KR102504692B1 - Trpa1을 포함하는 나노베지클을 포함하는 그래핀 채널 부재, 및 바이오 센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 그래핀 필름 및 상기 그래핀 필름에 고정화된 나노베지클(TRPA1을 포함)을 포함하는 그래핀 채널 부재, 기판; 상기 그래핀 채널 부재; 및 한쌍의 전극을 포함하는 그래핀 트랜지스터, 이를 포함하는 바이오 센서, 그리고 상기 바이오 센서에 시료를 처리하는 단계; 및 상기 바이오 센서의 전기적 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료로부터 살생물제를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

TRPA1을 포함하는 나노베지클을 포함하는 그래핀 채널 부재, 및 바이오 센서{Graphene Channel Member Comprising Nanovesicle Comprising TRPA1 Receptor and Biosensor comprising thereof}
본 발명은 살생물제의 검출에 이용될 수 있는 그래핀 채널 부재와 이를 포함하는 그래핀 트랜지스터 및 바이오 센서에 관한 것이다.
트랜지스터는 전기적 신호를 증폭시킬 수 있는 장치로, 이를 바탕으로 미량의 표적 물질을 검출하기 위한 목적으로 센서 산업에서 광범위하게 응용되고 있다. 그래핀은 탄소 원자로 이루어진 탄소 동소체 중의 하나로서, 전기적으로 반금속 성질을 가지면서도, 그 내부에서 전하가 제로 유효 질량 입자로 작용하기 때문에, 매우 높은 전기 전도도(20,000 cm2/Vs의 진성 전자 이동도)를 가지는 것으로 알려져 있다. 특히, 그라파이트를 기계적으로 박리하여 6각 구조의 2차원 형상의 탄소 원자로 구성된 그래핀을 트랜지스터에 이용한 경우에 전계효과(field effect) 특성이 있다는 것이 보고된 이후로, 그래핀은 종래의 실리콘과 같은 반도체 물질을 대체할 수 있는 물질로 각광받고 있다.
한편, 표적 물질을 검출할 수 있는 센서들 중에서, 악취의 감지, 오염물질의 감지, 부패의 감지 등 환경 부문에서도 다양한 종류의 센서가 개발되어 상용화되어 있지만, 일상에서 사용되는 생활화학제품 내에 포함되어 있을 수 있는 살생물제를 감지하기 위한 센서의 개발은 아직 진행되지 않은 상황이며, 세포실험을 통해서만 살생물제의 존재 여부를 검출하고 있을 뿐이다.
살생물제(biocide)는 인간이나 가축, 농작물 등에 피해를 줄 수 있는 해충, 세균, 쥐와 같은 생물체를 죽이거나 무력화시키기 위한 용도로 사용하는 제품으로, 해로운 생물체를 죽이기 위한 목적에서 생물체에 대한 살상 효과를 나타내는 성분들로 이루어져 있으므로, 상기와 같은 살생물제가 인체 내에 유입될 경우 사람의 건강에도 악영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 국내에서 발생했던 가습기 살균제에 포함된 살생물제로 인한 사망 사고 등으로 인해 살생물제의 위험성과 경각심이 날로 높아지고 있으며, 일상에서 이용하는 제품들에 살생물제가 포함되어 있는지 여부를 간편하면서도 정밀하게 검출할 수 있는 기술의 개발 필요성이 더욱 강조되고 있다. 또한, 살생물제가 함유된 제품을 제조하는 과정에서 발생하는 폐기물이나, 상기 제품을 폐기하는 과정에서 살생물제에 의한 토양, 수질 오염이 발생할 수 있어 살생물제는 사람뿐만 아니라 생태계를 위협할 수도 있는 물질이다. 이에, 효율적인 살생물제 센서의 개발과 연구가 시급하지만, 살생물제에 대해 높은 선택성 및 민감도를 가지면서도 신속하고 간단한 방법을 통해 이를 검출할 수 있는 센서의 개발은 아직 미흡한 실정이다.
TRPA1(Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1)은 동물세포 막에 존재하는 수용체의 일종으로, 고통, 추위, 가려움 등 기계적/화학적 자극 및 스트레스를 감지하고 눈물, 기침, 기도 저항 등의 방어 반응과 관련된 기능을 하는 것으로 알려진 체성감각수용체이다. 상기 TRPA1이 결합하여 감지할 수 있는 리간드로, 올리브 오일의 페놀 화합물, 티몰(thymol), 멘톨(menthol) 등 다양한 물질이 알려져 있으나, 전술한 것과 같은 살생물제, 예컨대 PHMG(polyhexamethyleneguanidine) 등의 살생물제에도 선택적으로 결합하여 고감도로 이를 감지해 낼 수 있는 센서로 이용할 수 있다는 점에 대해서는 보고되거나 공개된 바 없다.
이에, 본 발명의 발명자는 TRPA1이 PHMG를 비롯한 살생물제들과 높은 선택성, 민감도를 가지고 결합할 수 있다는 점을 새롭게 밝혀내고, 이를 검출하기 위한 센서에 생체 내 세포와 유사한 환경을 구현하여, 보다 신속하고 민감하게 살생물제를 검출할 수 있는 신규한 바이오센서를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 PHMG(polyhexamethyleneguanidine)와 같은 살생물제를 높은 감도로 검출 가능한 센서를 제공하는 것을 목적으로 하며, 상기 센서에 이용될 수 있도록 살생물제와 선택적으로 반응할 수 있는 그래핀 채널 부재 및 이를 포함하는 그래핀 트랜지스터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 그래핀 필름 및 상기 그래핀 필름에 고정화된 나노베지클을 포함하는 그래핀 채널 부재로서, 상기 나노베지클은 TRPA1(Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1)을 포함하는 것인, 그래핀 채널 부재를 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 그래핀 필름; 및 한 쌍의 전극;을 포함하는, 그래핀 트랜지스터를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 그래핀 트랜지스터를 포함하는, 바이오 센서를 제공하고, 상기 바이오 센서에 시료를 처리하는 단계; 및 상기 바이오 센서의 전기적 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료로부터 살생물제를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 그래핀 채널 부재와 이를 포함하는 그래핀 트랜지스터 및 바이오 센서는, TRPA1을 이용함에 따라, PHMG, OIT, CMIT, MIT 등 다양한 종류의 살생물제에 대해 선택적, 특이적 감지 능력이 있으며, 10 ㎍/ℓ 농도 정도의 매우 미량의 살생물제까지도 검출할 수 있는바, 고감도의 살생물제 센서로 이용할 수 있는 효과가 있다.
나아가, 본 발명에서는 표면의 개질을 통한 나노베지클의 부착, 고정의 안정성이 향상되고 전기 전도도가 우수한 그래핀 필름을 포함하는 그래핀 채널 부재와, 이를 이용한 소형화된 그래핀 트랜지스터를 이용함으로써 보다 간단하게 살생물제의 검출이 가능하며, 휴대성이 우수한 그래핀 트랜지스터를 제공할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 HEK-293 세포에 TRPA1을 암호화하는 유전자를 형질전환시킨 후 발현시켜 제조한 나노베지클의 막에, GFP와 융합된 TRPA1이 존재하는지 여부를 확인하기 위한 형광현미경 관찰 결과를 나타낸 것으로, 녹색의 형광이 나타나 있다.
도 2는 HEK-293 세포에 TRPA1을 암호화하는 유전자를 형질전환시킨 후 발현시켜 TRPA1의 존재 여부를 웨스턴 블랏팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다. 가장 왼쪽은 마커, 가운데는 대조군의 결과를 의미하며, TRPA1이 발현되어 존재함을 의미하는 151 kDa 부분에 밴드가 형성되어 있음을 확인할 수 있다.
