自以下中之至少一者：導電性、電阻、複電阻、阻抗、電化學阻抗、電流及藉由交流電場誘導之振盪之共振頻率。
EIS 裝置
在一個實施例中，本發明之感測器裝置經組態以偵測化學電池之工作電極中之電化學阻抗的變化。因此，在此實施例中感測器裝置經組態用於電化學阻抗頻譜(EIS)。
電化學阻抗頻譜
(EIS) 電化學阻抗頻譜為熟習此項技術者所熟知，且已長期用於研究電化學系統。對於阻抗量測，施用小正弦AC電壓探針(通常2-10 mV)，且確定電流反應。同相電流反應確定阻抗之實(電阻)分量，而異相電流反應確定虛(電容)分量。AC探針電壓應足夠小，使得系統反應係線性的，允許進行簡單之等效電路分析。阻抗方法非常有效，原因在於其能夠表徵廣泛不同的時間常數之物理化學過程，在高頻率下取樣電子轉移且在低頻率下取樣質量轉移。 阻抗結果通常與電阻器及電容器之等效電路擬合，該等效電路諸如經常用以解釋簡單電化學系統之Randles電路。Randles電路[Rs+CPE/(Rct+W)]之示意性圖示顯示於圖3中，其包含溶液電阻(Rs)，該溶液電阻與恆定相位元件(CPE)串聯且與電荷轉移電阻(Rct)及瓦爾堡(Warburg)擴散元件(W)並聯。 若分析物影響此等等效電路參數中之一或多者且此等參數不藉由干擾物種受影響，則阻抗方法可用於分析物偵測。 瓦爾堡阻抗可用以量測有效的擴散係數，幾乎不適用於分析性應用。最常適用於分析物偵測之等效電路元件係Rct及CPE。經量測電容通常起因於若干元件之系列組合，諸如分析物與金(Au)電極上之感測層結合。
電化學阻抗頻譜 ( EIS ) 裝置
EIS裝置通常包含具有以下之電化學電池： · 工作電極(WE) · 對立電極(CE) · 參考電極(RE) · 恆電位器/恆電流儀(PGSTAT) 視應用而定，儀器與電化學電池之連接可(或必須)以不同方式設置。 在恆電位模式中，恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)將精確控制對立電極(CE)針對工作電極(WE)之電位，使得工作電極(WE)與參考電極(RE)之間的電位差經明確界定，且對應於使用者所指定的值。在恆電流模式中，WE與CE之間的電流受控制。連續監測RE與WE之間的電位差及CE與WE之間的電流。藉由使用PGSTAT，藉由使用負反饋機制，在量測期間的任何時候，使用者所指定的值(亦即施加電位或電流)受到精確控制。 對立電極(CE)係用以關閉電化學電池中之電流電路之電極。其通常由惰性材料(例如，Pt、Au、石墨、玻璃態碳)製成且通常其不參與電化學反應。由於電流在WE與CE之間流動，因此CE(電子源/電子槽)之全部表面區域必須高於WE之區域，使得其將不為所研究的電化學製程之動力學之限制因素。 參考電極(RE)係具有穩定及熟知的電極電位之電極，且其用作電化學電池中之參考點以用於電位控制及量測。參考電極電位之高穩定性通常藉由採用具有氧化還原反應之恆定(緩衝或飽和)濃度之各參與者的氧化還原系統達成。此外，通過參考電極之電流接近零(理想地，零)，其藉由使用CE來關閉電池中之電流電路以及靜電計上之極高的輸入阻抗(＞ 100 GOhm)來達成。 工作電極(WE)係電化學系統中之正發生相關反應之電極。常見的工作電極可由惰性材料諸如Au、Ag、Pt、玻璃態碳(GC)以及Hg滴及膜製成。 EIS裝置亦可包括量測工作電極之電特性之變化的組件。舉例而言，此組件可為頻率分析器。頻率分析器可與恆電位器/恆電流儀連接。
CNT-FET 裝置
在一個實施例中，本發明之感測器裝置經組態以偵測CNT-FET設備之源極增益電流之變化。
碳奈米管場效電晶體 ( CNT - FET )
碳奈米管場效電晶體(CNT-FET)係如下場效電晶體：其利用單個碳奈米管或碳奈米管之陣列作為通道材料，來替代傳統之金屬氧化物半導體場效電晶體(MOS-FET)結構中之塊體矽。
CNT-FET 裝置
CNT-FET裝置通常包含： a) 源電極(SE) b) 汲電極(DE) c) 閘電極(GE)，及 d) 至少一個由碳奈米管(CNT)構成之通道 閘電極用以控制貫穿源電極及汲電極中之電流。當閘電極開啟時，電流能夠貫穿源電極及汲電極調節而通過通道。 電極通常由至少一種金屬構成。較佳之金屬包括但不限於：鉑、金、鉻、銅、鋁、鎳、鈀及鈦。 在一較佳實施例中，通道由碳奈米管構成。 CNT-FET裝置亦可包括量測源極汲極間電流之變化之組件。
QCM 裝置
在一個實施例中，本發明之感測器裝置經組態以偵測石英晶體微天平(QCM)中之共振器組件之共振振盪頻率的變化。 在一個實施例中，共振器組件係以下或由以下構成：壓電材料、至少一種壓電晶體及至少一種石英晶體。在一個較佳實施例中，共振器組件係石英晶體共振器。 在一個實施例中，石英晶體用金塗佈。
石英晶體微天平 ( QCM )
石英晶體微天平(QCM)技術為熟習此項技術者所熟知，且藉由量測石英晶體共振器之頻率變化來量測每單位面積之質量變化。因為在聲波共振器表面之氧化物生長/衰退或膜沈積，共振受添加或移除的小質量干擾。可在真空下、在氣相中及在液體環境中使用QCM。在測定分子(尤其蛋白質)與經識別位點官能化之表面之親和力時，其高度有效。QCM亦已用以研究生物分子間的相互作用。頻率量測易於具有高精確度，因此其易於量測降至低於1 μg/cm
2
水準之質量密度。除量測頻率以外，通常量測耗散因子(等於共振頻寬)以幫助分析。耗散因子係共振之倒品質因子(inverse quality factor)，Q
- 1
= w/f
r
；其量化系統之減振且與樣品之黏彈性質有關。 石英係經驗壓電效應之晶體家族的一個成員。施加電壓與機械變形間的關係係熟知的；此允許藉由電手段探測聲波共振。向石英晶體施加交流電將誘導振盪。在適當切割晶體的電極之間使用交流電，產生靜剪切波。Q因子為頻率與頻寬之比率，可高達106。此窄共振產生高度穩定的振盪器且在確定共振頻率中極精確。對於感測，QCM利用此容易性及精確度。常見的設備允許解析度在晶體上降至1 Hz，基本共振頻率在4-6 MHz範圍內。 石英晶體之振盪頻率部分地視晶體厚度而定。在正常操作期間，所有其他影響變數保持恆定；因此，厚度變化直接與頻率變化相關。在物質沈積於晶體表面上時，厚度增加；因此振盪頻率自最初值下降。在一些簡化假設下，使用Sauerbrey方程式，此頻率變化可定量且精確地與質量變化相關。
石英晶體微天平 ( QCM ) 裝置
QCM之典型設置含有水冷卻管、保留單元、經由微點引線(microdot feed-through)之頻率感測設備、振盪源以及量測及記錄裝置。 QCM由共振器組件(通常薄壓電板)組成，其中電極蒸發於兩側上。因壓電效應所致，貫穿電極之AC電壓誘導剪切變形且反之亦然。電機械偶聯提供一種藉由電學手段偵測聲共振之簡單方式。否則，其重要性較小。
本發明之感測器裝置
在第一態樣中，本發明提供一種感測器裝置，其包含與基板電連通之昆蟲氣味受體(OrX)，其中該感測器裝置經組態以偵測該基板之電特徵之變化。
感測器組件
在另一態樣中，本發明提供一種用於感測器裝置之組件，該組件包含與如本文所定義之基板電連通之OrX。此組件適用於添加至根據本發明之感測器裝置中。 在一個態樣中，本發明提供一種感測器裝置組件，其包含與基板電連通之昆蟲氣味受體(OrX)。 在一個態樣中，本發明作為包含本發明之感測器裝置組件之感測器裝置提供，其中感測器裝置經組態以偵測基板之電特徵之變化。 在另一態樣中，本發明提供一種製造感測器裝置組件之方法，該方法包括在昆蟲OrX與基板之間確立電連通的步驟。 在另一態樣中，本發明提供一種組裝感測器裝置之方法，該方法包含將本發明之感測器裝置組件添加至感測器裝置中，其中組裝之感測器裝置經組態以偵測基板之電特徵之變化。 在感測器裝置組件及感測器裝置之某些實施例中，昆蟲氣味受體(OrX)、電連通、基板、組態及偵測如本文所描述。
電化學阻抗頻譜 ( EIS ) 設備
在一個實施例中，感測器裝置包含電化學電池。 在一個實施例中，電化學電池包含至少兩個電極。 在另一實施例中，電化學電池至少包含： a) 工作電極(WE)，及 b) 對立電極(CE) 在一較佳實施例中，電化學電池亦包含參考電極(RE)。 在另一實施例中，電化學電池包含恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)。 在一較佳實施例中，電化學電池包含以下中之所有者： a) 工作電極(WE)， b) 對立電極(CE)， c) 參考電極(RE)，及 d) 恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)。
對立電極
在一個實施例中，對立電極由選自以下之材料構成或用選自以下之材料塗佈：鉑(Pt)、金(Au)、石墨或玻璃態碳(GC)。 較佳地，對立電極由鉑(Pt)構成。 較佳地，對立電極係鉑(Pt)線。
參考電極
較佳地，參考電極係銀/氯化銀(Ag/AgCl)參考電極。
工作電極
在一個實施例中，電化學阻抗頻譜(EIS)設備包含至少一個工作電極。 電極可由任何適合之材料構成或用任何適合之材料塗佈。電極可由選自以下之材料構成或用選自以下之材料塗佈：金(Au)、銀(Ag)、鉑(Pt)、碳奈米管(CNT)及玻璃態碳(GC)。 在一較佳實施例中，電極由金構成或用金塗佈。
恆電位器
/
恆電流儀
(PGSTAT) 較佳地，恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)以恆電位模式使用。
偵測器組件
在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。偵測器組件檢測或量測基板之電特徵之變化。 在一個實施例中，偵測器組件係頻率分析器。在另一實施例中，頻率分析器與恆電位器/恆電流儀(PGSTAT)連接。
昆蟲 OrX 之 製備
用於重組表現及純化昆蟲OrX之方法為熟習此項技術者所已知
14
。
昆蟲 OrX 之呈現
在另一實施例中，回應於與分析物之相互作用，OrX以能夠經受構形變化之形式存在。 在一個實施例中，昆蟲OrX存在於膜模擬物中。 如名稱所提出，膜模擬物模擬天然膜，且可以與活體內發現之構形相同或類似之構形負載受體。 膜模擬物可選自脂質體、兩性孔、清潔劑微胞、奈米囊泡、脂質雙層及奈米盤。 較佳地，膜模擬物係人工的。 在一個實施例中，膜模擬物係脂質體。 在一個實施例中，膜模擬物係人工脂質體。 在另一實施例中，膜模擬物係脂質雙層。 在另一實施例中，膜模擬物係人工脂質雙層。 用於將昆蟲受體重建於脂質體中之方法在此項技術中已知
14
。
在工作電極上之包含昆蟲 OrX 之脂質雙層之形成
