KR102527194B1

KR102527194B1 - 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물

Info

Publication number: KR102527194B1
Application number: KR1020210009256A
Authority: KR
Inventors: 신지환
Original assignee: 신지환
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2023-04-27
Also published as: WO2022158761A2; KR20230022912A; WO2022158761A3; KR20220106386A

Abstract

본 발명은 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물에 관한 것이다.

Description

인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물 {Composition for cognitive function improvement, memory improvement, stress relief and anti-anxiety}

본 발명은 인지기능개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물에 관한 것이다.

현대인에게 기억력은 급변하는 생활에서 그 중요성이 증대되고 있으며, 사회적으로 학습량이 많은 청소년에서부터 노년에 이르기까지 주요 관심 대상이 되고 있다.

또한, 최근 생활수준의 향상과 의학기술의 발달에 따라 노령 인구가 증가하여 인구의 고령화 현상이 두드러지고 있으며, 조직사회의 치열한 경쟁화에 따른 극심한 스트레스로 인한 성인병의 발병률 또한 급격한 증가 추세를 보이고 있다. 사망원인의 경우 과거 주원인이었던 감염형 질환에서 대표적인 성인병인 순환기계 질환, 암 등에 의한 사망이 전체의 절반을 넘기기에 이르렀다. 이에 건강한 삶을 누리고자 하는 '웰빙(wellbeing)' 이 하나의 큰 관심사로 대두하게 되고 장수에 대한 욕구 증가로 일상생활을 통한 성인병 및 노인성 질환에 대한 예방에 관심이 고조되고 있다. 최근 식품성분에 대해 새로운 관점에서의 체계적인 연구가 발전함에 따라 식품기원의 특정 성분들이 인체의 신경계, 생체 방어계, 세포분화(cell differentiation) 등 각종 생리기능 조절계 등에 작용하여 직간접적으로 생체조절기능 효과를 나타낸다는 사실들이 밝혀지고 있다. 이들 특정성분들에 의한 생체 조절계 및 생체 방어계에 대한 적절한 조절이 가능하게 된다면 그것은 가장 자연스러운 건강유지를 위한 최적의 수단이 될 수 있음을 의미한다.

노인성 치매의 일종인 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)로부터 유발되는 기억력 및 학습능력의 상실 등 인지 기능 장애는 대뇌 기저부의 아세틸콜린(Acethylcholine)성 신경세포의 손상에서 비롯된다는 연구결과에 의해 무스카린성 아세틸콜린 수용체(muscarine acetylcholine receptor)에 대한 효능제(agonist), 아세틸콜린 생성촉진제, 아세틸콜린 분해효소(Acetylcholinesterase, AChE) 저해제 등 여러 가지 작용기전에 따라 아세틸콜린성 신경세포의 기능을 강화시켜줄 수 있는 약물들이 개발되어 왔다. 실제로 현재 각국에서 사용되고 있는 알츠하이머병 치료제는 이러한 아세틸콜린 분해효소 억제제가 대부분이며, 타크린(tacrine)과 도네페질(donepezil)등이 이에 속한다. 이 밖에도 리바스티그민(rivastigmin), 갈라타민(galatamine) 등이 사용되고 있다.

오늘날은, 퇴행성 뇌신경 질환으로 인한 인지기능 또는 기억능력 저하 현상 개선을 위한 더욱 효과적인 제제(건강기능성 식품 소재 포함)의 개발 수요가 어느 때보다 높은 시기이다. 결국, 퇴행성 뇌신경 질환, 특히 치매 치료에 탁월한 효과를 나타내고 부작용이 없는 치료제에 대한 연구개발이 절실한 실정이다.

이와 관련된, 종래의 기술로, 대한민국 등록특허공보 제10-0861730호에는 연자육 추출물을 함유하는 인지기능 장애 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물이 개시된 바 있는데, 이는 연자육 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 연자육 추출물은 마우스의 수동회피시험에서 우수한 기억력 및 학습능력 향상 효과와 뇌세포 증식에 탁월한 증가 효과를 나타내므로 인지기능 장애 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있도록 한 것이다.

그러나, 상기 인지기능 장애 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물은 연자육 60 내지 80% 메탄올 가용 추출물을 포함하는 것으로써, 인지기능 개선 효과가 미미하다는 문제점이 있었고, 이를 개선하기 위해 상이한 방법으로 제조되어 효과를 더욱 증대시킬 수 있는 조성물의 필요성이 커지고 있었다.

