CN117396521A - 用于预防或治疗病毒感染的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种RBD‑(L)n‑X序列的核酸分子(其中，RBD是包括刺突蛋白的受体结合结构域的至少一部分区域的序列，L是接头序列，n是0或1，X是SEQ ID NO:1的核苷酸序列)，和包括所述核酸分子的病毒疫苗组合物。优选地，所述分子可用于针对各种病毒感染的疫苗组合物。

Description

用于预防或治疗病毒感染的疫苗
技术领域
本发明涉及一种具有用于预防和治疗病毒感染的用途的包含用于承载核酸的载体的疫苗组合物。
背景技术
最近的包括COVID-19在内的病毒感染在发生后会在短期内进展到全球流行病阶段，因此需要快速的疫苗开发。然而，传统的疫苗开发的问题在于，从临床前阶段到最终使用，由于包括基础研究、临床试验、许可、制造和销售阶段在内的许多阶段而需要很长时间。
mRNA疫苗是具有诱导建立针对病毒的获得性免疫系统的机制的疫苗，其通过将含有病毒的遗传信息的mRNA注射至人体，在体内引起例如刺突蛋白等病毒蛋白质的合成，从而诱导人免疫系统检测所合成的蛋白质并产生针对所述病毒的抗体。目前，使用该mRNA疫苗技术，通过对病毒基因序列进行分析，然后仅改变疫苗平台、即现有疫苗中的特定抗原或遗传物质的遗传信息，从而尝试开发可替代的基础技术。基于已明确毒性谱分析和制造过程的mRNA疫苗平台技术，美国的Moderna将从病原体识别后的病毒序列选择到开始1期临床试验的时间段由先前的20个月缩短至3个月。
但是，问题在于，mRNA疫苗由于其分子结构性质而不稳定、由此容易分解、向靶细胞的递送效率不高、或者mRNA序列编码的氨基酸不具有高抗原性或免疫原性。因此，迫切需要研究更好的mRNA疫苗技术。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种编码形成稳定结构的病毒受体结合结构域的核酸分子。
本发明的另一目的在于提供一种用于承载核酸分子的载体。
此外，本发明的另一目的在于提供一种用于预防或治疗病毒感染的疫苗。
用于解决问题的方案
1.一种以下序列的核酸分子：
RBD-(L)n-X
(其中，RBD是包括刺突蛋白中的受体结合结构域的至少一部分区域的序列，L是接头序列，n是0或1，X是SEQ ID NO:1的核苷酸序列)。
2.根据上述1所述的核酸分子，其中所述RBD是通过其受体结合结构域形成三聚体的病毒衍生序列。
3.根据上述1所述的核酸分子，其中所述RBD的长度为100nt至5,000nt。
4.根据上述1所述的核酸分子，其中所述RBD是SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
5.根据上述1所述的核酸分子，其中L是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
6.根据上述1所述的核酸分子，其中所述RBD是选自由以下组成的组中的病毒衍生序列：疱疹病毒科(herpesviridae)、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)、炮弹病毒科(rhabdoviridae)、副黏液病毒科(paramyxoviridae)、乳头瘤病毒科(papilomaviridae)、腺病毒科(adenoviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、星状病毒科(astroviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、动脉炎病毒科(arteriviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、肝炎病毒科(hepeviridae)、玻那病毒科(bornaviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、黃病毒科(flaviviridae)和冠状病毒科(coronaviridae)。
7.根据上述1所述的核酸分子，其中所述RBD是选自由以下组成的组中的病毒衍生序列：可乐冠状病毒(Colacovirus)、德卡冠状病毒(Decacovirus)、杜维那冠状病毒(Duvinacovirus)、鹿城冠状病毒(Luchavirus)、米纳冠状病毒(Minacovirus)、米奴那冠状病毒(Minunacovirus)、麦欧塔冠状病毒(Myotacovirus)、奈可塔冠状病毒(Nyctacovirus)、配达冠状病毒(Pedacovirus)、莱娜冠状病毒(Rhinacovirus)、塞特拉冠状病毒(Setracovirus)、索拉冠状病毒(Soracovirus)、特噶冠状病毒(Tegacovirus)、艾姆贝冠状病毒(Embecovirus)、海贝冠状病毒(Hibecovirus)、麦本冠状病毒(Merbecovirus)、诺本冠状病毒(Nobecovirus)、萨本冠状病毒(Sarbecovirus)、布莱岗冠状病毒(Brangacovirus)、开岗冠状病毒(Cegacovirus)、艾岗冠状病毒(Igacovirus)、艾德冠状病毒(Andecovirus)、布尔德冠状病毒(Buldecovirus)和海尔德冠状病毒(Herdecovirus)。
8.一种病毒疫苗组合物，其包含根据上述1至7中任一项所述的核酸分子。
9.根据上述8所述的病毒疫苗组合物，其中所述核酸分子承载在选自由以下组成的组中的载体上：病毒载体、病毒样颗粒(VLP)、带正电荷的聚合物、脂质体、脂质纳米颗粒、金、半导体量子点、碳纳米管和多孔二氧化硅颗粒。
10.根据上述8所述的病毒疫苗组合物，其中所述核酸分子承载在多孔二氧化硅颗粒上。
11.根据上述10所述的病毒疫苗组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒的平均孔径为5nm至100nm。
12.根据上述10所述的病毒疫苗组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒在孔的内部带正电荷。
13.根据上述10所述的病毒疫苗组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒为生物降解性颗粒。
14.根据上述10所述的病毒疫苗组合物，其中所述核酸分子与所述多孔二氧化硅颗粒的重量比为1:1至30。
发明的效果
本发明提供一种核酸分子，其包含编码包括刺突蛋白的受体结合结构域的至少一部分区域的序列的核苷酸序列、接头序列和SEQ ID NO:1的核苷酸序列。优选地，所述核酸分子承载在载体上，由此用作针对病毒感染具有高预防率的疫苗组合物。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。
图2是根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。
图3是根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的制造过程中获得的小孔颗粒的显微照片。
图4是根据本发明的一个实施方案的小孔颗粒的显微照片。
图5是根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。可降解性载体(DDV)是根据一个实施方案的颗粒，其中括号中的数值是指颗粒的直径，下标的数值是指孔径。例如，根据一个实施方案，DDV(200)10是指具有200nm的粒径(即，颗粒尺寸)和10nm的孔径的颗粒。
图6是确定根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性的显微照片。
图7是显示根据一个说明性实例的具有圆筒状渗透膜的管的视图。
图8显示根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果。
图9显示根据本发明的一个实施方案的各粒径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果。
图10显示根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果。
图11显示根据本发明的一个实施方案的各环境pH的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果。
图12显示根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果。
图13显示根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒与RBD-Ln-X核酸的重量比；和根据核酸序列的多孔二氧化硅颗粒的负载效率的确认结果。
图14显示在将Covid mRNA承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并改变核酸序列、贮存温度和缓冲液的蔗糖含量时，多孔二氧化硅颗粒的负载效率的确认结果。
图15显示在将RBD-L n-X核酸承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并在体外递送时，RBD翻译效率的确认结果。
图16显示在将RBD-Ln-X核酸承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并在体内递送时，RBD特异性IgG的量的确认结果。
图17显示在将Seq.3承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并在体内递送时，根据Seq.3的剂量，抗体的产生量的确认结果。
图18显示在将Seq.3承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并在体内递送时，随时间产生的结合抗体的量的确认结果。
