KR102581165B1 - 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제 - Google Patents

Abstract

[과제] 난치성 혈관염 등의 염증성 질환이나 감염성 질환의 치료에 유효한 표적분자를 특정함으로써, 표적분자가 특정되어 있지 않은 종래의 치료법과는 상이하며 이들 질환에 특화된 치료법을 제공한다.
[해결수단] 본 발명의 일 형태에 따르면, 아포리포단백질 A2(APOA2)를 특이적으로 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제가 제공된다.

Description

감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제

본 발명은 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제에 관한 것이다.

염증성 질환인 만성 관절 류마티스 등에는 항체 의약(인플릭시맙, 악템라 등)이 사용되고 있다. 한편, 마찬가지로 염증성 질환인 난치성 혈관염은 표준 치료제가 아닌 스테로이드 또는 항체 의약 사용이 검토되고 있다. 최근에는 면역글로불린(Ig) 제제를 난치성 혈관염에 사용하는 경우도 있고, 호산구성 다발혈관염성 육아종증(Eosinophilic Granulomatosis with Polyangitis: EGPA, 처그스트라우스(Churg-Strauss) 증후군)에서 허용되고 있다. 또한, 면역글로불린은 항체 및 이와 구조상·기능상 관련성이 있는 단백질의 총칭이다. 즉, 결합하는 항원이 밝혀진 면역글로불린을 특정 항원에 대응시켜 항체라고 하고 있다.

난치성 혈관염의 치료로는 스테로이드 등이 가이드라인에 있으며, 또한 표준 치료법으로서 항체 의약이 검토되고 있다. 여기서 특정 항원에 대한 항체 의약으로서 난치성 혈관염에도 사용되기 시작한 인플릭시맙(레미케이드(등록상표))은, 크론병의 경우 염증성 사이토카인 TNFα가 대응 항원이며, 과생성된 TNFα의 기능을 억제하는 항체 의약으로 개발되었다. 이 인플릭시맙은 TNFα를 생성하는 세포도 파괴시키는 항체 의약이다(비특허문헌 1 참조). 또한 예를 들어 리툭시맙(리툭산)은, 항체 의약품은 CD20에 대한 단클론성 항체로서 해외에서 림프종용으로 개발되어 난치성 혈관염에도 이용되기 시작했다(비특허문헌 2 참조). 항원이 특정된 다양한 이러한 항체 의약은 난치성 혈관염에 한정되는 것은 아니지만, 유효성이 있고, 직접 항원과 반응하여 그 항원을 중화시키고 있다고 여겨진다. 현재 임상적으로 사용되는 항체 의약은 난치성 혈관염에 특이적인 항원에 대해 개발된 항체가 아니므로 리스크가 항상 존재한다.

대량의 면역글로불린의 투여가 난치성 혈관염의 치료에 효과적이다. 자세한 내용은, 면역글로불린의 다양성은 10⁸개의 클론으로 이루어지며, 기본적인 분자 구조는 경쇄(L사슬) 및 중쇄(H사슬)의 2종류의 폴리펩타이드가 2개씩 다이설파이드 결합(이황화 결합)에 의해 연결된 것이다. 중쇄는 정상 영역(C 영역) 및 VH 영역으로 이루어진 가변 영역(V 영역)이 연결된 구조이다. 한편, 경쇄는 CL 영역으로 이루어진 정상 영역 및 VL 영역으로 이루어진 가변 영역이 연결되어 있다. 가변 영역의 아미노산 서열의 다양성으로 인해 다양한 항원에 대한 다양한 항체가 생체 내에서 만들어지고 있다.

면역글로불린 제제의 작용 기전에 대한 몇 가지 가설이 있다. 첫 번째 가설은 면역글로불린 제제에 포함된 미지의 항원에 대한 항체를 포함한 여러 종류의 항체가 약리 효과를 발휘하고 있다는 설이다. 두 번째 가설은 여러 종류의 항체 중 난치성 혈관염의 자가항체 미엘로퍼옥시다제(MPO)에 대한 항체(항MPO 항체)(비특허문헌 3 참조)에 그 효과가 있으며, 특히 MPO의 광범위한 에피토프에 대한 여러 종류의 항MPO 항체가 약리 효과를 발휘하고 있다는 설이다. 또한, 마찬가지로 난치성 혈관염의 중증화에도 관여하는 자가항체 항모에신 항체(특허문헌 1, 비특허문헌 4 내지 5 참조)에 대한 약리 작용이 아니냐는 설도 있다. 두 이론의 공통된 점은 면역글로불린 제제가 다양한 면역글로불린의 혼합물이라는 점, 즉, 다클론성 과 같은 것이 치료 효과에 크게 기여한다는 점이다. 기타 가설로서는 특정 항원에 대한 다양한 항체가 효과를 나타낸다는 설도 있다.

인간 재조합 항체인 단일 클론 ScFv가 난치성 혈관염의 모델 마우스에 대해서 치료 효과를 나타내는 것이 알려져 있다(특허문헌 2 내지 5 참조). 이러한 점에서, 환자의 감염 리스크를 감소시키고, 또한 재조합 면역글로불린 제제의 치료 기전을 밝히기 위해서라도, 항원이 특정화된 항체를 유효 성분으로 하는 난치성 혈관염에 대한 항체 의약의 개발이 기대되고 있다.

항원이 특정화된 항체의 경우, 지금까지의 재조합 ScFv를 모델로 하여, 재조합 DNA 기술로 항체 의약 제조가 가능하다. 키메라 항체 및 인간화 항체는 항체 의약으로서 이미 실용화되어 있다(특허문헌 6 내지 7 참조). 또한 면역글로불린 유전자를 숙주세포 내에서 가용 상태의 정상형 단백질로 발현시키는 기술로서 면역글로불린을 샤페로닌과의 융합 단백질로 발현시키는 예도 알려져 있다(특허문헌 8 참조). 또한, 이들은 모두 단일 분자 면역글로불린, 즉, 단클론 면역글로불린 또는 그 단편이다.

특허문헌 1: WO2012/039161A 특허문헌 2: US2013-0164290A 특허문헌 3: JP2013-147495A 특허문헌 4: US2015-0166645A 특허문헌 5: JP2016-160265A 특허문헌 6: JPH5-304989A 특허문헌 7: JP2000-14383A 특허문헌 8: JP2004-81199A

비특허문헌 1: Gilberto Poggioli, Silvio Laureti, Massimo Campieri,Filippo Pierangeli,Paolo Gionchetti, Federica Ugolini, Lorenzo Gentilini, Piero Bazzi, Fernando Rizzello, and Maurizio Coscia. Infliximab in the treatment of Crohn's disease. Ther Clin Risk Manag. 2007 Jun; 3(2):301-308. 비특허문헌 2: Watts RA,Scott DG.Vasculitis and inflammatory arthritis.Best Pract Res Clin Rheumatol. 2016 Oct; 30(5):916-931. 비특허문헌 3: Goeken JA. Antineutrophil cytoplasmic antibody-A useful serological marker for vasculitis. J Clin Immunol 1991; 11:161-174. 비특허문헌 4: Suzuki K, Nagao T, Itabashi M, Hamano Y, Sugamata R, Yamazaki Y, Yumura W, Tsukita S, Wang PC, Nakayama T, Suzuki K. A novel autoantibody against moesin in the serum of patients with MPO-ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 2014 Jun; 29(6):1168-77. 비특허문헌 5: Ellen F. Carney. VASCULITIS: Potential role of an antimoesin autoantibody in AAV Nature Reviews Nephrology 2014; 10:3. 비특허문헌 6: Ito-Ihara T, Ono T, Nogaki F, Suyama K, Tanaka M, Yonemoto S, Fukatsu A, Kita T, Suzuki K, E. Muso. Clinical efficacy of intravenous immunoglobulin for patients with MPO-ANCA-associated rapidly progressive glomerulonephritis. Nephron Clin Pract. 2005; 102:c35-c42. 비특허문헌 7: Unizony S, Villarreal M, Miloslavsky EM, Lu N, Merkel PA, Spiera R, Seo P, Langford CA, Hoffman GS, Kallenberg CM, St Clair EW, Ikle D, Tchao NK, Ding L, Brunetta P, Choi HK, Monach PA, Fervenza F, Stone JH, Specks U; RAVE-ITN Research Group. Clinical outcomes of treatment of anti-neutrophil cytoplasmic antibody(ANCA)-associated vasculitis based on ANCA type. Ann Rheum Dis. 2015 Nov 30. pⅡ: annrheumdis-2015-208073. doi: 10.1136／annrheumdis-2015-208073. ［Epub ahead of print］ 비특허문헌 8: de Joode AA, Roozendaal C, van der Leij MJ, Bungener LB, Sanders JS, Stegeman CA. Performance of two strategies for urgent ANCA and anti-GBM analysis in vasculitis. Eur J Intern Med. 2014 Feb; 25(2):182-6. doi: 10.1016j.ejim.2013.11.011. Epub 2013 Dec 19. 비특허문헌 9: Kallenberg CG, Stegeman CA, Heeringa P. Autoantibodies vex the vasculature. Nat. Med. 2008 Oct; 14(10):1018-9. 비특허문헌 10: Kain R, Exner M, Brandes R, Ziebermayr R, Cunningham D, Alderson CA, Davidovits A, Raab I, Jahn R, Ashour O, Spitzauer S, Sunder-Plassmann G, Fukuda M, Klemm P, Rees AJ, Kerjaschki D. Molecular mimicry in pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis. Nat. Med. 2008 Oct; 14(10):1088-96. Epub 2008 Oct 5. 비특허문헌 11: Tomizawa K, Nagao T, Kusunoki R, Saiga K, Oshima M, Kobayashi K, Nakayama T, Tanokura M, Suzuki K. Reduction of MPO-ANCA epitopes in SCG/Kj mice by 15-Deoxyspergualin treatment restricted by IgG2b associated with crescentic glomerulonephritis. Rheumatology(Oxford). 2010; 49:1245-56.

전술한 바와 같이, 난치성 혈관염의 표준 치료법은 존재하지 않는 것이 현실이다. 또한 항체 의약을 이용한 치료법도 검토되고 있지만, 난치성 혈관염에 특화된 치료법으로 개발된 것은 아니다. 즉, 염증성 질환인 난치성 혈관염은 스테로이드의 사용이 가이드라인에 제시되어 있지만 표준 치료약이 없는 실정이다.

따라서 본 발명은 전술한 바와 같은 종래의 기술과 의료의 현황을 감안하여 난치성 혈관염 등의 염증성 질환 및 감염 질환의 치료에 효과적인 표적 분자를 특정하여 표적 분자가 식별되지 않은 기존의 치료법과는 달리 이러한 질환에 특화한 전문치료법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 전술한 과제 해결을 목표로 집중적인 연구를 했다. 그리고 그 과정에서 막대한 어려움을 극복한 결과, 특허문헌 5의 혈관염 모델 마우스에 대한 다양한 치료 효과를 표시한 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 단쇄가변분절(hScFv; 이하 해당 클론을 'VasSF'라 함)의 표적 항원이 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2: APOA2)라는 것을 밝혀냈다. 그 결과 APOA2를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 혈관염 등의 염증성 질환과 감염성 질환의 예방 및/또는 치료가 가능해진다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 일례에 따르면, 아포리포단백질 A2(APOA2)를 특이적으로 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제가 제공된다.

본 발명의 다른 형태에 따르면, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로서 함유하는 항APOA2 재조합 면역글로불린 단편 조성물 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 유효성분으로서 함유하는 항APOA2 재조합 면역글로불린 단편 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 해당 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터 및 해당 벡터를 함유하는 숙주세포가 제공된다.

본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 유효량의 항APOA2 항체를 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료 방법, 또는 아포리포단백질 A2(APOA2)를 이용하는, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 아포리포단백질 A2(APOA2)를 유효성분으로서 함유하는 감염성 질환, 염증성 질환의 유도제 및 인간을 제외한 비 유전자변형동물에게 아포리포단백질 A2(APOA2)를 투여하는 단계를 포함한, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 병태모델 동물의 제작방법, 및 그 제조방법에 의해 제조된 감염성 질환, 염증성 질환의 병태모델 동물이 제공된다.

본 발명을 완성시키는 과정에서 난치성 혈관염 등의 염증성 질환 및 감염질환의 치료에 효과적인 표적분자를 특정할 수 있었다.　그리고 이 연구결과에 근거하여 예의검토를 거듭한 결과, 표적분자가 특정되지 않은 기존의 치료법과는 다른 이러한 질환의 전문 치료법을 제공할 수 있게 되었다.