不希望受理論所束縛，申請人假定在一些實施例中，當將脂質體中之昆蟲OrX施用至工作電極時，脂質體改變結構以在電極上形成脂質雙層。申請人假定昆蟲OrX以與活體內細胞膜中所發現之構形類似或相同的構形嵌入於脂質雙層中，使得受體之配位體/分析物結合域進入配位體/分析物。 不希望受理論所束縛，申請人假定在其他實施例中，脂質體在與工作電極結合時作為脂質體保留。此例示於圖21中。
OrX 與 基板之偶聯
在另一實施例中，OrX與基板偶聯。 用於將蛋白質與基板偶聯之諸多方法為熟習此項技術者所已知。此類方法包括使用共價化學偶聯、光化學交聯、表面塗佈/改質、金表面化學反應、蛋白質親和標籤、生物素-抗生蛋白鏈菌素聯接、抗體固定及經工程改造表面結合肽序列。 用於本發明裝置之OrX蛋白亦可包括胺基、組胺酸標籤或用以將蛋白質與基板偶聯之某其他官能化。在具有胺基之蛋白質的情況下，使用者可使用胺基來置換與基板偶聯之離去基，以便使蛋白質與基板結合。偶聯無需藉由親核試劑-離去基反應實現，因為偶聯可藉由共價鍵(例如醯胺鍵)、離子鍵、藉由氫鍵合或藉由金屬配位而發生。作為配位之一個實例，OrX蛋白可藉由組胺酸標籤與鎳之間的配位與基板偶聯。OrX蛋白亦可藉助於半胱胺酸殘基與基板偶聯。在一些實施例中，天然附接之OrX蛋白包括半胱胺酸殘基。此可為天然存在的或此類殘基可有意地併入天然或重組蛋白中。其他資訊可見於WO2012050646。 在一些實施例中，基板表面包含使基板與跨膜蛋白鍵聯之官能基。在一個非限制性實例中，材料表面可經羧化重氮鹽官能化，該等羧化重氮鹽自發地與諸如碳奈米管之基板形成共價鍵。認為胺及醯胺官能基適用作酚系/芳族官能基。
EIS 之 鍵聯劑
在另一實施例中，昆蟲OrX經由鍵聯劑與電極偶聯。 在一個實施例中，鍵聯分子足夠短以允許OrX與電極之間的電連通。 在另一實施例中，鍵聯分子足夠短以防止電極與受體分離。 在另一實施例中，鍵聯分子選自16-巰基十六烷酸(16-MHDA)、6-巰基十六烷酸(6-MHDA)及6-巰基己酸(MHA)。 在一較佳實施例中，鍵聯劑係6-巰基己酸(MHA)。 在另一實施例中，鍵聯劑係自組裝單(SAM)層的一部分。 因此，在一個實施例中，SAM層由6-巰基己酸(MHA)構成。 在另一實施例中，在偶聯昆蟲OrX之前活化MHA之羧基。 較佳地，在使昆蟲OrX與電極偶聯之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之溶液來活化MHA之羧基。
對分析物之偵測
在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲OrX之結合。 在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。 較佳地，對分析物之偵測係特異性的。 在另一實施例中，分析物與昆蟲OR之結合改變工作電極中之電化學阻抗。
碳奈米管場效電晶體 ( CNT - FET ) 設備
較佳地，碳奈米管場效電晶體(CNT-FET)設備包含至少兩個末端。在另一實施例中，CNT-FET設備至少包含源電極及汲電極。 在一個實施例中，CNT-FET設備包含： a) 源電極 b) 汲電極 c) 閘電極 d) 至少一個由碳奈米管(CNT)構成之通道 較佳地，閘電極係銀/氯化銀(Ag/AgCl)線。
偵測器組件
在另一實施例中，感測器包含偵測器組件。偵測器組件檢測或量測源極汲極間電流之變化。 可使用手動操作或在電腦控制下操作之習知電子儀錶來量測電特徵之變化。舉例而言，電腦化實驗室設置可能包括National Instrument PCI-6722 DAQ板以施加偏壓電壓及各個值之閘電壓。接著Keithley 6485微微電流計(Picoammeter)可用以量測電流，提供全I-Vg曲線。在希望量測位於單個基板上之許多裝置的情況下，可使用開關矩陣(Keithley 7001)或其他多工器。 Agilent 4156C參數分析器亦可用於所有電量測
20
。參數分析器具有極佳之靈敏性且可精確量測飛安(femto-amp)標度之電流。
昆蟲 OrX 之呈現
在另一實施例中，回應於與分析物之相互作用，OrX以能夠經受構形變化之形式存在。 在一個實施例中，昆蟲OrX存在於膜模擬物中。 如名稱所提出，膜模擬物模擬天然膜，且可以與活體內發現之構形相同或類似之構形負載受體。 膜模擬物可選自脂質體、兩性孔、清潔劑微胞、奈米囊泡、脂質雙層及奈米盤。 較佳地，膜模擬物係人工的。 在一較佳實施例中，膜模擬物係奈米盤。
本發明之 CNT - FET 裝置 中 OrX 與 通道之偶聯
在一個實施例中，OrX與呈通道形式之碳奈米管偶聯。
昆蟲 OrX 官能化
在一個實施例中，昆蟲OrX經官能化以促進與CNT之偶聯。 在一個實施例中，昆蟲OrX經his標籤官能化。 因此，在一個實施例中，OrX包含his標籤。 較佳地，his標籤處於OrX蛋白之N端。
CNT 官能化
在一個實施例中，CNT經官能化以促進與昆蟲OrX之偶聯。 在另一實施例中，CNT經鎳(Ni)-氮基三乙酸(NTA)官能化。
偶聯
在另一實施例中，OrX經由his標籤親和結合與CNT偶聯。 因此，在一個實施例中，his標記之Orx與Ni-NTA官能化CNT結合。
對分析物之偵測
在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲OrX之結合。 在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。 較佳地，對分析物之偵測係特異性的。 在另一實施例中，分析物與昆蟲OR之結合改變本發明之CNT-FET設備之通道的電源增益電流。
石英晶體微天平 ( QCM ) 設備
較佳地，
石英晶體微天平 ( QCM ) 設備
包含： a) 共振器組件 b) 振盪源組件 c) 頻率感測組件
共振器組件
在一個實施例中，共振器組件係以下各者或由以下各者構成：壓電材料、至少一種壓電晶體及至少一種石英晶體。在一較佳實施例中，共振器組件係石英晶體共振器。 在一個實施例中，石英晶體用金塗佈。 在一個實施例中，共振器組件具有附接至其相對側中之兩者之電極。 在一個實施例中，電極由金構成或用金塗佈。 在一較佳實施例中，共振器組件與至少一種昆蟲OrX電連通。
振盪源組件
在一個實施例中，振盪源組件經組態以向共振器組件施加交流電場。 在一個實施例中，交流電場經由附接至共振器組件之相對側的電極施加。
頻率感測組件
在一個實施例中，頻率感測組件經組態以量測共振器組件之振盪頻率。在一個實施例中，頻率感測組件經組態以量測共振器組件之振盪頻率之變化。
昆蟲 OrX 之呈現
在另一實施例中，回應於與分析物之相互作用，OrX以能夠經受構形變化之形式存在。 在一個實施例中，昆蟲OrX存在於膜模擬物中。 如名稱所提出，膜模擬物模擬天然膜，且可以與活體內發現之構形相同或類似之構形負載受體。 膜模擬物可選自脂質體、兩性孔、清潔劑微胞、奈米囊泡、脂質雙層及奈米盤。 較佳地，膜模擬物係人工的。 在一較佳實施例中，膜模擬物係脂質體。 在另一實施例中，膜模擬物係脂質雙層。 在另一實施例中，膜模擬物係人工脂質雙層。 用於將昆蟲受體重建於脂質體中之方法在此項技術中已知
14
。
在共振器組件上之包含昆蟲 OrX 之脂質雙層之形成
不希望受理論所束縛，申請人假定在一些實施例中，當將脂質體中之昆蟲OrX施用至工作電極時，脂質體改變結構以在共振器組件上形成脂質雙層。申請人假定昆蟲OrX以與活體內細胞膜中所發現之構形類似或相同的構形嵌入於脂質雙層中，使得受體之配位體/分析物結合域進入配位體/分析物。 不希望受理論所束縛，申請人假定在其他實施例中，脂質體在與工作電極結合時作為脂質體保留。此例示於圖21中。
用於 QCM 之 鍵聯劑
在另一實施例中，昆蟲OrX經由鍵聯劑與共振器組件偶聯。 在一個實施例中，鍵聯分子足夠短以允許OrX與共振器組件之間的電連通。 在另一實施例中，鍵聯分子足夠短以防止共振器組件與受體分離。 在另一實施例中，鍵聯分子選自16-巰基十六烷酸(16-MHDA)、6-巰基十六烷酸(6-MHDA)及6-巰基己酸(MHA)。 在一較佳實施例中，鍵聯劑係6-巰基己酸(MHA)。 在另一實施例中，鍵聯劑係自組裝單層(SAM)的一部分。 因此，在一個實施例中，SAM層由6-巰基己酸(MHA)構成。 在另一實施例中，在偶聯昆蟲OrX之前活化MHA之羧基。 較佳地，在使昆蟲OrX與電極偶聯之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之溶液來活化MHA之羧基。
對分析物之偵測
在另一實施例中，感測器能夠偵測分析物與昆蟲OrX之結合。 在另一實施例中，感測器能夠在環境中偵測與昆蟲OrX結合之分析物之存在。 較佳地，對分析物之偵測係特異性的。 在另一實施例中，分析物與昆蟲OrX之結合改變藉由施加至共振器組件之交流電場誘導之共振器組件的共振頻率。
偵測之靈敏性
如上文所論述，本發明之感測器出人意料地工作良好。申請人已顯示，本發明之感測器裝置比涉及使用昆蟲OR之任何已知分析之靈敏性高得多。 在一個實施例中，感測器可偵測以下濃度之分析物之存在：小於1x10
-3
M、較佳小於1x10
-3
M、更佳小於1x10
-4
M、更佳小於1x10
-5
M、更佳小於1x10
-6
M、更佳小於1x10
-7
M、更佳小於1x10
-8
M、更佳小於 1x10
-9
M、更佳小於1x10
-10
M、更佳小於1x10
-11
M、更佳小於1x10
-12
M、更佳小於1x10
-13
M、更佳小於1x10
-14
M、更佳小於1x10
-15
M、更佳小於1x10
-16
M、更佳小於1x10
-17
M、更佳小於1x10
-18
M。
動態範圍
在一個實施例中，為偵測分析物，感測器具有至少2、較佳至少3、更佳至少4、更佳至少5、更佳至少6、更佳至少7、更佳至少8、更佳至少9、更佳至少10數量級之分析物濃度之動態範圍。
感測器裝置中 Orco 之缺乏
使用昆蟲氣味受體之所有先前已知系統/分析利用昆蟲OrX與氣味劑輔受體(Orco)之組合。此指示在先前技術中，對OrX及Orco組分兩者之需求有著極強的偏向，以便產生具有呈適當組合形式之OrX/Orco之昆蟲氣味受體(OR)複合體，其能夠特異性結合同源配位體且轉導針對配位體結合的反應。 如先前所論述，(Orco及OrX之)昆蟲OR複合體形成配位體閘控之離子通道，且其通過在活體內轉導信號之離子通道轉運離子，且大概在先前技術之感測器系統/分析中。 因此，本發明之進一步且高度出人意料的特徵係本發明之感測器在不存在Orco輔受體下偵測配位體/分析物結合之能力。 在一個實施例中，感測器包含小於10:1、較佳小於1:1、較佳小於0.1:1、較佳小於0.01:1、較佳小於0.001:1、較佳小於0.0001:1、較佳小於0.00001:1之OrX:Orco之比率。 在一較佳實施例中，感測器不包括昆蟲氣味劑輔受體(Orco)。
