KR102566548B1 - 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 조성물 - Google Patents
달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 조성물에 관한 것이다.
상기 달맞이꽃은 뿌리부를 제외한 지상부인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 조성물은 세포독성이 없고, 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성이 뛰어나며, 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하여 세포의 생존율을 증가시킴으로써, 피부 보호 효과를 제공할 수 있다.
상기 달맞이꽃은 뿌리부를 제외한 지상부인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 조성물은 세포독성이 없고, 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성이 뛰어나며, 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하여 세포의 생존율을 증가시킴으로써, 피부 보호 효과를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 조성물에 관한 것이다.
피부 노화는 자연적으로 발생하는 내인성 노화와 외부의 환경에 의해 발생하는 외인성 노화로 분류할 수 있다.
내인성 노화는 유전적 요인과 세포대사 불균형으로 발생하며, 외인성 노화는 주로 자외선 자극과 같은 외부적 자극에 의해 발생한다.
자외선에 노출되어 피부가 자극받게 되면 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)이 발생하는데, 활성산소종은 피부의 산화 스트레스로 인한 손상을 유도하여 피부 노화를 촉진시킨다.
산화 스트레스로 인해 피부노화가 촉진되면 DNA 손상을 야기하며, 이러한 손상이 회복될 수 없을 정도로 심각하면 세포사멸이 유도되어 피부의 상피 구조를 파괴시키고 피부 질환을 일으킨다.
이에 따라, 산화 스트레스에 의한 피부 노화 및 피부 질환을 치료할 수 있는 새로운 항산화 물질에 대한 연구 및 개발이 요구되고 있는 실정이다.
현재까지 사용되고 있는 항산화제는 부티레이트 하이드록시톨루엔 (butylated hydroxytoluene, BHT)이 있지만, 최근 동물실험에서 기형 발생 또는 암 발생에 관여하는 것으로 보고되어 BHT를 사용함에 있어서 문제되고 있다.
따라서, 부작용이 개선되어 인체에 흡수되도 안전하며, 항산화 효과가 뛰어난 항산화물질을 개발하기 위한 연구가 필요한 실정이다.
한편 본 발명자는 달맞이꽃 추출물을 이용하여 세포독성이 낮으며 항산화 활성이 뛰어난 피부 보호용 조성물을 개발하고자 하는 바, 달맞이꽃에 대해 살펴보면 다음과 같다.
달맞이꽃 (Oenothera biennis)은 바늘꽃과의 2년생초본으로 야래향 또는 월하향으로도 불리며, 우리 나라 전국 각지에서 찾아볼 수 있다.
한방에서는 뿌리를 월견초라고 하여 감기로 열이 높고 인후염이 있을 때 물에 넣고 달여서 복용하고, 종자를 월견자라고 하여 고지혈증에 사용한다.
달맞이꽃과 관련된 선행기술에 대해 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1892626호에는 "달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환의 예방 또는 개선용 조성물"에 대해 기재되어 있다.
그러나 상기 선행기술과 본 발명을 비교해보면, 달맞이꽃을 사용한다는 점에서는 유사하나, 본 발명은 달맞이꽃을 사용하여 산화 스트레스로부터 피부를 보호하기 위해 사용한다는 점에서 효과가 상이하다.
이에 따라, 본 발명은 달맞이꽃의 지상부 (arial part) 추출물이 인간 피부각질세포의 산화 스트레스에 의한 손상을 억제하는데 효과적이라는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 조성물을 제공하고자 한다.
보다 상세하게는, 세포독성이 없고, 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성이 뛰어나며, 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하여 세포의 생존율을 증가시키는 효과를 갖는 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 보호용 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
상기 달맞이꽃은 뿌리부를 제외한 지상부인 것을 특징으로 한다.
상기 달맞이꽃 추출물의 처리 농도는 인간 피부각질세포 (HaCaT) 3 x 105 cells/ml에 50~70 ug/ml인 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 세포독성이 없고, 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성이 뛰어나며, 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하여 세포의 생존율을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 달맞이꽃을 유효성분으로 함유하는것을 특징으로 하는 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 조성물은, 세포독성이 없고, 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성이 뛰어나며, 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하여 세포의 생존율을 증가시키는 효과를 보유하고 있다.