도 1a는 특정 항체가 표적으로 하는 항원의 동정에 사용되는 방법을 설명하기 위한 설명도이다.
도 1b는 실시예 1에서 ProteoSeek　^TM　법에 의해 표적 항원의 동정을 시도한 결과를 나타낸 사진이다.
도 1c는 실시예 1에서 HiTrap(등록상표) NHS-activated HP 칼럼을 이용하여 표적 항원의 동정을 시도한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 실시예 1에서 토실기 활성화 Dynabeads(등록상표)에 의해 표적 항원의 동정을 시도한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 왼쪽은 도 2와 같은 사진이고, 오른쪽은 MS/MS 이온 검색법에 의해 히트한 11종의 후보 분자를 나타낸 표이다.
도 4는 실시예 4에서 항APOA2 다클론성 항체의 신장조직에 대한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 현미경 사진이다.
도 5는 실시예 4에서 항APOA2 다클론성 항체의 신장사구체 반월체 형성률에 관한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 4에서 항APOA2 다클론성 항체의 비장조직에 대한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 현미경 사진이다.
도 7은 실시예 4에서 항APOA2 다클론성 항체의 비장 중량에 관한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 4에서 항APOA2 다클론성 항체의 혈청 중 MPO-ANCA 및 항모에신 항체 수준에 관한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 4에서 항APOA2 다클론성 항체의 혈청 사이토카인·케모카인 수준에 관한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 4에서 항APOA2 다클론성 항체의 말초혈액 중의 백혈구수에 관한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 4에서 항APOA2 다클론성 항체의 폐조직에 대한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 현미경 사진이다.
도 12는 실시예 5에서 제작한 플라스미드 pTAC2-URq01_OptEcoli를 설명하기 위한 설명도이다.
도 13은 실시예 5에서 pET32 벡터의 T7 프로모터 제어 영역 조합 부위에 본 발명의 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 단편을 통합하는 방법에 관한 설명도이다.
도 14는 실시예 5의 작업 전체를 설명하기 위한 설명도이다.
도 15는 실시예 5에 있어서 대장균 세포 DE32의 배양물로부터 재조합 단백질(VasAP)을 정제한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 16은 실시예 6에 있어서 항APOA2 단클론성 항체(VasAP)의 신장 사구체 반월체 형성률에 관한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 실시예 6에 있어서 항APOA2 단클론성 항체(VasAP)의 비장 중량에 관한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 실시예 6에 있어서 항APOA2 단클론성 항체(VasAP)의 혈청 중 MPO-ANCA 및 항모에신 항체 수준에 관한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 실시예 6에 있어서 항APOA2 단클론성 항체(VasAP)의 혈청 중 염증성 사이토카인·케모카인 수준에 대한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 실시예 6에 있어서 항APOA2 단클론성 항체(VasAP)의 말초혈액 중의 백혈구수에 대한 치료 효과의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 실시예 7에 있어서 APOA2 단백질을 투여한 야생형 마우스의 소변 스코어(Urinary Score)의 경시적인 변화의 평가결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 실시예 7에 있어서 APOA2 단백질을 투여한 야생형 마우스의 신장 사구체 반월체 형성률의 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 실시예 7에 있어서 APOA2 단백질을 투여한 야생형 마우스의 신장조직 관찰결과를 나타낸 현미경 사진이다.
도 24는 실시예 7에 있어서 APOA2 단백질을 투여한 야생형 마우스의 비장조직 및 폐조직의 관찰결과를 나타낸 현미경 사진이다.

본 발명의 제1 형태는 아포리포단백질 A2(APOA2)를 특이적으로 인식하는 항체를 유효성분으로서 함유하는, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제이다.

본 발명자들이 본 발명을 완성하게 된 경위를 설명하자면, 먼저 본 발명자들은 특허문헌 5에서 혈관염 모델 마우스에 대해 다양한 치료 효과를 나타낸 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 단쇄가변단편(hScFv; 이하 해당 클론을 'VasSF'라고 함)의 표적 항원 탐색을 시도했다.　그러나 항원의 탐색이 용이하지 않아 후술하는 실시예란에 기재한 바와 같이 다양한 방법을 시도하였으나 쉽게 항원 특정화에 도달하지 못하였으나, 오랜 시간에 걸친 노력과 창의 연구의 결과, 최종적으로 VasSF의 표적 항원을 특정하기에 이르렀으며, 이로 인해 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명자들은, 놀랍게도, VasSF의 표적 항원으로서 감염성 질환 또는 염증성 질환과의 관련성이 전혀 알려지지 않은 단백질 아포리포단백질 A2(APOA2)가 VasSF 표적 항원임을 밝혀내고, 이를 통해 APOA2를 특이적으로 인식하는 항체를 이용함으로써 혈관염 등의 염증성 질환과 감염성 질환의 예방 및/또는 치료가 가능해진다는 사실을 발견했다.　또한 인간 아포리포단백질 A2(hAPOA2)는 473bp로 이루어진 APOA2 유전자(RefSeq 수탁번호 NM_001643, CDS의 서열이 서열번호 1에 대응함)로 코딩되어 있으며, 100 아미노산(RefSeq 수탁번호 NP_001634, 서열번호 2)으로 구성되어 있다.

전술한 여러 연구결과에 의거해서, 본 발명자들은 본 발명을 완성하기에 이르렀다.　이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 상세하게 설명하겠지만, 본 발명의 기술적인 범위는 아래의 형태에만 한정되는 것은 아니다.

[본 발명의 단백질(항원)]　

본 발명에서 이용되는 아포리포단백질 A2(APOA2; '본 발명의 단백질'이라고도 함)은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다.　본 발명의 단백질은 인간 및 기타 온혈동물(예를 들어, 기니피그, 쥐, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등)의 세포 [예를 들어, 간세포, 비장세포, 신경세포, 신경교세포, 췌장 β 세포, 골수세포, 메산기우무 세포, 랑겔한스 세포, 표피세포, 상피세포, 배세포, 내피세포, 평활근세포, 섬유아세포, 섬유세포, 근세포, 지방세포, 면역세포(예컨대, 마크로파지 T 세포, B 세포, 자연살해세포, 비만세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구), 거핵구, 활막세포, 연골세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 유선세포 또는 간질세포, 또는 이러한 세포의 전구세포, 줄기세포나 암세포 등] 혹은 이들 세포가 존재하는 모든 조직[예를 들어, 뇌, 뇌의 각 부위(예컨대, 후구, 편도핵, 대뇌기저핵, 해마, 시상, 시상 하부, 대뇌피질, 연수, 소뇌), 척수, 뇌하수체, 위, 췌장, 신장, 간, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육(예컨대, 평활근, 골격근), 폐, 소화기관(예컨대, 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 악하선, 말초혈관, 전립선, 고환, 난소, 태반, 자궁, 뼈, 관절, 지방조직(예컨대, 백색 지방조직, 갈색 지방조직) 등] 등으로부터 단리·정제된 단백질이어도 된다.　또한 화학 합성 또는 무세포 번역계에서 화학적으로 합성된 단백질이어도 되고, 또는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열의 핵산이 도입된 형질 전환체로부터 생산된 재조합 단백질이어도 된다.

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로서는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 50% 이상의 상동성, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 특히 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성(상동; homology)을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.　여기에서 '상동성'이라 함은 해당 기술분야에 공지된 수학적 알고리즘을 이용하여 2개의 아미노산 서열을 얼라인시킨 경우의 최적의 얼라인먼트(바람직하게는, 상기 알고리즘은 최적의 얼라인먼트를 위해 서열의 한쪽 또는 양쪽의 갭 도입을 고려할 수 있음)에서 중복된 전체 아미노산 잔기에 대한 동일한 아미노산 및 유사한 아미노산 잔기의 비율(%)을 의미한다. '유사 아미노산'은 물리 화학적 성질에 있어서 유사한 아미노산을 의미하며, 예를 들면, 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 산성 아미노산(Glu, Asp) 수산기를 갖는 아미노산(Ser, Thr), 측쇄가 작은 아미노산(Gly, Ala, Ser, Thr, Met) 등의 같은 그룹으로 분류되는 아미노산을 들 수 있다.　이러한 유사한 아미노산에 의한 치환은 단백질의 표현형에 변화를 초래하지 않는(즉, 보존적 아미노산 치환) 것으로 예측된다.　보존적 아미노산 치환의 구체적인 예는 해당 기술분야에서 알려져 있으며, 각종 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Bowie et al., Science, 247: 1306-1310(1990)] 참조).

본 명세서의 아미노산 서열의 상동성은 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 다음의 조건(기대치=10; 갭을 허용; 매트릭스=BLOSUM62; 필터링=OFF)으로 계산할 수 있다.　아미노산 서열의 상동성을 결정하기 위한 기타 알고리즘으로서는, 예를 들어, 문헌[Karlin et al., Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA 90:5873-5877(1993)]에 기재된 알고리즘 [해당 알고리즘은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(version2.0)에 도입된(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)), Needleman et al., J.　Mol.　Biol.　48:444-453(1970)에 기재된 알고리즘 [해당 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 도입], 문헌[Myers and Miller, CABIOS 4:11-17(1988)]에 기재된 알고리즘[해당 알고리즘은 CGC 순서 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(version2.0)에 도입], 문헌[Pearson et al., Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA 85:2444-2448(1988)]에 기재된 알고리즘[해당 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지의 FASTA 프로그램에 도입] 등을 들 수 있고 이들도 마찬가지로 바람직하게 사용될 수 있다.

보다 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 50% 이상의 동일성, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 특히 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성(정체성(identity))을 갖는 아미노산 서열이다.

본 발명에서 사용되는 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하고, 또한 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질이다.

실질적으로 동질의 활성으로서는, 예를 들면, 리간드 결합활성이나 신호정보 전달작용 등을 들 수 있다.　여기서 '실질적으로 동질'이란 그 성질이 정성적으로(예컨대, 생리학적으로 또는 약리학적으로) 동질임을 나타낸다.　따라서, 본 발명에서 단백질의 활성이 동등한 것이 바람직하지만, 이러한 활성의 정도(예컨대, 약 0.01 내지 약 100배, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10배, 보다 바람직하게는 0.5 내지 2배)나, 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 다를 수도 있다.

리간드 결합활성이나 신호정보 전달작용 등의 활성 측정은 그 자체가 이미 잘 알려진 방법에 준하여 실시할 수 있다.　예를 들어, 후술하는 본 발명에서 사용되는 단백질의 활성을 저해하는 화합물 또는 이의 염 스크리닝에서 사용되는 방법 등으로 측정할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 단백질로서는, 예를 들어, (ⅰ) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 또는 2개 이상(예를 들어, 1 내지 50개 정도, 바람직하게는 1 내지 30개 정도, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개 정도, 더 더욱 바람직하게는 몇(1 내지 5, 4, 3 또는 2) 개)의 아미노산이 결실(상실)된 아미노산 서열, (ⅱ) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 1개 또는 2개 이상(예를 들어, 1 내지 50개 정도, 바람직하게는 1 내지 30개 정도, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 정도, 더욱 바람직하게는 몇(1 내지 5, 4, 3 또는 2) 개)의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, (ⅲ) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 1개 또는 2개 이상(예를 들어, 1 내지 50개 정도, 바람직하게는 1 내지 30개 정도, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 정도 더 바람직하게는　몇(1 내지 5, 4, 3 또는 2) 개)의 아미노산이 삽입된 아미노산 서열, (ⅳ) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 또는 2개 이상(예를 들어, 1 내지 50개 정도, 바람직하게는 1 내지 30개 정도, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 정도, 더욱 바람직하게는 몇(1 내지 5, 4, 3 또는 2) 개)의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 (ⅴ) 이들을 조합시킨 아미노산 서열을 함유하는 단백질 등의 이른바 돌연변이도 포함된다.

상기와 같이 아미노산 서열이 삽입, 결실 또는 치환되어 있는 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환 위치는 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 단백질의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 인간 아포리포단백질 A2(Refseq 수탁번호 NP_001634) 또는 다른 포유동물에 있어서의 이의 동족체 등을 들 수 있다.

본 명세서에서, 단백질 및 펩타이드는 펩타이드 표기의 관례에 따라 좌단이 N말단(아미노 말단), 우단이 C말단(카복실 말단)으로 기재된다.　서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 단백질을 비롯한 본 발명에서 사용되는 단백질은 C 말단이 카복실기(-COOH), 카복실레이트(-COO　^-　), 아마이드(-CONH₂) 또는 에스터(-COOR) 중 어느 것이어도 된다.

또한, 본 발명에서 사용되는 단백질은 N말단 아미노산 잔기(예컨대, 메티오닌 잔기)의 아미노기가 보호기(예를 들어, 포밀기, 아세틸기 등의 C_1-6　알카노이드 등의 C_1-6　아실기 등)로 보호되어 있는 것, 생체 내에서 절단되어 생성하는 N말단의 글루타민 잔기가 피로글루탐산화한 것, 분자 내 아미노산의 측쇄 상의 치환기(예컨대, -OH, - SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등)가 적당한 보호기(예를 들어, 포밀기, 아세틸기 등의 C_1-6　알카노이드기 등의 C_1-6　아실기 등)로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합한 이른바 당단백질 등의 복합 단백질 등도 포함된다.

본 발명에서 사용되는 단백질의 부분 펩타이드로는, 상기 본 발명에서 사용되는 단백질의 부분 아미노산 서열의 펩타이드이며, 또한 상기 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 지닌 것이면 어느 것이어도 된다.　여기서 '실질적으로 동질의 활성'이란 상기와 같은 의미이다.　또한 '실질적으로 동질의 활성'의 측정은 상기 본 발명에서 사용되는 단백질의 경우와 동일하게 측정할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서 사용되는 단백질의 구성 아미노산 서열 중 적어도 20개 이상, 바람직하게는 50개 이상, 더욱 바람직하게는 70개 이상, 보다 바람직하게는 100개 이상, 가장 바람직하게는 150개 이상의 아미노산 서열을 가진 펩타이드 등이 사용된다.

또한, 본 발명에서 사용되는 부분 펩타이드는 그 아미노산 서열 중 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1 내지 20개 정도, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 정도, 더욱 바람직하게는 몇(1 내지 5, 4, 3 또는 2) 개)의 아미노산이 결실, 또는 그 아미노산 서열에 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1 내지 20개 정도, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 정도, 더욱 바람직하게는 몇(1 내지 5, 4, 3 또는 2) 개)의 아미노산이 부가, 또는 그 아미노산 서열에 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1 내지 20개 정도, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 정도, 더욱 바람직하게는 몇(1 내지 5, 4, 3 또는 2) 개)의 아미노산이 삽입되고, 또는 그 아미노산 서열 중 1개 또는 2개 이상(바람직하게는 1 내지 20개 정도, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 정도, 더욱 바람직하게는 몇(1 내지 5, 4, 3 또는 2) 개)의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것이어도 된다.

본 발명에서 사용되는 부분 펩타이드는 항체 제작을 위한 항원으로도 사용할 수 있다.　본 발명에서 사용되는 단백질 또는 그 부분 펩타이드는 유리체이어도 되고, 염이어도 된다(이하 특기하지 않는 한 마찬가지이다).　이와 같은 염으로는, 생리학적으로 허용되는 산(예컨대, 무기산, 유기산)과 염기(예컨대, 알칼리 금속염) 등의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다.　이러한 염으로는, 예를 들어 무기산(예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 등의 염, 또는 유기산(예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 호박산, 주석산, 구연산, 사과산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 등의 염이 사용된다.

