JP7457224B2 - バイオセンサーデバイスおよび方法 - Google Patents

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Description

技術分野
本発明は、分析物を検出するためのセンサーおよび方法に関する。
揮発性有機化合物（ＶＯＣ）や可溶性有機化学物質などの分析物（analytes）のリアルタイム検出は、健康状態や環境のモニタリング、加えて食品安全性や水の品質にとって重要な問題であり、手ごろで迅速な分析物センサーを開発しようとうする強い動機になっている。
便利な、高感度の、特異的な分析物センサーは、食物の品質／安全性（風味、熟成、汚染、および腐敗）、バイオセキュリティー（有害生物および疾患）、環境のモニタリング（有害汚染物質）、医療診断（例えば呼気診断）およびセキュリティー（違法な化合物および爆発物）に関連する分析物をモニターすることを含む多様な用途を有するであろう。
昆虫嗅覚受容体（olfactory receptor, ＯＲ）は、様々な天然および合成化学物質のなかでも特に、ＶＯＣを区別することができる。昆虫ＯＲは、ヘテロメリックなリガンド開口型カチオンチャネル（heteromeric ligand-gated cation channels）として機能し（図１）、Ｏｒｃｏおよび匂い物質特異的調整受容体（odorant-specific tuning receptor）（ＯｒＸ）として公知の必須のコレセプター（co-receptor）で構成される。
昆虫ＯＲは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として機能する哺乳類やCaenorhabditis elegansのＯＲとは構造的にも機能的にも大きく異なっている。
多くの著者が、アフリカツメガエル卵母細胞２、昆虫細胞株３～５、およびヒトＨＥＫ２９３細胞６を使用する昆虫ＯＲの機能１に関する細胞ベースのアッセイを記載している。しかしながらそれらの用途は、主として昆虫ＯＲの化合物の特異性を同定することに限定され、その一部は、害虫の行動制御のための活性化および阻害化合物を同定するのに使用される７。
多数の公開された特許文書が、昆虫ＯＲ細胞アッセイを記載している8～13。いずれも、害虫の制御のための新規の活性化および阻害化合物に関するアッセイへのアプローチを網羅したものである。細胞ベースのセンサーに関して、２つの公報１４～１５は、細胞ベースのセンサー様式における昆虫ＯＲを発現する細胞株の使用を記載している。一方の公報は、２つの電極電圧固定法を使用する、匂い物質を検出するための昆虫ＯＲでトランスフェクトしたアフリカツメガエル卵母細胞の使用を実証し１４、他方１５は、フェロモン受容体を発現する細胞株を、ガラス製マイクロ流体チップ（glass microfluidic chip）上で成長させること、および蛍光顕微鏡を使用したカルシウムイメージングによりフェロモン結合を検出することを記載している。
市販されているポータブルの揮発物質感知技術は、電子鼻または化学電子鼻に限定されているが、その性能は、感度および特異性に関して実質的に昆虫の嗅覚器系に劣る。さらに、出願人が知る限り、上記で論じられた昆虫ＯＲベースのシステムに基づく市販品はない。イオン移動度分光計や質量分析計などの他の技術は、電子鼻より改善された感度および特異性を提供するが、入手に非常に費用がかかり、使用者の広範な訓練を必要とし、可動性が極めて低い。
したがって、本発明の目的は、少なくとも１つの昆虫受容体を利用する改善されたセンサーデバイスを提供すること、および／または公衆に有用な選択肢を少なくとも提供することである。
本発明は、センサーのディスプレイ表面／基板にカップリングされるＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体（odorant receptor complex）を含むセンサーデバイスを提供する。出願人が知る限り、これは、精製された昆虫の匂い物質受容体複合体（ＯｒＸ／Ｏｒｃｏ）がセンサーディスプレイ表面／基板上に機能的に固定された最初のことである。
本発明者らは、驚くべきことに、新規のセンサーは、これまでに使用されてきた昆虫ＯＲベースのシステムに比べて極めて顕著な感度の増加を提供することを示した。
センサーデバイス
第１の形態において、本発明は、基板と電気的に連通するＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体を含むセンサーデバイスであって、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記センサーデバイスを提供する。
一実施態様において、電気的な特徴における変化は、前記昆虫の匂い物質受容体複合体中の前記ＯｒＸと分析物との相互作用に起因する。
さらなる実施態様において、相互作用は、昆虫の匂い物質受容体複合体中のＯｒＸへの分析物の結合である。
さらなる実施態様において、分析物は、ＯｒＸに相補的である。
さらなる実施態様において、分析物とＯｒＸとの相互作用は、特異的である。
分析物の検出
したがって、一実施態様において、センサーは、基質の電気的な特徴における変化を検出することによって、ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境における昆虫の匂い物質受容体複合体中の昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
電気的な連通
一実施態様において、電気的な連通は、昆虫の匂い物質受容体複合体が、基板の電気的な特徴に影響を与えることができることを意味する。
さらなる実施態様において、分析物と、昆虫の匂い物質受容体複合体中のＯｒＸとの相互作用は、昆虫の匂い物質受容体複合体におけるコンフォメーション変化をもたらす。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体におけるコンフォメーション変化は、基板の電気的な特徴における変化をもたらす。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、分析物の存在またはそれ以外に対して感受性のイオンチャネルを形成する。
基板への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、基板にカップリングされる。
昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、分析物との相互作用に応答して、コンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、膜模倣物（membrane mimic）に存在する。
膜模倣物は、リポソーム、アンフィポール（amphipole）、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、およびナノディスクから選択することができる。
膜模倣物は、脂質分子などの両親媒性分子を含んでいてもよい。好ましくは、両親媒性分子は、リン脂質分子を含む。
好ましくは、膜模倣物は、人工物である。
昆虫の匂い物質受容体複合体は、界面活性剤に存在していてもよく、界面活性剤は、イオン性であってもよいし、または非イオン性であってもよい。
検出の感度
一実施態様において、センサーは、１×１０－３Ｍ未満、好ましくは１×１０－３Ｍ未満、より好ましくは１×１０－４Ｍ未満、より好ましくは１×１０－５Ｍ未満、より好ましくは１×１０－６Ｍ未満、より好ましくは１×１０－７Ｍ未満、より好ましくは１×１０－８Ｍ未満、より好ましくは１×１０－９Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１０Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１１Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１２Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１３Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１４Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１５Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１６Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１７Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１８Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１９Ｍ未満、より好ましくは１×１０－２０Ｍ未満の濃度で分析物の存在を検出することができる。
基板
一実施態様において、基板は、電極、半導体材料、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、グラフェン、酸化物、ドープシリコン（doped silicon）、導電性ポリマー、共振器要素（resonator component）、プリズム上の不活性金属表面の少なくとも１つから選択されるかまたはそれで構成される。
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、水晶（quartz crystal）であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子である。
電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、導電率（conductivity）、抵抗、複合抵抗（complex resistance）、インピーダンス、電気化学インピーダンス、電気化学ポテンシャル、表面プラズモン共鳴、電流の流れ、および交流電場により誘導された振動の共振振動数の少なくとも１つから選択される。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、基板の電気的な特徴における変化を測定する検出器要素を含む。
電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）センサーデバイス
センサーデバイスの一実施態様において、基板は、電気化学セルの作用電極である。
一実施態様において、電気化学セルは、作用電極に加えて、対電極をさらに含む。
さらなる実施態様において、電気化学セルは、参照電極をさらに含む。
さらなる実施態様において、電気化学セルは、ポテンシオスタットをさらに含む。
さらなる実施態様において、電気的な特徴は、電気化学インピーダンスである。
したがって、一実施態様において、センサーデバイスは、電気化学セルの作用電極と電気的に連通するＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体を含み、センサーデバイスは、作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を検出するように設計されている。
ＥＩＳセンサーデバイスの作用電極
一実施態様において、作用電極は、金で構成されるか、または金でコーティングされている。
ＥＩＳセンサーデバイスにおける昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
昆虫の匂い物質受容体複合体は、上述したような膜模倣物に存在していてもよい。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リポソームに存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、人工リポソームに存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、脂質二重層に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、人工脂質二重層に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ナノディスクに存在する。
ＥＩＳセンサーデバイスにおける電極への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、作用電極にカップリングされる。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカー分子を介して作用電極にカップリングされる。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、昆虫の匂い物質受容体複合体と電極との電気的な連通が可能になる程度に短い。
一実施態様において、リンカー分子は、電極が、昆虫の匂い物質受容体複合体から分離することを防ぐ程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６－メルカプトヘキサデカン酸（１６－ＭＨＤＡ）、６－メルカプトヘキサデカン酸（Mecaptohexadecanoic acid）（６－ＭＨＤＡ）および６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
好ましい実施態様において、リンカー分子は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子（ＳＡＭ）層の一部である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子（ＳＡＭ）層の一部である。
したがって、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して電極にカップリングされる。
好ましい実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して電極にカップリングされる。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＥＤＣ／ＮＨＳ上のエステルと、昆虫の匂い物質受容体複合体中のタンパク質上のアミンとの相互作用によって作用電極にカップリングされる。これらのアミンは、ＯｒＸとＯｒｃｏの両方に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＥＤＣ／ＮＨＳ上のエステルと、膜模倣物中の脂質（ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＰＯＰＳ）上のアミンとの相互作用によって作用電極にカップリングされる。
ＥＩＳセンサーにおける分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質受容体複合体への分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境における昆虫の匂い物質受容体複合体に結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、作用電極の電気化学インピーダンスを変化させる。
好ましい実施態様において、作用電極の電気化学インピーダンスは、昆虫ＯｒＸに分析物が結合すると減少する。
好ましい実施態様において、センサーによって検出された分析物の量または昆虫ＯｒＸへの結合が変化すると、作用電極の電気化学インピーダンスは、減少する。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。さらなる実施態様において、検出器要素は、作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を検出または測定する。
半導体ベースのセンサーデバイス
センサーデバイスの一実施態様において、基板は、半導体材料である。あらゆる好適な半導体材料を使用することができる。
センサーデバイスの一実施態様において、半導体材料は、グラフェン、酸化物、ドープシリコン、導電性ポリマー、およびカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）の少なくとも１つであるか、またはそれで構成される。
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）センサーデバイス
一実施態様において、基板は、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）で構成される。カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）は、単壁、二重壁もしくは多重壁、またはそれらの組合せであってもよい。好ましい実施態様において、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）は、単壁である。
さらなる実施態様において、基板は、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）装置のチャネルを形成する。
一実施態様において、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置は、ソース電極およびドレイン電極を含む。
さらなる実施態様において、チャネルは、ソース電極とドレイン電極との間に見出されるか、またはそこに形成される。
さらなる実施態様において、チャネルは、ソース電極およびドレイン電極と電気的に連通する。
したがって、一形態において、本発明は、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）装置のチャネルにおいて、少なくとも１つのカーボンナノチューブと電気的に連通する昆虫の匂い物質受容体複合体を含むセンサーデバイスを提供する。
さらなる実施態様において、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）装置はまた、ゲート電極で構成される。
ＣＮＴ－ＦＥＴセンサーデバイスにおける昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
昆虫の匂い物質受容体複合体は、上述したような膜模倣物に存在していてもよい。
好ましい実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ナノディスクに存在する。
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、チャネルにおいて、カーボンナノチューブにカップリングされる。
さらなる実施態様において、カップリングにより、昆虫の匂い物質受容体複合体がカーボンナノチューブと電気的に連通した状態になる。
昆虫の匂い物質受容体複合体の機能化（官能基化、functionalisation）
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＣＮＴへのカップリングが容易になるように機能化される。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグで機能化される。
それゆえに、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグを含む。
一実施態様において、ＯｒＸタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、ＯｒＸタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、Ｏｒｃｏタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、Ｏｒｃｏタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質の両方は、上記の通りのｈｉｓ－タグを含む。
ＣＮＴの機能化
一実施態様において、ＣＮＴは、昆虫の匂い物質受容体複合体へのカップリングが容易になるように機能化される。
さらなる実施態様において、ＣＮＴは、ニッケル（Ｎｉ）－ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で機能化される。
カップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグとの親和性結合を介してＣＮＴにカップリングされる。
したがって、一実施態様において、ｈｉｓ－タグを有する昆虫の匂い物質複合体は、Ｎｉ－ＮＴＡで機能化されたＣＮＴに結合する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、昆虫の匂い物質受容体複合体中のタンパク質上のアミンとの相互作用によってＣＮＴにカップリングされる。これらのアミンは、ＯｒＸとＯｒｃｏの両方に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、膜模倣物中の脂質（ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＰＯＰＳ）上のアミンとの相互作用によってＣＮＴにカップリングされる。
ＣＮＴ－ＦＥＴセンサーにおける分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置におけるソース－ゲイン電流を変化させる。
好ましい実施態様において、ソース－ゲイン電流は、昆虫ＯｒＸに分析物が結合すると減少する。
好ましい実施態様において、センサーによって検出された分析物の量または昆虫ＯｒＸへの結合が増加するにつれて、ソース－ゲイン電流は、より減少する。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。さらなる実施態様において、検出器要素は、ソース－ドレイン電流における変化を検出または測定する。
グラフェン－電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）センサーデバイス
一実施態様において、基板は、グラフェン（Ｇ）のシートで構成される。グラフェンは、単層、二重層または多層であってもよいし、またはそれらの組合せであってもよい。好ましい実施態様において、グラフェンは、単層である。
さらなる実施態様において、基板は、グラフェン－電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）装置のチャネルを形成する。
一実施態様において、ＧＦＥＴ装置は、ソース電極およびドレイン電極を含む。
さらなる実施態様において、チャネルは、ソース電極とドレイン電極との間に見出されるか、またはソース電極とドレイン電極との間に形成される。
さらなる実施態様において、チャネルは、ソース電極およびドレイン電極と電気的に連通する。
したがって、一形態において、本発明は、グラフェン－電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）装置のチャネルにおいて、グラフェンと電気的に連通する昆虫の匂い物質受容体複合体を含むセンサーデバイスを提供する。
さらなる実施態様において、グラフェン－電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）装置はまた、ゲート電極も含む。
ＧＦＥＴセンサーデバイスにおける昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
昆虫の匂い物質受容体複合体は、上述したような膜模倣物に存在していてもよい。
好ましい実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リポソームに存在する。
グラフェンへの昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、チャネルにおいて、グラフェンにカップリングされる。
さらなる実施態様において、カップリングにより、昆虫の匂い物質受容体複合体がグラフェンと電気的に連通した状態になる。
昆虫の匂い物質受容体複合体の機能化
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、グラフェンへのカップリングが容易になるように機能化される。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグで機能化される。
それゆえに、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグを含む。
一実施態様において、ＯｒＸタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、ＯｒＸタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、Ｏｒｃｏタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、Ｏｒｃｏタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質の両方は、上記の通りのｈｉｓ－タグを含む。
グラフェンの機能化
一実施態様において、グラフェンは、昆虫の匂い物質受容体複合体へのカップリングが容易になるように機能化される。
さらなる実施態様において、グラフェンは、１－ピレン酪酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＢＡＳＥ）で機能化される。
カップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグとの親和性結合を介してグラフェンにカップリングされる。
したがって、一実施態様において、ｈｉｓ－タグを有する昆虫の匂い物質複合体は、ＰＢＡＳＥで機能化されたグラフェンに結合する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、昆虫の匂い物質受容体複合体中のタンパク質上のアミンとの相互作用によってグラフェンにカップリングされる。これらのアミンは、ＯｒＸとＯｒｃｏの両方に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、膜模倣物中の脂質（ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＰＯＰＳ）上のアミンとの相互作用によってグラフェンにカップリングされる。
ＧＦＥＴセンサーにおける分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、ＧＦＥＴ装置におけるソース－ゲイン電流を変化させる。
好ましい実施態様において、ソース－ゲイン電流は、昆虫ＯｒＸに分析物が結合すると減少する。
好ましい実施態様において、センサーによって検出された分析物の量または昆虫ＯｒＸへの結合が増加するにつれて、ソース－ゲイン電流は、より減少する。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。さらなる実施態様において、検出器要素は、ソース－ドレイン電流における変化を検出または測定する。
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）センサーデバイス
センサーデバイスの一実施態様において、基板は、水晶振動子マイクロバランスにおける共振器要素である。
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、および少なくとも１種の水晶振動子であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子である。
一実施態様において、水晶振動子は、金でコーティングされている。
電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、共振器要素に適用された交流電場により誘導された振動の共振振動数である。
ＱＣＭセンサーデバイスの電極
一実施態様において、共振器要素は、その対向する２つの側に電極が取り付けられている。
一実施態様において、電極は、金で構成されるか、または金でコーティングされている。
ＱＣＭセンサーデバイスにおける昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
昆虫の匂い物質受容体複合体は、上述したような膜模倣物に存在していてもよい。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リポソームに存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、人工リポソームに存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、脂質二重層に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、人工脂質二重層に存在する。
