JP2022182870A - 肌質改善剤及び当該肌質改善剤を配合した皮膚外用剤 - Google Patents

Abstract

【課題】肌質改善剤及び当該肌質改善剤を配合した皮膚外用剤を提供する。【解決手段】ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の菌体を有効成分とする、肌質改善剤である。前記肌質改善剤が、皮膚バリア機能の改善、菌に対する抵抗力の向上、又はＴＥＷＬの抑制のうち少なくともいずれかを目的として使用されることが好ましい。また、前記ラクトバチルス・ラムノーサスが、ＫＯ３株（ＮＩＴＥ ＢＰ－７７１）であることが好ましい。【選択図】図１

Description

本発明は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を有効成分とする肌質改善剤に関するものであり、当該肌質改善剤を配合した皮膚外用剤に関するものである。

皮膚は、体の最外部に位置し、絶え間なく再生されている器官である。皮膚は、表皮、真皮、及び皮下組織の３層に大別され、表皮と真皮とは基底膜を介して接している。基底膜の表皮側に接している基底細胞は絶えず分裂を繰り返しており、この分裂した細胞が順次上方に押し上げられ、分化を経て、表皮の最上層にある角層を形成する。

また、皮膚は、感染、温度、湿度、化学的な攻撃、及び機械的な攻撃等の外部からの刺激に対し身体を保護する皮膚バリア機能を有し、生体の機能維持に重要な役割を果たしている。皮膚バリア機能の不全は、皮膚の乾燥、肌あれといった皮膚状態の悪化という形で現れる。このような皮膚状態の悪化が更に進行すると、細菌や有害物質の生体内への侵入による直接的な障害、アレルギー反応などが生じやすくなる。

皮膚バリア機能の中心的な役割を果たす器官として、皮膚の最外部に存在する角層がある。角層は、水分が蒸発することを防ぐ機能だけでなく、アレルゲンや細菌等の様々な異物が侵入することを防ぐバリア機能も担っている。この角層は、基底細胞から分化した細胞が積み上げられることで形成され、古くなると垢となって剥がれ落ちるという一連の過程を経る。この一連の過程は、ターンオーバーと呼ばれ、一定の周期で繰り返される。
角層のバリア機能は、ターンオーバーによる細胞の代謝、細胞代謝物の産生及び輸送、並びに酵素反応等が、角層内で正常に機能することによって維持されている。しかしながら、生理的老化、外的ダメージ等によってバリア機能が乱されると、バリア機能が低下し、皮膚の乾燥、肌荒れ等の皮膚トラブルの原因となる。そこで、細胞の増殖を促進し、細胞の代謝を促進することは、角層の機能を正常化し、水分保持機能や肌バリア機能を改善することに繋がると考えられる。

皮膚バリア機能を発揮するにあたり、表皮細胞間隙の存在もまた重要であることが知られている。表皮細胞間隙には、約数ｍｇ／ｍＬという高濃度のヒアルロン酸（ＨＡ：Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）が存在しているという報告がある。ＨＡの特筆すべき物理的性質としては、水和力、粘弾性、及び水溶液中で取りうる可変的な網目構造が知られている。特にその網目構造は、ＨＡの濃度もしくは分子量、又は周囲のイオンもしくはｐＨによって動的に変化することから、細胞空間の維持及び浸透圧の維持と共に、栄養素等の保持及び移動、並びに高分子成分の移動阻害に関わると考えられている。
そして、生理的老化に伴い皮膚内のＨＡ含量は減少することが知られており、皮膚内のＨＡ含量の減少が、皮膚の乾燥及び萎縮、弾性力の低下、並びに小じわの形成等の老化に関与している可能性が示唆されている。従って、ＨＡの産生を促進することは、皮膚の老化予防や肌状態の改善に寄与することができると考えられる。

その他に、タイトジャンクション（ＴＪ：Ｔｉｇｈｔ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）もまた、皮膚バリア機能に大きく関与することが知られている。ＴＪは、細胞の周囲にベルト状に存在し、隣り合った細胞同士を接着させることで、連続的に細胞を繋ぎ止める細胞間接着構造体であり、細胞間隙の液体及び物質の透過を制御している。
ＴＪの機能が弱まると、細胞間接着機能及び透過制御機能が弱まる。細胞間接着機能及び透過制御機能が弱まると皮膚バリア機能及び水分保持機能も弱まり、乾燥肌、あれ性、アトピー性皮膚炎及び各種感染症などの皮膚症状の原因となると考えられる。従って、ＴＪを構成する成分の産生を促進することは、皮膚バリア機能及び水分保持機能を高めることに繋がると考えられる。