본 발명에서 사용되는 단백질은, 앞에서 언급한 인간 및 기타 온혈동물의 세포 및 조직에서, 그 자체가 이미 알려진 단백질 정제방법으로 정제하여 제조될 수 있다.　구체적으로는, 예를 들어 포유동물의 조직 또는 세포를 계면활성제 존재 하에 호모지나이즈(균질화)하여 얻어지는 조직의 조추출물 분획을 역상 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 등에 의해 본 발명에서 사용되는 단백질 제조가 가능하다.

본 발명에서 사용되는 단백질 또는 그 부분 펩타이드는 이미 잘 알려진 펩타이드 합성법에 따라 제조할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 단백질의 부분 펩타이드는, 본 발명에서 사용되는 단백질을 적절한 펩티다아제로 절단하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 단백질 또는 그 부분 펩타이드는, 이것을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한 형질전환체를 배양하여 얻어진 배양물로부터 상기 단백질 또는 그 부분 펩타이드를 분리 정제하여 제조할 수도 있다.

[본 발명의 항체]　

본 발명에서 사용되는 단백질 또는 그 부분 펩타이드에 대한 항체(이하, '본 발명의 항체'라고도 함)는 본 발명에서 사용되는 단백질 또는 그 부분 펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체이면, 다클론성 항체, 단클론성 항체 중 어느 것이어도 된다.　항체의 아이소타이프는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 IgG, IgM 또는 IgA이며, 가장 바람직한 것은 IgG이다.

또한, 본 발명의 항체는 표적 항원을 특이적으로 인식하여 결합하는 상보성 결정영역(CDR)을 가진 것이면 특별한 제한은 없고, 완전 항체 분자 이외의, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂　등의 단편, ScFv, ScFv-Fc 미니 바디, 다이아 바디 등의 유전자 공학적으로 제작된 콘쥬게이트 분자 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 단백질 안정화 작용을 갖는 분자 등으로 수식된 이들의 유도체이어도 된다.

본 발명의 항체로서는, 예를 들면, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드)로 구성된 항체를 들 수 있다.　즉, 본 발명의 다른 형태에 따르면, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드)를 유효성분으로서 함유하는 항APOA2 재조합 면역글로불린 단편 조성물이 제공된다.　이러한 항APOA2 재조합 면역글로불린 단편 조성물은 바람직하게는 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용되는 것이다.

본 발명에서 사용되는 단백질 또는 그 부분 펩타이드(이하, 항체의 설명에서는 이들을 '본 발명의 단백질'이라고도 함)에 대한 항체는, 그 자체가 이미 알려진 항체 또는 항혈청 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

이하에, 본 발명의 항체의 면역 원성 조제법 및 해당 항체의 제조방법을 설명한다.

본 발명의 항체의 제조에 사용되는 항원으로서는, 상기 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩타이드 또는 그와 동일한 항원 결정기를 1종 또는 2종 이상 지닌(합성) 펩타이드 등 어느 것이나 사용될 수 있다(이하, 이들을 '본 발명의 항원'이라고도 함).

본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩타이드는, 예를 들어, (a) 인간, 원숭이, 쥐, 마우스, 닭 등의 온혈동물의 조직 또는 세포로부터 이미 알려진 방법 또는 그에 준하는 방법을 사용하여 조제, (b) 펩타이드 신디사이저 등을 사용하는 널리 알려진 펩타이드 합성방법으로 화학적으로 합성, (c) 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩타이드를 코딩하는 DNA를 함유한 형질 전환체를 배양 또는 (d) 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩타이드를 코딩하는 핵산을 주형으로 하여 무세포전사/번역계를 이용하여 화학적으로 합성하여 제조된다.

(a) 단클론성 항체 생산 세포의 제작

본 발명의 항원은 온혈동물에 대해, 예를 들어 복강내 주사, 정맥주사, 피하주사, 피내주사 등의 투여방법에 의해 항체생산이 가능한 부위에, 그 자체 단독으로 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다.　투여 시 항체생산 능력을 높이기 위해 완전 프로인트 보조제 및 불완전 프로인트 보조제를 투여할 수 있다.　투여는 일반적으로 1 내지 6주마다 1회씩 총 2 내지 10회 정도 진행된다.　사용되는 온혈동물로서는, 예를 들면, 원숭이, 토끼, 개, 기니피그, 마우스, 쥐, 햄스터, 양, 염소, 당나귀, 닭을 들 수 있다.　항Ig 항체 생산의 문제를 해결하기 위해 투여 대상과 동일한 종류의 포유동물을 이용하는 것이 바람직하지만, 단클론성 항체 제작에는 일반적으로 마우스 및 쥐가 주로 사용된다.

인간에 대한 인위적인 면역감작은 윤리적으로 어려우므로, 본 발명의 항체가 인간을 투여 대상으로 할 경우에는 (i) 후술하는 방법에 따라 제작되는 인간 항체 생산 동물(예를 들어, 마우스)을 면역하여 인간 항체를 얻는 것, (ii) 후술하는 방법에 따라 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 제작하는 것 혹은 (iii) 체외 면역법과 바이러스에 의한 세포의 불사화, 인간 - 인간(혹은 마우스) 하이브리도마 제작기술, 파지디스플레이법 등을 조합하여 인간 항체를 얻는 것이 바람직하다.　또한, 체외면역 요법은, 일반적인 면역으로는 항체생산이 억제되는 항원에 대한 항원 취득이 가능하다는 점과, ng 내지 ㎍ 정도의 항원량으로 항체를 얻을 수 있다는 점, 면역이 며칠 사이에 종료된다 점 등에서, 불안정하고 대량 제조가 어려운 항원에 대한 항체를 얻는 방법으로서, 비 인간 동물 유래의 항체를 제조하는 경우에도 쉽게 사용될 수 있다.

체외 면역법에 사용되는 동물 세포로는, 인간 및 상기 온혈동물(바람직하게는 마우스, 쥐)의 말초 혈액, 비장, 림프절 등으로부터 격리된 림프구, 바람직하게는 B 림프구 등을 들 수 있다.　예를 들어, 마우스 세포와 쥐 세포의 경우 4 내지 12주령 정도의 동물에서 비장을 적출·비장세포를 분리하여 적당한 배지(예를 들어, 둘베코수정이글배지(DMEM), RPMI1640 배지, 햄 F12 배지 등)로 세척한 후 항원을 포함하는 태아 소 혈청(FCS; 5 내지 20% 정도) 첨가 배지에 부유시켜 4 내지 10일 정도 CO₂　인큐베이터 등을 이용하여 배양한다.　항원 농도로는, 예를 들어 0.05 내지 5㎍을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.　동일 계통의 동물(1 내지 2주령 정도가 바람직함)의 흉선세포 배양 상청액을 일반적인 방법에 따라 조제하고, 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.

인간세포의 체외 면역은 흉선세포 배양 상청액을 얻기가 어려우므로, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 등 여러 종류의 사이토카인 및 필요한 경우 보강제(예를 들면 무라밀다이펩타이드 등)를 항원과 함께 배지에 첨가하여 면역 감작을 행하는 것이 바람직하다.

(b) 단클론성 항체 정제

단클론성 항체의 단리정제는, 그 자체의 잘 알려진 방법, 예를 들어 면역글로불린의 단리정제법[예컨대, 염석법, 알코올 침전법, 등전점 침전법, 전기영동법, 이온교환기(예를 들어, DEAE, QEAE)에 의한 흡탈착법, 초원심법, 젤 여과법, 항원결합 고상 또는 단백질 A 및 단백질 G 등의 활성 흡착제로 항체만을 채취한 후 결합을 해리시켜 항체를 얻는 특이적 정제법 등]에 따라 정제할 수 있다.

이상과 같이 하여, 하이브리도마를 온혈동물의 생체내 또는 생체외에서 배양한 후 그 체액 또는 배양물로부터 항체를 채취함으로써 단클론성 항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 항체를 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방·치료에 이용하는 경우, 해당 항체는 이러한 질환에 대한 치료 활성을 지닌 것이어야 하므로, 얻어진 단클론성 항체의 치료 활성 정도에 대해 알아볼 필요가 있다.　치료 활성은, 항체의 존재 또는 비존재 하의 질환 모델 동물의 치료 효과 발현 정도 등을 비교함으로써 측정할 수 있다.

바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 인간을 투여 대상으로 하는 의약품으로서 사용된다.　따라서 본 발명의 항체(바람직하게는 단클론성 항체)는 인간에게 투여할 경우 항원성을 보일 위험성이 감소된 항체(구체적으로는 완전 인간 항체, 인간화 항체, 마우스 - 인간 키메라 항체 등)로, 가장 바람직한 것은 완전 인간 항체이다.　인간화 항체 및 키메라 항체는 후술하는 방법에 따라 유전자 공학적으로 제조할 수 있다.　완전 인간 항체는 위에서 언급한 인간-인간(혹은 마우스) 하이브리도마로 생산할 수도 있지만, 대량의 항체를 안정적 또한 저비용으로 제공하기 위해서는 후술하는 인간 항체 생산 동물(예를 들어, 마우스) 또는 파지디스플레이법을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다.

(i) 키메라 항체의 제작

본 명세서에서 '키메라 항체'란, H사슬 및 L사슬의 가변영역(V_H　및 V_L)의　서열이 있는 포유동물종에서 유래하고, 정상영역(C_H　및 CL)의 서열이 기타 포유동물종에서 유래하는 항체를 의미한다.　가변영역의 서열, 예를 들어 마우스 등과 같이 손쉽게 하이브리도마를 제작할 수 있는 동물종 유래인 것이 바람직하고, 정상영역의 서열은 투여 대상이 되는 동물종 유래인 것이 바람직하다.

키메라 항체의 제작법은, 예를 들어 미국 특허 제6,331,415호 명세서에 기재된 방법 또는 그 일부를 수정한 방법 등을 들 수 있다.　또한, 얻어진 키메라 단클론성 항체를 파파인으로 분해시키면 Fab를, 펩신으로 분해하면 F(ab')₂를 각각 얻을 수 있다.

또한 마우스 V_H와　V_L을 코딩하는 DNA를 적당한 링커, 예를 들어 1 내지 40 아미노산, 바람직하게는 3 내지 30 아미노산, 보다 바람직하게는 5 내지 20 아미노산으로 구성된 펩타이드(예컨대, Ser-(Gly)m]n 또는 [(Gly)m-Ser]n(m은 0 내지 10의 정수 n은 1 내지 5의 정수) 등)를 코딩하는 DNA를 통해 연결하여 scFv로 할 수 있고, 또한 C_H3를 코딩하는 DNA를 적당한 링커를 통해 연결하여 미니바디 단위체로 하거나,　C_H전장을 코딩하는 DNA를 적절한 링커를 통해 연결하여 ScFv-Fc로 할 수도 있다.　이러한 유전자공학적으로 수식(공액)된 항체 분자를 코딩하는 DNA는 적당한 프로모터의 통제 하에 두면 대장균 및 효모 등의 미생물에서 발현이 가능하므로 대량의 항체 분자를 생산할 수 있다.

마우스 V_H와 V_L을 코딩하는 DNA를 하나의 프로모터의 하류에 텐덤으로 삽입하여 대장균에 도입하면 단일시스트론 유전자가 발현되어 Fv라는 이합체를 형성한다.　또한 분자 모델링을 이용하여 V_H와 V_L의 FR 중 적절한 아미노산을 Cys로 치환하면 두 가닥의 분자간 다이설파이드 결합(이황화결합)에 의해 dsFv라는 이합체가 형성된다.

(ii) 인간화 항체

본 명세서에서 '인간화 항체'는 가변영역에 존재하는 상보성 결정영역(CDR)을 제외한 모든 영역(즉, 정상영역 및 가변영역 중의 프레임워크영역(FR))의 서열이 인간 유래이고, CDR의 서열만이 기타 포유동물종에서 유래된 항체임을 의미한다.　다른 포유동물종은 예를 들면 마우스 등과 같이 쉽게 하이브리도마를 제작할 수 있는 동물종이 바람직하다.

인간화 항체의 제작법은, 예를 들어 미국 특허 제5,225,539호, 제5,585,089호, 제5,693,761호 및 제5,693,762호에 기재된 방법 또는 그것을 일부 변경한 방법 등을 들 수 있다.　인간화 항체도 키메라 항체와 마찬가지로 유전자공학적인 기술을 이용하여 ScFv, ScFv-Fc, 미니바디, dsFv, Fv 등을 수정할 수 있으며, 적당한 프로모터를 이용하여 대장균과 효모 등의 미생물에서도 생산시킬 수 있다.

인간화 항체 제작기술은, 예를 들어 하이브리도마의 제작기술이 확립되어 있지 않은 다른 동물종에게 바람직하게 투여할 수 있는 단클론성 항체를 제작하는 데에도 적용할 수 있다.　예를 들어, 소, 돼지, 양, 염소, 닭 등의 가축(가금)으로서 널리 사육되고 있는 동물과 개, 고양이 등의 애완동물을 대상으로 들 수 있다.

(ⅲ) 인간 항체 생산 동물을 이용한 완전 인간 항체의 제작

내인성 면역글로불린(Ig) 유전자를 넉아웃(KO)시킨 비인간 온혈동물에게 기능적인 인간 Ig 유전자를 도입하여 이를 항원으로 면역하면, 해당 동물 유래의 항체 대신에 인간 항체가 생산된다.　따라서, 마우스 등과 같은 하이브리도마 제작기술이 확립되어 있는 동물을 이용하면 기존의 마우스 단클론성 항체의 제작과 동일한 방법으로 완전 인간 단클론성 항체를 얻을 수 있게 된다.

본 발명의 항체를 의약품으로 사용할 경우에는 단클론성 항체인 것이 바람직하지만, 다클론성 항체이어도 된다.　본 발명의 항체가 다클론성 항체인 경우에는, 하이브리도마의 이용을 필요로 하지 않으므로, 하이브리도마 제작기술은 확립되어 있지 않지만 유전자 변형 기술이 확립된 동물종, 바람직하게는 소 등의 유제동물을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 인간 항체 생산 동물을 제작하면 더 많은 인간 항체를 저렴하게 제조할 수 있다(예를 들어, 문헌[Nat. Biotechnol., 20,889-894(2002)] 참조).　얻어진 인간 다클론성 항체는 인간 항체 생산 동물의 혈액, 복수, 젖, 알 등, 바람직하게는 젖, 알을 채취하여 상기와 동일한 정제기술을 결합하여 정제할 수 있다.