好ましい実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リポソームに存在する。
ＱＣＭセンサーデバイスにおける共振器要素への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、共振器要素にカップリングされる。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカー分子を介して共振器要素にカップリングされる。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、昆虫の匂い物質受容体複合体と共振器要素との電気的な連通が可能になる程度に短い。
一実施態様において、リンカー分子は、共振器要素が、昆虫の匂い物質受容体複合体から分離することを防ぐ程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６－メルカプトヘキサデカン酸（１６－ＭＨＤＡ）、６－メルカプトヘキサデカン酸（６－ＭＨＤＡ）および６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
好ましい実施態様において、リンカー分子は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の一部である。
したがって、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して共振器要素にカップリングされる。
好ましい実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して共振器要素にカップリングされる。
ＱＣＭセンサーを用いた分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質受容体複合体中の昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振振動数を変化させる。
一実施態様において、共振振動数は、昆虫ＯｒＸに分析物が結合すると増加する。
さらなる実施態様において、共振振動数は、昆虫ＯｒＸに分析物が結合すると減少する。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。さらなる実施態様において、検出器要素は、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素における共振振動数における変化を検出または測定する。
一実施態様において、検出器要素は、周波数分析器である。
二重層（bilayer）センサーデバイス
センサーデバイスの一実施態様において、センサーは、
両親媒性分子、ＯｒＸタンパク質およびＯｒｃｏタンパク質を含む膜模倣物；
前記膜の第１の側に配置された第１の電極を含む第１の基板；および
前記膜の第２の側に配置された第２の電極を含む第２の基板
を含む。
電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、電気化学ポテンシャルである。別の実施態様において、電気的な特徴は、電流の流れである。
二重層センサーデバイスの電極
一実施態様において、基板は、作用電極である。一実施態様において、センサーは、対電極をさらに含む。
さらなる実施態様において、センサーは、参照電極をさらに含む。
さらなる実施態様において、電気化学セルは、ポテンシオスタットをさらに含む。
一実施態様において、電極の１つまたはそれより多くは、銀で構成されるか、または銀でコーティングされている。好ましくは、電極の少なくとも一部は、塩化銀層でカバーされている。
二重層センサーデバイスにおける昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
昆虫の匂い物質受容体複合体は、好ましくは、上述したように膜模倣物に配置される。
好ましくは、膜模倣物は、脂質分子などの両親媒性分子を含む。好ましくは、両親媒性分子は、リン脂質分子を含む。
さらなる実施態様において、ＯｒＸおよびＯｒｃｏは、イオノトロピック型膜タンパク質（ionotrophic membrane protein）である。ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質は一緒に、複合体を形成する。一部の実施態様において、複合体は、分析物の存在下で形成される。
二重層センサーを用いた分析物の検出
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、分析物の存在またはそれ以外に対して感受性のイオンチャネルを形成する。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
さらなる実施態様において、分析物の結合は、昆虫の匂い物質受容体複合体を活性化して、膜を通過するイオンの流れをもたらす。
好ましくは、第１の電極は、膜の第１の側と電気的に接触しており、第２の電極は、膜の第２の側と電気的に接触している。
さらなる実施態様において、センサーは、第１の電極と第２の電極との間の電気的な特徴、例えば電流の流れを測定するように設計されている制御システムを含む。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーデバイス
センサーデバイスの一実施態様において、基板は、ガラスプリズム上の不活性金属表面である。好ましくは、金属表面は、銀または金の金属性の層である。より好ましくは、金属層は、およそ５０ｎｍの厚さを有する。
電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、表面プラズモン共鳴である。
ＳＰＲセンサーデバイスにおける昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
昆虫の匂い物質受容体複合体は、上述したような膜模倣物に存在していてもよい。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リポソーム、例えば人工リポソーム、またはナノディスクに存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、脂質二重層、例えば人工脂質二重層に存在する。
好ましい実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リポソームに存在する。
ＳＰＲセンサーデバイスにおける金属性の層への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、金属表面にカップリングされる。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、Ｎ末端のシステイン残基を介して金属表面に直接カップリングされる。
ＳＰＲセンサーを用いた分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質受容体複合体中の昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
さらなる実施態様において、ＳＰＲセンサーは、
（ａ）分析物と結合することが可能な昆虫の匂い物質受容体複合体が結合する金属表面、
（ｂ）金属表面における方向付けのための光源励起ビーム、
（ｃ）金属表面から内部反射する光ビームから光を検出することが可能な少なくとも１つの検出器
を含む。
さらなる実施態様において、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程は、センサーの屈折率における変化を引き起こす。好ましくは、この変化は、表面プラズモン共鳴角または共鳴波長におけるシフトを測定することによって検出される。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。
さらなる実施態様において、検出器要素は、励起ビームの共鳴波長の時間変動（固定した共鳴角での）または固定した波長での共鳴角の時間シフトを検出または測定する。
本発明のセンサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）基板の電気的な特徴における変化を検出する工程
を含み、
基板の電気的な特徴における変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
本発明のセンサーデバイスを使用して環境における分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）センサーにおいて、該分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
ｃ）基板の電気的な特徴における変化を検出する工程
を含み、
基板の電気的な特徴における変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
本発明のＥＩＳセンサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明の電気化学セルで、該分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）作用電極における電気化学インピーダンスにおける変化を測定する工程
を含み、
電気化学インピーダンスにおける変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
本発明のＥＩＳセンサーデバイスを使用して環境における分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）本発明の電気化学セルで、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｃ）作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を測定する工程
を含み、
電気化学インピーダンスにおける変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
本発明のＣＮＴ－ＦＥＴセンサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）ＣＮＴ－ＦＥＴ装置で、ソース－ゲイン電流における変化を測定する工程
を含み、
ソース－ゲイン電流における変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
本発明のＣＮＴ－ＦＥＴセンサーデバイスを使用して環境における分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）センサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
ｃ）ＣＮＴ－ＦＥＴ装置におけるソース－ゲイン電流の変化を測定する工程
を含み、
ソース－ゲイン電流における変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
本発明のグラフェン－ＦＥＴ（ＧＦＥＴ）センサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）ＧＦＥＴ装置で、ソース－ゲイン電流における変化を測定する工程
を含み、
ソース－ゲイン電流における変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
本発明のグラフェン－ＦＥＴ（ＧＦＥＴ）センサーデバイスを使用して環境における分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）センサーにおいて、該分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
ｃ）ＧＦＥＴ装置で、ソース－ゲイン電流の変化を測定する工程
を含み、
ソース－ゲイン電流における変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
本発明のＱＣＭセンサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）ＱＣＭ装置で、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素における共振振動数における変化を測定する工程、
を含み、
共振振動数における変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
本発明のＱＣＭセンサーデバイスを使用して環境における分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）センサーにおいて、該分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
ｃ）ＱＣＭ装置で、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素の共振振動数の変化を測定する工程
を含み、
共振振動数における変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
本発明のＳＰＲセンサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）表面プラズモン共鳴角または共鳴波長におけるシフトを測定する工程、
を含み、
表面プラズモン共鳴角または共鳴波長における変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
本発明のＳＰＲセンサーデバイスを使用して環境における分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）センサーにおいて、該分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
ｃ）表面プラズモン共鳴角または共鳴波長におけるシフトを測定する工程
を含み、
表面プラズモン共鳴角または共鳴波長における変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
本発明の二重層センサーデバイスを使用して分析物の結合を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、分析物を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｂ）前記第１および第２の電極にわたり電気的な測定値を得る工程
を含み、
電気的な測定値における変化が分析物の検出を示す、上記方法を提供する。
本発明の二重層センサーデバイスを使用して環境における分析物の存在を検出する方法
さらなる形態において、本発明は、環境における分析物の存在を検出する方法であって、
ａ）本発明のセンサーを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
ｂ）本発明のセンサーにおいて、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
ｃ）前記第１および第２の電極にわたり電気的な測定値を得る工程
を含み、
電気的な測定値における変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法を提供する。
本発明のセンサーデバイスの製造方法
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスを製造する方法であって、ＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体と、センサーデバイスの基板との間に電気的な連通を確立する工程を含み、センサーデバイスは、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている上記方法を提供する。
一実施態様において、本方法は、基板に昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングする工程を含む。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、昆虫の匂い物質受容体複合体がカップリングされた基板がセンサーデバイスに組み立てられる前に、基板にカップリングされる。
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
本発明のＥＩＳセンサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、本明細書に記載されるような電気化学セルの作用電極である。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体と電気化学セルの作用電極との間に電気的な連通を確立する工程を含み、電気化学セルは、作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一実施態様において、本方法は、作用電極に昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングする工程を含む。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、昆虫の匂い物質受容体複合体がカップリングされた作用電極がセンサーデバイスに組み立てられる前に、作用電極にカップリングされる。
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
電極への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカーを介して電極にカップリングされる。
一実施態様において、リンカー分子は、昆虫の匂い物質受容体複合体と電極との電気的な連通が可能になる程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、電極が、昆虫の匂い物質受容体複合体から分離することを防ぐ程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６－メルカプトヘキサデカン酸（１６－ＭＨＤＡ）、６－メルカプトヘキサデカン酸（６－ＭＨＤＡ）および６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
好ましい実施態様において、リンカー分子は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子（ＳＡＭ）層の一部である。
したがって、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して電極にカップリングされる。
好ましい実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して電極にカップリングされる。
さらなる実施態様において、リンカーまたはＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリングの前に実行される。
好ましくは、リンカーまたはＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、電極に昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングする前に、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を使用して実行される。
本発明のＣＮＴ－ＦＥＴセンサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、本明細書に記載されるようなＣＮＴ－ＦＥＴ装置のチャネルである。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体と、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置のチャネルとの間に電気的な連通を確立する工程を含み、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置は、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置のソース－ゲイン電流における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一実施態様において、本方法は、チャネルに昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングする工程を含む。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、昆虫の匂い物質受容体複合体がカップリングされたチャネルがセンサーデバイスに組み立てられる前に、チャネルにカップリングされる。
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、チャネルにおいて、カーボンナノチューブにカップリングされる。
昆虫の匂い物質受容体複合体の機能化
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＣＮＴへのカップリングが容易になるように機能化される。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグで機能化される。
それゆえに、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグを含む。
一実施態様において、ＯｒＸタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、ＯｒＸタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、Ｏｒｃｏタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、Ｏｒｃｏタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質の両方は、上記の通りのｈｉｓ－タグを含む。
ＣＮＴの機能化
一実施態様において、ＣＮＴは、昆虫の匂い物質受容体複合体へのカップリングが容易になるように機能化される。さらなる実施態様において、ＣＮＴは、ニッケル（Ｎｉ）－ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で機能化される。
カップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグとの親和性結合を介してＣＮＴにカップリングされる。
したがって、一実施態様において、ｈｉｓ－タグを有する昆虫の匂い物質受容体複合体は、Ｎｉ－ＮＴＡで機能化されたＣＮＴに結合する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、昆虫の匂い物質受容体複合体中のタンパク質上のアミンとの相互作用によってＣＮＴにカップリングされる。これらのアミンは、ＯｒＸとＯｒｃｏの両方に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、膜模倣物中の脂質（ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＰＯＰＳ）上のアミンとの相互作用によってＣＮＴにカップリングされる。
本発明のＧＦＥＴセンサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、本明細書に記載されるようなＧＦＥＴ装置のチャネルである。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体と、ＧＦＥＴ装置のチャネルとの間に電気的な連通を確立する工程を含み、ＧＦＥＴ装置は、ＧＦＥＴ装置のソース－ゲイン電流における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一実施態様において、本方法は、チャネルに昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングする工程を含む。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、昆虫の匂い物質受容体複合体がカップリングされたチャネルがセンサーデバイスに組み立てられる前に、チャネルにカップリングされる。
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
グラフェンへの昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、チャネルにおいてグラフェンにカップリングされる。
昆虫の匂い物質受容体複合体の機能化
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、グラフェンへのカップリングが容易になるように機能化される。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグで機能化される。
それゆえに、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグを含む。
一実施態様において、ＯｒＸタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、ＯｒＸタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、Ｏｒｃｏタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、Ｏｒｃｏタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質の両方は、上記の通りのｈｉｓ－タグを含む。
グラフェンの機能化
一実施態様において、グラフェンは、昆虫の匂い物質受容体複合体へのカップリングが容易になるように機能化される。
さらなる実施態様において、グラフェンは、１－ピレン酪酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＢＡＳＥ）で機能化される。
カップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグとの親和性結合を介してグラフェンにカップリングされる。
したがって、一実施態様において、ｈｉｓ－タグを有する昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥで機能化されたグラフェンに結合する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、昆虫の匂い物質受容体複合体中のタンパク質上のアミンとの相互作用によってグラフェンにカップリングされる。これらのアミンは、ＯｒＸとＯｒｃｏの両方に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、膜模倣物中の脂質（ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＰＯＰＳ）上のアミンとの相互作用によってグラフェンにカップリングされる。
本発明のＱＣＭセンサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、水晶振動子マイクロバランスの水晶共振子である。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体と、水晶振動子マイクロバランスの共振器要素との間に電気的な連通を確立する工程を含み、水晶振動子マイクロバランスは、ＱＣＭ装置で、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素の共振振動数における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一実施態様において、本方法は、共振器要素に昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングする工程を含む。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、昆虫の匂い物質受容体複合体がカップリングされた作用共振器要素がセンサーデバイスに組み立てられる前に、共振器要素にカップリングされる。
好ましくは、共振器要素は、水晶共振子である。
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
共振器要素への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカーを介して共振器要素にカップリングされる。