さらに、皮膚バリア機能が低下又は崩壊すると、細菌等が生体内に侵入しやすくなる。細菌等の生体内への侵入に対しては、抗菌ペプチド等の自然免疫機構が働くことが知られている。抗菌ペプチドは、細菌等に対する抗菌活性を有するペプチドであり、生体が細菌や炎症性サイトカインに暴露されたときに産生され、細菌等の生体内への侵入を排除する生体バリアとして機能する。
抗菌ペプチドの発現レベルが低いと、細菌等に対する十分な抗菌活性を示すことができず、また、アトピー性皮膚炎が発症したり重症化したりすることが示唆されている。従って、抗菌ペプチドの発現レベルを適切なレベルに高めることで、細菌等に対する抵抗力の向上や、アトピー性皮膚炎の抑制等に繋がると考えられる。

加えて、皮膚バリア機能の低下は、皮膚から経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ：ＴｒａｎｓＥｐｉｄｅｒｍａｌ Ｗａｔｅｒ Ｌｏｓｓ）を増加させることが知られている。皮膚表面からは絶えず水分が蒸散しており、この水分蒸散のことを古くは不感知蒸泄と呼んでいたが、現在はＴＥＷＬと呼ばれることが一般的である。この水分の蒸散とは、角層を通過して蒸散する水のことであり、皮膚に存在する汗腺からの水の蒸散とは区別される。皮膚バリア機能が低下し、ＴＥＷＬが増加すると、皮膚の乾燥や痒みを引き起こすことが知られている。この皮膚の乾燥や痒みは、紫外線等の様々な刺激が、皮膚内部環境に影響を及ぼし、皮膚バリア機能が阻害された結果生じるものと考えられている。また、アトピー性皮膚炎等の病的皮膚では、角層の機能が低下し、ＴＥＷＬが上昇していることが知られている。
スキンケアにおいては、皮膚の保湿が非常に重要な要素であり、この水分蒸散に対するバリア機能が最も重要であると考えられている。ＴＥＷＬは汗腺機能が働かないと考えられている温度約２０℃、湿度約５０％において測定され、皮膚バリア機能の指標として広く用いられている。

上述したように、皮膚バリア機能の低下は生体に様々な悪影響を及ぼすことが明らかにされている。そのため、皮膚バリア機能を向上し、又は肌質を改善するために、多くの研究がなされてきた。しかしながら、皮膚バリアを向上し、又は肌質を改善する素材についての研究は十分ではなく、いまだ新たな素材の開発が要望されている。

他方で、乳酸菌は、一般消費者からの認知度が高く、整腸作用や免疫賦活作用といった有益な生理活性を有することが知られている素材である。このような有益な生理活性を有する乳酸菌は、従来から食品や化粧品等に応用されてきた。例えば、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトバチルス・ブレビスの菌体を経口摂取することで、ＴＥＷＬ抑制作用、皮膚バリア機能向上作用、角層水分量向上作用、皮膚皮脂量低減作用、及び皮膚弾力向上作用を有することが報告されている（特許文献１）。また、ラクトバチルス・ペントサスのイチジク醗酵物を経口摂取することで、皮膚バリア機能向上作用、ＴＥＷＬ抑制作用、及び角層水分量向上作用を有することが報告されている（特許文献２）。更に、ラクトバチルス・ブレビスの菌体及び菌体処理物を経口摂取等することで、ＴＥＷＬ抑制作用を有することが記載されている（特許文献３）。

上述したように、これまで、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、及びラクトバチルス・ペントサスの菌体又は菌体処理物を経口摂取することで、皮膚バリア機能の向上等の有用な効果を奏することが報告されてきた。しかしながら、当該有用な効果を奏する場合に細胞内で起こるメカニズム、特に、皮膚バリア機能の向上等に関して特定の遺伝子発現の変動については解明されていない。また、特許文献１～３に記載された発明の使用方法は経口摂取であり、皮膚に塗布することで皮膚バリア機能改善効果があることについても記載はない。

