KR102527193B1

KR102527193B1 - 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물

Info

Publication number: KR102527193B1
Application number: KR1020210009255A
Authority: KR
Inventors: 신지환
Original assignee: 신지환
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2023-04-27
Also published as: KR20220106385A; WO2022158760A1; KR20230023687A

Abstract

본 발명은 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물에 관한 것이다.

Description

항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물 {Compositions for antidepressants, stress relief and antianxiety}

최근 우울증은 사회적 문제로 대두되고 있다. 핵가족화, 산업화의 영향으로 그 심각성이 더해지며, 자살률 및 사회적 비용의 증가로 이어지고 있다. 우울증은 객관적 상황과는 관계없이 일어나는 정서적 병리현상으로 환자의 모든 생활이 우울한 기분으로 덮여있고, 흥미가 감소하고 무쾌감증(anhedonia)이 되며 정신운동의 저하, 염세감, 절망에 사로잡히게 되고 자살의욕을 느껴 자살기도에까지 이르는 질병인데, 식욕저하, 불면, 변비, 성욕감퇴 등 다양한 신체적 증상을 보인다.

우울증의 발생기전과 우울증의 치료제인 항우울제의 작용기전을 완벽하게 설명하는 이론은 아직 없다. 그러나 일반적으로는 중추신경계의 시냅스 내에 모노아민(monoamine)계 신경전달물질(neurotransmitter)인 세로토닌(serotonin), 노르에피네프린(norepinephrin), 도파민(dopamine) 등이 부족하게 되면 우울증이 유발된다는 것이 가장 유력한 가설이다. 그래서 현재의 항우울제는 대부분 중추 세로토닌 또는 노르아드레날린 시냅스에서 신경전달물질의 농도를 높이는 약리작용을 가지고 있다. 항우울제는 신경전달물질의 농도를 높여주는 메커니즘에 따라 크게 삼환계 항우울제(TCA; tricyclic antidepressants), 모노아민 옥시다제 억제제(MAOI; monoamine oxidase inhibitors), 또는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI; selective serotonin reuptake inhibitors)등이 많이 사용되고 있다.

이러한 기존의 항우울제가 비교적 효과적이기는 하나, 일부에서 심한 부작용 및 기대에 미치지 못하는 효과가 나타나는 경우 있다. 이에, 자연에서 얻은 천연물을 이용한 항우울 조성물이 떠오르고 있다.

이러한 조성물과 관련된 것으로, 대한민국 등록특허공보 제10-0672949호에는 "우울증 치료용 연자육 추출물, 이를 포함하는 약학적조성물 및 건강식품"이 공지된 바 있는데, 이는 연자육을 물로서 열수 추출하여 제조한 연자육 추출물을 제공하되, 본 발명의 연자육 추출물은 동물행동학적, 생화학적 방법을 통하여 강력한 항우울 활성을 나타내고 기존 항우울제의 부작용을 감소시키는 안전성이 확보되어 있으므로 우울증 치료용 조성물 및 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있도록 한 것이다.

그러나, 상기 종래의 우울증 치료용 연자육 추출물, 이를 포함하는 약학적조성물 및 건강식품은 연자육을 물로 추출한 것으로써, 그 효과가 미미하였으며, 속효성에 대한 기재가 나타나 있지 않아 급성우울증 등에 의한 자살 사고에 긴히 대처하기 어렵다는 문제점이 있었다.

대한민국 등록특허공보 제10-0672949호(2007.04.12.공고), "우울증 치료용 연자육 추출물, 이를 포함하는 약학적조성물 및 건강식품"

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 연자육(연자)추출물을 포함하여 속효성의 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 연자육(연자)추출물은 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 추출되는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명은 상기 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물을 포함하여 속효성의 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 연자육(연자)추출물과 원지추출물은 30 : 70 ~ 70 : 30의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연자육(연자)추출물과 원지추출물은 80 ~ 120 rpm으로 교반되면서 4 ~ 8시간 동안 혼합되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물은 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖되 속효성을 갖도록 하여, 급성우울증 등에 의한 자살 사고에 긴히 대처할 수 있는 효과를 갖는다.

도 1은 사회적 패배 스트레스 모델이 생성되었는지 확인하기 위한 행동 테스트를 나타낸 예시도
도 2는 사회적 계층 스트레스 모델이 생성되었는지 확인하기 위한 행동 테스트를 나타낸 예시도
도 3은 비스트레스 모델에서의 TST 측정을 나타낸 그래프
도 4는 비스트레스 모델에서의 FST 측정을 나타낸 그래프
도 5는 비스트레스 모델에서의 OFT 측정을 나타낸 그래프
도 6은 비스트레스 모델에서의 EPM 측정을 나타낸 그래프
도 7은 SDS 모델의 TST 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프
도 8은 SDS 모델의 FST 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프
도 9는 SHS 모델의 TST 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프
도 10은 SHS 모델의 FST 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프
도 11은 SDS 모델의 FUST 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프
도 12는 SHS 모델의 FUST 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프
도 13은 control과 SHS 모델의 Sucrose 선호도를 나타낸 그래프
도 14는 SDS 모델의 EPM 거리 측정 및 비스트레스 모델과의 이동 거리 비교를 나타낸 그래프
도 15는 SDS 모델의 EPM 시간 측정 및 비스트레스 모델과의 이동 시간 비교를 나타낸 그래프
도 16은 SHS 모델의 EPM 거리 측정 및 비스트레스 모델과의 이동 거리 비교를 나타낸 그래프
도 17은 SHS 모델의 EPM 시간 측정 및 비스트레스 모델과의 이동 시간 비교를 나타낸 그래프
도 18은 SDS 모델의 OFT 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프
도 19는 SHS 모델의 OFT 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프
도 20은 SDS 모델의 NSFT 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프
도 21은 SHS 모델의 NSFT 측정 및 비스트레스 모델과의 비교를 나타낸 그래프

이하의 본 발명에 관한 상세한 설명들은 본 발명이 실시될 수 있는 실시 예이고 해당 실시 예의 예시로써 도시된 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당 업자가 본 발명의 실시에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시 예에 관련하여 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 기재된 실시 예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.