도 1은 달맞이꽃 추출물이 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 효과를 나타낸 도면으로, (a)는 달맞이꽃 추출물을 다양한 농도로 처리하였을 때의 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 효과를 나타낸 그래프이며, (b)는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 달맞이꽃 추출물의 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 도면으로, (a)는 달맞이꽃 추출물의 환원력을 나타낸 그래프이며, (b)는 달맞이꽃 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 활성산소종 생산에 미치는 효과를 나타낸 도면으로, (a)는 HaCaT 세포의 활성산소종 생산정도를 나타낸 현광현미경 사진이고 (200배율), (b) 활성산소종의 생산정도를 유세포측정기로 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, (c)는 현광현미경에서 측정된 형광발현정도를 나타낸 그래프이고, (d)는 활성산소종의 생산정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한HaCaT 세포의 comet 생성에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 comet의 생성정도를 나타낸 현광현미경 사진이며, (b)는 comet 꼬리의 운동 (tail moment, TM)을 측정한 그래프이며, (c)는 comet 꼬리의 길이 (tail length, TL)를 측정한 그래프이다.
도 5는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 γH2AX 및 인산화된 γH2AX의 발현정도를 나타낸 전기영동 사진이며, (b)는 γH2AX 발현정도에 따른 인산화된 γH2AX 단백질의 비율의 변화를 나타낸 그래프이며, (c)는 caspase-3 및 PARP의 활성화정도를 나타낸 전기영동 사진이며, (d)는 달맞이꽃 추출물의 처리 시간에 따른 keap1, Nrf2 및 HO-1의 발현정도를 나타낸 전기영동 사진이다.
도 6은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 미토콘드리아 막 전위에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 JC-1 응집체가 JC-1 단량체로 변하는 정도를 유세포측정기로 측정하여 나타낸 그래프이며, (b)는 JC-1 응집체가 JC-1단량체로 변하면서 달라지는 붉은색 형광값을 나타낸 그래프이다.
도 7은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스가 유도된 HaCaT 세포의 사멸에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 4',6'-디아미노-2-페닐인돌 (4',6'-diamidino-2-phenylindol, DAPI)로 염색한 세포 핵을 촬영한 형광현미경 사진이며, (b)는 실험군과 대조군의 세포사멸정도를 측정하여 나타낸 그래프이며, (c) 세포사멸이 유도된 세포의 DNA를 추출하여 전기영동하여 DNA 절단정도를 나타낸 사진이다.
도 2는 달맞이꽃 추출물의 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 도면으로, (a)는 달맞이꽃 추출물의 환원력을 나타낸 그래프이며, (b)는 달맞이꽃 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 활성산소종 생산에 미치는 효과를 나타낸 도면으로, (a)는 HaCaT 세포의 활성산소종 생산정도를 나타낸 현광현미경 사진이고 (200배율), (b) 활성산소종의 생산정도를 유세포측정기로 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, (c)는 현광현미경에서 측정된 형광발현정도를 나타낸 그래프이고, (d)는 활성산소종의 생산정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한HaCaT 세포의 comet 생성에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 comet의 생성정도를 나타낸 현광현미경 사진이며, (b)는 comet 꼬리의 운동 (tail moment, TM)을 측정한 그래프이며, (c)는 comet 꼬리의 길이 (tail length, TL)를 측정한 그래프이다.
도 5는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 γH2AX 및 인산화된 γH2AX의 발현정도를 나타낸 전기영동 사진이며, (b)는 γH2AX 발현정도에 따른 인산화된 γH2AX 단백질의 비율의 변화를 나타낸 그래프이며, (c)는 caspase-3 및 PARP의 활성화정도를 나타낸 전기영동 사진이며, (d)는 달맞이꽃 추출물의 처리 시간에 따른 keap1, Nrf2 및 HO-1의 발현정도를 나타낸 전기영동 사진이다.