대한민국 등록특허공보 제10-0861730호(2008.10.06.공고), "연자육 추출물을 함유하는 인지기능 장애 관련 질환의예방 및 치료용 조성물"

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 인지기능개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 연자육(연자)추출물을 포함하여 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 연자육(연자)추출물은 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 추출되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물을 포함하여 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 연자육(연자)추출물과 원지추출물은 30 : 70 ~ 70 : 30의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연자육(연자)추출물과 원지추출물은 80 ~ 120 rpm으로 교반되면서 4 ~ 8시간 동안 혼합되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물은 인지기능 개선 효과, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는다.

도 1는 수동회피실험을 통한 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 인지기능 개선 효과를 나타낸 그래프
도 2은 비스트레스 모델에서 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 EPM 측정 이동거리를 나타낸 그래프
도 3는 SDS 모델의 EPM 측정 및 비스트레스 모델과의 이동 거리 비교를 나타낸 그래프
도 4는 SDS 모델의 EPM 측정 및 비스트레스 모델과의 이동 시간 비교를 나타낸 그래프
도 5은 SHS 모델의 EPM 측정 및 비스트레스 모델과의 이동 거리 비교를 나타낸 그래프
도 6은 SHS 모델의 EPM 측정 및 비스트레스 모델과의 이동 시간 비교를 나타낸 그래프
도 7은 Y-maze test를 통한 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 인지기능 개선 효과를 나타낸 그래프

이하의 본 발명에 관한 상세한 설명들은 본 발명이 실시될 수 있는 실시 예이고 해당 실시 예의 예시로써 도시된 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당 업자가 본 발명의 실시에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시 예에 관련하여 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 기재된 실시 예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.

따라서 후술되는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 적절하게 설명된다면 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명은 연자육(연자)추출물을 포함하여 속효성의 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제공한다.

상기 연자육(연자, Nelumbo Nucifera Gaertner(NNG))은 수련과에 속하는 다년생 초본식물인 연꽃(Nelumbo nucifera GAERTNER)의 종자를 칭한다. 상기 연꽃은 아시아 남부와 오스트레일리아 북부가 원산지이며, 진흙 속에서 자라면서도 청결하고 고귀한 식물로, 여러 나라 사람들에게 친근감을 주어 온 식물이다. 상기 연꽃은 연못에서 자라고 논밭에서 재배하기도 한다. 연꽃의 종자는 자양(滋養)·보비(補脾)·익신(益腎)·진정(鎭靜)·수렴(收斂)·지사(止瀉)의 효능이 있다고 하여 신체허약, 위장염, 불면 등의 증상에 치료제로 이용되었고, 잎은 수종, 소변불리, 토혈, 변혈, 붕루 등의 증상에 이용되었다.

상기 연자육(연자)추출물은 연자육(연자)을 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 추출한 것이 적절하다. 이때, 상기 추출용매는 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3 ~ 99 : 1의 중량비로 혼합된 것이 바람직할 것이다. 한편, 상기 추출용매는 연자육(연자)의 중량 기준 7 ~ 9배가 되도록 포함되는 것이 적절하다. 상기 연자육(연자)추출물은 연자육(연자)을 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 100 ~ 140℃에서 3 내지 5시간 추출하여, 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조한 것이 바람직하며, 얻어진 동결건조물을 증류수에 희석한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 동결 건조물은 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 것일 수 있다.

정리하여, 본 발명에 따른 조성물은 연자육(연자)을 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3 ~ 99 : 1의 중량비로 혼합된 추출용매로 100 ~ 140℃에서 3 내지 5시간 추출하고, 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 것일 수 있다.

상기 연자육(연자)추출물은 일반적인 상황에서의 완효성 효과뿐만 아니라, 급성 인지기능 장애 등에 대처하기 위하여, 속효성의 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물은 상기 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물을 유효성분으로 하여 속효성의 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과가 더 증대된 것일 수 있다.

상기 원지추출물은 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 추출한 것이 적절하다. 보다 구체적으로 상기 원지추출물은 원지를 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 70 ~ 90℃에서 30 ~ 90분간 추출하여, 얻어진 것을 다시 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 70 ~ 90℃에서 30 ~ 50분간 추출하여, 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조한 것이 바람직하며, 얻어진 동결건조물을 증류수에 희석한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 동결 건조물은 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류서에 희석한 것일 수 있다.