따라서 후술되는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 적절하게 설명된다면 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명은 연자육(연자)추출물을 포함하여 속효성의 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제공한다.

상기 연자육(연자, Nelumbo Nucifera Gaertner(NNG))은 수련과에 속하는 다년생 초본식물인 연꽃(Nelumbo nucifera GAERTNER)의 종자를 칭한다. 상기 연꽃은 아시아 남부와 오스트레일리아 북부가 원산지이며, 진흙 속에서 자라면서도 청결하고 고귀한 식물로, 여러 나라 사람들에게 친근감을 주어 온 식물이다. 상기 연꽃은 연못에서 자라고 논밭에서 재배하기도 한다. 연꽃의 종자는 자양(滋養)·보비(補脾)·익신(益腎)·진정(鎭靜)·수렴(收斂)·지사(止瀉)의 효능이 있다고 하여 신체허약, 위장염, 불면 등의 증상에 치료제로 이용되었고, 잎은 수종, 소변불리, 토혈, 변혈, 붕루 등의 증상에 이용되었다.

상기 연자육(연자)추출물은 연자육(연자)을 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 추출한 것이 적절하다. 이때, 상기 추출용매는 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3 ~ 99 : 1의 중량비로 혼합된 것이 바람직할 것이다. 한편, 상기 추출용매는 연자육(연자)의 중량 기준 7 ~ 9배가 되도록 포함되는 것이 적절하다. 상기 연자육(연자)추출물은 연자육(연자)을 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 100 ~ 140℃에서 3 내지 5시간 추출하여, 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조한 것이 바람직하며, 얻어진 동결건조물을 증류수에 희석한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 동결 건조물은 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 것일 수 있다.

정리하여, 본 발명에 따른 조성물은 연자육(연자)을 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3 ~ 99 : 1의 중량비로 혼합된 추출용매로 100 ~ 140℃에서 3 내지 5시간 추출하고, 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 것일 수 있다.

상기 연자육(연자)추출물은 일반적인 상황에서의 완효성 효과뿐만 아니라, 급성 우울증 등의 상황에 대처하기 위하여, 속효성의 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물은 상기 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물을 유효성분으로 하여 속효성의 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과가 더 증대된 것일 수 있다.

상기 원지추출물은 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 추출한 것이 적절하다. 보다 구체적으로 상기 원지추출물은 원지를 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 70 ~ 90℃에서 30 ~ 90분간 추출하여, 얻어진 것을 다시 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 70 ~ 90℃에서 30 ~ 50분간 추출하여, 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조한 것이 바람직하며, 얻어진 동결건조물을 증류수에 희석한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 동결 건조물은 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류서에 희석한 것일 수 있다.

상기 원지(Polygalae Radix)는 무환자나무목 원지과 원지(Polygala tenuifolia)의 뿌리를 칭한다. 상기 원지의 뿌리는 굵고 길며 끝에서 몇 개의 원줄기가 무더기로 나오고 거의 털이 없다. 상기 원지는 가을이나 봄에 뿌리를 캐 물에 씻은 다음 목질부를 뽑아 버리고 햇볕에 말린다. 상기 원지의 맛은 쓰고 매우며 성질은 따뜻하다. 심경(心經), 신경(腎經)에 작용한다. 정신을 안정시키고 가래를 삭인다.

한편, 상기 연자육(연자)추출물과 원지추출물은 30 : 70 ~ 70 : 30의 중량비의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다.

상기 연자육(연자)추출물과 원지추출물은 80 ~ 120 rpm으로 교반되면서 4 ~ 8시간 동안 혼합되는 것이 바람직하다. 80 ~ 120 rpm으로 교반되면서 4 ~ 8시간 동안 혼합하는 혼합 과정에서 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 각 성분이 상호 작용하여, 속효성의 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과가 증대될 수 있다.

한편, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물은 숙성 과정을 추가로 거칠 수 있다. 이 때, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물은 5 ~ 25℃의 온도로 1 ~ 3일간 숙성한 것이 바람직할 것이다. 숙성과정을 통해 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 각 성분이 상호 작용하여, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물의 속효성의 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과가 증대될 수 있다.

정리하여, 본 발명에 따른 조성물은 연자육(연자)을 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3 ~ 99 : 1의 중량비로 혼합된 추출용매로 100 ~ 140℃에서 3 내지 5시간 추출하여 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 연자육(연자)추출물과, 원지를 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 70 ~ 90℃에서 30 ~ 90분간 추출하여 얻어진 것을 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 70 ~ 90℃에서 30 ~ 50분간 추출하여 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 0.1g/kg ~ 10g/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 원지추출물을, 80 ~ 120 rpm으로 교반하면서 4 ~ 8시간 동안 혼합하고 5 ~ 25℃의 온도로 1 ~ 3일간 숙성한 것일 수 있다.

이하, 하기의 실시예, 비교예 및 실험예를 통하여 본 발명에 따른 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물의 효과에 대하여 구체적으로 살펴본다.

실험용 동물

본격적인 실험에 앞서, 실험에 사용된 동물들에 대하여 설명한다. 8주령 수컷 C57/BL6과 12주령 수컷 ICR은 Daehan Bio-link(충북, 한국)에서 공급받았다. 실험용 쥐들은 12시간 명암 주기로 온도와 습도가 자동으로 제어된 상태로 있었다. 실험용 쥐들은 실험이 수행되기 전까지 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 실험용 쥐들은 실험이 시작되기 전 일주일 동안 환경에 적응되도록 하였다. 이프로토콜은 경희대학교 기관 동물 관리 및 사용 커뮤니티(KHUASP (SE)-18-024)의 승인을 받았으며, 실험동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 따라 연구를 수행하였다.

