KR102529194B1 - 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 RBD-(L)n-X 서열의 핵산 분자(식 중, RBD는 스파이크 단백질에서 수용체 결합 도메인을 포함하는 적어도 일부 영역의 서열이고, L은 링커 서열로 n은 0 또는 1이며, X는 서열번호 1의 염기 서열) 및 그 핵산 분자를 포함하는 바이러스 백신 조성물에 관한 것이다. 이는 바람직하게는 다양한 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 바이러스 감염증의 예방 및 치료용도를 가진 핵산을 담지하는 전달체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
COVID-19를 포함한 최근 바이러스 감염증은 발생 후 단기간에 전세계 유행단계까지 진행되므로 신속한 백신개발을 필요로 한다. 그러나 종래의 백신 개발은 전임상부터 사용까지 기초연구, 임상실험, 허가, 제조, 판매 단계까지 장시간이 소요되는 문제점이 있다.
mRNA 백신은 바이러스의 유전정보가 담긴 mRNA를 사람 몸에 주입하여, 체내에서 스파이크 단백질과 같은 바이러스 단백질이 합성되도록 함으로써, 합성된 단백질들을 인체 면역계가 감지하여 바이러스에 대한 항체를 만들도록 유도하여, 바이러스에 대한 후천적 면역 시스템 구축을 유도하는 기전의 백신이다. 이러한 mRNA 백신 기술을 이용하여, 최근 바이러스 유전자 서열을 분석 후, 유전 물질을 백신 플랫폼, 즉 기존 백신에서 특정 항원이나 유전 정보만 변경하여 대체 가능한 기반 기술을 개발하려는 시도가 있다. 미국 모더나 사는 독성 프로필 분석과 제조 절차가 확립된 mRNA 백신 플랫폼 기술을 기반으로 병원체 식별 후 바이러스 서열 선택에서 1상 임상시험 시작까지 걸리는 기간을 종래 20개월에서 3개월까지 단축시켰다.
그러나 mRNA 의 분자 구조 특성 상 불안정하여 쉽게 분해될 수 있거나, 타겟 세포로의 전달 효율이 높지 않거나, 또는 mRNA 서열에 의하여 코딩되는 아미노산이 높은 항원성 내지는 면역원성을 가지지 못하는 경우와 같은 문제점이 존재하는 바, 더욱 우수한 mRNA 백신 기술을 위한 연구가 시급한 현황이다.
본 발명은 안정한 구조를 형성하는 바이러스 수용체 결합 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 핵산 분자를 담지한 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 하기와 같은 서열의 핵산 분자:
RBD-(L)n-X
(식 중, RBD는 스파이크 단백질에서 수용체 결합 도메인을 포함하는 적어도 일부 영역의 서열이고, L은 링커 서열로 n은 0 또는 1이며, X는 서열번호 1의 염기 서열임).
2. 위 1에 있어서, 상기 RBD는 그 수용체 결합 도메인이 삼중체를 형성하는 바이러스 유래 서열인 핵산 분자.
3. 위 1에 있어서, 상기 RBD는 그 길이가 100 nt 내지 5,000 nt인 핵산 분자.
4. 위 1에 있어서, 상기 RBD는 서열번호 2의 염기서열인 핵산 분자.
5. 위 1에 있어서, 상기 L은 서열번호 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열인 핵산 분자.
6. 위 1에 있어서, 상기 RBD는 herpesviridae, orthomyxoviridae, rhabdoviridae, paramyxoviridae, papilomaviridae, adenoviridae, parvoviridae, astroviridae, reoviridae, bunyaviridae, arteriviridae, caliciviridae, hepeviridae, bornaviridae, arenaviridae, togaviridae, filoviridae, retroviridae, flaviviridae 및 coronaviridae 로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 유래 서열인 핵산 분자.
7. 위 1에 있어서, 상기 RBD는 Colacovirus, Decacovirus, Duvinacovirus, Luchavirus, Minacovirus, Minunacovirus, Myotacovirus, Nyctacovirus, Pedacovirus, Rhinacovirus, Setracovirus, Soracovirus, Tegacovirus, Embecovirus, Hibecovirus, Merbecovirus, Nobecovirus, Sarbecovirus, Brangacovirus, Cegacovirus, Igacovirus, Andecovirus, Buldecovirus 및 Herdecovirus로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 유래 서열인 핵산 분자.
8. 위 1 내지 7 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 바이러스 백신 조성물.
9. 위 8에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 전달체, 바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP), 양전하성 폴리머, 리포좀, 지질나노입자(lipid nanoparticle), 금, 반도체 나노결정 입자(quantum dot), 탄소나노튜브 및 다공성 실리카 입자로 이루어진 군에서 선택되는 전달체에 담지된 것인 바이러스 백신 조성물.
10. 위 8에 있어서, 상기 핵산 분자는 다공성 실리카 입자에 담지된 것인 바이러스 백신 조성물.
11. 위 10에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 기공의 평균 직경이 5 nm 내지 100 nm인 바이러스 백신 조성물.
12. 위 10에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 기공 내부가 양전하로 대전된 것인 백신 조성물.
13. 위 10에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 생분해성 입자인 백신 조성물.
14. 위 10에 있어서, 상기 핵산 분자와 상기 다공성 실리카 입자의 중량비는 1: 1 내지 30인 바이러스 백신 조성물.
본 발명은 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함하는 적어도 일부 영역의 서열을 코딩하는 염기서열, 링커서열 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 이는 바람직하게는 전달체에 담지하여 바이러스 감염증에 대하여 높은 예방율을 가지는 백신 조성물로서 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 제조 공정 중의 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 기공 직경별 현미경 사진이다. DDV(Degradable Delivery Vehicle)는 실시예의 입자로서 괄호안의 숫자는 입자의 직경, 아래첨자의 숫자는 기공 직경을 의미한다. 예를 들어, DDV(200)10은 입자 직경은 200 nm, 기공 직경은 10 nm인 실시예의 입자를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 생분해성을 확인할 수 있는 현미경 사진이다.
도 7은 일 예시에 따른 원통형 투과막을 구비한 튜브이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 입경별 흡광도 감소 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 기공 직경별 흡광도 감소 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 환경의 pH별 흡광도 감소 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자 대 RBD-Ln-X 핵산의 중량비; 및 핵산 서열에 따른 다공성 실리카 입자 담지 효율을 확인한 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Covid mRNA를 담지하고, 핵산 서열, 저장 온도, 버퍼의 sucrose 함량을 각각 달리 하였을 때, 다공성 실리카 입자의 담지 효율을 확인한 것이다.
도 15는 in vitro에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 RBD-Ln-X 핵산을 담지하여 전달하였을 때 RBD 번역 효율을 확인한 것이다.
도 16은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 RBD-Ln-X 핵산을 담지하여 전달하였을 때 RBD에 특이적인 IgG 양을 확인한 것이다.
도 17은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Seq.3을 담지하여 전달하였을 때, Seq.3 의 용량에 따른 항체 생성량을 확인한 것이다.
도 18은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Seq.3을 담지하여 전달하였을 때, 시간 경과에 따른 결합항체 생성량을 확인한 것이다.
도 19는 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Seq.3을 담지하여 전달하였을 때, 시간 경과에 따른 중화항체 생성량을 확인한 것이다.
도 20은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 근육하 주사 하였을 때, 루시퍼레이즈 발현 위치 및 그 기간을 확인한 것이다.
도 21은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 종양내 주사 하였을 때, 루시퍼레이즈 발현 위치 및 그 기간을 확인한 것이다.
도 22는 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 근육하 주사 하였을 때, 루시퍼레이즈 발현 기간 및 발현 세기를 확인한 것이다.
도 23은 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 4 ℃ 또는 25 ℃ 에서 각각 7 일 및 14 일간 보관하였을 때, 주사 후 시간 경과에 따른 루시퍼레이즈의 발현 위치 및 그 발현량을 확인한 것이다.
도 24는 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 보관 시간 및 보관 온도에 따른 주사 후 루시퍼레이즈 발현량을 확인한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 제조 공정 중의 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 소기공 입자의 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 기공 직경별 현미경 사진이다. DDV(Degradable Delivery Vehicle)는 실시예의 입자로서 괄호안의 숫자는 입자의 직경, 아래첨자의 숫자는 기공 직경을 의미한다. 예를 들어, DDV(200)10은 입자 직경은 200 nm, 기공 직경은 10 nm인 실시예의 입자를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 생분해성을 확인할 수 있는 현미경 사진이다.
도 7은 일 예시에 따른 원통형 투과막을 구비한 튜브이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 입경별 흡광도 감소 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 기공 직경별 흡광도 감소 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 환경의 pH별 흡광도 감소 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자의 시간 경과에 따른 흡광도 감소 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자 대 RBD-Ln-X 핵산의 중량비; 및 핵산 서열에 따른 다공성 실리카 입자 담지 효율을 확인한 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Covid mRNA를 담지하고, 핵산 서열, 저장 온도, 버퍼의 sucrose 함량을 각각 달리 하였을 때, 다공성 실리카 입자의 담지 효율을 확인한 것이다.
도 15는 in vitro에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 RBD-Ln-X 핵산을 담지하여 전달하였을 때 RBD 번역 효율을 확인한 것이다.
도 16은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 RBD-Ln-X 핵산을 담지하여 전달하였을 때 RBD에 특이적인 IgG 양을 확인한 것이다.
도 17은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Seq.3을 담지하여 전달하였을 때, Seq.3 의 용량에 따른 항체 생성량을 확인한 것이다.