상기 원지(Polygalae Radix)는 무환자나무목 원지과 원지(Polygala tenuifolia)의 뿌리를 칭한다. 상기 원지의 뿌리는 굵고 길며 끝에서 몇 개의 원줄기가 무더기로 나오고 거의 털이 없다. 상기 원지는 가을이나 봄에 뿌리를 캐 물에 씻은 다음 목질부를 뽑아 버리고 햇볕에 말린다. 상기 원지의 맛은 쓰고 매우며 성질은 따뜻하다. 심경(心經), 신경(腎經)에 작용한다. 정신을 안정시키고 가래를 삭인다.

한편, 상기 연자육(연자)추출물과 원지추출물은 30 : 70 ~ 70 : 30의 중량비의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다.

상기 연자육(연자)추출물과 원지추출물은 80 ~ 120 rpm으로 교반되면서 4 ~ 8시간 동안 혼합되는 것이 바람직하다. 80 ~ 120 rpm으로 교반되면서 4 ~ 8시간 동안 혼합하는 혼합 과정에서 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 각 성분이 상호 작용하여, 속효성의 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과가 증대될 수 있다.

한편, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물은 숙성 과정을 추가로 거칠 수 있다. 이 때, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물은 5 ~ 25℃의 온도로 1 ~ 3일간 숙성한 것이 바람직할 것이다. 숙성과정을 통해 연자육(연자))추출물과 원지추출물의 각 성분이 상호 작용하여, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물의 속효성의 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과가 증대될 수 있다.

정리하여, 본 발명에 따른 조성물은 연자육(연자)을 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3 ~ 99 : 1의 중량비로 혼합된 추출용매로 100 ~ 140℃에서 3 내지 5시간 추출하여 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 연자육(연자)추출물과, 원지를 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 70 ~ 90℃에서 30 ~ 90분간 추출하여 얻어진 것을 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 70 ~ 90℃에서 30 ~ 50분간 추출하여 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 원지추출물을, 80 ~ 120 rpm으로 교반하면서 4 ~ 8시간 동안 혼합하고 5 ~ 25℃의 온도로 1 ~ 3일간 숙성한 것일 수 있다.

이하, 하기의 실시예, 비교예 및 실험예를 통하여 본 발명에 따른 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물의 효과에 대하여 구체적으로 살펴본다.

실시예 1 내지 3. 본 발명의 실시예에 따른 연자육(연자) 추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3의 연자육(연자)추출물을 제조하였다.

(S10): 연자육(연자)을 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 121℃에서 4시간 추출하였다.

(S20): 상기 단계(S10)에서 추출하여 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하였다.

(S30): 상기 단계(S20)에서 얻어진 동결건조물을 하기 표 1의 농도로 증류수에 희석하여 연자육(연자)추출물을 제조하였다.

(S40): 상기 단계(S30)에서 얻어진 추출물을 20℃의 온도로 2일간 숙성하였다.

	실시예1	실시예2	실시예3
연자육(연자)추출물의 농도	0.1mg/kg	1mg/kg	10mg/kg

비교예 1. 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거치지 않은 연자육(연자)추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 비교예 1의 조성물을 제조하였다.

(S10): 연자육(연자)을 물로 121℃에서 4시간 열수 추출하였다.

(S20): 상기 단계(S10)에서 얻어진 추출물을 20℃의 온도로 2일간 숙성하였다.

비교예 2. 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거친 연자육(연자)추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 비교예 2의 조성물을 제조하였다.

(S10): 연자육(연자)을 물로 121℃에서 4시간 열수 추출하였다.

(S30): 상기 단계(S20)에서 얻어진 동결건조물을 1mg/kg의 농도로 증류수에 희석하여 샘플을 준비하였다.

실시예 4 내지 6. 본 발명의 실시예에 따른 원지추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 본 발명에 따른 실시예 2의 조성물을 제조하였다.

(S10): 원지를 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 60분간 추출하였다.

(S20): 상기 단계(S10)에서 얻어진 것을 다시 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 80℃에서 40분간 추출하였다.

(S30): 상기 단계(S20)에서 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하였다.

(S40): 상기 단계(S30)에서 얻어진 동결건조물을 하기 표 2의 농도로 증류수에 희석하여 원지추출물을 제조하였다.

(S50): 상기 단계(S40)에서 얻어진 추출물을 20℃의 온도로 2일간 숙성하였다.

	실시예4	실시예5	실시예6
연자육(연자)추출물의 농도	0.1mg/kg	1mg/kg	10mg/kg

비교예 3. 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거치지 않은 원지추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 비교예 3의 조성물을 제조하였다.

