KR102589755B1 - 상온 발효 유산균(Enterococcus faecium MSS2) 대사산물의 Trichoderma hazianum에 대한 성장억제 활성 및 조성물 - Google Patents
상온 발효 유산균(Enterococcus faecium MSS2) 대사산물의 Trichoderma hazianum에 대한 성장억제 활성 및 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대한 항진균용 조성물 에 관한 것으로, 본 발명에 따른 항진균용 조성물은 버섯의 생장력 증진과 버섯에서 나타나는 푸른곰팡이병의 주 원인균인 트리코더마 하지아눔의 성장을 억제하는 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 상온에서 발효 가능한 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대한 항진균용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 출원일자 2020년 8월 11일자, 출원번호 10-2020-0100308, 명칭 “상온 발효 유산균(Enterococcus faecium MSS2) 대사산물의 Trichoderma hazianum에 대한 성장억제 활성 및 조성물”에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 발명의 일부로 포함시킨다.
담자균강 주름버섯목 느타리과 잣버섯속에 속하는 표고버섯(Lentinus edodes)은 맛이 좋은 3대 버섯의 하나로 널리 알려져 있으며, 또한 면역강화 등 건강에 이로운 여러 효능이 알려져 우수한 식재료로 이용되고 있다(비특허문헌 1). 황기를 이용한 황기 표고버섯균사체는 암세포등에 항암효과와 알레르기 억제효과가 있으며(비특허문헌 2), 섬유질과 비타민이 풍부하여 혈중 콜레스테롤 및 체중 감소 효과가 있는 등(비특허문헌 3), 여러 가지 효과가 있어 선호도가 매우 높은 버섯이다.
이러한 표고버섯의 다양한 장점에도 불구하고 국내 표고버섯 생산량은 꾸준히 감소하는 추세이며 그 중 주된 원인 중 하나가 푸른곰팡이병의 빈번한 발생이다. 푸른곰팡이병은 균의 종류에 따라 병원성이 다르며, 이들 중 트리코더마 종(Trichoderma spp)의 발생빈도가 높고 피해도 가장 심하다(비특허문헌 4).
푸른곰팡이병은 균사 생장기에는 백색이지만 포자가 형성되면서 푸른색을 띠기 때문에 푸른곰팡이병으로 불린다. 푸른곰팡이는 목재성분을 부패시키고, 표고균사에 직접 기생한 후 균사를 사멸시키기도하며, 독소(gliotoxin)를 분비하며 균사 생장 및 버섯의 발생을 억제한다(비특허문헌 5).
푸른곰팡이 트리코더마 종에 의한 녹색곰팡이병은 크로아티아를 포함한 전세계 버섯 재배자들에게 심각한 문제가 되고 있다(비특허문헌 6). 종래에는 항진균성 펩타이드를 이용하여 표고버섯 푸른곰팡이병을 억제하기도 하였다(비특허문헌 7).
또한 톨리신류 펩타이드의 혼합처리에 의한 항진균 활성이 있어 푸른곰팡이병을 억제할 수 있었다(비특허문헌 8). 농약 등 화학약품에 의한 방제는 약제에 대한 내성균의 발생가능성, 비표적 생물에 대한 독성, 환경문제를 야기할 수 있기 때문에(비특허문헌 9) 푸른곰팡이병에 대한 연구가 더 필요하다.
따라서, 본 발명자는 지금까지 이용되지 않았던 김치에서 분리된 유산균(Enterococcus facium MSS2)을 이용하여 유산균 배양의 최적조건 및 항진균성이 높은 유기산을 제조하여 버섯의 생장력 증진과 버섯 재배에서 자주 나타나는 푸른곰팡이병의 주된 원인인 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)을 억제하는 활성에 대해 연구하여 본 발명을 완성하였다.
Yamamoto, Y., Shirono, H., Kono, K., & Ohashi, Y. Immunopotentiating activity of the water-soluble lignin rich fraction prepared from LEM: The extract of the solid culture medium of Lentinus edodes mycelia. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 61(11), 1909-1912, 1997
Bae, M. J., Kim, K. J., Kim, S. J., & Ye, E. J. Effect of mycelia extracts from Lentinus edodes mushroom-cultured Astragalus membranaceus bunge on anti-cancer and anti-allergy activities. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 36(1), 8-13, 2007.
