KR102510199B1 - 와이셀라 컨푸사 vp30 배양물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물 - Google Patents
와이셀라 컨푸사 vp30 배양물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물 Download PDFInfo
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
- A61K2800/84—Products or compounds obtained by lyophilisation, freeze-drying
Abstract
본 발명은 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 (KCTC 13871BP)의 배양액 또는 배양물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 (KCTC 13871BP)의 배양액 또는 배양물은 피부 장벽 개선 효능 및 피부 보습 효능이 우수하다.
Description
본 발명은 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 (KCTC 13871BP)의 배양액 또는 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다.
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus 및Weissella sp.를 포함하는 수많은 유산균(Lactic Acid Bacteria, LAB)들은 다양한 인간, 동물, 식물 및 환경으로부터 분리되어 가공 식품 생산을 위해 널리 사용되고 있다.
게다가, 유산균은 식품의 발효뿐만 아니라 사람의 면역력 증진, 식중독 방지, 변비 예방 및 정장 효능이 있어 오래전부터 많은 연구개발로 발전을 거듭하였다. 최근에는 암 예방에도 효과가 있다고 보고되고 있다. 이러한 유산균의 엄청난 효능 때문에 다양한 유산균 발효 제품과 음식에 대한 관심이 해를 거듭할수록 높아지고 있다. 하지만, 화장품 소재로서의 연구는 아직까지 미미하다.
한편, 유산균에 의해 생산된 생체 활성 물질 중 바이오 폴리머(biobased polymers)로 사용되는 EPS(exopolysaccharide)는 그 수요가 증가하고 있다. EPS는 식품 가공 및 유익한 효능에 있어 널리 연구되어 왔다. LAB에 의해 생산된 EPS는 점도 조절제 및/또는 유화제로 작용할 수 있으며, 요구르트, 치즈 및 기타 발효 식품을 가공하는 데 중요한 역할을 한다.
유산균의 EPS는 중요한 생체 기능을 가지고 있는데, 그 기능은 EPS의 구조 및 EPS를 생성하는 박테리아에 따라 다르다고 보고된 바가 있다. 예를 들어, Lactobacillus rhamnosus KL37에서 유래한 EPS는 arthritogenic antibodies의 생산을 억제함으로써 관절염을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, London et al. [London LEE, Kumar AHS, Wall R, Casey PG, O'Sullivan O, Shanahan F, et al. 2014. Exopolysaccharide-Producing Probiotic Lactobacilli Reduce Serum Cholesterol and Modify Enteric Microbiota in ApoE-Deficient Mice. Journal of Nutrition. 144: 1956-1962]은 Lactobacillus paracasei NFBC 338가 생산한 EPS가 지질대사에 대한 조절기능이 있는 것으로 보고하였다. 또한, Weissella cibaria GA44가 생산한 EPS는 항산화 작용이 있다고 한다.
본 발명에서는 피부 장벽 개선 효능 및 피부 보습 효능이 우수한 와이셀라 컨푸사 VP30의 배양액 또는 배양물을 제공하고자 한다.
본 발명은 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 (KCTC 13871BP)의 배양액 또는 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 배양액 또는 배양물은 바람직하게 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 (KCTC 13871BP)가 분비하는 EPS(exopolysaccharide)를 함유하고 있는 것이 좋다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 배양물은 바람직하게 상기 배양액을 동결건조하여 수득되는 동결건조물인 것이 좋다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습용 및 피부 장벽 개선용인 것이 좋다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 토너, 젤, 로션, 크림, 에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 스킨소프너, 화장수, 파운데이션, 미스트, 바디클린저 중 선택되는 어느 하나의 제형인 것이 좋다.
본 발명의 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 (KCTC 13871BP)의 배양액 또는 배양물은 피부 장벽 개선 효능 및 피부 보습 효능이 우수하여 화장료 조성물로 사용하기 좋다.
도 1은 VP30 발효동결건조물을 인간진피섬유아세포에 처리한 후, 세포 생존율을 측정한 결과로, VP30 배양물이 세포독성을 나타내지 않았음을 보여준다.
도 2는 VP30 EPS 동결건조물을 인간진피섬유아세포에 처리한 후, 세포 생존율을 측정한 결과로, VP30 배양물이 세포독성을 나타내지 않았음을 보여준다.
도 3은 VP30 발효동결건조물을 인간진피섬유아세포에 처리한 후, 인간진피섬유아세포의 히알루론산 합성효소 및 아쿠아포린 유전자 발현 변화를 측정한 결과로, VP30 배양물의 우수한 피부 보습 효능을 보여준다.
도 4는 VP30 EPS 동결건조물을 인간진피섬유아세포에 처리한 후, 인간진피섬유아세포의 히알루론산 합성효소 및 아쿠아포린 유전자 발현 변화를 측정한 결과로, VP30 배양물의 우수한 피부 보습 효능을 보여준다.