本發明之感測器之其他優勢
在便利性、可攜性、穩定性、快速偵測、靈敏性及量測容易性方面，感測器或本發明提供優於先前已知的基於昆蟲OR之系統/分析之諸多其他電位優勢。
分析物介質
分析物可在氣態或液體介質中。
視情況選用之捕獲組件
感測器裝置可另外包含捕獲分析物且向受體呈現分析物之組件。在一些實施例中，此組件可適用於捕獲揮發性分析物用於向OrX呈現。此可涉及使用微通道以處理呈液相或氣相(
50
)之目標VOC。微流體系統已經設計以按液相(
51 、 52
)及氣相(
53 、 52 、 54
)向感測器表面遞送目標分子。
多工
本發明涵蓋使用多種不同OrX蛋白之多工途徑。以此方式，使用者可構築對多種分析物靈敏之多工裝置。此類多工裝置可包括幾十、數百或甚至數千之如本文所描述之感測器。多工裝置亦可包括與相同OrX偶聯之兩個或更多個感測器以便將雙檢驗引入裝置中。 本發明亦涵蓋具有各自包含不同或相同受體之多個感測器基板之晶片的用途。本發明之感測器裝置組件可為此類晶片。
使用本發明之感測器裝置之方法
本發明提供使用本發明之感測器裝置以偵測分析物及/或偵測環境中分析物之存在的方法，如上文所描述。
對照及校準
使用者可比較裝置之電特徵與當裝置暴露於對照、已知分析物或兩者時所量測之對應電特徵。使用者亦可估計樣品中一或多種分析物之存在。此可藉由比較樣品中所觀測到之電特徵與該電特徵之校準曲線來實現，該校準曲線對應於自具有已知量之相關分析物之對照或標準品收集之資料點。以此方式，使用者可估計存在於已接觸裝置之樣品中之分析物的濃度。 使用者可構築裝置之一或多種電特徵之庫，該一或多種電特徵對應於暴露於一或多種已知分析物之裝置暴露。舉例而言，使用者可構築表示當裝置暴露於各種濃度之分析物時觀測到之電特徵的結果庫。
製造本發明之感測器裝置之方法 感測器裝置
在另一態樣中，本發明提供一種製造感測器裝置之方法，該方法包括在昆蟲OrX與感測器裝置的基板之間確立電連通之步驟，其中感測器裝置經組態以偵測基板之電特徵之變化。 在一個實施例中，該方法包括使昆蟲OrX與基板偶聯之步驟。 在一個實施例中，使OrX與基板偶聯，之後將OrX偶聯之基板組裝於感測器裝置中。 較佳地，感測器之組件、偶聯及功能性係如本文所描述。
感測器組件
在另一態樣中，本發明提供一種用於生產感測器裝置之組件之方法，該組件包含與如本文所定義之基板電連通之OrX。該方法包含在OrX與基板之間確立電連通，如本文所描述。此組件適用於添加至根據本發明之感測器裝置中。 在另一實施例中，本發明提供一種用於生產感測器裝置之方法，該方法包含將該組件添加至其他組件中，如本文所描述，以生產根據本發明之感測器裝置。
製造本發明之 EIS 感測器裝置之方法
在實施例中，基板係如本文所描述之電化學電池之工作電極。 因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲OrX與電化學電池之工作電極之間確立電連通的步驟，其中電化學電池經組態以偵測工作電極之電化學阻抗之變化，由此形成感測器裝置。 藉助於實例，用於製造本發明之EIS裝置之適合方法描述於實例部分中。此實例不意欲限制本發明之範疇。
製造本發明之 CNT - FET 感測器裝置之方法
在實施例中，基板係如本文所描述之CNT-FET設備之通道。 因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲OrX與CNT-FET設備的通道之間確立電連通的步驟，其中CNT-FET設備之通道經組態以偵測CNT-FET設備之源極增益電流之變化，由此形成感測器裝置。 藉助於實例，用於製造本發明之CNT-FET裝置之適合方法描述於實例部分中。此實例不意欲限制本發明之範疇。
製造本發明之 QCM 感測器裝置之方法
在實施例中，基板係如本文所描述之石英晶體微天平(QCM)之共振器組件。 因此，在一個實施例中，方法包含在昆蟲OrX與石英晶體微天平(QCM)之共振器組件之間確立電連通的步驟，其中QCM經組態以偵測藉由施加至共振器組件之交流電場誘導之振盪的共振頻率的變化，由此形成感測器裝置。 藉助於實例，用於製造本發明之QCM裝置之適合方法描述於實例部分中。此實例不意欲限制本發明之範疇。
通用定義及方法 OrX 蛋白 / 多肽及片段
如本文所使用，術語「多肽」涵蓋具任何長度但較佳至少5個胺基酸之胺基酸鏈，包括全長蛋白質，其中胺基酸殘基藉由共價肽鍵而鍵聯。用於本發明之多肽較佳使用重組或合成技術部分地或整體地生產。 多肽之「片段」係較佳執行多肽之功能及/或提供多肽之三維結構的多肽子序列。 OrX多肽之「功能片段」係可執行結合分析物並在分析物結合時經受構形變化之功能之OrX的子序列，其中構形變化導致結合功能片段之基板之電特性發生變化。 術語「重組」係指在其天然背景中自其周圍序列移出及/或與不存在於其天然背景中之序列重組的聚核苷酸序列。 「重組」多肽序列藉由自「重組」聚核苷酸序列轉譯而產生。
變異體
OrX多肽之變異體係指與特異性鑑別之序列不同之多肽序列，其中一或多個胺基酸殘基缺失、經取代或添加。變異體可為天然存在之對偶基因變異體或非天然存在之變異體。變異體可來自相同或其他物種，且可涵蓋同源物、旁系同源物及直系同源物。在某些實施例中，經鑑別多肽之變異體擁有與本發明多肽或多肽之生物活性相同或類似的生物活性。較佳地，OrX多肽變異體可執行結合分析物並在分析物結合時經受構形變化之功能，其中構形變化導致結合功能片段之基板之電特性發生變化。 變異的多肽序列較佳展現與本發明之序列至少70%、更佳至少80%、更佳至少90%、更佳至少95%、更佳至少96%、更佳至少97%、更佳至少98%且最佳至少99%之一致性。較佳在經鑑別多肽之全部長度內計算一致性。 可按以下方式確定多肽序列一致性。使用bl2seq中之BLASTP (來自BLAST程式組，版本2.2.5 [Nov 2002])將本發明多肽序列與候選多肽序列相比較，BLASTP可公開購自ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/處之全球資訊網(World Wide Web)上之NCBI網站。 亦可使用全域序列比對程式在候選聚核苷酸序列與本發明聚核苷酸序列之間的重疊之全部長度內計算多肽序列一致性。如上文所論述，EMBOSS-needle (可在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/獲得)及GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235)亦為用於計算多肽序列一致性之適合的全域序列比對程式。 用於計算多肽序列一致性%之較佳方法係基於待使用Clustal X比較之比對序列(Jeanmougin等人, 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-405)。 在不顯著改變所描述多肽序列之生物活性的情況下，所描述多肽序列之一個或若干個胺基酸之保守取代亦包括於本發明中。熟習此項技術者將知曉用於產生表型沈默氨基酸取代之方法(參見例如Bowie等人, 1990, Science 247, 1306)。
用於生產多肽之方法
用於本發明之包括變異多肽之多肽可使用此項技術中熟知的肽合成方法來製備，諸如使用固相技術之直接肽合成(例如，Stewart等人, 1969, in Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California)，或自動化合成，例如使用Applied Biosystems 431A肽合成器(Foster City, California)。亦可在此類合成期間生產多肽之突變形式。 較佳地，多肽及變異多肽在適合之宿主細胞中重組表現，且自細胞分離，如下文所論述。用於表現多肽之聚核苷酸宜可藉由熟習此項技術者所熟知之方法合成。聚核苷酸序列可為天然存在的，或可自天然存在之序列調整，例如針對重組表現該序列之細胞，經由使用較佳之密碼子使用。
用於生產構築體及載體之方法
用於本發明之基因構築體包含一或多個編碼用於本發明之OrX多肽之聚核苷酸序列，且可適用於轉化例如細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物體。 用於生產並使用基因構築體及載體之方法在此項技術中已熟知，且通常描述於以下中：Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 Cold Spring Harbor Press, 1987；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987。
用於生產包含聚核苷酸、構築體或載體之宿主細胞之方法
包含聚核苷酸之宿主細胞適用於此項技術中熟知之方法(例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 Cold Spring Harbor Press, 1987；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987)，以重組生產用於本發明之多肽。此類方法可涉及在適當培養基中在適用於或有助於表現本發明之多肽的條件下培養宿主細胞。接著可視情況分泌於培養物中之經表現之重組多肽可藉由此項技術中熟知之方法(例如，Deutscher編, 1990, Methods in Enzymology, 第182卷, Guide to Protein Purification)自培養基、宿主細胞或培養物培養基分離。 如在本說明書中所使用的術語『包含(comprising)』意謂『至少部分由......組成』。當解譯本說明書中之包括術語『包含』的各表述時，亦可呈現除前面有術語之彼或彼等特徵以外的特徵。諸如『包含(comprise)』及『包含(comprises)』之相關術語將以相同方式解釋。 意欲對本文所揭示之數目的範圍(例如，1至10)的參考亦併入對該範圍內之所有合理數目(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9及10）以及該範圍內的合理數目之任何範圍(例如，2至8、1.5至5.5，及3.1至4.7)的參考，且因此，特此明確地揭示本文中明確揭示的所有範圍之所有子範圍。此等僅為特定意欲之實例，且所列舉之最低值與最高值之間的數值之所有可能組合將視為以類似方式明確地陳述於本申請案中。 應理解，替代實施例或組態可包括本說明書中所說明、描述或提及之部件、元件或特徵中之兩者或更多者的任何或所有組合。 本發明亦可在廣義上認為包括申請案說明書中個別地或共同地提及或指示之部件、元件及特徵，及任何兩個或更多個該等部件、元件或特徵之任何或所有組合。 對於熟習本發明所涉及之技術之人員，在不背離如所附申請專利範圍所定義的本發明之範疇的情況下，本身將提出構築的許多變化及本發明之廣泛不同實施例及應用。本文中揭露內容及描述純粹為說明性且不意欲在任何意義上為限制性的。在本文中提及在本發明所涉及之技術中具有已知等效物的特定整數時，此類已知等效物被視為併入本文中，如同個別地闡述一般。