도 6은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 미토콘드리아 막 전위에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 JC-1 응집체가 JC-1 단량체로 변하는 정도를 유세포측정기로 측정하여 나타낸 그래프이며, (b)는 JC-1 응집체가 JC-1단량체로 변하면서 달라지는 붉은색 형광값을 나타낸 그래프이다.
도 7은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스가 유도된 HaCaT 세포의 사멸에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 4',6'-디아미노-2-페닐인돌 (4',6'-diamidino-2-phenylindol, DAPI)로 염색한 세포 핵을 촬영한 형광현미경 사진이며, (b)는 실험군과 대조군의 세포사멸정도를 측정하여 나타낸 그래프이며, (c) 세포사멸이 유도된 세포의 DNA를 추출하여 전기영동하여 DNA 절단정도를 나타낸 사진이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 실험예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을수 있음을 이해하여야 한다.
실험예 1. 달맞이꽃 추출물 준비
경상북도 상주시에서 채집한 달맞이꽃을 물로 씻은 후 실온에서 공기 건조하였다.
달맞이꽃의 뿌리부를 제외한 지상부만을 선별한 뒤 분쇄기를 사용하여 분쇄하여 분말을 얻었다.
분말 100 g을 에탄올 2 L에 넣고 25℃에서 24시간동안 100 rpm에서 진탕혼합하였다.
이렇게 얻은 달맞이꽃 추출물을 필터를 사용하여 여과하였고, 진공회전농축기 (N-1000S)를 사용하여 용매가 제거된 달맞이꽃 분말을 획득하였다.
달맞이꽃 분말을 디메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹여 100 mg/ml 의 원액 (stock solution)을 제조한 후 4℃에서 보관하였다.
원액은 생리식염수를 사용하여 원하는 농도로 희석시켜 실험을 진행하였다.
아래 실시되는 모든 실험 결과는 평균값을 기초로 ±S.D.(표준편차)로 나타내었고, 결과값의 P-valus가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
실험예 2. 세포 배양 및 세포 생존율분석
1. 세포 배양
본 실험에 사용한 인간 피부각질세포 (HaCaT) 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, ATCC)에서 구입하였다.
HaCaT 세포를 10% 소태아 혈청 (가열하여 불활성화시킴), 스트렙토마이신 (100 μg/mL) 및 페니실린 (100 unit/mL)이 함유된 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 1640 배지를 사용하여, 이산화탄소 배양기에서 5% CO2 및 37℃를 유지하며 배양하였다.
2. 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 생존율 분석
세포 생존율을 분석하기 위해 HaCaT 세포를 6-웰 플레이트 (6-well plate)에 3 x 105 cells/ml로 접종하고 24시간 동안 배양한 후 다양한 농도의 달맞이꽃 추출물울 처리한 뒤 24시간동안 배양하였다.
도 1(a)는 달맞이꽃 추출물을 다양한 농도로 처리하였을 때의 HaCaT 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 달맞이꽃 추출물은 60 ug/ml 까지의 농도에서 세포 생존력에 별다른 영향을 주지 않았으나, 80 ug/ml 이상의 농도에서 세포 생존력을 점차적으로 감소시켰다.
따라서, 달맞이꽃 추출물이 과산화수소 처리된 HaCaT 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 60 ug/ml 농도로 맞춰서 실험을 진행하였다.
달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 30분동안 처리하여 산화 스트레스가 유도된 HaCaT 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 수행하였다.
세포에 MTT 0.5 mg/ml를 처리한 뒤 37℃에서 3시간동안 배양하였다.
배양이 끝난 뒤, 배지를 제거하고 포르마잔 (formazan) 침전물을 디메틸설폭사이드에 용해시켰다.
포르마잔 생성물의 흡광도를 Cytation-3 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 사용하여 540 nm 파장에서 측정하였다.
아무것도 처리되지 않은 세포를 정상군, 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 대조군1, 항산화제인 N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-L-cysteine, NAC) 10 mM을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 대조군 2, 달맞이꽃 추출물을 처리한 뒤 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포를 실험군으로 정하였다.