图19显示在将Seq.3承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并在体内递送时，随时间产生的中和抗体的量的确认结果。
图20显示在将Luc mRNA承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并在体内肌下注射时，荧光素酶的表达位置和持续时间的确认结果。
图21显示在将Luc mRNA承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并在体内瘤内注射时，荧光素酶的表达位置和持续时间的确认结果。
图22显示在将Luc mRNA承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并且在体内肌下注射时，荧光素酶的表达持续时间和表达强度的确认结果。
图23显示在将Luc mRNA承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上并且分别在4℃或25℃下贮存7天和14天时，注射后随时间的荧光素酶的表达位置和表达水平的确认结果。
图24显示通过将Luc mRNA承载在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒上，注射后根据贮存时间和贮存温度的、荧光素酶的表达水平的确认结果。
具体实施方式
下文中，将详细说明本发明。除非另外明确说明，否则本说明书中所有术语具有与具有本发明所属公知常识的人(“本领域技术人员”)所理解的一般含义相同的含义，并且如果一般含义与本文所用的术语的含义存在冲突，则本说明书中使用的含义占主导。
本发明涉及一种以下序列的核酸分子：
RBD-(L)n-X
(其中，RBD是包括刺突蛋白中的受体结合结构域的至少一部分区域的序列，L是接头序列，n是0或1，X是SEQ ID NO:1的核苷酸序列)。
在本发明中，RBD包括在本发明的范围内而没有限制，只要其包括编码与存在于宿主细胞中的受体结合的病毒衍生结构域的核苷酸序列即可。优选地，RBD在病毒表面上通过其受体结合结构域形成三聚体，更具体地，RBD可以是SEQ ID NO:2的核苷酸序列，但不限于此。
RBD可以包括在本发明的范围内而对序列的长度没有限制，只要其包括刺突蛋白中的受体结合结构域区域的至少一部分，可以表现作为疫苗的效果即可。例如，RBD可以在其序列的5’-末端或3’-末端进一步包括核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在刺突蛋白的受体结合结构域区域的N-末端或C-末端的氨基酸。更具体地，RBD序列可以具有100nt至5,000nt、200nt至4,000nt、300nt至3,000nt、400nt至2,000nt、500nt至1000nt等长度，但不限于此。
此外，RBD可以包括在本发明的范围内而无论病毒的类型如何，只要其是构成位于病毒表面上的刺突蛋白的结构域即可。例如，RBD可以是属于选自由以下组成的组中的病毒家族的病毒衍生序列：疱疹病毒科、正黏液病毒科、炮弹病毒科、副黏液病毒科、乳头瘤病毒科、腺病毒科、细小病毒科、星状病毒科、呼肠孤病毒科、布尼亚病毒科、动脉炎病毒科、杯状病毒科、肝炎病毒科、玻那病毒科、沙粒病毒科、披膜病毒科、丝状病毒科、逆转录病毒科、黃病毒科和冠状病毒科，更具体地，选自由以下组成的组中的病毒衍生序列：可乐冠状病毒、德卡冠状病毒、杜维那冠状病毒、鹿城冠状病毒、米纳冠状病毒、米奴那冠状病毒、麦欧塔冠状病毒、奈可塔冠状病毒、配达冠状病毒、莱娜冠状病毒、塞特拉冠状病毒、索拉冠状病毒、特噶冠状病毒、艾姆贝冠状病毒、海贝冠状病毒、麦本冠状病毒、诺本冠状病毒、萨本冠状病毒、布莱岗冠状病毒、开岗冠状病毒、艾岗冠状病毒、艾德冠状病毒、布尔德冠状病毒和海尔德冠状病毒，但不限于此。
如果RBD和SEQ ID NO:1的核苷酸序列连接，它们可以包括在本发明的范围内而没有限制。例如，编码RBD的核苷酸序列和SEQ ID NO:1的核苷酸序列可以直接连接，或者RBD可以通过接头与SEQ ID NO:1的核苷酸序列连接。作为接头，可以使用本领域已知的那些而没有限制，例如，可以使用饱和烷基链(C3至C18)、三唑接头、4-甲基-6,7,8,9,10,10a-六氢-5H-3λ2-环辛并[d]哒嗪接头等。在最小化体内的副反应和副作用方面，优选使用饱和烷基链。作为饱和烷基链，可以使用C3至C18、C3至C15、C3至C12、C3至C10、C4至C15、C4至C12、C4至C10、C4至C8、C5至C15、C5至C12、C5至C10、C3至C8、C3至C6、或C4至C6。具体地，由SEQ IDNOs:3至5的核苷酸序列结合并且由核苷酸序列编码的氨基酸可以用作接头。优选地，在将由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列结合并且由所述核苷酸序列编码的氨基酸用作接头时，可以进一步提高作为疫苗的效率，但不限于此。
在本发明中，SEQ ID NO:1的核苷酸序列可以与RBD连接以增加RBD翻译效率和/或疫苗生产效率。效率的提高可以通过诱导由核酸编码的氨基酸序列形成三聚体来实现，并且可以通过增加形成三聚体的病毒受体结合结构域的结合稳定性来实现，但不限于此。
在本发明中，核酸可以进一步包括信号肽序列。所述信号肽序列可以是插入在核酸的5’-末端或3’-末端区域的核苷酸序列，对其长度没有限制。信号肽序列可以取决于目的在其中插入具有这种效果的核酸而没有限制。例如，信号肽序列可以是旨在提高核酸和/或由其编码的氨基酸的稳定性，增加氨基酸的翻译效率，或者可以用于使合成的氨基酸分泌到细胞外。信号肽序列的长度可以是例如1至200nt、10至150nt、或20至100nt等。更具体地，可以将SEQ ID NO:6的序列添加至核酸的5’-末端，但不限于此。
在本发明中，所述核酸可以在3’-末端进一步包含终止密码子。例如，可以将TGA、TAG、和TAA序列添加至SEQ ID NO:1的3’-末端，所述序列可以重复1次至几次。
在本发明中，构成核酸分子的碱基可以是DNA或RNA，即使核苷酸序列包括已经历化学修饰的碱基，其也包括在本发明的范围内而没有限制。已经历化学修饰的碱基可以是例如假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷、或2’-O-甲基尿苷。核酸的翻译效率可以通过化学修饰的碱基来增加，但不限于此。
本发明涉及包括上述核酸分子的病毒疫苗组合物。
在将本发明的病毒疫苗组合物引入至靶细胞中时，其可以合成由组合物中含有的RBD-(L)n-X序列编码的氨基酸序列。在被免疫细胞识别的情况下，所述氨基酸序列可以具有高抗原性或免疫原性以起到针对由包括所述RBD的病毒导致的感染的疫苗的作用。如上所述，与RBD单独存在的情况相比，本发明的病毒疫苗组合物可以表现较高的翻译效率和/或疫苗生产效率。
本发明的病毒疫苗组合物可以具有将核酸分子承载在载体上的形式。只要所述载体能够将所承载的疫苗组合物递送至靶细胞即可，无论其类型如何都可以包括在本发明的范围内。例如，所述载体可以包括病毒载体、病毒样颗粒(VLP)、带正电荷的聚合物、脂质体、脂质纳米颗粒、金、半导体量子点、碳纳米管、或多孔二氧化硅颗粒，并且优选地，承载在多孔二氧化硅颗粒上，但不限于此。
为了承载在载体上，所述核酸分子可以进一步具有与其偶联的官能团，所述官能团能够在5’-末端和/或3’-末端与载体结合。在这方面，在生物学和化学领域中，能够彼此偶联的官能团或具有其的化合物可以应用于核酸分子而没有限制，并且核酸分子可以通过这些官能团之间的偶联反应而承载在载体上。
在本发明中，本发明的多孔二氧化硅颗粒是基于二氧化硅(SiO2)材料的颗粒并且具有纳米级颗粒尺寸，相当于能够在其表面上和/或孔的内部承载核酸的载体。颗粒可以具有多个孔，其中孔可以从颗粒的表面延伸至内部，并且可以彼此连接。在本发明中，在将核酸承载在多孔二氧化硅颗粒中并递送至细胞时，与没有将核酸承载在二氧化硅颗粒上的情况相比，可以提高向细胞的递送效率，并且可以逐渐释放其中承载的核酸，使得血液中的滞留时间增加。此外，与上述的其它载体相比，二氧化硅颗粒可以表现较高的递送效果。
在本发明中，多孔二氧化硅颗粒的平均粒径包括在本发明的范围内而没有限制，只要它们可以承载所述核酸即可，并且可以由本领域技术人员根据例如要承载的核酸的类型或量来选择。颗粒可以具有例如50nm至1,000nm的平均粒径。平均粒径可以由本领域技术人员根据例如其中承载的核酸的重量来选择。平均粒径的下限可以是例如50nm、60nm、70nm、80nm或90nm，平均粒径的上限可以是例如1,000nm、900nm、800nm、700nm或600nm，但不限于此。
通过使平均孔径在上述范围内，多孔二氧化硅颗粒可在其孔的内部充分地支承或承载核酸分子并递送至细胞。取决于上述平均粒径的尺寸，可以在较小的范围内选择孔径。颗粒的直径越大，越容易承载核酸，其承载的核酸的重量越大，但核酸的释放速率可以与此成比例。孔径可以根据本领域技术人员的目的选择而没有限制，下限可以是例如5nm、7nm、10nm、12nm、15nm、17nm、或20nm，上限可以是例如100nm、90nm、80nm、70nm、60nm或50nm，但不限于此。
多孔二氧化硅颗粒可以在孔的内部带正电荷，并且可以具有5至80mV的ζ电位。在上述范围内，ζ电位可以是例如5mV至80mV、5mV至70mV、5mV至60mV、5mV至55mV、10mV至80mV、10mV至70mV、10mV至60mV、10mV至55mV、20mV至80mV、20mV至70mV、20mV至60mV、20mV至55mV、30mV至80mV、30mV至70mV、30mV至60mV、30mV至55mV、40mV至80mV、40mV至70mV、40mV至60mV、40mV至55mV、50mV至80mV、50mV至70mV、50mV至60mV、或50mV至55mV等，但不限于此。