一実施態様において、リンカー分子は、昆虫の匂い物質受容体複合体と共振器要素との電気的な連通が可能になる程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、共振器要素が受容体から分離することを防ぐ程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６－メルカプトヘキサデカン酸（１６－ＭＨＤＡ）、６－メルカプトヘキサデカン酸（６－ＭＨＤＡ）および６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
好ましい実施態様において、リンカー分子は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の一部である。
したがって、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して共振器要素にカップリングされる。
好ましい実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）リンカー分子で構成されるＳＡＭ層を介して共振器要素にカップリングされる。
さらなる実施態様において、リンカーまたはＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリングの前に実行される。
好ましくは、リンカーまたはＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、共振器要素に昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングする前に、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を使用して実行される。
発明の詳細な説明
本出願人の発明は、昆虫匂い物質受容体の匂いを感知する力を便利なセンサー様式とうまく組み合わせている。
改善された便利さに加えて、本発明のセンサーデバイスは、驚くべきことに、昆虫ＯＲの使用に基づく以前のアッセイシステムと比べて、検出の感度における顕著な改善を提供する。
昆虫の匂い物質受容体複合体
昆虫匂い物質受容体（ＯＲ）は、リガンド開口型非選択的カチオンチャネルを形成する７回膜貫通タンパク質の新規のファミリーのメンバーである。図１に提示されるように、高度に保存された昆虫の匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）は、インビボで活性なチャネルを形成すると考えられ、匂い物質の特異性は、リガンド結合サブユニット（ＯｒＸ）の一群によって付与される。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
インビボにおいて、昆虫ＯｒＸタンパク質のＮ末端は、細胞質内であり、一方でＣ末端は、細胞外である。この形態は、哺乳類Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と逆の形態である。加えて、哺乳類ＧＰＣＲとは異なり、昆虫ＯＲは、リガンド開口型非選択的カチオンチャネルとして機能し、シグナルの大部分はＧタンパク質と独立している１６～１７。
Hopfら、2015１８はさらに、昆虫ＯＲの予測された構造とそれが哺乳類ＧＰＣＲと無関係なことを論じている。
昆虫ＯｒＸ
昆虫ＯｒＸタンパク質は、ＯｒＸポリペプチドと記載される場合もあり、当業者周知である。本発明で使用するために好適なＯｒＸ配列としては、多様なＶＯＣ（２０～２２）を検出することができるキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＯＲ遺伝子ファミリー（１９）、多様なＶＯＣ（２４～２５）を検出することができるガンビアハマダラカ（Anopheles gambiae）ＯＲ遺伝子ファミリー（２３）の配列；加えて、公知のＯＲファミリーの近年のリストに記載された他の昆虫種からのＯＲ遺伝子ファミリーの配列が挙げられる。Montagne 2015（１）の表Ｉを参照されたい。一実施態様において、昆虫ＯｒＸタンパク質は、このような参考文献１、１９および２３で開示された配列、またはそれらのバリアント（variant）もしくは機能的なフラグメントを含む。
昆虫の匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）
昆虫の匂い物質コレセプター（Ｏｒｃｏ）タンパク質（Ｏｒ８３ｂ２６としても公知）は、Ｏｒｃｏポリペプチドとして記載される場合もあり、当業者周知である。本発明での使用のために好適なＯｒｃｏ配列としては、キイロショウジョウバエＯｒｃｏ遺伝子ファミリー（１９）、ガンビアハマダラカＯｒｃｏ遺伝子ファミリー（２３、２７）、加えて、公知のＯｒｃｏファミリーの近年のリストに記載された他の昆虫種からのＯｒｃｏ遺伝子ファミリーの配列が挙げられる。Montagne 2015（１）の表Ｉを参照されたい。一実施態様において、昆虫Ｏｒｃｏタンパク質は、このような参考文献１、１９および２３、２７で開示された配列、またはそれらのバリアントもしくは機能的なフラグメントを含む。
ＯｒＸタンパク質の性質
一実施態様において、受容体複合体におけるＯｒＸは、組換え技術によって発現されたタンパク質である。
好ましい実施態様において、ＯｒＸは、組換え発現の後に精製されている。
一実施態様において、ＯｒＸは、昆虫嗅覚細胞から直接的に精製されていない。
さらなる実施態様において、ＯｒＸは、センサーデバイスにおいて、昆虫嗅覚細胞中に存在しない。
Ｏｒｃｏタンパク質の性質
一実施態様において、受容体複合体におけるＯｒｃｏは、組換え技術によって発現されたタンパク質である。
好ましい実施態様において、Ｏｒｃｏは、組換え発現の後に精製されている。
一実施態様において、Ｏｒｃｏは、昆虫嗅覚細胞から直接的に精製されていない。
さらなる実施態様において、Ｏｒｃｏは、センサーデバイスにおいて、昆虫嗅覚細胞中に存在しない。
本発明のセンサーデバイスで使用するための基板
本発明のセンサーデバイスで使用するための基板は、電気的な特徴における変化を測定できるあらゆる基板であってもよい。好ましくは、電気的な特徴における変化は、ＯｒＸと分析物との相互作用の結果としての変化である。
基板は、昆虫の匂い物質受容体複合体がカップリングできる表面も提供することができる。
好適な基板は、電極、半導体材料、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、グラフェン、酸化物、ドープシリコン、導電性ポリマー、共振器要素、プリズム上の不活性金属表面の少なくとも１つを含むか、またはそれで構成される。
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、および水晶振動子であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子である。
本発明のセンサーデバイスで測定するための電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、導電率、抵抗、複合抵抗、インピーダンス、電気化学インピーダンス、電気化学ポテンシャル、表面プラズモン共鳴、電流の流れ、および交流電場により誘導された振動の共振振動数の少なくとも１つから選択される。
ＥＩＳデバイス
一実施態様において、本発明のセンサーデバイスは、化学的セルの作用電極における電気化学インピーダンスにおける変化を検出するように設計されている。したがって、この実施態様におけるセンサーデバイスは、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）に合わせて設計される。
電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）
電気化学インピーダンス分光法は当業者周知であり、電気化学システムの研究に長く採用されてきた。インピーダンスを測定する場合、小さい正弦波ＡＣ電圧プローブ（典型的には２～１０ｍＶ）が適用され、電流応答が決定される。同位相（in-phase）の電流応答は、インピーダンスの実際の（抵抗性の）要素を決定するが、一方で位相が異なる（out-of-phase）電流応答は、仮想の（容量性の）要素を決定する。ＡＣプローブ電圧は、システム応答が線形であり単純な等価回路分析が可能になる程度に十分小さくあるべきである。インピーダンス方法は、それらが、広範に異なる時間定数の物理化学的プロセスを特徴付けること、高い周波数で電子移動をサンプリングすること、および低い周波数で物質移動をサンプリングすることが可能であるという点でかなり強力である。
インピーダンスの結果は、抵抗器およびキャパシタの等価回路、例えば単純な電気化学システムを説明するのにしばしば使用されるランドルス回路に通常フィッティングされる。ランドルス回路［Ｒｓ＋ＣＰＥ／（Ｒｃｔ＋Ｗ）］は、定位相エレメント（ＣＰＥ）と直列であり、電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）およびワールブルグ拡散エレメント（Ｗ）と並列である溶液抵抗（Ｒｓ）を含む。
分析物がこれらの等価回路パラメーターの１つまたはそれより多くに影響を与え、これらのパラメーターが干渉種（interfering species）の影響を受けない場合、インピーダンス方法は、分析物検出に使用することができる。
ワールブルグインピーダンスは、有効な拡散係数を測定するのに使用できるが、分析用途に有用であることはめったにない。ほとんどの場合に分析物検出に有用な等価回路エレメントは、ＲｃｔおよびＣＰＥである。測定されたキャパシタンスは通常、金（Ａｕ）電極上の感知層に結合する分析物などのいくつかの要素の一連の組合せに起因する。
電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）デバイス
ＥＩＳデバイスは、典型的には、
・作用電極（ＷＥ）
・対電極（ＣＥ）
・参照電極（ＲＥ）
・ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）
を有する電気化学セルを含む。
用途に応じて、電気化学セルへの機器の接続は、異なる方法で構築することができる（または構築されていなければならない）。
ポテンシオスタットモードでは、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）は、作用電極（ＷＥ）と参照電極（ＲＥ）との間の電位差が明確であり、使用者によって特定された値に相当するように、作用電極（ＷＥ）に対する対電極（ＣＥ）の電位を正確に制御するだろう。ガルバノスタットモードでは、ＷＥとＣＥとの間の電流の流れが制御される。ＲＥとＷＥとの間の電位差およびＣＥとＷＥとの間に流れる電流は、連続的にモニターされる。ＰＧＳＴＡＴを使用することによって、使用者によって特定された値（すなわち適用された電位または電流）は、負のフィードバックメカニズムを使用することによって、測定中いつも正確に制御される。
対電極（ＣＥ）、は、電気化学セル中の電流回路を閉じるのに使用される電極である。これは通常、不活性材料（例えばＰｔ、Ａｕ、グラファイト、グラッシーカーボン）で作製され、通常、電気化学反応に参加しない。電流はＷＥとＣＥとの間に流れるため、ＣＥ（電子のソース／シンク）の合計表面積は、調査中の電気化学的プロセスの速度論においてそれが限定要因にならないように、ＷＥの面積より大きくなければならない。
参照電極（ＲＥ）は、安定な周知の電極電位を有する電極であり、これは、電位の制御および測定に関する電気化学セルにおける基準点として使用される。参照電極電位の高い安定性は通常、酸化還元反応の各参加物質が一定（緩衝化または飽和）濃度を有する酸化還元系を採用することによって達成される。さらに、参照電極を通る電流の流れは、ゼロ近くに（理想的にはゼロに）維持され、これは、電位計での極めて高い入力インピーダンス（＞１００ＧＯｈｍ）と共に、ＣＥを用いてセルの電流回路を閉じることによって達成される。
作用電極（ＷＥ）は、目的の反応が起こる電気化学システム中の電極である。一般的な作用電極は、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、グラッシーカーボン（ＧＣ）およびＨｇのドロップおよびフィルム（Hg drop and film）などの不活性材料で作製することができる。
ＥＩＳデバイスはまた、作用電極の電気特性における変化を測定するための要素を含んでいてもよい。例えば、この要素は、周波数分析器であり得る。周波数分析器は、ポテンシオスタット／ガルバノスタットに連結されていてもよい。
ＣＮＴ－ＦＥＴデバイス
一実施態様において、本発明のセンサーデバイスは、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置のソース－ゲイン電流における変化を検出するように設計されている。
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）は、従来の金属酸化物半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳ－ＦＥＴ）構造におけるバルクシリコンの代わりに、チャネル材料として単一のカーボンナノチューブまたはカーボンナノチューブのアレイを利用する電界効果トランジスタである。
ＣＮＴ－ＦＥＴデバイス
ＣＮＴ－ＦＥＴデバイスは、典型的には、
ａ）ソース電極（ＳＥ）
ｂ）ドレイン電極（ＤＥ）
ｃ）ゲート電極（ＧＥ）、および
ｄ）カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）で構成される少なくとも１つのチャネル
を含む。
ゲート電極は、ソースおよびドレイン電極にわたり電流を制御するのに使用される。ゲート電極がオンのとき、電流の流れは、チャネルを通じてソースおよびドレイン電極にわたり調節することができる。
電極は、典型的には少なくとも１つの金属で構成される。好ましい金属としては、これらに限定されないが、白金、金、クロム、銅、アルミニウム、ニッケル（tickle）、パラジウムおよびチタンが挙げられる。
好ましい実施態様において、チャネルは、カーボンナノチューブで構成される。
ＣＮＴ－ＦＥＴデバイスはまた、ソース－ドレイン電流における変化を測定するための要素を含んでいてもよい。
ＧＦＥＴデバイス
一実施態様において、本発明のセンサーデバイスは、ＧＦＥＴ装置のソース－ゲイン電流における変化を検出するように設計されている。
グラフェン－電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）は、従来の金属酸化物半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳ－ＦＥＴ）構造におけるバルクシリコンの代わりに、チャネル材料としてグラフェンを利用する電界効果トランジスタである。
ＧＦＥＴデバイス
ＧＦＥＴデバイスは、典型的には、
ｅ）ソース電極（ＳＥ）
ｆ）ドレイン電極（ＤＥ）
ｇ）ゲート電極（ＧＥ）、および
ｈ）グラフェンで構成される少なくとも１つのチャネル
を含む。
ゲート電極は、ソースおよびドレイン電極にわたり電流を制御するのに使用される。ゲート電極がオンのとき、電流の流れは、チャネルを通じてソースおよびドレイン電極にわたり調節することができる。
電極は、典型的には、少なくとも１つの金属で構成される。好ましい金属としては、これらに限定されないが、白金、金、クロム、銅、アルミニウム、ニッケル、パラジウムおよびチタンが挙げられる。
好ましい実施態様において、チャネルは、カーボンナノチューブで構成される。
ＧＦＥＴデバイスはまた、ソース－ドレイン電流における変化を測定するための要素を含んでいてもよい。
ＱＣＭデバイス
一実施態様において、本発明のセンサーデバイスは、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）における共振器要素の共振振動周波数における変化を検出するように設計されている。
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、および少なくとも１種の水晶振動子であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子である。
一実施態様において、水晶振動子は、金でコーティングされている。
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）技術は当業者周知であり、水晶共振子の周波数における変化を測定することによって単位面積当たりの質量変動を測定する。共振（resonance）は、音響共振器表面における酸化物の成長／減衰またはフィルム堆積による小さい質量の付与または除去によって乱される。ＱＣＭは、真空、気相および液体環境中で使用することができる。これは、認識部位で機能化された表面への分子（特にタンパク質）の親和性を測定するのに極めて有効である。ＱＣＭはまた、生体分子間の相互作用を調査するのにも使用されてきた。周波数測定は、容易に高精度になるため、１μｇ／ｃｍ２未満もの低いレベルまで質量密度を簡単に測定することができる。周波数を測定することに加えて、誘電正接（dissipation factor）（共振帯域幅と同等である）が、分析を補助するためにしばしば測定される。誘電正接は、共振のＱ値（quality factor）の逆数、Ｑ－１＝ｗ／ｆｒであり、これは、系中の減衰を定量し、サンプルの粘弾性と関連する。
水晶は、圧電性作用を受ける結晶のファミリーの一種である。適用された電圧と機械的な歪みとの関係は周知であり、これは、電気的な手段によって音響共振をプロービングすることを可能にする。水晶振動子に交流を適用することは、振動を誘導するだろう。適切にカットされた結晶の電極間の交流により、持続的な剪断波が生じる。Ｑ値は、周波数と帯域幅との比率であり、１０６もの高さになり得る。このような狭い共振により高度に安定なオシレーターが生じ、共振振動数決定において高い精度がもたらされる。ＱＣＭは、この容易さと精度を感知に活用する。一般的な器具によって、４～６ＭＨｚの範囲の基本的な共振周波数を有する結晶において分解能を１Ｈｚまで下げることができる。
水晶振動子の振動の周波数は、結晶の厚さに一部依存する。通常操作中、他の影響のある変数は一定のままであることから、厚さにおける変化は、周波数における変化に直接相関する。結晶表面上に物質が堆積するにつれて厚さは増加し、その結果として振動の周波数は、最初の値から減少する。一部の簡易化した仮定によれば、この周波数の変化は、定量して、Ｓａｕｅｒｂｒｅｙの方程式を使用して正確に質量変化に相関させることができる。
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）デバイス
典型的なＱＣＭのための装置は、水冷チューブ、保持ユニット、マイクロドットフィードスルーを介した周波数感知器具、加振源、ならびに測定および記録デバイスを含有する。
ＱＣＭは、電極を両方の側に蒸着させた共振器要素（典型的には、薄い圧電性プレート）からなる。圧電効果により、電極にわたるＡＣ電圧は剪断変形を誘導し、逆もまた同様である。電気機械的なカップリングは、電気的な手段によって音響共振を検出する単純な方法を提供する。それ以外の状況において、それはあまり重要ではない。
二重層デバイス
二重層デバイスのための典型的な装置は、生物学的な要素、例えば脂質二重層およびタンパク質をエレクトロニクスと組み合わせて、目的の分析物または分析物群からの刺激に応答して出力シグナルを提供する。
二重層デバイスは、電気回路にマウントされた分析物によってゲーティング（活性化／不活性化）されるイオンチャネルを形成する昆虫の匂い物質受容体複合体を含み、ＯｒＸへの分析物の結合は、イオンチャネルを通る電流の流れを引き起こし、これは電気回路を使用して測定される。
ＳＰＲデバイス
ＳＰＲデバイスのための典型的な装置は、
（ａ）分析物と結合することが可能な金属性のセンサー表面を提供するセンサー：
（ｂ）センサー表面における方向付けのための光源励起ビーム：
（ｃ）センサー表面から内部反射する光ビームから光を検出することが可能な少なくとも１つの検出器
を含む。
ＳＰＲデバイスは、金属性の表面にカップリングされる昆虫の匂い物質受容体複合体を含み、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させることが、センサーの屈折率における変化を引き起こす。好ましくは、この変化は、表面プラズモン共鳴角または共鳴波長におけるシフトを測定することによって検出することができる。
本発明のセンサーデバイス
第１の形態において、本発明は、基板と電気的に連通するＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体を含むセンサーデバイスであって、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記センサーデバイスを提供する。
センサーの要素
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスのための要素であって、本明細書で定義されるように基板と電気的に連通するＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体を含む、要素を提供する。この要素は、本発明に係るセンサーデバイスに付与するのに有用である。
一形態において、本発明は、基板と電気的に連通するＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体を含むセンサーデバイスの要素を提供する。
一形態において、本発明は、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、本発明のセンサーデバイスの要素を含むセンサーデバイスを提供する。
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスの要素を製造する方法であって、ＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体と基板との間に電気的な連通を確立する工程を含む、上記方法を提供する。
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスを組み立てる方法であって、本発明のセンサーデバイスの要素を、センサーデバイスに付与することを含み、組み立てられたセンサーデバイスは、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記方法を提供する。
センサーデバイスの要素およびセンサーデバイスの特定の実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体、電気的な連通、基板、立体配置、および検出は、本明細書に記載した通りである。
電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）装置
一実施態様において、センサーデバイスは、電気化学セルを含む。
一実施態様において、電気化学セルは、少なくとも２つの電極を含む。
さらなる実施態様において、電気化学セルは、少なくとも：
ａ）作用電極（ＷＥ）、および
ｂ）対電極（ＣＥ）
を含む。
好ましい実施態様において、電気化学セルはまた、参照電極（ＲＥ）も含む。
さらなる実施態様において、電気化学セルは、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）を含む。
好ましい実施態様において、電気化学セルは、
ａ）作用電極（ＷＥ）、
ｂ）対電極（ＣＥ）、
ｃ）参照電極（ＲＥ）、および
ｄ）ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）
の全てを含む。
対電極
一実施態様において、対電極は、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、グラファイトまたはグラッシーカーボン（ＧＣ）から選択される材料で構成されるか、またはそれでコーティングされている。
好ましくは、対電極は、白金（Ｐｔ）で構成される。
好ましくは、対電極は、白金（Ｐｔ）線である。
参照電極
好ましくは、参照電極は、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）参照電極である。
作用電極
一実施態様において、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）装置は、少なくとも１つの作用電極を含む。
電極は、あらゆる好適な材料で構成されていてもよいし、またはそれでコーティングされていてもよい。電極は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）およびグラッシーカーボン（ＧＣ）から選択される材料で構成されていてもよいし、またはそれでコーティングされていてもよい。
好ましい実施態様において、電極は、金で構成されるか、または金でコーティングされている。
ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）
好ましくは、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）は、ポテンシオスタットモードで使用される。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。検出器要素は、基板の電気的な特徴における変化を検出または測定する。
一実施態様において、検出器要素は、周波数分析器である。さらなる実施態様において、周波数分析器は、ポテンシオスタット／ガルバノスタット（ＰＧＳＴＡＴ）に連結されている。
昆虫ＯｒＸタンパク質の調製
昆虫ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質を組換え技術で発現させ、精製するための方法は、当業者公知である２８。
昆虫ＯｒＸの調製物の存在
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、分析物との相互作用に応答して、コンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、膜模倣物に存在する。
膜模倣物は、名前が示唆する通り、天然膜を模倣するものであり、インビボで見出されるのと同じかまたは類似したコンフォメーションで受容体を支持することができる。
膜模倣物は、リポソーム、アンフィポール、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、およびナノディスクから選択することができる。
好ましくは、膜模倣物は、人工物である。
一実施態様において、膜模倣物は、リポソームである。
一実施態様において、膜模倣物は、人工リポソームである。
さらなる実施態様において、膜模倣物は、脂質二重層である。
さらなる実施態様において、膜模倣物は、人工脂質二重層である。
リポソームにおいて昆虫受容体タンパク質（ＯｒＸおよびＯｒｃｏ）を再構成するための方法は、当業界において公知である２８。
作用電極上での昆虫の匂い物質受容体複合体を含む脂質二重層の形成
理論に制限されることは望まないが、本出願人は、一部の実施態様において、リポソーム中の昆虫の匂い物質受容体複合体が作用電極に適用されると、リポソームが構造を変化させて電極上に脂質二重層を形成すると仮定している。本出願人は、ＯｒＸ受容体のリガンド／分析物結合ドメインがリガンド／分析物に接近可能になるように、昆虫の匂い物質受容体複合体は、インビボで細胞膜に見出されるものと類似のまたは同じコンフォメーションで脂質二重層中に埋め込まれると仮定している。
理論に制限されることは望まないが、本出願人は、他の実施態様において、リポソームは、作用電極に結合したとき、リポソームのままであることを仮定している。これは、図２に例示される。
基板への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、基板にカップリングされる。
基板にタンパク質をカップリングするための多数の方法が当業者公知である。このような方法としては、共有結合による化学的カップリング、光化学的な架橋、表面のコーティング／修飾、金の表面化学、タンパク質親和性タグ、ビオチン－ストレプトアビジン連結、抗体固定、および操作された表面結合ペプチド配列の使用が挙げられる。
また本発明のデバイスで使用するためのＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質は、アミン基、ヒスチジンタグ、または基板に昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングするのに使用される一部の他の官能基を含んでいてもよい。アミン基を有するタンパク質の場合、使用者は、基板にカップリングされた脱離基をアミン基を用いて置換し、基板にタンパク質を結合させてもよい。カップリングは、必ずしも求核脱離基反応によって達成されなくてもよく、カップリングは、共有結合（例えばアミド結合）、イオン結合、水素結合、または金属配位によって行われてもよい。配位の一例として、ＯｒＸまたはＯｒｃｏタンパク質は、ヒスチジンタグとニッケルとの配位によって、基板にカップリングされてもよい。またＯｒＸまたはＯｒｃｏタンパク質は、システイン残基によって基板にカップリングされてもよい。一部の実施態様において、天然に結合されるＯｒＸまたはＯｒｃｏタンパク質は、システイン残基を含む。これは、天然に存在するものでもよいし、またはこのような残基は、天然または組換えタンパク質に意図的に取り込まれていてもよい。さらなる情報は、ＷＯ２０１２／０５０６４６に見出すことができる。