도 1(b)는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 과산화수소를 처리한 대조군1의 생존력은 현저하게 감소하였다.
그러나, 달맞이꽃 추출물을 전처리한 실험군은 NAC를 전처리한 대조군2와 마찬가지로 달맞이꽃 추출물의 농도 의존적으로 생존율이 증가하였다.
실험예 3. 달맞이꽃 추출물의 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능 분석
1) 달맞이꽃 추출물의 환원력 분석
달맞이꽃 추출물의 환원력을 분석하기 위해, Fe3+/페리시안화합물 (ferric cyanide) 복합체가 Fe2+ 형태로 환원되는 정도를 분석하였다.
달맞이꽃 추출물 (0~100 ug/ml)을 0.1M 인산염완충용액 (phosphate buffer, pH 6.6) 50 ml에 용해시키고, 페리시안화 칼륨 (potassium ferricyanide) 0.5 g을 첨가하여 혼합하였다.
혼합액을 50℃에서 30분간 반응시켰고 10% 트리클로로 아세트산 (trichloroacetic acid, 50 ml, 5 g)을 첨가하여 혼합하였다.
혼합액 100 ul에 증류수 100 ul와 0.1% 염화제2철 (ferric chloride, 10 ml, 0.01 g)을 첨가하여 Cytation-3 마이크로플레이트 리더를 사용하여 700 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
대표적 항산화제인 아스코르빈산 (ascorbic acid) 100 ug/ml을 양성대조군, 달맞이꽃 추출물을 실험군으로 하였다.
아스코르빈산이 Fe3+/페리시안화합물 (ferric cyanide) 복합체를 Fe2+ 형태로 환원한 정도를 100%로 놓고 달맞이꽃 추출물의 환원력을 분석하였다.
도 2(a)는 달맞이꽃 추출물의 환원력을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 달맞이꽃 추출물의 환원력은 농도 의존적으로 증가하였고, 60 ug/ml의 농도에서 가장 높은 환원력을 보였다.
2) 달맞이꽃 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 분석
달맞이꽃 추출물의 2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질 (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH) 라디칼 소거능을 분석하기 위해, 달맞이꽃 추출물 (0~100 ug/ml) 100 ul에 DHHP 라디칼 (최종농도 0.2 mM)가 포함된 메탄올 용액 100 ul를 첨가하여 혼합하였다.
혼합액을 25℃에서 30분간 반응시킨 뒤, 분광광도계를 사용하여 517 nm 파장에서 혼합액의 흡광도를 측정하였다.
대표적 항산화제인 아스코르빈산 (ascorbic acid) 100 ug/ml을 양성대조군, 달맞이꽃 추출물을 실험군으로 하였다.
도 2(b)는 달맞이꽃 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 달맞이꽃 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였고, 60 ug/ml의 농도에서 가장 높은 소거능을 보였다.
실험예 4. 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 ROS 생산정도 측정
세포 내 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생산정도를 측정하기 위해 산화민감염료인 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA)를 사용하였다.
배양된 HaCaT 세포에 인산완충식염수 (phosphate-buffered saline, PBS)로 2번 워싱한 후, 10 uM DCF-DA를 첨가한 뒤 37℃에서 30분간 암실에서 반응시켰다.
반응액을 PBS로 워싱한 뒤, FL-1 형광을 유세포측정기 (FACS Calibur)로 측정하였다.
아무것도 처리되지 않은 세포를 정상군, 달맞이꽃 추출물 60 ug/ml만 처리한 세포를 대조군 1, NAC 10 mM만 처리한 세포를 대조군 2, 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 양성대조군, NAC 10 mM을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 음성대조군, 달맞이꽃 추출물 60 ug/ml을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 실험군으로 정하였다.