도 18은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Seq.3을 담지하여 전달하였을 때, 시간 경과에 따른 결합항체 생성량을 확인한 것이다.
도 19는 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Seq.3을 담지하여 전달하였을 때, 시간 경과에 따른 중화항체 생성량을 확인한 것이다.
도 20은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 근육하 주사 하였을 때, 루시퍼레이즈 발현 위치 및 그 기간을 확인한 것이다.
도 21은 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 종양내 주사 하였을 때, 루시퍼레이즈 발현 위치 및 그 기간을 확인한 것이다.
도 22는 in vivo에서 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 근육하 주사 하였을 때, 루시퍼레이즈 발현 기간 및 발현 세기를 확인한 것이다.
도 23은 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 4 ℃ 또는 25 ℃ 에서 각각 7 일 및 14 일간 보관하였을 때, 주사 후 시간 경과에 따른 루시퍼레이즈의 발현 위치 및 그 발현량을 확인한 것이다.
도 24는 발명의 일 구현예에 따른 다공성 실리카 입자에 Luc mRNA를 담지하여 보관 시간 및 보관 온도에 따른 주사 후 루시퍼레이즈 발현량을 확인한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적인 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 의미를 따른다.
본 발명은 하기와 같은 서열의 핵산 분자:
RBD-(L)n-X
(식 중, RBD는 스파이크 단백질에서 수용체 결합 도메인을 포함하는 적어도 일부의 서열이고, L은 링커 서열로 n은 0 또는 1이며, X는 서열번호 1의 염기 서열임).
에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 RBD는 숙주세포에 존재하는 수용체에 결합하는 바이러스 유래 도메인을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것이라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 RBD는 바람직하게는, 바이러스 표면에서 삼중체를 형성하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 염기서열일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 RBD는 스파이크 단백질에서 수용체 결합 도메인 부위 중 적어도 일부를 포함하는 것이라면, 백신으로서의 효과가 발휘될 수 있는 것으로서, 서열의 길이에 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 예를 들면, 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 부위의 N-말단 또는 C-말단의 아미노산을 코딩 하는 염기서열을 상기 RBD 서열의 5'- 또는 3'- 말단에 추가로 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, RBD 서열의 길이는 100 nt 내지 5,000 nt 일 수 있고, 200 nt 내지 4,000 nt, 300 nt 내지 3,000 nt, 400 nt 내지 2,000 nt, 500 nt 내지 100 nt 등일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 RBD는 바이러스의 종류와 관계 없이, 바이러스 표면에 위치하는 스파이크 단백질을 구성하는 도메인이라면, 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 예를 들면, herpesviridae, orthomyxoviridae, rhabdoviridae, paramyxoviridae, papilomaviridae, adenoviridae, parvoviridae, astroviridae, reoviridae, bunyaviridae, arteriviridae, caliciviridae, hepeviridae, bornaviridae, arenaviridae, togaviridae, filoviridae, retroviridae, flaviviridae 및 coronaviridae 를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 과에 속하는 바이러스 유래 서열일 수 있고, 보다 구체적으로 Colacovirus, Decacovirus, Duvinacovirus, Luchavirus, Minacovirus, Minunacovirus, Myotacovirus, Nyctacovirus, Pedacovirus, Rhinacovirus, Setracovirus, Soracovirus, Tegacovirus, Embecovirus, Hibecovirus, Merbecovirus, Nobecovirus, Sarbecovirus, Brangacovirus, Cegacovirus, Igacovirus, Andecovirus, Buldecovirus 및 Herdecovirus 를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 유래 서열일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
상기 RBD와 서열번호 1의 염기서열이 연결된 것이라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 예를 들면, RBD를 코딩하는 염기서열과 서열번호 1의 염기서열이 직접 연결될 수 있고, 또는 상기 서열번호 1의 염기서열에 링커를 통해 연결된 것일 수 있다. 상기 링커로는 당 분야에 공지된 것을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 포화알킬체인(C3 내지 C18), 트리졸 링커(trizole linker), 4-methyl-6,7,8,9,10,10a-hexahydro-5H-3λ2-cycloocta[d]pyridazine linker 등을 사용할 수 있다. 체내 부반응, 부작용 최소화의 측면에서 바람직하게는 포화알킬체인을 사용할 수 있다. 포화알킬체인으로는 C3 내지 C18, C3 내지 C15, C3 내지 C12, C3 내지 C10, C4 내지 C15, C4 내지 C12, C4 내지 C10, C4 내지 C8, C5 내지 C15, C5 내지 C12, C5 내지 C10, C3 내지 C8, C3 내지 C6, C4 내지 C6의 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는 서열번호 3 내지 5의 염기서열에 의해 결합되어, 상기 염기서열로 코딩되는 아미노산이 링커로 사용되는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열에 의해 결합되어 상기 염기서열로 코딩되는 아미노산을 링커로 사용하는 경우, 백신으로서의 효율이 더욱 개선될 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 1의 염기서열은 상기 RBD에 연결됨으로써, RBD 번역 효율 및/또는 백신 생성 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 효율의 개선은 상기 핵산으로부터 코딩되는 아미노산 서열이 삼중체를 형성하도록 유도함으로써 발생할 수 있고, 삼중체를 형성한 바이러스 수용체 결합 도메인의 결합 안정성이 증가함으로써 발생하는 것일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 핵산은 시그널 펩티드 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 시그널 펩티드 서열은 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단 부위에 삽입되는 염기 서열일 수 있고, 그 길이에는 제한되지 않는다. 상기 시그널 펩티드 서열은 목적에 따라 제한 없이 그러한 효과를 가지는 핵산을 삽입할 수 있다. 예를 들면, 핵산 및/또는 그로부터 코딩 되는 아미노산의 안정성 개선을 위한 것이거나, 아미노산의 번역 효율을 증가시키기 위한 것일 수 있고, 또는 합성된 아미노산을 세포 밖으로 분비시키기 위한 용도일 수 있다. 상기 시그널 펩티드 서열의 길이의 예를 들면 그 길이는 1 내지 200 nt, 10 내지 150 nt 또는 20 내지 100 nt 등일 수 있다. 보다 구체적으로는 서열번호 6의 서열을 상기 핵산의 5'말단에 추가한 것일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 핵산은 3'- 말단에 종결코돈을 더 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 서열번호 1의 3'- 말단에 TGA, TAG, TAA 서열이 추가될 수 있고, 상기 서열은 1회 내지 복수 회 반복될 수 있다.
본 발명에서 상기 핵산 분자를 구성하는 염기는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 그 염기 서열 내에 화학적 변형이 일어난 염기를 포함하는 경우에도 제한 없이 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 화학적 변형이 일어난 염기의 예를 들면, 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 또는 2'-O-메틸 우리딘일 수 있다. 상기 화학적 변형이 된 염기에 의하여, 상기 핵산의 번역 효율이 증가할 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 앞서 언급한 핵산 분자를 포함하는 바이러스 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 바이러스 백신 조성물은 타깃 세포 내부로 유입될 경우, 상기 조성물에 포함된 RBD-(L)n-X 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 합성할 수 있다. 상기 아미노산 서열은 면역세포에 의해 인식될 경우, 높은 항원성(antigenicity) 내지는 면역원성(immunogenicity)을 가짐으로써 상기 RBD를 포함하는 바이러스에 의해 유발되는 감염증에 대한 백신 역할을 수행할 수 있다. 본 발명의 상기 바이러스 백신 조성물은 앞서 언급하였던 것처럼, RBD 단독으로 존재하는 것에 비하여 더 높은 번역 효율 및/또는 백신 생성 효율을 보일 수 있다.
본 발명의 상기 바이러스 백신 조성물은 상기 핵산 분자가 전달체에 담지된 것일 수 있다. 상기 전달체는 담지된 백신 조성물을 타깃 세포에 전달할 수 있는 것이라면 그 종류와 무관하게 본 발명의 범위에 속할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 전달체, 바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP), 양전하성 폴리머, 리포좀, 지질나노입자(lipid nanoparticle), 금, 반도체 나노결정 입자(quantum dot), 탄소나노튜브 또는 다공성 실리카 입자를 들 수 있고, 바람직하게는 다공성 실리카 입자에 담지된 것일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
상기 핵산 분자는 상기 전달체에 담지되기 위하여 5'-말단 및/또는 3'-말단에 전달체와 결합할 수 있는 작용기가 더 결합된 것일 수 있다. 이는 생물학, 화학 분야에서 서로 커플링이 가능한 작용기 또는 이를 갖는 화합물이 제한 없이 적용될 수 있으며, 그러한 작용기 간의 커플링 반응으로 핵산 분자가 전달체에 담지될 수도 있다.