도 2는 VP30 EPS 동결건조물을 인간진피섬유아세포에 처리한 후, 세포 생존율을 측정한 결과로, VP30 배양물이 세포독성을 나타내지 않았음을 보여준다.
도 3은 VP30 발효동결건조물을 인간진피섬유아세포에 처리한 후, 인간진피섬유아세포의 히알루론산 합성효소 및 아쿠아포린 유전자 발현 변화를 측정한 결과로, VP30 배양물의 우수한 피부 보습 효능을 보여준다.
도 4는 VP30 EPS 동결건조물을 인간진피섬유아세포에 처리한 후, 인간진피섬유아세포의 히알루론산 합성효소 및 아쿠아포린 유전자 발현 변화를 측정한 결과로, VP30 배양물의 우수한 피부 보습 효능을 보여준다.
와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30은 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2019년 06월 25자로 기탁된 균주로서, 수탁번호가 KCTC13871BP이다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-2312221호에서 등록받은 균주이며, EPS(exopolysaccharide) 분비능이 우수한 균주이다.
EPS는 생성하는 균주 마다 구조 및 특징이 다르게 나타나는데, 본 발명에서 VP30의 배양물이 VP30 특유의 EPS를 포함하여 피부 장벽 개선 효능 및 피부 보습 효능이 우수한 것을 확인하였다. 또한, VP30 배양물은 피부에 무자극성으로 나타나 화장료 조성물로 사용하기 좋은 것으로 나타났다.
이에 본 발명은 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 (KCTC 13871BP)의 배양액 또는 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명에 있어서, 배양물은 균주 배양액을 다양한 방법으로 처리하여 가공한 것을 말하는데, 일예로, 배양액을 동결건조한 동결건조물일 수 있다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물은 다양한 제형으로 제조될 수 있는데, 바람직하게 피부 보습용으로 사용하기 좋은 제형이 좋다. 구체적인 제형의 예시로는 토너, 젤, 로션, 크림, 에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 스킨소프너, 화장수, 파운데이션, 미스트 등이 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 와이셀라 컨푸사 (
Weissella confusa
) VP30 배양물 제조]
본 실시예에서는 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 배양물을 제조하였다.
1-1) 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 발효동결건조물 제조
전배양 배지에 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30을 접종한 후, 2차례에 걸쳐 전배양을 진행하였다. 본 배양 배지(자당(sucrose) 10%(w/v), 탈지분유(skimmilk) 10%(w/v); 6.8pH)를 제조한 후, 100℃에서 30분동안 멸균하였다. 2차례에 걸쳐 전배양시킨 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 배양액을 본 배양 배지에 5% 접종하고, 30℃에서 17시간 정치발효하여 EPS 함유량이 높은 배양액을 제조하였다.
이후, 제조된 배양액을 고압증기 멸균기에서 75℃, 2시간의 살균 과정을 진행한 후, 동결건조기를 사용하여 동결 건조시켜 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 발효동결건조물을 제조하였다.
1-2) 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30의 EPS 동결건조물 제조
전배양 배지에 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30을 접종한 후, 2차례에 걸쳐 전배양하였다. 본 배양 배지(자당(sucrose) 10%(w/v), 콩펩톤(soy peptone) 3%(w/v), 효모 추출물(yeast extract) 1%(w/v), 폴리소르베이트80(Tween80) 0.3%(w/v), 제2인산나트륨(sodium phosphate dibasic) 0.2%(w/v); 6.8pH)를 제조한 후, 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 2차례에 걸쳐 전배양시킨 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 배양액을 본 배양 배지에 10% 접종하고, 발효기를 사용하여 30℃에서 7시간동안 발효하여 EPS 함유량이 높은 배양액을 제조하였다.
이후, 제조된 배양액을 고압증기 멸균기에서 75℃, 2시간의 살균 과정을 완료 후, 배양액에 95% 에탄올(-20℃)을 동량으로 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 정치하여 EPS를 침전시켰다. 원심분리기를 이용하여, 원심분리 (10000rpm, 15분)하고, 상등액인 에탄올을 완전히 제거한 후, EPS를 회수하였다. 회수한 EPS를 동결건조기를 사용하여 동결 건조시켜 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 EPS 동결건조물을 제조하였다.
[실험예 1: VP30 배양물의 피부 보습 효능 확인]
본 실험예에서는 VP30 배양물의 피부 보습 효능을 확인하고자 했다. 이를 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 VP30 발효동결건조물 및 VP30 EPS 동결건조물을 인간진피섬유아세포에 처리하고, 히알루론산 합성효소 (Hyaluronan synthase 2, HAS2) mRNA 및 아쿠아포린(Aquaporin 3, AQP3) mRNA 발현량 변화를 분석하였다.