(S10): 원지를 물로 121℃에서 4시간 열수 추출하였다.

비교예 4. 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거친 원지추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 비교예 4의 조성물을 제조하였다.

(S10): 원지를 물로 121℃에서 4시간 열수 추출하였다.

실시예 7 내지 9 및 비교예 5 내지 6. 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물을 포함하는 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물의 제조

하기의 제조방법에 따라 본 발명에 따른 실시예 3의 조성물을 제조하였다.

(S30): 상기 단계(S20)에서 얻어진 동결건조물을 1mg/kg의 농도로 증류수에 희석하여 연자육(연자)추출물을 제조하였다.

(S40): 원지를 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 60분간 추출하였다.

(S50): 상기 단계(S40)에서 얻어진 것을 다시 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 40분간 추출하였다.

(S60): 상기 단계(S50)에서 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하였다.

(S70): 상기 단계(S60)에서 얻어진 동결건조물을 1mg/kg의 농도로 증류수에 희석하여 원지추출물을 제조하였다.

(S80): 상기 단계(S30)의 연자육(연자)추출물과 상기 단계(S40)의 원지추출물을 하기 표 1의 중량비로 100 rpm에서 교반하면서 6시간 동안 혼합하였다.

(S90): 상기 단계(S80)에서 혼합된 혼합물을 20℃의 온도로 2일간 숙성하였다.

	비교예5	실시예7	실시예8	실시예9	비교예6
연자육(연자)추출물	10	30	50	70	90
원지추출물	90	70	50	30	10

실험예 1. 동물모델에서 인지기능 또는 기억력 개선 효능 평가 - 수동회피 실험(Passive Avoidance Task )

수동회피실험은 암실에서 마우스가 이전에 전기자극에 대한 기억을 기억함으로써 암실의 문으로 다시 들어가지 않는 것을 배우는 공포 동기 회피 실험 중 하나이다. 이전에 전기자극을 받은 구획으로 들어가는 것을 머뭇거리는 시간을 측정하여 측정시간을 기억능력의 지표로 삶아, 기억력을 평가하는 실험이다.

실험동물로는 6주령의 마우스를 ICR 마우스(26 ~ 28g)를 Daehan Bio-link(충북, 한국)에서 공급받아 동물 실험실에 약 5일간 적응시켜 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도, 습도 및 명암주기는 자동으로 조절되도록 하였다.

실험은 한 그룹당 8마리씩을 사용하였다. 양성 대조군으로는 이미 기억력 개선용 치료제로 임상에서 사용되고 있는 도네페질(donepezil) 약물을 5 mg/kg 투여하였다. 스코폴라민(scopolamine) 및 도네페질(donepezil)은 Sigma-Aldrich Chemistry Co.에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 시약은 시중에서 구입할 수 있는 최상급을 사용하였다.

실험시작 1시간 전에 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물을 경구투여하고, 실험시작 30분 전에 scopolamine 1.2 mg/kg을 복강투여하였다. 두 약물의 효능이 극화되어 겹치는 시점에 실험을 진행하였으며, 통계처리는 Mean±SEM, ANOVA(one wayanalysis of variance) 및 T-test 분석법으로 하였다.

일반적으로는, 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물인 도네페질(donepezil)은 15일이 지나야 정상농도에 도달하고 인지기능 개선에 있어 만족할 만한 효과를 발휘할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이번 실험에 있어, 1시간 전에 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물을 경구투여하였으므로, 본 발명에 따른 조성물이 1시간 만에 인지기능 개선 효과를 갖는다면 속효성을 갖는 것으로 유추할 수 있을 것이다.

구체적인 실험 방법으로, 스코폴라민 투여 30분 후에 쥐를 조명을 비춘 밝은 쪽 구획에 놓고 30초의 탐색시간 후 길로틴문 (guillotine door)이 열려 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 이때 길로틴문이 열린 후 300초 이내에 어두운 쪽으로 들어가지 않는 쥐는 실험에서 제외시켰다. 길로틴문이 열린 후 쥐가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다. 일단 쥐가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴문이 닫히고 0.8 mA의 전기 충격이 3초 동안 격자 바닥을 통해 흐르게 하여 이를 기억하도록 하였다(학습 시험). 학습 시험이 끝나고 24시간 후에 본 실험을 시행하였다. 쥐가 30초의 탐색시간 후 길로틴문이 열리고 어두운 쪽으로 네 발이 모두 들어가는데 걸리는 시간(latency time: 머무름 시간)을 300초까지 측정하였다. 걸리는 시간이 길수록 수동회피의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다.