(ⅳ) 파지디스플레이 인간 항체 라이브러리를 이용한 완전 인간 항체의 제작

완전 인간 항체를 제작하는 또 다른 방법은 파지디스플레이를 이용하는 방법이다.　이 방법은 PCR에 의한 돌연변이가 CDR 이외에 도입되는 경우가 있으므로, 임상단계에서 소수의 HAHA 생산이 보고된 예가 있으나, 한편 숙주동물에서 유래하는 이종간 바이러스 감염의 위험성이 없다는 점과 항체의 특이성이 무한하다는 점(금지클론 및 당쇄 등에 대한 항체도 쉽게 제작 가능) 등의 장점을 가지고 있다.　또한, 파지디스플레이 인간 항체 라이브러리의 제작방법은 특별히 제한되어 있지 않다.

(3) 다클론성 항체의 제작

본 발명의 다클론성 항체는 그 자체가 이미 잘 알려진 방법 또는 그에 준하는 방법으로 제조할 수 있다.　예를 들어, 면역항원(단백질 또는 펩타이드항원) 자체, 또는 이것과 캐리어 단백질의 복합체를 만들어, 상기 단클론성 항체 제조법과 마찬가지로 온혈동물에게 면역하여, 해당 면역동물로부터 본 발명의 단백질의 항체 함유물을 채취한 후, 항체의 단리정제를 실시하면 제조가 가능하다.

다클론성 항체는 상기 방법으로 면역된 온혈동물의 혈액, 복수 등, 바람직하게는 혈액에서 채취할 수 있다.

항혈청 중의 다클론성 항체의 측정은, 상기 항혈청 중의 항체가 측정과 동일한 방법으로 측정할 수 있다.　다클론성 항체의 단리정제는, 상기 단클론성 항체의 단리정제와 동일한 면역글로불린의 단리정제법으로 정제할 수 있다.

아래에, 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩타이드(이하 '본 발명의 단백질'이라고도 함), 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩타이드를 코딩하는 DNA, 위에서 언급한 본 발명의 항체의 용도를 설명한다.

본 발명의 단백질은, 본 발명의 항체의 표적 분자라는 점에서 감염성 질환 또는 염증성 질환을 앓고 있거나 의심되는 환자에게 있어서 본 발명의 단백질 발현의 유무 및 그 정도를 지표로 하여, 발명의 항체를 이용한 예방·치료의 유효성을 추정할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질(APOA2)에 대해 그 활성을 저해함으로써 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료가 가능하다.　따라서 본 발명의 항체는 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방·치료제로 사용될 수 있다.　또 다른 관점에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체의 투여를 포함하는 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료 방법도 제공된다.　이때 '유효량'은 의사 등의 판단자가 항체 활성의 정도 및 환자의 상태, 질환의 상황 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다.　또한 감염증은 광의로 해석되어 다양한 외래 물질에 의한 감염에 의한 것(예를 들어, 각종 세균, 바이러스 또는 기생충에 의한 감염과 이로 인한 패혈증 등)이 포함되어 있다.　또한 염증성 질환으로서는, 예를 들어, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 무감마글로불린혈증, 가와사키병, 길랭-바레 증후군, 현미경적 다발혈관염(MPA), 호산구성 다발성 혈관염성 육아종증(Eosinophilic Granulomatosis with Polyangitis: EGPA, 처그스트라우스(Churg-Strauss) 증후군) 등의 난치성 혈관염 이외에도 신장염/사구체신염, 특발성 폐섬유증 등이 예시된다.

본 발명의 항체를 함유하는 상기 질환의 예방·치료제는 저독성으로, 그대로 액제로서 또는 적절한 제형의 의약 조성물로서, 인간 또는 동물(예를 들어, 쥐, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등)에게 경구적 또는 비경구(예를 들어, 혈관내 투여, 피하 투여, 근육내 투여 등)으로 투여할 수 있다.

본 발명의 항체는 그 자체를 투여해도 되고, 또는 적절한 의약 조성물로 투여해도 된다.　투여에 사용되는 의약 조성물은 본 발명의 항체 및 그 염, 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한 것이어도 된다.　이러한 의약 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 제형으로 제공된다.

비경구 투여를 위한 조성물로서는, 예를 들어, 주사제, 좌약 등이 사용되고, 주사제는 정맥주사제, 피하주사제, 피내주사, 근육주사, 링겔 주사제 등의 형태가 포함되어도 된다.　이러한 주사제는 이미 잘 알려진 방법에 따라 제조할 수 있다.　주사제의 제조방법은 예를 들어, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 염을 일반적으로 주사제에 사용되는 멸균 수성액 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화시켜 조제할 수 있다.　주사용 수성액으로서는, 예를 들면, 생리식염수, 포도당 및 기타 보조제를 포함한 등장액 등이 사용되고, 적절한 용해 보조제, 예를 들어, 알코올(예컨대, 에탄올), 폴리알코올(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온 계면활성제 [예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50(polyoxyethylene(50mol) adduct of hydrogenated castor oil)] 등과 병용해도 된다.　유성액으로서는, 예를 들어, 참기름, 콩기름 등이 사용되고, 용해 보조제로서 벤조산벤질, 벤질 알코올 등을 병용해도 된다.　조제된 주사액은 적절한 앰플에 충전되는 것이 바람직하다.　직장 투여에 사용되는 좌약은 상기 항체 또는 이의 염을 일반적 좌약용 기제에 혼합하여 조제해도 된다.

경구 투여를 위한 조성물은 고체 또는 액체 등의 제형, 구체적으로는 정제(당의정, 필름 코팅 정제 포함), 환제, 과립제, 산제, 캡슐(소프트 캡슐제를 포함), 시럽제, 유제, 현탁제 등을 들 수 있다.　이러한 조성물은 이미 잘 알려진 방법에 의해 제조되고, 제제 분야에서 통상적으로 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유해도 된다.　정제용 담체, 부형제로는 예를 들면, 유당, 전분, 자당, 스테아린산 마그네슘이 사용된다.

상기 비경구용 또는 경구용 의약 조성물은, 활성성분의 투여량에 적합한 투약 단위 제형으로 제조되는 것이 된다.　이러한 투약 단위 제형으로서는, 예를 들면, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제(앰플), 좌약을 들 수 있다.　항체의 함유량으로서는 투약 단위 제형당 통상 5 내지 500㎎, 특히 주사제는 5 내지 100㎎, 기타 제형은 10 내지 250㎎의 상기 항체가 함유되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 항체를 함유하는 상기 제제의 투여량은 투여 대상, 대상의 질환, 증상, 투여 경로 등에 따라 다르지만, 예를 들어 성인의 치료 및 예방을 위해 사용하는 경우에는 본 발명의 항체 1회 용량으로 통상 0.01 내지 20㎎/㎏ 정도, 바람직하게는 0.1 내지 10㎎/㎏ 정도, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 5㎎/㎏ 정도를 1일 1 내지 5회 정도, 바람직하게는 1일 1 내지 3회 정도 정맥주사로 투여하는 것이 좋다.　다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우에도 이에 준하는 양을 투여할 수 있다.　증상이 특히 심한 경우에는 그 증상에 따라 증량해도 된다.

또한 상기 각 조성물은 상기 항체와의 배합으로 인해 바람직하지 않은 상호작용을 일으키지 않는 한, 기타 활성성분을 함유해도 된다.

또한, 본 발명의 항체는 기타 약물과 병용해도 된다.　본 발명의 항체와 기타 약제는 동시 또는 다른 시간에 환자에게 투여하면 된다.

[본 발명의 폴리뉴클레오타이드]　

본 발명에 따르면, 위에서 언급한 예방·치료제나 면역글로불린 단편 조성물의 유효성분으로서 이용되는 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드도 제공한다.　일례로서 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.　본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 DNA이어도 되고 RNA이어도 되고, 또는 DNA/RNA 키메라이어도 된다.　바람직하게는 DNA를 들 수 있다.　또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 두 가닥이라도 한 가닥이어도 된다.　두 가닥의 경우에는 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA 또는 DNA:RNA 하이브리드이어도 된다.　단일 가닥의 경우에는 센스 가닥(즉, 코드 사슬)이어도, 안티센스 가닥(즉, 비코드 사슬)이어도 된다.

본 발명의 항체를 코딩하는 DNA로서는, 예를 들면, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 함유하는 DNA와 하이스트린젠트(high stringent)한(엄중한) 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 함유하고 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 지닌 단백질을 코딩하는 DNA이면 된다.

서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 하이스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈가 가능한 DNA로서는 예를 들어, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 특히 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성(homology)를 지닌 염기서열을 함유한 DNA 등이 사용된다.

본 명세서에 있어서 염기서열의 상동성은, 예를 들어, 상동성 알고리즘 NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 다음의 조건(기대치=10; 갭을 허용; 필터링=ON; 매치 스코어=1; 미스매치 스코어=-3)으로 계산할 수 있다.　염기서열의 상동성을 결정하기 위한 기타 알고리즘으로는 상기 아미노산 서열의 상동성 계산 알고리즘이 마찬가지로 예시된다.

하이브리디제이션(이종교배)은 그 자체가 이미 잘 알려진 방법 또는 그에 준하는 방법, 예를 들면, 문헌[Molecular Cloning 2nd ed.　(J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab.Press 1989)]에 기재된 방법 등에 따라 시행 가능하다. 또한 상용 라이브러리를 사용하는 경우 첨부된 사용설명서에 기재된 방법에 따라서 시행 가능하다.　보다 바람직하게는 하이스트린젠트한 조건에 따라서 시행할 수 있다.

하이스트린젠트한 조건이란, 예를 들어, 나트륨 농도가 약 19 내지 약 40mM, 바람직하게는 약 19 내지 약 20mM로 온도가 약 50 내지 70℃, 바람직하게는 약 60 내지 약 65℃의 조건을 의미한다.　특히 나트륨염 농도가 약 19mM로 온도가 약 65℃인 경우가 바람직하다.　당업자는 하이브리디제이션 용액의 염 농도, 하이브리디제이션 반응 온도 프로브 농도, 프로브의 길이, 미스매치 수, 하이브리디제이션 반응시간, 세정액의 염 농도, 세척 온도 등을 적절히 변경하여 원하는 스트린젠시(강도)(stringency)로 쉽게 조정할 수 있다.

또한 서열번호 3은 3＇ 말단에 His 태그를 구성하는 6개의 히스티딘 잔기를 코딩하는 서열이 부가되어 있다(서열번호 3의 제778 내지 795번째 염기).　따라서, 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 적어도 서열번호 3의 제1 내지 777번째 염기를 포함하는 염기서열(또는 이에 대해 전술한 범위의 상동성을 갖는 염기서열)을 포함한 것이 바람직하다.　또한, 마찬가지 관점에서 본 발명의 항체는, 서열번호 4의 제1 내지 259번째 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한('실질적으로 동일'의 바람직한 형태는 상기와 동일) 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로 구성된 항체도 바람직하다.

또한 본 발명은 위에서 언급한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.　해당 벡터는, 그 자체를 유효성분으로서 함유하는 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제로서 사용되어도 되고, 본 발명의 항체를 생산하는데 이용되어도 된다.

상기 벡터는, 일반적으로 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 담지하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 일반적이다.　당업자라면, 원하는 DNA를 지닌 벡터를 일반적인 유전공학 기술에 의해 적절하게 제조 가능하다.　일반적으로는, 시판되는 다양한 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 벡터는 숙주세포 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 유지하거나, 본 발명의 항체를 발현시키거나 하는데 유용하다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 적당한 벡터에 담지(삽입)된 숙주세포에 도입된다.　이 벡터는, 담지된 DNA를 안정하게 유지하는 것이면 특별히 제한받지 않는다.　예를 들어, 숙주세포로서 대장균을 이용한다면 클로닝용 벡터로서 pBluescript 벡터(Stratagene사 제품) 등이 바람직하지만, 시판되는 다양한 벡터를 이용할 수 있다.　또한, 본 발명의 항체 생산을 목적으로 벡터를 이용하는 경우에는 특히 발현 벡터가 유용하다.　발현 벡터로는 시험관 내, 대장균 내, 배양세포 내, 생물 개체 내에서 폴리펩타이드를 발현하는 벡터이면 특별히 제한이 없으나, 예를 들어, 시험관 내 발현이면 pBEST 벡터(프로메가사 제품), 대장균의 경우에는 pET 벡터(Invitrogen 사 제품), 배양세포이면 pME18S-FL3 벡터(GenBank 수탁번호 AB009864), 생물 개체의 경우에는 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)) 등을 예시할 수 있다.　벡터에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 일반적인 방법에 의해, 예를 들어, 제한 효소 부위를 이용한 리가아제 반응에 의해 또는 In-fusion법(다카라바이오 주식회사)에 의해 가능하다.

상기 숙주세포로서는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 다양한 숙주세포가 사용된다.　본 발명의 항체를 발현시키기 위한 세포로는, 예를 들어, 박테리아세포(예: 충치균, 황색포도상구균, 대장균, 스트렙토마이세스, 고초균), 곤충세포(예: 초파리 S2, Spodoptera SF9), 동물세포(예컨대, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes 흑색종 세포)와 식물 세포를 예시할 수 있다.　숙주세포에 대한 벡터 도입은, 예를 들어 인산칼슘 침전법, 전기 펄스 천공법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9) 리포펙션법(GIBCO-BRL사제), 미세주입법 등 이미 잘 알려진 방법으로 도입할 수 있다.

숙주세포에서 발현된 폴리펩타이드를 세포체 내공에, 세포 주변공간에, 또는 세포외 환경에 분비시키기 위해 적절한 분비 신호를 목적으로 하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.　이러한 신호는, 목적으로 하는 폴리펩타이드에 대해서 내인성이어도 되고 이종 신호이어도 된다.

상기 제조방법에 있어서 폴리펩타이드의 회수는 본 발명의 폴리펩타이드가 중간에 분비되는 경우에는 배지를 회수한다.　본 발명의 폴리펩타이드가 세포 내에 생산되는 경우, 세포를 먼저 용해시키고 이어서 폴리펩타이드를 회수한다.