實例
現將參考以下非限制性實例來說明本發明。 不意欲將本發明之範疇僅限於上述實例。如熟習此項技術者所瞭解，在不背離本發明之範疇的情況下，許多變化形式係可能的。
實例 1 - 具有電阻抗頻譜 ( EIS ) 之 本發明之感測器的例證 1.0 實驗方法 1.1 材料 N
-(3-二甲基胺基丙基)-
N
′-乙基碳化二亞胺(EDC)、
N -
羥基丁二醯亞胺(NHS)、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)球粒、6-巰基己酸(MHA)、二甲亞碸(DMSO)係購自Sigma Aldrich。除非另外陳述，否則所有水溶液用蒸餾水(Milli-Q 18.2 MΩ)製備，經由Microscience Hydraflon過濾器(0.22 µm)過濾且用N
2
沖洗10分鐘。1.6 mm金(Au)圓盤電極、鉑(Pt)螺旋形輔助電極及Ag/AgCl參考電極係購自BASI。
1.2 脂質體相關 OR 次單元之製備
使用磷脂溶液製備脂質體，該磷脂溶液藉由以下方式產生：在小玻璃管中在N
2
氣體流下蒸發含有以下之溶液：莫耳比係5:3:3:1之磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷脂醯膽鹼(PC)及膽固醇(CH)，接著在真空下乾燥1小時。 藉由渦旋5分鐘，隨後在Microson超音波細胞破碎儀(Medisonic, USA)上以20%功率音波處理五次，持續10-20秒，在各音波處理步驟之間將樣品置放於冰上1分鐘，來將此等脂質再懸浮於1 mL再水合緩衝液(10 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl)中。為促進形成脂質體，藉由將來自液氮之管轉移至40℃水浴進行10次冷凍/融化步驟。 接著藉由使用Avestin LiposoFAST擠出機單元(Avestin, Germany)使脂質溶液11次地穿過100 nm聚碳酸酯膜，來對脂質體定尺寸。以最終體積之10%添加甘油且將10 mg/mL之等分試樣快速冷凍於液氮中並儲存於 -80℃下。 純化之OR次單元
43
以與Geertsma等人(2008)
34
之方案類似的方式重建於合成脂質體中。 在使用其之前，將脂質體在冰上解凍且接著藉由在室溫下用0.2% CHAPS培育15分鐘而去穩定。接著將200 µg純化之氣味受體
14
添加至1 mg脂質體中，且在室溫下以10 rpm旋轉1小時。藉由四次添加25 mg Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad, USA)且在4℃下分別培育30分鐘、2小時、隔夜及再次2小時，來移除過量清潔劑。在各培育期後移除Bio-Beads。藉由以100,000 g 離心1小時來粒化OR整合脂質體，且將其再懸浮於500 µL的再水合緩衝液中。藉由密度梯度超速離心(DGU)使用Accudenz (Accurate Chemical & Scientific Corporation, USA)來評估OrX於脂質體中之整合。藉由添加相等體積之80% Accudenz溶液，將整合之脂質體引至40% Accudenz，置於超離心管之底部處，且用30% Accudenz溶液及DGU緩衝液(25 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 10%甘油)覆蓋。接著在4℃下以100,000 g使樣品離心4小時。在Accudenz DGU後，由於脂質體之密度低，因此脂質體將漂浮至梯度的頂部。
1.3 電極清洗
用氧化鋁糊狀物拋光2分鐘，在純乙醇中且接著在Milli-Q水中進行超音波處理，各自持續5分鐘，來清洗金圓盤(2 mm)電極。接著針對硫醇解吸附，各自在0.1M NaOH中在3端電化學電池中施加-1.4 V，持續30秒。再次將電極用氧化鋁糊狀物拋光2分鐘，在純乙醇中且接著在Milli-Q水中進行超音波處理，各自持續5分鐘。經由在0.5M H
2
SO
4
中在-0.2與1.6V之間以50 mV/sec之掃描速率循環，持續5次循環，來清洗任何保留的有機分子。
1.4 自組裝單層 ( SAM ) 製備及活化
將經清洗電極浸沒於6-巰基己酸(MHA)之2 mM乙醇溶液中隔夜。此後，經純乙醇及Milli-Q水處理電極。 藉由在28℃下在含有100 mM 1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)與50 mM N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之混合物的PBS (pH：6.5)溶液中，將電極培育60分鐘，來活化MHA之羧基。
1.5 脂質體培育
在-COOH活化後，在室溫下在100 µL之按1:100稀釋之含脂質體的PBS (pH 7.4)中，將電極培育20分鐘。接著將其用過量PBS (pH 7.4)溫和地沖洗。
1.6 目標氣味劑溶液製備及培育
在含有1% DMSO之PBS (pH 7.4)中稀釋目標溶液，得到128 pM、640 pM、3.2 nM、16 nM、80 nM、400 nM及2 µM之濃度。在相關氣味劑溶液中將電極各自培育5分鐘，且用PBS (pH 7.4)溫和地洗滌。 表1：氣味受體以及相關陽性及陰性配位體之清單.
1.7 電化學阻抗頻譜 ( EIS ) 量測
隨後在三端電化學電池中在100 kHz-0.2 Hz之間，在針對參考施加 -0.7V的情況下，進行EIS量測，該等電化學電池包含鉑(Pt)線作為對立電極(CE)、Ag/AgCl (3 M KCl，相較於SHE為+0.197 V)參考電極(RE)、及具有脂質體之1.6 mm金圓盤電極作為工作電極(WE)。在各氣味劑培育後，表面之電荷轉移電阻降低，且在添加2 µM氣味劑後保持不變。
2.0 結果
將乾淨的金表面與MHA一起培育隔夜，使得表面經-COOH基團官能化。接著經由NHS-EDC化學反應將攜載受體(Or35a、Or22a或Or10a)之脂質體共價連接於MHA (圖2)。在使用增加的濃度下培育目標(配位體)前後進行EIS量測。用於此研究之受體及配位體可見於表1。 預期受體-配位體相互作用改變總表面電荷且此類變化可在EIS下觀測到。圖3表示藉由隨後在經Or35a官能化之電極上培育配位體(E2-己烯醛)所導致的阻抗光譜演變。針對在此論文中所研究之所有類型的受體，在與增加量之配位體相互作用時，電極阻抗降低。 藉由將所獲得資料與Randles等效電路[R
s
+CPE/(R
ct
+W)]擬合來計算電極之電荷轉移電阻(R
ct
)，該電路包含溶液電阻(R
s
)，該溶液電阻與恆定相位元件(CPE)串聯且與電荷轉移電阻（R
ct
)及瓦爾堡擴散元件並聯。接著將
R ct
之所獲得值歸一化成
R0 ct
(ΔR
ct
)，其中
R0 Ct
表示配位體培育之前的電極。藉由將感測器反應定義為ΔR
ct
/R
0 ct
相對於log[
C
(配位體)]，獲得校準曲線(圖4)。 圖4揭露偵測之再現性，其由相對較小之誤差棒突顯，獲自感測實驗之3次重複(or10a及or35a)以及2次重複(or22a)。所獲得感測器擁有在3-4個數量級之動態範圍內之極低偵測極限。當認為信號/背景變化(雜訊)為＞3
35 - 38
時，氣味劑之最低可偵測濃度經計算針對Or10a為3.3 ×10
- 10
M水楊酸甲酯，針對Or35a為3.6 × 10
- 11
M E2-己烯醛且針對Or22a為 2.8 × 10
- 10
M己酸甲酯。此等偵測極限大大低於氣味劑結合蛋白在不使用脂質體的情況下直接固定於感測器表面上之先前研究之偵測極限。舉例而言，在氣味劑結合蛋白(BdorOBP2)直接固定於金基板上的情況下，針對後蜂費洛蒙(queen pheromone) (苯甲酸甲基-對羥基酯)、警報費洛蒙(乙酸異戊酯)、沈香醇、香草醇、β-紫羅蘭酮、4-烯丙藜蘆素、苯乙醛、鄰苯二甲酸二丁酯，感測器提供大約微莫耳(10
- 6
M)之偵測極限
39
。在另一研究中，將含有果蠅(
Drosophila
) OBP LUSH之序列之肽溶液再次直接固定於金表面上，且針對1-己醇實現4.9 10
- 5
M之偵測極限，針對3-甲基丁醇實現5.6 10
- 5
M之偵測極限
40
。在最新的研究中，碳奈米管而非金用作感測元件且再次在無任何介質的情況下直接固定OBP蛋白
41
。作者報導到，可偵測到1.8 × 10
- 2
M 2-庚酮及0.52 × 10
- 10
M TNT。 藉由使用各感測器之線性範圍之斜率(最低的三種濃度)計算所獲得感測器之靈敏性
36 、 42 、 38
，且發現靈敏性針對Or10a為0.313 U/[log (conc/M)]，針對Or35a為0.116 U/[log (conc/M)]且針對Or22a為0.156 U/[log (conc/M)]。
3.0 論述
在將6-巰基己酸(MHA)鑑別為具有理想長度以將脂質體結合於金電極表面上之鍵聯劑之前，申請人最初測試了不同的自組裝單層(SAM層)。先前，16-巰基十六烷酸(16-MHDA)用以使金表面官能化且將脂質體結合於金電極上。來自該實驗之結果不顯示高靈敏性，表明脂質體離電極表面太遠而不能給出可偵測信號。為克服該障礙，申請人改為使用更短的6-巰基己酸。申請人假定，更短之此鍵聯劑將使金與脂質體之間的電子轉移更快，因此，可以更靈敏的方式監測表面上發生之任何事件。在將哺乳動物氣味受體固定於粗細胞膜中之兩個論文的情況下，其使用16-巰基十六烷酸(16-MHDA)
34
或6-巰基十六烷酸(6-MHDA)
14
用於SAM形成。 比較資料顯示，與已與昆蟲氣味受體一起使用之其他感測器型式相比，如此處所揭示之昆蟲OR-EIS生物感測器型式更靈敏。 表2概述基於氣味受體之裝置之公開資料。與基於細胞之感測器相比，本發明裝置提供在100-10,000倍之間的更大靈敏性。 表2：對昆蟲氣味受體感測器裝置資料之比較.