도 3은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 활성산소종 생산에 미치는 효과를 나타낸 도면으로, (a)는 HaCaT 세포의 활성산소종 생산정도를 나타낸 현광현미경 사진이고 (200배율), (b) 활성산소종의 생산정도를 유세포측정기로 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, (c)는 현광현미경에서 측정된 형광발현정도를 나타낸 그래프이고, (d)는 활성산소종의 생산정도를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 30분동안 과산화수소를 처리한 양성대조군은 세포내 활성산소종 생산에 상당한 증가를 보인 반면에, NAC를 전처리한 음성대조군 및 달맞이꽃 추출물을 전처리한 실험군에서는 활성산소종 생산이 억제되었다.
실험예 5. comet assay를 이용한 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 DNA 손상정도 측정
코밋 어세이 (comet assay)는 단일세포전기영동법 (single cell gel electrophoresis assay)을 이용하여 세포에 DNA 손상정도를 측정하는 실험법이다.
세포가 손상되면 DNA 이중가닥이 절단되어 파편이 생기는데 그 파편이 생긴 흔적이 혜성 (comet)이 지나가는 모양과 흡사하다.
DNA 분자량의 크기가 작을수록 핵으로부터 멀리 이동되므로 손상되어 잘려진 DNA 가닥이 많을수록 혜성 꼬리처럼 긴 모양이 생긴다.
달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 30분동안 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 DNA 손상에 미치는 영향을 분석하기 위해, 코밋 어세이를 수행하였다.
달맞이꽃 추출물을 처리한 HaCaT 세포를 PBS로 워싱한 뒤, 0.5% 아가로오스 젤 (agarose gel)과 혼합하였다.
슬라이드 글라스 (slide glass)에 1% 아가로스 젤로 코팅된 슬라이드 글라스에 혼합액을 올려준 뒤 커버 글라스 (cover glass)로 덮어 4℃에서 10분간 보관하였다.
젤이 굳은 후, 커버글라스를 제거하고 다시 0.5% 아가로오스 젤을 슬라이드 위에 떨어뜨린 후, 4℃에서 40분간 보관하였다.
젤이 굳은 것을 확인하고 용해완충용액 (2.5 M NaCl 및 500 mM Na-ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA))와 1% 트리톤 (triton) X-100을 섞어 커버 글라스를 벗긴 슬라이드 슬라이드 글라스를 담가 4℃에서 1시간 동안 침지시켜 주었다.
이어서, DNA의 이중가닥을 풀기위해 언와인딩 (unwinding) 완충용액 (300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH 13)에 슬라이드 글라스를 침지시킨 뒤 전기영동 탱크에 슬라이드 글라스를 옮겼다.
그런 다음, 25 V/300 mA의 전압에서 20분간 전기영동 하였다.
전기영동이 끝난 뒤, 슬라이드를 25℃에서 5분동안 0.4 M Tris (pH 7.5)으로 3회 워싱하고, 20 ug/ml 요오드화 프로피듐 (propidium iodide, PI)으로 염색하고, 형광현미경 (Carl Zeiss)으로 관찰하였다.
아무것도 처리되지 않은 세포를 정상군, 달맞이꽃 추출물 60 ug/ml만 처리한 세포를 대조군 1, 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 양성대조군, NAC 10 mM을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 음성대조군, 달맞이꽃 추출물 60 ug/ml을 처리한 뒤 과산화수소 0.5 mM을 처리한 세포를 실험군으로 정하였다.
*도 4는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한HaCaT 세포의 comet 생성에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 comet의 생성정도를 나타낸 현광현미경 사진이며, (b)는 comet 꼬리의 운동 (tail moment, TM)을 측정한 그래프이며, (c)는 comet 꼬리의 길이 (tail length, TL)를 측정한 그래프이다.
그 결과, 과산화수소를 처리한 양성대조군의 꼬리 길이와 꼬리 운동값이 증가하였지만, NAC를 전처리한 음성대조군과 달맞이꽃 추출물을 전처리한 실험군의 꼬리 길이와 꼬리 운동값은 감소하였다.