재조합 세포 배양물로부터 본 발명의 폴리펩타이드를 회수하고 정제하려면 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실 인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 이미 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 단백질(APOA2)은 본 발명의 항체를 이용한 치료가 유효한 환자에게서 발현되고 있으며, 또한 APOA2의 활동을 억제하면 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방·치료가 가능하게 된다.　따라서, APOA2의 활성을 저해하는 화합물 또는 이의 염은 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제로 사용되고 있다.

따라서, 본 발명의 단백질(APOA2)은, 이 단백질의 활성을 저해하는 화합물 또는 이의 염의 스크리닝용 시약으로서 유용하다.

즉, 본 발명의 다른 형태에 따르면, 본 발명의 단백질을 이용하는, 상기 단백질의 활성을 저해하는 화합물 또는 이의 염의 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 화합물 또는 이의 염을 스크리닝하는 경우, 스크리닝 방법은,

(a-1) 분리된 본 발명의 단백질 활성을, 피험물질의 존재와 비존재 하에서 비교하는 방법과,

(a-2) 본 발명의 단백질 생산능력을 지닌 세포를 피험물질의 존재와 비존재 하에서 배양하여 두 조건하에서의 본 발명의 단백질 활성을 비교하는 방법으로 대별된다.

상기 (a-1) 스크리닝 방법에서 이용되는 본 발명의 단백질은, 위에서 언급한 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩타이드의 제조방법을 이용하여 단리·정제할 수 있다.

상기 (a-2) 스크리닝 방법에서 이용되는 본 발명의 단백질 생산능력을 지닌 세포로서는, 그것이 자연히 발현되는 인간 또는 기타 온혈동물 세포 또는 이를 포함한 생체 시료(예를 들어, 혈액, 조직, 장기 등)이면 특별히 제한되지 않는다.　비인간동물 유래의 혈액, 조직, 장기 등의 경우에는 이것을 생체에서 단리시켜 배양해도 되고, 혹은 생체에 피험물질을 투여한 후, 일정 시간 경과 후에 그 생체 시료를 단리시켜도 된다.

또한, 본 발명의 단백질 생산능력을 지닌 세포로서는, 위의 유전공학적 기법에 의해 제작된 각종 형질 전환체가 예시된다.

피험물질로서는, 예를 들어, 단백질, 펩타이드, 비펩타이드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 등을 들 수 있으며, 이러한 물질은 신규 물질이어도 되고, 이미 잘 알려진 것이어도 된다.

상기 (a-1) 및 (a-2) 스크리닝 방법에 있어서 본 발명의 단백질 활성의 측정은, 종래의 잘 알려진 방법에 의해 측정할 수 있다.

본 발명의 스크리닝용 키트는 본 발명의 단백질 또는 그 부분 펩타이드(이하 '본 발명의 단백질'이라고도 함)를 함유한다.　본 발명의 단백질은 위에서 언급한 방법을 이용하여 분리·정제된 것이어도 되고, 혹은 전술한 바와 같이, 이것을 생산하는 세포(온혈동물 세포)의 형태로 제공되어도 된다.

본 발명의 스크리닝용 키트는 본 발명의 단백질 생산 세포의 상기 단백질 발현량을 측정하기 위해, 위에서 언급한 본 발명의 항체를 함유할 수도 있다.

상기 스크리닝용 키트는, 상기 이외에, 임의로 반응 완충액, 블로킹 용액, 세척용 완충액, 표지 시약, 표지 검출시약 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 이용하여 얻어지는 본 발명의 단백질 활성을 저해하는 물질(유리체형태 또는 염형태의 어느 것이어도 됨)은 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방·치료제로서 독성이 낮고 안전한 의약으로서 유용하다.

본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 이용하여 얻어지는 화합물 또는 이의 염을 상기 예방·치료제로 사용하는 경우, 상투적 수단에 따라서 의약품 형태로 제제화할 수 있다.

본 명세서에서, 염기나 아미노산 등을 약자로 표시한 경우에는, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature의 약자 또는 해당 분야의 관용 약자에 따라 표시한 것이다.　또한 아미노산 관련 광학이성체일 경우에는 특별히 명시하지 않는 한 L체를 나타내는 것으로 한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 단백질(APOA2)의 활동을 억제하면 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방·치료가 가능해진다.　따라서, 본 발명의 단백질(APOA2)은 감염성 질환 또는 염증성 질환의 원인이다.　그러므로 본 발명의 다른 형태에 따르면, 아포리포단백질 A2(APOA2)를 유효성분으로서 함유하는 감염성 질환 또는 염증성 질환의 유도제가 제공된다.

또한, 본 발명의 또 다른 형태에 의하면, 인간을 제외한 비유전자 변형동물에게 아포리포단백질 A2(APOA2)를 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 병태 모델동물 제작방법이 제공된다.　또한, 본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 상기 제조방법에 의해 제조된 감염성 질환 또는 염증성 질환의 병태 모델동물도 제공된다.

본 발명의 일 형태에 따른 감염성 질환 또는 염증성 질환의 병태 모델동물의 제작방법은 인간을 제외한 비유전자변형동물에게 아포리포단백질 A2(APOA2)를 투여하는 단계를 포함한다.　이와 같이 구성함으로써, 실험동물에 대한 감염성 질환 또는 염증성 질환 특유의 증상을 유도할 수 있다.　또한, 구체적인 질환은 전술한 바와 같으므로 여기서 상세한 설명은 생략한다.

본 형태에 따른 병태 모델동물의 제작방법에 사용되는 비유전자변형동물은, 유전자변형동물이 아니라, 소위 야생형 동물을 가리킨다.　여기에서 유전자변형동물이란, 외래성 DNA를 게놈에 도입한 동물이며, 인위적으로 조작한 유전자를 도입하여 특정 유전자의 기능이 발현되지 않는 넉아웃 동물 등을 포함한다.　또한 유전자변형동물은 유전 가능한 생식세포계 DNA 변화를 수반하는 동물 및 유전 불가능한 체세포계 DNA 변화를 수반하는 동물, 모두가 포함된다.　즉, 본 형태에 따른 병태 모델동물은 야생형 동물을 기반으로 제작된다.　기존에 감염성 질환 또는 염증성 질환의 병태 모델 동물에 있어서 야생형 동물을 기초로 유도된 예는 거의 없다.　구체적인 동물로는, 인간을 제외한 포유동물을 사용할 수 있다.　그런 동물로서는 마우스, 쥐, 햄스터, 기니피그 등의 설치류 이외에, 원숭이, 침팬지, 오랑우탄 등의 비인간 영장류, 토끼, 소, 염소, 양, 돼지 등을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.　바람직하게는 설치류이며, 특히 바람직하게는 마우스이다.

본 형태에 따른 병태 모델동물의 제작방법에 있어서, 아포리포단백질 A2(APOA2)의 투여경로는 특별히 제한되지 않는다.　경구, 비경구 투여 여부와 관계없이, 경구, 복강 내, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 피하, 피내, 흡입, 위장 내, 장내, 경피 등의 종래 이미 잘 알려진 임의의 투여 경로가 예시될 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

아포리포단백질 A2(APOA2)는 단독으로 투여해도 되지만, 아포리포단백질 A2(APOA2)의 효과를 방해하지 않는 범위에서 적당한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 투여할 수 있다.　따라서 의약품 및 화장품에 사용되는 각종 성분을 포함하여 구성될 수 있으며, 각종 제형의 제제로 제조하여 사용할 수 있다.

아포리포단백질 A2(APOA2)의 투여량, 투여 횟수, 투여 기간은 동물의 종류, 계통, 주령, 성별 차이 등에 따라 적절하게 설정할 수 있다.　마우스는, 실험동물로서 범용되는 FVB/N, Balb /c, C57BL/6가 바람직하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.　이때 원하는 증상이 1회에 발병할 경우에는 1회 투여이면 되고, 원하는 발병 시까지 계속 투여해도 된다.

제작한 병태 모델 동물이 감염성 질환 또는 염증성 질환을 앓고 있는지의 여부는, 이미 잘 알려진 방법에 따라 확인할 수 있다.　예를 들어, 혈관염의 발병을 확인하려면 후술하는 실시예와 같이 모델 동물의 신장, 비장, 폐 등의 조직을 현미경 관찰을 통해 상기 질환에 특유의 병리학적 변화의 존재 여부를 판정함으로써 발병의 확인이 가능하다.　또한 동물의 소변 스코어를 평가하거나 동물에서 채취한 혈액의 각종 성분을 검출 또는 측정하여 발병을 확인할 수 있다.

그리고, 본 발명의 또 다른 형태로서, 전술한 감염성 질환 또는 염증성 질환의 병태 모델 동물의 제작방법에 의해 제작된 병태 모델 동물도 제공된다.　본 형태에서 제공하는 감염성 질환 또는 염증성 질환의 병태 모델 동물이 아닌 유전자변형동물 즉, 야생형동물 아포리포단백질 A2(APOA2)를 투여하여 제작된 것이며, 감염성 질환 또는 염증성 질환 특유의 증상을 나타낸다.　따라서, 본 형태에 따라 제공되는 병태 모델 동물은 감염성 질환 또는 염증성 질환, 특히 난치성 혈관염의 발병 및 병태 형성 기전 분석 및 이러한 치료·예방 방법 및 치료·예방제의 평가 및 스크리닝에 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제의 스크리닝 방법도 제공된다.　예를 들어, 전술한 병태 모델 동물에게 전염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제 후보 물질인 시험 물질을 투여하여 증상의 개선과 손실을 평가할 수 있다.　여기에서 시험 물질로는 감염성 질환 또는 염증성 질환 후보 물질이면 어떠한 것이어도 되고, 생체물질, 유전자 재조합 물질, 합성화합물 등의 여부에 관계없고, 또한 이들로 한정되는 것은 아니다.　또한 단독으로 투여해도 되지만, 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 제제화하여 투여할 수도 있다.　시험물질의 투여는 이미 잘 알려진 투여 경로에 따라 투여해도 되고, 경구, 비경구 투여 방법을 불문한다.　따라서 경구, 복강내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 피내, 흡입, 위장내, 장내, 경피 등을 예시할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.　시험물질의 성질, 특히 약물 동태적 성질 및 용해성 등을 고려하여 설정하면 된다.　또한 시험물질의 투여량, 투여 횟수 및 투여기간은 동물의 종류, 계통, 주령, 성별 등 및 시험물질의 종류 등에 따라 적절하게 설정할 수 있다.

본 형태에 따른 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제의 스크리닝 방법에서 증상의 개선 및 소실의 평가는 전술한 각종 지표 및 후술하는 실시 예에서 사용되는 것과 같은 관점에서 평가할 수 있다.　그리고 시험 물질의 투여로 증상이 개선되거나 소실된 경우에는 그 시험 물질을 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제라고 평가할 수 있다.　또한 대조군으로서 아무것도 투여하지 않거나, 시험물질을 포함하지 않는 것 이외에는 동일한 조성 제제를 투여한 병태 모델 동물을 이용할 수 있다.　이 대조군 동물과 시험물질을 투여한 동물을 증상의 개선 및 소실에 대해 비교할 수 있다.　그리고 예를 들어, 시험물질이 투여된 동물의 증상이, 시험물질이 투여되지 않은 대조군 동물보다 개선된 경우에는 시험물질을 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제라고 평가할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 상세히 설명하겠지만, 본 발명은 다음의 실시예로 한정되는 것은 아니다.　또한, 하기 실시예에서 인간의 혈액 시료의 채취는 모든 정보에 사전동의를 하고 혈액 제공자의 의사를 확인한 후 실시된 것이다.

[실시예 1]

1.　재조합 인간 ScFv항체(VasSF)의 표적 분자의 동정

특허문헌 5에서 혈관염 모델 마우스에 대해 다양한 치료 효과를 나타낸 것이 기재되어 있는 특허문헌 5의 서열번호 31(본 명세서의 서열번호 4와 동일)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 인간 ScFv(VasSF)가 표적으로 하는 항원의 탐색을 다음과 같이 시도했다.

먼저 특정 항체가 표적으로 하는 항원의 동정은 도 1a와 같이 크게 두 가지 방법이 있으나, 일반적으로 표적 분자의 동정은 매우 어렵다.

본 실시예에서 본 발명자들은 다음의 3가지 방법을 각각 사용함으로써 VasSF의 표적 항원을 동정하고, 최종적으로는 토실기 활성화 Dynabeads(등록상표)를 사용하여 MS/MS법으로 후보 물질의 범위를 정하여 표적 항원을 식별하는데 성공했다.

1-1.　ProteoSeek^TM　법에 의한 분류

샘플로서 정상인 유래의 혈장을 준비하고 이를 ProteoSeek^TM　Albumin/IgG Removal Kit(PIERCE)를 이용하여 처리한 후 이하의 1차 내지 4차 항체를 이용한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 표적 항원의 동정을 시도했다.

1차 항체: VasSF

2차 항체: 항인간 IgG F_(ab)2　항체(Rockland)

3차 항체: 항토끼 IgG 염소 항체(알칼리 포스파타제 표식)(invitorogen)

4차 항체: 항염소 IgG 토끼 항체(알칼리 포스파타제 표식)(jackson)

이 결과를 도 1b에 나타내었다.　도 1b의 왼쪽 사진은 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB) 염색의 결과를 나타내고 오른쪽의 사진은 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.　오른쪽 사진의 동그라미 부위에 반응을 볼 수 있으나, 대부분의 표적 항원 후보의 부위가 겹쳐 있으므로 본 실험에 의한 표적 항원의 동정에는 이르지 못했다.

1-2.　HiTrap(등록상표) NHS-activated HP 칼럼(GE 헬스케어)에 의한 분류

베드 볼륨 1㎖의 HiTrap NHS-activated HP 칼럼(GE 헬스케어)을 준비했다.　0.4㎎/㎖의 VasSF 용액을 5㎖(2㎎)를 준비하여 amico 10k를 이용하여 약 40배로 농축시켰다.　그 후, 커플링 버퍼를 이용하여 희석시켜 위에서 준비한 칼럼에 결합시켰다.