본 발명에서 상기 다공성 실리카 입자는 실리카(SiO2) 소재의 입자로서, 나노 사이즈의 기공을 가지고 있으며, 그 표면 및/또는 기공 내부에 핵산이 담지될 수 있는 전달체에 해당한다. 상기 입자는 복수개의 기공을 가질 수 있고, 상기 기공은 입자 표면에서 내부까지 이어진 것일 수 있고, 서로 연결된 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 다공성 실리카 입자 내에 상기 핵산을 담지하여 전달하는 경우, 실리카 입자에 담지하지 않는 경우에 비해, 세포 내로의 전달 효율을 개선시킬 수 있고, 점진적으로 내부에 담지된 핵산을 방출시킬 수 있어, 혈중체류시간이 증가될 수 있다. 또한, 실리카 입자는 앞서 언급한 타 전달체에 비하여도 더 높은 전달효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 상기 다공성 실리카 입자의 평균 입자 직경은 제한 없이 본 발명의 범위에 포함되고, 담지되는 핵산의 종류 또는 양 등의 조건에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있다. 평균 입자 직경의 예를 들면, 50 nm 내지 1,000 nm일 수 있다. 평균 입자 직경은 내부에 담지하는 핵산의 중량 등의 조건에 따라 당업자에 의하여 선택될 수 있다. 평균 입자 직경의 하한의 예를 들면, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm 또는 90 nm 일 수 있고, 상한의 예를 들면, 1,000 nm, 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm 일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 평균 기공 직경을 가짐으로써, 그 기공 내부에 상기 핵산 분자를 충분히 담지하고 전달할 수 있다. 기공 직경은 앞서 언급한 평균 입자 직경의 사이즈에 따라서 그보다 작은 범위에서 선택될 수 있고, 직경이 클수록 핵산의 담지가 용이하고, 더 많은 중량의 핵산을 담지할 수 있으나, 그와 비례하여 핵산의 방출 속도가 빠를 수 있다. 상기 기공 직경은 당업자의 목적에 따라서 제한 없이 선택될 수 있고, 그 하한의 예를 들면, 5 nm, 7 nm, 10 nm, 12 nm, 15 nm, 17 nm 또는 20 nm일 수 있고, 상한의 예를 들면, 100 nm, 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm 또는 50 nm일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
다공성 실리카 입자는 기공 내부가 양전하로 대전된 것일 수 있다. 예를 들면 제타 전위는 5 mV 내지 80 mV일 수 있다. 상기 범위 내에서 예를 들면 5 mV 내지 80 mV, 5 mV 내지 70 mV, 5 mV 내지 60 mV, 5 mV 내지 55 mV, 10 mV 내지 80 mV, 10 mV 내지 70 mV, 10 mV 내지 60 mV, 10 mV 내지 55 mV, 20 mV 내지 80 mV, 20 mV 내지 70 mV, 20 mV 내지 60 mV, 20 mV 내지 55 mV, 30 mV 내지 80 mV, 30 mV 내지 70 mV, 30 mV 내지 60 mV, 30 mV 내지 55 mV, 40 mV 내지 80 mV, 40 mV 내지 70 mV, 40 mV 내지 60 mV, 40 mV 내지 55 mV, 50 mV 내지 80 mV, 50 mV 내지 70 mV, 50 mV 내지 60 mV, 50 mV 내지 55 mV 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전하를 띠는 입자가 타겟 세포 내로 흡수(예를 들어, endocytosis 등의 과정을 통해)될 때 세포 내부로 들어간 입자는 엔도좀 내에서의 낮은 pH 때문에 강한 양전하를 띄게 되고, 이는 엔도좀의 막을 가로지르는 물의 확산에 의한 삼투압을 유발하게 되어 액포(vacuole, 공포)의 형성으로 이어질 수 있다.
입자의 양전하가 강한 경우에, 세포막이 입자를 감쌀 때 보다 크게 벌어져서 입자 외의 세포외액(extracellular fluid), 또는 그에 포함된 여러 단백질 등의 이물질이 타겟 세포 내로 함께 유입될 수 있고, 그러한 경우에는 이물 유입에 따른 예상치 못한 효과가 발생하거나, 이물이 유입되지 않는 경우에 비해 입자는 상대적으로 적게 유입되는 것으로서 입자의 충분한 전달에 의한 약효 발생이 어려울 수 있다. 반면, 입자의 양전하가 약한 경우에, 담지 효율이 떨어질 수 있다. 그러나 본 발명은 상기 핵산을 담지한 전달체의 전하를 최적화함으로써 상기 문제들을 방지할 수 있다.
상기 핵산 분자의 상기 입자에의 담지 비율은 예를 들면 핵산 분자와 다공성 실리카 입자의 중량비가 1: 1 내지 30일 수 있다. 함량비가 상기 범위 내인 경우에 핵산 분자가 충분히 다 담지되면서, 핵산 분자가 담지되지 않은 빈 다공성 실리카 입자가 발생하는 것을 방지할 수 있으며, 이에 의해 강한 양전하를 가진 입자가 세포로 전달되는 것을 방지할 수 있다. 상기 범위 내에서 예를 들면 1:1 내지 30, 1: 3 내지 20, 1: 3 내지 15, 1: 3 내지 12, 1: 3 내지 10, 1: 5 내지 20, 1: 5 내지 15, 1: 5 내지 10 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 전달체를 개체에 투여하기 위해 핵산 분자를 담지한 다공성 실리카 입자는 분산매에 분산되어 있는 것일 수 있고, 이는 다공성 실리카 입자와 핵산 분자를 분산매에 넣고 교반하여 얻어진 것일 수 있다. 이와 관련하여, 핵산 분자 대비 입자의 양이 너무 많으면 핵산 분자를 충분히 담지하지 못한 빈 입자가 발생할 수 있고, 핵산 분자 대비 입자의 양이 너무 적으면 입자에 담지되지 못하는 잔여 핵산 분자가 발생하게 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다공성 실리카 입자는 하기 스펙을 갖는 것일 수 있다. 예를 들어 기공 크기가 7 nm 내지 30 nm, 구체적으로 12 nm 내지 18nm, 더욱 구체적으로 14 nm 내지 16nm일 수 있다. 입경은 50 nm 내지 1,000 nm, 구체적으로, 200 내지 500nm, 더욱 구체적으로, 250 nm 내지 350 nm일 수 있다. 표면적은 200 m2/g 내지 700 m2/g, 구체적으로, 360 m2/g 내지 480 m2/g일 수 있다. 제타 전위는 핵산 분자 담지 전 상태에서 5 mV 이상, 구체적으로 20 mV 내지 70 mV, 더욱 구체적으로 40 mV 내지 60 mV 일 수 있다. 입자는 핵산 분자를 중량비 1: 1 내지 30, 보다 구체적으로 1: 5 내지 25, 1: 5 내지 20, 1: 10 내지 25, 1: 10 내지 20이 되도록 담지할 수 있다.
다공성 실리카 입자는 생분해성 입자일 수 있다. 이에, 핵산 분자를 담지하여 체내에 투여되었을 때 체내에서 생분해되면서 핵산 분자를 방출할 수 있는데, 체내에서 서서히 분해되어 담지된 핵산 분자가 서방적으로 방출되도록 할 수 있다. 예를 들면, 하기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이다:
[수학식 1]
At/A0
(A0는 상기 다공성 실리카 입자 1 mg/mL 현탁액 5 mL를 직경 50 kDa 의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고, 상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15 mL가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37 ℃에서 60 rpm 수평 교반되며, 상기 현탁액의 pH는 7.4이고, At는 상기 A0의 측정 시로부터 t시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
상기 수학식 1은 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것으로서, 상기 수학식 1에서의 흡광도 A0, At는 원통형 투과막에 다공성 실리카 입자 및 현탁액을 넣고, 투과막 외부에도 동일한 현탁액을 넣고 측정된 것일 수 있다.
다공성 실리카 입자는 생분해성으로서, 현탁액 내에서 서서히 분해될 수 있고, 직경 50 kDa는 약 5 nm에 해당하는 것으로서 생분해된 다공성 실리카 입자는 직경 50 kDa의 투과막을 통과할 수 있고, 원통형 투과막은 60 rpm 수평 교반 하에 있으므로 현탁액이 고루 섞일 수 있으며 분해된 다공성 실리카 입자는 투과막 외부로 나올 수 있다.
상기 수학식 1에서의 흡광도는 예를 들어 투과막 외부의 현탁액이 새로운 현탁액으로 교체되는 환경 하에 측정된 것일 수 있다. 현탁액은 지속적으로 교체되는 것일 수 있고, 일정 기간마다 교체되는 것일 수 있으며, 상기 일정 기간은 정기 또는 비정기적인 기간일 수 있다. 예를 들어 1시간 내지 1주일의 범위 내에서, 1시간 간격, 2시간 간격, 3시간 간격, 6시간 간격, 12시간 간격, 24시간 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 7일 간격 등으로 교체될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 흡광도의 비가 1/2가 된다는 것은 t시간 후에 흡광도가 초기 흡광도의 절반이 된다는 것인 바, 이는 다공성 실리카 입자의 대략 절반이 분해되었다는 의미이다.
상기 현탁액은 완충용액일 수 있고, 구체적인 예를 들면, PBS(phosphate buffered saline) 및 SBF(simulated body fluid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 PBS일 수 있다.
상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상으로, 예를 들면 t는 20 내지 120일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 20 내지 96, 24 내지 96, 24 내지 72, 30 내지 70, 40 내지 70, 50 내지 65 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/5가 되는 t가 예를 들면 70 내지 140일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 80 내지 140, 80 내지 120, 80 내지 110, 70 내지 140, 70 내지 120, 70 내지 110 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 상기 수학식 1의 흡광도의 비가 1/20가 되는 t가 예를 들면 130 내지 220일 수 있고, 예를 들어 상기 범위 내에서 130 내지 200, 140 내지 200, 140 내지 180, 150 내지 180 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 측정되는 흡광도가 0.01 이하가 되는 t가 예를 들면 250 이상, 예를 들어, 300 이상, 350 이상, 400 이상, 500 이상, 1,000 이상 등일 수 있으며, 그 상한은 2,000일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자에서 상기 수학식 1의 흡광도의 비와 t는 높은 양의 상관 관계를 갖는 것으로서, 예를 들면 피어슨 상관 계수가 0.8 이상일 수 있고, 예를 들어, 0.9 이상, 0.95 이상일 수 있다.