一部の実施態様において、基板の表面は、膜貫通タンパク質に基板を連結する官能基を含む。１つの非限定的な例において、材料の表面は、カルボキシル化されたジアゾニウム塩で機能化（官能化、fanctionalized）されていてもよく、これは、自発的にカーボンナノチューブなどの基板への共有結合を形成する。アミンおよびアミド官能基は、好適であるとみなされ、フェノール基／芳香族官能基も同様である。
ＥＩＳのためのリンカー
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカーを介して電極にカップリングされる。
一実施態様において、リンカー分子は、昆虫の匂い物質受容体複合体と電極との電気的な連通が可能になる程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、電極が受容体から分離することを防ぐ程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６－メルカプトヘキサデカン酸（１６－ＭＨＤＡ）、６－メルカプトヘキサデカン酸（６－ＭＨＤＡ）および６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
好ましい実施態様において、リンカーは、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子（ＳＡＭ）層の一部である。
したがって、一実施態様において、ＳＡＭ層は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）で構成される。
さらなる実施態様において、ＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリングの前に実行される。
好ましくは、ＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、電極に昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングする前に、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を使用して実行される。
分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境における昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、作用電極における電気化学インピーダンスを変化させる。
カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）装置
好ましくは、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）装置は、少なくとも２つの端部を含む。さらなる実施態様において、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置は、少なくともソース電極およびドレイン電極を含む。
一実施態様において、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置は、
ａ）ソース電極
ｂ）ドレイン電極
ｃ）ゲート電極
ｄ）カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）で構成される少なくとも１つのチャネル
を含む。
好ましくは、ゲート電極は、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）線である。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。検出器要素は、ソース－ドレイン電流における変化を検出または測定する。
電気的な特徴における変化は、手動で、またはコンピューター制御下で操作される従来の電子機器を使用して測定することができる。例えば、コンピューター化された実験設定は、バイアス電圧および様々な値のゲート電圧を適用するための、ナショナルインスツルメンツ（National Instrument）のＰＣＩ－６７２２ＤＡＱボードを含んでいてもよい。次いでケースレー（Keithley）の６４８５ピコ電流計を、電流を測定するのに使用でき、それにより全Ｉ－Ｖｇ曲線を提供することができる。単一の基板上に配置された多くのデバイスを測定したいというケースにおいて、切り換えマトリックス（ケースレー７００１）または他のマルチプレクサーを使用してもよい。
アジレント（Agilent）の４１５６Ｃパラメーター分析器も、全ての電気的な測定に使用することができる。パラメーター分析器は、優れた感度を有し、フェムトアンペアスケールで電流を正確に測定することができる。
昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、分析物との相互作用に応答して、コンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、膜模倣物に存在する。
膜模倣物は、名前が示唆する通り、天然膜を模倣するものであり、インビボで見出されるのと同じかまたは類似したコンフォメーションで受容体を支持することができる。
膜模倣物は、リポソーム、アンフィポール、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、およびナノディスクから選択することができる。
好ましくは、膜模倣物は、人工物である。
好ましい実施態様において、膜模倣物は、ナノディスクである。
本発明のＣＮＴ－ＦＥＴデバイスにおけるチャネルへの昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、チャネルにおいて、カーボンナノチューブにカップリングされる。
昆虫の匂い物質受容体複合体の機能化
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＣＮＴへのカップリングが容易になるように機能化される。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグで機能化される。
それゆえに、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグを含む。
一実施態様において、ＯｒＸタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、ＯｒＸタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、Ｏｒｃｏタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、Ｏｒｃｏタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質の両方は、上記の通りのｈｉｓ－タグを含む。
ＣＮＴの機能化
一実施態様において、ＣＮＴは、昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリングが容易になるように機能化される。
さらなる実施態様において、ＣＮＴは、ニッケル（Ｎｉ）－ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）で機能化される。
カップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグとの親和性結合を介してＣＮＴにカップリングされる。
したがって、一実施態様において、ｈｉｓ－タグを有する昆虫の匂い物質受容体複合体は、Ｎｉ－ＮＴＡで機能化されたＣＮＴに結合する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、昆虫の匂い物質受容体複合体中のタンパク質上のアミンとの相互作用によってＣＮＴにカップリングされる。これらのアミンは、ＯｒＸとＯｒｃｏの両方に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、膜模倣物中の脂質（ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＰＯＰＳ）上のアミンとの相互作用によってＣＮＴにカップリングされる。
分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境における昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
さらなる実施態様において、分析物が昆虫ＯＲに結合することは、本発明のＣＮＴ－ＦＥＴ装置のチャネルにおける電気的なソース－ゲイン電流を変化させる。
グラフェン電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）装置
好ましくは、グラフェン電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）装置は、少なくとも２つの端部を含む。さらなる実施態様において、ＧＦＥＴ装置は、少なくともソース電極およびドレイン電極を含む。
一実施態様において、ＧＦＥＴ装置は、
ｅ）ソース電極
ｆ）ドレイン電極
ｇ）ゲート電極
ｈ）グラフェンで構成される少なくとも１つのチャネル
を含む。
好ましくは、ゲート電極は、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）線である。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。検出器要素は、ソース－ドレイン電流における変化を検出または測定する。
電気的な特徴における変化は、手動で、またはコンピューター制御下で操作される従来の電子機器を使用して測定することができる。例えば、コンピューター化された実験設定は、バイアス電圧および様々な値のゲート電圧を適用するための、ナショナルインスツルメンツ（National Instrument）のＰＣＩ－６７２２ＤＡＱボードを含んでいてもよい。次いでケースレー（Keithley）の６４８５ピコ電流計を、電流を測定するのに使用でき、それにより全Ｉ－Ｖｇ曲線を提供することができる。単一の基板上に配置された多くのデバイスを測定したいというケースにおいて、切り換え（switching）マトリックス（ケースレー７００１）または他のマルチプレクサーを使用してもよい。
アジレント（Agilent）の４１５６Ｃパラメーター分析器も、全ての電気的な測定に使用することができる。パラメーター分析器は、優れた感度を有し、フェムトアンペアスケールで電流を正確に測定することができる。
昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、分析物との相互作用に応答して、コンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、膜模倣物に存在する。
膜模倣物は、名前が示唆する通り、天然膜を模倣するものであり、インビボで見出されるのと同じかまたは類似したコンフォメーションで受容体を支持することができる。
膜模倣物は、リポソーム、アンフィポール、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、およびナノディスクから選択することができる。
好ましくは、膜模倣物は、人工物である。
好ましい実施態様において、膜模倣物は、リポソームである。
本発明のＧＦＥＴデバイスにおけるチャネルへの昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、チャネルにおいて、昆虫の匂い物質受容体複合体は、グラフェンにカップリングされる。
昆虫の匂い物質受容体複合体の機能化
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、グラフェンへのカップリングが容易になるように機能化される。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグで機能化される。
それゆえに、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグを含む。
一実施態様において、ＯｒＸタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、ＯｒＸタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、Ｏｒｃｏタンパク質は、ｈｉｓ－タグを含む。
好ましくは、ｈｉｓ－タグは、Ｏｒｃｏタンパク質のＮ末端にある。
さらなる実施態様において、ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質の両方は、上記の通りのｈｉｓ－タグを含む。
グラフェンの機能化
一実施態様において、グラフェンは、昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリングが容易になるように機能化される。
さらなる実施態様において、グラフェンは、１－ピレン酪酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＢＡＳＥ）で機能化される。
カップリング
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ｈｉｓ－タグとの親和性結合を介してグラフェンにカップリングされる。
したがって、一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、昆虫の匂い物質受容体複合体中のタンパク質上のアミンとの相互作用によってグラフェンにカップリングされる。これらのアミンは、ＯｒＸとＯｒｃｏの両方に存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、ＰＢＡＳＥ上のエステルと、膜模倣物中の脂質（ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＰＯＰＳ）上のアミンとの相互作用によってグラフェンにカップリングされる。
分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境における昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
さらなる実施態様において、分析物が昆虫ＯＲに結合することは、本発明のＧＦＥＴ装置のチャネルにおける電気的なソース－ゲイン電流を変化させる。
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）装置
好ましくは、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）装置は、
ａ）共振器要素
ｂ）加振源要素（oscillation source component）
ｃ）周波数を感知する要素
を含む。
共振器要素
一実施態様において、共振器要素は、圧電材料、少なくとも１種の圧電性結晶、および少なくとも１種の水晶振動子であるかまたはそれで構成される。好ましい実施態様において、共振器要素は、水晶共振子である。
一実施態様において、水晶振動子は、金でコーティングされている。
一実施態様において、共振器要素は、その対向する２つの側に電極が取り付けられている。
一実施態様において、電極は、金で構成されるか、または金でコーティングされている。
好ましい実施態様において、共振器要素は、少なくとも１つの昆虫の匂い物質受容体複合体と電気的に連通する。
加振源要素
一実施態様において、加振源要素は、共振器要素に交流電場を適用するように設計されている。
一実施態様において、交流電場は、共振器要素の対向する側に取り付けられた電極を介して適用される。
周波数を感知する要素
一実施態様において、周波数を感知する要素は、共振器要素の振動周波数を測定するように設計されている。一実施態様において、周波数を感知する要素は、共振器要素の振動周波数における変化を測定するように設計されている。
昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、分析物との相互作用に応答して、コンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、膜模倣物に存在する。
膜模倣物は、名前が示唆する通り、天然膜を模倣するものであり、インビボで見出されるのと同じかまたは類似したコンフォメーションで受容体を支持することができる。
膜模倣物は、リポソーム、アンフィポール、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、およびナノディスクから選択することができる。
好ましくは、膜模倣物は、人工物である。
好ましい実施態様において、膜模倣物は、リポソームである。
さらなる実施態様において、膜模倣物は、脂質二重層である。
さらなる実施態様において、膜模倣物は、人工脂質二重層である。
リポソームにおいて昆虫受容体を再構成するための方法は、当業界において公知である２８。
共振器要素上での昆虫の匂い物質受容体複合体を含む脂質二重層の形成
理論に制限されることは望まないが、本出願人は、一部の実施態様において、リポソーム中の昆虫の匂い物質受容体複合体が作用電極に適用されると、リポソームが構造を変化させて共振器要素上に脂質二重層を形成すると仮定している。本出願人は、受容体のリガンド／分析物結合ドメインがリガンド／分析物に接近可能になるように、昆虫の匂い物質受容体複合体は、インビボで細胞膜に見出されるものと類似のまたは同じコンフォメーションで脂質二重層中に埋め込まれると仮定している。
理論に制限されることは望まないが、本出願人は、他の実施態様において、リポソームは、作用電極に結合したとき、リポソームのままであることを仮定している。これは、図２に例示される。
ＱＣＭのためのリンカー
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リンカーを介して共振器要素にカップリングされる。
一実施態様において、リンカー分子は、昆虫の匂い物質受容体複合体と共振器要素との電気的な連通が可能になる程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、共振器要素が、昆虫の匂い物質受容体複合体から分離することを防ぐ程度に短い。
さらなる実施態様において、リンカー分子は、１６－メルカプトヘキサデカン酸（１６－ＭＨＤＡ）、６－メルカプトヘキサデカン酸（６－ＭＨＤＡ）および６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）から選択される。
好ましい実施態様において、リンカーは、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）である。
さらなる実施態様において、リンカーは、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の一部である。
したがって、一実施態様において、ＳＡＭ層は、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）で構成される。
さらなる実施態様において、ＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリングの前に実行される。
好ましくは、ＭＨＡのカルボキシル基の活性化は、電極に昆虫ＯｒＸをカップリングする前に、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の溶液を使用して実行される。
分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質受容体複合体中の昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境における昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、分析物の検出は、特異的である。
さらなる実施態様において、昆虫ＯｒＸへの分析物の結合は、共振器要素に適用された交流電場により誘導された共振器要素の共振振動数を変化させる。
二重層デバイス
センサーデバイスの一実施態様において、センサーは、
両親媒性分子、ＯｒＸタンパク質およびＯｒｃｏタンパク質を含む膜模倣物；
前記膜の第１の側に配置された第１の電極を含む第１の基板；および
前記膜の第２の側に配置された第２の電極を含む第２の基板
を含む。
電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、電気化学ポテンシャルである。別の実施態様において、電気的な特徴は、電流の流れである。
二重層センサーデバイスの電極
一実施態様において、基板は、作用電極である。一実施態様において、センサーは、対電極をさらに含む。
さらなる実施態様において、センサーは、参照電極をさらに含む。
さらなる実施態様において、電気化学セルは、ポテンシオスタットをさらに含む。
一実施態様において、電極の１つまたはそれより多くは、銀で構成されるか、または銀でコーティングされている。
センサーデバイスの二重層における昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
昆虫の匂い物質受容体複合体は、好ましくは、上述したように膜模倣物に配置される。
さらなる実施態様において、人工膜の第１の側は、第１の媒体を含む第１のボリューム（volume）と接触する。
さらなる実施態様において、人工膜の第２の側は、第２の媒体を含む第２のボリュームと接触する。第２の媒体は、第１の媒体と同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
好ましくは、第１の媒体および／または第２の媒体は、流動性の媒体、好ましくは液状媒体である。
第１の媒体および／または第２の媒体は、親水性媒体、好ましくは水性媒体であってもよい。
代替として、第１の媒体および／または第２の媒体は、疎水性媒体であってもよい。この代替の配置において、膜二重層の両親媒性分子の疎水性基は、媒体と接触した状態である。
さらなる実施態様において、第１の媒体および／または第２の媒体は、溶液中のイオン、好ましくは、水溶液中のイオン；好ましくは金属イオン；好ましくは第１族または第２族金属のイオンを含む。プロトン（Ｈ＋）、およびＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋イオンが好ましい。第１の媒体および第２の媒体中のイオンは、両方に存在する場合、同一でもよいし、または異なっていてもよい。
さらなる実施態様において、第１のボリュームおよび／または第２のボリュームは、ポリマーネットワークを含み、ポリマーネットワークは、二重層と直接接触していてもよいし、またはそうでなくてもよい。好ましくは、ポリマーネットワークは、ヒドロゲルを含むかまたはそれからなる。
さらなる実施態様において、第１のボリュームは、直径が少なくとも１００ｎｍの、好ましくは直径が少なくとも２００ｎｍの第１の媒体の液滴を含み、および／または第２のボリュームは、直径が少なくとも１００ｎｍの、好ましくは直径が少なくとも２００ｎｍの第２の媒体の液滴を含む。
さらなる実施態様において、第１のボリュームおよび／または第２のボリュームは、第１の媒体または第２の媒体それぞれを取り囲む両親媒性分子の層を含む。第１の媒体および／または第２の媒体は、全体的に取り囲まれていなくてもよい。
さらなる実施態様において、両親媒性分子の層は、第１および／または第２のボリュームの全部または一部をカバーしていてもよい。両親媒性分子の層は、典型的には単分子層である。
好ましい実施態様において、人工二重層はそれゆえに、第１および第２のボリュームそれぞれを取り囲む両親媒性分子の層が接触しているところに形成された液滴界面二重層であり得る。他の実施態様において、平面の二重層であり得る。
好ましくは、膜は、脂質分子などの両親媒性分子を含む。好ましくは、両親媒性分子は、リン脂質分子を含む。好ましい脂質分子としては、ＤＰｈＰＣ（１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＳ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン）、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＥ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質、ＰＯＰＧ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））、およびそれらの塩が挙げられる。
さらなる実施態様において、膜、および存在する場合、第１のボリューム、および存在する場合、第２のボリュームは、疎水性媒体中に配置され、好ましくは、疎水性媒体は、油を含む。
さらなる実施態様において、ＯｒＸおよびＯｒｃｏは、イオノトロピック型膜タンパク質である。ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質は一緒に、複合体を形成する。一部の実施態様において、複合体は、分析物の存在下で形成される。
二重層センサーを用いた分析物の検出
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、分析物の存在またはそれ以外に対して感受性のイオンチャネルを形成する。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
さらなる実施態様において、分析物の結合は、昆虫の匂い物質受容体複合体を活性化して、膜を通過するイオンの流れをもたらす。
好ましくは、第１の電極は、膜の第１の側と電気的に接触しており、第２の電極は、膜の第２の側と電気的に接触している。
さらなる実施態様において、センサーは、第１の電極と第２の電極との間の電気的な特徴、例えば電流の流れを測定するように設計されている制御システムを含む。
さらなる実施態様において、センサーは、出力システムをさらに含み、その表示システムは、分析物が検出されたことを示すように設計されている。分析物の検出は、当業界において公知のあらゆるシステム、例えば警報器、電気シグナル、グラフィカルユーザーインターフェースなどによって示すことができる。表示システムはまた、分析物の存在または非存在、分析物の濃度などを示すこともできる。
感知方法
さらなる実施態様において、本明細書で開示されるセンサーを使用して分析物を検出するための方法であって、センサーは、
ａ）両親媒性分子、Ｏｒｘタンパク質およびＯｒｃｏタンパク質を含む膜；
ｂ）膜の第１の側に配置された第１の電極を含む第１の基板；および
ｃ）膜の第２の側に配置された第２の電極を含む第２の基板
を含み、該方法は、
ａ）分析物を膜と接触させる工程；および
ｂ）第１および第２の電極にわたり電気的な測定値を得る工程
を含む、方法が提供される。
分析物と昆虫の匂い物質受容体複合体との接触は、昆虫の匂い物質受容体複合体によって形成されたイオンチャネルを通るイオンの流れを引き起こす。理論に縛られることはないが、このチャネルのイオンに対する透過性は、分析物がＯｒＸと相互作用するとき変化すると考えられる。イオンチャネルを通る第１の電極と第２の電極との間のイオンの流れは、電極間に電流が流れることを可能にする。
好ましくは、本方法は、第１の電極と第２の電極との間に流れる電流を検出することを含む。電流のレベルは、イオンチャネルの状態を示し、結合または結合した分析物の種類を示し得る。好ましくは、電流における変化は、分析物の結合を示す。
電流における変化は、経時的な変化として測定することができる。このような測定は、一連の別々の測定、または連続的な測定を含んでいてもよい。複数の測定値または連続的な測定値をとることは、より多くの複合体シグナルの検出を可能にし、このようなシグナルを解明して、例えば複数の分析物が存在するのかどうかを示すことができる。
さらなる実施態様において、本方法は、ｉ）分析物が存在するかどうかを決定する工程、ｉｉ）どの分析物が存在するかを決定する工程、および／またはｉｉｉ）分析物の濃度を決定する工程などの任意のさらなる工程を含む。
さらなる実施態様において、本方法は、第１の電極と第２の電極との間に電位を適用する。一部の実施態様において、電位は、ゼロであってもよい。
さらなる実施態様において、本方法は、ＯｒｃｏおよびＯｒＸタンパク質によって形成された複合体を介した、膜を通るイオンの流れを検出する工程を含む。
さらなる実施態様において、本方法は、分析物を膜と接触させる工程を含み、これは、Ｏｒｃｏタンパク質、Ｏｒｘタンパク質および分析物を含む複合体を形成することを含む。