도 1은 스코폴라민 유도 마우스 모델에서 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물 경구 투여에 따른 수동회피빈도를 통한 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과를 평가하여 나타내는 그래프이다.

도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 조성물이 비교예 1 내지 2의 조성물보다 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과가 높음을 확인할 수 있으며, 실시예 4 내지 6의 조성물이 비교예 3 내지 4의 조성물보다 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과가 높음을 확인할 수 있다. 특히, 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 혼합물인 실시예 7 내지 9의 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과가 가장 높게 나타났으며, 이는 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 혼합에 따라 예기치 못한 효과가 나타났음을 유추할 수 있다. 또한, 도네피질은 15일이 지나야 정상농도에 도달하고 인지기능 개선에 있어 만족할 만한 효과를 발휘하는데 비해, 본 발명의 조성물은 1시간 만에 인지기능 개선 효과를 갖는 바, 인지기능 개선에 있어 속효성을 가진다 할 것이다.

실험예 2. 비 스트레스 모델에서의 항불안 효과 측정

8주령 수컷 C57/BL6과 12주령 수컷 ICR은 Daehan Bio-link(충북, 한국)에서 공급받았다. 실험용 쥐들은 12시간 명암 주기로 온도와 습도가 자동으로 제어된 상태로 있었다. 실험용 쥐들은 실험이 수행되기 전까지 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 실험용 쥐들은 실험이 시작되기 전 일주일 동안 환경에 적응되도록 하였다. 이 프로토콜은 경희대학교 기관 동물 관리 및 사용 커뮤니티(KHUASP (SE)-18-024)의 승인을 받았으며, 실험동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 따라 연구를 수행하였다.

상기 실험용 쥐들은 실험시작 30분 전에 각각 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물이 경구투여되었으며, 대조군은 실험 시작 30분 전에 동일한 양의 증류수(DW)를 경구투여하였다.

항불안 효과를 확인하기 위하여, Elevated plus maze (EPM) 실험을 진행하였다. EPM 실험은 Lister RG와 관련하여 불안 관련 행동을 평가하는데 사용되었다. closed arms에 대한 마우스의 선호도에 따라, open arms를 꺼리는 행동은 불안한 것으로 간주되었다. 장치는 5cm x 5cm의 중앙을 기준으로 반대의 위치에 있는 각각 열리고 닫힌 arm으로 구성된 미로로 구성된다. 이 장치는 각 팔의 크기가 30cm × 5cm × 30cm인 지상 40cm 높이의 white opaque Plexiglass maze였다. 실험용 쥐는 머리가 open arms를 향하도록 미로의 중앙에 놓였다. 그들의 움직임은 5분 동안 촬영되었고 그들이 open arms에서 이동한 거리는 비디오 추적 소프트웨어(Smart 3.0, Panlab, Spain)를 사용하여 측정되었다. 결과는 open arms에서 이동한 거리(distance in open arms(cm))로 나타낼 수 있다. open arms에서 오래 머무를수록 실험용 쥐가 불안하지 않다는 것을 의미하며, 본 실험에서는 open arms에서 오래 머무를수록 투여한 조성물의 항 불안효과가 높다는 것을 의미할 것이다.

결과는 도 2에 도시된 바와 같다. 도 2에 도시된 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 조성물이 비교예 1 내지 2의 조성물보다 항불안 효과가 높음을 확인할 수 있으며, 실시예 4 내지 6의 조성물이 비교예 3 내지 4의 조성물보다 항불안 효과가 높음을 확인할 수 있다. 특히, 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 혼합물인 실시예 7 내지 9의 효과가 가장 높게 나타났으며, 이는 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 혼합에 따라 예기치 못한 효과가 나타났음을 유추할 수 있다.

실험예 3. 스트레스 모델에서의 항불안 효과 평가

스트레스 모델에서의 항불안 효과를 평가하고, 실험예 2의 데이터와 비교하여 스트레스 개선에 대한 본 발명의 조성물의 효과에 대하여 살펴본다.