また、ラクトバチルス属乳酸菌の中でも、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株（ＮＩＴＥ ＢＰ－７７１）（以下、ＫＯ３株という。）は、ヒト唾液中から分離された乳酸菌の一種である。ＫＯ３株は、う蝕菌、歯周病菌等の口腔内疾患の原因となる菌に対して抗菌スペクトルが広いことが報告されており、口腔ケア製品及び食品等に応用されている（特許文献４～６）。その他に、ＫＯ３株は、その抗菌性を利用して、皮膚外用剤としても応用されている（特許文献７、８）。

これまで、ＫＯ３株は、口腔及び皮膚に存在する菌に対する抗菌性について主に研究されてきた。しかしながら、ＫＯ３株、ひいてはラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）が、皮膚バリア機能等を向上させるか否かについては知られておらず、これまで知見もなかった。

特開２００８－１７９６０１ 特開２０１９－１１３１６ 特許第６０６７２９２ 特許第５６４５１９２ 特開２０１８－１００２２８ 特開２０１９－１１２６８ 特許第６７４６０９１ 特開２０１８－２６６１

以上のような状況に鑑み、本発明者らが鋭意研究を重ねたところ、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の菌体、特にＫＯ３株の菌体が、皮膚バリア機能の改善、細菌等に対する抵抗力の向上、及びＴＥＷＬの抑制に関する効果を奏することを見出した。そして、本発明者らは、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を有効成分とした肌質改善剤及び当該肌質改善剤を配合した皮膚外用剤を完成させた。すなわち、本発明は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を有効成分とする肌質改善剤、及び当該肌質改善剤を配合した皮膚外用剤を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の菌体又は菌体の抽出物を有効成分とする、肌質改善剤。
（２）前記ラクトバチルス・ラムノーサスが、ＫＯ３株（ＮＩＴＥ ＢＰ－７７１）である、（１）に記載の肌質改善剤。
（３）皮膚バリア機能の改善、菌に対する抵抗力の向上、又はＴＥＷＬの抑制のうち少なくともいずれかを目的として使用するものである、（１）又は（２）に記載の肌質改善剤。
（４）ＨＢＥＧＦ、ＨＡＳ３、ＣＬＤＮ１、又はＤＥＦＢ２のうち少なくともいずれかの遺伝子発現を促進するものである、（１）～（３）のいずれか１項に記載の肌質改善剤。
（５）（１）～（４）のいずれか１項に記載の肌質改善剤を配合する、皮膚外用剤。
（６）前記肌質改善剤の配合量が、０．１～１０．０質量％である、（５）に記載の皮膚外用剤。

本発明の実施形態によれば、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の菌体を有効成分とする肌質改善剤、及び当該肌質改善剤を配合した皮膚外用剤を提供することができる。

１％殺菌粉末（殺菌粉末）と、０．２質量％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液（コントロール）と、をヒト３次元培養表皮モデル（ＲＨＥ）にそれぞれ添加したときにおける遺伝子（ＨＢＥＧＦ）発現量を示す図である。縦軸は、コントロールの遺伝子発現量を１としたときの殺菌粉末の相対発現量を示す。 図１と同様の方法で試験を行ったときの遺伝子（ＨＡＳ３）発現量を示す図である。 図１と同様の方法で試験を行ったときの遺伝子（ＣＬＤＮ１）発現量を示す図である。 図１と同様の方法で試験を行ったときの遺伝子（ＤＥＦＢ２）発現量を示す図である。 殺菌粉末配合クリーム（殺菌粉末）又はプラセボクリーム（プラセボ）をそれぞれ塗って、試験開始時のＴＥＷＬ測定値（初期値）に対する２週間経過後のＴＥＷＬ測定値（２週後）の比（％）を算出し（初期値比（％））、１２名の初期値比（％）を平均化したときの図である。

以下に本発明の実施の形態を説明する。

「肌質改善剤」
本発明における肌質改善剤は、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）に属する乳酸菌の菌体又は菌体の抽出物を有効成分として含有する。ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の具体例としては、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、ＮＩＴＥ ＢＰ－７７１として寄託されたラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株が挙げられる（以下、単にＫＯ３株ともいう。）