当带电荷的颗粒被吸收到靶细胞中时(例如，通过诸如内吞作用等过程)，由于核内体(endosome)中的低pH，进入细胞的颗粒可具有强正电荷，这可诱导由于通过核内体的膜的水的扩散而引起的渗透，从而导致液泡的形成。
当颗粒具有强正电荷时，细胞膜比其包裹颗粒时更膨胀，从而可以将细胞外液或除了颗粒以外的其中包含的诸如各种蛋白质等异物一起引入靶细胞。在这种情况下，由于异物的流入会出现意想不到的效果，或者与没有异物流入的情况相比，颗粒可以相对较少地流入。因此，难以通过充分递送颗粒来产生药效。另一方面，如果颗粒的正电荷弱，负载效率可能降低。然而，本发明可以通过优化承载核酸的颗粒的电荷来防止上述问题。
核酸分子相对于颗粒的负载率可以是例如多孔二氧化硅颗粒相对于核酸分子的重量比为1:1至30。当含量比在上述范围内时，可以防止产生其中未承载核酸分子的空多孔二氧化硅颗粒，同时充分地承载核酸分子，从而防止将具有强正电荷的颗粒递送至细胞。在上述范围内，负载率可以是例如1:1至30、1:3至20、1:3至15、1:3至12、1:3至10、1:5至20、1:5至15、1:5至10等，但不限于此。
具体地，为了使用本发明的载体将组合物施用至受试者，可以将承载核酸分子的多孔二氧化硅颗粒分散在分散介质中，这可以通过将多孔二氧化硅颗粒和核酸分子添加至分散介质中并搅拌来获得。在这方面，如果颗粒的量相对于核酸分子过多，可能出现不充分承载核酸分子的空颗粒，如果颗粒的量相对于核酸分子过少，可能产生未由颗粒承载的残留的核酸分子。
在本发明的一个实施方案中，多孔二氧化硅颗粒可以具有以下规格。例如，孔尺寸的范围可以为7至30nm，具体地，12至18nm，更具体地，14至16nm。粒径的范围可以为50至1,000nm，具体地，200至500nm，更具体地，250至350nm。表面积的范围可以为200至700m2/g，具体地，360至480m2/g。在承载核酸分子之前的状态下，ζ电位可以是5mV以上，具体地，20至70mV，更具体地，40至60mV。颗粒可以承载核酸分子以达到1:1至30的重量比，具体地，1:5至25、1:5至20、1:10至25、1:10至20。
本发明的多孔二氧化硅颗粒是生物降解性颗粒，其承载核酸分子并且在施用至体内时可以在体内生物降解以释放核酸分子。然而，本发明的多孔二氧化硅颗粒在体内缓慢降解，使得所承载的核酸可以以持续方式释放。例如，在下式1的吸光度比为1/2时，t可以为20以上：
[式1]
At/A0
(其中A0为如下测定的多孔二氧化硅颗粒的吸光度：通过将5mL的含1mg/mL的多孔二氧化硅颗粒的悬浮液置于具有孔径为50kDa的孔的圆筒状渗透膜中，使15mL的与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在37℃以60rpm水平地搅拌渗透膜的内部/外部，悬浮液的pH为7.4，和At表示从测定A0开始经过“t”小时后测定的多孔二氧化硅颗粒的吸光度)。
上式1意味着多孔二氧化硅颗粒在类似于身体的环境中降解的速率，可以在将多孔二氧化硅颗粒和悬浮液置于圆筒状渗透膜中，并且还将相同的悬浮液置于渗透膜的外部后，测定上式1中的吸光度A0和At。
本发明的多孔二氧化硅颗粒是生物降解性的，并且可以在悬浮液中缓慢地降解。50kDa的直径相当于约5nm，这使得生物降解性多孔二氧化硅颗粒通过直径为50kDa的渗透膜，并且以60rpm水平搅拌圆筒状渗透膜以均匀共混悬浮液，使得降解的多孔二氧化硅颗粒可以从渗透膜中出来。
上式1中的吸光度可以例如在用新的悬浮液替换渗透膜的外部的悬浮液的环境下测量。可以连续替换或者每周期替换悬浮液，其中所述周期是定期的或不定期的。例如，可以在1小时至1周的范围内以1小时间隔、2小时间隔、3小时间隔、6小时间隔、12小时间隔、24小时间隔、2天间隔、3天间隔、4天间隔、或7天间隔等替换悬浮液，但不限于此。
吸光度比达到1/2的意义是指在t小时后，吸光度为初始吸光度的一半，简言之，约一半的多孔二氧化硅颗粒被降解。
悬浮液可以是缓冲溶液，例如选自由磷酸盐缓冲盐水(PBS)和模拟体液(SBF)组成的组中的至少一种，并且更具体地，PBS。
在吸光度比达到1/2时，上式1中的“t”可以为20以上，例如，t的范围可以为24至120。即，在上述范围内，t的范围可以为20至96、24至96、24至72、30至70、40至70、或50至65等，但不限于此。
对于多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/5时，t的范围可以为70至140。例如，在上述范围内，t的范围可以为80至140、80至120、80至110、70至140、70至120、或70至110等，但不限于此。
对于多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/20时，t的范围可以为130至220。例如，在上述范围内，t的范围可以为130至200、140至200、140至180、或150至180等，但不限于此。
对于多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到0.01以下时，t可以为250以上、300以上、350以上、400以上、500以上、或1000以上等，并且上限可以为2,000，但不限于此。
对于多孔二氧化硅颗粒，上式1中的吸光度比与t具有高的正相关性。例如，皮尔森相关系数可以为0.8以上，例如0.9以上、或0.95以上。
上式1中的“t”意味着多孔二氧化硅颗粒在类似于身体的环境下降解的速度。即，t可以通过调整例如表面积、粒径、孔径、多孔二氧化硅颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、和表面的致密性(compactness)等来调节。例如，可以增加颗粒的表面积来减小t，或者可以减小表面积来增大t。表面积可以通过调整颗粒的粒径和孔径来调节。此外，如果通过使取代基处于颗粒的表面上和/或孔的内部来减少多孔二氧化硅颗粒对环境(例如溶剂)的直接暴露，则可以增大t。此外，当多孔二氧化硅颗粒支承或承载核酸分子时，和当提高核酸分子与多孔二氧化硅颗粒之间的亲和性时，可以减少多孔二氧化硅颗粒对环境的直接暴露，从而增大t。此外，可以通过在制造过程中制备具有更致密的表面的颗粒来增大t。如上所述，已描述了调整上式1中的t的各种实例，但不限于此。
本发明的多孔二氧化硅颗粒可以具有球形形状，但不限于此。
本发明的多孔二氧化硅颗粒的BET表面积可以为例如200至700m2/g，但不限于此。例如，在上述范围内，BET表面积的范围可以为200m2/g至700m2/g、220m2/g至680m2/g、220m2/g至620m2/g、280m2/g至680m2/g、280m2/g至580m2/g、280m2/g至520m2/g、280m2/g至480m2/g、320m2/g至620m2/g、320m2/g至580m2/g、320m2/g至520m2/g、320m2/g至480m2/g、320m2/g至450m2/g、320m2/g至420m2/g、360m2/g至480m2/g、或360m2/g至420m2/g等，但不限于此。
本发明的多孔二氧化硅纳米颗粒的每克的体积可以为例如0.7至2.2mL。例如，在上述范围内，所述体积可以为0.7至2.0mL、0.8至2.2mL、0.8至2.0mL、0.9至2.0mL、1.0至2.0mL等，但不限于此。
多孔二氧化硅颗粒可以包括平均孔径小于5nm的小孔颗粒扩张至平均直径7至30nm的孔。因此，孔径大，以便可在孔的内部承载大的核酸分子，而粒径本身与孔径相比并不大，以便易于递送和吸收到细胞中。
本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在其外表面和/或孔的内部带正电荷。例如，颗粒的表面和孔的内部两者都可以带正电荷，或者可以仅颗粒的表面或孔的内部带正电荷。例如，可以通过阳离子取代基的存在来进行带电荷。
阳离子取代基可包括例如氨基或任何其它含氮基团作为碱性基团。此外，阴离子取代基可包括例如羧基(-COOH)、磺酸基(-SO3H)、或硫醇基(-SH)等作为酸性基团，但不限于此。
带正电荷可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有例如含氮基团(例如氨基或氨基烷基)等碱性基团的烷氧基硅烷反应来进行。具体地，可以使用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]苯胺、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、或3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷等。带正电荷可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有例如含氮基团等碱性基团的聚合物反应来进行。例如，聚醚酰亚胺(PEI)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)、聚丙烯酰胺(CPAM)、聚酰胺表氯醇(PAE)、或聚氯化铝(PAC)等可以用作聚合物。可以选择聚合物而无论其分子量、电荷等，只要其可以修饰多孔二氧化硅颗粒的外表面和/或孔的内部即可，但不限于此。
在通过使多孔二氧化硅颗粒与聚合物反应来使其带正电荷时，这些颗粒可以带有比使多孔二氧化硅颗粒与含有胺基的化合物反应的情况高的电荷。因此，当在多孔二氧化硅颗粒上承载核酸分子时，由于核酸和胺基之间的电结合，可以表现较高的负载效率。当通过调整取代基通过上述带电荷来调节多孔二氧化硅颗粒与核酸分子的释放环境的相互作用时，可以调节纳米颗粒本身的降解速率以控制核酸分子的释放速率。此外，所述核酸分子可以从纳米颗粒扩散和释放。在这方面，调整取代基可以调节核酸分子与纳米颗粒的结合力，从而控制核酸分子的释放。