상기 실험용 쥐들에 대하여 Social　defeat　stress(SDS) 모델을 형성하였다. 이는, 동물 모델에서의 사회적 스트레스 경험으로, 사회적 고립과 사회적 패배를 활용한다. 이 연구는 실험용 쥐가 공격적인 상대를 만나도록 강요하고 패배를 경험함으로써, 사회적 패배 스트레스를 유도하는 '사회적 패배 스트레스 모델'을 이용하였다. 사회적 패배 스트레스를 반복적으로 경험하는 실험용 쥐들은 쾌락을 느끼지 못하며, 무기력, 과도한 활동, 사회적 회피를 보였다. 본 실험은 Golden, S.A. et al.을 참고하여 수행되었다. 본 실험은 직사각형 햄스터 케이지 (14cm X 40cm X 12cm)와 한 쌍의 강철 와이어 상판으로 구성된 케이지를 사용했다. 케이지 중앙에 스테인레스 망을 설치하여 다른 케이지로 넘어가지 않도록 했다. 그물망의 크기는 0.9cm X 0.9cm였다. 실험에 앞서 공격성 테스트를 통해 ICR 마우스를 선택했다. 공격적인 ICR 마우스는 한 케이지에 배치되고 C57/BL6 마우스는 다른 케이지에 배치되었다. 그 다음, 스테인레스 망을 제거하여 두 마리의 마우스가 10일 동안 하루에 10분 동안 만나게 했다. 그 후, 사회적 스트레스 모델이 생성되었는지 확인하기 위해 사회적 상호작용 테스트를 수행하였다.

상기 실험용 쥐들에 대하여 Social hierarchy stress(SHS) 모델을 형성하였다. 이는, 지배 계층을 기반으로 설계된다. 높은 지위의 개인에 의한 지배가 낮은 지위의 개인에 의해 파괴됨에 따라 사회적 패배로 인한 사회적 계층 스트레스를 유발했다. 이 실험은 투명 아크릴 튜브(길이 30cm, 외경 3.0cm, 내경 2.4cm)를 사용했다. 첫날, 짧은 투명아크릴 튜브(길이 10cm, 외경 3.0cm, 내경 2.4cm)를 각 그룹의 홈 케이지에 넣었다. 둘째 날과 셋째 날에는 습관화를 위해 실험용 긴 투명 아크릴 튜브를 배치하여 튜브 양쪽 끝으로 통과시키는데 익숙해지도록 하였다. 그 후, 각 그룹의(4마리의 쥐) 우세 계층은 양쪽 끝에서 각각 튜브에 들어가도록 허용함으로써 결정되었다. 둘 사이에서 4개의 다리로 뒤로 물러난 개체가 다른 개체에 비해 사회 계층이 더 낮은 것으로 간주되었다. 2분 안에 우세가 결정나지 않으면 실험에서 제외되었다. 4회 연속 이긴 쥐가 가장 높은 계층으로 선정되었다. 가장 높은 계층의 쥐를 한쪽 끝에서 튜브에 넣고 낮은 상태의 쥐를 다른 끝에서 넣은 다음 양쪽 끝을 닫았다. 여기에서 계급이 낮은 쥐는 탈출이 불가능하다는 것을 알고 높은 계급의 쥐를 공격하려 할 수 있다. 높은 계층의 쥐가 패배한 이 후, 패배한 높은 계층의 쥐들로 이 실험에 사용할 사회적 계층 스트레스 모델을 형성했다. 그 다음, 사회적 스트레스 모델이 생성되었는지 확인하기 위해 sucrose 선호도 테스트를 수행하였다.

상기 실험용 쥐들은 실험시작 30분 전에 각각 실시예2, 비교예 1, 비교예2의 조성물(연자육(연자) 관련)이 경구투여되었으며, 실시예5, 비교예 3, 비교예 4의 조성물(원지 관련)이 경구투여되었으며, 비교예5, 실시예7, 실시예8, 실시예9, 비교예6(혼합조성물 관련)이 경구투여되었다. 비교군에는 10mg/kg의 Fluoxectine을 주사하고 대조군은 실험 시작 30분전에 동일한 양의 증류수(DW)를 경구투여하였다.