さらなる実施態様において、本方法は、分析物とＯｒｃｏおよびＯｒｘタンパク質との相互作用を検出する工程を含む。
さらなる実施態様において、膜の第１の側は、第１の媒体を含む第１のボリュームと接触し、本方法は、第１のボリュームに分析物を導入する工程を含む。
さらなる実施態様において、センサーは、本明細書において定義されるセンサーであり、本方法は、第１の電極および第２の電極のそれぞれにわたる複合的な電気的な測定値を得る工程を含み、好ましくは、第２の電極と第１の電極のそれぞれとの間に流れる複合的な電流を検出する工程を含む。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーデバイス
小さい可溶性の分析物を検出するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の使用は周知である（例えば「Advances in Biosensors - Vol 5. 2003」Bansi D. MalhotraおよびAnthony P. F. Turner編、Pub. Jai Press Ltd、ロンドンを参照）。
表面プラズモン（ＳＰ）は、電磁波、例えば光と共に誘電性物質（例えばシリカガラス）と金属（例えば銀または金）との間の界面に沿って伝播するコヒーレント電子振動を指す。特定の条件下で（波長、分極および／または入射角によって定義される）、金属の表面における遊離の電子は、入射光の光子を吸収し、それらを表面プラズモン波に変換する。共鳴状態は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）と称され、これは、光の光子周波数が、金属の陽子核の復元力に対して振動する表面電子の天然の周波数と一致するときに確立され得る。
表面プラズマ共鳴条件を使用して、光の反射角度の最小値（または吸収の最大値）を測定することによって、金属性の表面にカップリングされた昆虫の匂い物質受容体複合体への分析物の結合を検出することができる。例えば、昆虫の匂い物質受容体複合体への分析物の結合は、金属表面における攪乱を引き起こす可能性があり、これは順に、ＳＰＲ状態の変更を誘発する可能性がある。このような変更は、基板の反射率における変化として測定することができ、様々な標的分子の存在を測定するのに合わせて適合される一部のＳＰＲベースの測定技術のための基準を形成する。センサーデバイスの一実施態様において、基板は、ガラスプリズム上の不活性金属表面である。好ましくは、金属表面は、銀または金の金属性の層である。より好ましくは、金属層は、およそ５０ｎｍの厚さを有する。
電気的な特徴
一実施態様において、電気的な特徴は、表面プラズモン共鳴である。
ＳＰＲセンサーデバイスにおける昆虫の匂い物質受容体複合体の存在
昆虫の匂い物質受容体複合体は、上述したような膜模倣物に存在していてもよい。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リポソーム、例えば人工リポソーム、またはナノディスクに存在する。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、脂質二重層、例えば人工脂質二重層に存在する。
好ましい実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、リポソームに存在する。
ＳＰＲセンサーデバイスにおける金属性の層への昆虫の匂い物質受容体複合体のカップリング
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、金属表面にカップリングされる。
さらなる実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、Ｎ末端のシステイン残基を介して金属表面に直接カップリングされる。
ＳＰＲセンサーを用いた分析物の検出
さらなる実施態様において、センサーは、昆虫の匂い物質受容体複合体中の昆虫ＯｒＸへの分析物の結合を検出することが可能である。
さらなる実施態様において、センサーは、環境において、昆虫ＯｒＸに結合する分析物の存在を検出することが可能である。
好ましくは、検出は、分析物に特異的である。
さらなる実施態様において、ＳＰＲセンサーは、
（ａ）分析物と結合することが可能な昆虫の匂い物質受容体複合体が結合する金属表面、
（ｂ）金属表面における方向付けのための光源励起ビーム、
（ｃ）金属表面から内部反射する光ビームから光を検出することが可能な少なくとも１つの検出器
を含む。
さらなる実施態様において、ＳＰＲセンサーは、任意にビーム改変手段（beam modifying means）を含み、これは、制御された方法で励起ビームに影響を与え、それによりセンサー表面から放出された光のレベルを実質的に強化するものである。
ビーム改変手段は、金属表面に対する角度範囲にわたり、励起ビームを変位させるように機能するものであり得る。励起変位手段は、ビーム反映鏡（beam-reflecting mirror）および鏡を振動させるための手段を含み得る。励起ビームは、直線のビーム、扇形のビームまたはくさび形のビームを含み得る。
代替として、ビーム改変手段は、励起ビームの波長を調整するように機能するものであり得る。
さらなる実施態様において、分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程は、センサーの屈折率における変化を引き起こす。好ましくは、この変化は、表面プラズモン共鳴角または共鳴波長におけるシフトを測定することによって検出される。
検出器要素
さらなる実施態様において、センサーは、検出器要素を含む。
さらなる実施態様において、検出器要素は、励起ビームの共鳴波長の時間変動（固定した共鳴角での）または固定した波長での共鳴角の時間シフトを検出または測定する。
検出の感度
上記で論じられたように、本発明のセンサーは驚くほどよく作用する。本出願人は、本発明のセンサーデバイスが、昆虫匂い物質受容体の使用を含む公知のアッセイのどれよりも顕著に高い感度を有することを示した。
一実施態様において、センサーは、１×１０－３Ｍ未満、好ましくは１×１０－３Ｍ未満、より好ましくは１×１０－４Ｍ未満、より好ましくは１×１０－５Ｍ未満、より好ましくは１×１０－６Ｍ未満、より好ましくは１×１０－７Ｍ未満、より好ましくは１×１０－８Ｍ未満、より好ましくは１×１０－９Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１０Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１１Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１２Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１３Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１４Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１５Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１６Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１７Ｍ未満、より好ましくは１×１０－１８Ｍ未満の濃度で分析物の存在を検出することができる。
ダイナミックレンジ
一実施態様において、センサーにおいて、分析物の検出に関するダイナミックレンジは、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、より好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも１０桁の分析物濃度である。
本発明のセンサーの他の利点
本発明のセンサーは、便利さ、携帯できること、安定性、迅速な検出、感度、および測定の容易さに関して、これまでに公知の昆虫ＯＲベースのシステム／アッセイを上回る多数の潜在的な利点を提供する。
分析物の媒体
分析物は、ガス状または液状媒体中にあってもよい。
任意の捕獲要素
センサーデバイスは、加えて、分析物を捕獲し、受容体に分析物を提示するための要素を含んでいてもよい。一部の実施態様において、この要素は、ＯｒＸへ提示するために揮発性分析物を捕獲することに関して有用であり得る。これは、液相または気相のいずれかにおいて標的ＶＯＣを取り扱うためのマイクロチャネルの使用を含んでいてもよい（２９）。マイクロ流体システムは、液相中（３０～３１）および気相中（３１～３３）でセンサー表面に標的分子を送達するように設計されている。
多重化（multiplexing）
本発明は、昆虫の匂い物質受容体複合体中の複数の異なるＯｒＸタンパク質を使用する多重アプローチを予期する。この方法で、使用者は、複数の分析物に対して高感度を有する多重デバイスを構築することができる。このような多重デバイスは、本明細書で記載される通り、数十、数百、またはさらには数千ものセンサーを含んでいてもよい。また多重デバイスは、「ダブルチェック」をデバイスに導入するように、同じ昆虫の匂い物質受容体複合体にカップリングされる２またはそれより多くのセンサーを含んでいてもよい。
本発明はまた、昆虫の匂い物質受容体複合体においてそれぞれ異なるまたは同じ受容体を含む複数のセンサー基板を有するチップの使用も予期する。本発明のセンサーデバイスの要素は、このようなチップであってもよい。
本発明のセンサーデバイスを使用する方法
本発明は、上述したような分析物および／または環境における分析物の存在を検出するための本発明のセンサーデバイスの使用方法を提供する。
対照および較正
使用者は、デバイスの電気的な特徴を、対照、公知の分析物、またはその両方にデバイスを曝露したときに測定された対応する電気的な特徴と比較することができる。使用者はまた、サンプル中の１種またはそれより多くの分析物の存在を見積もることもできる。これは、サンプルで観察された電気的な特徴を、目的の分析物の公知の量を有する対照または標準から集められたデータポイントに対応するその電気的な特徴の検量線と比較することによって達成することができる。この方法で、使用者は、デバイスが接触したサンプル中に存在する分析物の濃度を見積もることができる。
使用者は、１つまたはそれより多くの公知の分析物へのデバイスの曝露に対応する、デバイスの１つまたはそれより多くの電気的な特徴のライブラリーを構築することができる。例えば、使用者は、デバイスを様々な濃度の分析物に曝露したときに観察される電気的な特徴を表す結果のライブラリーを構築することができる。
本発明のセンサーデバイスの製造方法
センサーデバイス
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスを製造する方法であって、昆虫の匂い物質受容体複合体と、センサーデバイスの基板との間に電気的な連通を確立する工程を含み、センサーデバイスは、基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記方法を提供する。
一実施態様において、本方法は、基板に昆虫の匂い物質受容体複合体をカップリングする工程を含む。
一実施態様において、昆虫の匂い物質受容体複合体は、昆虫の匂い物質受容体複合体がカップリングされた基板がセンサーデバイスに組み立てられる前に、基板にカップリングされる。
好ましくは、センサーの要素、カップリングおよび機能化は、本明細書に記載される通りである。
センサーの要素
さらなる形態において、本発明は、センサーデバイスのための要素を生産するための方法であって、要素は、本明細書で定義されるように基板と電気的に連通する昆虫の匂い物質受容体複合体を含む、方法を提供する。本方法は、本明細書に記載されるように、昆虫の匂い物質受容体複合体と基板との間に電気的な連通を確立することを含む。この要素は、本発明に係るセンサーデバイスに付与するのに有用である。
さらなる実施態様において、本発明は、センサーデバイスを生産するための方法であって、本明細書で記載されるように、要素を他の要素に付与して、本発明に係るセンサーデバイスを生産することを含む、上記方法を提供する。
本発明のＥＩＳセンサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、本明細書に記載されるような電気化学セルの作用電極である。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体と電気化学セルの作用電極との間に電気的な連通を確立する工程を含み、電気化学セルは、作用電極の電気化学インピーダンスにおける変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一例として、本発明のＥＩＳデバイスの製造のための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。この実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
本発明のＣＮＴ－ＦＥＴセンサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、本明細書に記載されるようなＣＮＴ－ＦＥＴ装置のチャネルである。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体と、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置のチャネルとの間に電気的な連通を確立する工程を含み、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置のチャネルは、ＣＮＴ－ＦＥＴ装置のソース－ゲイン電流における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一例として、本発明のＣＮＴ－ＦＥＴデバイスの製造のための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。この実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
本発明のグラフェンＦＥＴ（ＧＦＥＴ）センサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、本明細書に記載されるようなＧＦＥＴ装置のチャネルである。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体と、ＧＦＥＴ装置のチャネルとの間に電気的な連通を確立する工程を含み、ＧＦＥＴ装置のチャネルは、ＧＦＥＴ装置のソース－ゲイン電流における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一例として、本発明のＧＦＥＴデバイスの製造のための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。この実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
本発明のＱＣＭセンサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、本明細書に記載されるような水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）の共振器要素である。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体と、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）の共振器要素との間に電気的な連通を確立する工程を含み、ＱＣＭは、共振器要素に適用された交流電場により誘導された振動の共振振動数における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一例として、本発明のＱＣＭデバイスの製造のための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。この実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
本発明の二重層センサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、本明細書に記載されるような電気化学セルの作用電極である。
したがって、一実施態様において、方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体と電気化学セルの作用電極との間に電気的な連通を確立する工程を含み、電気化学セルは、作用電極と第２の電極との間の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一例として、本発明の二重層デバイスの製造のための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。この実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
本発明のＳＰＲセンサーデバイスの製造方法
一実施態様において、基板は、本明細書に記載されるようなプリズム上の不活性金属表面である。
したがって、一実施態様において、本方法は、昆虫の匂い物質受容体複合体を金属表面にカップリングする工程を含み、デバイスは、基板の屈折率における変化を検出するように設計されており、このようにしてセンサーデバイスが形成される。
一例として、本発明のＳＰＲデバイスの製造のための好適な方法は、実施例のセクションに記載される。この実施例は、本発明の範囲を限定することを意図していない。
一般的な定義および方法
ＯｒＸおよびＯｒｃｏタンパク質／ポリペプチドならびにフラグメント
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸残基が共有結合によるペプチド結合によって連結された、あらゆる長さを有する、ただし好ましくは全長タンパク質を含み、少なくとも５個のアミノ酸のアミノ酸鎖を含む。本発明で使用するためのポリペプチドは、好ましくは、組換えまたは合成技術を使用して部分的または全体的に生産される。
ポリペプチドの「フラグメント」は、好ましくはポリペプチドの機能を発揮する、および／またはポリペプチドの３次元構造を提供するポリペプチドの部分配列である。
本明細書で使用されるＯｒＸポリペプチドの「機能的なフラグメント」は、分析物と結合する機能を発揮することができ、結合するとき、それが一部を構成する昆虫の匂い物質受容体複合体におけるコンフォメーション変化をもたらすことができるＯｒＸの部分配列であり、ここでコンフォメーション変化は、機能的なフラグメントを結合させた基板の電気特性における変化をもたらす。一実施態様において、コンフォメーション変化は、昆虫の匂い物質受容体複合体におけるイオンチャネルの開口である。
本明細書で使用されるＯｒｃｏポリペプチドの「機能的なフラグメント」は、分析物が昆虫の匂い物質受容体複合体中のＯｒＸに結合するときにコンフォメーション変化を受ける昆虫の匂い物質コレセプターの機能を発揮することができるＯｒｃｏの部分配列であり、ここでコンフォメーション変化は、機能的なフラグメントを結合させた基板の電気特性における変化をもたらす。一実施態様において、コンフォメーション変化は、昆虫の匂い物質受容体複合体におけるイオンチャネルの開口である。
用語「組換え」は、その天然の環境中でその周りにある配列から除去され、および／またはその天然の環境に存在しない配列と組み換えられるポリヌクレオチド配列を指す。
「組換え」ポリペプチド配列は、「組換え」ポリヌクレオチド配列からの翻訳によって生産される。
バリアント
ＯｒＸまたはＯｒｃｏポリペプチドのバリアントは、１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された、具体的に同定された配列と異なるポリペプチド配列を指す。バリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアント（allelic variant）であってもよいし、または天然に存在しないバリアントであってもよい。バリアントは、同じ種由来であってもよいし、または他の種由来であってもよく、ホモログ、パラログおよびオルソログを含んでいてもよい。特定の実施態様において、同定されたポリペプチドのバリアントは、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの生物活性と同じまたは類似の生物活性を有する。
好ましくは、ＯｒＸポリペプチドバリアントは、分析物と結合する機能を発揮することができ、結合するとき、それが一部を構成する昆虫の匂い物質受容体複合体におけるコンフォメーション変化をもたらすことができ、ここでコンフォメーション変化は、機能的なフラグメントを結合させた基板の電気特性における変化をもたらす。一実施態様において、コンフォメーション変化は、昆虫の匂い物質受容体複合体におけるイオンチャネルの開口である。
好ましくは、ＯｒＸポリペプチドバリアントは、昆虫の匂い物質コレセプターの機能を発揮することができ、分析物が昆虫の匂い物質受容体複合体中のＯｒＸに結合するときにコンフォメーション変化を受けるものであり、ここでコンフォメーション変化は、機能的なフラグメントを結合させた基板の電気特性における変化をもたらす。一実施態様において、コンフォメーション変化は、昆虫の匂い物質受容体複合体におけるイオンチャネルの開口である。
バリアントポリペプチド配列は、好ましくは、本発明の配列に、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を呈示する。同一性は、好ましくは同定されたポリペプチドの全長にわたり計算される。
ポリペプチド配列の同一性は、以下の方式で決定することができる。ワールドワイドウェブ上のＮＣＢＩウェブサイトftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/から公的に入手可能なｂｌ２ｓｅｑで、ＢＬＡＳＴＰ（プログラムのＢＬＡＳＴスイート、バージョン２．２．５［２００２年１１月］より）を使用して、対象のポリペプチド配列を候補ポリペプチド配列と比較する。
ポリペプチド配列の同一性はまた、グローバル配列アライメントプログラムを使用して、候補ポリヌクレオチド配列と対象ポリヌクレオチド配列との間のオーバーラップの全長にわたり計算することもできる。上記で論じられたように、ＥＭＢＯＳＳ－ニードル（http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/で入手可能）およびギャップ（Huang, X. （1994）On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10、227～235）も、ポリペプチド配列の同一性を計算するための好適なグローバル配列アライメントプログラムである。
ポリペプチドの％配列同一性を計算するための好ましい方法は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ（Jeanmouginら、1998、Trends Biochem. Sci.23、403～405）を使用して比較するために配列を並べることに基づく。
その生物活性を有意に変更しない記載されたポリペプチド配列の１つまたは数種のアミノ酸の保存的置換も本発明に含まれる。当業者は、表現型的にはサイレントのアミノ酸置換をなす方法を認識しているだろう（例えば、Bowieら、1990、Science 247、1306を参照）。
ポリペプチドを生産するための方法
本発明で使用されるポリペプチドは、バリアントポリペプチドを含め、当業界において周知のペプチド合成方法、例えば固相技術を使用する直接のペプチド合成（例えばStewartら、1969、Solid-Phase Peptide Synthesis、WH Freeman Co、カリフォルニア州サンフランシスコ）、または例えばアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）の４３１Ａペプチドシンセサイザー（カリフォルニア州フォスターシティー）を使用する自動合成を使用して調製することができる。ポリペプチドの突然変異した形態も、このような合成中に生産することができる。
好ましくは、ポリペプチドおよびバリアントポリペプチドは、以下で論じられるように好適な宿主細胞中で組換え発現され、細胞から分離される。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するために、当業者周知の方法によって都合のよい形態で合成することができる。ポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものであってもよいし、または例えば配列が組換え発現された細胞にとって好ましいコドン出現頻度（codon usage）の使用を介して、天然に存在する配列から適合させてもよい。
コンストラクトおよびベクターを生産するための方法
本発明で使用するための遺伝学的コンストラクトは、本発明で使用するためのＯｒＸまたはＯｒｃｏポリペプチドをコードする１つまたはそれより多くのポリヌクレオチド配列を含み、例えば細菌、真菌、昆虫、哺乳類または植物などの生物を形質転換するのに有用であり得る。
遺伝学的コンストラクトおよびベクターを生産および使用するための方法は当業界において周知であり、一般的に、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、1987；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing、1987）に記載されている。
ポリヌクレオチド、コンストラクトまたはベクターを含む宿主細胞を生産するための方法
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、本発明で使用するためのポリペプチドの組換え生産に関して、当業界において周知の方法（例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、1987；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing、1987）において有用である。このような方法は、本発明のポリペプチドの発現に好適な、またはそれを助長する条件下で、適切な培地で宿主細胞を培養することを含んでいてもよい。発現された組換えポリペプチドは、任意に培養物に分泌させてもよく、次いで、当業界において周知の方法（例えばDeutscher編、1990、Methods in Enzymology、182巻、Guide to Protein Purification）によって培地、宿主細胞または培養培地から分離してもよい。
用語「含む」は、本明細書で使用される場合、「から少なくとも部分的になる」を意味する。本明細書における用語「含む」を含む各記述を解釈するとき、この用語の後に記載される１つまたは複数の特徴以外の特徴も存在し得る。「含む（comprise）」および「含む（comprises）」などの関連用語は、同じように解釈されることとする。
本明細書で開示された数値範囲への言及（例えば１～１０）はまた、その範囲内の全ての合理的な数値への言及（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９および１０）、さらに、その範囲内の合理的な数値のあらゆる範囲（例えば、２～８、１．５～５．５および３．１～４．ｋ７）への言及も含むことが意図され、それゆえに、本明細書で明示的に開示された全ての範囲の全ての部分範囲がそれにより明示的に開示される。これらは具体的に意図されるものの単なる例であり、列挙された下限値から上限値の間の数値のあらゆる可能な組合せが、本出願において類似の方式で明示的に述べられているとみなされるものとする。
代替の実施態様または構成は、本明細書において例示された、記載された、または言及されたパーツ、エレメントまたは機構の２つまたはそれより多くの、いずれかのまたは全ての組合せを含んでいてもよいことが理解されるものとする。
本発明はまた、本願明細書で個々にまたは集合的に言及または示されたパーツ、エレメントおよび機構、ならびに前記パーツ、エレメントまたは機構のいずれか２つまたはそれより多くのいずれかのまたは全ての組合せで構成されるように幅広く述べることができる。
本発明が関する分野の当業者であれば、添付の特許請求の範囲で定義した通りの本発明の範囲から逸脱することなく、構造における多くの変化および本発明の広範に様々な実施態様および適用に想到するであろう。本明細書における開示および記載は単に例示的なものであり、決して限定を意図していない。本明細書で、本発明が属する分野において公知の等価値がある具体的な整数が述べられる場合、このような公知の等価値は、個々に明示されたのと同様にして本明細書に含まれるとみなされる。
本発明は、添付の非限定的な図面を参照してよりよく理解されるであろう。