*指示值已自繪製於所引用參考文獻中之曲線圖上之劑量反應資料的視覺評估而估計。 表3概述獲自細胞分析之資料。與在HEK293細胞及非洲爪蟾卵母細胞中表現之OrX/Orco相比，本發明昆蟲OrX-EIS感測器資料更靈敏。注意在此等系統中，一些費洛蒙受體(PR)展現比普通氣味受體低得多的靈敏性，此為預期的，因為此等受體經細調成其費洛蒙目標分子。 表3：對昆蟲ORX/Orco細胞分析資料之綜述.
*指示值已自繪製於曲線圖上之劑量反應資料之視覺評估而估計。
實例 2 - 具有碳奈米管 - 場效電晶體 ( CNT - FET ) 之 本發明之感測器的例證 1. 概述
申請人已使用昆蟲OrX序列生產了方便、靈敏的感測器裝置。嵌入於奈米盤
55 、 56
中之黑腹果蠅OR35a
43
昆蟲OrX受體經由1-芘丁酸丁二醯亞胺基酯(PBASE)及聚組胺酸官能化在CNT FET上官能化。以即時電流量測模式，以1 fM濃度開始，CNT FET已顯示針對目標配位體E-2-己烯醛之清晰的電子反應。藉由測試OR35a官能化CNT FET反應來驗證結合之特異性，以控制材料、PBS及己酸甲酯。為進一步確保特異性，亦測試初始CNT FET及空奈米盤官能化之CNT FET針對E-2-己烯醛之反應。 2. 實驗方法 2.1 碳奈米管電晶體裝置製造 為製造碳奈米管場效電晶體(CNT FET)感測器平台，使用溶液沈積途徑在無界面活性劑的情況下將CNT首先沈積於SiO
2
/Si基板(SiO
2
=100 nm)上。
58 、 59
經由音波處理一小時，將尖鑷尖端量的CNT貝克(bucky)紙(99.9% IsoNanotube-S，來自NanoIntegris)分散於二氯苯(DCB)中。如圖5(a)中所示，經由聚二甲基矽氧烷(PDMS)衝壓方法，將SiO
2
基板經2-硫醇-吡啶(Sigma aldrich)之薄層官能化
58 、 59
。如圖5(b)中所示，接著將2-硫醇-吡啶官能化之SiO
2
/Si基板浸沒於CNT DCB懸浮液中，持續在30分鐘至6小時範圍內之時間
58 、 59
。浸沒時間允許吾等控制CNT薄膜網絡形態。自CNT懸浮液移出基板且在乙醇中清洗並在乾淨的N
2
中乾燥。結果係覆蓋整個基板表面之均一薄膜CNT網絡。 由於整個基板塗有CNT，因此控制將形成FET裝置之活性通道之CNT的位置係必需的。為此，用光致抗蝕劑塗佈CNT膜，之後使用光學光刻在受控位置處圖案化。光致抗蝕劑塗佈之CNT形成受保護之CNT FET通道區。接著使用反應性離子蝕刻(Oxford Instruments Plasmalab 80)來蝕刻掉暴露之CNT。蝕刻條件係600毫托、200瓦、40 sccm O
2
流量及3分鐘之蝕刻時間。此產生保留在受控位置處之100 µm (長度)× 100 µm (寬度)之CNT薄膜區。接著藉由第二光刻步驟、隨後蒸發Cr/Au (5 nm/50 nm)電極且剝離來界定源電極及汲電極。該製程示意性地存在於圖6中。 最後，藉由光刻用AZ1518光致抗蝕劑囊封電極以充當電絕緣槽，在感測實驗期間其防止漏電電流及電極損害，圖7。 在電極囊封後，暴露之CNT區變成100 µm (寬度)× 10 µm (長度)，且此最終係裝置之活性感測區
20
。接著在200℃熱板上烘烤光致抗蝕劑囊封之CNT FET裝置10分鐘，且逐漸冷卻至室溫。如圖8中所示，接著將手工聚二甲基矽氧烷(PDMS)槽持久性地附接至基板以用於CNT FET官能化及電測試。
2.2 嗅覺受體固定 2.2.1 碳奈米管之非共價官能化
為了在不破壞CNT之電子特性的情況下將嗅覺受體固定在CNT表面上，選擇非共價官能化途徑。OrX官能化係經由his標籤化學反應，其中CNT表面最初經1-芘丁酸丁二醯亞胺基酯(PBASE) (95%純度，Sigma Aldrich)官能化。在二甲亞碸(DMSO)溶劑中以10 mM濃度製備PBASE溶液，且以1600 rpm攪拌30秒，直至PBASE完全溶解於DMSO中。在室溫下歷時一小時將120 µl PBASE溶液添加至PDMS測試槽中。在PBASE官能化後，為洗去過量PBASE，在純DMSO溶劑中清洗CNT FET三次。為自裝置基板移除殘餘DMSO，在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，pH = 7.4)中洗滌樣品三次。
2.2.2 氮基三乙酸官能化
接著藉由浸沒於11.3 mM濃度之氮基三乙酸(NTA，Mw~191.14 g/mol)溶液中2小時，將PBASE官能化之CNT FET經NTA官能化。自100 mM NTA儲備溶液(儲備溶液在不使用時通常保持在4℃冰箱下)稀釋PBS中之11.3 mM NTA，且在室溫下將120 μl NTA溶液添加於PDMS槽中用於官能化。藉由在PBS中洗滌三次，隨後浸泡於去離子水(DI水，18.2 Ω·cm)中至少1小時，來清洗過量NTA。
2.2.3 硫酸鎳官能化
在11.3 mM硫鎳酸(NiSO
4
，Mw~154.76 g/mol)溶液中將NTA官能化之CNT培育30分鐘。自100 mM NiSO
4
儲備溶液(儲備溶液在不使用時保持在4℃冰箱下)稀釋PBS中之11.3 mM NiSO
4
。在室溫下將120 μl NiSO
4
溶液添加於PDMS槽中用於官能化。藉由在PBS中洗滌三次移除過量NiSO
4
。
2.2.4 嗅覺受體官能化
經由his標籤親和結合將OR/奈米盤
55 、 56
固定於Ni-NTA官能化之CNT FETs上。為製備奈米盤溶液，本體OrX/奈米盤溶液係在PBS緩衝液中以1:10或1:100之稀釋度稀釋。為作1:10稀釋，將10 μl奈米盤儲備溶液添加於100 μl PBS中。為作1:100稀釋，將1 μl奈米盤儲備溶液添加於100 μl PBS中。OrX/奈米盤儲備溶液在不使用時通常儲存於-80℃冰箱中或儲存於-20℃冰箱中長達一週。將稀釋之奈米盤添加於PDMS槽中，且接著在室溫下將整個CNT表面浸沒於奈米盤中30分鐘用於官能化。在官能化過程後，藉由在PBS中洗三次清洗過量奈米盤。
2.3 電量測
為了進行電量測，經由微操作器以及Rucker及Kolls探針台，將裝置設置PDMS槽及源電極、汲電極及閘電極，如圖9中所示。在開始電量測之前，將100 µl的PBS緩衝液(含有1% DMSO)添加於測試槽中。閘電極係Ag/AgCl線(活體內度量)包覆在塑膠中，其中Ag/AgCl末端之暴露區完全插入PBS緩衝液中，以避免已知當改變閘電極之活性區時發生之任何電假像。Agilent 4156C參數分析器用於所有電量測
20
。該參數分析器具有極佳之靈敏性且可精確量測飛安(femto-amp)標度之電流。 在轉移(V
lg
-I
ds
)量測期間，閘電壓(V
lg
)係在-500 mV至+1 V之間掃描，且將源極汲極間電壓(V
ds
)設定為固定值(50 mV、100 mV或200 mV)。針對吾等即時感測量測，將V
lg
設定為0且將V
ds
設定為固定值(50 mV、100 mV或200 mV)，時間步驟係1秒。
2.4 配位體稀釋
自吾等100 mM儲備溶液將E-2-己烯醛配位體溶液稀釋至感測實驗所需之濃度範圍。為製備於DMSO中之100 mM E-2-己烯醛儲備液，吾等取得5 μl體積之8.4 M E-2-己烯醛(購自Sigma Aldrich)且在415 μl DMSO中混合，且在不使用時在冰箱中儲存在4℃。為進一步將溶液稀釋至測試範圍，使用PBS緩衝液。於PBS(含有1% DMSO)中之E-2-己烯醛之量測範圍係1 fM - 1 nM (10倍增加)或64 pM-200 nM (5倍增加)。在即時量測期間，PBS溶液(含有1% DMSO)最初添加作為對照，且另外以增加的濃度添加分析物。
3. 結果及論述 3.1 OR35a / 奈米盤官能化後 CNT FET 之轉移特性
在進行感測量測之前，量測CNT FET轉移特性以確定官能化製程的成功。圖10比較OR35a奈米盤官能化之CNT FET(圓形)與初始CNT FET(方形)，其中顯而易見，在OR35a奈米盤官能化後，臨限電壓朝向負電壓方向移位。正向
I - V
掃描之臨限電壓自0.6 V(初始)移位至0.42 V(使用OR35a奈米盤)。此有可能係由於來自Ni
+
(NiSO
4
)之正電荷之靜電閘控作用以及由附接在CNT側壁上之奈米盤散射之載波
60
。類似於吾等先前研究，當系留至CNT之適體之負電荷引起臨限電壓正移位
58 、 61
時，此證明OrX/奈米盤成功地固定。針對成功地用OR官能化之CNT FET，臨限電壓始終在負電壓方向上移位。
3.2. OR35a 奈米盤及配位體結合 3.2.1. 經 OR35a 奈米盤 ( 1 : 10 稀釋度 ) 官能化之 CNT FET
如上文所描述，用OR35a奈米盤以1:10稀釋度使CNT FET官能化。將PBS緩衝液添加至測試槽中，接著以64 pM、320 pM、1.6 nM、8 nM、40 nM及200 nM之順序每3分鐘添加E-2-己烯醛，同時不斷地監測裝置之源極汲極間電流。在圖11(a)中，添加PBS緩衝液時電流增加地較小，然而在暴露於64 pM E-2-己烯醛後電流顯示即刻較大的降低。此電流降低係由於OR35a與E-2-己烯醛之結合改變了對CNT FET之有效閘 控
58 、 60 、 62
。在分別暴露於320 pM、1.6 nM、8 nM及40 nM E-2-己烯醛時，觀測到電流進一步降低。 圖11(b)顯示歸一化電流反應電流對E-2-己烯醛濃度之依賴性。基於圖11(a)中之即時量測，藉由ΔI = I - I
0
計算電流ΔI的變化，其中I係暴露於E-2-己烯醛後之穩定化電流，且I
0
係將64 pM E-2-己烯醛添加至測試槽中之前的最初電流。在64 pM下，ΔI/I
0
變化10%。為獲得類S朗繆爾(Langmuir)吸附曲線，需要更低的濃度及更多的量測，因為此處吾等最初量測係用64 pM濃度之E-2-己烯醛進行。此處，在將更高濃度之E-2-己烯醛添加至裝置槽中時，ΔI/I
0
繼續增加。
3.3 對照實驗
為確保電流反應真實地來自OR35a與E-2-己烯醛之結合，進行對照實驗。此等量測係來自初始CNT FET及經空奈米盤官能化之CNT FET之E-2-己烯醛反應。在圖12中繪製即時電流量測以顯示該比較。
3.3.3 驗證 OR35 奈米盤不針對對照配位體反應
在此情況下，亦量測OR35a奈米盤對非特異性配位體己酸甲酯之電反應，圖13。圖13中之經量測濃度範圍係70 nM至500 µM，高於圖12中之E-2-己烯醛濃度之量測範圍。不同於圖11中所存在之結果，在圖11中在添加E-2-己烯醛時觀測到清晰的類步驟反應且電流在3分鐘後達到穩定，在圖13中對己酸甲酯配位體之即時量測顯示隨時間之背景漂移電流但反應不清晰。
4. 結論
基於電子裝置平台，此研究已證實OR35a之識別能力及有前景的嗅覺生物感測器應用。在用Ni-NTA使CNT官能化後，經由聚組胺酸標籤使嵌入於奈米盤中之OR35a在CNT FET上官能化。Ni-NTA鍵聯於PBASE官能化之CNT FET之N-羥基丁二醯亞胺基團上。藉由使用此方法，OR35a奈米盤官能化之CNT FET證實對64 pM E-2-己烯醛配位體具有即時反應且對PBS緩衝液不反應。與來自初始CNT FET以及空奈米盤官能化之CNT FET之結果相比，未觀測到對E-2-己烯醛之清晰的電流反應。OR35a之特異性結合亦已藉由測試對PBS及來自OR35a官能化CNT FET之對照配位體己酸甲酯之反應得到驗證。OR35a奈米盤官能化之CNT FET已證實對E-2-己烯醛之即時偵測具特異性及靈敏性。 比較資料顯示，與已與昆蟲氣味受體一起使用之其他感測器型式相比，此處所揭示之昆蟲OrX-CNT-FET生物感測器型式更靈敏。 表4概述基於氣味受體之裝置之公開資料。吾等估計與基於細胞之感測器相比，本發明裝置提供在100-10,000倍之間的更大靈敏性。 表4：對昆蟲氣味受體感測器裝置資料之比較.