상기 실험용 쥐들에 대한 항불안 효과를 확인하기 위하여, Elevated plus maze (EPM) 실험을 진행하였다. EPM 실험은 Lister RG와 관련하여 불안 관련 행동을 평가하는데 사용되었다. closed arms에 대한 마우스의 선호도에 따라, open arms를 꺼리는 행동은 불안한 것으로 간주되었다. 장치는 5cm x 5cm의 중앙을 기준으로 반대의 위치에 있는 각각 열리고 닫힌 arm으로 구성된 미로로 구성된다. 이 장치는 각 팔의 크기가 30cm × 5cm × 30cm인 지상 40cm 높이의 white opaque Plexiglass maze였다. 실험용 쥐는 머리가 open arms를 향하도록 미로의 중앙에 놓였다. 그들의 움직임은 5분 동안 촬영되었고 그들이 open arms에서 이동한 거리는 비디오 추적 소프트웨어(Smart 3.0, Panlab, Spain)를 사용하여 측정되었다. 결과는 open arms에서 이동한 거리(distance in open arms(cm)) 및 open arms에서 머문 시간(Time(s))으로 나타낼 수 있다. open arms에서 오래 머무를수록 실험용 쥐가 불안하지 않다는 것을 의미하며, 본 실험에서는 open arms에서 오래 머무를수록 투여한 조성물의 항불안 효과가 높다는 것을 의미할 것이다.

결과는 도 3 내지 도 6에 나타낸 바와 같다. 우선, 도 3은 Social　defeat　stress(SDS) 모델에 대한 EPM 측정 및 비스트레스 모델과의 이동거리 비교를 나타낸 그래프이고, 도 4는 Social　defeat　stress(SDS) 모델에 대한 EPM 측정 및 비스트레스 모델과의 이동시간 비교를 나타낸 그래프다. 또한, 도 5은 Social hierarchy stress(SHS) 모델에 대한 EPM 측정 및 비스트레스 모델과의 이동거리 비교를 나타낸 그래프이고, 도 6은 Social hierarchy stress(SHS) 모델에 대한 EPM 측정 및 비스트레스 모델과의 이동 시간 비교를 나타낸 그래프다. 도 3 내지 도 6의 실시예 2(Non), 실시예 5(Non), 실시예 7(Non), 실시예 8(Non), 실시예 9(Non)는 실험예 3의 비스트레스 모델의 EPM 측정 수치로써, 스트레스 모델과 비스트레스 모델간에 비교하기 위해 함께 나타낸 것이다.

도 3 내지 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 스트레스 모델에서 항불안 효과가 더 높게 나타났으며, DW를 투여한 대조군을 기준으로 비스트레스 모델보다, 스트레스 모델에서 항불안 효과가 더욱 높게 나타났으며, 이는, 본 발명에 따른 조성물이 항불안 효과뿐만 아니라 스트레스 완화 효과가 있음을 나타낸다. 또한, 일반적으로 장기 투여해야 효과를 나타내는 비교대상 Fluoxectine에 비해, 본 발명에 따른 조성물은 실험시작 30분 전에 투여되었음에도 불구하고, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 나타냄을 확인하였기에, 본 발명에 따른 조성물이 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과에 대해 속효성을 가짐을 확인할 수 있었다.

한편, 실시예 1 내지 3의 조성물이 비교예 1 내지 2의 조성물보다 수치가 높음을 확인할 수 있으며, 실시예 4 내지 6의 조성물이 비교예 3 내지 4의 조성물보다 수치가 높음을 확인할 수 있다. 특히, 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 혼합물인 실시예 7 내지 9의 수치가 가장 높게 나타났으며, 이는 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 혼합에 따라 예기치 못한 효과가 나타났음을 유추할 수 있다.

실험예 4. Y- maze test

본 발명에 따른 조성물의 인지기능 개선 효과를 추가적으로 확인하기 위하여 Y-maze test를 수행하였다. 실험동물로는 6주령의 마우스를 ICR 마우스(26 ~ 28g)를 Daehan Bio-link(충북, 한국)에서 공급받아 동물 실험실에 약 5일간 적응시켜 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도, 습도 및 명암주기는 자동으로 조절되도록 하였다.

본 실험은 새로운 환경을 끊임없이 탐구하는 습관을 바탕으로 Y형 미로를 사용하여 실험용 쥐의 공간 기억 및 학습을 평가하도록 설계되었다. Y-maze 장치는 동일한 3개의 통로(35cm × 8cm × 12.5cm)로 구성되어 있으며 각각은 서로 120°의 일정한 각도로 배치되어 있다. 마우스를 한쪽 arm 끝에 위치시킨 다음에 8분 동안 자유롭게 Y maze를 돌아다니도록 하였다. 분석은 마우스가 세 개의 다른 통로에 순차적으로 들어간 순간을 기준으로 했으며, 마우스 뒷다리의 1/3이 통로를 통과했을 때 진입이 결정되었다. 각 arm에 들어간 횟수 및 순서를 측정하여 spontaneous alteration (%)을 평가하였다. alteration은 3개의 arm을 순차적으로 들어가는 경우, 즉 ABC, BCA, CAB 등으로 정의하였다. 따라서, % alteration은 하기 계산식으로 계산하였다.