상기 수학식 1의 t는 다공성 실리카 입자가 체내와 유사한 환경에서 어느 정도의 속도로 분해되는지를 의미하는 것으로서, 이는 예를 들면 다공성 실리카 입자의 표면적, 입경, 기공 직경, 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 표면의 치밀함 정도 등을 조절함으로써 조절될 수 있다. 예를 들면, 입자의 표면적을 증가시켜 t를 감소시키거나, 표면적을 감소시켜 t를 증가시킬 수 있다. 표면적은 입자의 직경, 기공의 직경을 조절함으로써 조절될 수 있다. 또한, 표면 및/또는 기공 내부에 치환기를 위치시켜 다공성 실리카 입자가 환경(용매 등)에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 다공성 실리카 입자에 핵산 분자를 담지시키고 핵산 분자와 다공성 실리카 입자 간의 친화도를 증가시켜, 다공성 실리카 실리카 입자가 환경에 직접 노출되는 것을 줄여 t를 증가시킬 수 있다. 또한, 입자의 제조시에 표면을 보다 치밀하게 제조하여 t를 증가시킬 수도 있다. 상기에는 수학식 1의 t를 조절할 수 있는 다양한 예시를 서술하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 예를 들면 구형 입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 예를 들면 BET 표면적은 200 m2/g 내지 700 m2/g일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 상기 범위 내에서 200 m2/g 내지 700 m2/g, 220 m2/g 내지 680 m2/g, 220 m2/g 내지 620 m2/g, 280 m2/g 내지 680 m2/g, 280 m2/g 내지 580 m2/g, 280 m2/g 내지 520 m2/g, 280 m2/g 내지 480 m2/g, 320 m2/g 내지 620 m2/g, 320 m2/g 내지 580 m2/g, 320 m2/g 내지 520 m2/g, 320 m2/g 내지 480 m2/g, 320 m2/g 내지 450 m2/g, 320 m2/g 내지 420 m2/g, 360 m2/g 내지 480 m2/g, 360 m2/g 내지 420 m2/g 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다공성 실리카 나노입자는 기공의 g당 부피가 예를 들면 0.7 mL 내지 2.2 mL일 수 있다. 예를 들어 상기 범위 내에서 0.7 mL 내지 2.0 mL, 0.8 mL 내지 2.2 mL, 0,8 mL 내지 2.0 mL, 0.9 mL 내지 2.0 mL, 1.0 mL 내지 2.0 mL 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 평균 기공 직경 5 nm 미만의 소기공 입자의 기공이 평균 직경 7 nm 내지 30 nm로 확장된 것일 수 있다. 이에 의해 기공 직경이 커서 큰 핵산 분자를 기공 내부에 담지할 수 있으며, 기공 직경에 비해 입경 자체는 크지 않아 세포 내로의 전달 및 흡수가 용이하다.
본 발명의 다공성 실리카 입자는 외부 표면 및/또는 기공 내부가 양전하로 대전된 것일 수 있다. 예를 들면 표면 및 기공 내부 모두 양전하로 대전되거나, 표면 또는 기공 내부만 양전하로 대전될 수 있다. 상기 대전은 예를 들면 양이온성 치환기가 존재함으로써 된 것일 수 있다.
상기 양이온성 치환기는 예를 들면 염기성기로서 아미노기, 그 외 질소함유기 등일 수 있고, 상기 음이온성 치환기는 예를 들면 산성기로서 카르복시기(-COOH), 술폰산기(-SO3H), 티올기(-SH) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 양전하로의 대전은 예를 들면 아미노기, 아미노알킬기 등 질소 함유기 등의 염기성기를 갖는 알콕시실란과 반응시켜 수행할 수 있다. 구체적으로는 N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine, N1-(3-Trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine, (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, (3-Aminopropyl)triethoxysilane, N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]aniline, Trimethoxy[3-(methylamino)propyl]silane, 3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane 등을 사용할 수 있다. 또한, 질소 함유기 등의 염기성기를 갖는 고분자와 반응시켜 수행시킬 수 있다. 예를 들면, polyetherimide(PEI), polydiallydimethylammonium chloride(PDADMAC), poly-acrylamide(CPAM), polyamine epichlorohydrin(PAE), poly-aluminium chloride(PAC) 등을 사용할 수 있다. 상기 고분자는 다공성 실리카 입자의 외부 표면 및/또는 기공 내부를 개질할 수 있는 것이라면, 그 분자량, 전하 등의 성질과 무관하게 선택할 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 실리카 입자를 상기 고분자와 반응시켜 양전하로 대전하는 경우, 아민기를 포함하는 화합물과 반응시키는 것에 비해 더 높은 전하로 대전될 수 있다. 이는 상기 다공성 실리카 입자에 핵산을 담지하는 경우에, 핵산과 아민기 간 전기적인 결합으로 더 높은 담지 효율을 보일 수도 있다. 상기 대전에 의해 상기 치환기의 조절로 핵산 분자의 방출 환경에 대한 다공성 실리카 입자의 상호 작용이 조절되어 나노입자 자체의 분해 속도가 조절되어 핵산 분자의 방출 속도가 조절될 수 있고, 또한, 핵산 분자는 나노입자로부터 확산되어 방출될 수도 있는데, 상기 치환기의 조절로 핵산 분자의 나노입자에 대한 결합력이 조절되어 핵산 분자의 방출이 조절될 수 있다.
또한, 다공성 실리카 입자는 그 표면 및/또는 기공 내부에 상기 외에 핵산 분자의 담지, 핵산 분자의 표적 세포로의 이동, 그 외 기타 목적을 위한 물질의 담지 또는 그외 추가 치환기의 결합 등을 위한 치환기가 존재할 수 있으며, 이에 결합된 항체, 리간드, 세포투과성 펩타이드 또는 압타머 등을 더 포함할 수 있다.
전술한 표면 및/또는 기공 내부의 치환기, 전하, 결합물질 등은 예를 들면 표면 개질에 의해 부가될 수 있다. 표면 개질은 예를 들면 도입하고자 하는 치환기를 갖는 화합물 또는 고분자를 입자와 반응시켜 수행할 수 있고, 상기 화합물은 예를 들면 C1 내지 C10 알콕시기를 갖는 알콕시실란일 수 있고, 상기 고분자는 예를 들면 polyetherimide(PEI), polydiallydimethylammonium chloride(PDADMAC), poly-acrylamide(CPAM), polyamine epichlorohydrin(PAE), poly-aluminium chloride(PAC) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 알콕시실란은 상기 알콕시기를 1개 이상 갖는 것으로서, 예를 들면 1 내지 3개 가질 수 있고, 알콕시기가 결합되지 않은 부위에 도입하고자 하는 치환기가 있거나 이로 치환된 치환기가 있을 수 있다.
상기 고분자로 다공성 실리카 입자의 표면 및/또는 기공 내부를 개질하는 경우, 예를 들면 분자량이 100,000 이상인 고분자를 사용하는 경우, 기공 내부에 핵산이 담지될 공간을 확보하지 못하여 담지 효율이 떨어질 수 있다. 사용 가능한 고분자의 분자량은 예를 들면 100,000 이하, 90,000 이하, 70,000 이하, 60,000 이하, 50,000 이하 또는 40,000 이하 등일 수 있다. 그 하한은 예를 들면 500, 이상, 1,000 이상, 2,000 이상, 3,000 이상, 4,000 이상 또는 5,000 이상 등일 수 있다. 상기 표면 개질 방법은 당업자에 의해 공지된 방법에 의하여 제한 없이 수행될 수 있다. 예를 들면, 개질하고자 하는 화합물 또는 고분자가 용해/분산 되어있는 용액에 상기 다공성 실리카 입자를 투입하고, 건조함으로써 개질할 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
다공성 실리카 입자는 예를 들면 소기공의 입자 제조 및 기공 확장공정을 거쳐 제조된 것일 수 있고, 필요에 따라 하소(calcination) 공정, 표면 개질 공정 등을 더 거쳐 제조된 것일 수 있다. 하소 및 표면 개질 공정을 모두 거친 경우는 하소 이후에 표면 개질 된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 백신 조성물은 mRNA를 주성분으로 하는 종래 백신 조성물에 비하여 높은 온도에 보관하더라도, 일정 기간 동안 그 효과를 유지할 수 있다. 예를 들면, -70 ℃내지 25 ℃에서 2 주간 보관하더라도, 다공성 실리카 입자에 담지된 핵산의 양이 감소하지 않을 수 있으며, 다공성 실리카 입자에서 담지된 핵산이 분해 또는 서열이 변형되지 않고, 정상적인 단백질을 합성할 수도 있다. 바람직하게는 보관 온도가 저온인 것이 유리할 수 있으나 25 ℃, 20 ℃, 15 ℃, 10 ℃, 4 ℃ 또는 0 ℃ 에서도 보관이 가능할 수 있다.