이에 따라, 달맞이꽃 추출물이 DNA 손상을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 단백질 추출 후 western blot 분석
과산화수소 처리된 세포는 산화 스트레스를 받게되고, 세포내 활성산소종이 생성되며, 생성된 활성산소종이 DNA 이중가닥을 절단한다.
이 때, DNA의 이중가닥을 유지시켜주는 단백질인 히스톤 단백질 γH2AX가 인산화 (phosphorylation)되며, γH2AX 단백질이 인산화되는 정도를 분석하여 DNA 손상정도를 판단할 수 있다.
또한, 세포가 산화 스트레스를 받아 활성산소종을 생성하게 되면 세포에 손상을 야기하고, 야기된 손상이 복구되기 힘들 정도로 심각하면 세포사멸이 일어나게 된다.
세포사멸이 진행되면, 세포사멸 인자가 활성화되면 불필요한 세포의 단백질을 분해하기 위해 단백질 분해효소인 캐스페이즈-3 (caspase-3)과 폴리(ADP-리보오스) 중합효소 (poly(ADP-ribose) polymerase, PARP)가 활성화된다.
caspase-3 및 PARP 활성화정도에 따라 세포사멸의 정도를 판단할 수 있다.
또한, 세포가 산화 스트레스를 받게 되면 Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)의 발현이 증가되고, Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) 및 헴산화효소 (heme oxygenase, HO-1)가 활성화되어 산화 스트레스에 대항하는 항산화 활동을 한다.
Nrf2 및 HO-1는 세포의 산화 스트레스를 억제하는 항산화 활성에 중요한 역할을 하며, Nrf2 및 HO-1 발현정도에 따라 세포의 산화 스트레스에 대항하는 항산화 활동을 판단할 수 있다.
달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 30분동안 처리하여 산화 스트레스가 유도된 HaCaT 세포의 DNA 손상, 세포사멸 및 항산화 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해, γH2AX, caspase-3, PARP, Keap1, NrF2 및 HO-1 단백질의 발현정도를 측정하였다.
HaCaT 세포에 용해완충용액 (20 mM sucrose, 1 mM EDTA, 20 μM Tris-Cl (pH 7.2), 1 mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol, DTT), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 및 5 ug/ml 아프로티닌 (aprotinin))을 첨가한 뒤 30분 동안 반응시킨 후, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거한 상층액을 얻었다.
상층액을 단백질 추출 키트 (Bio-Rad Protein Assay Kit)를 사용하여 상층액에 존재하는 단백질을 정량하였다.
30~50 ug의 용해액 (lysate)을 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)로 분리하여, 이를 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 전달하였다.
발현정도를 확인하려는 단백질과 결합하는 1차 항체 및 2차 항체를 처리한 뒤 enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Corp) 용액을 처리한 뒤 X-ray 필름에 감광하였다.
*대조군과 실험군은 실험예 6과 동일하게 설정하였다.
도 5는 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 γH2AX 및 인산화된 γH2AX의 발현정도를 나타낸 전기영동 사진이며, (b)는 γH2AX 발현정도에 따른 인산화된 γH2AX 단백질의 비율의 변화를 나타낸 그래프이며, (c)는 caspase-3 및 PARP의 활성화정도를 나타낸 전기영동 사진이며, (d)는 달맞이꽃 추출물의 처리 시간에 따른 keap1, Nrf2 및 HO-1의 발현정도를 나타낸 전기영동 사진이다.
그 결과, 과산화수소를 처리한 양성대조군은 γH2AX의 인산화가 증가하였으므로 DNA가 손상된 것을 알 수 있었으며, caspase-3 및 PARP가 활성화되어 세포사멸이 진행되고 있는 것을 알 수 있었다.
그러나, NAC를 전처리한 음성대조군과 달맞이꽃 추출물을 전처리한 실험군은 γH2AX의 인산화가 감소하였으므로 DNA가 손상이 억제된 것을 알 수 있었으며, caspase-3 및 PARP가 활성화되지 않아 세포사멸이 억제 된 것을 알 수 있었다.
또한, 달맞이꽃 추출물의 처리 시간에 따라 Nrf2 및 HO-1의 발현이 증가되었으므로 항산화 활동이 활발한 것을 알 수 있었다.