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본 발명의 목적은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대한 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 버섯 배양용배지에 접종하는 것을 포함하는 버섯의 재배방법을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대해 성장억제활성을 나타내는 균주를 찾고자 노력한 결과, 김치에서 분리한 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물이 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 항진균 활성을 갖는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC 12795BP) 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 발명은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC 12795BP)는 김치 유래의 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2를 김치에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2) 균주는 출원번호 10-2015-0080818 발명을 통해, 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과를 나타내는 유산균인 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2) 균주이다.
본 발명에의 실시예를 통해 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대해 항진균 활성을 나타내는 유산균 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, 서열번호 1의 핵산서열을 갖는다.
서열번호 1의 16S rDNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2)로 명명되었으며, 미생물보존센터에 2015년 4월 13일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12795BP).
본 발명의 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2는 그람양성균이며 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이고, 연쇄상구균의 형태를 취하고 있다.
본 발명의 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2는 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역증강효과를 갖는다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 기술한 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물이 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대해 항진균 활성을 갖는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대한 항진균용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양물은 상기한 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP)을 상온에서 발효 배양시킨 대사산물을 포함하는 의미로 사용된다.
상기 대사산물은 당류(예컨대, 포도당 등)를 탄소원으로 하여 미생물에 의해 생산될 수 있는 생화학 물질을 지칭하며, 그 예로는 에탄올, 프로판올, 프로판디올, 부탄올, 부탄디올 등의 알콜류; 아세톤, 락톤 등의 케톤류; 라이신 등의 아미노산류; 아세트산, 젖산, 부티르산, 푸마르산, 말레산, 호박산, 감마아미노부티르산, 아미노발레르산, 글루타르산 등의 유기산류; 벤젠; 탄화수소 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 담자균류 버섯에서 푸른곰팡이병을 유발하는 트리코더마 하지아눔에 대해 항진균 활성을 나타내는 대사산물로서 이해될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물 외에 종래 버섯의 영양제로 사용되는 버섯영양제를 추가로 포함할 때 트리코더마 하지아눔에 대해 항진균 활성을 갖는 것을 확인하였다.
상기 버섯영양제는 해양심층수유래 미네랄농축수, 일라이트용액, 유황용액, 해조류추출물 또는 이의 혼합의 영양제가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 버섯영양제 20%(v/v)와 상기 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물이 5%(v/v) 내지 90%(v/v)으로 혼합되어 트리코더마 하지아눔에 대한 항진균용 조성물에 포함될 수 있고, 바람직하게는 버섯영양제 20%(v/v)에 상기 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물이 10%(v/v) 내지 90%(v/v), 더욱 바람직하게는 버섯영양제 20%(v/v)와 상기 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물이 35%(v/v) 내지 90%(v/v)으로 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 트리코더마 하지아눔에 대한 항진균용 조성물은 버섯영양제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 버섯영양제는 상기 항진균용 조성물을 기준으로 10%(v/v) 내지 30%(v/v)로 포함될 수 있고, 바람직하게는 12%(v/v) 내지 28%(v/v) 혹은 15%(v/v) 내지 25%(v/v)로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 버섯 배양용배지에 접종하는 것을 포함하는 버섯의 재배방법을 제공한다.
본 발명에서의 버섯은 표고버섯, 느타리버섯, 느티만가닥버섯, 꽃송이버섯, 새송이버섯, 양송이버섯, 팽이버섯, 목이버섯 및 노루궁뎅이버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 담자균류 버섯일 수 있고, 바람직하게는 표고버섯일 수 있으나, 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 의해 푸른곰팡이병이 나타나는 버섯이라면 그 종류 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 본 발명의 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP) 균주를 증식시키기 위한 재료로서 대두, 팥, 옥수수, 감자 및 고구마로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 곡류 분말; 및 톳, 다시마, 미역 및 청각으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 해조류 분말을 혼합하여 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP) 균주 배양용 배지에 첨가하였다.
상기 곡류 분말과 해조류 분말은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP) 균주 배양 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 각각 5%(w/v)으로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP) 균주를 배양하기 위한 배지는 당업계에서 사용되는 유산균 배양용 배지가 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 일 측면은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물, 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대한 항진균용 식물영양제를 제공한다.
본 발명에 있어서, 버섯 재배에 사용되는 기본배지에는 보조재료가 사용될 수 있고, 보조재료의 사용량은 주재료의 사용량에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 따른 버섯 생육 과정 시의 유산균 및 유산균 대사산물은 푸른곰팡이를 예방하고, 수확된 버섯의 저장기간을 연장할 수 있으며, 수확량을 증가시키는 효과를 제공한다.