이어서 샘플로 준비한 건강한 사람 유래의 혈장을 상기 칼럼에서 처리하고 CBB 염색 및 은 염색, 웨스턴 블롯에 의해 표적 항원의 동정을 시도했다.

샘플이 결합된 칼럼의 염색결과를 도 1c에 나타내었다.　도 1c에 나타낸 바와 같이, CBB 염색(도 1c 왼쪽)에서는 거의 검출 가능한 상태가 아니었으나, 은염색(도 1c 중앙)에 의해 소량을 검출할 수 있었다.　또한 웨스턴 블롯(도 1c 오른쪽)에서는 10kDa 근처에 굵은 밴드가 보였다.　그러나 본 실험에서도 대부분의 표적 항원 후보 부분이 겹쳐 있었으므로 본 실험에서도 역시 표적 항원의 동정에는 이르지 못했다.

1-3.　토실기 활성화 Dynabeads(등록상표)에 의한 동정

제공된 프로토콜에 따라 VasSF 1㎎을 리간드로 사용하여 0.1M 붕소나트륨 버퍼에 토실기 활성화 Dynabeads(25㎎)와 혼합하여 반응시킴으로써, 리간드 코팅 비즈를 제작하였다.　그리고 PBS(0.05% Tween20 함유)를 사용하여 이 코팅 비즈를 5 회 세척하였다.

한편, 인간혈장(채혈 시 항응고제로 EDTA-2K를 사용) 3㎖를 PBS로 10배 희석한 후, 한외여과막 50kDa에서 원심 여과한 것을 샘플로 준비했다.

이 샘플을 상기 코팅 비즈 25㎎와 혼합하여 1시간 회전시키면서 실온에서 반응시켰다.　혈장을 제거한 후 PBS(0.05% Tween20 함유)를 이용하여 3회 세척하였다.

그 후, 코팅 비즈에 결합한 분획을 용출 버퍼(0.1M 글리신-HCl, pH2.7)로 용출하고 1/10 체적의 중화 버퍼(1M 트리스 HCl, pH9.0)로 중화시켰다.　이렇게 하여 용출된 분획을 이용하여 SDS-PAGE를 실시했다.　여기서 이 SDS-PAGE에 은염색 결과를 보여주는 사진을 도 2에 나타내었다.　도 2의 사진과 같이 약 10kDa 부근에 밴드를 볼 수 있었으므로, 이 밴드 부분을 추출했다.

[실시예 2]

2.　MS/MS 이온 검색법을 이용한 현장에서 표적 항원 후보의 검색

도 2에서 얻어진 부분을 추출(도 3 왼쪽).　이어서, 프로테아제 분해에 의해 얻어진 펩타이드 혼합물의 MS/MS 측정을 실시하여, 질량 분석기에서 특정 펩타이드 유래의 이온을 선택하는 방법으로 MS/MS 스펙트럼을 얻었다.　얻어진 MS/MS 스펙트럼과, 데이터베이스에 등록되어 있는 전체 단백질 데이터에서 스코어를 산출하였다(표 1).　그 결과 아래 표 1에 기재된 11종의 단백질이 표적 항원 후보 분자로 히트했다(도 3의 오른쪽 표는 똑같은 약자로 기재하였다).

[실시예 3]

3.　표적 항원 후보 분자에 대한 다클론성 항체의 치료 효과

1) 상기 표에 기재된 11종의 후보 분자 중 혈액에 존재할 것으로 예상되는 분자: Ig 감마-2 사슬 C 영역, Apolipoprotein A-Ⅱ, Ig 중쇄 Ⅴ-Ⅲ, Ankyrin 반복부 및 KH 도메인-함유 단백질 1, Apolipoprotein C-I의 5종에 대한 다클론성 항체 제조를 시도했다.

2) 재조합 인간 ApoAⅡ 항원을 포함한 각 항원을 보조제와 혼합하여 토끼에게 접종했다.

3) 각 항원을 1주 간격으로 토끼에게 4회 접종하고, 1주 후에 채혈하여 ELISA법에 의해 항체가 충분히 높은 것을 확인했다.

4) 고도로 면역된 토끼로부터 전채혈을 하여 혈장성분을 분리하였다.

5) 혈장에서 proteinG 칼럼을 이용하여 IgG를 분리하였다.

6) 각 항원을 결합시킨 어피니티 칼럼을 통해 IgG 분획으로부터 특이항체를 단리정제하였다.

7) 얻어진 다클론성 항체를 혈관염 자연 발병 모델 마우스(SCG/Kj 마우스)에게 투여하여 각 항체의 치료 효과를 판정했다.

상기 검토 결과 Apolipoprotein A-Ⅱ(아포리포단백질 A2; APOA2)를 이용하여 제작한 다클론성 항체만이 현저한 치료 효과를 보였다.　그러므로 VasSF의 표적 항원은 Apolipoprotein A-Ⅱ(아포리포단백질 A2; APOA2)라는 것이 특정되었다.

[실시예 4]

4.　난치성 혈관염의 치료를 위한 항체 의약으로서의 항APOA2 다클론성 항체의 치료 효과

전술한 실시예 3에서 현저한 치료 효과를 나타낸 항APOA2 다클론성 항체를 0.45% 글리신 및 0.9% 염화나트륨을 포함하는 1.5% D-만니톨에 용해시켜 사용했다.

첫째, 10주령의 SCG/Kj 마우스에게 항APOA2 다클론성 항체를 10 내지 40㎎/kg/day 처방으로 복강 내 투여(ip)로 5일간 연속 투여하고, 13주령이 되었을 때 CO₂　가스로 안락사시켜, 혈관염의 지표인 혈청 MPO-ANCA(myeloperoxidase-specific anti-neutrophil cytoplasmic antibody)값, 비장 중량, 말초 혈액의 백혈구수, 림프구, 단핵구수, 과립구(호중구) 수와 혈소판 수를 측정하고, 그 결과를 토대로 치료 효과를 판정했다.

4-1.　방법

4-1-1) 마우스 사육 조건

SCG/Kj 마우스 14L10D의 명암주기(명기 5:00-19:00 암기 19:00-5:00), 온도 23±1℃, 습도 50±5%로 설정된 환경에서 사육했다.　먹이는 실험 전까지는 소형 설치류(특수 번식용) CRF1: 방사선 멸균(오리엔털효모공업주식회사)을 이용하여 투여 전날부터 소형 설치류(일반 사육용) FR-2: 방사선 멸균(후나바시 팜)으로 전환했다.　식음수는 역 삼투압(RO)식 식음수 처리장치에 의해 정화된 물에 농도 0.3 내지 2.0ppm의 염소를 첨가하여 자유 섭취시켰다.　동물 시설은 HEPA 필터를 통한 청정한 공기가 공급되고, SPF 동물만의 사육으로 제한했다.

4-1-2) 치료법

대상 마우스는 약 3주 전부터 일주일에 한 번씩 소변검사를 하여, 투여 당일의 체중 및 요잠혈·소변 스코어 수치에 따라 그룹을 나누었다.　투여군은 샘플을 0.1 내지 400㎎/kg 5일간 ip 연속 투여, 대조군은 Solvent(안정제: D 만니톨, 글리신, PBS)를 5일간 ip 연속 투여했다.　투여량은 최종 측정 체중에 따라 산출하여, 한 마리당 0.33㎖가 되도록 조정했다.　투여 후 주 2회 체중 측정 및 소변검사를 했다.

4-1-3) 시료 채취

투여 3주 후에 안락사시켜 해부하여 시료를 채취하였다.

1.　CO₂(드라이아이스) 마취하에서 심장으로부터 전혈을 채혈했다(헤파린 무함유).

2.　혈액 성상 검사를 위해, EDTA-2K 및 생식: 250㎕가 들어간 샘플링 튜브에 혈액 50㎕를 넣고 희석시켰다.　약 2시간 후에 자동 측정기(VetScanHMⅡ ABAXIS사 제품, 미국 캘리포니아주 유니언시티 소재)에서, WBC, RBC, Hgb, Hct, MCV, MCH, MCHC, Plt를 측정했다.

3.　말초혈액 또는 채혈한 시린지에 남은 혈액으로 도말표본을 2매 작성했다.

4.　잔여 혈액은 원심분리 후 혈청을 -80℃에서 보관하였다.　그리고 주식회사 A-CLIP 연구소에 송부했다(MPO-ANCA 및 사이토카인(Bio-Plex) 측정용).

5.　개복하여 사진을 찍은 후, 비장, 심장, 신장, 폐, 피부를 적출·처리하고, 남은 전신을 10% 중성 완충 포르말린액(와코준야쿠코교 주식회사: 060-01667)에 침지했다.

비장: 중량 측정 후, RNA용으로 사방 5㎜ 크기를 RNA later에 취하고, 나머지 조직을 10% 중성 완충 포르말린액에 침지했다.

폐: RNA용으로 사방 5㎜ 크기를 RNA later에 취하고, 나머지 조직을 10% 중성 완충 포르말린액 속에서 탈기 후 침지했다.

신장: 사진 촬영 후 RNA용으로 사방 5㎜ 크기를 RNA later에 취하고, 나머지 조직에 칼집을 넣어 10% 중성 완충 포르말린액에 침지했다.

4-1-4) 측정·분석

체중당 비장 중량(%)

사구체 형성률: HE 염색한 슬라이드를 현미경 관찰함으로써 80 내지 100 개의 사구체에 대해 반달체 형성률(% Crescent)을 구했다.

4-1-5) 혈구수: 백혈구(WBC), 림프구(LYM), 단핵구(MON), 호중구(GRA)를 VetScan(상기 언급)에 의해 측정했다.

4-1-6) 혈청 중 바이오마커 분석

MPO-ANCA 및 항모에신 항체, BUN의 정량은 ELISA 방법을 이용했다.

혈청 중 염증성 사이토카인·케모카인(이하에 표시)의 정량은 Bio-Plex(Bio-Rad)를 이용하고, pg/㎖로 표기하였다:

인터류킨(IL)-1alpha, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL-17, Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-감마, KC, MCP-1, MIP-1알파, MIP-1beta, RANTES, TNF-알파, IL-15, IL-18, FGF-basic, LIF, M-CSF, MIG, MIP-2, PDGF-bb, VEGF, IL6sR, IL-23.

4-2.　결과

4-2-1) 신장 사구체 반월체 형성의 감소

면역질환인 난치성 혈관염의 주된 표적 조직은 신장, 폐장과 비장이다.　먼저 신장의 기능과 크게 관련된 사구체 조직상에 변화가 보였다.　C56BL/6 정상적인 마우스는 신장 사구체 보우만강이 형성된 현미경상을 보여 주었다(도 4A).　한편, 모델 마우스 SCG/Kj 무치료(Solvent 투여)군의 신장 사구체 현미경상은 반월체를 형성하고, 신장 기능부전이 발생했다(도 4B 원 내).　이는 음성 대조군의 투여에서도 마찬가지였다(도 4C).　또한, 음성 대조군으로는, 특허문헌 3에 기재된 방법으로 VasSF(ScFv)를 정제하는 과정에서 정제된, 항Fab 항체에 의해 인식되지 않는 55kDa 크기를 지닌 분자(본 명세서 중 'Different Mol'이라고도 함)를 사용하였다.　이에 대해 본 모델 마우스 SCG/Kj에게 항APOA2 다클론성 항체를 투여함으로써 신장 사구체 반월체 형성이 저하되고(도 4D), 그 형성률이 50% 정도까지 개선되었다(도 5A).

4-2-2) 비장 조직 및 중량에 대한 항APOA2 다클론성 항체의 치료 효과

난치성 혈관염은 자가면역질환이므로, 면역기능 부전으로 모델 마우스의 경우 현저한 비장 비대가 확인된다(비특허문헌 11).　C56BL/6 정상적인 마우스의 비장 현미경상(도6 A)은 백비수와 적비수가 제대로 분리되어 있었으나, 모델 마우스 SCG/Kj 무치료(Solvent 투여)군의 비장 현미경상(도 6B)은 백비수와 적비수가 분리되지 않았다.　이것은 VasSF와 다른 분자(Different Mol)를 투여해도 마찬가지였다.(도6 C)).　한편, 본 모델 마우스 SCG/Kj에게 항APOA2 다클론성 항체를 투여함으로써 거의 정상적인 마우스의 비장 조직상을 얻었다(도 6D).

또한, 도 7을 참조하면, 모델 마우스 SCG/Kj의 비장 중량은 무치료(Solvent 투여)군에서 C56BL/6 건강한 마우스보다 높은 수치를 나타냈다.　한편, 본 모델 마우스 SCG/Kj에게 항APOA2 다클론성 항체를 투여함으로써, 건강한 마우스의 비장 중량 수치까지는 내려가지 않았지만, 비장 중량은 저하되었다.　또한 VasSF와는 다른 분자(Different Mol)의 투여로는 비장 중량을 감소시키지 않았다.

4-2-3) 난치성 혈관염의 혈청 중 바이오마커: MPO-ANCA 및 항모에신 항체에 대한 항APOA2 다클론성 항체의 치료 효과

난치성 혈관염은 자가면역질환으로 임상시험에 사용되는 바이오마커: MPO-ANCA와 스즈키 가즈오 등이 발견한 새로운 바이오마커: 항모에신 항체(비특허문헌 4)의 혈청 수준에 대해 항APOA2 다클론성 항체가 미치는 치료 효과를 검토했다.　MPO-ANCA 양성을 나타내는 모델 마우스 SCG/Kj 마우스에 대한 무치료(Solvent 투여)군 및 VasSF와는 다른 분자(Different Mol)의 투여군과 비교하여, 항APOA2 다클론성 항체를 투여함으로써 거의 건강한 마우스의 혈청 중 MPO-ANCA 및 항모에신 항체 수준으로 개선되었다(도 8A 및 B).