상기 실험용 쥐들은 실험시작 30분 전에 각각 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물이 경구투여되었으며, 비교군에는 10mg/kg의 Fluoxectine을 주사하고 대조군은 실험 시작 30분전에 동일한 양의 증류수(DW)를 경구투여하였다.

그 다음, 사회적 패배 스트레스모델(Social　defeat　stress, SDS)과 사회적 계급 스트레스모델(Social hierarchy stress, SHS)에 대한 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물과 10mg/kg의 Fluoxectine, 증류수(DW)가 투여되었다. 또한, 비사회적 스트레스모델과 사회적 스트레스모델에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물과 10mg/kg의 Fluoxectine, 증류수(DW)가 투여되었다.

실험 방법

Tail suspension test (TST)

본 실험은 Streu(Steru et al., 1985) 등을 참조하여 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물의 항우울 효과를 검사하기 위한 것이다. 실험용 쥐들은 접착테이프로 금속 막대에 꼬리 끝을 매달았다. 그 다음, 금속 막대와 쥐들은 지상에대해 각각 45cm, 15cm의 높이로 올려졌다. 쥐들의 움직임을 0 ~ 6분간 촬영하고, 영상의 binding review를 통해 부동성을 측정하였다. 영상은 양쪽 뒷다리의 움직임을 중심으로 총 6분간 촬영되었다. 예외는 실험용 쥐가 자신의 꼬리를 오르는 경우였다. 결과는 부동성(Immobility(s))으로 나타내며, 움직이지 않은 시간을 측정한다.

Forced swim test (FST)

본 실험은 Borsini와 Meli(Borsini and Meli, 1988)를 참조하여 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물의 항우울 효과를 선별하는 또 다른 실험이다. Plexiglas cylinder (35cm high and 20cm in diameter)에 수돗물을 20cm(±20cm) 높이까지 채우고 실험용 쥐들의 움직임을 6분간 촬영하였다. 6분의 test session 동안 binding review를 통해 2분에서 6분까지 4분 동안의 부동 시간을 측정하였다. 결과는 부동성(Immobility(s))으로 나타내며, 움직이지 않은 시간을 측정한다.

Open field test (OFT)

본 실험은 Amiri S et al.을 참조하여 그룹 간의 이동을 비교하였다. OFT는 보행 행동을 평가하며, vitality가 TST 및 FST의 부동성에 영향을 미치고 다른 행동 실험에 영향을 미치지 않았는지 확인하기 위한 것이다. OFT는 흰색의 불투명한 Plexiglas(50 Х 50 Х 40cm)에 의해 생성된 희미한 조명 상태에서 수행되었다. 흰색의 불투명한 Plexiglas로 만든 장치 안에 쥐를 부드럽게 넣고, 1시간 동안 움직임을 촬영했다. 기기의 표면은 각 실험 후 70% 에탄올로 청소했다. 결과는 총 이동거리(Total distance(cm))로 나타낼 수 있다.

Novelty suppressed feeding test (NSFT)

본 실험은 Garcia-Gutierrez MS 등을 참조하여 불안 증상과 급성 발병 항우울 효과를 확인하기 위한 것이다. NSFT는 만성적이거나 아 만성 또는 급성 항우울제 치료 후 불안 증상이 감소했을 뿐만 아니라 새로운 환경에서 섭식 행동이 억제된다는 것을 발견했다. 실험이 시작되기 24시간 전에 실험용 쥐에게 음식은 부족하게 제공하였으며 물은 제공하지 않았다. 본 실험을 위해, 희미한 Plexiglass test chamber(<20 lux)의 모서리(60cm x 60cm)에 single food pellet을 배치했다. 식사 지연 시간은 5분 동안 측정되었다. 생쥐가 5분 안에 음식을 먹지 않는다면, 식사 지연 시간은 5분으로 간주되었다. 여기서 식사를 하지 않는 행동(예: 만지고 냄새 맡기)은 음식을 먹는 것으로 간주되지 않았다. 결과는 섭식 지연 시간(Feeding Time(s))으로 나타낼 수 있다.

Elevated plus maze (EPM)

본 실험은 Lister RG와 관련하여 불안 관련 행동을 평가하는데 사용되었다. closed arms에 대한 마우스의 선호도에 따라, open arms를 꺼리는 행동은 불안한 것으로 간주되었다. 장치는 5cm x 5cm의 중앙을 기준으로 반대의 위치에 있는 각각 열리고 닫힌 arm으로 구성된 미로로 구성된다. 이 장치는 각 팔의 크기가 30cm × 5cm × 30cm인 지상 40cm 높이의 white opaque Plexiglass maze였다. 실험용 쥐는 머리가 open arms를 향하도록 미로의 중앙에 놓였다. 그들의 움직임은 5분 동안 촬영되었고 그들이 open arms에서 이동한 거리는 비디오 추적 소프트웨어(Smart 3.0, Panlab, Spain)를 사용하여 측정되었다. 결과는 open arms에서 이동한 거리(distance in open arms(cm)) 및 open arms에서 머문 시간(Time(s))으로 나타낼 수 있다. open arms에서 오래 머무를수록 실험용 쥐가 불안하지 않다는 것을 의미하며, 본 실험에서는 open arms에서 오래 머무를수록 투여한 조성물의 항 불안효과가 높다는 것을 의미할 것이다.