본 발명은 이들의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법을 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 청구항의 범위에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은 상온에서 발효 가능한 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대한 항진균용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항진균용 조성물은 버섯의 생장력 증진과 버섯에서 나타나는 푸른곰팡이병의 주 원인인 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)의 성장억제에 효과적이고, 나아가 수확된 버섯의 저장기간을 연장할 수 있으며, 수확량을 증가시키는 효과를 제공한다.
도 1은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2) 균주를 1 콜로니(colony) 접종한 후, 각각 25, 30 및 37℃에서 24시간 간격으로 배양하면서 Mcfarland standard를 이용하여 총 균수가 적정균수까지 도달하였는지 측정한 결과를 보여준다.
도 2는 유산균의 생육 온도에 따른 시간별 생육 곡선을 보여준다.
도 3은 24시간 간격으로 72시간 까지 시간이 경과함에 따른 pH 변화량을 보여준다(A : 톳, B : 다시마, C : 미역, D : 청각, E : 팥, F : 옥수수, G : 대두박 H : 고구마, I : 감자).
도 4는 HPLC-DAD를 사용하여, 표준물질을 기준으로 하여 유기산 함량을 측정 결과를 보여준다(표준물질의 LC 크로마토그래피).
도 5는 HPLC-DAD를 사용하여, 표준물질을 기준으로 하여 유기산 함량을 측정 결과를 보여준다(다시마 유산균 대사산물의 LC 크로마토그래피).
도 6은 유기산 함량 분석 결과를 보여준다(1) 함량(Contents); y = 0.2944x + 0.2621 (R2 = 1.0000) (Y = 젖산 영역(Area of Lactic acid), X = 젖산 농도( concentration of Lactic acid)) (함량 = 젖산 농도 x 희석 인자(Dilution factor)) 2) mg/kg = ppm).
도 7은 영양제와 유산균 대사산물을 혼합한 배지에서의 버섯균의 형태학적 변화를 보여준다. 본 발명에 따른 유산균 대사산물이 버섯의 생육을 억제하지 않음을 알 수 있다. (A): PDA배지 대조군, (B) 버섯균만 첨가한 배지, (C) 영양제20%+유산균대사산물10%, (D) 영양제20%+유산균대사산물20%, (E) 영양제20%+유산균대사산물30%, (F) 영양제20%+유산균대사산물40%, (G) 영양제20%+유산균대사산물50%, (H) 영양제20%+유산균대사산물60%, (I) 영양제20%+유산균대사산물70%, (J) 영양제20%+유산균대사산물80%
도 8은 유산균 대사산물의 농도에 따른 트리코더마 하지아눔의 성장억제율에 대한 형태학적 변화를 보여준다.
도 2는 유산균의 생육 온도에 따른 시간별 생육 곡선을 보여준다.
도 3은 24시간 간격으로 72시간 까지 시간이 경과함에 따른 pH 변화량을 보여준다(A : 톳, B : 다시마, C : 미역, D : 청각, E : 팥, F : 옥수수, G : 대두박 H : 고구마, I : 감자).
도 4는 HPLC-DAD를 사용하여, 표준물질을 기준으로 하여 유기산 함량을 측정 결과를 보여준다(표준물질의 LC 크로마토그래피).
도 5는 HPLC-DAD를 사용하여, 표준물질을 기준으로 하여 유기산 함량을 측정 결과를 보여준다(다시마 유산균 대사산물의 LC 크로마토그래피).
도 6은 유기산 함량 분석 결과를 보여준다(1) 함량(Contents); y = 0.2944x + 0.2621 (R2 = 1.0000) (Y = 젖산 영역(Area of Lactic acid), X = 젖산 농도( concentration of Lactic acid)) (함량 = 젖산 농도 x 희석 인자(Dilution factor)) 2) mg/kg = ppm).
도 7은 영양제와 유산균 대사산물을 혼합한 배지에서의 버섯균의 형태학적 변화를 보여준다. 본 발명에 따른 유산균 대사산물이 버섯의 생육을 억제하지 않음을 알 수 있다. (A): PDA배지 대조군, (B) 버섯균만 첨가한 배지, (C) 영양제20%+유산균대사산물10%, (D) 영양제20%+유산균대사산물20%, (E) 영양제20%+유산균대사산물30%, (F) 영양제20%+유산균대사산물40%, (G) 영양제20%+유산균대사산물50%, (H) 영양제20%+유산균대사산물60%, (I) 영양제20%+유산균대사산물70%, (J) 영양제20%+유산균대사산물80%
도 8은 유산균 대사산물의 농도에 따른 트리코더마 하지아눔의 성장억제율에 대한 형태학적 변화를 보여준다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
1.