도 3은 HEK-293 세포로부터 제조한 TRPA1을 포함하는 나노베지클을 주사전자현미경(SEM)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 폴리-디-라이신 링커로 표면 개질화시킨 그래핀 트랜지스터 사진이다.
도 5는 TRPA1을 포함하는 나노베지클을 그래핀 필름 위에 고정화시킨 그래핀 채널 부재와 이를 포함하는 그래핀 트랜지스터를 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명의 그래핀 트랜지스터를 대상으로 전류의 변화량 값을 측정하여 나타낸 그래프이다. 그래프에서 Nanovesicle/PDL/Gr은 TRPA1을 포함하는 나노베지클을 PDL(폴리-디-라이신)을 통해 그래핀 필름에 고정화시킨 트랜지스터를, PDL/Gr은 나노베지클은 고정화시키지 않고 PDL 링커층만을 그래핀 필름에 형성시킨 트랜지스터를, Pristine graphene은 상기 PDL 링커층도 형성되지 않은 그래핀 필름으로 이루어진 트랜지스터를 의미한다. Vds는 소스/드레인(source/drain) 전압을, Vg는 게이트(gate) 전압을 의미한다.
도 7은 본 발명의 그래핀 트랜지스터(Nanovesicle with receptor)와 TRPA1을 포함하지 않는 나노베지클을 고정화시킨 그래핀 트랜지스터(Nanovesicle w/p receptor)에 PHMG를 농도 별로 투입하여 전류의 변화량 값을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 그래핀 트랜지스터에 OIT, CMIT, 및 PHMG를 동일한 농도로 순차적 투입하여 전류의 변화량 값을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 그래핀 트랜지스터에 BNP, OIT, MIT, CA, CBDZ, 및 SPO를 각각 농도 별로 투입하여 전류의 변화량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 그래핀 트랜지스터에 CMIT + OIT, CMIT + PHMG, OIT + PHMG, 및 CMIT + OIT + PHMG 조합의 살생물제를 순차적 투입하여 전류의 변화량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 그래핀 채널 부재
본 발명의 일 측면은 그래핀 채널 부재를 제공한다.
본 발명의 그래핀 채널 부재는 그래핀 필름 및 상기 그래핀 필름에 고정화된 나노베지클을 포함하는 것으로서, 상기 나노베지클은 TRPA1(Transient receptor potential channel, subfamily A, member 1)을 포함한다.
본 발명의 나노베지클(nanovesicle)이란 인지질 이중층으로 구성된 막으로 둘러싸인 형태를 갖는 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 의미하며 '나노소포체'와 혼용되어 사용될 수 있다. 나노베지클은 다양한 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소포인 엑소좀(exosome)과 동일, 유사한 크기 및 구조를 갖는 것일 수 있으며, 세포 외부로 방출되어 다른 세포 및 조직에 결합 후 소포 내 단백질, RNA 등의 물질을 전달하는 역할을 하는 엑소좀과는 달리, 나노베지클은 세포로부터 인위적으로 수득한 것이다. 상기 나노베지클은 지질 이중층으로 구성된 막으로 둘러싸인 소포의 형태를 가지며, 상기 지질 이중층 막은 하나 이상일 수 있다.
상기 나노베지클은 TRPA1(Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1)을 포함한다. 상기 TRPA1은 상기 나노베지클의 막표면에 위치할 수 있으며, 상기 막표면에는 TRPA1 이외에도 다른 단백질, 당단백질, 콜레스테롤 등이 결합되어 있을 수 있다. 나노베지클은 세포와 유사한 구조를 가지고 있어 실제 세포 내 환경, 세포막과 유사한 환경을 제공할 수 있다. 따라서, 원래 생체 내에서 세포막 표면 존재하는 TRPA1이 나노베지클에 포함됨에 따라, TRPA1이 생체 내에서 기능하는 것과 동일하거나 유사하게 기능할 수 있는 장점이 있으며, TRPA1의 구조 변화에 따라 발생하는 이온의 유입/유출에 의해 나노베지클 내외의 이온 농도 차이를 구현해 낼 수 있어 이에 따른 전기적 신호의 변화를 측정함으로써 TRPA1을 포함하는 나노베지클을 센서로 이용하기에 유리한 장점이 있다.
상기 TRPA1은 'Transient receptor potential ankyrin 1'라고도 불리는 이온 채널 단백질의 일종으로, 사람을 비롯한 동물세포의 생체막 표면에 위치하며 물리적, 화학적 스트레스를 감지하며 고통, 추위, 가려움 등의 체성감각과 관련된 수용체이다.
본 발명의 나노베지클에 포함되는 TRPA1은 살생물제에 선택적으로 반응할 수 있다. 살생물제(biocide)는 세균, 곤충 등의 생물체를 죽이거나 무력화시킬 수 있는 제제를 말하며 보존제, 살균제, 살충제, 살서제, 방부제 등을 모두 포함할 수 있다. 특히 사람이나 농작물, 가축에게 피해를 주는 병원균, 해충, 쥐 등을 퇴치하기 위한 목적으로 이용되는 것일 수 있으나, 퇴치의 대상이 아닌 사람, 동물, 식물 등에 대해서도 독성이 있을 수 있어 건강을 악화시키거나 질병, 장애를 유발할 수 있고 죽음에 이르게 할 수도 있다. 구체적으로, 상기 살생물제는 PHMG(polyhexamethyleneguanidine), BNP(2-bromo-2-nitropropane-1,3-diol), OIT(2-Octyl-3(2H)-isothiazolone), CMIT(Chloromethylisothiazolinone), MIT(Methylisothiazolinone), CA(Citric acid), CBDZ(Carbendazim), 및 SPO(Sodium 2-pyridinethiol 1-oxide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기와 같은 살생물제는 생활화학제품 또는 가공식품에 포함되어 있을 수 있다. 상기 TRPA1은 상기 나열된 살생물제 중에서도 PHMG에 대한 선택성이 가장 큰 것일 수 있다. 상기 TRPA1은 상기 살생물제와 선택적으로 결합함에 따라, 구조가 변화되고 채널이 열려 나노베지클의 외부에 존재하던 이온, 예컨대 칼슘 이온이 나노베지클의 내부로 이동할 수 있다. 이에 따라 나노베지클 막을 중심으로 내외부의 전위의 변화가 발생하게 되고, TRPA1이 살생물제와 결합하기 전/후의 전위 차이에 따른 전기적 변화가 발생할 수 있다. 따라서 TRPA1의 구조 변화에 따른 전기적 신호의 변화를 측정함으로써, 살생물제의 존재 여부를 확인하기 위한 용도로 상기 TRPA1을 이용할 수 있다.
상기 TRPA1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있고, 상기 TRPA1은 상기 살생물제와 선택적으로 결합하여 이를 감지할 수 있는 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들 또는 단편들일 수 있다. 상기 살생물제와 선택적으로 결합하여 이를 감지할 수 있는 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 예컨대, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 의미한다. 또한, 상기 단백질에는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 단백질 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열이 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 TRPA1은 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오타이드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 예컨대, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 단백질의 개질, 특히 단백질의 안정성을 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 상기 '안정성'은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 단백질을 보호하는 인 비보에서의 안정성뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.
상기 TRPA1을 포함하는 나노베지클은, 동물세포로부터 생산하여 분리함으로써 제조된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 TRPA1 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 동물세포로부터 TRPA1을 발현시키고 사이토칼라신 B(cytochalasin B)와 같이 세포막의 안정성을 감소시키는 물질을 상기 동물세포에 처리한 다음, 원심분리를 통해 나노베지클을 수득할 수 있다. 상기 TRPA1 단백질을 암호화하는 유전자를 형질전환시키는 것은 본 발명의 기술분야에서 동물세포에 특정 유전자를 형질전환시키기 위해 이용될 수 있는 것으로 알려진 어떠한 기술 및 방법이든 이용될 수 있으며, 예컨대 발현벡터에 상기 TRPA1 암호화 유전자를 클로닝하여, 리포펙타민 용액의 처리를 통해 동물세포 내로 형질전환시키는 것일 수 있다.