此外，多孔二氧化硅颗粒可以包括出于以下目的而存在于其中的取代基：在颗粒的表面和/或孔的内部承载核酸分子；将核酸分子递送至靶细胞；承载出于其它目的的其它物质；或额外的取代基的结合。此外，多孔二氧化硅颗粒可以进一步包括与其结合的抗体、配体、细胞穿透肽、或适体等。
颗粒的表面和/或孔的内部的上述取代基、电荷、结合物等可以通过例如表面修饰来添加。表面修饰可以例如通过使具有要引入的取代基的化合物或聚合物与颗粒反应来进行。化合物可以是例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，聚合物可以是例如聚醚酰亚胺(PEI)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)、聚丙烯酰胺(CPAM)、聚酰胺表氯醇(PAE)、或聚氯化铝(PAC)等，但不限于此。烷氧基硅烷具有一个以上的烷氧基，例如1至3个烷氧基。此外，可以在未结合烷氧基的位点引入取代基，或具有由其取代的取代基。
在用聚合物修饰多孔二氧化硅颗粒的表面和/或孔的内部时，例如，在使用分子量为100,000以上的聚合物时，无法确保孔的内部用于承载核酸的空间，从而导致负载效率降低。可用的聚合物的分子量可以是例如100,000以下、90,000以下、70,000以下、60,000以下、50,000以下、或40,000以下等。其下限可以是例如500以上、1,000以上、2,000以上、3,000以上、4,000以上、或5,000以上等。表面修饰可以通过本领域技术人员已知的方法来进行而没有限制。例如，修饰可以通过将多孔二氧化硅颗粒置于其中溶解/分散有要修饰的化合物或聚合物的溶液中、然后将其干燥来进行，但不限于此。
例如，多孔二氧化硅颗粒可以例如通过小孔颗粒制备和孔扩张工艺来制造，并且根据需要，可以进一步通过煅烧或表面修饰工艺等来制造。如果实施煅烧和表面修饰工艺两者，颗粒可以在煅烧后被表面修饰。
与包括mRNA作为主要组分的常规疫苗组合物相比，本发明的疫苗组合物即使在较高温度下贮存，也可以维持其效果持续预定的时间。例如，即使在-70℃至25℃贮存2周，多孔二氧化硅颗粒上承载的核酸的量可以不减少，并且多孔二氧化硅颗粒上承载的核酸可以不被降解或其序列无修改，由此也合成正常的蛋白质。优选地，在低温下贮存疫苗组合物是有利的，但也可以在25℃、20℃、15℃、10℃、4℃或0℃的温度下贮存。
由于核酸的高翻译效率和/或中和抗体生产能力；或载体的高递送效率，本发明的疫苗组合物可以诱导高免疫应答，即使所述组合物不包括佐剂。然而，疫苗组合物可以进一步包括佐剂以诱导较高免疫应答。佐剂可以由本领域技术人员来选择而没有限制，只要其旨在增强疫苗组合物的效果即可。佐剂的实例可以包括选自由以下组成的组中的至少一种：Alum(铝盐)、IL-12、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、角鲨烯、MF59、AS03、AS04、poly(I:C)、MPL(单磷酰脂质A)、GLA、鞭毛蛋白、Imiquimod、R848、CpG ODN、CpG DNA、皂素(QS-21)、C型凝集素配体(TDB)、α-半乳糖神经酰胺、胞壁酰二肽、脂多糖(LPS)、KuilA、AS01(与单磷酰脂质A和皂素QS-21混合的脂质体)、IC31(寡核苷酸和阳离子肽)、CFA01(阳离子脂质体)、和GLA-SE(MPL和葡萄糖吡喃酰基脂质的水包油乳液)，但不限于此。
本发明的疫苗组合物可以进一步包含药学上可接受的载体，并且可以与此类载体一起配制。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不刺激生物体并且不抑制所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。配制为液体溶液的组合物中可接受的药物载体是无菌且生物相容的，并且可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、和这些成分中的一种以上的混合物。此外，如果需要，可以添加其它典型添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。还可以额外地添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂和润滑剂以将疫苗组合物配制成注射剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，例如水溶液、悬浮液、和乳液等。
本发明的疫苗组合物适用于任何制剂形式，并且可以制备成口服或肠胃外制剂。本发明的药物制剂可以包括适用于口服、直肠、鼻、局部(包括面颊和舌下)、皮下、阴道或肠胃外(肌下、皮下)施用的形式。
疫苗组合物的多孔二氧化硅颗粒在通过肌下注射、肿瘤注射等来施用时，在引入的局部部位与细胞结合，并递送其中承载的核酸，从而将疫苗组合物特异性地递送至特定组织，但不限于此。例如，在静脉内注射的情况下，其中承载的核酸可以沿着血管全身释放。
本发明的疫苗组合物以药学有效量施用。有效剂量水平可以取决于患者的疾病的类型或严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和释放速率、治疗持续时间、包括同时用药在内的因素以及医疗领域众所周知的其它因素来确定。本发明的疫苗组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合施用，可以与常规治疗剂依次或同时施用，并且可以以单剂量或多剂量施用。综合考虑上述因素，重要的是以可以达到最大效果的最小的量施用疫苗组合物且无副作用，这是本领域技术人员容易确定的。
本发明的疫苗组合物的施用量、即剂量可以取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况或饮食、施用时间、施用方法、排泄率和疾病的严重程度而有很大变化，并且合适的剂量取决于例如在患者体内累积的药物量和/或所使用的本发明的载体的特定功效。例如，所述量可以是每kg体重0.01μg至1g。此外，本发明的疫苗组合物可以在诸如每天、每周、每月或每年等单位时间段内每单位时间施用一次或多次，或者可以使用输液泵长时间连续施用。考虑到药物在体内的滞留时间、体内的药物浓度等来确定重复施用剂量的次数。根据疾病治疗的过程，即使在治疗后也可以进一步施用组合物以防止复发，即，疾病的复发。
下文中，参考以下实施例详细描述本发明。
实施例1：多孔二氧化硅颗粒(DegradaBALL)的制备
1.多孔二氧化硅颗粒的制备
(1)多孔二氧化硅颗粒的制备
1)小孔颗粒的制备
将960mL的蒸馏水(DW)和810mL的MeOH置于2L圆底烧瓶中。将7.88g的CTAB添加至烧瓶中，然后在搅拌下快速添加4.52mL的1M NaOH。在搅拌10分钟的同时添加均质混合物后，进一步添加2.6mL的TMOS。在搅拌6小时以均匀混合后，将反应溶液老化24小时。
然后，将反应溶液在8,000rpm和25℃下离心10分钟以去除上清液，在8,000rpm和25℃下离心10分钟的同时用乙醇和蒸馏水交替洗涤5次。
其后，将所得产物在70℃在烘箱中干燥以收获1.5g的粉末状小孔多孔二氧化硅颗粒(孔平均直径为2nm，并且颗粒尺寸为200nm)。
2)孔扩张
将1.5g的小孔多孔二氧化硅颗粒粉末添加至10mL的乙醇中并进行超声波分散，并且进一步添加10mL的水和10mL的TMB(三甲基苯)，然后进行超声波分散。
其后，将分散液置于高压釜中，并且在160℃反应48小时。
反应在25℃开始并且在以10℃/min的速率升高温度的同时进行，然后在高压釜中以1至10℃/min的速率缓慢冷却。
将冷却的反应溶液在8,000rpm和25℃下离心10分钟以去除上清液，并且在8,000rpm和25℃下离心10分钟的同时用乙醇和蒸馏水交替洗涤5次。
然后，将产物在70℃在烘箱中干燥以收获粉末状多孔二氧化硅颗粒(孔径为10至15nm，并且颗粒尺寸为200nm)。
3)煅烧
将在上述2)中制备的多孔二氧化硅颗粒置于玻璃小瓶中，在550℃加热5小时，并且在反应完成后缓慢冷却至室温以制备颗粒。
(2)多孔二氧化硅颗粒的制备
除了将孔扩张时的反应条件改变为140℃和72小时以外，通过与上述实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(3)多孔二氧化硅颗粒的制备(10L规模)
除了使用大5倍的容器并且每种物质以5倍容量使用以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(4)多孔二氧化硅颗粒的制备(颗粒尺寸为300nm)
除了使用920mL的蒸馏水和850mL的甲醇来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(5)多孔二氧化硅颗粒的制备(颗粒尺寸为500nm)
除了使用800mL的蒸馏水、1,010mL的甲醇和10.6g的CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(6)多孔二氧化硅颗粒的制备(颗粒尺寸为1,000nm)
除了使用620mL的蒸馏水、1,380mL的甲醇和7.88g的CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(7)多孔二氧化硅颗粒的制备(孔径为4nm)
除了将2.5mL的TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(8)多孔二氧化硅颗粒的制备(孔径为7nm)
除了将4.5mL的TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(9)多孔二氧化硅颗粒的制备(孔径为17nm)
除了将11mL的TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(10)多孔二氧化硅颗粒的制备(孔径为23nm)