실험예 7. 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 미토콘드리아 막 포텐셜 분석
활성산소종은 세포 내 미토콘드리아를 공격하여 손상을 야기한다.
미토콘드리아에 손상이 야기되면 미토콘드리아 막 포텐셜 (mitochondrial membrane potential, MMT)이 변하는 탈분극 상태가 되는데, 탈분극 정도를 분석하여 미토콘드리아의 손상정도를 측정할 수 있다.
미토콘드리아 막 포텐셜을 알아보기 위해 JC-1이라는 형광염료를 사용할 수 있다.
JC-1은 세포사멸이 일어나지 않은 세포에서는 JC-1이 응집체 형태로 결합되어 붉은색 형광을 띄는 반면에, 세포사멸이 일어나는 세포에서는 JC-1이 단량체로 결합되어 붉은색의 형광이 감소하고 녹색 형광이 증가하게 된다.
이러한 붉은색 형광과 녹생 형광의 발현의 변화를 통해, 미토콘드리아 막 포텐셜의 변화를 측정하여 세포사멸 정도를 분석할 수 있다.
HaCaT 세포를 배양한 뒤, 세포만 모아서 JC-1 (10 ㎍/ml)을 포함하고 있는 인산완충식염수에 현탁하였다.
37℃에서 15분 동안 반응시킨 뒤, 세포만 모아서 인산완충식염수에 현탁하여 유세포측정기를 사용하여 측정하였다.
대조군과 실험군은 실험예 6과 동일하게 설정하였다.
도 6은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 미토콘드리아 막 전위에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 JC-1 응집체가 JC-1 단량체로 변하는 정도를 유세포측정기로 측정하여 나타낸 그래프이며, (b)는 JC-1 응집체가 JC-1단량체로 변하면서 달라지는 붉은색 형광값을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 과산화수소를 처리한 양성대조군은 미토콘드리아 막이 손상되어 전위의 변화가 일어났으며 (탈분극), JC-1의 붉은색 형광값이 감소하였고 녹색 형광값이 증가하였다.
그러나, NAC를 전처리한 음성대조군과 달맞이꽃 추출물을 전처리한 실험군의 미토콘드리아 막의 전위의 변화가 관찰되지 않았으며, JC-1의 붉은색 형광값은 정상군의 값과 유사하였다.
실험예 8. 달맞이꽃 추출물을 처리한 세포의 사멸정도 분석
활성산소종은 세포의 손상을 야기하여 세포사멸 (apoptosis)을 유도한다.
정상세포의 세포막 내에는 포스파티딜세린 (phosphatidylserine)이라는 단백질이 존재하는데, 세포사멸이 유도된 세포는 세포막의 안과 밖이 뒤집혀 세포막 내에 있어야 할 포스파티딜세린이 세포막 밖에 존재하게 된다.
이때, 포스파티딜세린과 결합하는 형광염료인 아넥신 V (annexin V)를 처리하여 발현되는 형광의 정도를 분석하여 세포사멸의 유무를 측정할 수 있다.
달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 30분동안 처리하여 산화 스트레스를 유도한 HaCaT 세포의 사멸에 미치는 영향을 알아보기 위해, 아넥신 V-FITC (annexin V-FITC) 세포사멸 검출 키트 (BD Biosciences)를 사용하였다.
HaCaT 세포에 달맞이꽃 추출물을 24시간동안 처리한 후 인산완충식염수로 워싱하고 아넥신 (annexin) V와 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)가 혼합된 바인딩 (binding) 버퍼 5 ul를 이용하여 암실의 상온에서 15분간 염색시킨 다음, 염색된 세포는 유세포분석기 (FACS calibur)를 이용하여 사멸세포를 나타내는 아넥신 V 양성 세포들을 측정하였다.
대조군과 실험군은 실험예 6과 동일하게 설정하였다.