Female urine sniffing test (FUST)

본 실험은 보상 추구 활동을 모니터링하기 위해 설계되었으며 Malkesman, O. et al.을 참조하여 수행되었다. FUST는 발정한 암컷 쥐의 소변 냄새를 맡은 수컷 쥐의 성적 욕구를 기반으로 한다. 실험용 쥐를 sterile cotton-tipped applicator에 익숙해 지도록 실험 전에 1시간 동안 home cage에 두었다. habituation 후 실험 공간으로 옮겨졌다. 테스트는 희미한 실내(<20lux)에서 수행되었다. 두 개의 면봉이 준비되었다. 한 면 끝은 증류수에 적셔졌고, 다른 면 끝은 발정 한 암컷 마우스의 소변에 적셔졌습니다. 이 실험은 3분 동안 지속되었고, 냄새를 맡는 시간이 측정되었다. 결과는 냄새를 맡은 시간(sniffing time(s))으로 나타낼 수 있다.

Sucrose preference test (SPT)

본 실험은 Liu, M. Y. et al.을 참조하여 설치류의 Sucrose 선호도 비율을 기반으로 수행되었다. SPT에서는 2개의 급수관이 장착된 가정용 케이지를 사용했다. 하나는 수돗물을 공급하고 다른 하나는 1% Sucrose 용액을 공급했다. 실험은 다음날 19:00부터 10:00까지 수행되었으며 각 튜브에서 소비된 양을 비교하였다.

Social　defeat　stress(SDS)

본 실험은 동물 모델에서의 사회적 스트레스 경험으로, 사회적 고립과 사회적 패배를 활용한다. 이 연구는 실험용 쥐가 공격적인 상대를 만나도록 강요하고 패배를 경험함으로써, 사회적 패배 스트레스를 유도하는 '사회적 패배 스트레스 모델'을 이용하였다. 사회적 패배 스트레스를 반복적으로 경험하는 실험용 쥐들은 쾌락을 느끼지 못하며, 무기력, 과도한 활동, 사회적 회피를 보였다. 본 실험은 Golden, S.A. et al.을 참고하여 수행되었다. 본 실험은 직사각형 햄스터 케이지 (14cm X 40cm X 12cm)와 한 쌍의 강철 와이어 상판으로 구성된 케이지를 사용했다. 케이지 중앙에 스테인레스 망을 설치하여 다른 케이지로 넘어가지 않도록 했다. 그물망의 크기는 0.9cm X 0.9cm 였다. 실험에 앞서 공격성 테스트를 통해 ICR 마우스를 선택했다. 공격적인 ICR 마우스는 한케이지에 배치되고 C57/BL6 마우스는 다른 케이지에 배치되었다. 그 다음, 스테인레스 망을 제거하여 두 마리의 마우스가 10일 동안 하루에 10분 동안 만나게 했다. 그 후, 사회적 스트레스 모델이 생성되었는지 확인하기 위해 사회적 상호작용 테스트를 수행한 후 도 1과 같이 행동테스트를 구현했다.

Social hierarchy stress(SHS)

본 실험은 지배 계층을 기반으로 설계되었다. 높은 지위의 개인에 의한 지배가 낮은 지위의 개인에 의해 파괴됨에 따라 사회적 패배로 인한 사회적 계층 스트레스를 유발했다. 이 실험은 투명 아크릴 튜브(길이 30cm, 외경 3.0cm, 내경 2.4cm)를 사용했다. 첫날, 짧은 투명아크릴 튜브(길이 10cm, 외경 3.0cm, 내경 2.4cm)를 각 그룹의 홈 케이지에 넣었다. 둘째 날과 셋째 날에는 습관화를 위해 실험용 긴 투명 아크릴 튜브를 배치하여 튜브 양쪽 끝으로 통과시키는데 익숙해지도록 하였다. 그 후, 각 그룹의(4마리의 쥐) 우세 계층은 양쪽 끝에서 각각 튜브에 들어가도록 허용함으로써 결정되었다. 둘 사이에서 4개의 다리로 뒤로 물러난 개체가 다른 개체에 비해 사회 계층이 더 낮은 것으로 간주되었다. 2분 안에 우세가 결정나지 않으면 실험에서 제외되었다. 4회 연속 이긴 쥐가 가장 높은 계층으로 선정되었다. 가장 높은 계층의 쥐를 한쪽 끝에서 튜브에 넣고 낮은 상태의 쥐를 다른 끝에서 넣은 다음 양쪽 끝을 닫았다. 여기에서 계급이 낮은 쥐는 탈출이 불가능하다는 것을 알고 높은 계급의 쥐를 공격하려 할 수 있다. 높은 계층의 쥐가 패배한 이 후, 패배한 높은 계층의 쥐들로 이 실험에 사용할 사회적 계층 스트레스 모델을 형성했다. 그 다음, 사회적 스트레스 모델이 생성되었는지 확인하기 위해 sucrose 선호도 테스트를 수행하고 도 2와 같이 행동테스트를 구현앴다.

실시예 1 내지 3. 본 발명의 실시예에 따른 연자육(연자) 추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3의 연자육(연자)추출물을 제조하였다.

(S10): 연자육(연자)을 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 121℃에서 4시간 추출하였다.

(S20): 상기 단계(S10)에서 추출하여 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하였다.

(S30): 상기 단계(S20)에서 얻어진 동결건조물을 하기 표 1의 농도로 증류수에 희석하여 연자육(연자)추출물을 제조하였다.

(S40): 상기 단계(S30)에서 얻어진 추출물을 20℃의 온도로 2일간 숙성하였다.

	실시예1	실시예2	실시예3
연자육(연자)추출물의 농도	0.1mg/kg	1mg/kg	10mg/kg

비교예 1. 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거치지 않은 연자육(연자)추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 비교예 1의 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제조하였다.

(S10): 연자육(연자)을 물로 121℃에서 4시간 열수 추출하였다.

(S20): 상기 단계(S10)에서 얻어진 추출물을 20℃의 온도로 2일간 숙성하였다.