상기 TRPA1을 포함하는 나노베지클의 직경은 100 ㎚ 내지 200 ㎚일 수 있으며, 구체적으로, 120 ㎚ 내지 200 ㎚, 140 ㎚ 내지 180 ㎚, 120 ㎚ 내지 180 ㎚, 또는 140 ㎚ 내지 160 ㎚일 수 있다. 나노베지클의 직경이 상기 범위보다 더 작을 경우 나노베지클에 포함될 수 있는 TRPA1의 양이 목표치보다 감소될 수 있고, 직경이 상기보다 더 클 경우 상기 나노베지클을 그래핀 필름에 고정화시키는 과정에서 장애가 될 수 있다.
상기 TRPA1을 포함하는 나노베지클은 상기 그래핀 필름에 화학적 결합으로 고정화되어 있을 수 있다. 상기 고정화는, 나노베지클이 그래핀 필름의 일 위치에서 이동하지 않도록 고정시키는 것을 의미하며, 나노베지클에 포함된 TRPA1이 살생물제와 결합함으로써 발생하는 TRPA1의 구조 변화 및 이에 따른 전기적 신호의 변화가 그래핀 필름에 전달될 수 있도록 고정되는 것이라면 어떠한 방법을 통해서도 고정될 수 있다.
상기 화학적 결합은 폴리-디-라이신(poly-D-lysine, 또는 PDL), 폴리-엘-라이신(poly-L-lysine) 및 폴리-엘-오르니틴(poly-L-ornithine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 링커로 하여서 고정화되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 전자 운반자(전자 또는 양공)가 이를 통해 이동할 수 있으면서 그래핀 필름 및 나노베지클에 각각 결합할 수 있는 특성이 있다면 어떠한 형태로든 이용될 수 있다. 상기 폴리-디-라이신은 D-라이신(D-lysine)이 복수 개 연결된 형태의 중합체로서, 라이신이 나타내는 양이온의 특성을 이용하여 그래핀 필름 및 나노베지클의 표면에 각각 이온결합을 형성하며 결합할 수 있다. 따라서, 폴리-디-라이신으로 그래핀 필름을 코팅하여 그래핀 필름의 표면을 개질하고, 폴리-디-라이신에 나노베지클을 결합시킴으로써 상기 그래핀 필름에 본 발명의 나노베지클을 고정화할 수 있다.
상기 그래핀 필름은 단층 또는 이층(bi-layer)일 수 있다. 이층의 그래핀 필름을 사용하면 표면저항의 감소로 인해 그래핀 트랜지스터의 민감도가 저하될 수 있는 점에서, 단층의 그래핀 필름을 포함하는 것이 보다 바람직하다.
상기 그래핀 필름은 패턴화될 수 있고, 구체적으로는 미세 패턴화될 수 있다. 예를 들어, 상기 그래핀 필름을 원 또는 삼각형, 사각형, 오각형, 육각형(허니콤(honeycomb)) 등의 다각형의 형태로 다양하게 패턴화시킬 수 있다. 상기 패턴화된 그래핀 필름의 표면에 상기 TRPA1을 포함하는 나노베지클이 고정화되어 있을 수 있다. 이 때, 상기에서 설명한 바와 같이 상기 나노베지클이 폴리-디-라이신을 링커로 하여서 그래핀 필름에 고정화되어 있을 수 있다.
본 발명의 그래핀 채널 부재는 그래핀 필름을 포함하는데, 위와 같이 채널 부재로 그래핀을 이용하는 경우 게이트에 전압이 가해지지 않은 오프 상태에서도 높은 전류가 흘러 작동 전류의 온/오프 비율이 매우 낮으므로 고성능의 트랜지스터를 제조할 수 있는 장점이 있다.
이 때 상기 그래핀 필름의 두께는 0.1 내지 1 ㎚일 수 있으며, 구체적으로 0.2 내지 0.8 ㎚, 0.3 내지 0.8 ㎚, 0.5 내지 0.7 ㎚일 수 있다. 상기 그래핀 필름의 두께는 단일층의 그래핀 두께를 의미하며, 그래핀 필름의 두께가 상기 범위 내일 경우 높은 전도도 및 높은 전하 이동도를 나타내므로 상기 그래핀 필름을 고감도의 센서 제조를 위한 반도체로 이용할 수 있다.
2. 그래핀 트랜지스터
본 발명의 또 다른 측면은 그래핀 트랜지스터를 제공한다.
상기 그래핀 트랜지스터는 기판; 본 발명의 상기 그래핀 채널 부재; 및 한 쌍의 전극;을 포함한다.
상기 기판은 본 발명의 그래핀 트랜지스터의 구성들이 지지되는 지지대로서의 역할을 하는 것으로서, Si 기판, 유리 기판, GaN 기판, 실리카(SiO2) 기판 등의 절연성 무기물 기판, Ni, Cu, W 등의 금속 기판 또는 플라스틱 기판 등을 사용할 수 있으며, 절연성 기판을 사용하는 경우, 그래핀 채널 부재와의 친화력이 우수한 점에서, 실리카(SiO2) 기판, 또는 실리콘 웨이퍼인 것이 바람직하다.
또한, 상기 기판은 그래핀의 증착이 가능한 다양한 물질 중에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 실리콘-게르마늄, 실리콘 카바이드(SiC) 등의 물질로 구성될 수 있고, 에피택셜(epitaxial) 층, 실리콘-온-절연체(silicon-on-insulator) 층, 반도체-온-절연체(semiconductor-on-insulator) 층 등을 포함할 수 있다.
상기 그래핀 채널 부재는 상기 기판 상에 형성될 수 있다.
구체적으로는 상기 기판 상에 탄화수소 가스를 탄소 공급원으로 하여 화학 기상 증착법으로 그래핀을 성장시켜 그래핀 필름을 형성하는 것일 수 있다.
상기 그래핀 필름은 예를 들면, 화학 기상 증착법을 이용하여 형성할 수 있으며, 이를 이용하면 뛰어난 결정질을 갖는 단층 내지 수층의 그래핀을 대면적으로 얻을 수 있다. 상기 화학 기상 증착법은 기판 표면에 높은 운동 에너지를 갖는 기체 또는 증기 형태의 탄소 전구체를 흡착, 분해 또는 반응시켜 탄소 원자로 분리시키고, 해당 탄소 원자들이 서로 원자간 결합을 이루게 함으로써 그래핀을 성장시키는 방법이다.
상기 화학 기상 증착법은 PECVD(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition), APCVD(Atmospheric Pressure Chemical Vapor Deposition) 및 LPCVD(Low Pressure Chemical Vapor Deposition)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으며, 넓은 면적에 결점을 최소화하여 증착이 가능한 점에서 상기 화학 기상 증착법은 LPCVD인 것이 바람직하다.
상기 화학 기상 증착의 구체적인 방법으로서, 예를 들면 니켈, 구리, 알루미늄, 철 등의 금속 촉매를 스퍼터링 장치 및 전자빔 증발 장치를 이용하여 산화 실리콘층을 가지는 웨이퍼 상에 증착시켜 금속 촉매층을 형성하고, 이를 CH4, C2H2 등의 탄소를 포함하는 가스와 함께 반응기에 넣고 가열하여, 금속 촉매층에 탄소가 흡수되도록 하고, 이를 냉각하여 상기 금속 촉매층으로부터 탄소를 분리시켜 결정화시킨 후, 최종적으로 상기 금속 촉매층을 제거함으로써 그래핀 필름을 형성할 수 있다.
다만, 상기 그래핀 필름을 형성하는 방법은 화학 기상 증착법에 한정되는 것은 아니며, 여러 가지 방법을 이용하여 그래핀 필름을 형성할 수 있다.