사용균주
및 재료
본 발명에 사용된 유산균은 본 연구실에서 분리동정된 상온발효가 가능한 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2) 균주를 사용하였다. 유산균 증식용 배지는 MRS broth(MB Cell, KisanBio, Korea)를 5%(w/v) 농도로 사용하였으며, 첨가제인 영양제는 (주)엘에스과학기술원(강릉, 강원도)의 제품을 사용하였다.
유산균을 증식시키기 위한 첨가 재료는 톳분말, 다시마분말, 미역분말, 청각분말, 대두박분말, 팥분말, 옥수수분말, 감자, 고구마 등으로 ㈜엘에스과학기술원(강릉, 강원도)에서 지원받아 사용되었다. 유산균 증식용 배양기는 인큐베이터(incubator; LIB-150M Laptech.Co Korea)를 사용하여 배양하였다. 배양액의 pH는 pH 컨트롤러(controller; BL 981411, Hanna Co., Korea)를 사용하여 측정하였으며, 수율(brix)은 당도계(N-3E, Atago사, USA)를 사용하여 측정하였다. 유산균 대사산물의 유기산 함량측정을 위하여 HPLC-DAD (High performance Liquid Chromatography - Diode Array Detector)가 사용되었다.
유산균 대사산물의 트리코더마 하지아눔에 대한 성장 억제율을 측정하기 위한 배지는 PDA(Potato Dextrose agar) 배지를 사용하였으며, 영양제는 ㈜엘에스과학기술원(강릉, 강원도) 제품 (해양심층수유래 미네랄농축수, 일라이트용액, 유황용액, 해조류추출물 또는 이의 혼합의 영양제)을 사용하였다.
<서열번호 1> 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2의 16S rDNA
GGCCAAAAAGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCTAAGGGGAACCCCCCCAAAAAAAGCGGC
2. 유산균 액체배양
배지조건
및
적정균수
측정
유산균을 배양하기 위한 액체배지는 증류수 95mL에 5g의 MRS broth 분말, 5mL의 영양제를 넣어 증류수로 전체 부피가 100mL되도록 하여 멸균기(AC-13, JEIOTECH, Korea)를 사용하여 멸균시킨 후 30분간 상온에서 냉각하여 제조하였다. 유산균수는 액체배지에 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2를 1 colony 접종한 후, 각각 25℃, 30℃, 37℃에서 24시간 간격으로 배양하면서 Mcfarland standard를 이용하여 측정하였다(도 1). 72시간 배양 후 총 균수가 1x109 CFU/ml에 도달하였는지 측정하였다.
3. 유산균
대사산물
제조
엔테로코쿠스 파에시움 MSS2의 액체배양액을 이용하여 유산균 대사산물을 제조하기 위하여 톳분말, 다시마분말, 미역분말, 팥분말, 청각분말, 옥수수분말, 대두박분말, 고구마, 감자 등 상업적으로 활용할 수 있는 곡물, 해조류등을 사용하였다.
100ml의 MRS broth 배지에 각각 곡물, 해조류를 5%(5g)씩 혼합한 후 멸균기(AutoClave)를 이용하여 멸균한 후 1x109CFU/ml 이상 배양된 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2의 액체배양액을 1ml 접종하여 30℃에서 24시간 간격으로 pH변화량을 측정하였다. 72시간 이상 배양하였을 때 pH값이 가장 낮은 발효물을 선정하였다. 또한 유산균 대사산물의 수율(brix)을 4brix이상을 기준으로 측정하였다.
4. 유산균
대사산물
유기산 함량 측정
다시마를 이용하여 발효시킨 유산균 대사산물의 Lactic acid 함량 측정을 위해 유산균 대사산물 시료의 전처리로 8000rpm에서 5분 동안 원심분리(Centrifugation)한 후 0.22um 필터로 여과하여 사용되었다. HPLC-DAD(High performance Liquid Chromatograph - Diode Array Detector)로 분석되었으며, 컬럼은 Eclipse XDB-C18, 이동상으로는 아이소크라틱(Isocratic) (A : 0.1% phosphoric acid in water)이 사용되었고 검출기는 DAD를 사용하였다.