비교예 2. 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거친 연자육(연자)추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 비교예 2의 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제조하였다.

(S10): 연자육(연자)을 물로 121℃에서 4시간 열수 추출하였다.

(S30): 상기 단계(S20)에서 얻어진 동결건조물을 1mg/kg의 농도로 증류수에 희석하여 샘플을 준비하였다.

실시예 4 내지 6. 본 발명의 실시예에 따른 원지추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 본 발명에 따른 실시예 4 내지 6의 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제조하였다.

(S10): 원지를 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 60분간 추출하였다.

(S20): 상기 단계(S10)에서 얻어진 것을 다시 정제수 또는 정제수와 에탄올이 혼합된 추출용매로 80℃에서 40분간 추출하였다.

(S30): 상기 단계(S20)에서 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하였다.

(S40): 상기 단계(S30)에서 얻어진 동결건조물을 하기 표 2의 농도로 증류수에 희석하여 원지추출물을 제조하였다.

(S50): 상기 단계(S40)에서 얻어진 추출물을 20℃의 온도로 2일간 숙성하였다.

	실시예4	실시예5	실시예6
연자육(연자)추출물의 농도	0.1mg/kg	1mg/kg	10mg/kg

비교예 3. 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거치지 않은 원지추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 비교예 3의 조성물을 제조하였다.

(S10): 원지를 물로 121℃에서 4시간 열수 추출하였다.

비교예 4. 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거친 원지추출물의 제조

하기의 제조방법에 따라 비교예 4의 조성물을 제조하였다.

(S10): 원지를 물로 121℃에서 4시간 열수 추출하였다.

실시예 7 내지 9 및 비교예 5 내지 6. 연자육(연자) 추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물을 포함하는 항우울 조성물의 제조

하기의 제조방법에 따라 본 발명에 따른 실시예 7 내지 9의 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 제조하였다.

(S30): 상기 단계(S20)에서 얻어진 동결건조물을 1mg/kg의 농도로 증류수에 희석하여 연자육(연자)추출물을 제조하였다.

(S40): 원지를 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 60분간 추출하였다.

(S50): 상기 단계(S40)에서 얻어진 것을 다시 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 40분간 추출하였다.

(S60): 상기 단계(S50)에서 얻어진 것을 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하였다.

(S70): 상기 단계(S60)에서 얻어진 동결건조물을 1mg/kg의 농도로 증류수에 희석하여 원지추출물을 제조하였다.

(S80): 상기 단계(S30)의 연자육(연자)추출물과 상기 단계(S40)의 원지추출물을 하기 표 3의 중량비로 100 rpm에서 교반하면서 6시간 동안 혼합하였다.

(S90): 상기 단계(S80)에서 혼합된 혼합물을 20℃의 온도로 2일간 숙성하였다.

	비교예5	실시예7	실시예8	실시예9	비교예6
연자육(연자)추출물	10	30	50	70	90
원지추출물	90	70	50	30	10

실험예 1. 일반 실험쥐에 대한 용량 의존적 항우울 및 항불안 영향 평가

우선, 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 일반 실험쥐에 대한 항우울 효과를 확인하기 위하여, 일반 실험용 쥐에 대해 Tail suspension test(TST), Forced swim test(FST), Open field test(OFT), Elevated plus maze(EPM)를 수행하였다.

연자육(연자)추출물은 실시예 1 내지 3에 따라 각각 0.1mg/kg, 1mg/kg, 10mg/kg의 용량으로 실험용 쥐에 실험시작 30분 전에 투여되었다. 한편, 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거치지 않은 연자육(연자)추출물인 비교예 1과 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거친 연자육(연자)추출물인 비교예 2 역시 비교 실험으로 투여되었다.

원지추출물은 실시예 4 내지 6에 따라 각각 0.1mg/kg, 1mg/kg, 10mg/kg의 용량으로 실험용 쥐에 실험시작 30분 전에 투여되었다. 한편, 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거치지 않은 원지추출물인 비교예 3과 추출용매로 물만을 사용하고, 여과 건조 및 증류수 희석과정을 거친 원지추출물인 비교예 4 역시 비교 실험으로 투여되었다.

연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 혼합물을 포함하는 항우울 조성물인 실시예 7 내지 9 역시 1mg/kg의 용량으로 실험용 쥐에 실험시작 30분 전에 투여되었다. 한편, 연자육(연자)추출물과 원지추출물의 혼합비가 상이한 비교예 5 및 비교예 6 역시 비교 실험으로 투여되었다. 한편, 실험시작 30분 전에 증류수(DW)를 급이한 실험군을 대조군으로 하였다.

우선, 상술한 실험방법에 따라 Tail suspension test(TST)를 수행하였다. 결과는 도 3에 도시된 바와 같다.

다음으로, 상술한 실험방법에 따라 Forced swim test(FST)를 수행하였다. 결과는 도 4에 도시된 바와 같다.

다음으로, 상술한 실험방법에 따라 Open field test (OFT)를 수행하였다. 결과는 도 5에 도시된 바와 같다.

다음으로, 상술한 실험방법에 따라 Elevated plus maze (EPM)를 수행하였다. 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.

도 3 및 도 4에 나타난 측정결과에 따라, 실시예 1 내지 3 및 실시예 4 내지 6의 조성물을 투여한 실험군이 비교예 1 내지 4의 조성물을 투여한 실험군에 비해 부동성(Immobility)이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 특히, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 실시예 7 내지 9을 투여한 경우 단독의 조성물을 투여한 경우보다 더 낮은 부동성(Immobility)을 보임을 확인할 수 있었으며 이들의 조합으로부터 항우울 효과가 증대되었음을 확인할 수 있었다.