도 7은 달맞이꽃 추출물이 과산화수소를 처리하여 산화적 스트레스가 유도된 HaCaT 세포의 사멸에 미치는 영향을 나타낸 도면으로, (a)는 4',6'-디아미노-2-페닐인돌 (4',6'-diamidino-2-phenylindol, DAPI)로 염색한 세포 핵을 촬영한 형광현미경 사진이며, (b)는 실험군과 대조군의 세포사멸정도를 측정하여 나타낸 그래프이며, (c) 세포사멸이 유도된 세포의 DNA를 추출하여 전기영동하여 DNA 절단정도를 나타낸 사진이다.
그 결과, 과산화수소를 처리한 양성대조군은 세포사멸이 유도되어 세포 핵이 파괴된 것을 관찰할 수 있었고, 아넥신 V 양성세포 및 DNA 절단정도가 증가하였다.
그러나, NAC를 전처리한 음성대조군과 달맞이꽃 추출물을 전처리한 실험군의 세포 핵은 정상군의 형태와 유사하였으며, 아넥신 V 양성세포 및 DNA 절단정도가 감소하였다.
따라서, 실험예의 결과를 종합해보았을 때, 달맞이꽃 추출물은 세포독성이 없고, 환원력 및 DPPH 라디칼 소거능이 높아 항산화 활성이 뛰어나며, 활성산소종 생산, DNA 손상, 세포사멸 및 미토콘드리아 막 손상을 억제하여 세포의 생존율을 증가시키므로 피부 보호에 효과적인 조성물이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1. 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 화장료 조성물.
본 실시예에 따른 조성물은 상기 실험예의 실험 결과에 근거하여, 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 화장료 조성물이다.
유효성분의 농도는 상기 실험예에 근거하여 볼 때, 인간 피부각질세포 (HaCaT) 3 x 105 cells/ml에 50~70 ug/ml인 것이 바람직하다.
상기 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카,알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등이 사용될 수 있다.
실시예 2. 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 건강식품 조성물
본 실시예에 따른 조성물은 상기 실험예의 실험 결과에 근거하여, 달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보호용 건강기능식품 조성물이다.
유효성분의 농도는 상기 실험예에 근거하여 볼 때, 인간 피부각질세포 (HaCaT) 3 x 105 cells/ml에 50~70 ug/ml인 것이 바람직하다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품 보조 첨가제를 추가하여 식품류, 음료, 껌, 차 또는 비타민 복합제와 같은 건강기능식품을 제조할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 다른 성분을 사용하는 것에 있어 제한이 없으며, 향미제 또는 천연탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다.
상기 향미제는 타우마틴, 스테비아 추출물, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린 또는 아스파르탐 등을 유리하게 사용할 수 있다.
상기 천연탄수화물은 포도당, 과당, 말토스, 슈크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린, 자일리톨, 소르비톨 또는 에리트리톨 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제, 천연 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
Claims (1)
- 달맞이꽃의 뿌리부를 제외한 지상부만을 선별한 뒤 분쇄기를 사용하여 분쇄하여 재료분말을 제조하는 단계;
재료분말 100g을 에탄올 2 L에 넣고 25℃에서 24시간동안 100 rpm에서 진탕혼합하여 달맞이꽃 지상부 용액을 제조하는 단계;
달맞이꽃 지상부 용액을 필터로 여과하여 여과물을 제조하는 단계;
여과물을 진공회전농축시켜 용매를 제거함으로써 달맞이꽃 분말을 제조하는 단계;
달맞이꽃 분말을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹여 100 mg/ml의 달맞이꽃 원액을 제조하는 단계;
달맞이꽃 원액을 희석하여 인간 피부각질세포 (HaCaT) 3 x 105 cells/ml 기준으로 60 ug/ml이 되게하여 DNA의 손상 방지, caspase-3 및 PARP의 불활성화, 미토콘드리아 막 포텐셜의 변화를 억제함으로써 세포사멸을 방지하는 기능을 갖는 달맞이꽃 추출물을 제조하는 단계; 및
달맞이꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 단계;를 포함하는, 피부 세포사멸 방지용 화장료 조성물의 제조방법.
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