ＫＯ３株は、ヒト唾液中から本発明者らによって初めて分離されたものであり、ヒト由来の乳酸菌である。ＫＯ３株は、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列がラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ｓｔｒａｉｎ ＩＤＣＣ３２０１の塩基配列と１４８５／１４８５の間で１００％の相同性を示し、グラム染色後の顕鏡下においてグラム陽性桿菌の様相を呈することから、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）と同定された。ＫＯ３株の主な菌学的性質を以下に示す。
（１）グラム陽性乳酸桿菌、（２）ホモ型乳酸醗酵、（３）カタラーゼ陰性、（４）芽胞形成能なし、（５）好気条件下でも培養可、（６）菌体外多糖類を産生。

本発明においては、上記乳酸菌の菌体を、乳酸菌培養の常法に従って培養し、得られた培養物から遠心分離等の集菌手段によって分離されたものをそのまま用いることのみならず、その菌体の濃縮液や、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分等の菌体の抽出物も用いることができる。また、生菌体のみならず死菌体であってもよい。ただし、皮膚外用剤に配合して製剤化する場合は、品質管理上及び安全性上の観点から死菌体を対象とすることが好ましい。

本発明の乳酸菌を培養する培地には、果汁培地、野菜汁培地、牛乳培地、脱脂粉乳培地、乳成分を含む培地、又はこれを含まない半合成培地等種々の培地を用いることができる。このような培地としては、脱脂乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地、酵母エキスを添加した脱脂粉乳培地、ＭＲＳ培地、又はＧＡＭ培地等を例示することができる。
培養方法は、静置培養又はｐＨを一定にした中和培養や、回分培養及び連続培養等、菌体が良好に生育する条件であれば、特に制限はない。

本発明における菌体とは、乳酸菌の菌体そのものを意味するだけでなく、菌体の粉砕物も含むものである。

本発明における菌体の抽出物とは、菌体を、溶媒抽出等により得られる各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末を意味するものである。

本発明の抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類等が挙げられ、このうち、エタノール等のアルコール類が好ましい。

抽出条件は、使用する溶剤によっても異なるが、例えば、菌体を含む培養液１質量部に対して1～１０質量部の溶剤を用い、０～５０℃、好ましくは２５～３７℃の温度で、０．５時間～３時間抽出するのが好ましい。

上記の抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、必要に応じて粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、
液々分配等の技術により、適宜精製して用いることもできる。

本発明におけるラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）に属する乳酸菌の菌体又は菌体の抽出物は、肌質改善剤として用いることができる。本発明における肌質改善剤とは、肌の機能の改善効果を奏する剤のことをいう。ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）は従来公知の菌種であるが、皮膚に塗布することで肌の機能を改善させる効果を奏するという報告はこれまでになく、当該効果は本発明者らによって初めて見出された効果である。

本発明における肌の機能の改善とは、皮膚バリア機能の改善、菌に対する抵抗力の向上、又はＴＥＷＬの抑制のうち少なくともいずれかのことをいう。本発明における肌質改善剤は、これらの肌の機能の改善を目的として、それぞれ、皮膚バリア機能の改善剤、菌に対する抵抗力の向上剤、及びＴＥＷＬの抑制剤としても使用することができる。ここで、皮膚バリア機能とは、皮膚組織の表面付近が有する、外界からの異物が組織内部に侵入することを防ぐ機能のことをいう。

皮膚バリア機能の改善とは、具体的には、細胞増殖促進、ＨＡの産生促進、又はＴＪの強化のうち少なくともいずれかのことをいう。

細胞増殖促進とは、細胞分裂により細胞の増殖が進むように促すことをいい、細胞増殖促進に伴いターンオーバーを促進させることをも含みうる。具体的には、細胞増殖促進に関わるたんぱく質であるヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子の発現量を増加させることをいい、更には、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子をコードする遺伝子の発現量を増加させることをいう。ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子をコードする遺伝子の遺伝子名はｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒであり、遺伝子シンボルはＨＢＥＧＦである。ここで「ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子をコードする遺伝子の発現量を増加させる」とは、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）非存在下における存在量と比較して有意に増大することを意味する。本発明における肌質改善剤を肌に塗布することで、被投与部位においてＨＢＥＧＦの発現が促進され、当該部位において、ＨＢＥＧＦの発現により改善されうる疾患又は状態を改善、治療又は予防することができる。より具体的には、本発明における肌質改善剤を肌に塗布することで、ターンオーバーを改善することができ、それに関連して水分保持機能及び肌バリア機能を改善することができる。