예를 들어, 여러 층으로 구성된 흑연 결정에서 기계적인 힘으로 한 층을 벗겨내어 그래핀을 만드는 물리적 박리법, 산화-환원 특성을 활용한 화학적 박리법 또는 SiC와 같이 탄소가 결정에 흡착되거나 포함되어 있는 재료를 1,500 ℃의 고온 상태에서 열처리하는 에피텍셜 합성법을 이용하여 그래핀 필름을 형성시킬 수 있다.
상기 한 쌍의 전극은 그래핀 채널 부재에 전압을 인가하기 위해 상기 그래핀 필름 상에서 서로 이격되어 형성되는 소스 전극과 드레인 전극일 수 있다.
이러한 소스 전극과 드레인 전극은 상기 그래핀 필름을 통하여 전기적으로 연결될 수 있고, 도전성을 가지는 물질을 포함할 수 있으며, 예를 들어 금속, 금속 합금, 전도성 금속 산화물 또는 전도성 금속 질화물 등으로 형성될 수 있다.
상기 소스 전극과 드레인 전극은 각각 독립적으로 Cu, Co, Bi, Be, Ag, Al, Au, Hf, Cr, In, Mn, Mo, Mg, Ni, Nb, Pb, Pd, Pt, Re, Rh, Sb, Ta, Te, Ti, W, V, Zr, Zn 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 그래핀과의 접촉성 및 식각의 용이성 측면에서, Au, 또는 Cr/Au 합금인 것이 바람직하다.
상기 한 쌍의 전극은 당업계에 공지된 방법으로 형성할 수 있으나, 예를 들어, 포토리소그라피(photolithography), 열증착 공정(Thermal Deposition), 이빔증착 공정(E-beam Deposition), PECVD(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition), LPCVD(Low Pressure Chemical Vapor Deposition), PVD(Physical Vapor Deposition), 스퍼터링(sputtering), ALD(Atomic Layer Deposition) 등의 증착 방법에 의하여 형성할 수 있다.
상기 그래핀 채널 부재는 상기 그래핀 필름 상에 TRPA1을 포함하는 나노베지클이 화학적 결합, 예컨대 폴리-디-라이신을 매개로 고정화되어 있는 것일 수 있다. 상기 그래핀 채널 부재, TRPA1, 나노베지클, 폴리-디-라이신, 그래핀 필름에 관한 설명은 상기 '1. 그래핀 채널 부재'에서 설명한 바와 동일하다.
상기 TRPA1을 포함하는 나노베지클이 상기 그래핀 필름에 고정화되는 경우, 나노베지클에 포함되지 않은 형태로 TRPA1이 그래핀 필름에 결합된 그래핀 채널 부재를 포함하는 그래핀 트랜지스터(즉, TRPA1이 단독으로 물리적 또는 화학적 결합으로 그래핀 필름 등에 고정화된 형태의 그래핀 트랜지스터)와 비교할 때, 더 민감도가 높고 검출한계가 향상되는 효과가 있다. 전술한 바와 같이, 나노베지클은 세포와 유사한 구조를 가지고 있으므로 나노베지클에 포함된 TRPA1을 이용하는 경우, TRPA1이 실제 생체 내에서 기능하는 것과 동일하거나 유사하게 기능할 수 있으며, TRPA1의 구조 변화에 따라 발생하는 이온의 유입/유출에 의해 나노베지클 내외의 이온 농도 차이를 구현해 낼 수 있다. 따라서, 나노베지클을 이용하지 않고 단백질만을 이용하는 트랜지스터 또는 바이오센서와 비교할 때, 단백질 자체의 구조 변화나 이에 따른 저항 변화만을 측정할 수 있는 것이 아니라, 이온의 이동 및 나노베지클 내외부의 이온 구배에 따라 형성되는 전기적 차이를 측정할 수 있으므로 전기적 신호의 변화가 더 크게 측정될 수 있고, 이에 따라 보다 높은 민감도를 나타낼 수 있다. 또한, 그래핀의 경우 다른 반도체 특성을 가지는 물질에 비해 전하 이동도가 높은 특성이 있으므로 전기적 신호 변화를 보다 빠르고 높은 민감도로 측정할 수 있으며 이에 따라 검출한계가 향상될 수 있는 장점이 있다.
상기 그래핀 필름 상에 결합된 폴리-디-라이신은 단일층의 형태로 링커층을 형성할 수 있고, 상기 폴리-디-라이신에 고정화된 나노베지클 역시 단일층의 형태로 수용체층을 형성할 수 있다.
상기 링커층이 단일층으로 형성되는 경우, 그래핀 본연의 우수한 전하 이동도, 투명도 및/또는 유연성을 가질 뿐만 아니라, 외부의 비특이적 전하들의 접근에 의한 노이즈 신호를 차단할 수 있는 효과가 있다.
또한, 상기 링커층은 그 두께가 0.1 내지 2 ㎚일 수 있다. 상기 링커층의 두께가 0.1 ㎚보다 얇은 경우 저항이 증가하는 문제점이 있고, 2 ㎚보다 두꺼운 경우 투명도가 감소하는 문제가 있다.
3. 바이오 센서 및 이를 이용한 살생물제의 검출 방법
본 발명의 또 다른 측면은 바이오 센서 및 이를 이용한 살생물제의 검출 방법을 제공한다.
상기 바이오 센서는 본 발명의 상기 그래핀 트랜지스터를 포함한다. 본 발명에 따른 바이오 센서는, 전기장 효과에 의해 소스 및 드레인 전극 사이의 그래핀 필름에 흐르는 전류가 변하는 반도체 특성을 이용한 것이다.
상기 바이오 센서는 살생물제의 검출용일 수 있다. 본 발명의 바이오 센서가 검출할 수 있는 살생물제에 관한 설명은 상기 '1. 그래핀 채널 부재'에서 설명한 바와 동일하며, 예컨대 상기 살생물제는 PHMG(polyhexamethyleneguanidine), BNP(2-bromo-2-nitropropane-1,3-diol), OIT(2-Octyl-3(2H)-isothiazolone), CMIT(Chloromethylisothiazolinone), MIT(Methylisothiazolinone), CA(Citric acid), CBDZ(Carbendazim), 및 SPO(Sodium 2-pyridinethiol 1-oxide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기와 같은 살생물제는 생활화학제품 또는 가공식품에 포함되어 있을 수 있다.
구체적으로, 그래핀 필름의 표면에 고정화된 나노베지클에 포함되어 있는 TRPA1이 살생물제와 결합하여 반응하면, 이의 구조 변화 및 저항 변화로 인해 주변의 전기장에 변화가 일어날 수 있고, TRPA1의 구조 변화로 인해 이온의 이동이 가능하게 됨에 따라 나노베지클 내외부의 전위 변화가 발생할 수 있고, 이에 따라 소스 전극과 드레인 전극 사이의 그래핀 필름에 흐르는 전류 값이 함께 변하고, 이러한 전류의 변화를 측정하는 방식으로 표적물인 살생물제를 검출할 수 있다.
상기 바이오 센서는 살생물제의 농도가 10 g/ℓ 이하인 경우에도 감지할 수 있으며, 예컨대 1 g/ℓ 이하, 100 ㎎/ℓ 이하, 10 ㎎/ℓ 이하, 1 ㎎/ℓ 이하, 100 ㎍/ℓ 이하, 또는 10 ㎍/ℓ 이하인 살생물제를 감지할 수 있다.
이러한 바이오 센서는, 위와 같은 그래핀 트랜지스터를 이용함으로써 민감도, 특이성, 신속성 및/또는 휴대성이 우수하며, 특히, 그래핀 필름을 채널층으로 사용함으로써 그래핀의 높은 전하 캐리어 이동도와 전도도 특성으로 인하여 우수한 민감도와 실시간 감지 성능을 가지고, 이에 따라 생활화학제품이나 가공식품 등에 포함되어 있을 수 있는 살생물제의 검출 한계를 향상시켜서 높은 민감도와 재현성을 가지는 검출이 가능한 효과가 있다.