한편, 히알루론산(Hyaluronic acid synthase, HAS)은 섬유아세포 및 각질형성세포에서 형성되어 있으며, 히알루론산 합성을 촉진하는 효소 중 HAS2가 히알루론산 합성에 결정적인 역할을 한다. 히알루론산은 수분 균형유지, 삼투압과 이온의 흐름 등 피부 구조의 안정화에 관여할 뿐만 아니라, 상처의 회복에도 관여하고 있다. 표피 내 히알루론산의 감소는 피부 노화의 주 현상이며, 히알루론산 감소에 따라 피부 수분 손실과 피부 탄력 감소 현상이 나타난다.
아쿠아포린(Aquaporin, AQP)은 사람의 각질형성세포에 형성되어 있으며, 세포 간의 수분과 글리세롤 이동을 조절하는 단백질 중에서 AQP3가 피부 보습 조절에 결정적인 역할을 한다. 아쿠아포린 생성이 저해되면 피부 장벽이 손상되고 피부의 탄력과 수분 함유 능력이 감소하는 현상이 나타난다.
1-1) 실험방법
- 시험 대상 물질 준비
상기 실시예 1에서 제조한 VP30 발효동결건조물 및 VP30 EPS 동결건조물은 정제수로 희석하여 다양한 농도로 시험에 사용하였다. 한편, 양성 대조군인 Retinoic acid(Sigma-Aldrich, USA)는 DMSO에 녹여 세포처리에 사용하였다.
- 인간진피섬유아세포 준비
인간진피섬유아세포(NHDFs; CELLnTEC, Switzer-land)의 배양을 위하여 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Biowest, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS; Biowest, USA), 1% penicillin/streptomycin(penicillin 100 IU/mL, streptomycin 100 μg/mL; Life Technologies, USA)을 함유한 배지를 사용하였으며, 세포배양기 내에서 5% CO2, 37℃의 조건하에 배양하였다.
- 세포독성 실험 방법
배양된 인간진피섬유아세포를 96-well plate에 5×103 cells/well로 분주하고 24시간 배양한 후, 상기 시험대상 물질을 여러 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후, WST-1 assay solution(EZ-CYTOX; DOGEN, Korea)을 배지양의 10%씩 첨가하여 추가적으로 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, Microplate reader system(SpectraMax® i3x Multi-Mode Detection Platform; Molecular Devices, USA)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 인간진피섬유아세포의 세포생존율을 측정하였다.
- mRNA 발현량 변화 측정 방법
배양된 인간진피섬유아세포를 96-well plate에 5×103 cells/well로 분주하고 24시간 배양한 후, 상기 시험 대상 물질을 처리하며 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수확한 후, 1 ml TRIzol reagent (Invitrogen, USA)을 첨가하여 세포 용해 및 mRNA 추출을 수행하였다. mRNA는 M-MLV reverse transcriptase(Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA로 치환하여 qRT-PCR에 사용하였다. qRT-PCR은 SYBR™ Green Master Mix (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였으며, StepOnePlus™ Systems software (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 해당 유전자의 발현을 분석하였다. 한편, 유전자 발현 변화는 β-actin 발현량을 대조군으로 하여 상대적인 발현 정도를 나타내었고, Retinoic acid를 양성대조물질로 사용하였다.
1-2) 실험 결과
- 세포독성 실험 결과
시험물질 VP30 발효동결건조물을 0.18, 0.36, 0.9, 1.8, 3.6%(w/v) 농도로 처리하였을 시, 세포생존율이 음성대조군 대비 각각 100.43%, 103.12%, 104.24%, 107.88%, 114.02%로 나타나 세포생존율이 감소하지 않았다 (도 1). 이는 VP30 발효동결건조물은 해당 농도에서 세포독성을 나타내지 않았음을 의미한다
시험물질 VP30 EPS 동결건조물을 0.06, 0.12, 0.3, 0.6, 1.2%(w/v) 농도로 처리하였을 시, 세포생존율은 음성대조군 대비 각각 100.47%, 104.62%, 108.57%, 115.85%, 117.01%로 나타나 세포생존율이 감소하지 않았다 (도 2). 이는 VP30 EPS 동결건조물은 해당 농도에서 세포독성을 나타내지 않았음을 의미한다
- 히알루론산 합성효소 및 아쿠아포린 mRNA 발현량 변화 측정 결과
시험물질 'VP30 발효동결건조물'을 0.9, 1.8, 3.6%(w/v) 농도로 처리하였을 시, 히알루론산 합성효소(Hyaluronan synthase 2, HAS2) 및 아쿠아포린(Aquaporin 3, AQP3)의 mRNA 발현량이 VP30 발효동결건조물의 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
시험물질 'VP30 EPS 동결건조물'을 0.3, 0.6, 1.2%(w/v) 농도로 처리하였을 시, 히알루론산 합성효소(Hyaluronan synthase 2, HAS2) 및 아쿠아포린(Aquaporin 3, AQP3)의 mRNA 발현량이 VP30 EPS 동결건조물의 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
상기와 같은 결과는, VP30 배양물이 피부 세포 내 히알루론산 합성효소 생성 증가 및 아쿠아포린 생성 증가에 도움을 준다는 것을 의미하고, 더 나아가, VP30 배양물이 피부 탄력 증가, 피부 보습 및 피부 주름 개선 효능이 있음을 의미한다.