ＨＡの産生促進とは、ＨＡの産生量を増加させることをいう。具体的には、ＨＡを合成する酵素であるヒアルロン酸合成酵素３の産生量を増加させることをいい、更には、ヒアルロン酸合成酵素３をコードする遺伝子の発現量を増加させることをいう。ヒアルロン酸合成酵素３をコードする遺伝子の遺伝子名はｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ３であり、遺伝子シンボルはＨＡＳ３である。ここで「ヒアルロン酸合成酵素３をコードする遺伝子の発現量を増加させる」とは、ヒアルロン酸合成酵素３をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）非存在下における存在量と比較して有意に増大することを意味する。本発明における肌質改善剤を肌に塗布することで、被投与部位においてＨＡＳ３の発現が促進され、当該部位において、ＨＡＳ３の発現により改善されうる疾患又は状態を改善、治療又は予防することができる。より具体的には、本発明における肌質改善剤を肌に塗布することで、ＨＡの産生促進ができ、それに関連して細胞空間の維持及び浸透圧の維持、並びに栄養素等の保持及び移動をスムーズにすることに繋がり、ひいては肌あれ、小ジワ等の改善に繋がると考えられる。

ＴＪの強化とは、ＴＪのストランド形成を強化することをいう。具体的には、ストランド形成を担うたんぱく質であるクローディン１の発現量を増加させることをいい、更には、クローディン１をコードする遺伝子の発現量を増加させることをいう。クローディン１をコードする遺伝子の遺伝子名はｃｌａｕｄｉｎ １であり、遺伝子シンボルはでＣＬＤＮ１ある。ここで「クローディン１をコードする遺伝子の発現量を増加させる」とは、クローディン１をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）非存在下における存在量と比較して有意に増大することを意味する。本発明における肌質改善剤を肌に塗布することで、被投与部位においてＴＪの発現が促進され、当該部位において、ＴＪの発現により改善されうる疾患又は状態を改善、治療又は予防することができる。より具体的には、本発明における肌質改善剤を肌に塗布することで、ＴＪを産生促進することができ、それに関連してＴＪのストランド形成を強化することができ、それに関連して皮膚のバリア機能及び水分保持機能を向上することができる。

菌に対する抵抗力の向上とは、細菌等に対する抗菌活性を向上させることをいう。具体的には、細菌等に対して抗菌活性を示すペプチドである抗菌ペプチドの発現量を増加させることをいい、更には、抗菌ペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させることをいう。抗菌ペプチドをコードする遺伝子の遺伝子名はｄｅｆｅｎｓｉｎ ｂｅｔａ ２であり、遺伝子シンボルはＤＥＦＢ２である。ここで「抗菌ペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させる」とは、抗菌ペプチドをコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）非存在下における存在量と比較して有意に増大することを意味する。本発明における肌質改善剤を肌に塗布することで、被投与部位においてＤＥＦＢ２の発現が促進され、当該部位において、ＤＥＦＢ２の発現により改善されうる疾患又は状態を改善、治療又は予防することができる。より具体的には、本発明における肌質改善剤を肌に塗布することで、菌に対する抵抗力を強化することができ、それに関連してアトピー性皮膚炎の抑制等が期待できる。

ＴＥＷＬの抑制とは、具体的には、経表皮水分の蒸散量を抑制することをいう。ＴＥＷＬは、皮膚のバリア機能の指標として用いられる。ＴＥＷＬを抑制することで、皮膚バリア機能の強化等が期待できる。

その他に、肌機能を改善することで、肌のキメをよくしたり、化粧のりをよくしたり、吹き出物を抑制したりするなどの効果も挙げられる。また、肌のハリを向上させる、肌のたるみを抑制する、といった効果や、肌（特に顔肌）の毛穴の引き締め効果も挙げられる。