除了将12.5mL的TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(11)多孔二氧化硅颗粒的制备
除了将900mL的蒸馏水、850mL的甲醇和8g的CTAB用于制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
2.多孔二氧化硅颗粒的表面修饰
(1)使实施例1-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应以使其带正电荷。
具体地，用浴超声仪(bath sonicator)将100mg的多孔二氧化硅颗粒分散在100mL圆底烧瓶中的10mL甲苯中。然后，添加1mL的APTES并且在400rpm和130℃下搅拌12小时。
反应后，将产物缓慢地冷却至室温并且以8,000rpm离心10分钟以去除上清液，并且在8,000rpm和25℃下离心10分钟的同时用乙醇和蒸馏水交替洗涤5次。
其后，将产物在70℃在烘箱中干燥以收获在颗粒的表面上和孔的内部具有氨基的粉末状多孔二氧化硅颗粒。
(2)除了使用1.8mL的APTES以外，通过与上述相同的方法对实施例1-1-(11)的产物进行表面修饰，从而获得在颗粒的表面上和孔的内部具有氨基的粉末状多孔二氧化硅颗粒。
3.颗粒形成和孔扩张的确定
在显微镜下观察在实施例1-1-(1)至(3)中制备的小孔颗粒和多孔二氧化硅颗粒，以确认小孔颗粒是否均匀地形成、或者孔是否充分地扩张以均匀地形成多孔二氧化硅颗粒(图1至4)。
图1是实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，图2是实施例1-1-(2)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，从这些附图可以看出，均匀地形成了具有充分扩张的孔的球形多孔二氧化硅颗粒。图3是实施例1-1-(1)中的小孔颗粒的照片，图4是实施例1-1-(1)和1-1-(3)中的小孔颗粒的比较照片，从这些附图可以看出，均匀地形成了球形小孔颗粒。
4.孔径和BET表面积的计算
计算实施例1-1-(1)的小孔颗粒和实施例1-1-(1)、(7)、(8)、(10)和(11)的多孔二氧化硅颗粒的表面积和孔径。通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)法计算表面积，并且通过Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法计算孔径分布。
颗粒的显微照片在图5中示出，计算结果在下表1中示出。
[表1]
颗粒分类 孔径(nm) BET表面积(m2/g)
1-1-(1)的小孔颗粒 2.1 1,337
1-1-(7) 4.3 630
1-1-(8) 6.9 521
1-1-(1) 10.4 486
1-1-(10) 23 395
1-1-(11) 12.3 379
5.生物降解性的确定
为了确定实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性，在0小时、120小时和360小时、在显微镜下观察在SBF(pH 7.4)中在37℃下的生物降解性，并且其结果在图6中示出。参照图6可以看出，多孔二氧化硅颗粒被生物降解并且在360小时之后几乎完全降解。
6.吸光度比的测定
根据下式1测定随时间的吸光度比。
[式1]
At/A0
(其中A0是如下测定的多孔二氧化硅颗粒的吸光度：将5mL的含有1mg/ml的多孔二氧化硅颗粒的悬浮液置于具有孔径为50kDa的孔的圆筒状渗透膜中，
使15mL的与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在60rpm和37℃下水平地搅拌渗透膜的内部和外部，和
At表示从测定A0开始经过“t”小时后测定的多孔二氧化硅颗粒的吸光度)。
具体地，将5mg的多孔二氧化硅颗粒粉末溶解于5mL的SBF(pH 7.4)中。其后，将5mL的多孔二氧化硅颗粒溶液置于图7中示出的具有孔径为50kDa的孔的渗透膜中。将15mL的SBF添加至外膜，并且每12小时更换外膜的SBF。多孔二氧化硅颗粒的降解在37℃、在60rpm的水平搅拌下进行。
然后，通过UV-可见光谱法测定吸光度并且在λ＝640nm进行分析。
(1)吸光度比的测定
根据上述方法测定实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度比，其结果在图8中示出。
参照图8可以看出，在吸光度比达到1/2时，t为约58小时，表明非常缓慢的降解。
(2)粒径
根据上式1测定实施例1-1-(1)、(5)和(6)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，其结果在图9中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。
参照图9可以看出，t随颗粒尺寸的增加而降低。
(3)平均孔径
根据上式1测定实施例1-1-(1)和(9)的多孔二氧化硅颗粒以及作为对照的实施例1-1-(1)的小孔多孔二氧化硅颗粒的吸光度，其结果在图10中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。
参照图10可以看出，与对照相比，本发明实施例的多孔二氧化硅颗粒具有显著更大的t。
(4)pH
测定每个pH的实施例1-1-(4)的多孔二氧化硅颗粒的吸光度。在SBF中和在pH 2、5和7.4的Tris中测定吸光度，其结果在图11中示出。
参照图11可以看出，虽然t根据pH而存在差异，但是在所有吸光度比达到1/2时，t为20以上。
(5)带电荷
测定实施例1-2-(1)的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，其结果在图12中示出(Tris(pH 7.4)用作悬浮液和溶剂)。
参照图12可以看出，在带正电荷的颗粒的吸光度比达到1/2时，t为20以上。
实施例2.mRNA核苷酸序列的选择和在载体上承载
1.mRNA核苷酸序列的选择
选择下表2中的6个序列Seq 1至Seq 6，同时改变编码冠状病毒的刺突蛋白的核苷酸序列和与其连接的核酸序列。表2显示包括病毒受体和与其连接的序列的mRNA构成。SEQID NO:6的atgttcgtgttcctggtgctgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtg核苷酸序列用于信号肽(SP)，SEQ ID NO:2的核苷酸序列，其是COVID-19的RBD序列，用于相应的RBD，SEQ IDNO:12的核苷酸序列用于完整刺突蛋白。
[表2]
*SP：信号肽，*RBD：受体结合结构域
2.mRNA-DegradaBALL的制备
(1)重量比为1:10的mRNA-DegradaBALL
DegradaBALL，其中与上述实施例1-2-(1)中同样地对上述实施例1-1-(11)的多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰，用作载体。
在将150μg的载体粉末与15μg的上述实施例2-1的Seq.1至Seq.6的每种mRNA序列混合后，将混合物溶解于50μL的PBS中，轻轻摇动以制备mRNA-DegradaBALL。
(2)重量比为1:8的mRNA-DegradaBALL
除了将DegradaBALL的剂量改变为120μg以外，通过采用与实施例2-2-(1)相同的方式来制备mRNA:DegradaBALL的重量比为1:8的mRNA-DegradaBALL。
3.mRNA-DegradaBALL的重量比的确定
将上述实施例2-2-(1)和(2)中制备的mRNA-DegradaBALL在室温下贮存30分钟，然后以13,000rpm离心5分钟。
从离心后的溶液获得上清液，在λ＝260nm测定吸光度。
基于上清液中剩余的mRNA的量来计算承载在DegradaBALL上的mRNA的量。
作为结果，证实了80％以上的mRNA承载在DegradaBALL上，无论与所有Seq.1至Seq.6混合的DegradaBALL粉末的重量如何。然而，当与150μg的DegradaBALL混合时，证实了90％以上的mRNA承载在DegradaBALL上，表现出更高的负载效率，因此将其设定为用于承载mRNA的最佳条件(图13)。
4.DegradaBALL的稳定性试验
在-20℃或-70℃的温度条件下，将上述实施例2-2-(1)的mRNA-DegradaBALL分别置于2％或4％蔗糖-PBS中，然后贮存7天。
通过分别在贮存之前和之后测定在λ＝260nm的吸光度来确认mRNA负载量的变化。
作为结果，证实了维持了90％以上的所承载的mRNA，无论蔗糖浓度、贮存温度或mRNA序列，从而证实了DegradaBALL可以稳定地承载mRNA(图14)。
5.根据mRNA核苷酸序列的翻译效率
(1)体外
所有细胞在CO2培养箱(SANYO Electric,Osaka,Japan)中在37℃和5％CO2条件下培养。A549细胞在含有10％ FBS(v/v)和10单位/mL的青霉素/链霉素的F-12K培养基中培养。CT26细胞在含有10％ FBS(v/v)和10单位/mL青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养。
将5×104个A549细胞分配在24孔板中，并将mRNA-DegradaBALL(其中将1μg的上述实施例2-1的每种mRNA与10μg的通过如上述实施例1-2(1)中所述对上述实施例1-1-(11)的多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰而获得的DegradaBALL混合)或者未承载在载体上的Seq.1注射至各个细胞，并在无血清F-12K培养基中进行转染6小时。然后，用生长培养基替换所述培养基并进一步培养18或32小时。