5. 유산균
대사산물과
영양제가
버섯균
생장에 끼치는 영향
다시마를 이용한 유산균 대사산물과 영양제의 버섯균에 대한 영향을 확인하기 위하여 유산균 대사산물을 8000rpm에서 5min동안 원심분리한 후 상층액을 취하였다. 패트리 디쉬(Petri dish)에 대조구(Control)를 PDA(Potato Dextrose agar)배지 30ml 대조군으로 배지조성을 영양제 20%(v/v)로 고정한 후 유산균 대사산물 10%(v/v) 내지 80%(v/v)를 혼합하고 멸균기를 이용한 후 배지로 사용하였다. PDA(Potato Dextrose agar) 배지에서 3일이상 배양한 표고버섯(Lentinula edodes)균을 영양제와 유산균대사산물을 비율별로 혼합한 배지의 중앙에 1 colony 접종하였다. 표고버섯(Lentinula edodes)균을 접종 후 25℃에서 3일간 배양하여 버섯균 생장력을 확인하였다.
6. 유산균
대사산물의
Trichoderma
hazianum
에
대한 성장 억제율
유산균 대사산물의 트리코더마 하지아눔에 대한 성장 억제율을 확인하기 위하여 유산균 대사산물을 8000rpm에서 5분동안 원심분리한 후 상층액을 취하였다. PDA(Potato Dextrose agar) 배지에서 3일이상 배양한 트리코더마 하지아눔 균을 영양제와 유산균대사산물을 비율별로 혼합한 배지의 중앙에 1 콜로니 접종하였다. 배지조성은 영양제 비율을 20%(v/v)로 고정한 후 유산균 대사산물을 10%(v/v) 내지 80%(v/v)를 혼합하여 사용하였다. 접종 후, 25℃에서 3일간 배양하여 24시간 간격으로 곰팡이균 환의 반지름 길이를 측정하여, 면적을 구한 뒤 면적비에 따른 트리코더마 하지아눔에 대한 성장억제율(%)을 측정하였다.
면적비에 따른 계산법
성장억제율(%) : (A-B)/A*100
A : 대조군의 환의크기
B : 실험군의 환의크기
7. 결과
7-1. 유산균의 생육 온도에 따른 시간별 생육곡선 확인
유산균(Enterococcus faecium MSS2)의 최적 배양조건 및 푸른곰팡이에 대한 항균력이 높은 유기산을 제조하기 위하여 유산균 대사산물을 이용한 버섯영양제의 소재 개발에 대한 연구를 진행하였다. 유산균의 최적 배양조건을 확립하기 위해 MRS broth 배지에 영양제를 혼합하여 균이 더 잘 자랄 수 있게 영양분을 공급하였으며, 균이 주로 자랄 수 있는 온도인 25℃, 30℃ 및 37℃에서 배양한 결과 30℃에서 가장 안정적인 유산균 생장력을 확인할 수 있었다(도 2).
7-2. 시간의 경과에 따른 pH 변화량 측정 결과
유산균 대사산물을 제조하기 위하여 상업적으로 이용할 수 있는 여러 가지 곡류, 해조류인 톳, 다시마, 미역, 청각, 팥, 옥수수. 대두박, 고구마, 감자 등을 이용하여 유산균 대사산물을 제조하였다. 해조류 중에서 톳을 이용한 유산균 발효물은 pH 5.7에서 pH4.9까지 감소하였으며, 다시마를 이용한 유산균 발효물은 pH6.1에서 pH3.8까지 감소하였다. 미역과 청각의 유산균 발효물은 각각, pH5.7에서 pH4.6까지 감소, 곡류 중에서 팥 유산균 발효물은 pH5.9에서 pH4.9까지 감소, 옥수수는 pH5.8에서 pH4.7로 감소, 대두박은 pH5.6에서 pH5.1로 감소, 고구마의 경우 pH4.8에서 시작하였지만 pH4.4까지 감소되었다. 감자는 pH5.8에서 pH4.5까지 감소시켰다. 실험기준은 pH값의 변동이 크고 pH값이 낮을수록 유기산 함량이 높을 것이라 판단하여 pH변동값이 가장 크고, 가장 낮은 pH값인 pH3.8까지 감소된 다시마를 유산균 대사산물로 선정하였다(도 3).