また、本発明における肌質改善剤は、肌の機能が不調である場合にこれを改善して通常の状態に戻す効果のみならず、肌機能を通常の状態から更に優れた状態にする効果をも奏する。すなわち、本発明に係る肌質改善剤は、肌機能修復剤としてのみならず、肌機能亢進剤としても用いることができる。またさらに、本発明に係る肌質改善剤は、肌機能低下を予防する効果も奏しうる。つまり、肌機能が低下はしていないものの、低下する可能性がある場合にあらかじめ塗布しておくことで肌機能の低下を抑制することができる。

「皮膚外用剤」
本発明における皮膚外用剤とは、例えば、医薬品類、医薬部外品類、化粧品類等に、肌質改善剤を配合し、製剤化したもののことをいう。

皮膚外用剤の剤形としては、肌質改善剤の効果を損なわない範囲内であれば特に限定されず、任意の剤形とすることができる。剤形の種類としては、特に限定されないが、例えば、軟膏剤、ジェル剤、ゲル剤、クリーム、パック剤、シップ剤、乳液、ローション剤、化粧水、パウダーなどの半固形物や液体あるいは固形物等があげられる。

本発明における皮膚外用剤には、肌質改善剤の効果を損なわない範囲であれば特に限定されず、医薬品類、医薬部外品類、化粧品類等の分野において通常用いられる添加成分を適宜配合することができる。添加成分としては特に限定されず、例えば、精製水、油性成分、界面活性剤、乳化剤、低級アルコール、高級アルコール、多価アルコール、水溶性高分子、粘度調整剤、ゲル化剤、保湿剤、殺菌剤、抗炎症剤、鎮痛剤、抗真菌剤、角層軟化剥離剤、皮膚着色剤、ホルモン剤、紫外線吸収剤、汗防臭剤、ビタミン剤、血流促進剤（血管拡張剤、血行促進剤）、生薬、ｐＨ調整剤、金属イオン封鎖剤、パール化剤、天然香料、合成香料、色素、顔料、酸化防止剤、防腐剤、及び香油等が挙げられる。

本発明における皮膚外用剤に配合される肌質改善剤の量は特に限定されないが、肌質改善剤の配合量が、皮膚外用剤の全質量に対して、０．１～１０．０質量％であることが好ましく、より好ましくは０．５～５．０質量％であり、更により好ましくは１．０質量％である。肌質改善剤の配合量が１０．０質量％を超えると、凝集等の問題が起こりやすくなり好ましいものではなくなる。また、０．１質量％未満では、肌質改善剤の効果が十分に発揮できず、これも皮膚外用剤として好ましいものではなくなる。

本発明に係る肌質改善剤を皮膚外用剤に配合することで、使用者が肌質改善剤を取扱いやすくなるという効果を奏する。

以下、実施例を示してより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

「ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）による遺伝子発現評価」
ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）による遺伝子発現評価は、以下の方法で行った。

１．方法
１－１原材料
試験試料として、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＫＯ３株（ＮＩＴＥ ＢＰ－７７１）を遺伝子発現評価に用いた。
乳酸菌殺菌粉末として、上記ＫＯ３株を、米たんぱくを含む培地で培養後、加熱殺菌した菌体に賦形剤を加え乾燥、粉砕したものを用いた（製品名：Ｌ８０２０殺菌粉末、ヤヱガキ醗酵技研株式会社製）。

１－２．試験試料
０．２質量％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースを、蒸留水で０．２質量％水溶液へ希釈することで調製した。本水溶液はコントロールとして用いた。
１％殺菌粉末は、０．２質量％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液に、乳酸菌殺菌粉末が１質量％となるように溶解・分散することで調製した。

１－３．ヒト３次元培養表皮モデル（ＲＨＥ）の培養と試料添加
ＲＨＥは、ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社製のＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ ２４を用いた。試験は当該メーカーの説明書に従い行った。当該メーカーから入手したＲＨＥを培養培地に移し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。次に、ＲＨＥの角層側に各試料を５０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で１時間培養した。その後、角層上の各試料を除去し、更に５時間培養して続く解析に用いた。

１－４．定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＨＥ組織を、セルカルチャーインサートから、メルカプトエタノールを添加したＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）に移した。当該ＲＨＥ組織を粉砕し、上清をフェノール－クロロホルム混液で精製した。さらにＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて合成した。定量的ＰＣＲは、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて行った。ＧＡＰＤＨを内在性コントロールとして、定量的ＰＣＲ解析を行った。コントロールに対する遺伝子の相対発現量は、△△Ｃｔ法を用いて算出した。試験は３回繰り返し行い、その結果は３検体の平均±標準偏差で示し、スチューデントのｔ検定によってコントロールに対する有意差検定を行った（α＝０．０５）。