본 발명의 상기 백신 조성물은 상기 핵산의 높은 번역 효율 및/또는 중화항체 생성능력; 또는 전달체의 높은 전달 효율 등에 의해 상기 조성물에 어쥬번트(adjuvant)가 포함되지 않더라도 높은 면역반응을 유발할 수 있는 것에 해당하나, 어쥬번트를 추가로 더 포함하여 면역반응을 더욱 높게 유발시킬 수도 있다. 상기 어쥬번트는 당업자에 의하여 백신 조성물의 효과를 증진시키기 위한 것이라면 제한 없이 선택될 수 있다. 어쥬번트의 예를 들면, Alum(Aluminium salts), IL-12, GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 스쿠알렌(squalene), MF59, AS03, AS04, poly(I:C), MPL(Monophosphoryl Lipid A), GLA, flagellin, Imiquimod, R848, CpG ODN, CpG DNA, saponins (QS-21), C-type lectin ligands (TDB), α-galactosylceramide, 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 리포폴리사카라이드(LPS), 쿠일 A, AS01(liposome mixed with monophosphoryl lipid A and saponin QS-21), IC31 (oligo nucleotide and cationic peptide), CFA01 (cationic liposome) 및 GLA-SE (oil-in-water emulsion of MPL and glucopyranosyl lipid) 으로 이루어진 군에서 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육하, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
상기 백신 조성물의 상기 다공성 실리카 입자는 근육하주사, 종양주사 등에 의한 투여 시 투입한 국소 부위의 세포에 결합하여 내부에 담지한 핵산을 전달함으로써 특정 조직에 특이적으로 백신 조성물을 전달할 수 있다. 하지만 이에 제한되는 것은 아니고, 예를 들면 정맥 내 주사의 경우에는 혈관을 따라 전신에서 내부에 담지된 핵산이 방출되도록 할 수도 있다.
본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 본 발명의 전달체의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 체중 1 kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. 다공성 실리카 입자(DegradaBALL)의 제조
1. 다공성 실리카 입자의 제조
(1) 다공성 실리카 입자의 제조
1) 소기공 입자의 제조
2 L 둥근바닥플라스크에 증류수 (DW) 960 mL 과 MeOH 810 mL을 넣었다. 상기 플라스크에 CTAB 7.88 g을 넣은 후 교반하면서 1M NaOH 4.52 mL를 빠르게 넣었다. 10분 동안 교반시켜 균일한 혼합액을 넣은 후 TMOS 2.6 mL를 넣었다. 6시간 동안 교반하여 균일하게 혼합한 후, 24시간 동안 숙성시켰다.
이후 상기 반응액을 25 ℃에서 10 분간 8,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25 ℃에서 10 분간 8,000 rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70 ℃오븐에서 건조시켜 1.5 g의 분말형의 소기공 다공성 실리카 입자(기공 평균 직경 2 nm, 입경 200 nm)를 얻었다.
2) 기공 확장
1.5g의 소기공 다공성 실리카 입자 분말을 에탄올 10 mL에 첨가하여 초음파 분산시키고, 물 10 mL, TMB(trimethyl benzene) 10 mL를 첨가하여 초음파 분산시켰다.
이후 상기 분산액을 오토클레이브에 넣고 160 ℃ 48 시간 반응시켰다.
반응은 25 ℃에서 시작하여 10 ℃/분의 속도로 승온시켜 수행하였고, 이후 오토클레이브 내에서 1 ℃/분 내지 10 ℃/분의 속도로 서서히 냉각시켰다.
냉각된 반응액을 25 ℃에서 10 분간 8,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25 ℃에서 10 분간 8,000 rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70 ℃오븐에서 건조시켜 분말형의 다공성 실리카 입자(기공 직경 10 nm 내지 15 nm, 입경 200 nm)를 얻었다.
3) 하소
상기 2)에서 제조된 다공성 실리카 입자를 유리 vial에 담아 550 ℃에서 5 시간 동안 가열하고, 반응 종료 후 상온으로 서서히 식혀 입자를 제조하였다.
(2) 다공성 실리카 입자의 제조
기공 확장시의 반응 조건을 140 ℃, 72 시간으로 변경한 것을 제외하고는 상기 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(3) 다공성 실리카 입자의 제조 (10 L 스케일)
5배 큰 용기를 사용하고, 각 물질을 모두 5배 용량으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(4) 다공성 실리카 입자의 제조 (입경 300 nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 920 mL, 메탄올 850 mL를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(5) 다공성 실리카 입자의 제조 (입경 500 nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 800 mL, 메탄올 1010 mL, CTAB 10.6 g을 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(6) 다공성 실리카 입자의 제조 (입경 1,000 nm)
소기공 입자의 제조시에 증류수 620 mL, 메탄올 1,380 mL, CTAB 7.88g을 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(7) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 4 nm)
기공 확장시에 TMB를 2.5 mL를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(8) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 7 nm)
기공 확장시에 TMB를 4.5 mL를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(9) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 17 nm)
기공 확장시에 TMB를 11 mL를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(10) 다공성 실리카 입자의 제조 (기공 직경 23nm)
기공 확장시에 TMB를 12.5 mL를 사용한 것을 제외하고는 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
(11) 다공성 실리카 입자의 제조
소기공 입자의 제조 시에 증류수 900 mL, 메탄올 850 mL, CTAB 8 g을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1-(1)과 동일한 방법으로 다공성 실리카 입자를 제조하였다.
2. 다공성 실리카 입자의 표면 개질
(1) 실시예 1-1-(1)의 다공성 실리카 입자를 (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)와 반응시켜 양전하로 대전시켰다.
구체적으로, 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 100 mg의 다공성 실리카 입자를 10 mL의 톨루엔에 bath sonicator로 분산시켰다. 이후 1 mL의 APTES를 첨가하고 400 rpm, 130 ℃에서 교반하며 12시간 동안 반응시켰다.
반응 후에 상온까지 서서히 식히고, 10 분간 8,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 제거하고, 25 ℃에서 10 분간 8,000 rpm에서 원심분리하며 에탄올 및 증류수로 번갈아가며 5회 세척하였다.
이후 70 ℃오븐에서 건조시켜 표면 및 기공 내부에 아미노기를 갖는 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
(2) 1.8 mL의 APTES를 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 실시예 1-1-(11)을 표면 개질하여, 표면 및 기공 내부에 아미노기를 갖는 분말형의 다공성 실리카 입자를 얻었다.
3. 입자의 형성 및 기공의 확장 확인
실험방법 실시예 1-1-(1) 내지 (3)의 입자의 소기공 입자, 제조된 다공성 실리카 입자를 현미경으로 관찰하여, 소기공 입자가 균일하게 생성되었는지, 기공이 충분히 확장되어 다공성 실리카 입자가 균일하게 형성되었는지를 확인하였다(도 1 내지 4).
도 1은 실시예 1-1-(1)의 다공성 실리카 입자의 사진, 도 2는 실시예 1-1-(2)의 다공성 실리카 입자의 사진으로 기공이 충분히 확장된 구형의 다공성 실리카 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있고, 도 3은 실시예 1-1-(1)의 소기공 입자의 사진이고, 도 4는 실시예 1-1-(1)과 1-1-(3)의 소기공 입자의 비교 사진으로, 구형의 소기공 입자가 고르게 생성된 것을 확인할 수 있다.
4. 기공 직경 및 BET 표면적 계산
실시예 1-1-(1)의 소기공 입자, 실시예 1-1-(1), (7), (8), (10), (11)의 다공성 실리카 입자의 표면적을 계산하였다. 표면적은 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법에 의해 계산되었으며, 기공 직경의 분포는 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법에 의하여 계산되었다.
상기 각 입자들의 현미경 사진은 도 5에 나타내었고, 계산 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
| 입자 구분 | 기공 직경(nm) | BET 표면적(m2/g) |
| 1-1-(1)의 소기공 입자 | 2.1 | 1,337 |
| 1-1-(7) | 4.3 | 630 |
| 1-1-(8) | 6.9 | 521 |
| 1-1-(1) | 10.4 | 486 |
| 1-1-(10) | 23 | 395 |
| 1-1-(11) | 12.3 | 379 |
5. 생분해성 확인
실시예 1-1-(1)의 다공성 실리카 입자의 생분해성 확인을 위해 37 ℃ SBF(pH 7.4)에서의 생분해 정도를 0 시간, 120 시간, 360 시간에 현미경으로 관찰하였고, 이는 도 6에 나타내었다. 이를 참조하면 다공성 실리카 입자가 생분해되어 360 시간 경과 후에는 거의 다 분해된 것을 확인할 수 있다.
6. 흡광도비 측정
시간별 하기 수학식 1에 따른 흡광도비를 측정하였다.
[수학식 1]
At/A0
(식 중, A0는 상기 다공성 실리카 입자 1 mg/mL 현탁액 5 mL를 직경 50 kDa의 기공을 갖는 원통형 투과막에 넣고 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도이고,
상기 투과막 외부에는 상기 투과막과 접하며, 상기 현탁액과 동일한 용매 15 mL가 위치하고, 상기 투과막 내외부는 37 ℃에서 60 rpm 수평 교반되며,
At는 상기 A0의 측정시로부터 t 시간 경과 후에 측정된 다공성 실리카 입자의 흡광도임).
구체적으로, 다공성 실리카 입자 분말 5 mg을 SBF (pH 7.4) 5 mL에 녹였다. 이후 5 mL의 다공성 실리카 입자 용액을 도 7에 도시된 직경 50 kDa의 기공을 갖는 투과막에 넣었다. 외부막에 15 mL의 SBF를 첨가하고, 외부막의 SBF는 12시간마다 교체하였다. 다공성 실리카 입자의 분해는 37 ℃에서 60 rpm 수평 교반하며 수행되었다.
이후 UV-vis spectroscopy에 의해 흡광도를 측정하였고, λ = 640 nm에서 분석되었다.
(1) 흡광도 비 측정
실시예 1-1-(1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도비를 상기 방법에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 8에 나타내었다.