*指示值已自繪製於所引用參考文獻中之曲線圖上之劑量反應資料的視覺評估而估計。 表3概述獲自細胞分析之資料。與在HEK293細胞及非洲爪蟾卵母細胞中表現之OrX/Orco相比，本發明昆蟲OrX-CNT-FET感測器資料更靈敏。注意在此等系統中，一些費洛蒙受體(PR)展現比普通氣味受體低得多的靈敏性，此為預期的，因為此等受體經細調成其費洛蒙目標分子。
實例 3 - 具有碳奈米管 - 場效電晶體 ( CNT - FET ) 之本發明之感測器的進一步例證 1. 概述
申請人已使用昆蟲OrX序列進一步例示了方便、靈敏的感測器裝置。將四種黑腹果蠅OrX受體(Or10a、Or22a、OR35a及Or71a)
43 、 63
各自嵌入於奈米盤
55 、 56
中，且在其他最佳化條件下經由1-芘丁酸丁二醯亞胺基酯(PBASE)及胺基反應(存在於OrX及膜骨架蛋白上)在CNT FET上官能化。以即時電流量測模式，以1 fM濃度開始，OrX官能化之CNT FET中之每一者已顯示對其目標配位體(Or10a對水楊酸甲酯，Or22a對己酸甲酯，Or35a對E-2-己烯醛及Or71a對4-乙基愈創木酚)之清晰的電子反應。藉由測試各OrX官能化之CNT FET反應來驗證結合之特異性，以控制材料、PBS及非反應配位體。為進一步確保特異性，亦測試初始CNT FET及空奈米盤官能化之CNT FET針對目標配位體之反應。 2. 實驗方法
2.1 材料
膜骨架蛋白MSP1E3D1係購自Cube Biotech (#26152)且於水中再懸浮至5 mg/mL。1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)係購自Avanti polar lipids (#850457)，且將於氯仿中之100 mg/mL儲備溶液儲存於-20℃下直至需要。
2.2 碳奈米管電晶體裝置製造
在此實驗組中，使用簡單溶液沈積途徑及標準光刻技術，在SiO
2
/Si基板(SiO
2
=100 nm)上製造隨機通道CNT FET感測器平台。
20 、 21
首先，使用超音波處理在無水1,2-二氯苯(DCB)中製備SWNT懸浮液。將99%半導體級SWNT貝克紙(Nano Integris)稱量且分散DCB於以獲得5 µg/ml懸浮液。對分散體進行音波處理直至獲得澄清溶液。在整個音波處理過程中將溫度保持在25℃下。接著如圖5(a)中所示，藉由簡單衝壓方法，用硫醇吡啶分子使SiO
2
/Si基板官能化。藉由將10 mg 2-巰基吡啶(99%，Sigma Aldrich)溶解於1 ml甲醇中來製備硫醇吡啶溶液。以2000 rpm將該溶液旋塗於聚二甲基矽氧烷(PDMS)表面上，持續一分鐘。在旋塗過程之前，藉由50 W氧電漿清洗PDMS表面1分鐘以提高可濕性。將經清洗基板倒置地放置於PDMS表面上三分鐘，且在乙醇中洗滌以移除過量的硫醇吡啶分子。接著將基板轉移於CNT懸浮液中且浸沒於懸浮液中10分鐘。自懸浮液移出樣品且再浸漬於乙醇中10分鐘以移除SWNT網絡中之硫醇吡啶分子。藉由界定標記物藉由光刻及熱蒸發5 nm鉻及50 nm金來沈積對準標記物。藉由丙酮浸沒15分鐘隨後異丙醇(IPA)洗滌及N
2
吹乾來進行金屬剝離。結果係覆蓋整個基板表面之均一薄膜CNT網絡。 如實例2部分2.1中所描述，用光致抗蝕劑塗佈CNT膜且隨後圖案化，且用光致抗蝕劑囊封電極。
2.2 嗅覺受體固定 2.2.1 純化之 OR 次單元之製備
純化程序係詳述於Carraher等人2013
14
中之程序之變化形式。為his標籤親和純化來自桿狀病毒(baculovirus)感染之Sf9細胞之蛋白質，用桿狀病毒以0.1之MOI感染2 × 10
6
mL
- 1
之500 mL細胞且在27℃下培育72小時。藉由在室溫下以3800
g
離心10分鐘來收集細胞集結粒，且接著再懸浮於40 mL具有25 U/mL核酸酶(Benzonase)之再懸浮緩衝液A (20 mM Tris/HCl pH 7.5，100 mM NaCl，1×蛋白酶抑制劑混合液(Roche Diagnostics GmbH, Germany))中，接著藉由在10,000-15,000 psi下兩次通過Emulsiflex C5乳化器(Avestin, Germany)而裂解。接著以1000
g
將樣品離心5分鐘以移除整個細胞及核。移出上清液且在4℃下以100,000 g旋轉1小時。將膜集結粒再懸浮於40 mL具有1% w/v清潔劑(Zwittergent 3-16)之緩衝液A中，且在室溫下以10 rpm旋轉1小時。接著在18℃下以100,000 g離心樣品1小時。移出上清液且負載於1 mL NiNTA管柱(GE Healthcare)上，其中zwittergent 3-16清潔劑與Fos-Choline 14 (FC-14)進行交換。在具有300 mM NaCl及20 mM咪唑之十管柱體積之緩衝液B (20 mM Tris/HCl pH 7.5，3.6 mM FC-14)中洗滌管柱，且再用具有100 mM NaCl及50 mM咪唑之十管柱體積之緩衝液B洗滌。用具有100 mM NaCl及500 mM咪唑之四管柱體積之緩衝液B溶離蛋白質。在考馬斯染色SDS-PAGE凝膠及西方墨點法上評估純度。 用最終尺寸排阻層析法(SEC)步驟完成純化。將來自NiNTA純化之溶離級分彙集且以20,000 g離心5分鐘以移除聚集體及污染物。接著將5 mL樣品注射於附接至Akta-Pure層析系統(GE Healthcare)之Superdex 200 16/60管柱(GE Healthcare)上。在具有100 mM NaCl之緩衝液B中以1 mL/min運行樣品，且使用100 kDa MWCO Vivaspin2過濾器單元(Sartorius, Goettingen Germany)收集並濃縮2 mL級分且儲存於-80℃下。
2.2.2 奈米盤相關 OR 次單元之製備
使用自Bayburt等人2010及2003
55 、 56
修改之方案製備奈米盤。以1:0.2:150之MSP:蛋白質:脂質比率形成奈米盤。自100 mg/mL儲備液移出所需量之脂質且在恆定的氮氣流下乾燥，接著進一步在真空下乾燥隔夜。將脂質再懸浮於所需體積之緩衝液(20 mM Tris/HCl pH 7.5，100 mM NaCl，50 mM膽酸鈉)中且音波處理，產生20 mg/mL濃度之透明脂質儲備液。在所需比率下將清潔劑緩衝液中之純化之氣味受體蛋白與MSP1E3D1及POPC脂質混合且在冰上培育1小時。為藉由自系統移除清潔劑而引發重建，以1:1重量:體積比率將生物珠粒SM2 (Bio-Rad #1523920)添加至樣品中，且在4℃下在恆定旋轉下將混合物培育隔夜。接著移除生物珠粒且將經合併奈米盤冷凍在-80℃下直至需要。 藉由考馬斯染色SDS-PAGE凝膠確認合併。藉由考馬斯染色SDS-PAGE凝膠，將在添加生物珠粒前之重建混合物之樣品與在生物珠粒培育步驟後之樣品進行比較，明顯地鑑別出MSP1E3D1及OR條帶。若OR蛋白不併入奈米盤中，則藉由生物珠粒移除清潔劑將引起OR蛋白沈澱，且因此在生物珠粒培育後OR將不存在於樣品中。
2.2.3 碳奈米管之共價官能化
為了將嗅覺受體奈米盤固定於CNT表面上，選擇共價官能化途徑。OR官能化係經由胺/酯反應實現，其中CNT表面最初經1-芘丁酸丁二醯亞胺基酯(PBASE) (95%純度，Sigma Aldrich)官能化。為此，在室溫下歷時一小時將120 µl體積之PBASE溶液添加至CNT通道中。藉由超音波處理一分鐘在甲醇中以10 mM濃度製備PBASE溶液。在PBASE官能化後，為洗去過量PBASE，在甲醇中清洗CNT FET三次。為移除殘餘甲醇，在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，pH =7.4)中將裝置洗滌三次。 經由對存在於膜骨架蛋白(MSP)及組成OR相關奈米盤之OR次單元上之胺基具有特異性的胺/酯反應，將OR奈米盤固定化於PBASE官能化之CNT FET上。為製備奈米盤溶液，在PBS緩衝液中以1:100稀釋度稀釋本體OR奈米盤溶液。在不使用時OR奈米盤儲備溶液通常儲存於-80℃冰箱中。將稀釋之奈米盤添加於PDMS槽中，且接著在室溫下將整個CNT表面浸沒於奈米盤中30分鐘用於官能化。在官能化過程後，藉由在PBS中洗滌三次移除過量奈米盤。
2.2.4 膜表徵
原子力顯微鏡係用於表徵CNT膜形態。使用奈米surfe (NaioAFM)且以輕敲模式獲取影像。在奈米盤官能化前後表徵膜。
2.2.5 電量測
如實例2部分2.3中所描述進行電量測，其中有以下變化。閘電極係Ag/AgCl線(BASi，MF 2052)。在轉移(V
lg
-I
ds
)量測期間，閘電壓(V
lg
)在 -500 mV至+1 V之間掃描，且將源極汲極間電壓(V
ds
)設定為100 mV。針對吾等即時感測量測，將V
lg
設定為0且將V
ds