도 5 및 도 6에 나타난 측정결과에 따라, 실시예 1 내지 3 및 실시예 4 내지 6의 조성물을 투여한 실험군이 비교예 1 내지 4의 조성물을 투여한 실험군에 비해 총 이동거리 및 open arms에서의 이동 거리가 긴 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 본 발명에 따른 조성물이 항불안 효과를 가짐을 확인할 수 있다. 특히, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 실시예 7 내지 9을 투여한 경우 단독의 조성물을 투여한 경우보다 더 긴 이동 거리를 갖는 것을 확인할 수 있었으며 이들의 조합으로부터 항불안 효과가 증대되었음을 확인할 수 있었다.

이하, 추후의 실험에서 스트레스 모델과의 비교는, 비스트레스 모델에서 1mg/kg의 용량으로 투여된 측정값을 기준으로 한다.

실험예 2. 스트레스 모델에서의 항우울 효과 평가

사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS))과 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에서의 실험결과를 분석했다. 실험은 사회적 상호 작용 테스트와 sucrose 선호도 테스트를 통과한 마우스를 대상으로 수행되었다.

실험은 Tail suspension test(TST)와 Forced swim test(FST)를 수행하여 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS)) 및 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))을 실험예 1에서의 일반 쥐의 실험결과(1mg/kg)와 비교하였다. 한편, 실험시작 30분 전에 증류수(DW)를 급이한 실험군을 대조군으로 하였으며 실험시작 30분 전에 10mg/kg의 Fluoxectine를 투여한 실험군과도 비교하였다.

도 7 내지 10에서는, 실험예 1에서의 수치인 비스트레스 상황(Non)에서의 TST, FST 수치를 비교용 그래프로 나타내었다. 실시예2(Non), 실시예5(Non), 실시예7(Non), 실시예8(Non), 실시예9(Non)는 각각 실험예 1에서의 TST 또는 FST 수치이다.

우선, 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS))에 대한 Tail suspension test(TST)를 수행하였다. 결과는 도 7에 도시된 바와 같다.

다음으로, 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS))에 대한 Forced swim test(FST)를 수행하였다. 결과는 도 8에 도시된 바와 같다.

다음으로, 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에 대한 Tail suspension test(TST)를 수행하였다. 결과는 도 9에 도시된 바와 같다.

다음으로, 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에 대한 Forced swim test(FST)를 수행하였다. 결과는 도 10에 도시된 바와 같다.

그 결과, 도 7 내지 도 10에 도시된 바와 같이, 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS)) 및 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에서 비스트레스 모델보다 Tail suspension test(TST) 및 Forced swim test(FST)의 측정 수치, 즉 부동성(Immobility(s))이 낮게 나타났다. 이는 DW(증류수) 투여군을 기준으로 차이 값을 계산해 봤을 때 비스트레스 상황보다 스트레스 상황에서 본 발명의 조성물이 더 항우울 효과를 잘 나타냄을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 스트레스 완화효과를 가짐을 확인할 수 있다. 또한, 일반적으로 장기 투여해야 효과를 나타내는 비교대상 Fluoxectine에 비해, 본 발명에 따른 조성물은 실험시작 30분 전에 투여되었음에도 불구하고, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 나타냄을 확인하였기에, 본 발명에 따른 조성물이 속효성을 가짐을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 2가 비교예 1 내지 2보다 우수한 효능을 가지며, 실시예 5가 비교예 1 내지 2보다 우수한 효능을 가짐을 보이는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 실시예 7 내지 9을 투여한 경우 단독의 조성물을 투여한 경우보다 우수한 효능을 보여, 이들의 조합으로부터 예기치 못한 효과가 나타났음을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 스트레스 모델에서 성욕장애에 대해 미치는 영향에 대한 평가

실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물이 성욕장애에 영향을 미치는지의 여부를 확인하기 위해 Female urine sniffing test(FUST)를 수행하였다. 실험용 쥐들이 증류수와 발정난 암컷 쥐의 소변에 대해 얼마나 오래 냄새를 맡는지를 측정하였다. 한편, 실험시작 30분 전에 증류수(DW)를 급이한 실험군을 대조군으로 하여 스트레스 모델에서의 항우울 효과를 확인하였으며, 실험시작 30분 전에 10mg/kg의 Fluoxectine를 투여한 실험군과도 비교하였다.

우선, 비스트레스 모델에 대해 Female urine sniffing test(FUST)를 수행하여, 비교용 자료로 이용하였다. 실시예2(Non), 실시예5(Non), 실시예7(Non), 실시예8(Non), 실시예9(Non)를 투여한 실험용 쥐에 대해 Female urine sniffing test(FUST)를 수행하여 시간을 기록하였다.

다음으로, 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS))에 대한 Female urine sniffing test(FUST)를 수행하였으며, 결과는 도 11에 도시된 바와 같다. 도 11에서의 실시예2(Non), 실시예5(Non), 실시예7(Non), 실시예8(Non), 실시예9(Non)은 비스트레스 상황에 대한 수치로써, 비교용 수치이다.

다음으로, 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에 대한 Female urine sniffing test(FUST)를 수행하였으며, 결과는 도 12에 도시된 바와 같다. 도 12에서의 실시예2(Non), 실시예5(Non), 실시예7(Non), 실시예8(Non), 실시예9(Non)은 비스트레스 상황에 대한 수치로써, 비교용 수치이다.

도 11 및 도 12에 도시된 바와 같이, 실시예 2를 투여한 쥐가 비교예 1 내지 2를 투여한 쥐보다 왕성한 성욕을 가지며, 실시예 5를 투여한 쥐가 비교예 1 내지 2를 투여한 쥐보다 왕성한 성욕을 가짐을 보이는 것으로 나타났다. 이에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 성욕 개선 효과를 가짐을 유추할 수 있었다. 특히, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 실시예 7 내지 9을 투여한 경우 단독의 조성물을 투여한 경우보다 왕성한 성욕을 보여, 이들의 조합으로부터 예기치 못한 효과가 나타났음을 확인할 수 있었다. 또한, 일반적으로 장기 투여해야 효과를 나타내는 비교대상 Fluoxectine에 비해, 본 발명에 따른 조성물은 실험시작 30분 전에 투여되었음에도 불구하고, 성욕 개선 효과를 나타냄을 확인하였기에, 본 발명에 따른 조성물이 속효성을 가짐을 확인할 수 있었다.