이를 참조하면 흡광도비가 1/2가 되는 t가 약 58 시간으로 굉장히 천천히 분해되는 것을 확인할 수 있다.
(2) 입경별
실시예 1-1-(1), (5), (6)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 9에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용).
이를 참조하면, 입경의 증가에 따라 t가 감소함을 알 수 있다.
(3) 기공 평균 직경별
실시예 1-1-(1), (9)의 다공성 실리카 입자, 그리고 컨트롤로서 실시예 1-1-(1)의 소기공 다공성 실리카 입자의 흡광도를 상기 수학식 1에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 10에 나타내었다(현탁액과 용매로는 SBF를 사용).
이를 참조하면, 실시예의 다공성 실리카 입자는 컨트롤에 비해 t가 상당히 큰 것을 확인할 수 있다.
(4) pH별
실시예 1-1-(4)의 다공성 실리카 입자의 pH별 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 SBF에서, 그리고 pH 2, 5, 및 7.4의 Tris에서 측정하였고, 그 결과는 도 11에 나타내었다.
이를 참조하면, pH 별 t의 차이는 있으나, 모두 흡광도의 비가 1/2 이 되는 t가 20 이상이었다.
(5) 대전
실시예 1-2-(1)의 다공성 실리카 입자의 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 도 12에 나타내었다(현탁액과 용매로는 Tris(pH 7.4)를 사용).
이를 참조하면, 양전하로 대전된 입자도 흡광도의 비가 1/2이 되는 t가 20 이상이었다.
실시예 2. mRNA 염기서열 선정 및 전달체 담지
1. mRNA 염기서열 선정
코로나 바이러스의 스파이크 단백질을 코딩하는 염기서열 및 이에 연결시키는 핵산의 서열을 변경시켜가며 표 2의 Seq 1 내지 Seq 6의 6개의 서열을 선정하였다. 표 2은 바이러스 수용체 및 그에 연결된 서열을 포함하는 mRNA 구성을 나타낸 것으로서, 신호펩타이드(SP)는 서열번호 6의 atgttcgtgttcctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtg 염기서열을 사용하였고, 해당 RBD에는 COVID-19의 RBD 서열인 서열번호 2의 염기서열을 사용하였으며, whole spike protein은 서열번호 12의 염기서열을 사용하였다.
| 산물 | 구성 | 번호 |
| Seq. 1 | *SP-*RBD-tgatga | 서열번호 7 |
| Seq. 2 | SP-RBD-ggctacatccctgaagcgcctagagacggccagtgctacgtgagatgcgacggcgaatgggtgctgctgtccactttcctgtgatga | 서열번호 8 |
| Seq. 3 | SP-RBD-ggctctggttctggctctggctacatccctgaagcgcctagagacggccagtgctacgtgagatgcgacggcgaatgggtgctgctgtccactttcctgtgatga | 서열번호 9 |
| Seq. 4 | SP-RBD-gaagccgccgccaaggaagccgccgccaaggaagccgccgccaaggaagccgccgccaaggaagccgccgccaagggctacatccctgaagcgcctagagacggccagtgctacgtgagatgcgacggcgaatgggtgctgctgtccactttcctgtgatga | 서열번호 10 |
| Seq. 5 | SP-RBD-tccggcggcggctacatccctgaagcgcctagagacggccagtgctacgtgagatgcgacggcgaatgggtgctgctgtccactttcctgtgatga | 서열번호 11 |
| Seq. 6 | Whole spike protein | 서열번호 12 |
*SP: signal peptide, *RBD: 수용체 결합 도메인
2. mRNA-DegradaBALL의 제조
(1) 중량비 1:10의 mRNA-DegradaBALL
상기 실시예 1-1-(11)의 다공성 실리카 입자를 실시예 1-2-(1)과 같이 표면 개질한 DegradaBALL을 전달체로서 사용하였다.
상기 전달체 파우더 150 μg 과 상기 실시예 2-1의 Seq.1 내지 Seq.6의 각각의 mRNA 서열 15 μg을 섞은 후, 50 μL의 PBS에 녹이고 가볍게 흔들어 주어 혼합하여 mRNA-DegradaBALL을 제조하였다.
(2) 중량비 1:8의 mRNA-DegradaBALL
DegradaBALL의 용량을 120μg으로 변경한 것을 제외하고는 상기 실시예 2-2-(1)의 방법과 동일하게 채택하여 mRNA: DegradaBALL의 중량비가 1:8인 mRNA-DegradaBALL을 제조하였다.
3. mRNA-DegradaBALL의 중량비 결정
상기 실시예 2-2-(1), (2)에서 제조한 mRNA-DegradaBALL을 30 분간 상온에서 보관한 후, 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리하였다.
원심분리된 용액에서 상층액을 수득하여, λ= 260 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DegradaBALL에 담지된 mRNA의 양은 상층액에 잔류하는 mRNA의 양을 기반으로 하여 계산하였다.
그 결과, Seq.1 내지 Seq.6 모두 혼합한 DegradaBALL 파우더의 중량과 관계없이 80% 이상의 mRNA가 DegradaBALL에 담지되는 것을 확인하였다. 다만, DegradaBALL 150 μg과 혼합한 경우, 90% 이상의 mRNA가 DegradaBALL에 담지되어 더 높은 담지 효율을 보이는 것을 확인하여, mRNA를 담지하기 위한 최적의 조건으로 설정하였다(도 13).
4. DegradaBALL의 안정성 테스트
상기 실시예 2-2-(1)의 mRNA-DegradaBALL을 각각 -20 ℃ 또는 -70 ℃의 온도조건에서 2% 또는 4%의 sucrose-PBS에 넣어 7일 간 보관하였다.
보관 전/후에, 각각 λ=260 nm에서 흡광도를 측정하여 mRNA 담지량의 변화를 확인하였다.
그 결과, Sucrose 농도, 보관 온도 또는 mRNA의 서열과 무관하게, 담지된 mRNA가 90% 이상이 유지되는 것을 확인하여, DegradaBALL이 안정하게 mRNA를 담지할 수 있음을 확인하였다(도 14).
5. mRNA 염기서열에 따른 번역 효율
(1)
in vitro
모든 세포는 37 ℃, 5 % CO2 조건으로 CO2 배양기 (SANYO Electric,Osaka, Japan)에서 배양되었다. A549 세포는 10 % FBS (v / v) 및 10 unit/mL 페니실린/ 스트렙토마이신(PC/ST)을 포함하는 F-12K 배지에서 배양되었다. CT26 세포는 10% FBS (v / v) 및 10 unit/mL 페니실린/스트렙토마이신(PC/ST)을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양되었다.
상기 A549 세포 5 ×104 개를 24-well 플레이트에 분주하고, 상기 실시예 2-1의 각각의 mRNA 1μg과 상기 실시예 1-1-(11)의 다공성 실리카 입자를 실시예 1-2-(1)과 같이 표면 개질한 DegradaBALL 10 μg을 혼합한 mRNA-DegradaBALL; 또는 전달체에 담지하지 않은 Seq.1을 각각 세포에 주입시켜 6 시간 동안 serum-free F-12K 미디엄에서 트랜스팩션을 진행하고, 이후 growth 미디엄으로 교체하여 추가로 18시간 또는 32시간을 배양하였다.
배양 후, 세포를 분리하여 2,500 rpm 에서 10 분간 원심분리를 수행하고, 상층액을 취하여, Elisa(SARS-CoV-2 RBD ELISA kit, ab289833)를 통해 RBD의 번역 효율을 분석하였다.
그 결과, Seq.1 내지 Seq.5 모두 유의미하게 RBD가 번역되는 것을 확인하였고, 그 중, Seq.1 이 가장 높게 RBD를 번역하는 것을 확인하였다 (도 15).
(2)
in vivo
이하 모든 동물실험은 서울 대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)에 따라 진행되었다. Balb/C 암컷 마우스는 ORIENT BIO (성남, 한국)에서 구입했다. 실험 기간 동안 동물은 19 ℃ - 25 ℃, 습도 40%-70%, 빛 12 시간 및 암흑 12 시간 주기 등의 환경 조건에 수용되었다.
상기 실시예 2-5-(1)의 mRNA-DegradaBALL를 각각 멸균된 PBS 100 μL 에 녹여, Balb/c 마우스에 근육하 주사로 전달하였다, 2주간 1차 면역반응을 유도한 후, 혈청을 채취하여 SARS-CoV-2 S1-RBD에 특이적으로 결합한 IgG의 농도를 ELISA로 측정하였다. ELISA는 당업자에 의해 공지된 방법으로 수행되었다(Abcam, ab275300).
그 결과 Seq 3 mRNA를 DegradaBALL에 담지하여 주입한 마우스에서 SARS-CoV-2 S1-RBD에 특이적인 IgG가 가장 많이 검출되는 것을 확인하였다(도 16). 상기 결과를 바탕으로 실제 in vivo 수준에서 높은 백신 효율을 나타내는 mRNA 서열로서 Seq.3 을 선정하였다.
실시예 3. 약물 용량 범위 및 효능 테스트
1. 약물 용량 범위 및 투여 주기
Balb/C 마우스에 0주차, 2주차에 0 μg(1 레인), 7.5 μg(2 레인), 15 μg(3 레인), 45 μg(4 레인)의 Seq.3을 각각 실시예 1-1-(11)의 다공성 실리카 입자를 실시예 1-2-(1)과 같이 표면 개질한 DegradaBALL 0 μg(1 레인) 75 μg(2 레인), 150 μg(3 레인), 450 μg(4 레인) 에 담지하여 100μL의 PBS(phosphate buffered saline)에 녹인 후, 근육하 주사 하였다.