또한, 위와 같이 링커층을 그래핀 트랜지스터 내의 그래핀 필름에 형성시켜 이에 고정화된 TRPA1을 포함하는 나노베지클을 그래핀 트랜지스터의 채널 영역에 존재시키는 경우에는 센서의 민감도가 더욱 향상될 뿐만 아니라, 도핑 처리와 나노베지클의 부착을 동시에 실시할 수 있게 되어 공정이 간소화되는 효과가 있다.
나아가 전술한 그래핀 트랜지스터는 유심칩 형태로 제작이 되어서 소형화된 바이오 센서(휴대용 전자식 살생물제 센서 등)에 적용시킬 수 있어서, 생활화학제품이나 가공식품 등에 존재할 수 있는 살생물제를 매우 간편하고 정확하게 실시간으로 판별할 수 있고, 이를 다양한 식품 산업 및 환경 평가 산업 등에 활용할 수 있다.
상기 시료로부터 살생물제를 검출하는 방법은, 본 발명의 상기 바이오 센서에 시료를 처리하는 단계; 및 상기 바이오 센서의 전기적 신호를 측정하는 단계;를 포함한다.
상기 검출은 표적 물질의 존재를 확인하는 것을 의미하며, 표적 물질인 살생물제의 농도를 정량 또는 반정량하는 것을 포함한다.
상기 시료는 검출하고자 하는 표적 물질인 살생물제를 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 임의의 혼합물 또는 용액을 의미한다. 살생물제가 포함되어 있거나 포함되어 있을 것으로 여겨지는 물, 식품, 생활제품, 생활제품으로부터 발생되는 부산물, 인체나 동물로부터 얻어진 생체 시료, 또는 이들의 가공물일 수 있으며, 예컨대 화학생물제품 또는 가공식품일 수 있다.
상기 전기적 신호의 측정은, 전류의 변화량을 측정하는 것일 수 있으며, 구체적으로 시간에 따른 전류의 변화량 값을 초기 전류량으로 나눈 값을 측정함으로써 시료 내 살생물제의 존재 여부 및/또는 살생물제의 농도, 양을 검출할 수 있다.
상기 시료로부터 살생물제를 검출하는 방법은, 상기 바이오 센서의 전기적 신호가 변화하는 것으로 측정될 경우 시료 내에 살생물제가 존재하는 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 그래핀 채널 부재, TRPA1, 나노베지클, 폴리-디-라이신, 그래핀 필름, 그래핀 트랜지스터 등에 관한 설명은 상기 '1. 그래핀 채널 부재' 및 '2. 그래핀 트랜지스터'에서 설명한 바와 동일하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
[제조예 1]
TRPA1을 포함하는 나노베지클의 제조
[1-1] TRPA1 유전자의 형질전환 및 나노베지클의 제조
본 발명의 TRPA1을 발현시켜 나노베지클에 포함시킨 형태로 제조하기 위하여, 포유류 세포의 일종인 HEK-293 세포에 TRPA1의 유전자를 형질전환시키고, 나노베지클의 형성을 유도하였다.
먼저, TRPA1을 발현할 수 있는 발현벡터를 제조하기 위하여, TRPA1의 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행해 증폭시킨 다음, 발현 단백질이 세포막의 표면으로 이동되도록 유도하는 임포트 시퀀스(import sequence)인 rho-tag를 상기 PCR 증폭된 TRPA1 유전자와 융합하고, 포유세포의 발현벡터인 pCMV6-AC-GFP(CAT#: PS100010, OriGene)에 클로닝하였다. 상기 pCMV6-AC-GFP 벡터는 앰피실린 저항성 유전자, CMV 프로모터를 포함하고 있으며, 녹색형광단백질인 GFP를 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 것이다. 그리고, 0.5 ㎍의 상기 발현벡터를 100 ㎕의 Opti-MEM(Reduced Serum Media)로 희석시켜 0.75 ㎕ 내지 1.75 ㎕의 리포펙타민 용액(Lipofectamine LTX™, Invitrogen)과 함께 혼합해 DNA-리포펙타민 복합체를 형성하도록 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 발현벡터를 HEK-293 세포에 도입시키기에 앞서, HEK-293 세포를 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 4 mM L-글루타민, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 첨가)에서 37 ℃ 조건으로 가습 5% CO2 인큐베이터를 이용해 배양하였고, 24-well 세포 플레이트에 0.5 ㎖의 배지당 HEK-249 세포가 0.5 ~ 1.24 × 105 cell 만큼 포함되도록 분주한 후, 상기와 같이 제조된 발현벡터와 리포펙타민의 복합체를 각 well에 100 ㎖ 처리하여 도입시킨 후, 37 ℃ 조건으로 5% CO2 인큐베이터에서 18 ~ 24시간 동안 추가적으로 세포를 배양하였다.
상기 방법을 통해 TRPA1 유전자가 형질전환된 HEK-293 세포로부터 TRPA1 단백질을 발현시키고 이를 포함하는 나노베지클을 제작하기 위하여, 형질전환된 HEK-293 세포를 10 ㎍/㎖의 사이토칼라신 B(cytochalasin B, Sigma, USA)가 첨가된 DMEM 배지에서 37 ℃, 300 rpm의 조건으로 30분 동안 교반시켰다. 사이토칼라신 B는 세포막을 투과할 수 있는 독소(mycotoxin)의 일종으로 수축성 미세섬유의 형성을 방해하여 세포막의 안정성을 감소시킬 수 있다 상기와 같이 배양된 HEK-293 세포 배양액을 먼저 1,000 g로 30분 동안 원심분리하여 세포와 나노베지클을 분리하였고, 원심분리된 상청액(supernatant)를 대상으로 15,000 g로 30분 동안 원심분리함으로써 나노베지클을 확보하였다. 상기 원심분리를 통해 가라앉은 침전물을 단백질분해효소 저해제를 포함하는 PBS(pH 7.4, Sigma-Aldrich, USA)에 재부유시켜, 나노베지클을 수득하였고 추가적인 실험에 사용하기 위해 -80 ℃에서 보관하여 이용하였다.
[1-2] TRPA1의 발현 확인 및 나노베지클의 형성 확인
상기 제조예 1-1의 방법을 통해 형질전환된 HEK-293 세포로부터 TRPA1 유전자가 성공적으로 발현되어 TRPA1 단백질이 합성되었는지 여부를 확인하고, 이로부터 생성된 나노베지클에 TRPA1이 포함되었는지 여부 및 상기 나노베지클의 형태를 확인하였다.
먼저, 형질전환된 HEK-293 세포로부터 발현된 단백질이 성공적으로 발현되어, 상기 제조예 1-1을 통해 제조된 나노베지클 내에 포함되어 있는지 여부를 형광현미경을 통해 확인하였다. TRPA1을 HEK-293 세포에 도입하기 위해 제작한 발현벡터에는 GFP 유전자가 함께 융합되어 있는바, GFP의 녹색 형광을 관찰함으로써 상기 발현벡터로부터 발현된 단백질이 나노베지클의 막에 존재하는지 여부를 확인할 수 있다. 상기 제조예 1-1을 통해 제조한 나노베지클을 공초점 형광현미경(LSM 800, ZEISS)을 통해 Z축 스캔으로 관찰한 결과, 도 1의 그림과 같이 녹색의 형광이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 녹색 형광을 내는 GFP가 나노베지클 내에 존재함을 의미하는 것이므로, HEK-293 세포에 발현벡터가 성공적으로 도입되어 형질전환되었으며, 이로부터 발현된 단백질이 나노베지클 내에 포함되어 있음을 의미한다. 상기 발현벡터에는 TRPA1이 함께 암호화되어 있는바 상기와 같은 결과를 통해 나노베지클 내에 GFP와 함께 융합된 TRPA1이 발현되어 있는 것으로 해석할 수 있다.