設定為100 mV，時間步驟係1秒。 自100 mM儲備溶液將配位體溶液稀釋至感測實驗所需之濃度範圍。使配位體之儲備溶液在DMSO中達至100 mM濃度，且在不使用時儲存於4℃下。為進一步將溶液稀釋降至測試範圍，使用PBS緩衝液。PBS (含有1% DMSO)中之配位體之量測範圍係1 fM-10 pM (增加10倍)。在即時量測期間，將PBS溶液(含有1% DMSO)最初作為對照添加，且在增加的濃度下另外添加分析物。
2.2.6 配位體稀釋
自100 mM儲備溶液將配位體溶液稀釋至感測實驗所需之濃度範圍。使配位體之儲備溶液在DMSO中達至100 mM濃度，且在不使用時儲存於4℃下。為進一步將溶液稀釋降至測試範圍，使用PBS緩衝液。PBS (含有1% DMSO)中之配位體之量測範圍係1 fM-10 pM (增加10倍)。在即時量測期間，將PBS溶液(含有1% DMSO)最初作為對照添加，且在增加的濃度下另外添加分析物。
3.0 結果 3.1 OrX - 奈米盤共價官能化後 CNT FET 之轉移特性
圖14a顯示對OrX相關奈米盤中之每一者的考馬斯染色SDS-PAGE凝膠分析，且初始CNT及OrX奈米盤官能化之CNT之實例AFM影像確認OrX奈米盤固定至CNT (圖14b)，注意白點在CNT上。圖15a比較OR10a奈米盤官能化之CNT FET (藍線)與初始CNT FET (黑線)，其中顯而易見，在OR10a奈米盤官能化後，臨限電壓朝向負電壓方向移位。如實例2部分3.1中所描述，此證明OrX-奈米盤成功地固定。如圖16a、17a及18a中所顯示，CNT FET成功地分別經Or22a、Or35a及Or71a官能化，臨限電壓始終在負電壓方向上移位。
3.2. OrX 相關奈米盤及對應配位體結合 3.2.1. 經 OrX 奈米盤 ( 1 : 100 稀釋度 ) 共價官能化之 CNT FET
圖15(b)顯示添加PBS緩衝液時藉由OR10a奈米盤(1:100稀釋度)共價官能化之CNT FET的電流增加地較小，而在暴露於增加之水楊酸甲酯添加後電流顯示一致較大的降低。此電流降低係由於OR10a與水楊酸甲酯之結合改變對CNT FET之有效閘控
58 、 60 、 62
。圖15(c)顯示在添加增加量之水楊酸甲酯時，經空奈米盤(1:100稀釋度)共價官能化之CNT FET的電流不增加，確認Or10a在結合水楊酸甲酯中之作用。圖15(d)顯示歸一化電流反應電流對水楊酸甲酯濃度之依賴性，其中針對對照配位體E2-己烯醛，未觀測到反應。圖15(e)顯示經空奈米盤(1:100稀釋度)共價官能化之CNT-FET之歸一化電流反應無變化。圖15(d及e)指示針對水楊酸甲酯，藉由Or10a奈米盤展現之偵測極限低於1 fM。 針對分別經Or22a (目標配位體-己酸甲酯、對照配位體-E2-己烯醛)、Or35a (目標配位體-E2-己烯醛、對照配位體-己酸甲酯)及Or71a (目標配位體-4-乙基愈創木酚)共價官能化之CNT FET，圖16、17及18顯示類似結果，且指示針對各OrX奈米盤及其對應目標配位體，偵測極限均低於1 fM。
4. 結論
基於電子裝置平台，此研究已進一步證實OrX之識別能力及有前景的嗅覺生物感測器應用。嵌入於奈米盤中之OrX在CNT FET上共價官能化，且顯示對1 fM目標配位體具即時電流反應且對PBS緩衝液不反應。此比實例2中所描述之CNT-FET感測器之靈敏性大五倍，具有至少四個數量級之動態範圍。與來自空奈米盤官能化之CNT FET之結果相比較，未觀測到對目標配位體之清晰的電流反應。各OrX之特異性結合亦已藉由測試對PBS及來自OrX官能化CNT FET之對照配位體之反應得到驗證。OrX-奈米盤官能化之CNT FET已證實對其目標配位體之即時偵測具特異性及靈敏性。
實例 4 - 具有電阻抗頻譜 ( EIS ) 之 本發明之感測器的進一步例證 1. 概述
申請人已使用昆蟲OrX序列進一步例示了方便、靈敏的感測器裝置。將三種OrX受體(Or10a及Or22a及OR35a)
43 、 63
各自嵌入於奈米盤
55 、 56
中且在金電極上官能化以用於EIS量測。以即時形式，以fM水準濃度開始，OrX官能化之金電極中之每一者已顯示對其目標配位體(Or10a對水楊酸甲酯，Or22a對己酸甲酯及Or35a對E-2-己烯醛)之清晰的電子反應。藉由測試各OrX奈米盤官能化之電極對非反應配位體之反應來驗證結合之特異性。為進一步確保特異性，亦測試空奈米盤官能化之金電極對目標配位體之反應。 2. 實驗方法
2.1 材料
6-巰基己酸(MHA)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺) (EDC)、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)錠劑、水楊酸甲酯、己酸甲酯、己酸乙酯、E2-己烯醛及4-乙基愈創木酚係獲自Sigma-Aldrich。1.6 mm直徑金(Au)圓盤電極、捲曲鉑(Pt)線電極及不漏銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極係購自BASi以用於電化學量測。
2.2 奈米盤相關 OR 次單元之製備 2.2.1 純化之 OR 次單元之製備
如實例3部分2.3.1中所描述製備OR次單元。
2.2.2 奈米盤相關 OR 次單元之製備
如實例3部分2.3.2中所描述製備奈米盤。
2.3 電極製備
針對各電極，用拋光氧化鋁漿料在氧化鋁拋光墊上拋光金圓盤電極(1.6 mm直徑)一分鐘。將經拋光電極用去離子水(Milli-Q，18.2 MΩ cm)沖洗，隨後在乙醇(LR級)及去離子水中進行超音波處理直至自電極完全移除殘餘氧化鋁漿料。將-1.2 V下之時間電流滴定法應用於所有經超音波處理之電極上，以使用0.1 M氫氧化鈉(NaOH)電解質溶液，在三端電化學電池 -Ag/AgCl (3 M NaCl，相較於SHE為0.209 V)參考電極、作為對立電極之捲曲鉑絲及作為工作電極之金圓盤-中，使用PalmSens3恆電位器，使存在於電極表面上之硫醇之SAM解吸附30秒。接著，再次用去離子水沖洗電極且在乙醇及去離子水中連續進行超音波處理。最後，在-0.2與1.6 V之間、在100 mV/s之掃描速率下在0.5 M硫酸(H
2
SO
4
)溶液中進行循環伏安法，持續10次循環，以移除任何其他雜質(三電極電池，Ag/AgCl (於3 M NaCl中，相較於SHE為0.209 V)參考電極、作為對立電極之捲曲鉑絲及作為工作電極之金圓盤)。
2.4 自組裝單層 ( SAM ) 製備及 EDC : NHS 活化
藉由將1.36 µl MHA溶解於5 ml乙醇(AR級別)中製備2 mM MHA。將清洗的電極浸沒於MHA溶液中且培育隔夜。次日，用乙醇及去離子水徹底地洗滌所有電極以便移除未反應酸。在2 mL PBS (pH=6.5)溶液中製備2:1 莫耳:莫耳比之EDC:NHS (100 mM EDC，50 mM NHS)。接著，在此溶液中在28℃下將電極培育一小時以活化MHA之羧酸(COOH)基團。
2.5 電極上之 OR 相關奈米盤固定
藉由將一種PBS錠劑浸入200 ml Milli-Q水中(根據製造商說明書)並使用0.2 µm針筒過濾器過濾來製備PBS溶液。用pH計量測經製備緩衝溶液之pH。在PBS緩衝溶液(pH=7.4)中將OR稀釋100倍，且在該緩衝溶液中在室溫下將COOH活化之電極培育一小時。接著，用PBS緩衝溶液充分地洗滌電極以洗出任何未結合之奈米盤。
2.5 目標氣味劑溶液製備及培育
PBS溶液(pH=7.4)係用作電解質以進行電化學量測；EIS及CV。在電化學量測之前使PBS緩衝液脫氣15分鐘。自100 mM儲備溶液將配位體溶液稀釋至感測實驗所需之濃度範圍。使配位體之儲備溶液在DMSO中達至100 mM濃度，且在不使用時儲存於4℃下。為進一步將溶液稀釋降至測試範圍，使用PBS緩衝液。PBS (含有1% DMSO)中之配位體之量測範圍針對Or10a奈米盤係1 fM-100 nM (增加10倍)，針對Or22a奈米盤係100 fM-100 pM (增加10倍)，且針對Or35a奈米盤係10 aM -1 pM (增加10倍)。
2.6 電化學阻抗頻譜 ( EIS ) 量測
在相關氣味劑溶液中將OR固定化之電極各自培育約30分鐘，且在EIS量測之前用PBS溫和地洗滌。隨後在三端電化學電池中在100 mHz至100 kHz之間，在針對參考施加-0.7V的情況下，進行EIS量測，該等電化學電池包含鉑(Pt)線作為對立電極(CE)、Ag/AgCl (3 M KCl，相較於SHE為+0.197 V)參考電極(RE)、及具有奈米盤之1.6 mm金圓盤電極作為工作電極(WE)。
3.0 結果
如實例1部分2.0中所描述進行並分析EIS量測。在增加的濃度下培育目標配位體或對照配位體前後，對經OrX (Or10a、Or22a或Or35a)或空奈米盤官能化之金電極進行EIS量測。藉由將感測器反應定義為ΔR
ct
/R
0 ct
相對於log[
C