培养后，分离细胞并以2,500rpm离心10分钟，取得上清液，通过Elisa(SARS-CoV-2RBD ELISA试剂盒，ab289833)分析RBD的翻译效率。
作为结果，证实了RBD在所有Seq.1至Seq.5中显著翻译，它们之中，证实了Seq.1翻译RBD至最高水平(图15)。
(2)体内
以下所有动物实验均按照首尔大学(Seoul National University)的实验动物护理和使用委员会(IACUC)进行。Balb/C雌性小鼠购自ORIENT BIO(Seongnam,Korea)。实验期间，将动物保持在19至25℃的温度、40至70％的湿度、12小时光照和12小时黑暗的周期的环境条件下。
分别地，将上述实施例2-5-(1)的mRNA-DegradaBALL溶解于100μL的无菌PBS中，并通过肌下注射来递送至Balb/C小鼠。在诱导初次免疫应答2周后，收集血清，通过ELISA测定与SARS-CoV-2S1-RBD特异性结合的IgG的浓度。使用本领域技术人员已知的方法进行ELISA(Abcam,ab275300)测定。
作为结果，证实了在用承载在DegradaBALL上的Seq.3mRNA注射的小鼠中检测到最具SARS-CoV-2S1-RBD-特异性的IgG(图16)。基于上述结果，选择Seq.3作为在实际体内水平下显示出高疫苗效率的mRNA序列。
实施例3.药物剂量范围和功效试验
1.药物剂量范围和施用周期
分别地，将0μg(泳道1)、7.5μg(泳道2)、15μg(泳道3)和45μg(泳道4)的Seq.3承载在0μg(泳道1)、75μg(泳道2)、150μg(泳道3)和450μg(泳道4)的DegradaBALL上，所述DegradaBALL通过如上述实施例1-2(1)中所述对上述实施例1-1-(11)的多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰而获得，并溶解于100μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，在第0周、和第2周肌下注射至Balb/C小鼠。
最后一次注射后一周，从小鼠收集血清，并通过ELISA(Abcam,ab275300)测定与SARS-CoV-2S1-RBD特异性结合的IgG的浓度。
作为结果，在用Seq.3施用的所有实验组中，观察到与RBD结合的IgG与施用剂量成比例地增加(图17)。
基于IgG生产在用45μg的高剂量处理的组中与用其它剂量处理的组相比显著增加的结果，确定了施用剂量和周期，即以2周间隔施用45μg的Seq.3。
2.结合抗体的浓度的确定
将45μg的Seq.3承载在上述实施例3-1的DegradaBALL上，并溶解在100μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后在第0周和第2周肌下注射至Balb/C小鼠。
在首次注射后2、3、5周的时间点收集血清，通过ELISA(Covid-19 S1 RBD蛋白质人IgG Elisa试剂盒，RayBiotech,IEQ-CoVSN-IgG-1；山羊抗小鼠IgG Fc(biotin),Abcam)测定与SARS-CoV-2S1-RBD特异性结合的IgG的浓度。
3.中和抗体的浓度的确定
为了确定抗体的中和能力，用实施例3-2中收集的血清进行替代病毒中和试验(sVNT)。
具体地，使用SARS-CoV-2刺突RBD-ACE2封闭抗体检测ELISA试剂盒(cellsignaling technology)产品、通过ELISA方法对sVNT进行分析。
作为结果，即使在自首次注射2周时间间隔(lapsed)后的组中(泳道2)，检测到SARS-COV-2S1-RBD-特异性IgG，但显示出16至42％(平均30.56％)的中和活性。
另一方面，与2周时间间隔组相比，在3周和5周时间间隔后的其余实验组中，检测到显著更高的与SARS-COV-2S1-RBD特异性结合的IgG水平，并且在sVNT实验中，3周时间间隔实验组和5周时间间隔实验组表现出明显不同的中和能力，分别为约63至108％(平均82.31％)的中和能力和约53至100％(平均83.89％)的中和能力(图18和19)。
4.表达持续时间和表达位置的确定
为了确认在将mRNA-DegradaBALL递送至小鼠时的mRNA的表达位置和表达持续时间，将承载10μg的编码Fluc的报告mRNA(reporter mRNA)的实施例3-1的DegradaBALL溶解在100μL的PBS中，并通过肌下或瘤内注射(IT)递送至Balb/C小鼠中。
对于瘤内注射的分析，通过皮下注射在含有Matrigel的100μL无菌1xPBS溶液中的CT26细胞(1x 106)来制备荷瘤小鼠(Balb/C)。当肿瘤体积达到约200mm3时，将承载报告mRNA的DegradaBALL或不承载mRNA的DegradaBALL分别注射至小鼠的肿瘤部位。
然后，随着时间的推移(6小时、1天、2天、4天和7天)，将100μL的荧光素溶液(DPBS中0.3mg/mL)腹腔内施用至小鼠，施用1分钟后，通过体内光学成像系统(IVIS)分析发光的位置和强度。在注射后第7天，收集肿瘤、肺、心脏、肾脏、肝脏和胸腺并确认发光水平。
作为结果，证实了在肌下注射时，即使在注射后10天，注射部位附近也显著发光，并且在注射部位以外的其它组织中没有观察到信号(图20和22)。同样地，也证实了即使在瘤内注射时，即使在约7天后，荧光素酶仍然表达，并且在除了肿瘤组织以外的任何器官中没有观察到信号(图21)。通过相应的实验数据，证实了通过DegradaBALL，所承载的mRNA在期望的递送部位有效地累积，不会移动到注射部位以外的其它器官，以及可以长时间释放所承载的mRNA来诱导连续表达。
5.mRNA-LNP和DegradaBALL-mRNA之间的效率的比较
除了将mRNA承载在LNP(invivofectamine 3.0Reagent,Thermo Fischer)上、而不是在DegradaBALL上以外，使用与实施例3-2和实施例3-3中用于确认是否产生结合抗体/中和抗体的实验方法、以及实施例3-4中用于确认表达持续时间和表达位置的实验方法相同的方法来进行实验，将体内表达持续时间、肌下注射后的表达部位、结合抗体的生产水平和中和抗体的生产水平与使用实施例2-2的mRNA-DegradaBALL的情况进行比较。
[表3]
分类 mRNA-LNP mRNA-DegradaBALL
体内表达持续时间 约1天 约21天
IM施用后的表达部位 肝脏(90％)，注射部位(10％) 注射部位(90％)，次级淋巴器官(10％)
是否生产结合抗体 +++++ +++++
是否生产中和抗体 ++ ++++
如表3所示，与承载在本发明的DegradaBALL上相比，在以mRNA-LNP的形式体内递送时，表达持续时间相对较短，约1天，递送至其它组织的比例高，例如约90％在注射部位以外的肝脏中表达，等等，以及防止抗原与靶受体结合的中和抗体的产生量低。
6.体内DegradaBALL稳定性试验
将上述实施例2-2的mRNA-DegradaBALL在4℃贮存2周，然后通过与上述实施例3-4相同的方法肌下注射至小鼠，在6小时和48小时后确认是否发射荧光以及荧光的位置。
作为结果，证实了与在-70℃贮存的DegradaBALL相比，即使在4℃贮存2周，注射后6小时的表达水平也没有差异，并且即使自注射48小时时间间隔后也观察到非常高的表达水平(图23和24)。
<110> 雷莫内克斯生物制药有限公司（LEMONEX INC.）
<120> 用于治疗或预防病毒疾病的疫苗组合物
<130> 22P02011
<150> US 63/194,310
<151> 2021-05-28
<150> KR 10-2022-0066317
<151> 2022-05-30
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 稳定化序列
<400> 1
ggctacatcc ctgaagcgcc tagagacggc cagtgctacg tgagatgcga cggcgaatgg 60
gtgctgctgt ccactttcct g 81
<210> 2
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COVID-19受体结合结构域编码序列
<400> 2
agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60
ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120
agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180
tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240
tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300
gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360
aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc ggtatagatt gtttaggaag 420
tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480
ccttgtaatg gtgttcaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540
cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600
catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660
gtcaatttcg aagccgctgc taaggaagcc gctgctaag 699
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列1
<400> 3
ggctctggtt ctggctct 18
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列2
<400> 4
gaagccgccg ccaaggaagc cgccgccaag gaagccgccg ccaaggaagc cgccgccaag 60
gaagccgccg ccaag 75
<210> 5
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列3
<400> 5
tccggcggc 9
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽编码序列
<400> 6
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtg 48
<210> 7
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq.1
<400> 7
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaagtga tga 753
<210> 8
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq.2
<400> 8
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaagggc tacatccctg aagcgcctag agacggccag 780
tgctacgtga gatgcgacgg cgaatgggtg ctgctgtcca ctttcctgtg atga 834
<210> 9
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq.3
<400> 9
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaagggc tctggttctg gctctggcta catccctgaa 780
gcgcctagag acggccagtg ctacgtgaga tgcgacggcg aatgggtgct gctgtccact 840
ttcctgtgat ga 852
<210> 10
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq.4
<400> 10
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaaggaa gccgccgcca aggaagccgc cgccaaggaa 780
gccgccgcca aggaagccgc cgccaaggaa gccgccgcca agggctacat ccctgaagcg 840
cctagagacg gccagtgcta cgtgagatgc gacggcgaat gggtgctgct gtccactttc 900
ctgtgatga 909
<210> 11
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq.5
<400> 11
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgag agtccaacca 60
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 120
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 180
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 240
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 300
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 360
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 420
tctaaggttg gtggtaatta taattaccgg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 480
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 540
gttcaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 600
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 660
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat ttggttaaaa acaaatgtgt caatttcgaa 720
gccgctgcta aggaagccgc tgctaagtcc ggcggcggct acatccctga agcgcctaga 780
gacggccagt gctacgtgag atgcgacggc gaatgggtgc tgctgtccac tttcctgtga 840
tga 843
<210> 12
<211> 3825
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq.6
<400> 12
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgcgtgaa tctgactact 60
agaactcagc tgcctcctgc gtacactaat tccttcacta gaggcgtgta ctaccctgac 120
aaagttttca gatcctccgt tctgcactcc actcaggacc tgttcctgcc tttcttctcc 180
aatgtgactt ggttccacgc gatccacgtg tccggcacta atggcactaa gagattcgac 240
aatcctgtgc tgcctttcaa tgacggcgtg tacttcgcgt ccactgaaaa gtccaatatc 300
atcagaggct ggatcttcgg cactactctg gactccaaga ctcagtccct gctgatcgtg 360
aataatgcga ctaatgtggt gatcaaggtg tgcgaattcc agttctgcaa tgaccctttc 420
ctggacgtgt actaccacaa gaataataag tcctggatga agtccgaatt cagagtgtac 480
tcctccgcga ataattgcac tttcgaatac gtgtcccagc ctttcctgat ggacctggaa 540
ggcaagcagg gcaatttcaa gaatctgaga gaattcgtgt tcaagaatat cgatggttac 600
ttcaagatct actccaagca cactcctatc aatctggtga gagacctgcc tcagggcttc 660
tccgcgctgg aacctctggt ggacctgcca atcggtatca acatcactag attccagact 720
ctgctggcgc tgcacagatc ctacctgact cctggcgact cctcctccgg ctggactgcg 780
ggcgcggcgg cgtactacgt gggctacctg cagcctagaa ctttcctgct gaagtacaat 840
gaaaatggca ctatcactga cgcggtggac tgcgcgctgg accctctgtc cgaaactaag 900
tgcactctga agtccttcac tgtggaaaag ggcatctacc agacttccaa tttccgggtg 960
cagcctaccg aaagcatcgt gcggttcccc aatatcacta acctgtgccc tttcggcgaa 1020
gtgttcaatg ccactcggtt cgccagcgtg tacgcctgga accggaagcg gatctccaac 1080
tgcgtggccg actactccgt gctgtacaat tccgccagct tctccacctt caagtgctac 1140
ggcgtgagcc ctactaagct gaatgacctg tgcttcacta atgtgtacgc cgacagcttc 1200
gtgatccggg gcgacgaagt gcggcagatc gcccctggcc agaccggcaa gatcgccgac 1260
tacaactaca agctgcccga cgacttcact ggctgcgtga tcgcctggaa ttccaataat 1320
ctggactcca aggtgggcgg caattacaat taccggtacc ggctgttccg gaagtccaat 1380
ctgaagcctt tcgaacggga catctccacc gaaatctacc aggccggctc cactccctgc 1440