또한, 상기 나노베지클 내 TRPA1의 발현 여부를 정확히 확인하기 위하여, TRPA1 단백질을 대상으로 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 이용되는 방법에 따라 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 상기 나노베지클로부터 분리된 단백질들을 대상으로, 10%의 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 SDS-PAGE를 수행한 다음, 겔 내에 분리된 단백질을 PDFV 막(Bio-Rad, USA)으로 전이시켜 항-GFP 마우스 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 이용해 반응시킨 후 세척하여 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(항-마우스 항체, Santa Cruz Biotechnology)를 결합시켜 ECL 반응을 수행하였다. 마커는 Bio-Rad 社의 제품을 이용하였고, 대조군으로는 계면활성제를 처리하여 가용화시키지 않은 단백질을 이용하였다. 웨스턴 블랏팅 수행 결과, 도 2의 결과와 같이 TRPA1 단백질의 크기에 해당하는 151 kDa 부분(124 kDa의 TRPA1과 이에 결합된 27 kDA의 GFP 태그를 합친 크기)에서 밴드를 확인하여 TRPA1이 발현되어 존재함을 확인할 수 있었다.
나아가, 나노베지클이 형성된 형태를 확인하기 위하여 상기 제조예 1-1의 방법을 통해 제조된 나노베지클을 대상으로 주사전자현미경(Field Emission SEM, Magellan400)을 이용해 관찰하였다. 그 결과, 도 3과 같이 나노베지클이 구형을 형성하고 있음을 확인하였다. 상기와 같은 측정 결과를 종합할 때, 제조예 1-1의 방법을 통해 제조된 본 발명의 구형으로 형성된 나노베지클의 표면 막에는 GFP와 융합된 형태의 TRPA1이 발현되어 위치하고 있음을 알 수 있다.
[제조예 2]
그래핀 트랜지스터의 제조
[2-1] 기판 상에 그래핀 채널층의 형성
구리 호일을 챔버 내에 위치시키고, 이를 1,000 ℃까지 가열하고, 이를 H2 90 mTorr 및 8 sccm으로 30분(20분의 프리 어닐링과 10분의 안정화) 동안 유지한 후, CH4를 20 sccm으로 40분 동안 총 압력이 560 mTorr인 상태로 가한 다음, 이를 35 ℃/min로 200 ℃까지 냉각시키고, 로(furnace)를 상온까지 냉각하여 상기 구리 호일 상에 단일의 그래핀층을 형성하였다.
다음으로, 상기 구리 호일 상에 형성된 그래핀층 상에 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA, MicroChem Corp, 950 PMMA A4, 4% in anisole) 용액을 분당 6,000 rpm의 속도로 스핀 코팅하고, 에천트(etchant)를 이용하여 상기 PMMA가 코팅된 그래핀층을 상기 구리 호일로부터 분리하였고, 상기와 같이 구리 호일로부티 분리된 그래핀층을 10분 동안 탈이온 증류수에 침지하여 상기 그래핀 층에 남아 있는 잔여 에천트 이온들을 제거하였다.
상기와 같이 세척된 그래핀층을 기판인 실리콘 웨이퍼로 전사한 다음, 상기 그래핀층 상에 PMMA 용액을 투하하여 상기 그래핀층을 코팅하고 있던 PMMA를 제거함으로써, 기판 상에 그래핀 채널층을 형성하였다. 이 때 투명성은 97.8%로 유지되었다.
상기 기판 상에 형성된 그래핀 채널층에, 포지티브 포토레지스트(AZ5214, Clariant Corp)를 스핀 코팅한 다음, UV 노광, 베이킹 및 현상 과정을 거쳐 통해 그래핀 채널층을 패턴화하였다.
[2-2] 전극 형성
상기와 같이 패턴화되어 정렬된 그래핀 채널층의 양 말단에 RIE(oxygen plasma treatment) 방법을 통해 패턴 전극(폭/길이=W/L=1, L=100 ㎛ 채널 길이)을 형성한 다음, 이미지 반전, 열 증착 및 리프트-오프(Lift-off)의 공정을 통해 상기 그래핀 채널층 상에 전극(W/L=5, L=100 ㎛ 채널 길이)이 형성된 그래핀 트랜지스터를 제조하였다.
[2-3] 링커층의 형성
상기와 같이 제조된 그래핀 트랜지스터에 TRPA1을 포함하는 나노베지클을 고정시키기에 앞서, 그래핀 트랜지스터와 나노베지클을 고정시키기 위한 매개체가 되는 링커층을 형성시켰다. 구체적으로, 상기 링커는 폴리-디-라이신(poly-D-lysine, PDL)을 이용하였고, 0.1 ㎎/㎖ 농도의 PDL 용액으로 상기 그래핀층의 표면을 코팅하고 25 ℃에서 2시간 동안 반응시켜 링커층을 형성하였다.
[2-4] TRPA1을 포함하는 나노베지클의 고정
상기 링커층에 상기 제조예 1-1의 방법에 따라 제조된 TRPA1을 포함하는 나노베지클(1 ㎎/㎖) 용액을 1 ㎕ 만큼 상기 PDL 코팅된 링커층 표면에 첨가함으로써, 본 발명의 나노베지클이 고정된 그래핀 트랜지스터를 제조하였다.
[실험예 1]
TRPA1 포함 나노베지클 고정 전/후의 그래핀 트랜지스터의 전기적 특성 측정 차이 확인
상기 제조예 2를 통해 제조된 TRPA1을 포함하는 나노베지클이 고정된 형태의 그래핀 트랜지스터에서 나타나는 전기적 특성을 소스미터(Keithly 2412 sourcemteter)와 전위차계(Wonatech 3000 potentiostat)를 이용해 측정하여, 상기 나노베지클을 고정시키기 전의 그래핀 트랜지스터(제조예 2-3까지 제조된, 링커만 결합된 그래핀 트랜지스터), 링커층을 형성하기 전의 그래핀 트랜지스터(제조예 2-2의 그래핀 트랜지스터)의 전기적 특성 측정 결과와 비교하여 도 6에 나타내었다.
상기 그래핀 트랜지스터에 대하여 전압의 변화에 따른 전류량을 측정한 결과, PDL 링커만 결합되고 나노베지클은 결합되지 않은 그래핀 트랜지스터 및 PDL 링커도 결합되지 않은 그래핀 트랜지스터와 비교할 때, 본 발명의 나노베지클이 고정된 형태의 그래핀 트랜지스터에서는 저항의 기울기가 증가하였다. 이는, TRPA1을 포함하는 나노베지클이 링커를 통해 그래핀의 표면 상에 고정화됨에 따라 발생하는 저항에 의한 결과이므로, 상기와 같은 결과를 통해 상기 제조예 2에 따라 제조된 본 발명의 그래핀 트랜지스터 상에 나노베지클의 고정화가 이루어졌음을 확인할 수 있었다.