4-2-4) 혈청 중의 사이토카인·케모카인 수준에 대한 항APOA2 다클론성 항체의 치료 효과

비장 조직의 정상화 및 중량의 감소, 혈청 중 자가항체: MPO-ANCA, 항모에신 항체가 항APOA2 다클론성 항체에 의해 정상치에 가까운 수준으로 감소하였으므로, 염증의 지표인 혈청 중 염증 사이토카인·케모카인 수준을 Bio-Plex(Bio-Rad)를 이용하여 (pg/㎖) 단위로 측정했다. IL-1알파, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL-17, Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-감마, KC, MCP-1, MIP-1알파, MIP-1beta, RANTES, TNF-알파, IL-15, IL-18, FGF-basic, LIF, M-CSF, MIG, MIP-2, PDGF-bb, VEGF, IL6sR, IL-23 중, 거의 모든 사이토카인·케모카인 레벨이 모델 마우스 SCG/Kj의 무치료(Solvent 투여)군에서 상승하였다. 한편, 본 모델 마우스 SCG/Kj에 항APOA2 다클론성 항체를 투여하는 것에 의해, TNF-알파, G-CSF, RANTES, IFN-감마, IL-5, IL-10이 개선되었다(도 9의 A 내지 F).

범례

IL-1a: 인터류킨-1α(Interleukin-1alpha)

IL-1b: 인터류킨-1β(Interleukin-1beta)

IL-2: 인터류킨-2(Interleukin-2)

IL-3: 인터류킨-3(Interleukin-3)

IL-4: 인터류킨-4(Interleukin-4)

IL-5: 인터류킨-5(Interleukin-5)

IL-6: 인터류킨-6(Interleukin-6)

IL-9: 인터류킨-9(Interleukin-9)

IL-10: 인터류킨-10(Interleukin-10)

IL12p40: 인터류킨-12 서브유닛 p40(Interleukin-12 subunIt p40)

IL-12p70: 인터류킨-12 서브유닛 p70(Interleukin-12 subunIt p70)

IL-13: 인터류킨-13(Interleukin-13)

IL-17: 인터류킨-17(Interleukin-17)

Eotaxin: 에오탁신(Eotaxin)

G-CSF: 과립구콜로니자극인자(granulocyte colony-stimulating factor)

GM-CSF: 과립구／마크로파지콜로니자극인자(granulocyte Macrophage-colony stimulating factor)

IFN-g: 인터페론γ(Interferon gamma)

KC: 케라티노사이트 유래 케모카인(keratinocyte-derived chemokine)

MCP-1: 단구주화성인자단백질-1(Monocyte chemoattractant protein-1)

MIP-1a: 마크로파지염증성단백질-1α(Macrophage Inflammatory protein-1 alpha)

MIP-1b: 마크로파지염증성단백질-1β(Macrophage Inflammatory protein-1 beta)

RANTES: 활성화에 의해 제어되는, 정상 T세포에서 발현 및 분비되는 단백질(Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)

TNF-a: 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-alpha)

IL-15: 인터류킨-15(Interleukin-15)

IL-18: 인터류킨-18(Interleukin-18)

FGF-basIc: 염기성-선유아세포증식인자(fIbroblast growth factor-basIc)

LIF: 백혈병저지인자(leukeMIa-InhIbItoRy factor)

M-CSF: 마크로파지콜로니자극인자(Macrophage colony-stimulating factor)

MIG: 인터페론γ유도성모노카인(MonokIne Induced by Interferon gamma)

MIP-2: 마크로파지염증성단백질-2(Macrophage Inflammatory protein-2)

PDGF-bb: 혈소판유래증식인자-BB(platelet-derived growth factor-BB)

VEGF: 혈관내피증식인자(vascular endotheltal growth factor)

IL-6sR: 인터류킨-6가용성수용체(Interleukin-6 soluble Receptor)

IL-23: 인터류킨-23(Interleukin-23)

4-2-5) 말초혈액 중의 백혈구수에 대한 항APOA2 다클론성 항체의 치료 효과

난치성 혈관염은 자가면역질환으로, 모델 마우스 SCG/Kj는 비장비대, 혈청 중 자가항체 MPO-ANCA, 항모에신 항체 및 염증성 사이토카인·케모카인의 증가가 확인되었고, VasSF와 마찬가지로 항APOA2 다클론성 항체가 이들을 정상화시킨다.　이 결과에서 말초혈액이 백혈구에 미치는 영향을 조사한 결과, 전체 백혈구수(WBC), 림프구(LYM), 단핵구수(MON)는 변화가 없었으나(도 10A, B), 호중구수(GRA)는 항APOA2 다클론성 항체의 투여에 의해 거의 정상적인 마우스의 수치까지 개선되었다(도 10B).

4-2-6) 폐 조직의 현미경상

난치성 혈관염은 자가면역질환이므로 신장과 마찬가지로 영향 장기인 폐의 현미경상을 조사했다.　모델 마우스 SCG/Kj 무치료군과 Different Mol군에서는 폐조직에서 혈관염, 출혈, 일부 육아가 출현했다(도 11B, C).　한편, 항APOA2 다클론성 항체의 투여에 의해 정상 폐에 가까운 상으로 개선되었다(도 11A, D).

[실시예 5]

5.　난치성 혈관염 치료를 위한 hScFv 재조합체(VasAP)의 구축

5-1.　재조합체의 구축

5-1-1) 대장균 발현 최적화에 의한 단백질 발현

특허문헌 3(일본특허공개 2013-147495호 공보)에 의한 인공 감마글로불린 라이브러리 작성은 대장균 내에서의 감마글로불린균에 대한 독성을 최대한 억제하는 것이 명제였으므로, 플라스미드에 의한 단백질 발현을 엄격히 제어하는 벡터로서 아라비노스 프로모터 제어하에 외래유전자를 삽입하는 pBAD 벡터가 채용되었다.　그 후, 특허문헌 5(일본특허공개 2016-160265호 공보)에서 상기 라이브러리에서 사용한 클론(VasSF)이 선택되었으므로 단일클론에 의한 발현 효율이 높은 벡터의 검색 및 서열을 개선하였다.

5-1-2) 대장균 단백질 발현 최적화(pTAC-2 벡터에 도입)

대장균에 의한 단백질의 발현 효율을 극대화시키기 위해 유효 클론(VasSF)의 아미노산 서열(서열번호 4, 특허문헌 5의 서열번호 31과 동일)에서 대장균 코돈 출현 빈도를 배려하여, C 말단에 6개의 히스티딘 태그가 부착된 인공합성 유전자(URq01_OptEcoli서열; 서열번호 3)를 포함하는 플라스미드 pTAC2-URq01_OptEcoli를 작제하였다(도 12).

5-1-3) pET32 벡터에 도입

재조합 단백질의 대장균에서의 강력 발현을 목적으로 일반적으로 사용되는 벡터인 pET계 벡터는 LacZ 오페론 제어하에 T7 프로모터로 발현을 증강할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 URq01_OptEcoli 서열의 pET계 벡터에 도입을 시도했다.

구체적으로는, 먼저 위에서 구축한 플라스미드 pTAC2-URq01_OptEcoli에서 삽입서열(코드영역: 서열번호 3의 영역)을 PCR 증폭시키고, 편입 단편을 제작하였다.　이때 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같다(밑줄 부분은 pET32 벡터의 클로닝 부위의 말단과 상동성인 서열이다).

포워드 프라이머:　TTTAAGAAGGAGATATACAT　ATGGATTTCGGCCTCAGCTG

(서열번호 5, 도 13에 나타낸 pET32_Rq01OptEc_infF(Tm))　

리버스 프라이머: TTAATGGTGATGGTGGTGATG

(서열번호 6, 도 13에 나타낸 Rq01_OptEc_cds_6HisStpcmpR)　

한편, pET32 벡터를 선 형상화함과 동시에 상기 증폭 단편과의 접합을 가능하게 하는 것을 목적으로 해서, 인버스 PCR을 행하여 해당 벡터를 증폭시켰다.　이때 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같다(밑줄 부분은 삽입 서열의 His 태그 말단과 상동성인 서열이다).

포워드 프라이머:　CATCACCACCATCACCATTAA　CTGCTAACAAAGCCCGAAAG

(서열번호 7, 도 13에 나타낸 His6StpCmp_pET32_110-129F)　

리버스 프라이머: ATGTATATCTCCTTCTTAAA

(서열번호 8, 도 13에 나타낸pET32vbRev693-712)　

상기 증폭된 편입 단편 및 선상화 pET32 벡터를 In-Fusion법(다카라바이오)을 이용하여 융합함으로써, pET32 벡터의 T7 프로모터 제어영역의 조합 부위에 편입 단편을 삽입했다(도 14).

그 후, 대장균 숙주인 DE32에 히트쇼크법을 이용하여 상기 벡터를 도입함으로써, 형질전환체를 작제했다. 또한, 조합 서열에 대해서는, pET32벡터의 프레임 T7프로모터 영역에 설정된 프라이머 및 T7터미네이터 영역의 프라이머를 이용하여 삽입 서열을 PCR 증폭시킴으로써 10 콜로니에서 확인했다. 이때 이용한 프라이머의 염기서열은 아래와 같다.

포워드 프라이머: ATGGATTTCGGCCTCAGCTG

(서열번호 9, 도 13에 표시 Rq01_OptEc_cds_F)

리버스 프라이머: TTAATGGTGATGGTGGTGATG

(서열번호 6, 도 13에 표시 Rq01_OptEc_cds_6HisStpcmpR)

그리고 이 10 콜로니에서 얻은 플라스미드 DNA의 염기서열을 확인하여, 모든 클론이 제대로 구성된 조합 서열임을 확인했다.

5-2) 재조합체 클론의 정제

다음 방법에 의해 숙주인 대장균 세포 DE32의 배양물에서 재조합 단백질(서열번호 4로 이루어진 것으로, 본 명세서에서 'VasAP'라고도 함)을 정제했다.　다만, 본 발명에서 단백질 정제는 일반적인 정제 방법을 이용하여 정제할 수 있다.　정제 방법의 예로는 고정화 금속이온 친화성 크로마토그래피, 이온교환 칼럼에 의한 분획화, DEAE 등의 양성이온 교환 수지에 의한 크로마토그래피, 젤 여과법 등이 있다.

1) 목적 클론을 포함하는 대장균을 10℃에서 18 내지 48시간 배양하였다.

2) 대장균 배양액에서 3500 × g, 30 분간 원심분리하여 균체를 회수했다.

3) 균체 1L분 당 20㎖의 6M 구아니딘티오시아네이트의 50mM 트리스 버퍼(pH8.0) 용액을 첨가하고 초음파분쇄기 19 내지 22kHz에서 15초간씩 3회 처리했다.

4) 초음파 파쇄한 균체액에서 15000×g, 30분간 원심분리하여 상청액을 채취했다.

5) 상청액에서 8M Urea base의 고정화 금속이온 친화성 크로마토그래피 정제를 통해 목적으로 하는 클론 유래 hScFv(VasAP)의 피크를 채취했다.

6) 8M Urea base의 고정화 금속(Ni) 이온 친화성 크로마토그래피 정제한 단백질을 한외여과막 10kDa으로 원심농축하였다.

7) 원심농축 단백질의 피크를 젤 여과 HPLC를 이용하여 분취했다.

8) 젤여과 HPLC에서 얻은 단백질의 피크를 다시 고정화금속(Co) 이온 친화성 크로마토그래피 정제하였다.

9) 8M Urea base의 고정화금속(Co) 이온 친화성 크로마토그래피 정제된 용액을 한외여과막 10kDa으로 원심농축하였다.

10) 원심농축된 단백질을 젤여과 HPLC를 이용하여 8M 요소 PBS 버퍼로 치환했다.

11) 8M 요소 PBS 버퍼로 치환한 단백질을 투석하여 단계적으로 요소 농도를 낮추고 아르기닌을 첨가하면서 PBS로 치환했다.　구체적으로는 8M 요소 PBS, 4M 요소/0.4M 아르기닌, 2M 요소/0.4M 아르기닌, 2M 요소 0.4M 아르기닌, PBS 3번으로 이 순서대로 정제하였다.

이상의 정제 결과를 나타내는 데이터를 도 15에 나타내었다.　도 15A, B는 젤여과 HPLC 프로파일의 결과를 나타낸 사진이고, 도 15C는 전기영동과 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸 사진이다.

[실시예 6]

6.　단클론 재조합 VasAP 항체의 치료 효과 확인

6-1.　신장 사구체에서 반월체 형성 및 소변 소견에서의 재조합 VasAP 항체의 치료 효과

위에서 얻어진 재조합 VasAP 항체를 이용하여 전술한 실시예 4와 마찬가지 방법에 의해, SCG/Kj 모델 마우스를 이용하여 해당 항체가 신장 사구체에서 반월체 형성 및 소변 소견에 미치는 영향을 확인했다.　결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, VasAP 항체의 투여는 모델 마우스 SCG/Kj에서 반월체 형성이 개선되고(도 16의 A), 소변 소견에서도 Different Mol에 비해 낮은 수치를 보였다(도 16의 B).

6-2.　비장 중량에 대한 재조합 VasAP 항체의 치료 효과

위에서 얻어진 재조합 VasAP 항체를 이용하여 전술한 실시예 4와 마찬가지 방법에 의해, SCG/Kj 모델 마우스를 이용하여 해당 항체가 비장 중량에 미치는 영향을 확인했다.　결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에 나타낸 바와 같이, 모델 마우스 SCG/Kj에서 비대화된 비장의 중량을 Different Mol는 악화시키는 결과가 되었지만, VasAP 항체의 투여는 비장 중량을 감소시키는 결과가 되었다.

6-3.　혈청 중의 바이오마커: MPO-ANCA 및 항모에신 항체에 대한 재조합 VasAP 항체의 치료 효과

위에서 얻어진 재조합 VasAP 항체를 이용하여 전술한 실시예 4와 마찬가지 방법으로, SCG/Kj 모델 마우스를 사용하여 당해 항체가 혈청 중 MPO-ANCA 및 항모에신 항체 수준에 미치는 영향을 확인했다.　결과를 도 18에 나타내었다.

도 18에 나타낸 바와 같이, 모델 마우스 SCG/Kj에서 상승한 혈청 중 MPO-ANCA 및 항모에신 항체 수준을 Different Mol는 악화시키는 결과가 되었지만, VasAP 항체의 투여로는 이런 현상을 개선시키는 결과가 되었다.