한편, 성욕장애에 기반한 항우울 효과와 Female urine sniffing test(FUST)와 같은 보상 기반 테스트를 보기 위한 실험으로, Sucrose preference test (SPT) 실험을 추가로 진행하였다. 결과는 도 13에 도시된 바와 같다. 그 결과 control의 자당 선호도가 SHS 모델에 비해 높은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 스트레스 모델에서 항불안 효과 평가

본 실험은 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물의 항불안 효과가 항우울 효과에 영향을 미치는지 알아보기 위해 수행되었다. 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS))과 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에 대해 Elevated plus maze(EPM)를 수행하였다. 한편, 실험시작 30분 전에 증류수(DW)를 급이한 실험군을 대조군으로 하였으며, 실험시작 30분 전에 10mg/kg의 Fluoxectine를 투여한 실험군과도 비교하였다.

도 14 내지 17에서는, 실험예 1에서의 수치인 비스트레스 상황(Non)에서의 EPM 수치를 비교용 그래프로 나타내었다. 실시예2(Non), 실시예5(Non), 실시예7(Non), 실시예8(Non), 실시예9(Non)는 각각 실험예 1에서의 EPM 수치이다.

우선, 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS))에 대한 Elevated plus maze(EPM)를 수행하였다. 결과는 도 14 및 도 15에 도시된 바와 같다. 도 14는 open arms에서 이동한 거리(distance in open arms(cm))를 나타내며, 도 15는 open arms에서 머문 시간(Time(s))을 나타낸다.

다음으로, 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에 대한 Elevated plus maze(EPM)를 수행하였다. 결과는 도 16 및 도 17에 도시된 바와 같다. 도 16은 open arms에서 이동한 거리(distance in open arms(cm))를 나타내며, 도 17은 open arms에서 머문 시간(Time(s))을 나타낸다.

그 결과, 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS)) 및 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에서 비스트레스 모델보다 Elevated plus maze(EPM) 측정 수치가 높은 것으로 나타났다. 이는 DW(증류수) 투여군을 기준으로 차이 값을 계산해 봤을 때 비스트레스 상황보다 스트레스 상황에서 본 발명의 조성물이 더 항불안 효과를 잘 나타냄을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 항불안 효과를 가짐을 확인할 수 있다. 또한, 일반적으로 장기 투여해야 효과를 나타내는 비교대상 Fluoxectine에 비해, 본 발명에 따른 조성물은 실험시작 30분 전에 투여되었음에도 불구하고, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 나타냄을 확인하였기에, 본 발명에 따른 조성물이 속효성을 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 스트레스 모델에서 항우울 작용에 대한 운동능력 평가

실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물에 대하여 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS)) 및 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에 대한 운동능력을 평가하였다. 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS)) 및 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에 대해 Open field test(OFT)를 수행하였다. 한편, 실험시작 30분 전에 증류수(DW)를 급이한 실험군을 대조군으로 하였으며, 실험시작 30분 전에 10mg/kg의 Fluoxectine를 투여한 실험군과도 비교하였다.

도 18 내지 19에서는, 실험예 1에서의 수치인 비스트레스 상황(Non)에서의 OFT 수치를 비교용 그래프로 나타내었다. 실시예2(Non), 실시예5(Non), 실시예7(Non), 실시예8(Non), 실시예9(Non)는 각각 실험예 1에서의 OFT 수치이다.

우선, 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS))에 대한 Open field test (OFT)를 수행하였다. 결과는 도 18에 도시된 바와 같다.

다음으로, 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에 대한 Open field test (OFT)를 수행하였다. 결과는 도 19에 도시된 바와 같다.

그 결과, 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS)) 및 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에서 비스트레스 모델보다 Open field test (OFT) 측정 수치가 높은 것으로 나타났다. 이는 DW(증류수) 투여군을 기준으로 차이 값을 계산해 봤을 때 비스트레스 상황보다 스트레스 상황에서 본 발명의 조성물이 더 항우울 효과를 잘 나타냄을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 운동 능력 등의 요소적 관점에서 항우울 효과를 가짐을 확인할 수 있다. 또한, 일반적으로 장기 투여해야 효과를 나타내는 비교대상 Fluoxectine에 비해, 본 발명에 따른 조성물은 실험시작 30분 전에 투여되었음에도 불구하고, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 나타냄을 확인하였기에, 본 발명에 따른 조성물이 속효성을 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 스트레스 모델에서 빠르게 발병하는 항우울 작용에 대한 평가

일반적으로, Novelty suppressed feeding test(NSFT)에서 급성 불안 완화제와 만성 항우울제를 투여하면 섭식 지연 시간이 감소한다. 일반적으로 Novelty suppressed feeding test(NSFT)에서 효과를 확인하려면 최소 3주가 필요하다. 본 실험에서는 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 6의 조성물의 단일 경구 투여 후 그룹 간의 섭식 지연 시간을 비교했다. 한편, 실험시작 30분 전에 증류수(DW)를 급이한 실험군을 대조군으로 하였으며, 실험시작 30분 전에 10mg/kg의 Fluoxectine를 투여한 실험군과도 비교하였다.