최종 주사로부터 1주 후, 마우스로부터 혈청을 채취하여, SARS-CoV-2 S1-RBD에 특이적으로 결합하는 IgG의 농도를 ELISA로 측정하였다(Abcam, ab275300).
그 결과 Seq.3 을 투여한 모든 실험군에서 RBD와 결합하는 IgG가 투여한 용량에 비례하여 증가하는 것으로 관찰되었다(도 17).
45 μg의 고용량 처리 군에서도 다른 용량을 처리한 것과 대비하여 유의미하게 IgG 생산이 증가하는 결과를 바탕으로 Seq.3 45μg을 2주 간격으로 투여하는 것으로 투여 용량 및 주기를 확정하였다.
2. 결합 항체 농도 확인
Balb/C 마우스에 0주차, 2주차에 45 μg의 Seq.3을 상기 실시예 3-1의 DegradaBALL에 담지하고, 100μL의 PBS(phosphate buffered saline)에 녹인 후, 근육하 주사 하였다.
최초 주사로부터 각각 2주, 3주, 5주가 되는 시점에 혈청을 채취하여 SARS-CoV-2 S1-RBD에 특이적으로 결합하는 IgG의 농도를 ELISA로 측정하였다(Covid-19 S1 RBD protein Human IgG Elisa Kit, RayBiotech, IEQ-CoVSN-IgG-1; Goat Anti-Mouse IgG Fc(biotin), Abcam).
3. 중화 항체 농도 확인
상기 항체의 중화능을 확인하기 위하여, 실시예 3-2에서 채취한 혈청으로 바이러스 중화 실험(surrogate virus neutralization test, sVNT)을 수행하였다.
구체적으로, sVNT는 SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit (cell signaling technology) 제품을 활용하여 ELISA 방법으로 분석하였다.
그 결과, 최초 주사로부터 2주가 경과한 군(lane 2)에서도 SARS-COV-2 S1-RBD 에 특이적인 IgG가 검출되었으나, 16 내지 42 %의 중화능(평균 30.56 %)을 보였다.
반면 나머지 3주, 5주가 경과한 실험군에서는 2주 경과군에 비해 유의미하게 높은 수치의 SARS-COV-2 S1-RBD에 특이적으로 결합하는 IgG가 검출되었고, sVNT 실험에서 3주 실험군은 약 63-108%의 중화능(평균 82.31%), 5주 실험군은 약 53 내지 100%의 중화능(평균 83.89%)으로 유의미한 차이를 보였다(도 18, 19).
4. 발현 지속 시기 및 발현 위치 확인
mRNA-DegradaBALL를 마우스에 전달하였을 때, mRNA 발현 위치 및 발현 지속 기간을 확인하기 위하여 10 μg의 Fluc 인코딩 리포터 mRNA를 담지한 실시예 3-1의 DegradaBALL을 100 μL의 PBS에 녹여 Balb/C 마우스에 근육하 주사 하거나, 종양 내 주사(intratumoral injection, IT) 하였다.
종양 내 주사 분석을 위해, 종양 보유 마우스 (Balb/C)는 마트리겔(Matrigel)을 포함하는 100 μL 멸균된 1xPBS 용액에 CT26 세포 (1x 106 개)를 피하 주사하여 준비했다. 종양 부피가 약 200 mm3에 도달하면, 각각 상기 리포터 mRNA를 담지한 DegradaBALL 또는 mRNA를 담지하지 않은 DegradaBALL을 종양 위치에 주사하였다.
이후 시간의 경과(6h, 1일, 2일, 4일 및 7일)에 따라, 마우스에 Luciferin 용액 (0.3 mg/mL in DPBS) 100 μL를 복강 투여하였고, 1분 후 IVIS(in vivo optical imaging system)을 통해 발광(luminescence) 위치 및 세기를 분석하였다. 주사 후 7일 차에 종양, 폐, 심장, 신장, 간 및 흉선을 채취하여 발광 정도를 확인하였다.
그 결과, 근육하 주사 하였을 경우, 주사 후 10일이 경과하였을 때까지도, 유의미하게 주사 부위 근처에서 발광 되는 것을 확인하였고, 주사 부위 이외에 타 조직에서는 신호가 관측되지 않는 것을 확인하였다(도 20, 22). 마찬가지로, 종양 내 주사 시에도, 약 7일이 경과하였을 때에도 여전히 luciferase가 발현되는 것을 확인하였고, 종양 조직 이외에 다른 장기에서는 신호가 전혀 관측되지 않는 것을 확인하였다(도 21). 해당 실험 데이터를 통해, DegradaBALL이 효율적으로 담지된 mRNA을 원하는 전달 부위에 축적시키고, 주사 부위 이외에 다른 기관, 장기 등으로 이동하지 않으며, 장기간에 걸쳐 담지된 mRNA을 방출함으로써 지속적인 발현을 유도할 수 있음을 확인하였다.
5. mRNA-LNP와 DegradaBALL-mRNA의 효율 비교
mRNA를 DegradaBALL이 아닌, LNP(invivofectamine 3.0 Reagent, Thermo Fischer)에 담지하는 것을 제외하고, 상기 실시예 3-2, 실시예 3-3의 결합항체/중합항체 생성 유무 실험 방법과, 실시예 3-4의 발현 지속시기 및 발현 위치 확인 실험방법과 동일한 방법을 채택하여 실험을 진행하고, in vivo 발현 지속시간, 근육하 주사 후 발현 부위, 결합항체 생성 정도 및 중화항체 생성 정도를 실시예 2-2의 mRNA-DegradaBALL을 사용한 것과 비교하였다.
| 구분 | mRNA-LNP | mRNA-DegradaBALL |
| In vivo 발현 지속시간 |
About 1 day | About 21 days |
| IM 투여후발현부위 | Liver (90%), injection site (10%) | injection site (90%), secondary lymphoid organ (10%) |
| 결합항체 생성유무 | +++++ | +++++ |
| 중화항체 생성유무 |
++ | ++++ |
표 3에서 보듯, mRNA-LNP의 형태로 in vivo에 전달 하는 경우, 본 발명의 DegradaBALL에 담지하는 것에 비해 지속기간이 1일 가량으로 상대적으로 짧고, 주입 부위 이외에 간에서 90% 가량이 발현하는 등 타 조직으로 전달이 되는 비율이 높으며, 바이러스 항원이 타겟 수용체에 결합하지 못하게 하는 중화항체의 생성량이 적은 것을 확인하였다.
6. in vivo DegradaBALL의 안정성 테스트
상기 실시예 2-2의 mRNA-DegradaBALL을 2 주간 4 ℃에서 보관한 후에 상기 실시예 3-4의 방법으로 근육하 주사하고, 6시간 및 48시간 경과 후에 발광 여부 및 그 위치를 확인하였다.
그 결과, 4 ℃ 에서 2주간 보관하더라도, -70 ℃에서 보관한 DegradaBALL과 비교하였을 때, 주사 후 6시간 기준 발현양의 차이가 없음을 확인하였고, 주사 후 48시간 경과하였을 때에도 매우 높은 수준의 발현량을 보이는 것을 확인하였다(도 23, 24).
<110> LEMONEX INC.