(配位體)]，獲得校準曲線(圖19)。圖19(a)顯示Or10a奈米盤對水楊酸甲酯靈敏(10 fM之LOD)且選擇性地反應，且如所預期不對對照配位體E2-己烯醛起反應。圖19(b)顯示Or22a奈米盤對己酸甲酯靈敏(＜100 pM之LOD)且選擇性地反應，且如所預期不對對照配位體E2-己烯醛起反應。圖19(c)顯示Or35a奈米盤對E2-己烯醛靈敏(＜1 fM之LOD)且選擇性地反應，且如所預期不對對照配位體水楊酸甲酯起反應。在圖式中之每一者中，空奈米盤不對所測試之目標配位體中之任一者起反應，證實各OrX之存在對於偵測各目標配位體係關鍵的。
4. 結論
基於電子裝置平台，此研究已進一步證實OrX之識別能力及有前景的嗅覺生物感測器應用。嵌入於在金電極上官能化之奈米盤中之OrX顯示對fM目標配位體之電化學阻抗反應，且展示四個數量級之動態範圍。自空奈米盤官能化之電極未觀測到對目標配位體之阻抗反應。各OrX之特異性結合亦已藉由測試對來自OrX奈米盤官能化之電極之對照配位體的反應得到驗證。OrX奈米盤官能化之電極已顯示在特異性且靈敏地偵測其目標配位體方面有較大前景。
實例 5 - 具有電阻抗頻譜 ( EIS ) 之 本發明之感測器的進一步例證 概述
申請人已使用昆蟲OrX序列進一步例示了方便、靈敏的感測器裝置。三種OrX受體(Or10a、Or22a、OR71a)
43 、 63
各自嵌入於脂質體
55 、 56
中，且在其他最佳化實驗條件下在金電極官能化上以用於EIS量測。以fM濃度開始，OrX官能化之金電極中之每一者已顯示對其目標配位體(Or10a對水楊酸甲酯，Or22a對己酸甲酯，Or71a對4-乙基-愈創木酚)之清晰的電子反應。藉由測試各OrX脂質體官能化之電極對非反應配位體之反應來驗證結合之特異性。為進一步確保特異性，亦測試空奈米盤官能化之金電極對目標配位體之反應。 1. 實驗方法
2.1 材料
如實例4部分2.1中所描述
2.2 脂質體相關 OR 次單元之製備 2.2.1 純化之 OR 次單元之製備
如實例3部分2.3.1中所描述製備OR次單元。
2.2.2 脂質體相關 OR 次單元之製備
如實例1部分1.2中所描述製備OR及OR/Orco相關脂質體。
2.3 電極製備
如實例4部分2.3中所描述
2.4 自組裝單層 ( SAM ) 製備及 EDC : NHS 活化
如實例4部分2.4中所描述
2.5 電極上之 OR 相關奈米盤固定
如實例4部分2.5中所描述
2.6 目標氣味劑溶液製備及培育
如實例4部分2.6中所描述
2.7 電化學阻抗頻譜 ( EIS ) 量測
如實例4部分2.7中所描述
3.0 結果
圖20顯示來自對 Or22a之OR相關脂質體之一實例製備物的SDS-PAGE凝膠分析的西方墨點。色帶4顯示Or22a相關脂質體之最終製備物，當將accudenz梯度超速離心(色帶5-12)施用至此製備物時，Or22a相關脂質體漂浮至梯度頂部且發現於頂部兩種梯度級分中(色帶11及12)
14
。 作者使用原子力顯微鏡(AFM)來驗證脂質體可固定於金表面上。圖21顯示可在裸露金表面至OR相關脂質體固定化表面的表面形態及粗糙度輪廓中看出變化。裸露金表面(圖21(a))顯示表面粗糙度值為大約2 nm之各種尺寸之密集填充的平坦金奈米晶體。在SAM改質(圖21(b))及SAM改質金表面之NHS/EDC活化(圖21(c))後，觀測到表面形態的變化可忽略。當將OR相關脂質體引入EDC/NHS活化之SAM改質金表面時(圖21(d))，表面形態明顯變化，顯示圓形脂質體固定在表面上。尺寸可變的圓形脂質體均以其天然形式(亦即無破裂)見於表面上方，或觀測到雙層形成，其亦指示OR較好地保留在脂質體膜中。表面粗糙度值的較大增加(＞ 30 nm)亦證實含OR之脂質體成功地附接至NHS/EDC活化之SAM改質金表面。 如實例1部分2.0中所描述進行並分析EIS量測。在增加的濃度下培育目標配位體或對照配位體前後，對經OrX相關脂質體(Or10a、Or22a或Or71a)或空脂質體官能化之金電極進行EIS量測。藉由將感測器反應定義為ΔR
ct
/R
0 ct
相對於log[
C
(配位體)]，獲得校準曲線(圖22(a)至(c))。圖22(a)顯示Or10a脂質體對水楊酸甲酯靈敏(1 pM之LOD)且選擇性地起反應，且如所預期不對對照配位體己酸甲酯起反應。圖22(b)顯示Or22a脂質體對己酸甲酯靈敏(10 fM之LOD)且選擇性地起反應，且如所預期不對對照配位體水楊酸甲酯起反應。圖22(c)顯示Or71a脂質體對4-乙基愈創木酚靈敏(0.1 fM之LOD)且選擇性地起反應，且不對對照配位體水楊酸甲酯起反應。在圖式中之每一者中，空奈米盤不對目標配位體中之任一者起反應，證實各OrX之存在對於偵測各目標配位體係關鍵的。
4. 結論
基於電子裝置平台，此研究已進一步證實OrX之識別能力及有前景的嗅覺生物感測器應用。嵌入於金電極上官能化之脂質體中之OrX顯示向下對fM濃度之目標配位體之極靈敏的電化學阻抗反應，且展現超過8個數量級之動態範圍。與來自空奈米盤官能化之電極之結果相比較，未觀測到對目標配位體之清晰的阻抗反應。各OrX之特異性結合亦已藉由測試對來自OrX脂質體官能化之電極之對照配位體的反應得到驗證。OrX脂質體官能化之電極已顯示在特異性且靈敏地偵測其目標配位體方面有較大前景。
實例 6 - 具有石英晶體微天平 ( QCM ) 壓電換能器之本發明之感測器的例證 概述
申請人已使用嵌入於脂質體中之黑腹果蠅Or22a
43 、 63
序列生產了方便的壓電感測器裝置。具有耗散監測之石英晶體微天平(QCM-D)係質量靈敏型壓電換能器，其振盪頻率隨著負載於晶體上之質量變化。藉由監測與Or22a脂質體偶聯之QCM-D感測器之振盪頻率變化來偵測Or22a與目標配位體己酸甲酯之間的相互作用。藉由測試與QCM-D感測器偶聯之空脂質體對所測試目標配位體的反應來驗證結合之特異性。 1. 實驗方法
2.1 材料
6-巰基己酸(MHA)、N-羥基丁二醯亞胺（NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺) (EDC)、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)錠劑及己酸甲酯係獲自Sigma-Aldrich。金(100 nm)感測器晶體(QSX301)係獲自ATA Scientific Instruments。
2.2 OR 相關脂質體之製備 2.2.1 純化之 OR 次單元之製備
如實例3部分2.2.1中所描述製備OR次單元。
2.2.2 OR 相關脂質體之製備
如實例1部分1.2中所描述製備OR22a脂質體。
2.3 石英晶體微天平 ( QCM ) 製備及資料收集
將金(100 nm)感測器晶體各自分別在乙醇及milli-Q水中音波處理15分鐘。將5:1:1體積比率之milli-Q水、氨(25%)及過氧化氫(30%)加熱至75℃持續5分鐘，且將音波處理之晶體置於經加熱溶液中5分鐘。接著自該溶液移出晶體且用milli-Q水沖洗，之後用氮氣乾燥。藉由將乾淨的金晶體暴露於MHA之2 mM乙醇溶液隔夜而使其經硫醇官能化，隨後用乙醇溶液洗滌以便移除過量或鬆散結合之分子。接著將SAM官能化晶體置放於Q-sense分析儀器(Biolin Scientific)腔室中，且與NHS/EDC、OR22a/脂質體及各種濃度之己酸甲酯(1.6 µM、8 µM、40 µM、200 µM及1 mM)(在PBS緩衝溶液中)一起流動，以量測頻率(∆f)及耗散(∆D)值之變化。
3.0 結果
圖23(a)顯示在SAM及NHS/EDC改質、隨後Or22a脂質體固定在石英晶體上且接著結合目標配位體己酸甲酯時，頻率及耗散的變化。當結合事件發生在晶體上時，此導致質量增加，降低振盪頻率
64
。因此，感測器之質量隨著SAM、NHS/EDC及Or22a脂質體固定而增加。然而，在己酸甲酯結合的情況下，觀測到頻率增加(圖23(b))。不希望受理論所束縛，發明人提出感測器上之此質量損失係由於己酸甲酯與Or22a受體結合導致水及離子自Or22a脂質體內部釋放，亦即Or22a正形成功能性離子通道。此頻率增加隨著1.6至200 μM之間的己酸甲酯濃度的增加而發生，指示己酸甲酯特異性地與Or22a受體結合，因為在空脂質體固定於QCM上的情況下，未觀測到此頻率增加(圖23(c)及(d))。對以等於萬億分之幾(parts-per-trillion，ppt)濃度之μM水準結合之配位體的偵測與使用秀麗隱桿線蟲ODR-10
65
所見者不分上下。
4. 結論
基於電子裝置平台，此研究已進一步證實OrX之識別能力及有前景的嗅覺生物感測器應用。在石英晶體微天平(QCM)壓電感測器上官能化之脂質體中之OrX可特異性偵測其目標配位體。與來自在QCM上官能化之空脂質體之結果相比較，針對其未觀測到對目標配位體之清晰的壓電反應。OrX脂質體官能化之QCM顯示在特異性且靈敏地偵測其目標配位體方面有較大前景。
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