図１は、リガンド開口型非選択的カチオンチャネルを生産するための、匂い物質が結合したＯｒＸサブユニットおよびＯｒｃｏサブユニットで構成される昆虫ＯＲ膜複合体の概略図である。オレンジ色の丸は、結合した匂い物質を表す。 図２は、電極のクリーニングから始まり、続いてＳＡＭを形成し、ＳＡＭ層上にリポソームを共有結合させることで終わるＥＩＳセンサー製造の概略図である。電気化学的な読み出しは、３つの末端の電気化学的な構成で行われたＥＩＳ測定から得られる。青色の外観の丸は、リポソームと一体化した昆虫ＯｒＸまたはＯｒＸ／Ｏｒｃｏ複合体を表し、赤色の外観は、ＶＯＣリガンドを表す。 図３は、それぞれ、そのままの、ＳＡＭで改変された、ＮＨＳ－ＥＤＣとカップリングされた、およびＯｒ２２ａ／リポソームが固定された金表面の、ＡＦＭの高さの画像（ａ～ｄ）、高さの画像上にマークされたラインによって示された粗さのプロファイル（ｅ～ｈ）、および３Ｄ画像（ｉ～ｌ）を示す。 図４は、（Ａ）１ａＭ～１００μＭの濃度範囲を有する標的リガンドであるサリチル酸メチル（ｍｅｔｓａｌ）に対するＯｒ１０ａリポソームで機能化された電極のインピーダンスエボリューションである。実験データは記号として提示され、等価回路フィッティング曲線は実線として提示される。（Ｂ）標的リガンドであるサリチル酸メチル、および対照リガンドであるヘキサン酸メチルへの応答におけるＯｒ１０ａリポソームで機能化された金電極に関する用量応答曲線。標的および対照リガンドの結合測定も、空のリポソームで機能化された金電極で実行した。４回の反復を使用した標準偏差を使用して、エラーバーを作成した。 図５は、（Ａ）１ａＭ～１００μＭの濃度範囲を有する標的リガンドであるサリチル酸メチル（ｍｅｔｓａｌ）に対するＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化された電極のインピーダンスエボリューションである。実験データは記号として提示され、等価回路フィッティング曲線は実線として提示される。（Ｂ）標的リガンドであるサリチル酸メチルへの応答におけるＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化された金電極に関する用量応答曲線。標的リガンドの結合測定も、空応答を実証する空のリポソームおよびＯｒｃｏリポソームで機能化された金電極で実行した。４回の反復を使用した標準偏差を使用して、エラーバーを作成した。 図６は、（Ａ）１ａＭ～１００μＭの濃度範囲を有する標的リガンドであるヘキサン酸メチル（ｍｅｔｈｅｘ）に対する、Ｏｒ２２ａリポソームで機能化された電極のインピーダンスエボリューションである。実験データは記号として提示され、等価回路フィッティング曲線は実線として提示される。（Ｂ）標的リガンドであるヘキサン酸メチル、および対照リガンドであるサリチル酸メチルへの応答におけるＯｒ２２ａリポソームで機能化された金電極に関する用量応答曲線。標的および対照リガンドの結合測定も、空のリポソームで機能化された金電極で実行した。４回の反復を使用した標準偏差を使用して、エラーバーを作成した。 図７は、（Ａ）１ａＭ～１００μＭの濃度範囲を有する標的リガンドであるヘキサン酸メチル（ｍｅｔｈｅｘ）に対する、Ｏｒ２２ａ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化された電極のインピーダンスエボリューションである。実験データは記号として提示され、等価回路フィッティング曲線は実線として提示される。（Ｂ）標的リガンドであるヘキサン酸メチルへの応答におけるＯｒ２２ａ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化された金電極に関する用量応答曲線。標的リガンドの結合測定も、空応答を実証する空のリポソームおよびＯｒｃｏリポソームで機能化された金電極で実行した。４回の反復を使用した標準偏差を使用して、エラーバーを作成した。 図８は、（Ａ）１ａＭ～１００μＭの濃度範囲を有する標的リガンドであるＥ２－ヘキセナールに対する、リポソームで機能化された電極におけるＯｒ３５ａのインピーダンスエボリューションである。実験データは記号として提示され、等価回路フィッティング曲線は実線として提示される。（Ｂ）標的リガンドであるＥ２－ヘキセナール、および対照リガンドであるサリチル酸メチルへの応答におけるＯｒ３５ａリポソームで機能化された金電極に関する用量応答曲線。標的および対照リガンドの結合測定も、空のリポソームで機能化された金電極で実行した。４回の反復を使用した標準偏差を使用して、エラーバーを作成した。 図９は、（Ａ）１ａＭ～１００μＭの濃度範囲を有する標的リガンドであるＥ２－ヘキセナールに対する、リポソームで機能化された電極におけるＯｒ３５ａ／Ｏｒｃｏのインピーダンスエボリューションである。実験データは記号として提示され、等価回路フィッティング曲線は実線として提示される。Ｂ）標的リガンドであるＥ２－ヘキセナールへの応答におけるＯｒ３５ａ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化された金電極に関する用量応答曲線。標的リガンドの結合測定も、空応答を実証する空のリポソームおよびＯｒｃｏリポソームで機能化された金電極で実行した。４回の反復を使用した標準偏差を使用して、エラーバーを作成した。 図１０は、（ａ）Ｏｒ１０ａ±Ｏｒｃｏ、（ｂ）Ｏｒ２２ａ±Ｏｒｃｏ、および（ｃ）標的および対照リガンドへの応答におけるＯｒ３５ａ±Ｏｒｃｏリポソームに関するＥＩＳ用量応答曲線の要約である。全ての３つの用量応答曲線は、Ｏｒｃｏの存在が、各ＯｒＸ受容体がより大きい感度でその標的化合物に結合することをもたらすことを示しており、したがって用量応答曲線は左にシフトする。４回の反復を使用した標準偏差を使用して、エラーバーを作成した。 図１０は、（ａ）Ｏｒ１０ａ±Ｏｒｃｏ、（ｂ）Ｏｒ２２ａ±Ｏｒｃｏ、および（ｃ）標的および対照リガンドへの応答におけるＯｒ３５ａ±Ｏｒｃｏリポソームに関するＥＩＳ用量応答曲線の要約である。全ての３つの用量応答曲線は、Ｏｒｃｏの存在が、各ＯｒＸ受容体がより大きい感度でその標的化合物に結合することをもたらすことを示しており、したがって用量応答曲線は左にシフトする。４回の反復を使用した標準偏差を使用して、エラーバーを作成した。 図１１は、（Ａ）ＳＡＭおよびＮＨＳ／ＥＤＣでの改変、Ｏｒ１０ａリポソーム（上）またはＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソーム（下）の固定、それに続く標的リガンドであるサリチル酸メチル（ｍｅｔｓａｌ）の結合に伴う、散逸による水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ－Ｄ）における周波数の変化である。（Ｂ）Ｏｒ１０ａリポソーム（上）またはＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソーム（下）を固定したＱＣＭ－Ｄセンサーの場合の、濃度を増加させたサリチル酸メチル（１％ＤＭＳＯを含む緩衝液、１．６、８、２０、４０、１００、２００、５００および１０００μＭ）に伴う周波数における変化の拡大図を示す。（Ｃ）Ｏｒ１０ａリポソームまたはＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームが固定された金結晶のいずれかに曝露したときの、標的リガンドであるサリチル酸メチル、および対照リガンドであるヘキサン酸メチル（ｍｅｔｈｅｘ）の検出を示す用量応答曲線。エラーバー；２回の反復を使用して標準偏差（ＳＤ）を作成した。 図１１は、（Ａ）ＳＡＭおよびＮＨＳ／ＥＤＣでの改変、Ｏｒ１０ａリポソーム（上）またはＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソーム（下）の固定、それに続く標的リガンドであるサリチル酸メチル（ｍｅｔｓａｌ）の結合に伴う、散逸による水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ－Ｄ）における周波数の変化である。（Ｂ）Ｏｒ１０ａリポソーム（上）またはＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソーム（下）を固定したＱＣＭ－Ｄセンサーの場合の、濃度を増加させたサリチル酸メチル（１％ＤＭＳＯを含む緩衝液、１．６、８、２０、４０、１００、２００、５００および１０００μＭ）に伴う周波数における変化の拡大図を示す。（Ｃ）Ｏｒ１０ａリポソームまたはＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームが固定された金結晶のいずれかに曝露したときの、標的リガンドであるサリチル酸メチル、および対照リガンドであるヘキサン酸メチル（ｍｅｔｈｅｘ）の検出を示す用量応答曲線。エラーバー；２回の反復を使用して標準偏差（ＳＤ）を作成した。 図１２は、Ｓｉ／ＳｉＯ２基板上にＧＦＥＴの製作に関与する主要な工程であり、（ａ）グラフェンがコーティングされたＳｉ／ＳｉＯ２基板、（ｂ）不要なグラフェン層のエッチング、（ｃ）Ｓｉ／ＳｉＯ２基板上のグラフェンチャネル、（ｄ）電極の堆積、および（ｅ）電極の封止である。 図１３は、グラフェン上のリポソーム固定の概略図であり、（ａ）π－π相互作用を使用してグラフェン上でＰＢＡＳＥを機能化すること、（ｂ）ＰＢＡＳＥで機能化されたＣＮＴをリポソームとインキュベートすること、（ｃ）求核置換反応を使用して、リポソーをＰＢＡＳＥと係留することである。 図１４は、グラフェンチャネル上に固定された、（ａ）Ｏｒ１０ａリポソーム、（ｂ）Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソーム、（ｃ）Ｏｒ２２ａリポソーム、（ｄ）Ｏｒ２２ａ／Ｏｒｃｏリポソーム、（ｅ）空のリポソーム、および（ｆ）ＯｒｃｏリポソームのＡＦＭ画像である。 図１５は、ＧＦＥＴデバイスの概略図および変換特性である。（ａ）液体ゲート測定のためのソースおよびドレイン電極が封止されたＳｉＯ２／Ｓｉ基板上に製作されたＦＥＴのデバイス概略図および回路の接続。（Ｖｄｓは、ＣＮＴネットワークＦＥＴには１００ｍＶに、ＧＦＥＴには１ｍＶに選択された）。（ｂ）Ｏｒ１０ａ、（ｃ）Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏ、（ｄ）Ｏｒ２２ａ、（ｅ）Ｏｒ２２ａ／Ｏｒｃｏ、（ｆ）空、および（ｇ）Ｏｒｃｏリポソームの機能化の前（丸）および後（四角）における実際のＧＦＥＴの変換特性曲線（Ｖｄｓを、全ての測定で１ｍＶに維持した）。 図１６は、濃度を増加させた標的リガンド（Ｏｒ１０ａ－サリチル酸メチル（ＭｅＳａｌ）、Ｏｒ２２ａ－ヘキサン酸メチル（ＭｅＨｅｘ））の添加に対する、（ａ）Ｏｒ１０ａおよび（ｂ）Ｏｒ２２ａ、（ｃ）Ｏｒ１０ａ＋Ｏｒｃｏおよび（ｄ）Ｏｒ２２ａ＋Ｏｒｃｏリポソームが固定されたＧＦＥＴセンサーの正規化したリアルタイムの感知応答である。 図１７は、（ａ）Ｏｒ１０ａ、（ｂ）Ｏｒ１０ａ＋Ｏｒｃｏ、（ｃ）Ｏｒ２２ａ、および（ｄ）Ｏｒ２２ａ＋Ｏｒｃｏリポソームを用いた、標的リガンド（Ｏｒ１０ａ－サリチル酸メチル（ＭｅＳａｌ）、Ｏｒ２２ａ－ヘキサン酸メチル（ＭｅＨｅｘ））および対照リガンド（Ｏｒ１０ａおよびＯｒ２２ａ－Ｅ２－ヘキセナール（Ｅ２Ｈｅｘ））の正規化した用量応答曲線。標的リガンドに対する空のリポソーム（ａ、ｃ）およびＯｒｃｏのみのリポソーム（ｂ、ｄ）からの応答の欠如も示される。Ｏｒ２２ａ（ｅ）とＯｒ１０ａ（ｆ）の両方について、リポソーム中にＯｒｃｏが存在する場合、それらそれぞれの用量応答曲線の左へのシフトが見られる。 図１７は、（ａ）Ｏｒ１０ａ、（ｂ）Ｏｒ１０ａ＋Ｏｒｃｏ、（ｃ）Ｏｒ２２ａ、および（ｄ）Ｏｒ２２ａ＋Ｏｒｃｏリポソームを用いた、標的リガンド（Ｏｒ１０ａ－サリチル酸メチル（ＭｅＳａｌ）、Ｏｒ２２ａ－ヘキサン酸メチル（ＭｅＨｅｘ））および対照リガンド（Ｏｒ１０ａおよびＯｒ２２ａ－Ｅ２－ヘキセナール（Ｅ２Ｈｅｘ））の正規化した用量応答曲線。標的リガンドに対する空のリポソーム（ａ、ｃ）およびＯｒｃｏのみのリポソーム（ｂ、ｄ）からの応答の欠如も示される。Ｏｒ２２ａ（ｅ）とＯｒ１０ａ（ｆ）の両方について、リポソーム中にＯｒｃｏが存在する場合、それらそれぞれの用量応答曲線の左へのシフトが見られる。 図１７は、（ａ）Ｏｒ１０ａ、（ｂ）Ｏｒ１０ａ＋Ｏｒｃｏ、（ｃ）Ｏｒ２２ａ、および（ｄ）Ｏｒ２２ａ＋Ｏｒｃｏリポソームを用いた、標的リガンド（Ｏｒ１０ａ－サリチル酸メチル（ＭｅＳａｌ）、Ｏｒ２２ａ－ヘキサン酸メチル（ＭｅＨｅｘ））および対照リガンド（Ｏｒ１０ａおよびＯｒ２２ａ－Ｅ２－ヘキセナール（Ｅ２Ｈｅｘ））の正規化した用量応答曲線。標的リガンドに対する空のリポソーム（ａ、ｃ）およびＯｒｃｏのみのリポソーム（ｂ、ｄ）からの応答の欠如も示される。Ｏｒ２２ａ（ｅ）とＯｒ１０ａ（ｆ）の両方について、リポソーム中にＯｒｃｏが存在する場合、それらそれぞれの用量応答曲線の左へのシフトが見られる。 図１８は、二重層センサーデバイスに使用されるＰＭＭＡプラットフォームの概要である。（Ａ）アレイの４チャンバー設計。（Ｂ）元のＰＭＭＡの形状の、ベース上に堆積させた液滴（赤色および緑色）とマニピュレーター電極（青色）との間における液滴界面二重層（ＤＩＢ）形成の概略図。ＰＭＭＡの形状は、その形状内の電極の位置を適切に表示するために、完全に透明なものとして示される。 図１９は、（ａ）Ｏｒ２２ａまたは（ｂ）Ｏｒ２２ａ／Ｏｒｃｏ、および１０ｍＭのヘキサン酸メチル、Ｏｒ２２ａの公知の活性化剤を含有する液滴界面二重層（ＤＩＢ）からのイオンチャネルの記録である。ＤＩＢを、１：１の１ｍｇ／ｍｌのＤＰｈＰＣを含有するウンデカンとシリコーンオイルの混合物中で、２つの水性液滴間に形成し、イオンチャネルの形成を、浮遊電極のセットアップを使用して測定した。保持電位を指定された通りに変更した。Ｎａ＋に関する逆転電位は、上記の実験で４６ｍＶである。データを１０ｋＨｚでサンプリングし、０．８ｋＨｚでフィルタリングした。 図２０は、Ｏｒ２２ａ／Ｏｒｃｏ、および１０μＭのヘキサン酸メチルを含有する液滴界面二重層（ＤＩＢ）からのイオンチャネルの記録である。ＤＩＢを、１：１の１ｍｇ／ｍｌのＤＰｈＰＣを含有するウンデカンとシリコーンオイルの混合物中で、２つの水性液滴間に形成し、イオンチャネルの形成を、浮遊電極のセットアップを使用して測定した。Ｎａ＋に関する逆転電位は、この実験で４６ｍＶであり、保持電位は－１００ｍＶであった。データを１０ｋＨｚでサンプリングし、０．８ｋＨｚでフィルタリングした。 図２１は、（Ａ）Ｏｒ７１ａ、Ｏｒｃｏ、および公知のＯｒ７１ａアゴニストである１０μＭの４－エチルグアヤコールを含有する液滴界面二重層（ＤＩＢ）からのイオンチャネルの記録である。ＤＩＢを、１：１の１ｍｇ／ｍｌのＤＰｈＰＣを含有するウンデカンとシリコーンオイルの混合物中で、２つの水性液滴間に形成し、これを浮遊電極のセットアップを使用して測定した。Ｎａ＋に関する逆転電位は、この実験で－４６ｍＶである。データを１０ｋＨｚでサンプリングし、０．８ｋＨｚでフィルタリングした。（Ｂ）は、（Ａ）に記載したのと同様の第２のイオンチャネルの記録である。
実施例１－電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）を用いた本発明のセンサーの例証
本発明者らによって作成された以前の未公開のデータ（結果としてＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５８１８１に記載の発明に至る）は、驚くべきことに、ＯｒＸは、先行技術の昆虫ＯＲベースのセンサーシステムより著しく改善された分析物の特異的な結合の検出が可能な電子センサーデバイスにおいて単独で使用することができることを示している。
本出願のデータは、ＯｒＸに加えてＯｒｃｏを含むことが、驚くべきことに、先行技術の昆虫ＯＲベースのセンサーシステム、およびＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５８１８１の発明を構成する本出願人によって以前に生産されたＯｒＸ（単独）ベースの電子センサーデバイスの両方を超える、さらなる著しい改善を提供することを示す。
要約
本出願人は、昆虫ＯｒＸ配列を使用する便利な高感度のセンサーデバイスを実証する。２つのＯｒＸ受容体（Ｏｒ１０ａ、Ｏｒ２２ａ）１９をそれぞれそれら自体で、またはＯｒｃｏと共にリポソーム中に埋め込み２８、さらなる最適化実験条件下でＥＩＳ測定のために金電極上で機能化した。ＯｒＸで機能化した金電極のそれぞれは、ｆＭ濃度から開始して、その標的リガンドに対して明確な電子応答を示した（サリチル酸メチルに対してＯｒ１０ａ、ヘキサン酸メチルに対してＯｒ２２ａ）２０。リポソームにおけるＯｒｃｏの存在は、ＯｒＸ応答に対して相加的な、または増幅的な作用を有し、最大応答レベルを増加させ、その標的リガンドに対するＯｒＸの感度を増加させる。結合の特異性は、非応答リガンドに対する、各ＯｒＸリポソームおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化した電極の応答を試験することによって検証される。特異性をさらに確認するために、標的リガンドに対する空のリポソームで機能化した金電極の応答も試験した。
１．０ 実験方法
１．１ 材料
６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド）（ＥＤＣ）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）タブレット、サリチル酸メチル、およびヘキサン酸メチルを、シグマ－アルドリッチから得た。電気化学的な測定のために、直径１．６ｍｍの金（Ａｕ）ディスク電極、コイル状の白金（Ｐｔ）線電極およびリークレス（leakless）銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極を、ＢＡＳｉから購入した。
１．２ 精製されたＯｒＸおよびＯｒｃｏサブユニットの調製
精製手順は、Carraherら、2013２８で詳述されたものの改変法である。バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞からタンパク質をｈｉｓ－タグ親和性により精製するために、５００ｍｌの２×１０６／ｍｌを０．１のＭＯＩでバキュロウイルスに感染させ、２７℃で７２時間インキュベートした。３８００ｇで室温で１０分の遠心分離によって細胞ペレットを収集し、次いで２５Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（Benzonase）を含む４０ｍｌの再懸濁緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Roche Diagnostics GmbH）、ドイツ））に再懸濁し、次いでエマルシフレックスＣ５（Emulsiflex C5）乳化装置（アベスティン、ドイツ）を１０，０００～１５，０００ｐｓｉで２回通過させることによって溶解させた。次いでサンプルを１０００ｇで５分遠心分離して、細胞全体および核を除去した。上清を除去し、４℃、１００，０００ｇで１時間スピンした。膜ペレットを、１％ｗ／ｖの洗浄剤（フォス－コリン１４（Fos-Choline 14）（ＦＣ１４））を含む４０ｍＬの緩衝液Ａに再懸濁し、室温で１時間、１０ｒｐｍで回転させた。次いでサンプルを、１８℃、１００，０００ｇで１時間遠心分離した。上清を除去し、１ｍＬのＮｉＮＴＡカラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））にローディングした。カラム体積の１０倍の３００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３．６ｍＭのＦＣ－１４）中で、さらに１００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのイミダゾールを含むカラム体積の１０倍の緩衝液Ｂ中でカラムを洗浄した。タンパク質を、１００ｍＭのＮａＣｌおよび５００ｍＭのイミダゾールを含むカラム体積の４倍の緩衝液Ｂで溶出した。クーマシー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロッティングで純度を評価した。
最終的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）工程を用いて精製を完了した。ＮｉＮＴＡ精製からの溶出画分をプールし、２０，０００ｇで５分遠心分離して、集合体（aggregate）と汚染物質を除去した。次いでＡｋｔａ－Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア）に取り付けられたスーパーデックス２００（Superdex 200）１６／６０カラム（ＧＥヘルスケア）に５ｍＬのサンプルを注入した。１００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ｂ中、１ｍＬ／分でサンプルを流し、２ｍＬ分画を収集し、１００ｋＤａのＭＷＣＯのビバスピン２（Vivaspin2）フィルターユニット（ザルトリウス（Sartorius）、ゲッティンゲン、ドイツ）を使用して濃縮し、－８０℃で貯蔵した。
１．３ リポソームが会合したＯＲサブユニットの調製
Ｎ２ガス流下で、小さいガラス管中でホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびコレステロール（ＣＨ）を５：３：３：１のモル比で含有する溶液を蒸発させ、次いで真空中で１時間乾燥させることによって生産されたリン脂質溶液を使用して、リポソームを調製した。
これらの脂質を、５分間ボルテックスで混合することによって１ｍＬの再水和緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁し、続いてマイクロソン（Microson）超音波細胞破砕装置（メディソニック（Medisonic）、米国）で、２０％の出力、１０～２０秒で５回音波破砕し、各音波破砕工程間に１分間サンプルを氷上に置いた。リポソームの形成を促進するために、１０回の凍結／融解工程を、液体窒素から４０℃の水浴にチューブを移動させることによって実行した。
次いで、アベスティン（Avestin）のＬｉｐｏｓｏＦＡＳＴ押出ユニット（アベスティン、ドイツ）を使用して、脂質溶液を１００ｎｍのポリカーボネート膜に１１回通してリポソームを所定サイズに分類した。最終容量の１０％の量でグリセロールを添加し、液体窒素中で１０ｍｇ／ｍＬのアリコートを急速冷凍し、－８０℃で貯蔵した。
次いで、アベスティン（Avestin）のＬｉｐｏｓｏＦＡＳＴ押出ユニット（アベスティン、ドイツ）を使用して、脂質溶液を１００ｎｍのポリカーボネート膜に１１回通してリポソームを所定サイズに分類した。最終容量の１０％の量でグリセロールを添加し、液体窒素中で１０ｍｇ／ｍＬのアリコートを急速冷凍し、－８０℃で貯蔵した。
精製されたＯｒＸおよびＯｒｃｏサブユニット１９を、Geertsmaら、（2008）３４のプロトコールに類似した方式で合成リポソームに再構成した。
それらの使用の前に、リポソームを氷上で解凍し、次いで０．２％のＣＨＡＰＳと共に室温で１５分インキュベートすることによって不安定化した。次いで２００μｇの精製した匂い物質受容体２８を１ｍｇのリポソームに添加し、１０ｒｐｍで１時間回転した。２５ｍｇのバイオビーズ（Bio-Beads）ＳＭ－２（バイオラッド（Bio-Rad）、米国）を４回添加し、それぞれ４℃で３０分、２時間、一晩およびさらに２時間インキュベートすることによって、過量の洗浄剤を除去した。各インキュベーション期間後にバイオビーズを除去した。ＯｒＸまたはＯｒＸ／Ｏｒｃｏが一体化したリポソームを、１００，０００ｇで１時間の遠心分離によってペレット化し、５００μｌの再水和緩衝液中に再懸濁した。アキュデンツ（アキュレートケミカル＆サイエンティフィック（Accurate Chemical & Scientific）社、米国）を使用した密度勾配超遠心分離（ＤＧＵ）によって、リポソームへのＯｒＸおよびＯｒｃｏの一体化を評価した。等しい体積の８０％アキュデンツ溶液の添加によって、一体化されたリポソームを４０％アキュデンツにし、超遠心分離管の底部に入れ、３０％アキュデンツ溶液、およびＤＧＵ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）を上に載せた。次いでサンプルを、１００，０００ｇ、４℃で４時間遠心分離した。リポソームは、それらの低密度のために、アキュデンツＤＧＵの後の勾配の最上部に浮遊するであろう。
１．４ 電極の調製
金ディスク電極（直径１．６ｍｍ）を、各電極につき１分間、アルミナポリッシングパッド上でポリッシングアルミナスラリーを用いて磨いた。磨いた電極を脱イオン水（ミリＱ（Milli-Q）、１８．２ΜΩ・ｃｍ）で濯ぎ、続いて、残留したアルミナスラリーが電極から完全に除去されるまでエタノール（ＬＲグレード）および脱イオン水中で超音波破砕した。－１．４Ｖでのクロノアンペロメトリーを超音波破砕した電極の全てに適用し、３つの末端の電気化学セル中の０．１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）電解質溶液、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＮａＣｌ、ＳＨＥに対して０．２０９Ｖ）参照電極、対電極としてコイル状の白金線、および作用電極として金ディスクを使用して、ＰａｌｍＳｅｎｓ３ポテンシオスタットを使用して、３０秒にわたり、電極表面上に存在するチオールのＳＡＭを脱着させた。次いで電極を再度脱イオン水で濯ぎ、エタノールと脱イオン水中で連続的に超音波破砕した。最終的に、０．５Ｍ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液中、－０．２から１．６Ｖの間で、５０ｍＶ／秒のスキャン速度でサイクリックボルタンメトリーを１０サイクル実行して、他のあらゆる不純物を除去した（３つの電極セル、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＮａＣｌ中、ＳＨＥに対して０．２０９Ｖ）参照電極、対電極としてコイル状の白金線、および作用電極として金ディスク）。
１．５ 自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の調製および活性化
５ｍｌエタノール（ＡＲグレード）中に１．３６μｌのＭＨＡを溶解させることによって、２ｍＭのＭＨＡを調製した。クリーニングされた電極をＭＨＡ溶液に浸し、一晩インキュベートした。次の日、未反応の酸を除去するために、全ての電極をエタノールと脱イオン水で徹底的に洗浄した。２：１のｍｏｌ：ｍｏｌ比のＥＤＣ：ＮＨＳ（１００ｍＭのＥＤＣ、５０ｍＭのＮＨＳ）を２ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ＝６．５）溶液中で調製した。次いで、１００μｌのこの溶液中、２８℃で１時間、電極を被覆して、ＭＨＡのカルボン酸（ＣＯＯＨ）基を活性化した。
１．６ ＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏが会合したリポソームの電極への固定
ＰＢＳ溶液を、ＰＢＳの１つのタブレットを２００ｍｌのミリＱ水中に浸漬すること（製造元の説明書に従って）によって調製し、０．２μｍのシリンジフィルターを使用してろ過した。調製された緩衝溶液のｐＨをｐＨメーターで測定した。ＯｒＸリポソームまたはＯｒＸ／ＯｒｃｏリポソームをＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）で１００倍希釈し、その緩衝溶液中でＣＯＯＨ活性化電極を室温で１時間インキュベートした。次いで電極をＰＢＳ緩衝溶液で徹底的に洗浄して、全ての未結合のリポソームを洗い落とした。
１．７ 標的匂い物質溶液の調製およびインキュベーション
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を、電気化学的な測定を実行するための電解質として使用した。電気化学的な測定の前に、ＰＢＳ緩衝液を約３０分脱気した。１ａＭ～１μＭの濃度範囲の匂い物質溶液を、１％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ溶液での逐次的な希釈によって調製した。ＯＲが固定された電極を、関連する匂い物質溶液中でそれぞれ約３０分間インキュベートし、ＥＩＳ測定の前にＰＢＳで穏やかに洗浄した。
１．８ 電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）測定
ＥＩＳ測定を、ＰａｌｍＳｅｎｓポテンシオスタットを使用して、－０．７の固定した電圧で、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３ＭのＮａＣｌ、０．２０９Ｖ対ＳＨＥ）参照電極、対電極としてコイル状の白金線および作用電極として金ディスクを含有する３電極セルで行った。脱気したＰＢＳを、電解質として使用した。
２．０ 結果