7-3. 유기산 함량 측정 결과
유기산 함량을 측정하기 위하여 HPLC-DAD를 사용하여, 표준물질을 기준으로 하여 유기산 함량을 측정하였다(도 4 및 5). 유산균 대사산물의 유기산 함량을 측정한 결과 Area 31.53593 내지 37.25806 Conc 106.229mg/L 내지 125.665mg/L, 희석배수 91.491ml/g 내지 99.700ml/g, 최종농도 9.719mg/kg 내지 12.529mg/kg 으로 0.97% 내지 1.25%가량의 유기산 함량이 측정되었다(도 6).
7-4. 영양제와 유산균
대사산물을
혼합한 배지에서의
버섯균의
형태학적 변화
유산균 대사산물과 영양제가 버섯균에 끼치는 영향을 확인하기 위해 영양제와 유산균 대사산물을 농도별로 혼합한 배지를 이용하여 버섯균을 배양하였다. 대조군에 비해 영양제와 유산균 대사산물을 혼합한 배지에서 더 강한 세력의 버섯균이 자라는 것을 확인하였으며, 모든 배지조성에서 버섯균이 자라날 수 있음을 확인하였다(도 7).
7-5. 유산균
대사산물의
농도에 따른
트리코더마
하지아눔(
Trichoderma hazianum
)의
성장억제율에 대한 형태학적 변화
유산균 대사산물의 트리코더마 하지아눔에 대한 성장억제율을 확인하기 위해 다시마 유산균 대사산물과 영양제를 이용하여 농도별로 배지를 조성하여 트리코더나 하지아눔 균에 대한 성장억제율을 확인하였다. 표 1과 같이, 영양제 20%(v/v)와 유산균 대사산물 40%(v/v) 이상의 혼합배지부터 트리코더마 하지아눔에 대한 성장억제율을 확인하였다. 유산균 대사산물 50%(v/v) 농도에서 54%의 성장억제율을 나타냈으며, 유산균 대사산물 80%(v/v)의 농도에서 73%의 높은 성장억제율을 나타냈다. 유산균 대사산물의 농도가 높아짐에 따라 성장억제 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, 각 조성별 배지의 성장억제 활성은 면적비에 따른 성장억제율(%)를 계산하여 확인하였다(표 1 및 도 8).
[표 1] 유산균 대사산물의 농도에 따른 트리코더마 하지아눔에 대한 성장억제율
<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP
<120> ANTIFUNGAL ACTIVITY OF ENTEROCOCCUS FAECIUM MSS2 METABOLITE FOR
TRICHODERMA HAZIANUM
<130> P20U12C1541
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 714
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> Enterococcus faecium MSS2
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(714)
<223> 16S rDNA of Enterococcus faecium MSS2
<400> 1
ggccaaaaag agtgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat 60
taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 120
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 180
ttgacatcct ttgaccactc tagagataga gcttcccctt cgggggcaaa gtgacaggtg 240
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 300
acccttattg ttagttgcca tcattcagtt gggcactcta gcaagactgc cggtgacaaa 360
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 420
tgctacaatg ggaagtacaa cgagttgcga agtcgcgagg ctaagctaat ctcttaaagc 480
ttctctcagt tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg aagccggaat cgctagtaat 540
cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 600
cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tttggagcca gccgcctaag 660
gtgggataga tgattggggt gaagtctaag gggaaccccc ccaaaaaaag cggc 714
Claims (5)
- 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물; 및 버섯영양제를 유효성분으로 포함하는 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대한 항진균용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 버섯영양제는 항진균용 조성물 100%(v/v)을 기준으로 10 내지 30%(v/v)로 포함되는 것인, 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대한 항진균용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 버섯영양제는 해양심층수유래 미네랄농축수, 일라이트용액, 유황용액, 해조류추출물 또는 이의 혼합의 영양제인, 트리코더마 하지아눔(Trichoderma hazianum)에 대한 항진균용 조성물. - 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2(Enterococcus faecium MSS2; 수탁번호 KCTC12795BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물; 및 버섯영양제를 버섯 배양용배지에 접종하는 것을 포함하는 버섯의 재배방법.
- 제4항에 있어서,
상기 버섯은 표고버섯, 느타리버섯, 느티만가닥버섯, 꽃송이버섯, 새송이버섯, 양송이버섯, 팽이버섯, 목이버섯 및 노루궁뎅이버섯으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 담자균류 버섯인, 버섯의 재배방법.
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| Title |
|---|
| BIOLOGICAL CONTROL OF PESTS AND PLANT DISEASES Vol.8. No.2. pp.87-99 |
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