aatggcgtgc agggcttcaa ttgctacttc cctctgcagt cctacggctt ccagcctact 1500
aatggcgtgg gctaccagcc ttaccgggtg gtggtgctgt ccttcgaact gctgcacgcc 1560
cctgccactg tgtgcggccc taagaagtcc actaatctgg tgaagaataa gtgcgtgaat 1620
ttcaatttca atggcctgac tggcactggc gtgctgactg aatccaataa gaagttcctg 1680
cctttccagc agttcggccg ggacatcgcc gacactactg acgccgtgcg ggaccctcag 1740
actctggaaa tcctggacat cactccttgc tccttcggcg gcgtgtccgt gatcactcct 1800
ggcactaata cttccaatca ggtggccgtg ctgtaccagg gcgtgaattg cactgaagtg 1860
cctgtggcca tccacgccga ccagctgact cctacttggc gggtgtactc cactggctcc 1920
aatgtgttcc agactcgggc cggctgcctg atcggcgccg aacacgtgaa taattcctac 1980
gaatgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgcgcctcct accagactca gactaattcc 2040
cggcgggccg ccgcctccgt ggcctcccag tccatcatcg cctacactat gtccctgggc 2100
gccgaaaatt ccgtggccta ctccaataat tccatcgcca tccctactaa tttcactatc 2160
tccgtgacta ctgaaatcct gcctgtgtcc atgactaaga cttccgtgga ctgcactatg 2220
tacatctgcg gcgactccac tgaatgctcc aatctgctgc tgcagtacgg ctccttctgc 2280
actcagctga atcgggccct gactggcatc gccgtggaac aggacaagaa tactcaggaa 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag actcctccta tcaaggactt cggcggcttc 2400
aatttctccc agatcctgcc tgacccttcc aagccttcca agcggtcctt catcgaagac 2460
ctgctgttca ataaggtgac tctggccgac gccggcttca tcaagcagta cggcgactgc 2520
ctgggcgaca tcgccgcccg ggacctgatc tgcgcccaga agttcaatgg cctgactgtg 2580
ctgcctcctc tgctgactga cgaaatgatc gcccagtaca cttccgccct gctggccggc 2640
actatcactt ccggctggac tttcggcgcc ggcgccgccc tgcagatccc tttcgccatg 2700
cagatggcct accggttcaa tggcatcggc gtgactcaga atgtgctgta cgaaaatcag 2760
aagctgatcg ccaatcagtt caattccgcc atcggcaaga tccaggactc cctgtcctcc 2820
actgcctccg ccctgggcaa gctgcaggac gtggtgaatc agaatgccca ggccctgaat 2880
actctggtga agcagctgtc ctccaatttc ggcgccatct cctccgtgct gaatgacatc 2940
ctgtcccggc tggaccctcc tgaagccgaa gtgcagatcg accggctgat cactggccgg 3000
ctgcagtccc tgcagactta cgtgactcag cagctgatcc gggccgccga aatccgggcc 3060
tccgccaatc tggccgccac taagatgtcc gaatgcgtgc tgggccagtc caagcgggtg 3120
gacttctgcg gcaagggcta ccacctgatg tccttccctc agtccgcccc tcacggcgtg 3180
gtgttcctgc acgtgactta cgtgcctgcc cacgaaaaga atttcactac tgcccctgcc 3240
atctgccacg acggcaaggc ccacttccct cgggaaggcg tgttcgtgtc caatggcact 3300
cactggttcg tgactcagcg gaatttctac gaacctcaga tcatcactac tgacaatact 3360
ttcgtgtccg gcaattgcga cgtggtgatc ggcatcgtga ataatactgt gtacgaccct 3420
ctgcagcctg aactggactc cttcaaggaa gaactggaca agtacttcaa gaatcacact 3480
tcccctgacg tggacctggg cgacatctcc ggcatcaatg cctccgtggt gaatatccag 3540
aaggaaatcg accggctgaa tgaagtggcc aagaatctga atgaatccct gatcgacctg 3600
caggaactgg gcaagtacga acagtacatc aagtggcctt ggtacatctg gctgggcttc 3660
atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg actatcatgc tgtgctgcat gacttcctgc 3720
tgctcctgcc tgaagggctg ctgctcctgc ggctcctgct gcaagttcga cgaagacgac 3780
tccgaacctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacactt gatga 3825

Claims (14)

1.一种以下序列的核酸分子：
RBD-(L)n-X
(其中，RBD是包括刺突蛋白中的受体结合结构域的至少一部分区域的序列，L是接头序列，n是0或1，X是SEQ ID NO:1的核苷酸序列)。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述RBD是通过其受体结合结构域形成三聚体的病毒衍生序列。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述RBD的长度为100nt至5,000nt。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述RBD是SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，其中L是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述RBD是选自由以下组成的组中的病毒衍生序列：疱疹病毒科、正黏液病毒科、炮弹病毒科、副黏液病毒科、乳头瘤病毒科、腺病毒科、细小病毒科、星状病毒科、呼肠孤病毒科、布尼亚病毒科、动脉炎病毒科、杯状病毒科、肝炎病毒科、玻那病毒科、沙粒病毒科、披膜病毒科、丝状病毒科、逆转录病毒科、黃病毒科和冠状病毒科。
7.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述RBD是选自由以下组成的组中的病毒衍生序列：可乐冠状病毒、德卡冠状病毒、杜维那冠状病毒、鹿城冠状病毒、米纳冠状病毒、米奴那冠状病毒、麦欧塔冠状病毒、奈可塔冠状病毒、配达冠状病毒、莱娜冠状病毒、塞特拉冠状病毒、索拉冠状病毒、特噶冠状病毒、艾姆贝冠状病毒、海贝冠状病毒、麦本冠状病毒、诺本冠状病毒、萨本冠状病毒、布莱岗冠状病毒、开岗冠状病毒、艾岗冠状病毒、艾德冠状病毒、布尔德冠状病毒和海尔德冠状病毒。
8.一种病毒疫苗组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子。
9.根据权利要求8所述的病毒疫苗组合物，其中所述核酸分子承载在选自由以下组成的组中的载体上：病毒载体、病毒样颗粒(VLP)、带正电荷的聚合物、脂质体、脂质纳米颗粒、金、半导体量子点、碳纳米管和多孔二氧化硅颗粒。
10.根据权利要求8所述的病毒疫苗组合物，其中所述核酸分子承载在多孔二氧化硅颗粒上。
11.根据权利要求10所述的病毒疫苗组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒的平均孔径为5nm至100nm。
12.根据权利要求10所述的病毒疫苗组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒在孔的内部带正电荷。
13.根据权利要求10所述的病毒疫苗组合物，其中所述多孔二氧化硅颗粒为生物降解性颗粒。
14.根据权利要求10所述的病毒疫苗组合物，其中所述核酸分子与所述多孔二氧化硅颗粒的重量比为1:1至30。
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