<120> VACCINE COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING VIRAL DISEASES
<130> 22P02011
<150> US 63/194,310
<151> 2021-05-28
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> stabilization sequence
<400> 1
ggctacatcc ctgaagcgcc tagagacggc cagtgctacg tgagatgcga cggcgaatgg 60
gtgctgctgt ccactttcct g 81
<210> 2
<211> 699
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COVID-19 Receptor binding domain coding sequence
<400> 2
agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60
ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120
agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180
tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240
tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300
gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360
aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc ggtatagatt gtttaggaag 420
tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480
ccttgtaatg gtgttcaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540
cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600
catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660
gtcaatttcg aagccgctgc taaggaagcc gctgctaag 699
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker sequence 1
<400> 3
ggctctggtt ctggctct 18
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker sequence 2
<400> 4
gaagccgccg ccaaggaagc cgccgccaag gaagccgccg ccaaggaagc cgccgccaag 60
gaagccgccg ccaag 75
<210> 5
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker sequence 3
<400> 5
tccggcggc 9
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal peptide coding sequence
<400> 6
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtg 48
<210> 7
<211> 753
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Seq.1
<400> 7
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaagtga tga 753
<210> 8
<211> 834
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Seq.2
<400> 8
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaagggc tacatccctg aagcgcctag agacggccag 780
tgctacgtga gatgcgacgg cgaatgggtg ctgctgtcca ctttcctgtg atga 834
<210> 9
<211> 852
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Seq.3
<400> 9
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaagggc tctggttctg gctctggcta catccctgaa 780
gcgcctagag acggccagtg ctacgtgaga tgcgacggcg aatgggtgct gctgtccact 840
ttcctgtgat ga 852
<210> 10
<211> 909
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Seq.4
<400> 10
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaaggaa gccgccgcca aggaagccgc cgccaaggaa 780
gccgccgcca aggaagccgc cgccaaggaa gccgccgcca agggctacat ccctgaagcg 840
cctagagacg gccagtgcta cgtgagatgc gacggcgaat gggtgctgct gtccactttc 900
ctgtgatga 909
<210> 11
<211> 843
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Seq.5
<400> 11
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaagtcc ggcggcggct acatccctga agcgcctaga 780
gacggccagt gctacgtgag atgcgacggc gaatgggtgc tgctgtccac tttcctgtga 840
tga 843
<210> 12
<211> 3825
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Seq.6
<400> 12
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgcgtgaa tctgactact 60
agaactcagc tgcctcctgc gtacactaat tccttcacta gaggcgtgta ctaccctgac 120
aaagttttca gatcctccgt tctgcactcc actcaggacc tgttcctgcc tttcttctcc 180
aatgtgactt ggttccacgc gatccacgtg tccggcacta atggcactaa gagattcgac 240
aatcctgtgc tgcctttcaa tgacggcgtg tacttcgcgt ccactgaaaa gtccaatatc 300
atcagaggct ggatcttcgg cactactctg gactccaaga ctcagtccct gctgatcgtg 360
aataatgcga ctaatgtggt gatcaaggtg tgcgaattcc agttctgcaa tgaccctttc 420
ctggacgtgt actaccacaa gaataataag tcctggatga agtccgaatt cagagtgtac 480
tcctccgcga ataattgcac tttcgaatac gtgtcccagc ctttcctgat ggacctggaa 540
ggcaagcagg gcaatttcaa gaatctgaga gaattcgtgt tcaagaatat cgatggttac 600
ttcaagatct actccaagca cactcctatc aatctggtga gagacctgcc tcagggcttc 660
tccgcgctgg aacctctggt ggacctgcca atcggtatca acatcactag attccagact 720
ctgctggcgc tgcacagatc ctacctgact cctggcgact cctcctccgg ctggactgcg 780
ggcgcggcgg cgtactacgt gggctacctg cagcctagaa ctttcctgct gaagtacaat 840
gaaaatggca ctatcactga cgcggtggac tgcgcgctgg accctctgtc cgaaactaag 900
tgcactctga agtccttcac tgtggaaaag ggcatctacc agacttccaa tttccgggtg 960
cagcctaccg aaagcatcgt gcggttcccc aatatcacta acctgtgccc tttcggcgaa 1020
gtgttcaatg ccactcggtt cgccagcgtg tacgcctgga accggaagcg gatctccaac 1080
tgcgtggccg actactccgt gctgtacaat tccgccagct tctccacctt caagtgctac 1140
ggcgtgagcc ctactaagct gaatgacctg tgcttcacta atgtgtacgc cgacagcttc 1200
gtgatccggg gcgacgaagt gcggcagatc gcccctggcc agaccggcaa gatcgccgac 1260
tacaactaca agctgcccga cgacttcact ggctgcgtga tcgcctggaa ttccaataat 1320
ctggactcca aggtgggcgg caattacaat taccggtacc ggctgttccg gaagtccaat 1380
ctgaagcctt tcgaacggga catctccacc gaaatctacc aggccggctc cactccctgc 1440
aatggcgtgc agggcttcaa ttgctacttc cctctgcagt cctacggctt ccagcctact 1500
aatggcgtgg gctaccagcc ttaccgggtg gtggtgctgt ccttcgaact gctgcacgcc 1560
cctgccactg tgtgcggccc taagaagtcc actaatctgg tgaagaataa gtgcgtgaat 1620
ttcaatttca atggcctgac tggcactggc gtgctgactg aatccaataa gaagttcctg 1680
cctttccagc agttcggccg ggacatcgcc gacactactg acgccgtgcg ggaccctcag 1740
actctggaaa tcctggacat cactccttgc tccttcggcg gcgtgtccgt gatcactcct 1800
ggcactaata cttccaatca ggtggccgtg ctgtaccagg gcgtgaattg cactgaagtg 1860
cctgtggcca tccacgccga ccagctgact cctacttggc gggtgtactc cactggctcc 1920
aatgtgttcc agactcgggc cggctgcctg atcggcgccg aacacgtgaa taattcctac 1980
gaatgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgcgcctcct accagactca gactaattcc 2040
cggcgggccg ccgcctccgt ggcctcccag tccatcatcg cctacactat gtccctgggc 2100
gccgaaaatt ccgtggccta ctccaataat tccatcgcca tccctactaa tttcactatc 2160
tccgtgacta ctgaaatcct gcctgtgtcc atgactaaga cttccgtgga ctgcactatg 2220
tacatctgcg gcgactccac tgaatgctcc aatctgctgc tgcagtacgg ctccttctgc 2280
actcagctga atcgggccct gactggcatc gccgtggaac aggacaagaa tactcaggaa 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag actcctccta tcaaggactt cggcggcttc 2400
aatttctccc agatcctgcc tgacccttcc aagccttcca agcggtcctt catcgaagac 2460
ctgctgttca ataaggtgac tctggccgac gccggcttca tcaagcagta cggcgactgc 2520
ctgggcgaca tcgccgcccg ggacctgatc tgcgcccaga agttcaatgg cctgactgtg 2580
ctgcctcctc tgctgactga cgaaatgatc gcccagtaca cttccgccct gctggccggc 2640
actatcactt ccggctggac tttcggcgcc ggcgccgccc tgcagatccc tttcgccatg 2700
cagatggcct accggttcaa tggcatcggc gtgactcaga atgtgctgta cgaaaatcag 2760
aagctgatcg ccaatcagtt caattccgcc atcggcaaga tccaggactc cctgtcctcc 2820
actgcctccg ccctgggcaa gctgcaggac gtggtgaatc agaatgccca ggccctgaat 2880
actctggtga agcagctgtc ctccaatttc ggcgccatct cctccgtgct gaatgacatc 2940
ctgtcccggc tggaccctcc tgaagccgaa gtgcagatcg accggctgat cactggccgg 3000
ctgcagtccc tgcagactta cgtgactcag cagctgatcc gggccgccga aatccgggcc 3060
tccgccaatc tggccgccac taagatgtcc gaatgcgtgc tgggccagtc caagcgggtg 3120
gacttctgcg gcaagggcta ccacctgatg tccttccctc agtccgcccc tcacggcgtg 3180
gtgttcctgc acgtgactta cgtgcctgcc cacgaaaaga atttcactac tgcccctgcc 3240
atctgccacg acggcaaggc ccacttccct cgggaaggcg tgttcgtgtc caatggcact 3300
cactggttcg tgactcagcg gaatttctac gaacctcaga tcatcactac tgacaatact 3360
ttcgtgtccg gcaattgcga cgtggtgatc ggcatcgtga ataatactgt gtacgaccct 3420
ctgcagcctg aactggactc cttcaaggaa gaactggaca agtacttcaa gaatcacact 3480
tcccctgacg tggacctggg cgacatctcc ggcatcaatg cctccgtggt gaatatccag 3540
aaggaaatcg accggctgaa tgaagtggcc aagaatctga atgaatccct gatcgacctg 3600
caggaactgg gcaagtacga acagtacatc aagtggcctt ggtacatctg gctgggcttc 3660
atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg actatcatgc tgtgctgcat gacttcctgc 3720
tgctcctgcc tgaagggctg ctgctcctgc ggctcctgct gcaagttcga cgaagacgac 3780
tccgaacctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacactt gatga 3825
Claims (14)
- 하기와 같은 서열의 핵산 분자:
RBD-(L)n-X
(식 중, RBD는 스파이크 단백질에서 수용체 결합 도메인을 포함하는 적어도 일부 영역의 서열이고, L은 링커 서열로 n은 0 또는 1이며, X는 서열번호 1의 염기 서열임).
- 청구항 1에 있어서, 상기 RBD는 그 수용체 결합 도메인이 삼중체를 형성하는 바이러스 유래 서열인 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 RBD는 그 길이가 100 nt 내지 5,000 nt인 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 RBD는 서열번호 2의 염기서열인 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 L은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열인 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 RBD는 herpesviridae, orthomyxoviridae, rhabdoviridae, paramyxoviridae, papilomaviridae, adenoviridae, parvoviridae, astroviridae, reoviridae, bunyaviridae, arteriviridae, caliciviridae, hepeviridae, bornaviridae, arenaviridae, togaviridae, filoviridae, retroviridae, flaviviridae 및 coronaviridae 로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 유래 서열인 핵산 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 RBD는 Colacovirus, Decacovirus, Duvinacovirus, Luchavirus, Minacovirus, Minunacovirus, Myotacovirus, Nyctacovirus, Pedacovirus, Rhinacovirus, Setracovirus, Soracovirus, Tegacovirus, Embecovirus, Hibecovirus, Merbecovirus, Nobecovirus, Sarbecovirus, Brangacovirus, Cegacovirus, Igacovirus, Andecovirus, Buldecovirus 및 Herdecovirus로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 유래 서열인 핵산 분자.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 바이러스 백신 조성물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 전달체, 바이러스 유사 입자(virus-like particle, VLP), 양전하성 폴리머, 리포좀, 지질나노입자(lipid nanoparticle), 금, 반도체 나노결정 입자(quantum dot), 탄소나노튜브 및 다공성 실리카 입자로 이루어진 군에서 선택되는 전달체에 담지된 것인 바이러스 백신 조성물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 핵산 분자는 다공성 실리카 입자에 담지된 것인 바이러스 백신 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 기공의 평균 직경이 5 nm 내지 100 nm인 바이러스 백신 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 기공 내부가 양전하로 대전된 것인 백신 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 다공성 실리카 입자는 생분해성 입자인 백신 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 핵산 분자와 상기 다공성 실리카 입자의 중량비는 1: 1 내지 30인 바이러스 백신 조성물.
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|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
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| ANAM NAZ 등. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY. VOL. 11, 1663 (2020). |
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