[실험예 2]
본 발명의 그래핀 트랜지스터의 살생물제에 대한 검출 효과 확인
[2-1] 살생물제 PHMG의 농도에 따른 검출 효과 확인
본 발명의 그래핀 트랜지스터에 살생물제의 일종인 PHMG (polyhexamethyleneguanidine)를 다양한 농도로 투입하고, 이의 전류 변화를 측정함으로써 PHMG에 대한 감지 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 제조예 2를 통해 제조된 TRPA1을 포함하는 나노베지클이 고정된 형태의 그래핀 트랜지스터에 PHMG를 각각 10 ㎍/ℓ, 100 ㎍/ℓ, 1 ㎎/ℓ, 10 ㎎/ℓ, 100 ㎎/ℓ, 1 g/ℓ, 및 10 g/ℓ의 농도로 순차적으로 투입하였다. 상기 실험예 1과 동일한 방식을 통해 전기적 특성을 측정하여 시간에 따른 전류의 변화량 값(ΔI/I0 = (I-I0)/I0, I는 실시간으로 측정되는 전류 값, I0는 최초 측정된 전류 값)을 도 7에 나타내었다. 대조군으로는 TRPA1을 포함하지 않은 상태의 나노베지클을 제작해 이용하여 만든 그래핀 트랜지스터를 이용하였다.
그 결과, 첨가되는 PHMG의 농도가 증가함에 따라 전류의 변화량 값이 증가하였고, 이에 따라 본 발명의 그래핀 트랜지스터는 PHMG의 양에 따라 PHMG를 감지할 수 있는 효과가 있으며, 10 ㎍/ℓ의 매우 소량의 농도에서도 감지 및 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
[2-2] 살생물제 PHMG 대한 검출 선택성 확인
본 발명의 그래핀 트랜지스터에 상기 실험예 2-1에서 감지 효과를 확인한 PHMG를 비롯하여 다양한 살생물제를 투입하고, 이의 전류 변화를 측정함으로써 살생물제 중 어느 물질에 대해 가장 선택성이 높은지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 상기 제조예 2를 통해 제조된 TRPA1을 포함하는 나노베지클이 고정된 형태의 그래핀 트랜지스터에 살생물제로 OIT (2-Octyl-3(2H)-isothiazolone), CMIT (Chloromethylisothiazolinone) 및 PHMG를 각각 100 ㎍/ℓ의 농도로 첨가하여 순차적으로 투입하였다. 그리고 상기 실험예 1과 동일한 방식을 통해 전기적 특성을 측정하여 시간에 따른 전류의 변화량 값을 도 8에 나타내었다.
그 결과, OIT, CMIT의 첨가에 따라 전류의 변화가 나타났으나, PHMG를 첨가하였을 때의 경우 가장 전기적 신호가 크게 검출되었다. 따라서 본 발명의 TRPA1을 포함하는 나노베지클을 포함하는 그래핀 트랜지스터는 OIT 및 CMIT 역시 감지하여 검출할 수 있으나, 특히 PHMG에 대한 감지 효과가 우수하여 이에 대한 선택성이 매우 크다는 것을 확인할 수 있었다.
[2-3] 각종 살생물제들의 농도에 따른 검출 효과 확인
본 발명의 그래핀 트랜지스터에 다양한 종류의 살생물제들을 다양한 농도로 투입하고, 이의 전류 변화를 측정함으로써 각 살생물제들에 대한 감지 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 제조예 2를 통해 제조된 TRPA1을 포함하는 나노베지클이 고정된 형태의 그래핀 트랜지스터에 BNP, OIT, MIT, CA, CBDZ, 및 SPO를 각각 10 ㎍/ℓ, 100 ㎍/ℓ, 1 ㎎/ℓ, 10 ㎎/ℓ, 100 ㎎/ℓ, 1 g/ℓ, 및 10 g/ℓ의 농도로 순차적으로 투입하였다. 상기 실험예 1과 동일한 방식을 통해 전기적 특성을 측정하여 시간에 따른 전류의 변화량 값(ΔI/I0 = (I-I0)/I0, I는 실시간으로 측정되는 전류 값, I0는 최초 측정된 전류 값)을 도 9에 나타내었다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, 각 살생물제에 따라 전류의 변화량 값의 크기가 서로 다르고, 농도에 따른 전기적 신호 발생의 정도 역시 서로 다르게 나타났으나, 소량의 살생물제를 처리한 경우에도 본 발명의 그래핀 트랜지스터를 이용할 경우 높은 민감도로 이들의 감지 및 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
[2-4] 복합적인 살생물제의 처리에 따른 검출 효과 확인
상기 실험예의 결과에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 그래핀 트랜지스터가 다양한 종류의 살생물제에 대한 검출 효과가 있음을 확인하였는바, 여러 종류의 살생물제를 복합적으로 함께 처리하였을 때에도 검출 효과가 나타나는지 여부를 확인하였다.
본 발명의 그래핀 트랜지스터에 CMIT + OIT, CMIT + PHMG, OIT + PHMG, 및 CMIT + OIT + PHMG 조합의 살생물제를 총량이 10 ㎎/ℓ이 되도록 각각 투입시키고 상기 실험예 1과 동일한 방식을 통해 전기적 특성을 측정하여 시간에 따른 전류의 변화량 값(ΔI/I0 = (I-I0)/I0, I는 실시간으로 측정되는 전류 값, I0는 최초 측정된 전류 값)을 도 10에 나타내었다.
그 결과, 여러 종류의 살생물제를 복합적으로 투입한 경우에도, 전기적 신호를 관찰할 수 있었으며 상기 실험예 2-2를 통해 확인한 바와 같이, PHMG를 포함하여 처리한 경우의 감지 효과가 가장 우수하였다. 따라서 본 발명의 TRPA1을 포함하는 나노베지클을 고정시킨 그래핀 트랜지스터를 바이오센서로 이용할 경우, 단일 물질의 살생물제 뿐만 아니라, 이들이 다양한 조합으로 복합적으로 혼합되어 있더라도 높은 민감도를 가지고 이들을 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
상기에서는 본 발명의 제조예 및 실험예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 제조예 및 실험예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
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Asp Val Asn Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Asn Gly Asn Thr Ala Val Ile Ile Ala Cys Thr Thr Asn 165 170 175 Asn Ser Glu Ala Leu Gln Ile Leu Leu Asn Lys Gly Ala Lys Pro Cys 180 185 190 Lys Ser Asn Lys Trp Gly Cys Phe Pro Ile His Gln Ala Ala Phe Ser 195 200 205 Gly Ser Lys Glu Cys Met Glu Ile Ile Leu Arg Phe Gly Glu Glu His 210 215 220 Gly Tyr Ser Arg Gln Leu His Ile Asn Phe Met Asn Asn Gly Lys Ala 225 230 235 240 Thr Pro Leu His Leu Ala Val Gln Asn Gly Asp Leu Glu Met Ile Lys 245 250 255 Met Cys Leu Asp Asn Gly Ala Gln Ile Asp Pro Val Glu Lys Gly Arg 260 265 270 Cys Thr Ala Ile His Phe Ala Ala Thr Gln Gly Ala Thr Glu Ile Val 275 280 285 Lys Leu Met Ile Ser Ser Tyr Ser Gly Ser Val Asp Ile Val Asn Thr 290 295 300 Thr Asp Gly Cys His Glu Thr Met Leu His Arg Ala Ser Leu Phe Asp 305 310 315 320 His His Glu Leu Ala Asp Tyr Leu Ile Ser Val Gly Ala Asp Ile Asn 325 330 335 Lys Ile Asp Ser Glu Gly Arg Ser Pro Leu Ile Leu Ala Thr Ala Ser 340 345 350 Ala Ser Trp Asn Ile Val Asn Leu Leu Leu Ser Lys Gly Ala Gln Val 355 360 365 Asp Ile Lys Asp Asn Phe Gly Arg Asn Phe Leu His Leu Thr Val Gln 370 375 380 Gln Pro Tyr Gly Leu Lys Asn Leu Arg Pro Glu Phe Met Gln Met Gln 385 390 395 400 Gln Ile Lys Glu Leu Val Met Asp Glu Asp Asn Asp Gly Cys Thr Pro 405 410 415 Leu His Tyr Ala Cys Arg Gln Gly Gly Pro Gly Ser Val Asn Asn Leu 420 425 430 Leu Gly Phe Asn Val Ser Ile His Ser Lys Ser Lys Asp Lys Lys Ser 435 440 445 Pro Leu His Phe Ala Ala Ser Tyr Gly Arg Ile Asn Thr Cys Gln Arg 450 455 460 Leu Leu Gln Asp Ile Ser Asp Thr Arg Leu Leu Asn Glu Gly Asp Leu 465 470 475 480 His Gly Met Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Asn Gly His Asp Lys 485 490 495 Val Val Gln Leu Leu Leu Lys Lys Gly Ala Leu Phe Leu Ser Asp His 500 505 510 Asn Gly Trp Thr Ala Leu His His Ala Ser Met Gly Gly Tyr Thr Gln 515 520 525 Thr Met Lys Val Ile Leu Asp Thr Asn Leu Lys Cys