昆虫嗅覚受容体は、細胞膜において、イオンチャネルが生じるようにＯｒｃｏサブユニットと複合体化したＯｒＸサブユニットで構成される（図１）１７。この研究において、著者は、リポソームに埋め込まれたＯｒＸのリガンド結合活性に対するＯｒｃｏの作用を調査する。図２に、６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の堆積、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド／１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド）（ＮＨＳ／ＥＤＣ）カップリングでの－ＣＯＯＨ末端基の活性化、ＯＲ／リポソームの共有結合、およびＥＩＳによってモニタリングされる標的匂い物質分子の結合からなる実験手順が提示される。クリーニングした金表面をＭＨＡで一晩インキュベートして、スキームで示されるようにカルボン酸末端基を有するＳＡＭを構築した。金表面をＥＤＣ／ＮＨＳ溶液に曝露して、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルを形成する工程によって、ＳＡＭの－ＣＯＯＨ末端基をさらに活性化した。これは次いで生体分子に連結することができる。最後に、電極をＯｒＸ／リポソーム溶液と共にインキュベートして、ベシクルを金表面に共有結合で取り付けた。
著者は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いて、リポソームを金表面上に固定できることを検証した。図３は、そのままの金表面からＯＲが会合したリポソームが固定された表面への表面構造および粗さのプロファイルにおいて変化がみられることを示す。そのままの金表面（図３（ａ））は、約２ｎｍの表面粗さ値を有する様々なサイズの高密度に圧縮された平坦な金ナノ結晶を示す。ＳＡＭ改変の後（図３（ｂ））およびＳＡＭで改変された金表面のＮＨＳ／ＥＤＣの活性化の後（図３（ｃ））、表面構造においてごくわずかな変化が観察された。ＯｒＸリポソームをＥＤＣ／ＮＨＳ活性化されたＳＡＭで改変された金表面に導入したところ（図３（ｄ））、表面上に固定された円形のリポソームを示す表面構造における変化は、顕著であった。それらの天然型において、表面全体にわたり様々なサイズの丸型のリポソームがみられ、すなわち破裂または二分子層形成は観察されなかった。これも、リポソーム膜中でＯＲがよく保持されていることを示す。また表面粗さ値の大幅な増加（＞３０ｎｍ）も、リポソームを含有するＯＲが、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化されたＳＡＭで改変された金表面にうまく取り付けられたことを実証する。
標的リガンドまたは対照リガンドを濃度を増加させて（１ａＭから１００μＭ）インキュベートする前およびその後に、ＯｒＸリポソーム（Ｏｒ１０ａまたはＯｒ２２ａのいずれか）、ＯｒＸ／Ｏｒｃｏリポソーム、または空のリポソームで機能化された金電極にＥＩＳ測定を実行した。センサー応答を－（ΔＲｐ／Ｒｏ ｐ）対ｌｏｇ［Ｃ（リガンド）］と定義することによって、用量応答曲線を得た。図４ａは、様々な濃度でＯｒ１０ａの公知の標的リガンドの１種であるサリチル酸メチルを含有する溶液に曝露したときの、Ｏｒ１０ａリポソームで機能化したセンサーのナイキストプロットに対するＥＩＳ応答を提示する。ナイキストプロットは、濃度を増加させたサリチル酸メチルの添加の後にＥＩＳ応答における減少を示した。センサー応答としてｌｏｇ［濃度（リガンド）］に対して分極抵抗における変化（ΔＲｐ／Ｒｏ ｐ）をプロットすることによって、用量応答曲線（図４ｂ）を得た。式中、Ｒｐは、Ｏｒ１０ａリポソーム－標的相互作用後の分極抵抗であり、Ｒｏ ｐは、Ｏｒ１０ａリポソーム－標的相互作用前の分極抵抗である。Ｏｒ１０ａリポソームセンサーは、サリチル酸メチルには０．１ｐＭの検出限界（ＬＯＤ）で応答し、対照リガンドであるヘキサン酸メチル対照には無視できる程度の応答で応答した。空のリポソームで機能化されたセンサーは、陽性および陰性リガンドに対して無視できる程度の応答を示したことから、ＯＲが、匂い物質を検出するための主要なエレメントであることが示唆される。
図５ａは、Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化したセンサーの、様々な濃度でその標的リガンドであるサリチル酸メチルに曝露したときのＥＩＳ応答を提示する。図５ｂは、Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームのサリチル酸メチルの用量応答曲線を、Ｏｒ１０リポソーム、Ｏｒｃｏリポソームおよび空のリポソームに関して得られたものと比較する。Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームは、用量応答曲線の左へのシフトと１ｆＭのより低い検出限界によって反映される通り、Ｏｒ１０ａリポソームより大きい最大反応を示し、より大きい感度も呈示する。Ｏｒｃｏリポソームと空のリポソームはどちらも、サリチル酸メチルに対して無視できる程度の応答を示す。
著者は、受容体の別の例であるＯｒ２２ａに対するＯｒｃｏの作用を調査する。図６ａは、Ｏｒ２２ａリポソームで機能化したセンサーの、様々な濃度でその標的リガンドであるヘキサン酸メチルの１つに曝露したときのＥＩＳ応答を提示する。再度、ナイキストプロットは、濃度を増加させたヘキサン酸メチルの添加の後にＥＩＳ応答における減少を示した。用量応答曲線（図６ｂ）は、Ｏｒ２２ａリポソームセンサーが、１ｆＭの検出限界（ＬＯＤ）でヘキサン酸メチルに応答し、無視できる程度の応答で対照リガンドであるサリチル酸メチルに応答したことを示す。空のリポソームで機能化されたセンサーは、陽性および陰性リガンドに対して無視できる程度の応答を示したことから、ＯＲが、匂い物質を検出するための主要なエレメントであることが示唆される。
図７ａは、様々な濃度でその標的リガンドであるヘキサン酸メチルに曝露したときの、Ｏｒ２２ａ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化したセンサーのＥＩＳ応答を提示する。図７ｂは、Ｏｒ２２ａ／Ｏｒｃｏリポソームのヘキサン酸メチルの用量応答曲線を、Ｏｒ２２ａリポソーム、Ｏｒｃｏリポソームおよび空のリポソームに関して得られたものと比較する。予想通りに、Ｏｒ２２ａ／Ｏｒｃｏリポソームは、ここでも用量応答曲線の左へのシフトと０．１ｆＭのより低い検出限界によって反映される通り、Ｏｒ２２ａリポソームより大きい最大反応を示し、より大きい感度も呈示する。Ｏｒｃｏリポソームと空のリポソームはどちらも、ヘキサン酸メチルに対して無視できる程度の応答を示す。
３．０ 議論
本出願人は最初に、異なる自己組織化単分子層（ＳＡＭ層）を試験して、その後、金電極表面上のリポソームと結合するのに最適な長さのリンカーとして６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）を同定した。最初は、１６－メルカプトヘキサデカン酸（１６－ＭＨＤＡ）酸を使用して、金表面を機能化し、金電極上にリポソームを結合させた。その実験からの結果は、高感度を示さなかったことから、リポソームは、検出可能なシグナルを得るには電極表面から極端に離れていたことが示唆される。その障害を克服するために、本出願人は、その代わりにより短い６－メルカプトヘキサン酸を使用した。本出願人は、このリンカーは、より短く、金とリポソームとの間でより速い電子移動を提供し、したがって、表面上で起こるあらゆる事象を、より高感度の様式でモニタリングすることができるであろうと仮定した。未精製の細胞膜中に哺乳類匂い物質受容体を固定した２つの論文のケースにおいて、それらは、ＳＡＭ形成のために、１６－メルカプトヘキサデカン酸（１６－ＭＨＤＡ）３５または６－メルカプトヘキサデカン酸（６－ＭＨＤＡ）３６のいずれかを使用した。
比較データは、ここで開示された昆虫ＯｒＸ／Ｏｒｃｏ－ＥＩＳバイオセンサー様式が、昆虫匂い物質受容体と共に使用されてきたＯｒＸ－ＥＩＳバイオセンサーおよび他のセンサー様式の両方より高感度であることを示す。表１は、匂い物質受容体ベースデバイスに関する公開されたデータを要約する。本発明のデバイスは、細胞ベースのセンサーより１００～１００，０００倍大きい感度を提供する。
Figure 0007457224000001
表２は、細胞アッセイから得られたデータを要約する。本発明の昆虫ＯｒＸ－ＥＩＳセンサーおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏ－ＥＩＳデータは、ＨＥＫ２９３細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞で発現されたＯｒＸ／Ｏｒｃｏより高感度である。これらのシステムにおいて、一部のフェロモン受容体（ＰＲ）は正常な匂い物質受容体より著しく低い感度を呈示することに留意すべきであり、これは、これらの受容体が、それらのフェロモン標的分子に対して微細に調整されていると予想される。
Figure 0007457224000002
Figure 0007457224000003
４．０ 結論
この研究は、電子デバイスプラットフォームに基づく嗅覚バイオセンサーにおいて、Ｏｒｃｏの存在下におけるＯｒＸの改善された認識能力を実証した。金電極上で機能化されるリポソーム中にＯｒｃｏサブユニットと共に埋め込まれたＯｒＸは、ＯｒＸリポソームと比較して増加した感度（ｆＭ未満）および最大反応を示す。空のリポソームで機能化した電極からの結果と比較して、標的リガンドに対する明らかなインピーダンス応答は観察されない。ＯｒＸリポソームで機能化した電極からの対照リガンドに対する応答を試験することによって、各ＯｒＸの特異的な結合も検証された。
実施例２－電気インピーダンス分光法（ＥＩＳ）を用いた本発明のセンサーのさらなる例証
要約
本出願人はさらに、追加の昆虫ＯｒＸ配列を使用する便利な高感度のセンサーデバイスを実証する。Ｏｒ３５ａ１９を、それ自体で、またはＯｒｃｏと共にリポソーム中に埋め込み２８、ＥＩＳ測定のために、実施例１に類似した方式で金電極上で機能化した。これまでに実施例１において受容体Ｏｒ１０ａおよびＯｒ２２ａで見られたように、リポソーム中のＯｒｃｏの存在は、Ｏｒ３５ａ応答に対して相加的な、または増幅的な作用を有し、その標的リガンドに対するＯｒＸの感度を増加させる。
１．実験方法
１．１ 材料
６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド）（ＥＤＣ）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）タブレット、サリチル酸メチル、およびヘキサン酸メチルを、シグマ－アルドリッチから得た。電気化学的な測定のために、直径１．６ｍｍの金（Ａｕ）ディスク電極、コイル状の白金（Ｐｔ）線電極およびリークレス銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極を、ＢＡＳｉから購入した。
１．２ 精製されたＯｒ３５ａおよびＯｒｃｏサブユニットの調製
Ｏｒ３５ａおよびＯｒｃｏサブユニットを、実施例１のセクション１．２に記載した通りに調製した。
１．３ ＯＲが会合したリポソームの調製
Ｏｒ３５ａリポソームを、実施例１のセクション１．３に記載した通りに、ただし以下の変更を加えて調製した：
使用前、１ｍｇのリポソーム（２ｍｇ／ｍｌで５００μｌ）を氷上で解凍し、次いで０．２％ＣＨＡＰＳと共に室温で１５分インキュベートすることによって不安定化した。次いで５０μｇの精製されたＯｒ３５ａ／Ｏｒｃｏを添加し、１０ｒｐｍで、室温で１時間回転した。５００ｍｇのバイオビーズＳＭ－２（バイオラッド、米国）の添加と４℃で一晩のインキュベーションによって、過量の洗浄剤を除去した。チューブの両端に穴を開け、５０００ｇで１分の遠心分離によって、Ｏｒ３５ａ／Ｏｒｃｏ一体化リポソームをバイオビーズから分離した。全てのＯｒ３５ａ／Ｏｒｃｏ一体化リポソームサンプルをウェスタンブロットによって分析し、その後、等分して－８０℃で貯蔵した。アキュデンツ（アキュレートケミカル＆サイエンティフィック社、米国）を使用した密度勾配超遠心分離（ＤＧＵ）によって、リポソームへのＯｒ３５ａ／Ｏｒｃｏの一体化を評価した。等しい体積の８０％アキュデンツ溶液の添加によって、Ｏｒ３５ａ／Ｏｒｃｏ一体化リポソームを４０％アキュデンツにし、超遠心分離管の底部に入れ、３０％アキュデンツ溶液、およびＤＧＵ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）上に載せた。次いでサンプルを、１００，０００ｇ、４℃で４時間遠心分離した。リポソームは、その低密度のために、アキュデンツＤＧＵ後、勾配の最上部に浮遊した。
２．結果
本出願人は、実験１のセクション２．０に記載された通りにＥＩＳ測定を実行することによって、リポソーム中に埋め込まれたＯｒ３５ａのリガンド結合活性に対するＯｒｃｏの作用を調査した。
図８ａは、様々な濃度でその標的リガンドの１つであるＥ２－ヘキセナールに曝露したときの、ＯＲ３５ａリポソームで機能化したセンサーのＥＩＳ応答を提示する。再度、ナイキストプロットは、濃度を増加させたＥ２ヘキセナールの添加の後にＥＩＳ応答における減少を示した。用量応答曲線（図８）は、Ｏｒ３５ａリポソームセンサーが、１０ｆＭの検出限界（ＬＯＤ）でＥ２ヘキセナールに応答し、無視できる程度の応答で対照リガンドであるサリチル酸メチルに応答したことを示す。空のリポソームで機能化されたセンサーは、陽性および対照リガンドに対して無視できる程度の応答を示したことから、ＯＲが、匂い物質を検出するための主要なエレメントであることが示唆される。
図９ａは、ＯＲ３５ａ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化したセンサーの、その標的リガンドであるＥ２－ヘキセナールに様々な濃度で曝露したときのＥＩＳ応答を提示する。図９ｂは、Ｏｒ３５ａ／ＯｒｃｏリポソームのＥ２－ヘキセナールの用量応答曲線を、Ｏｒ３５ａリポソーム、Ｏｒｃｏリポソームおよび空のリポソームに関して得られたものと比較する。予想通りに、Ｏｒ３５ａ／Ｏｒｃｏリポソームは、ここでも用量応答曲線の左へのシフトと０．１ｆＭのより低い検出限界によって反映される通り、Ｏｒ２２ａリポソームより大きい最大反応を示し、より大きい感度も呈示する。Ｏｒｃｏリポソームと空のリポソームの両方はどちらも、ヘキサン酸メチルに対して無視できる程度の応答を示す。
図１０は、実施例１および２で試験されたＯｒＸおよびＯｒＸ／ＯｒｃｏベースのＥＩＳバイオセンサーの用量応答曲線における左へのシフトをわかりやすく要約する。表３に、ＯｒＸおよびＯｒＸ／ＯｒｃｏベースのＥＩＳバイオセンサーの用量応答方程式、ＥＣ５０および検出範囲を要約する。実施例１および実施例２で試験された受容体について、得られたセンサーは、Ｏｒｃｏの存在下で、センサー応答における改善を、より低いＬＯＤおよびＥＣ５０値の形態で示した。
Figure 0007457224000004
３．結論
この研究は、電子デバイスプラットフォームをベースとした嗅覚バイオセンサーにおけるＯｒｃｏの存在下におけるＯｒ３５ａの改善された認識能力を実証した。金電極上で機能化されるリポソーム中にＯｒｃｏサブユニットと共に埋め込まれたＯｒ３５ａは、Ｏｒ３５ａリポソームと比較して増加した感度（ｆＭ未満）を示す。空のリポソームで機能化した電極からの結果と比較して、標的リガンドに対する明らかなインピーダンス応答は観察されない。Ｏｒ３５ａの特異的な結合も、Ｏｒ３５ａリポソームで機能化した電極からの対照リガンドに対する応答を試験することによって検証された。
実施例３－水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）圧電トランスデューサーを用いた本発明のセンサーの例証
要約
本出願人は、Ｏｒｃｏ配列の非存在および存在下で、キイロショウジョウバエＯｒ１０ａ１９配列を使用して、便利な圧電センサーデバイスを生産した。散逸モニタリングによる水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ－Ｄ）は、結晶への質量負荷に伴い振動周波数が変化する質量検出型圧電性トランスデューサーである。Ｏｒ１０ａリポソームおよびＯｒ１０ａ／ＯｒｃｏリポソームがカップリングされたＱＣＭ－Ｄセンサーの振動周波数の変化をモニタリングすることによって、Ｏｒ１０ａと標的リガンドであるサリチル酸メチルとの相互作用を検出した。Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームは、サリチル酸メチルに対して、Ｏｒ１０ａリポソームよりより大きい応答を有することが見出された。この結果は、リポソーム中のＯｒｃｏサブユニットの存在が、ＯｒＸの応答に対して相加効果を有し、リガンド結合に対するその応答を増幅することを示唆する。結合の特異性を、対照リガンドであるヘキサン酸メチルに対する、ＱＣＭ－ＤセンサーにカップリングされたＯｒ１０ａリポソームおよびＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームの応答を試験することによって検証したところ、無視できる程度の応答だった。
１．実験方法
１．１ 材料
６－メルカプトヘキサン酸（ＭＨＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド）（ＥＤＣ）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）タブレット、およびサリチル酸メチルを、シグマ－アルドリッチから得た。金（１００ｎｍ）センサー結晶（ＱＳＸ３０１）を、ＡＴＡサイエンティフィックインスツルメンツ（ATA Scientific Instruments）から得た。
１．２ ＯＲが会合したリポソームの調製
１．２．１ 精製されたＯＲサブユニットの調製
ＯＲサブユニットを、実施例１のセクション１．２に記載した通りに調製した。
１．２．２ ＯＲが会合したリポソームの調製
Ｏｒ２２ａリポソームを、実施例１のセクション１．３に記載した通りに調製した。
１．３ 水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）の調製およびデータ収集
金（１００ｎｍ）センサー結晶を、エタノールおよびミリＱ水中でそれぞれ１５分、音波破砕した。５：１：１の体積比のミリＱ水、アンモニア（２５％）、および過酸化水素（３０％）を７５℃に５分加熱し、音波破砕した結晶を加熱した溶液に５分間入れた。次いで溶液から結晶を取り出し、ミリＱ水で濯ぎ、その後、窒素ガスで乾燥させた。過量のまたは緩く結合した分子を除去するために、それらをＭＨＡの２ｍＭエタノール溶液に一晩曝露し、続いてエタノール溶液で洗浄することによって、きれいな金結晶をチオールで機能化した。２ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ＝６．５）溶液中の２：１のｍｏｌ：ｍｏｌ比のＥＤＣ：ＮＨＳ（１００ｍＭのＥＤＣ、５０ｍＭのＮＨＳ）を使用して、ＮＨＳ／ＥＤＣを調製した。各ＯｒＸ／リポソームストック溶液を、ＱＣＭ－Ｄ測定のために、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）で１００倍希釈した。次いでＳＡＭで機能化した結晶をＱ－センス分析器装置（ビオリンサイエンティフィック（Biolin Scientific））チャンバーに入れ、１％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ緩衝溶液中のＮＨＳ／ＥＤＣ、Ｏｒ１０ａ／リポソームまたはＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソーム、および様々な濃度のヘキサン酸メチル（１．６μＭ、８μＭ、２０μＭ、４０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭおよび１０００μＭ）と共に流動させて、周波数（Δｆ）および散逸（ΔＤ）値の変化を測定した。
２．結果
図１１（ａ）は、ＳＡＭおよびＮＨＳ／ＥＤＣでの改変とそれに続く水晶振動子へのＯｒ１０ａリポソームまたはＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソーム固定、次いで標的リガンドであるサリチル酸メチルの結合における周波数の変化を示す。結合事象が結晶上で起こる場合、これは、振動周波数を低下させる質量における増加をもたらす５３。したがってセンサーの質量は、ＳＡＭ、ＮＨＳ／ＥＤＣ、およびＯｒ１０ａリポソームまたはＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏ固定に伴い増加する。しかしながら、サリチル酸メチル結合のケースでは、周波数における増加は、両方のタイプのリポソームで観察されている（図１１（ｂ））。理論に制限されることは望まないが、本発明者らは、このセンサー上の質量の損失は、サリチル酸メチルがＯｒ１０ａ受容体に結合して、Ｏｒ１０ａリポソームの内部からの水およびイオンの放出を引き起こす、すなわちＯｒ１０ａが機能的なイオンチャネルを形成することに起因することを示唆している。同様に、サリチル酸メチルがＯｒ１０ａ受容体に結合して、Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームの内部からの水およびイオンの放出を引き起こす、すなわちＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏは、機能的なイオンチャネルを形成する。しかしながら、Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームは、周波数におけるより一層大きい変化を呈示することから、Ｏｒｃｏサブユニットが、Ｏｒ１０ａサブユニットからの応答を増幅することが示される。両方のタイプのリポソームの用量応答曲線の比較は、Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームが、より高いサリチル酸メチル濃度で、より強く応答することを示す（図１１ｃ）。両方のケースにおいて、この周波数の増加は、１．６～１０００μＭで濃度を増加させたヘキサン酸メチルにより起こり、この周波数の増加が対照リガンドであるヘキサン酸メチルでは観察されないことから、サリチル酸メチルはＯｒ１０ａ受容体に特異的に結合することが示される（図１１ｃ）。一兆分率（ｐｐｔ）濃度に等しいμＭレベルでのリガンド結合の検出は、Ｃ．エレガンスのＯＤＲ－１０でみられたものと同等であった５４。
３．結論
この研究は、電子デバイスプラットフォームをベースとした嗅覚バイオセンサーにおけるＯｒＸの認識能力を実証した。水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）圧電センサー上で機能化されるリポソーム中のＯｒＸは、その標的リガンドを特異的に検出することができる。Ｏｒｃｏと組み合わせたＯｒＸは、その標的リガンドに対してより強い応答を示すことから、Ｏｒｃｏは、ＯｒＸのそのリガンドへの応答に対して相加的な、または増幅的な作用を有することが示される。対照リガンドに対して明らかな圧電応答が観察されなかったため、この応答はＯｒＸ特異的である。ＯｒＸ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化したＱＣＭは、その標的リガンドを特異的かつ高感度で検出するための高い将来性を示す。
実施例４－グラフェン電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）を用いたセンサーの例証
要約
本出願人は、Ｏｒｃｏ配列の非存在および存在下で、リポソーム中に埋め込まれたキイロショウジョウバエＯｒ１０ａおよびＯｒ２２ａ配列を使用して便利なＧＦＥＴセンサーデバイスを生産した１９。実験結果は、インビトロにおけるＧＦＥＴプラットフォームを用いた昆虫ＯＲの感知を示した。ＯｒＸで機能化したＧＦＥＴのそれぞれは、ｐＭ濃度から開始して、その標的リガンドに対して明確な電子応答を示した（サリチル酸メチルに対してＯｒ１０ａ、ヘキサン酸メチルに対してＯｒ２２ａ）２０。リポソーム中のＯｒｃｏの存在は、ＯｒＸ応答に対して相加的な、または増幅的な作用を有し、その標的リガンドのＯｒＸの感度をｆＭ濃度まで増加させる。結合の特異性は、非応答リガンドに対する、各ＯｒＸリポソームおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏリポソームで機能化したＧＦＥＴ応答を試験することによって検証される。特異性をさらに確認するために、標的リガンドに対する空のリポソームで機能化したＧＦＥＴの応答も試験した。
１．実験方法
１．１ 材料
実験のための窒素（≦９９．９９％）および酸素（９９．７％）を、ＢＯＣリミテッド（BOC limited）ニュージーランドから購入した。使用される脱イオン（ＤＩ）水（１８．２ＭΩ）は、ザルトリウス（Sartorius）（アリウム（Arium）（登録商標）６１１ＶＦ）脱イオン水プラントから得た。ＧＦＥＴの製作のために、３００ｎｍのＳｉＯ２／ｐ型Ｓｉ基板上に機械的に移行させたＣＶＤグラフェンを含有するウェーハを、アドバンストケミカルサプライヤー（Advanced Chemical Supplier）、米国カリフォルニア州から購入し；ポジティブフォトレジストＡＺ１５１８を、マイクロケム（Microchem）、ドイツから購入し；１－ピレン酪酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＢＡＳＥ）（９５％、シグマアルドリッチ）を、ＧＦＥＴデバイス上に存在するグラフェンの表面にＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏリポソームを係留するための分子リンカーとして使用した。
１．２ ＯＲが会合したリポソームの調製
１．２．１ 精製されたＯＲサブユニットの調製
ＯＲサブユニットを、実施例１のセクション１．２に記載した通りに調製した。
１．１．２．２ ＯＲが会合したリポソームの調製
ＯＲリポソームを、実施例１のセクション１．３に記載した通りに調製した。
１．３ ＧＦＥＴセンサーの調製
この研究で使用されたＧＦＥＴを、米国のＡＣＳサプライヤー（ACS Suppliers）からの３００ｎｍのＳｉＯ２コーティングされたＳｉ基板上に事前に堆積させたグラフェンフィルムから製作した。ＦＥＴは、１００μｍの幅および４０μｍの長さを有するチャネルからなる。図１２に、Ｓｉ／ＳｉＯ２基板上へのＧＦＥＴの製作に関与する主要な工程を図式的に例示する。ソースおよびドレイン電極をフォトリソグラフィーによって画定し、ＣｒおよびＡｕの連続的な堆積によって形成した。次いでドレインおよびソース電極の両方を、ＡＺ１５１８フォトレジストを使用して封止し、１００μｍの幅および１０μｍの長さの寸法を有するチャネルを、ゲーティングおよび機能化のために環境に対して開いたままにした。
ＧＦＥＴを製作するために、３００ｎｍのＳｉＯ２／ｐ型Ｓｉ基板上に機械的に移行させたＣＶＤグラフェンを含有するウェーハを、アドバンストケミカルサプライヤー（Advanced Chemical Supplier）、米国カリフォルニア州から購入した。ウェーハをまず１２ｍｍ×１２ｍｍの寸法を有する四角形のチップに切断した。チップをアセトンおよびＩＰＡ中で濯いで、グラフェン表面上の汚染物質を除去した。次いで、オングストロームエンジニアリング（Angstrom engineering）－Ｎｅｘ Ｄｅｐ ２００エバポレーターを使用した熱蒸発によって、アライメントマーカーの堆積を行った。デバイスを回転ステージ上にマウントし、クロムおよび金の金属源をローディングした。クロムをプレーティングしたタングステンロッド（カートＪ．レスカー（Kurt J. Lesker）社）をクロム源として使用した。金線（９９．９９％、カートＪ．レスカー社）の断片をタングステンボート（カートＪ．レスカー社）にローディングし、蒸発チャンバーにローディングした。チャンバーを２×１０－６ｍＴｏｒｒに排気し、５ｎｍのクロムおよび５０ｎｍの金を連続的に蒸発させた。チャンバーを冷却し、窒素でベントした。デバイスをアセトン中に１０分浸し、次いでＩＰＡで洗浄することによってリフトオフを行い、その後、窒素を用いて乾燥させた。チャネル領域を、ＡＺ１５１８フォトレジストを使用して画定し、チップの残部の上のグラフェンフィルムを、反応性イオンエッチング装置（オックスフォードインストゥルメンツ（Oxford instruments）、プラズマラボ（Plasmalab）８０プラス）を使用した２００Ｗの酸素プラズマを６００ｍＴｏｒｒで１分使用してエッチングした。次いで、フォトリソグラフィーによってそれらを画定した後、上部の接触部分を、５ｎｍのＣｒおよび５０ｎｍのＡｕの連続した熱蒸発によって堆積させた。電極をＡＺ１５１８フォトレジストによって封止した。封止されたグラフェンＦＥＴを、２００ｍＴｏｒｒの圧力および２０ＳＣＣＭの酸素フローで１分の５０Ｗの酸素プラズマ下でクリーニングして、グラフェンチャネル上の残留したフォトレジストを除去した。次いでデバイスを、ホットプレート上で、２００℃で１０分ハードベークし、機能化の前にアセトンおよびＩＰＡで洗浄した。
１．４ ＧＦＥＴ上でのＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏリポソームの機能化