[실험예 2: VP30 배양물의 피부 자극성 확인]
본 실험예에서는 VP30의 배양물이 피부를 자극하지 않는지 확인하고자 했다. 이를 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 VP30 발효동결건조물 및 VP30 EPS 동결건조물을 피시험자에게 피부첩포시험을 실시한 후 피부 자극을 평가하였다. 구체적인 실험방법은 하기와 같다.
자발적으로 모집된 20세 이상의 성인 남녀 35명을 피시험자로 하였다. 시험당당자가 시험부위인 피시험자의 등부위를 70% 에탄올로 닦아내고 건조시켰다. 시험물질(VP30 발효동결건조물 1.8% 또는 VP30 EPS 동결건조물 0.6%) 20 ㎕를 직경 8 ㎜의 첩포(Finn Chamber)에 적하하고, 첩포를 시험부위에 부착하여 고정하였다. 24시간이 지난 후 부착된 첩포를 제거하였다.
첩포 제거 후, 30분, 24시간, 48시간이 경과한 시점에 국제접촉피부염연구회(International Contact Dermatitis Research Group: ICDRG)의 판정기준(표 1)에 따라 피부의 자극 정도를 평가하였다. 또한, 피부반응도 계산공식을 따라 평균 피부반응도를 산출하여 시험물질의 자극 정도를 산출하였다 (표 2).
| 기호 | 점수 | 판정기준 |
| - | 0 | 무자극 |
| ± | 0.5 | 미자극 (희미한 또는 가까스로 감지할 수 있는 가벼운 홍반) |
| + | 1 | 경자극 (경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진) |
| ++ | 2 | 중자극 (뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포) |
| +++ | 3 | 강자극 (심한 홍반 및 대수포, 가피형성) |
| 시험물질명 | 반응자 수 | 피부반응도 | 평균 피부반응도 | ||
| 30분 경과 | 24시간 경과 | 48시간 경과 | |||
| VP30 발효동결건조물 1.8% | 0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.00 |
| VP30 EPS 동결건조물 0.6% | 0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.00 |
이를 통해, VP30 배양물은 피부 자극성이 없음을 확인할 수 있었다.
[실험예 3: VP30 배양물의 피부 장벽 개선 효능 확인]
본 실험예에서는 VP30 배양물의 피부 장벽 개선 효능을 확인하고자 했다. 이를 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 VP30 발효동결건조물 및 VP30 EPS 동결건조물을 피시험자에게 3주간 처리한 후, 경피 수분 손실량을 테스트하였다. 구체적인 실험방법은 하기와 같다.
자발적으로 모집된 20세 이상의 성인 여성 21명을 피시험자로 하여, 3주 동안 1일 2회(아침, 저녁) 세정 후, 왼쪽 전완상부에는 VP30 EPS 동결건조물 0.6%를, 왼쪽 전완하부에는 VP30 발효동결건조물 1.8%를 각각 동일한 양으로 처리하였다. 3주가 지난 후, 전완상부 및 전완하부에 SLS(Sodium Lauryl Sulfate)를 24시간 동안 첩포하여 피부 자극을 유도하고, 경피 수분 손실량을 측정하였다 (도 5).
도 5를 보면, VP30 배양물을 지속적으로 도포한 경우 피부 장벽이 개선되어, 경피 수분 손실량이 줄어든 것을 확인할 수 있다. 또한, 대조군(무도포)과 비교하여도, 경피 수분 손실량이 유의미하게 줄어든 것을 확인할 수 있다. 상기와 같은 결과는, VP30 배양물은 피부 장벽 개선 효능이 우수함을 의미한다.
Claims (5)
- 와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 (KCTC 13871BP)의 배양액 또는 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 배양액 또는 배양물은,
와이셀라 컨푸사 (Weissella confusa) VP30 (KCTC 13871BP)가 분비하는 EPS(exopolysaccharide)를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 배양물은,
상기 배양액을 동결건조하여 수득되는 동결건조물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
피부 보습용 및 피부 장벽 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
토너, 젤, 로션, 크림, 에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 스킨소프너, 화장수, 파운데이션, 미스트, 바디클린저 중 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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- 2023-01-25 KR KR1020230009698A patent/KR102510199B1/ko active IP Right Grant
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