* % alteration = [총 alteration 수]/ [arm에 들어간 총 횟수 -2] x 100

결과는 도 7에 나타낸 바와 같다. 도 7은 마우스 모델에서 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물 경구 투여에 따른 Y-maze test의 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과를 평가하여 나타내는 그래프이다.

도 7에 도시된 바와 같이, 실시예 1 내지 3의 조성물이 비교예 1 내지 2의 조성물보다 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과가 높음을 확인할 수 있으며, 실시예 4 내지 6의 조성물이 비교예 3 내지 4의 조성물보다 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과가 높음을 확인할 수 있다. 특히, 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 혼합물인 실시예 7 내지 9의 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과가 가장 높게 나타났으며, 이는 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 혼합에 따라 예기치 못한 효과가 나타났음을 유추할 수 있다. 또한, 도네피질은 15일이 지나야 정상농도에 도달하고 인지기능 개선에 있어 만족할 만한 효과를 발휘하는데 비해, 본 발명의 조성물은 1시간 만에 인지기능 개선 효과를 갖는 바, 인지기능 개선에 있어 속효성을 가진다 할 것이다.

결론.

상기 실시예, 비교예, 실험예를 통해 본 발명에 따른 조성물의 효과에 대하여 살펴보았다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과를 가짐을 실험예 1을 통해 확인할 수 있었다. 이중, 인지기능 개선 효과는 1시간 이내에 발휘되며, 본 발명에 따른 조성물의 인지기능 개선 효과가 속효성을 가짐을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 비스트레스 상황에서 항우울 효과를 가짐을 실험예 2를 통해 확인할 수 있었다.

그리고, 본 발명에 따른 조성물은 실험예 3을 통해, 스트레스 모델에서의 항불안효과를 가짐을 확인할 수 있었으며, 이와 더불어, 사회적 패배 스트레스(SDS)와, 사회적 계층 스트레스(SHS) 상황일 때 더 높은 항 불안효과를 가짐으로써 사회적 패배 스트레스(SDS)와, 사회적 계층 스트레스(SHS) 상황에 대한 스트레스 완화 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은 인지기능 개선 또는 기억력 개선 효과를 가짐을 실험예 4를 통해 추가적으로 확인하였다.

특히, 본 발명에 따른 조성물은 속효성을 가질 수 있음을 확인할 수 있었다. 3주 이상의 기간을 두고 장기적으로 섭취해야 하는 일반적인 인지기능 개선용 치료제와는 다르게, 본 발명에 따른 항우울용 조성물은 속효성을 가지므로, 급성 인지기능 장애 등에 신속하게 대처할 수 있는 진보된 조성물임을 확인하였다.

이에, 본 발명은 일반적인 상황 즉, 평시의 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과는 물론, 1시간 이내에 속효성의 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 신규한 조성물로써, 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 개발하였음을 명시한다.

본 발명을 첨부된 도면과 함께 설명하였으나, 이는 본 발명의 요지를 포함하는 다양한 실시 형태 중의 하나의 실시 예에 불과하며, 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 하는 데에 그 목적이 있는 것으로, 본 발명은 상기 설명된 실시예에만 국한되는 것이 아님은 명확하다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 하기의 청구범위에 의해 해석되어야 하며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 변경, 치환, 대체 등에 의해 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리에 포함될 것이다. 또한, 도면의 일부 구성은 구성을 보다 명확하게 설명하기 위한 것으로 실제보다 과장되거나 축소되어 제공되는 것임을 명확히 한다.

Claims

연자육(연자)을 정제수 또는, 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 100 ~ 140℃에서 4시간 추출하여 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 1mg/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 연자육(연자)추출물과,
원지를 정제수 또는, 정제수와 에탄올이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 60분간 추출하여 얻어진 것을 정제수 또는, 정제수와 에탄올이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 40분간 추출하여 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 1mg /kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 원지추출물을,
50 : 50의 중량비로 100 rpm으로 교반하면서 6시간 동안 혼합하고 20℃의 온도로 2일간 숙성한 혼합물로 구성되어, 인지기능 개선, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 인지기능 개선용, 기억력 개선용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물.
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