図１３で示されるように、ＯＲリポソームを、グラフェン表面上で、分子リンカーとしてＰＢＡＳＥを使用して、非共有結合経路を介して機能化した。ＯＲリポソームを、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、１：１０の比率で希釈した。クリーニングしたＧＦＥＴを、メタノール中の１ｍＭのＰＢＡＳＥ溶液中に１時間浸した。デバイスをメタノール中で３回洗浄し、続いて１×ＰＢＳで３回洗浄して、それぞれチャネル中の過量のＰＢＡＳＥおよび残留したメタノールを除去した。ＯＲリポソームを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１：１０に希釈し、１００μＬのＯＲ希釈液をグラフェンチャネルに設置し、密封したペトリ皿中で、室温で１時間インキュベートした。ＯＲリポソームの機能化の後、デバイスを、測定の前に、１×ＰＢＳ中で１０秒洗浄した。
グラフェン表面へのＯＲリポソームの取り付けを、卓上型のＡＦＭ（ナノサーフ（Nanosurf）、ＮａｉｏＡＦＭ）を使用したＡＦＭによって検証した。動的に適用された力を用いたタッピングモードを使用してイメージングを行った。ＯＲリポソームの機能化後のＡＦＭイメージングを空気中で行った。機能化されたグラフェンＦＥＴを脱イオン水で洗浄し、過量の水を切った。機能化されたデバイスを、画像化の前に窒素流下で乾燥させた。グウィディオン（Gwydion）（Ｖ．２．４７）およびＳＰＩＰソフトウェアパッケージを使用して、ＡＦＭ画像を分析した。図１４は、グラフェン表面上に固定したＯｒ１０ａ、Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏ、Ｏｒ２２ａ、Ｏｒ２２ａ／Ｏｒｃｏ、空のリポソームおよびＯｒｃｏリポソームを示す。この研究で使用されたリポソームの平均サイズは、１２８±４３ｎｍと推定された。ＡＦＭ画像から、機能化後に、リポソームの球状構造が保存されたことが確認された。
１．４ ＯＲリポソームＧＦＥＴの電気的な特徴付け
図１５（ａ）の概略図で示されるように、頂部の液体ゲート構造を使用して、ＯＲリポソームで機能化されたＧＦＥＴの電気的なセンサー測定を行った。ＰＤＭＳウェルを使用して、電解質をチャネル領域に強制的に送った。アジレント４１５６Ｃパラメーター分析器およびマイクロマニピュレーターを備えたルッカー・アンド・コールス（Rucker and Kolls）のプローブステーションを使用して、デバイスを電気的に特徴付けた。Ａｇ／ＡｇＣｌ標準電極を、液体ゲート測定のためのゲート電極として使用した。異なるグラフェンＦＥＴの変換特性（図１５（ｂ）～（ｇ））をＶｄｓ＝１ｍＶで測定し、液体ゲート電圧Ｖｌｇを、－０．５Ｖから１Ｖの間で、２０ｍＶのインターバルでスイープした。
１．５ ＯＲリポソームＧＦＥＴセンサー測定
上にＰＤＭＳウェルがマウントされたＯＲリポソームを固定したＧＦＥＴデバイスをプローブステーションに設置し、マイクロマニピュレーターによってソースおよびドレイン接続を作製した。１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する１００μｌのＰＢＳをウェルに添加し、Ａｇ／ＡｇＣｌ標準電極を緩衝液に入れた。それらは水性緩衝液中で安定ではないため、ＤＭＳＯ中にそれを溶解させることによって、１００ｍＭ濃度でのリガンドのストック溶液を調製した。ストック溶液を４℃で貯蔵した。感知のためのリガンド溶液を、１％ＤＭＳＯを含有する１×ＰＢＳ緩衝液でストック溶液を希釈することによって調製して、濃度を１０ｆＭから１００ｐＭに設定した。リガンド溶液を３分のインターバルでＰＤＭＳウェルに添加して、最終濃度を１ｆＭから１０ｐＭにした。リアルタイムのセンサー測定を、１秒のインターバルでＩｄｓを連続的に測定することによって行った。測定中にわたり、ゲート電圧Ｖｌｇを、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を介して０Ｖに維持した。
２．結果
ＯＲリポソームで機能化されたＧＦＥＴセンサーの感知性能を試験した。感知試験のために、コレセプターＯｒｃｏ含有および非含有のＯＲリポソームを使用した。Ｏｒ１０ａ、Ｏｒ１０ａ／Ｏｒｃｏ、Ｏｒ２２ａおよびＯｒ２２ａ／Ｏｒｃｏリポソームを固定することによってセンサーの４つの設定を製作し、試験した。
Ｏｒ１０ａおよびＯｒ１０ａ／Ｏｒｃｏリポソームセンサーを、それらのポジティブリガンドであるサリチル酸メチルに対して試験した。Ｏｒ２２ａおよびＯｒ２２ａ／Ｏｒｃｏリポソームセンサーを、それらのポジティブリガンドであるヘキサン酸メチルに対して試験した。これらのセンサーはまた、リガンド対照としてＥ２－ヘキセナールを使用しても試験した。空のリポソームおよびＯｒｃｏリポソームで機能化されたＧＦＥＴセンサーの応答を、対照としてサリチル酸メチルとヘキサン酸メチルの両方に対して試験した。実験および測定誤差を低減するために、各実験を３連で行った。
図１６は、濃度を増加させたそれらのポジティブリガンドの添加を用いた４つ全てのセンサーの正規化したリアルタイムの感知応答を示す。Ｏｒｃｏ含有および非含有のリポソームベースのセンサーのそれぞれが、ポジティブリガンドに特異的であるが対照リガンドには特異的ではない用量依存性の応答を生じたことが示される。空のリポソームだけでなくＯｒｃｏを含有するリポソームもポジティブリガンドに応答しないことから、選択的な結合がＯｒＸの存在によるものであることが確認される。図１７は、そのポジティブリガンドへの各ＯｒＸの応答に対するＯｒｃｏの存在の作用を要約する。Ｏｒｃｏの存在は、それらの用量応答曲線の左へのシフトと、それらのＬＯＤのｐＭレベルから１００ｆＭレベルへの低減によって実証されたように、感度の増加をもたらす。表４は、ＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏの組合せに関するＥｃ５０および検出範囲を要約する。
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３．結論
この研究は、ＧＦＥＴデバイスをベースとした嗅覚バイオセンサーにおいて、Ｏｒｃｏの存在下でのＯｒ１０とＯｒ２２ａの両方の改善された感度を実証した。グラフェン上で機能化された、リポソーム中にＯｒｃｏサブユニットと共に埋め込まれたＯｒ１０ａおよびＯｒ２２ａの両方は、リポソーム中のそれら自体である受容体と比較して増加した感度（ｆＭ）を示す。空のリポソームおよびＯｒｃｏリポソームで機能化したグラフェンからの結果と比較して、標的リガンドに対する明らかな電子の応答は観察されない。これは、Ｏｒｃｏはリガンド結合に直接関与しないが、リポソーム中におけるその存在は、その標的リガンドに対するＯｒＸの感度をさらに弱めることを確認する。
実施例５－液滴界面二重層（ＤＩＢ）を用いた二重層センサーデバイスの例証
要約
本出願人は、機能的なイオノトロピック（ionotropic）型の嗅覚受容体（ＯＲ）がプロテオリポソームに取り込まれ、人工二重層と融合すると、そこで匂い物質の可逆的な結合を電気的に測定できることを示した。
１．実験方法
１．１ 材料
リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）タブレット、サリチル酸メチル、およびヘキサン酸メチルを、シグマ－アルドリッチから得た。全ての脂質は、アバンティポーラーリピッド（Avanti polar lipids）から供給された。全ての他の化学物質を、別段の規定がない限り、メルク（Merck）、英国から購入した。再蒸留した「超純」水（ミリポア（Millipore）、ミリＱ：１８．２ＭΩｃｍ）を全体で使用した。
１．４ 脂質液滴の調製
ＤＰｈＰＣ（アバンティ（Avanti）、４ＭＥ１６：０ＰＣ）をクロロホルム中に溶解させ、等分し、その後、窒素流下で乾燥させて、薄い脂質フィルムを形成した。次いでこれをデシケーター中に真空中で１４時間置いた。次いでアリコートを、アルゴン下で、＜－２０℃で貯蔵した。使用前に、ウンデカン（メルク、英国）を添加して、脂質を溶解させて、１０ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。これをＡＲ２０シリコーンオイル（メルク、英国）およびウンデカンで希釈し（最終的なＡＲ２０シリコーンオイルとウンデカンとの比率を１：１にした）、１ｍｇ／ｍｌ溶液を作製した。ウンデカンおよびＡＲ２０シリコーンオイルを、使用前に、０．２２μｍフィルターを使用して予備的にろ過した。
１．５ 電極の調製
銀電極（直径０．５ｍｍ、純度＞９９％、メルク）を適切な長さに切り、微細なグリットサンドペーパーを用いて調製し、その後、次亜塩素酸ナトリウム溶液（フルカ（Fluka）、英国）中で１時間インキュベートした。次いで電極をｄｄＨ２Ｏで洗浄し、その後、電気生理学アレイウェルに挿入するか、またはマニピュレーターに貼り付けた。
１．６ 電気生理学アレイ
ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）から作製されるマルチウェルアレイを、コンピューター支援設計ソフトウェア（フリーＣＡＤ（FreeCAD）、https://www.freecadweb.org/）を使用して設計し、サブトラクティブなコンピューターによる数値制御（computerized numerical control、ＣＮＣ）装置（ローランド（Roland）のモデラ（Modela）ＭＤＸ－４０Ａ）を使用してミリングした。図１８は、このＰＭＭＡプラットフォームの概要を示す。（Ａ）は、アレイの４チャンバー設計を示す。（Ｂ）は、元のＰＭＭＡの形状のベース上に堆積させた液滴（赤色および緑色）とマニピュレーター電極（青色）との間におけるＤＩＢ形成の概略図を示す。ＰＭＭＡの形状は、その形状内の電極の位置を適切に表示するために、完全に透明なものとして示される。
１．７ 電気生理学装置
ファラデーケージ内に含有されるＰｉｃｏ２（テセラ（Tecella）、米国）増幅器を使用して、電気生理学的な記録をとった。
１．８ 液滴界面二重層の形成
ウンデカン中の１ｍｇ／ｍｌのＤＰｈＰＣおよびＡＲ２０シリコーンオイル（１：１の比率）で充填されたＰＭＭＡチャンバー内に形成された２つの液滴の間に二重層を形成した。このプロセスにおける第１の工程は、ウェルのベースに配置された固定の銀電極上に５０ｎｌの液滴を堆積させることであった。この液滴は、プロテオリポソーム中に匂い物質受容体タンパク質（プロテオリポソーム調製物からの１：２０の希釈で）、および０．１～１μＭの匂い物質を含有する、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含有する水溶液からなっていた。第２の液滴を、ＹＯＵ－３マニピュレーター（ナリシゲ（Narishige）、日本）を使用して、油および脂質混合物中に保持された第２の銀電極上にマウントした。第２の液滴は、５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含有する５０ｎｌの総体積を有していた。両方の液滴を、０．５μｌのシリンジ（ハミルトン（Hamilton）、米国）を使用して堆積させた。各液滴の周りに安定なリン脂質単分子層が形成されたことを確認するために、液滴を電極上に５分残し、その後、ＹＯＵ－３マニピュレーターを使用して穏やかに一緒にした。一旦液滴が接触すると、１分以内に二重層が自発的に形成された（これは視覚的評価によって決定した場合であり、Ｐｉｃｏ２増幅器を使用したキャパシタンス電圧プロトコールで測定した場合は、二重層のキャパシタンスの増加である）。活性なチャネルの挿入を、５０ｍＶで電圧を固定する間の電流における変化によって決定した。このプロセスは最大４５分を要した。この時点で挿入がみられなかった場合、実験を放棄した。液滴界面二重層実験は、２２．０±１．５℃で実行された。
１．９ パラメーターの記録
電流を、２０ｋＨｚのサンプリング周波数で、０．８または１．５ｋＨｚの低域通過フィルターを使用して、ギャップなしの獲得モードで作動する、埋め込み型のデジタイザーを備えたＰｉｃｏ２またはｅＯＮＥ－ＨＳ増幅器（それぞれ、テセラ、米国およびエレメンツ（Elements）、イタリア）を用いて記録した。全ての実験を、電圧固定アプローチを使用して実行した。膜を通る電圧を、－２００ｍＶ～２００ｍＶの範囲の様々な電位で固定した。
１.１０ 手動でのデータ分析
データを、ＡＮＡ（Dr Pusch、ジェノバ）、ＥＤＲ（エレメンツ、イタリア）およびＷｉｎＷＣＰ（Dr Dempster、ストラスクライド大学（University of Strathclyde））を使用して分析した。単一のチャネル電流を、観察された電流の振幅の段階的な増加として測定した。異なる保持電位で電流を測定する場合、ベースラインの電流が異なるレベルにある可能性がある。これを補正するために、電流における変化は、共通の実施であるためベースラインに対して示される。電気化学的な平衡値未満の保持電位で、チャネルの開口は、下方への偏差（downward deflection）として示される。反比例して、保持電位が逆転電位より大きい場合、チャネルの開口はベースラインから上方への偏差として示される。
２．結果
図１９は、浮遊電極のセットアップを使用して測定した場合の（図１８を参照）、１：１の１ｍｇ／ｍｌのＤＰｈＰＣを含有するウンデカンとシリコーンオイルの混合物中で２つの水性液滴間に形成された液滴界面二重層（ＤＩＢ）からのイオンチャネルの記録を示す。Ｏｒ２２ａのみ（図１９ａ）およびＯｒ２２ａ／Ｏｒｃｏ（図１９ｂ）を含有するプロテオリポソームをＤＩＢと融合させ、受容体サブユニットの挿入を可能にした。使用された溶液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを含むｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌまたは５０ｍＭのＮａＣｌのいずれかを含有し、公知のＯｒ２２ａアゴニストである１０μＭのヘキサン酸メチルが補充される。Ｏｒ２２ａのみのＤＩＢ実験の場合（図１９ａ）、保持電位を±１５０ｍＶ、±１００ｍＶ、および±５０ｍＶの間で変更した。いずれの保持電位でもイオンチャネル活性は観察されないことから、Ｏｒ２２ａは、それ自体活性なイオンチャネルを形成できないことが示される。Ｏｒ２２ａ／ＯｒｃｏＤＩＢ実験の場合（図１９ｂ）、保持電位を±１００ｍＶ、±５０ｍＶおよび±２５ｍＶの間で変更した。このケースにおいて、イオンチャネル活性は±１００ｍＶ、±５０ｍＶおよび－２５ｍＶで観察されることから、Ｏｒ２２ａは、Ｏｒｃｏと組み合わされる場合、活性なリガンドでゲーティングしたイオンチャネルを形成できることが示される。図２０は、－１００ｍＶの保持電位で獲得された第２の独立したＯｒ２２ａ／ＯｒｃｏのＤＩＢ実験を示す。このケースにおいて、複数の開口した状態を確認でき、これは、複数のＯｒ２２ａ／Ｏｒｃｏチャネル複合体の挿入に起因する可能性がある。
図２１は、０ｍＶ（図２１ａ）および－１００ｍＶ（図２１ｂ）の保持電位で、浮遊電極のセットアップを使用して測定した場合の（図１８を参照）、１：１の１ｍｇ／ｍｌのＤＰｈＰＣを含有するウンデカンとシリコーンオイルの混合物中で２つの水性液滴間に形成された２つの液滴界面二重層（ＤＩＢ）からのイオンチャネルの記録を示す。Ｏｒｃｏ／Ｏｒ７１ａを含有するプロテオリポソームをＤＩＢと融合させ、受容体サブユニットを挿入させた。使用された溶液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを含むｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌまたは５０ｍＭのＮａＣｌのいずれかを含有し、１０μＭの標的リガンドである４－エチルグアヤコールが補充される。両方のＤＩＢ実験は、Ｏｒｃｏの存在下でのＯｒ７１ａは、活性なリガンドでゲーティングしたイオンチャネルを形成できることを示す。
３．結論
この研究は、Ｏｒｃｏの存在が、電子デバイスプラットフォームをベースとした嗅覚バイオセンサーにおけるＯｒＸの感度に影響を与えることをさらに確認した。このケースにおいて、２つのＯｒＸ（Ｏｒ２２ａおよびＯｒ７１ａ）が独立してＯｒｃｏサブユニットと共に脂質二重層に挿入される場合、両方のＯｒＸ／Ｏｒｃｏ複合体は、ＯｒＸの標的リガンドの存在下でイオンチャネル活性を呈示する。しかしながら、Ｏｒｃｏの非存在下では、このリガンドでゲーティングされた活性は示されないことから、活性なイオンチャネルの形成におけるＯｒｃｏの役割が強調される。このデータは、特異的な揮発性有機化合物を、それらのイオンチャネル活性応答に基づいて検出するために、脂質二重層ベースのセンサーデバイスにＯｒＸ／Ｏｒｃｏ複合体を使用する可能性を実証する。
実施例６－表面プラズモン共鳴画像化を用いたセンサーの例証
要約
本出願人は、Ｏｒｃｏ配列の非存在および存在下でリポソームおよびナノディスクを含む膜模倣物に埋め込まれた昆虫匂い物質受容体（ＯｒＸ）サブユニットを使用した、便利なＳＰＲｉセンサーデバイスを記載している。ＯｒＸで機能化したＳＰＲセンサーのそれぞれは、その標的リガンドに対して明らかな電子応答を示す。膜模倣物におけるＯｒｃｏの存在は、ＯｒＸ応答に対して相加的な、または増幅的な作用を有し、その標的リガンドに対するＯｒＸの感度を増加させる。結合の特異性は、非応答リガンドに対する、各ＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏで機能化したＳＰＲｉセンサー応答を試験することによって検証される。
１．実験方法
１．２ ＯＲが会合したリポソームおよびナノディスクの調製
１．２．１ 精製されたＯＲサブユニットの調製
ＯｒＸおよびＯｒｃｏサブユニットは、実施例１のセクション１．２に記載されたように調製される。ＯｒＸおよびＯｒｃｏサブユニットは、ＳＰＲｉプリズムの金表面へのその直接のカップリングを可能にするために、そのＮ末端で改変されたシステイン残基を有する。
１．２．２ ＯＲが会合したリポソームの調製
ＯｒＸおよびＯｒｃｏリポソームは、実施例１のセクション１．３に記載されたように調製される。
１．２．３
ＯＲが会合したナノディスクの調製
ナノディスクを、Bayburtら、2010および2003５５、５６から改変したプロトコールを使用して調製する。１：０．２：１５０のＭＳＰ：タンパク質：脂質の比率で、ナノディスクを形成した。必要なの量の脂質を１００ｍｇ／ｍＬストックから取り出し、一定の窒素ガス流下で乾燥させ、次いで真空中で一晩さらに乾燥させる。脂質を、必要な体積の緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのコール酸ナトリウム）に再懸濁し、音波破砕し、２０ｍｇ／ｍＬ濃度で透明な脂質ストックを得る。洗浄剤緩衝液中の精製した匂い物質受容体タンパク質を、ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１およびＰＯＰＣ脂質と必要な比率で混合し、氷上で１時間インキュベートする。系から洗浄剤を除去することによって再構成を開始させるために、バイオビーズＳＭ２（バイオラッド番号１５２３９２０）を、サンプルに１：１の重量：体積比で添加し、混合物を、４℃で一晩、一定の回転でインキュベートする。次いでバイオビーズを除去し、取り込まれたナノディスクを必要になるまで－８０℃で凍結する。
１．３ ＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏ ＳＰＲｉセンサーの調製
リポソームまたはナノディスクにおけるＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏは、脊椎動物匂い物質結合タンパク質（ＯＢＰ）の固定のためのHurotら、2019によって使用されたプロトコール５７に従って、ＳＰＲｉプリズムの金表面上の画定されたスポットとして固定される。ＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏ複合体は、Ｎ末端のシステイン残基を介して直接固定される。固定は、リポソームまたはナノディスク単分子層をもたらす金表面上でのリポソームまたはナノディスクの自己集合を確実にするために、適切な密度で行われる。これは、金層に直接取り付けられたＯｒＸまたはＯｒＸ／Ｏｒｃｏ複合体の結合ポケットに標的リガンドがアクセスすることを妨げるリポソームまたはナノディスクの追加の無秩序な層の形成を妨げる。金表面を完全に覆う単分子層を、金表面への標的リガンドの非特異的な結合をブロックするために得る。
１．４ ＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏ ＳＰＲｉセンサーによるリガンド結合の検出および分析
ＶＯＣのＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏリポソームまたはナノディスクへの結合は、適切なＳＰＲｉ装置を使用して検出され、Hurotら、2019５７に記載されるようにして分析される。ＯｒＸまたはＯｒＸ／Ｏｒｃｏを固定した金表面は、異なる濃度（ｆＭからｎＭ）の標的リガンドまたは対照リガンドに曝露される。リガンド結合は、リガンド添加前のベースラインと比較した反射率の変化として測定される。実験および測定誤差を低減するために、各実験は３連で行われる。
２．結果
ＯｒＸおよびＯｒＸ／Ｏｒｃｏリポソームまたはナノディスクで機能化されたＳＰＲｉセンサーの感知性能は、ＯｒＸサブユニットに特異的なポジティブリガンドおよびＯｒＸが結合しないと予想される対照リガンドに対して試験される。空のリポソームおよびＯｒｃｏリポソーム、または空のナノディスクおよびＯｒｃｏナノディスクで機能化されたＳＰＲｉセンサーの応答もポジティブリガンドに対して試験される。
両方の膜提示様式のケースにおいて、ＯｒＸサブユニットそれ自体は、用量応答曲線を生じるポジティブリガンドに高感度で結合するが、対照リガンドに応答しない。Ｏｒｃｏサブユニットも存在する場合、それらの用量応答曲線の左へのシフトとそれらのＬＯＤの低減によって実証されたように、Ｏｒｃｏの存在は、感度の増加をもたらすと予想される。空のリポソームだけでなくＯｒｃｏを含有するリポソームもポジティブリガンドに応答しないことから、選択的な結合がＯｒＸの存在によるものであることが確認される。
３．結論
この研究は、ＳＰＲｉデバイスをベースとした嗅覚バイオセンサーにおけるＯｒｃｏの存在下でのＯｒＸの改善された感度を実証することが期待される。ＳＰＲｉガラスプリズムの金表面上で機能化されるリポソームまたはナノディスク中にＯｒｃｏサブユニットと共に埋め込まれたＯｒＸは、ＯｒＸ受容体それ自体と比較して増加した感度を示すと考えられる。空のリポソームまたはナノディスクおよびリポソームまたはナノディスクを含有するＯｒｃｏからの結果と比較して、それぞれ標的リガンドに対する明らかな電子応答は観察されない。これは、Ｏｒｃｏはリガンド結合に直接関与しないが、リポソーム中におけるその存在は、その標的リガンドに対するＯｒＸの感度をさらに弱めることを確認すると思われる。
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Claims (19)

  1. 基板と電気的に連通するＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体を含むセンサーデバイスであって、該昆虫の匂い物質受容体複合体は該基板にカップリングされており、該センサーデバイスは該基板の電気的な特徴における変化を検出することにより分析物の該ＯｒＸへの結合を検出するように設計されており、該基板は電気化学セルの作用電極、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）のチャネル、グラフェン－電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）のチャネル、水晶振動子マイクロバランスにおける共振器要素、またはガラスプリズム上の不活性金属表面から選択される、上記センサーデバイス。
  2. 前記昆虫の匂い物質受容体複合体が、前記分析物の結合に応答してコンフォメーション変化を受けることが可能な形態で存在する、請求項１に記載のセンサーデバイス。
  3. 前記昆虫の匂い物質受容体複合体が、膜模倣物に存在する、請求項１または２に記載のセンサーデバイス。
  4. 膜模倣物が、リポソーム、アンフィポール、洗剤ミセル、ナノベシクル、脂質二重層、ナノディスク、および界面活性剤から選択される、請求項３に記載のセンサーデバイス。
  5. 前記膜模倣物が、両親媒性分子を含む、請求項３または４に記載のセンサーデバイス。
  6. 前記両親媒性分子が、リン脂質分子を含む、請求項５に記載のセンサーデバイス。
  7. 前記分析物の存在を、１×１０－３Ｍ未満の濃度で検出することができる、請求項１に記載のセンサーデバイス。
  8. 前記分析物の存在を、１×１０－９Ｍ未満の濃度で検出することができる、請求項７に記載のセンサーデバイス。
  9. 前記分析物の存在を、１×１０－１２Ｍ未満の濃度で検出することができる、請求項８に記載のセンサーデバイス。
  10. 前記分析物の存在を、１×１０－１５Ｍ未満の濃度で検出することができる、請求項９に記載のセンサーデバイス。
  11. 前記基板が、電極、半導体材料、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、グラフェン、酸化物、ドープシリコン、導電性ポリマー、および共振器要素の少なくとも１つから選択されるかまたはそれで構成される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のセンサーデバイス。
  12. 前記電気的な特徴が、導電率、抵抗、複合抵抗、インピーダンス、電気化学インピーダンス、電気化学ポテンシャル、電流の流れ、および交流電場により誘導された振動の共振振動数の少なくとも１つから選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のセンサーデバイス。
  13. 分析物を検出する方法であって、
    ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のセンサーデバイスにおいて、該分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程、
    ｂ）基板の電気的な特徴における変化を検出する工程
    を含み、該基板の電気的な特徴における変化が分析物の検出を示す、上記方法。
  14. 環境における分析物の存在を検出する方法であって、
    ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のセンサーデバイスを、分析物を含有する環境に曝露する工程、
    ｂ）該センサーデバイスにおいて、該分析物を昆虫ＯｒＸに結合させる工程
    ｃ）基板の電気的な特徴における変化を検出する工程
    を含み、
    基板の電気的な特徴における変化が環境における分析物の存在を示す、上記方法。
  15. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のセンサーデバイスを製造する方法であって、ＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体と、センサーデバイスの基板との間に電気的な連通を確立する工程を含み、該センサーデバイスは、該基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記方法。
  16. 基板と電気的に連通するＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体を含むセンサーデバイスの要素であって、該昆虫の匂い物質受容体複合体は該基板にカップリングされており、該基板は電気化学セルの作用電極、カーボンナノチューブ電界効果トランジスタ（ＣＮＴ－ＦＥＴ）のチャネル、グラフェン－電界効果トランジスタ（ＧＦＥＴ）のチャネル、水晶振動子マイクロバランスにおける共振器要素、またはガラスプリズム上の不活性金属表面から選択される、上記センサーデバイスの要素。
  17. 請求項１６に記載のセンサーデバイスの要素を含むセンサーデバイスであって、該センサーデバイスは基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記センサーデバイス。
  18. 請求項１６に記載のセンサーデバイスの要素を製造する方法であって、ＯｒＸおよびＯｒｃｏを含む昆虫の匂い物質受容体複合体と基板との間に電気的な連通を確立する工程を含む、上記方法。
  19. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のセンサーデバイスを組み立てる方法であって、請求項１６に記載のセンサーデバイスの要素を、該センサーデバイスに付与することを含み、組み立てられたセンサーデバイスは、該基板の電気的な特徴における変化を検出するように設計されている、上記方法。
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