Thr Asp Arg Leu 530 535 540 Asp Glu Asp Gly Asn Thr Ala Leu His Phe Ala Ala Arg Glu Gly His 545 550 555 560 Ala Lys Ala Val Ala Leu Leu Leu Ser His Asn Ala Asp Ile Val Leu 565 570 575 Asn Lys Gln Gln Ala Ser Phe Leu His Leu Ala Leu His Asn Lys Arg 580 585 590 Lys Glu Val Val Leu Thr Ile Ile Arg Ser Lys Arg Trp Asp Glu Cys 595 600 605 Leu Lys Ile Phe Ser His Asn Ser Pro Gly Asn Lys Cys Pro Ile Thr 610 615 620 Glu Met Ile Glu Tyr Leu Pro Glu Cys Met Lys Val Leu Leu Asp Phe 625 630 635 640 Cys Met Leu His Ser Thr Glu Asp Lys Ser Cys Arg Asp Tyr Tyr Ile 645 650 655 Glu Tyr Asn Phe Lys Tyr Leu Gln Cys Pro Leu Glu Phe Thr Lys Lys 660 665 670 Thr Pro Thr Gln Asp Val Ile Tyr Glu Pro Leu Thr Ala Leu Asn Ala 675 680 685 Met Val Gln Asn Asn Arg Ile Glu Leu Leu Asn His Pro Val Cys Lys 690 695 700 Glu Tyr Leu Leu Met Lys Trp Leu Ala Tyr Gly Phe Arg Ala His Met 705 710 715 720 Met Asn Leu Gly Ser Tyr Cys Leu Gly Leu Ile Pro Met Thr Ile Leu 725 730 735 Val Val Asn Ile Lys Pro Gly Met Ala Phe Asn Ser Thr Gly Ile Ile 740 745 750 Asn Glu Thr Ser Asp His Ser Glu Ile Leu Asp Thr Thr Asn Ser Tyr 755 760 765 Leu Ile Lys Thr Cys Met Ile Leu Val Phe Leu Ser Ser Ile Phe Gly 770 775 780 Tyr Cys Lys Glu Ala Gly Gln Ile Phe Gln Gln Lys Arg Asn Tyr Phe 785 790 795 800 Met Asp Ile Ser Asn Val Leu Glu Trp Ile Ile Tyr Thr Thr Gly Ile 805 810 815 Ile Phe Val Leu Pro Leu Phe Val Glu Ile Pro Ala His Leu Gln Trp 820 825 830 Gln Cys Gly Ala Ile Ala Val Tyr Phe Tyr Trp Met Asn Phe Leu Leu 835 840 845 Tyr Leu Gln Arg Phe Glu Asn Cys Gly Ile Phe Ile Val Met Leu Glu 850 855 860 Val Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Ser Thr Val Val Phe Ile Phe Leu 865 870 875 880 Leu Leu Ala Phe Gly Leu Ser Phe Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Gln Asp 885 890 895 Pro Phe Ser Ser Pro Leu Leu Ser Ile Ile Gln Thr Phe Ser Met Met 900 905 910 Leu Gly Asp Ile Asn Tyr Arg Glu Ser Phe Leu Glu Pro Tyr Leu Arg 915 920 925 Asn Glu Leu Ala His Pro Val Leu Ser Phe Ala Gln Leu Val Ser Phe 930 935 940 Thr Ile Phe Val Pro Ile Val Leu Met Asn Leu Leu Ile Gly Leu Ala 945 950 955 960 Val Gly Asp Ile Ala Glu Val Gln Lys His Ala Ser Leu Lys Arg Ile 965 970 975 Ala Met Gln Val Glu Leu His Thr Ser Leu Glu Lys Lys Leu Pro Leu 980 985 990 Trp Phe Leu Arg Lys Val Asp Gln Lys Ser Thr Ile Val Tyr Pro Asn 995 1000 1005 Lys Pro Arg Ser Gly Gly Met Leu Phe His Ile Phe Cys Phe Leu Phe 1010 1015 1020 Cys Thr Gly Glu Ile Arg Gln Glu Ile Pro Asn Ala Asp Lys Ser Leu 1025 1030 1035 1040 Glu Met Glu Ile Leu Lys Gln Lys Tyr Arg Leu Lys Asp Leu Thr Phe 1045 1050 1055 Leu Leu Glu Lys Gln His Glu Leu Ile Lys Leu Ile Ile Gln Lys Met 1060 1065 1070 Glu Ile Ile Ser Glu Thr Glu Asp Asp Asp Ser His Cys Ser Phe Gln 1075 1080 1085 Asp Arg Phe Lys Lys Glu Gln Met Glu Gln Arg Asn Ser Arg Trp Asn 1090 1095 1100 Thr Val Leu Arg Ala Val Lys Ala Lys Thr His His Leu Glu Pro 1105 1110 1115

Claims (13)

  1. 인간 유래 TRPA1(Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1)을 포함하는 살생물제 검출용 바이오 센서로서,
    상기 살생물제는 PHMG(polyhexamethyleneguanidine), BNP(2-bromo-2-nitropropane-1,3-diol), OIT(2-Octyl-3(2H)-isothiazolone), CMIT(Chloromethylisothiazolinone), MIT(Methylisothiazolinone), CA(Citric acid), CBDZ(Carbendazim), 및 SPO(Sodium 2-pyridinethiol 1-oxide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 바이오 센서는 상기 TRPA1을 포함하는 그래핀 트랜지스터를 포함하는 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 그래핀 트랜지스터는 기판; 상기 TRPA1을 포함하는 그래핀 채널 부재; 및 한 쌍의 전극;을 포함하는 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 그래핀 채널 부재는 그래핀 필름 및 상기 그래핀 필름에 고정화된 나노베지클을 포함하고,
    상기 나노베지클은 TRPA1(Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1)을 포함하는 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 나노베지클은 상기 그래핀 필름에 화학적 결합으로 고정화되어 있는 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 화학적 결합은 폴리-디-라이신(Poly-D-lysine)을 링커로 하여서 고정화되어 있는 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 TRPA1은 상기 나노베지클의 막표면에 위치하는 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  8. 청구항 4에 있어서,
    상기 그래핀 필름은 단층 또는 이층(bi-layer)인 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  9. 청구항 4에 있어서,
    상기 그래핀 필름은 패턴화된 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  10. 청구항 4에 있어서,
    상기 그래핀 필름은 두께가 0.1 내지 1 ㎚인 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 유래 TRPA1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 살생물제 검출용 바이오 센서.
  12. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항의 바이오 센서에 시료를 처리하는 단계; 및
    상기 바이오 센서의 전기적 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료로부터 살생물제를 검출하는 방법으로서,
    상기 살생물제는 PHMG(polyhexamethyleneguanidine), BNP(2-bromo-2-nitropropane-1,3-diol), OIT(2-Octyl-3(2H)-isothiazolone), CMIT(Chloromethylisothiazolinone), MIT(Methylisothiazolinone), CA(Citric acid), CBDZ(Carbendazim), 및 SPO(Sodium 2-pyridinethiol 1-oxide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
  13. 삭제
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