우선, 비스트레스 모델에 대해 Novelty suppressed feeding test(NSFT)를 수행하여, 비교용 자료로 이용하였다. 실시예2(Non), 실시예5(Non), 실시예7(Non), 실시예8(Non), 실시예9(Non)를 투여한 실험용 쥐에 대해 Novelty suppressed feeding test(NSFT)를 수행하여 섭식 지연 시간을 기록하였다.

우선, 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS))에 대한 Novelty suppressed feeding test(NSFT)를 수행하였다. 결과는 도 20에 도시된 바와 같다. 도 20에서의 실시예2(Non), 실시예5(Non), 실시예7(Non), 실시예8(Non), 실시예9(Non)은 비스트레스 상황에 대한 수치로써, 비교용 수치이다.

다음으로, 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS))에 대한 Novelty suppressed feeding test(NSFT)를 수행하였다. 결과는 도 21에 도시된 바와 같다. 도 21에서의 실시예2(Non), 실시예5(Non), 실시예7(Non), 실시예8(Non), 실시예9(Non)은 비스트레스 상황에 대한 수치로써, 비교용 수치이다.

그 결과, 실시예 2, 실시예 5, 실시예 7 내지 9의 경우 사회적 패배 스트레스 모델(Social　defeat　stress(SDS))과 사회적 계층 스트레스 모델(Social hierarchy stress(SHS)) 모두 투여 30분 만에 Novelty suppressed feeding test(NSFT)에서 섭식 대기 시간이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 실시예에 따른 조성물인 실시예 2, 실시예 5, 실시예 7 내지 9는 섭식 대기 시간이 현저하게 줄어들었으나, 본 발명의 실시예를 따르지 않은 조성물은 섭식 대기 시간이 거의 줄어들지 않았다.

한편, 연자육(연자)추출물에 원지추출물을 혼합한 실시예 7 내지 9을 투여한 경우 단독의 조성물을 투여한 경우보다 우수한 효능을 보여, 이들의 조합으로부터 예기치 못한 효과인 속효성이 나타났음을 확인할 수 있었다.

Novelty suppressed feeding test(NSFT)에서는 효과를 확인하려면 최소 3주가 필요하나, 본 발명의 실시예에 따른 조성물의 경우, 경구 투여 30분만에 효과를 보일 수 있다는 사실을 발견하였으므로, 이는 본 발명에 따른 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물이 스트레스 개선 및 항우울 활성에 대해 속효성을 가짐을 나타낸다.

결론.

상기 실시예, 비교예, 실험예를 통하여, 본 발명에 따른 조성물의 효과에 대하여 확인하였다. 본 발명에 따른 조성물은 비 스트레스 상태에서 용량 의존적으로 항우울 효과를 가짐을 실험예 1을 통해 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 사회적 패배 스트레스 및 사회적 계층 스트레스 상황에서는 비 스트레스 상황일 때보다 더 강한 항우울 효과를 가짐을 실험예 2를 통해 확인할 수 있었으며, 또한, 실험예 2를 통해 본 발명의 조성물이 스트레스 완화 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은 실험예 3을 통해 성욕을 강화시키는 조성물임을 확인할 수 있었으며, 사회적 패배 스트레스 및 사회적 계층 스트레스 상황에서 더욱 강한 성욕 증대 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

그리고, 본 발명에 따른 조성물은 실험예 4를 통하여 항불안 효과를 가짐을 확인할 수 있었으며, 사회적 패배 스트레스 및 사회적 계층 스트레스 상황에서 더욱 강한 항불안 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 실험예 5를 통하여 우울 증세에 따른 운동능력 저하 현상을 개선할 수 있음을 확인하였다.

특히, 본 발명에 따른 조성물은 속효성을 가질 수 있음을 확인할 수 있었다. 3주 이상의 기간을 두고 장기적으로 섭취해야 하는 일반적인 항우울제와는 다르게, 본 발명에 따른 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물은 속효성을 가지므로, 급성우울증 등에 신속하게 대처할 수 있어, 우울증에 의한 자살 사고 등 불의의 상황을 방지할 수 있는 진보된 조성물임을 확인하였다.

이에, 본 발명은 일반적인 상황 즉, 평시의 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과는 물론, 1시간 이내에 속효성의 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖는 신규한 조성물로써, 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물을 개발하였음을 명시한다.

본 발명을 첨부된 도면과 함께 설명하였으나, 이는 본 발명의 요지를 포함하는 다양한 실시 형태 중의 하나의 실시 예에 불과하며, 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 하는 데에 그 목적이 있는 것으로, 본 발명은 상기 설명된 실시예에만 국한되는 것이 아님은 명확하다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 하기의 청구범위에 의해 해석되어야 하며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 변경, 치환, 대체 등에 의해 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리에 포함될 것이다. 또한, 도면의 일부 구성은 구성을 보다 명확하게 설명하기 위한 것으로 실제보다 과장되거나 축소되어 제공되는 것임을 명확히 한다.

Claims

연자육(연자)을 정제수 또는, 정제수와 에탄올의 비율이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 100 ~ 140℃에서 4시간 추출하여 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 1mg/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 연자육(연자)추출물과,
원지를 정제수 또는, 정제수와 에탄올이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 60분간 추출하여 얻어진 것을, 정제수 또는, 정제수와 에탄올이 97 : 3의 중량비로 혼합된 추출용매로 80℃에서 40분간 추출하여 여과하고 회전증발기에서 감압 하에 증발시켜 동결건조하여 1mg/kg의 농도가 되도록 증류수에 희석한 원지추출물을,
50 : 50의 중량비로 100 rpm으로 교반하면서 6시간 동안 혼합하고 20℃의 온도로 2일간 숙성한 혼합물로 구성되어, 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과를 갖되, 항우울 활성, 스트레스 완화 효과 및 항불안 효과 각각에 대하여 속효성을 갖는 것을 특징으로 하는 항우울용, 스트레스 완화용 및 항불안용 조성물.
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