２．結果
１％殺菌粉末をＲＨＥに添加し、６時間経過後における、特定遺伝子と、特定遺伝子のコントロールとの相対発現量を図１～４に示す。ＨＢＥＧＦ、ＨＡＳ３、ＣＬＤＮ１、及びＤＥＦＢ２の相対発現量に有意な増加が認められた。図には示さないが、評価対象としたその他遺伝子の相対発現量では有意な変動は認められなかった。

「殺菌粉末配合クリームの連用評価試験」
殺菌粉末配合クリームの連用評価試験は、以下の方法で行った。

１．方法
１－１．試験試料
殺菌粉末配合クリームは、上記殺菌粉末をクリームに配合することで調製した。
プラセボクリームは、殺菌粉末配合クリームと同じ処方のクリームであって、殺菌粉末を水に置き換えものである。

１－２．試験方法
２０代～５０代の１２名（女性８名、男性４名）を対象として試験を行った。使用期間は２週間で、１日２回、洗顔後、指定した側の半顔に殺菌粉末配合クリームを塗り、他方の半顔にプラセボクリームを塗った。
２週間連用開始前及び２週間連用後に、洗顔料を用いて洗顔し、２０分間測定環境（室温２０℃±１℃、湿度５０％±５％）に馴化させ、ＴＥＷＬの測定を行った。測定機器はＡｑｕａＦｌｕｘ（Ｂｉｏｘ社製）を用いた。

２．結果
１２名の試験結果の平均を図５に示す。殺菌粉末配合クリームを２週間連用した側の顔のＴＥＷＬは、２週間連用開始前に測定したＴＥＷＬと比較して有意に減少していた。一方、プラセボクリームを２週間連用した側の顔のＴＥＷＬは、２週間連用開始前に測定したＴＥＷＬと比較して有意な差はなかった。これにより、本発明における肌質改善剤を配合した皮膚外用剤を使用することで、皮膚バリア機能が向上することが明らかになった。

以下に本発明の肌質改善剤を皮膚外用剤に適用した場合の処方例を挙げる。なお、各処方例の製法は常法による。
＜処方例１＞乳液
（成分名） （質量％）
肌質改善剤 ０．１
スクワラン ５．０
ホホバ油 ０．３
自己乳化型グリセリルモノステアレート １．０
ステアリン酸 ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．１
グリセリン １．５
エタノール ７．０
ｐＨ調整剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部

＜処方例２＞化粧用クリーム
（成分名） （質量％）
肌質改善剤 １．０
シア脂 ２．０
ホホバ油 １．０
ステアリルアルコール ５．０
スクワラン １０．０
自己乳化型グリセリルモノステアレート ３．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０） １．０
１，３ブチレングリコール ５．０
グリセリン ５．０
ｐＨ調整剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部

＜処方例３＞化粧水
（成分名） （質量％）
肌質改善剤 ５．０
グリセリン ５．０
１，３ブチレングリコール ５．０
トリメチルグリシン ３．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．０） ０．５
エタノール ２．０
ｐＨ調整剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部

以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

Claims (6)

1. ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の菌体又は菌体の抽出物を有効成分とする、肌質改善剤。
2. 前記ラクトバチルス・ラムノーサスが、ＫＯ３株（ＮＩＴＥ ＢＰ－７７１）である、請求項１に記載の肌質改善剤。
3. 皮膚バリア機能の改善、菌に対する抵抗力の向上、又はＴＥＷＬの抑制のうち少なくともいずれかを目的として使用するものである、請求項１又は２に記載の肌質改善剤。
4. ＨＢＥＧＦ、ＨＡＳ３、ＣＬＤＮ１、又はＤＥＦＢ２のうち少なくともいずれかの遺伝子発現を促進するものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の肌質改善剤。
5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の肌質改善剤を配合する、皮膚外用剤。
6. 前記肌質改善剤の配合量が、０．１～１０．０質量％である、請求項５に記載の皮膚外用剤。

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