6-4.　혈청 중 염증성 사이토카인·케모카인 수준에 대한 재조합 VasAP 항체의 치료 효과

위에서 얻어진 재조합 VasAP 항체를 이용하여 전술한 실시예 4와 마찬가지 방법에 의해, SCG/Kj 모델 마우스를 이용하여 해당 항체가 혈청 중 염증성 사이토카인·케모카인 수준에 미치는 영향을 확인했다.　결과를 도 19에 나타내었다.

도 19에 나타낸 바와 같이 VasAP 항체의 투여로 TNF-알파, G-CSF, RANTES, IFN-감마, IL-5, IL-10의 혈청 수준이 저하하여 효능을 나타냈다.

6-5.　말초혈액 중 백혈구수에 대한 재조합 VasAP 항체의 치료 효과

위에서 얻어진 재조합 VasAP 항체를 이용하여 전술한 실시예 4와 마찬가지 방법에 의해, SCG/Kj 모델 마우스를 이용하여 해당 항체가 말초혈액 중의 백혈구수에 미치는 영향을 확인했다.　결과를 도 20에 나타내었다.

도 20에 나타낸 바와 같이, VasAP 항체 투여에 의한 말초혈 중의 백혈구수에 대한 영향은, 전체 백혈구수(WBC), 림프구(LYM)에서는 유의한 개선은 나타나지 않았지만(도 20A), 단핵구수(MON) 및 호중구수(GRA)는 VasAP 항체의 투여에 의해 거의 정상적인 마우스의 수치까지 감소하였다(도 20B).

[실시예 7]

7.　야생형 마우스의 혈관염 유도에 의한 유도형 혈관염 모델 마우스의 작제 및 평가

7-1.　APOA2 단백질 투여에 의한 혈관염 발병 유도

7-1-1) 시료 동물

암컷 BALB/cCr Slc 마우스(10 주령) 4마리를 준비하고, 그 중 3마리를 실험군, 1마리를 대조군으로 했다.

7-1-2) 투여 샘플의 준비

시료 단백질로서 APOA2 단백질(BTI: BT-928, LOT: 9280413)을 준비했다.　이 시료 단백질 1㎎을 식염수(일본전약공업주식회사, 412190) 1㎖에 용해시킨 후, 1㎖의 생리식염수를 첨가하여 균일하게 혼합하여 0.5㎎/㎖의 투여 샘플을 제조하였다.

7-1-3) 투여 샘플의 투여

위에서 조제한 투여 샘플 0.2를 실험군의 3마리 마우스에게 각각 복강 내 투여했다(시료 단백질의 투여량은 0.1㎎/마리).　한편, 대조군 마우스에게는 생리식염수(Solvent)를 0.2㎖ 투여했다.

7-2.　야생형 마우스의 혈관염 유도의 확인

7-2-1) 소변 스코어 평가

위에서 투여 샘플을 투여한 실험군 3마리 마우스에 대해 투여 샘플(시료 단백질을 함유)을 투여한 이후 44일 후까지 소변 스코어를 평가했다.　결과를 도 21에 나타내었다.　또한, 도 21에 나타낸 그래프는 투여 후 일수(가로축)에 대한 소변 스코어(세로축; 3마리의 산술 평균치)의 변화를 투여일(제0일)의 수치를 100으로 했을 경우의 상대치로 나타낸 것이다.

7-2-2) 신장사구체의 반월체 형성 확인

대조군과 실험군 각각의 마우스는 전술한 실시예 4와 마찬가지 방법으로 반월체 형성률을 산출함으로써 각 마우스 신장사구체의 반월체 형성을 확인했다.　이 결과를 도 22에 나타내었다.　또한 각 마우스의 신장 조직을 전술한 실시예 4와 마찬가지 방법으로 관찰하여 반월체 형성을 확인했다.　이 결과를 도 23에 나타내었다.

7-2-2) 비장조직 및 폐조직의 현미경상 관찰

각 마우스의 비장조직 및 폐조직을 전술한 실실시예 4와 마찬가지 방법으로 관찰했다.　이 결과를 도 23에 나타내었다.

7-3.　결과

도 21에 나타낸 바와 같이 실험군 마우스에서는 시료 단백질(APOA2) 투여 후 소변 스코어 수치가 경시적으로 상승하고, 그 후에도 높은 수치를 유지하는 것을 알 수 있다.　그러므로 실험군 마우스에서는 시료 단백질(APOA2) 투여로 인해 염증성 질환이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 22에 나타낸 바와 같이, 실험군 마우스에서는 대조군 마우스와 비교하여 신장사구체의 반월체 형성률이 크게 상승했다. 또한, 도 23에 나타낸 현미경상에서도, 실험군의 마우스 신장사구체의 현미경상은 반월체를 형성하고, 신장기능 부전이 발생했다. 또한, 도 23의 하단의 '확대도'는 상단의 현미경상의 사각으로 표시한 부분의 확대도이다.

또한, 도 24에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스의 비장 현미경상은 백비수와 적비수가 제대로 분리되었지만, 실험군 마우스의 비장 현미경상은 백비수와 적비수가 분리되지 않았다.　또한 실험군 마우스의 폐조직에서는 혈관염, 출혈, 일부 육아가 출현했으나, 대조군 마우스에서는 이러한 증상은 확인되지 않았다.

이상에서 야생형 비인간동물(여기에서는 마우스)에 APOA2 단백질을 투여함으로써 염증성 질환(여기에서는 혈관염)을 유도할 수 있다는 것이 확인되었다.

[서열 목록 프리 텍스트］

본 출원 명세서의 서열 목록의 서열번호는 이하의 서열을 나타낸다.

[서열번호 1]

인간 APOA2를 코딩하는 DNA(CDS; 종결 코돈 포함)의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 2]

인간 APOA2의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호 3]

본 발명의 항체의 1종(VasAP)을 코딩하는 DNA(CDS; 종결 코돈 포함)의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 4]

본 발명의 항체의 1종(VasAP)의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호 5]

PCR용 프라이머(pET32_Rq01OptEc_infF(Tm))의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 6]

PCR용 프라이머(Rq01_OptEc_cds_6HisStpcmpR)의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 7]

PCR용 프라이머(His6StpCmp_pET32_110-129F)의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 8]

PCR용 프라이머(pET32vbRev693-712)의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 9]

PCR용 프라이머(Rq01_OptEc_cds_F)의 염기서열을 나타낸다.

본 출원은 2017년 1월 27일자로 출원된 일본 특허출원 제2017-13486호에 기초한 것으로, 그 개시내용은 참조사항으로서 전체적으로 편입되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> A-CLIP INSTITUTE, CO., LTD. NATIONAL INSTITUTES OF BIOMEDICAL INNOVATION, HEALTH AND NUTRITION <120> PREVENTING AND/OR TREATING AGENT FOR INFECTIOUS DISEASE OR INFLAMMATORY DISEASE <130> WO2018/139608 <140> PCT/JP2018/002576 <141> 2018-01-26 <150> JP 2017-013486 <151> 2017-01-27 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 303 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Coding DNA sequence for human APOA2 <400> 1 atgaagctgc tcgcagcaac tgtgctactc ctcaccatct gcagccttga aggagctttg 60 gttcggagac aggcaaagga gccatgtgtg gagagcctgg tttctcagta cttccagacc 120 gtgactgact atggcaagga cctgatggag aaggtcaaga gcccagagct tcaggccgag 180 gccaagtctt actttgaaaa gtcaaaggag cagctgacac ccctgatcaa gaaggctgga 240 acggaactgg ttaacttctt gagctatttc gtggaacttg gaacacagcc tgccacccag 300 tga 303 <210> 2 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino acid sequence of human APOA2 <400> 2 Met Lys Leu Leu Ala Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Ile Cys Ser Leu 1 5 10 15 Glu Gly Ala Leu Val Arg Arg Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser 20 25 30 Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu 35 40 45 Met Glu Lys Val Lys Ser Pro Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr 50 55 60 Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly 65 70 75 80 Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln 85 90 95 Pro Ala Thr Gln 100 <210> 3 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding VasAP antibody <400> 3 atggatttcg gccttagctg gattttcctg gtagcgctgc tgcgtggcgt acagtgccaa 60 gtacacttag tggagtctgg tggtggcttg gttcaaccgg gtcgttctct gcggctctca 120 tgtgcggtga gcggcttcac ctttgcgtcc tatgccatgc attgggtccg tcaggctcct 180 ggcaaagggc tggaatgggt cgcagggatc agtaaggatg ggagcaacaa acgtcatgcc 240 gatagcctcg aaggccgctt taccattagt cgcgataact cgaagaacac cctgtatctc 300 caggttagtg gcttacgcgc agaagatacc gccgtttact attgtgcgcg ctcacaagat 360 ccgacggact tcgattggct tctgtccgaa cattggggtc agggtactct ggtgacagtc 420 tcgtcagcga gcacaaaagg cccgtcggtg tttccgttag ccccttgttc tcgcagtact 480 tccgagagta ctgctgcact gggttgcctg gtgaaagact acttcccgga accggttacc 540 gtgtcgtgga attcaggtgc actgacctct ggagtccata cgtttcctgc ggttttgcag 600 tcgagcggct tgtactctct gagcagcgtt gtgacggtgc cgagctccaa ctttggaacc 660 cagacctata cgtgcaatgt ggatcacaaa ccctccaata cgaaggtaga caaaaccgtg 720 gctccaccag ttgccggtcc aagcgtcttt ctgtttccgc ccaaaccgaa agacacacat 780 caccaccatc accattaa 798 <210> 4 <211> 265 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of VasAP antibody <400> 4 Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ala Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Lys Asp Gly Ser Asn Lys Arg His Ala 65 70 75 80 Asp Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Val Ser Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gln Asp Pro Thr Asp Phe Asp Trp Leu Leu 115 120 125 Ser Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 145 150 155 160 Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr 210 215 220 Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val 225 230 235 240 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr His His His His His His 260 265 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Base sequence for PCR primer (pET32_Rq01OptEc_infF(Tm)) <400> 5 tttaagaagg agatatacat atggatttcg gcctcagctg 40 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Base sequence for PCR primer (Rq01_OptEc_cds_6HisStpcmpR) <400> 6 ttaatggtga tggtggtgat g 21 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Base sequence for PCR primer (His6StpCmp_pET32_110-129F) <400> 7 catcaccacc atcaccatta actgctaaca aagcccgaaa g 41 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Base sequence for PCR primer (pET32vbRev693-712) <400> 8 atgtatatct ccttcttaaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Base sequence for PCR primer (Rq01_OptEc_cds_F) <400> 9 atggatttcg gcctcagctg 20

Claims (22)

1. 아포리포단백질 A2(apolipoprotein A2: APOA2)를 특이적으로 인식하는 항체로, 이하의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하지 않는 항체를 유효성분으로 함유하는, 혈관염의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료용 약제:
   서열: MDFGLSWIFLVALLRGVQCQVHLVESGG
   GLVQPGRSLRLSCAVSGFTFASYAMHWVRQA
   PGKGLEWVAGISKDGSNKRHADSLEGRFTIS
   RDNSKNTLYLQVSGLRAEDTAVYYCARSQDP
   TDFDWLLSEHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP
   LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW
   NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
   SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVAPPVA
   GPSVFLFPPKPKDTHHHHHH.
2. 제1항에 있어서, 상기 혈관염은 특발성 혈소판 감소성 자반증, 무감마글로불린혈증, 가와사키병, 길랭-바레 증후군, 현미경적 다발혈관염(MPA), 호산구성 다발혈관염성 육아종증(Eosinophilic Granulomatosis with Polyangitis: EGPA, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군), 신장염, 사구체신염, 특발성 폐섬유증, 또는 이들의 조합인, 약제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아포리포단백질 A2(APOA2)가 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 동일한, 또는 이와 90% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질인, 약제.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 단클론성 항체인, 약제.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체인, 약제.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 단쇄가변분절(ScFv)인, 약제.
7. 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로, 이하의 서열을 갖는 아미노산 서열이 아닌 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 혈관염의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료용 항APOA2 재조합 면역글로불린 단편 조성물:
   서열: MDFGLSWIFLVALLRGVQCQVHLVESGG
   GLVQPGRSLRLSCAVSGFTFASYAMHWVRQA
   PGKGLEWVAGISKDGSNKRHADSLEGRFTIS
   RDNSKNTLYLQVSGLRAEDTAVYYCARSQDP
   TDFDWLLSEHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP
   LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW
   NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
   SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVAPPVA
   GPSVFLFPPKPKDTHHHHHH.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 혈관염의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료용 약제의 스크리닝 방법으로서, 단리된 아포리포단백질 A2(APOA2)의 활성을 피험물질의 존재하 및 부재하에서 비교하거나, 또는 아포리포단백질 A2(APOA2)를 생산하는 능력을 갖는 세포를 피험물질의 존재하 및 부재하에 배양하고 양 조건 하에서 아포리포단백질 A2(APOA2)의 활성을 비교함으로써, 아포리포단백질 A2(APOA2)의 활성을 저해하는 피험물질을 혈관염의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료용 약제의 후보로 확인하는 것을 포함하는, 방법.
18. 아포리포단백질 A2(APOA2)를 유효성분으로 함유하는, 인간을 제외한 동물에서의 혈관염 유도제.
19. 인간을 제외한 비유전자변형동물에게 아포리포단백질 A2(APOA2)를 투여하는 단계를 포함하는, 혈관염의 병태 모델 동물의 제작 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 혈관염이 특발성 혈소판 감소성 자반증, 무감마글로불린혈증, 가와사키병, 길랭-바레 증후군, 현미경적 다발혈관염(MPA), 호산구성 다발혈관염성 육아종증(Eosinophilic Granulomatosis with Polyangitis: EGPA, 처그스트라우스(Churg-Strauss) 증후군), 신장염, 사구체신염, 특발성 폐섬유증, 또는 이들의 조합인, 방법.
21. 제19항 또는 제20항에 기재된 방법에 의해 제작된, 혈관염의 병태 모델 동물.
22. 제21항에 기재된 병태 모델 동물에게 혈관염의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료용 약제의 후보 물질인 시험물질을 투여하는 단계; 및
    상기 병태 모델 동물의 혈관염 증상의 개선 및 소실을 평가하는 단계;를 포함하는, 혈관염의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료용 약제의 스크리닝 방법.